Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Факторы, влияющие на пролиферацию и апоптоз в мышиных гепатокарциномах различного уровня дифференцировки

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Факторы, влияющие на пролиферацию и апоптоз в мышиных гепатокарциномах различного уровня дифференцировки"

На правах рукописи

ОВЧИННИКОВ ДМИТРИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ И АПОПТОЗ В МЫШИНЫХ ГЕПАТОКАРЦИНОМАХ РАЗЛИЧНОГО УРОВНЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ

03.00.06 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 2004

Работа выполнена на кафедре вирусологии Московского Государственного Университета им М.В. Ломоносова и в отделе Иммунохимии НИИ Канцерогенеза ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН

Научные руководители:

доктор биологических наук, академик РАН, профессор

доктор биологических наук,

Абелев Гарри Израилевич Лазаревич Наталья Леонидовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Бродский Всеволод Яковлевич доктор биологических наук, профессор Доброе Евгений Николаевич

Ведущая организация: Институт биологии гена РАН, г. Москва.

Защита диссертации состоится 24 ноября 2004 г. в часов

на заседании диссертационного совета Д 501.001.76

при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова

по адресу: 119992, Москва, ГСП-2, Ленинские Горы, МГУ, НИИ физико-

химической биологии им. А.Н. Белозерского, лабораторный корпус А, ауд. 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Автореферат разослан «_»_2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук

Н.О. Калинина

Введение.

Канцерогенез - сложный и многостадийный процесс, для реализации которого необходимо множество последовательных событий. Исследования показывают, что процесс появления опухоли можно условно разделить на 3 этапа. На первом этапе (инициация) происходит накопление мутаций в генах, приводящих к нарушению контроля пролиферации в клетках. В ходе второго этапа (промоция) трансформированные клетки, преодолевают сдерживающие влияние тканевого микроокружения и образуют пренеопластический фокус. На третьем этапе, получившем название прогрессия, происходит усиливающееся накопление генетических изменений, ведущее к приобретению клетками злокачественного фенотипа. Изменения, происходящие в трансформированных клетках на этой стадии, приводят к их клональной экспансии и образованию опухоли (Faber, 1980; Pitot et al., 1991).

Одним из основных событий канцерогенеза является усиление пролиферации опухолевых клеток и уклонение их от программируемой клеточной смерти (апоптоза) (Hanahan et al., 2000; Копнин, 2000; Hahn et al., 2002). На это направлены многие из генетических изменений, происходящих в опухолевых клетках.

Для большинства типов опухолей также характерна постепенная утрата маркеров дифференцировки и подавление экспрессии генов, препятствующих размножению опухолевых клеток (опухолевые супрессоры), или не требующихся опухоли для поддержания ее жизнедеятельности (антигенное упрощение) (Абелев, 1979). Поэтому снижение уровня дифференцировки также относится многими авторами к числу основных событий канцерогенеза (Hanahan and Weinberg, 2000; Копнин, 2000; Hahn and Weinberg, 2002).

Эти три основных признака опухолевой клетки (скорость пролиферации, уровень апоптоза и уровень дифференцировки) тесно связаны между собой. Изучение молекулярных механизмов, лежащих в основе взаимосвязи между этими процессами, является важным и перспективным направлением исследований в современной молекулярной биологии и онкологии. С их помощью могут быть расширены представления о взаимосвязи фундаментальных клеточных процессов и открыты новые мишени для лекарственной терапии, а также разработаны принципиально новые подходы к лечению рака.

В последние годы во всем мире наблюдается рост частоты возникновения гепатоцеллюлярных карцином (ГК) - наиболее часто встречающегося вида опухолей печени и одной из наиболее распространенных форм рака. Ежегодно в мире выявляется до 1 000 000 новых больных с диагнозом ГК (Заридзе, 1996; Feitelson et al, 2002). В некоторых регионах ГК являются основной причиной смертности от новообразований.

К факторам риска для возникновения ГК следует отнести вирусы гепатита В или С (HBV

или HCV), ряд химических

р ы е

другие факторы (Feitelson et al., 2002; Лазаревич, 2004). Быстрое распространение вирусов HBV и HCV ведет к увеличению частоты встречаемости ГК в мире. Изучение процессов, лежащих в основе появления ГК, привело к выявлению ряда генов, участвующих в возникновении и развитии этой патологии. К ним можно отнести гены, кодирующие факторы роста (Трансформирующий фактор роста TGFa и -Р, фактор роста гепатоцитов HGF и др.), их рецепторы, опухолевые супрессоры (р53 и pRb и др.), молекулы межклеточных контактов и адгезии (Buendia, 2000).

ГК в течение длительного времени являются моделью для изучения как общих, так и ткане-специфических механизмов канцерогенеза. В этом типе опухолей было открыто явление ре-экспрессии эмбрио-специфических белков (Абелев, 2000) и первый из онкоэмбриональных маркеров - альфа-фетопротеин (АФП) (Abelev et al., 1963; Abelev, 1993; Комов, 1996).

Накопленный массив данных о механизме контроля уровня дифференцировки, пролиферации и апоптоза делает ГК интересным объектом для изучения способов взаимодействия между этими процессами.

Недавно было показано, что прогрессия ГК может быть связана с нарушением функции гепатоцитарных ядерных факторов (ГЯФ), которые являются одними из основных регуляторов экспрессии генов, специфичных для печени (Spath et al., 1998; Lazarevich et al., 2004b). Важнейшим из ГЯФ во взрослой печени представляется ядерный рецептор гепатоцитарного ядерного фактора (HNF4al) (Duncan, 2003). Показана его связь с уровнем дифференцировки в ГК (Lazarevich et al., 2004a), но остается нерешенным вопрос о его связи с общими механизмами контроля уровня пролиферации и апоптоза.

Цитокины семейства TGFP являются одними из основных кандидатов на роль связующего звена между печень-специфическими и общими сигнальными путями, задействованными в процессе канцерогенеза. Показано, что члены этого семейства участвуют в поддержании дифференцировочного статуса, а также в контроле пролиферации и апоптоза, как в печени, так и в других органах (Massague, 1998; Bissell et al., 2001; Derynck et aL, 2001; Piek et al., 2001).

Данные о роли TGFP в канцерогенезе противоречивы. TGFPi был открыт как фактор, стимулирующий рост опухолей, но в дальнейшем было показано, что TGFPi ингибирует рост и развитие многих типов опухолей (Massague, 1998).

Для изучения факторов, контролирующих апоптоз и пролиферацию, и их связи с уровнем дифференцировки опухолей мы использовали уникальную модель одноступенчатой прогрессии ГК, полученную и охарактеризованную в нашей лаборатории (Энгельгардт et al., 2000; Кудрявцева et al., 2001), а также коллекцию независимо индуцированных ГК мышей с различным уровцем дифференцировки для проверки универсальности полученных результатов.

г

Цели и задачи исследования.

Цель настоящей работы состояла в поиске факторов, ответственных за различие в скорости пролиферации и уровня апоптоза между опухолями печени с различным уровнем дифференцировки, составляющими модель одноступенчатой прогрессии ПС.

В ходе работы решались следующие основные задачи:

1. Изучение влияния HNF 4а 1 на уровень пролиферации и апоптоза в ПС.

2. Анализ изменений экспрессии генов, участвующих в контроле пролиферации и апоптоза, при одноступенчатой прогрессии ПС.

3. Проверка универсальности выявленных закономерностей на панели независимо индуцированных ПС мышей с разным уровнем дифференцировки.

4. Идентификация фактора, ответственного за усиление пролиферации и снижение уровня апоптоза в ходе одноступенчатой прогрессии ПС.

5. Описание эффектов инактивации этого фактора на скорость роста ПС in vitro и in vivo.

Научная новизна и практическая ценность работы.

В течение длительного времени исследования генетических основ прогрессии ПС были сфокусированы на изучении функции основных клеточных онкогенов и анти-онкогенов в ходе гепатоканцерогенеза. В данной работе показано, что экспрессия гена гепато-специфического транскрипционного фактора HNF4al приводит к подавлению роста ПС, как in vitro, так и in vivo.

С другой стороны мы обнаружили, что клетки дедифференцированной высокозлокачественной ПС секретируют фактор стимулирующий их пролиферацию и

обладающий выраженным анти-апоптотическим эффектом.

Было показано, что в ходе прогрессии ПС, а так же при дедифференцировке нормальных мышиных гепатоцитов в культуре наблюдается гиперэкспрессия этого цитокина. Выявленная закономерность, скорее всего, носит универсальный характер, так как она была подтверждена в ходе исследований коллекции независимо индуцированных ПС с различным уровнем дифференцировки. Гиперэкспрессия TGFpj сопровождается активацией многих TGFJ5 респонсивных генов.

Впервые показана способность членов семейства подавлять

активацию р53. Можно предполагать, что этот эффект лежит в основе анти-апоптотического действия TGFp2.

В работе продемонстрировано, что инактивация приводит к подавлению скорости

пролиферации клеток и снижает скорость роста ПС у экспериментальных животных.

Изучение механизмов прогрессии опухолей печени относится к числу фундаментальных проблем современной онкологии и может способствовать разработке новых методов терапии

злокачественных новообразований. В ходе работы выявлены потенциальные прогностические маркеры (TGFP2, фибронектин, ТЫ68, TGIF) и мишени для терапии I(TGFp2)nG

Апробация работы.

Диссертация была апробирована на совместном заседании кафедры вирусологии биологического факультета МГУ им. MB. Ломоносова и лаборатории иммунохимии НИИ Канцерогенеза ГУ РОЩ им. Н.Н. Блохина РАМН 9 октября 2003 года. Материалы исследований, представленных в работе, докладывались на 1 конференции Европейской организации естествоиспытателей (Женева, 2000), 16, 17 и 18 конференциях Европейского общества исследователей рака (Халкидики, 2000; Гранада, 2002; Иннсбрук, 2004), И конференции Европейских раковых организаций (Лиссабон, 2001), конференциях «Механизмы дифференцировки и патогенеза печени» Федерации американских обществ экспериментальной биологии (Колорадо, 2000 и 2002) и на ученых советах НИИ Канцерогенеза ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых изданиях и 9 тезисов международных конференций.

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на страницах машинописного текста (12 шрифт, полуторный интервал), содержит рисунков, таблицы. Состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследования», «Обсуждение результатов», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Список литературы содержит источников, в том числе в отечественных рецензируемых изданиях.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Модель одноступенчатой прогрессии гепатокарцином мышей.

Настоящая работа проведена на коллекции перевиваемых гепатоцеллюлярных карцином мышей, полученной в лаборатории канцерогенных веществ НИИ Канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН О.В. Морозовой.

Модельная система состоит из медленнорастущей, высокодифференцированной опухоли (мГК), выделившегося из нее in vivo в ходе опухолевой прогрессии быстрорастущего дедифференцированного варианта (6ГК) и полученной из него клеточной линии НЗЗ.

Ранее было показано, что в ходе прогрессии от мГК к 6ГК и НЗЗ происходит утрата экспрессии гена HNF4al, одного из важнейших регуляторов экспрессии печень-специфических генов. Ре-экспрессия гена HNF4al в НЗЗ приводит к частичной реверсии опухолевого фенотипа, восстановлению экспрессии дифференцировочных маркеров, а также к

приобретению клетками эпителиальной морфологии (Варга et al., 2001; Lazarevich et al., 2004b). Трансфекция репортерного гена под контролем регуляторного района гена HNF4al в культуру НЗЗ показала, что репрессия HNF4cil происходит на транскрипционном уровне. Эти результаты говорят о существовании транс-фактора(ов), изменение уровня экспрессии или функциональной активности которых определяет подавление транскрипции при прогрессии опухолей.

Сравнение уровня апоптоза в ГК с различным уровнем дифференцировки.

Важнейшим свойством, приобретенным ГК в ходе прогрессии в исследуемой системе, стало резкое ускорение роста опухоли от vivo, от 5-7 месяцев между перевивками для мГК, до 2 недель для 6ГК. Этот феномен может быть связан как с усилением пролиферации, так и с уменьшением уровня апоптоза.

Для сравнения уровня апоптоза в мГК и 6ГК был использован метод выделения низкомолекулярной ДНК из образцов опухолей и нормальной мышиной печени. В образце нормальной мышиной печени и в образце мГК апоптотическая фрагментация ДНК не выявляется. Это совпадает с литературными данными об уровне апоптоза в нормальной печени, который в норме не превышает 3-4 апоптотических клеток на 10 000 нормальных и не может быть выявлен использованным методом. В то же время, ДНК из образца 6ГК имеет паттерн расщепления около 200 п.н., характерный для апоптотической деградации. Это согласуется с нашим наблюдением о присутствии апоптотических телец в гистологических препаратах 6ГК и свидетельствует о высоком уровне апоптоза в этой опухоли.

Влияние экспрессии HNF4al на уровень пролиферации и скорость роста 6ГК in vitro.

Разница в скорости роста между мГК и 6ГК позволяет предположить, что уровень экспрессии связан с ростовыми характеристиками ГК в исследуемой системе. Для

проверки этой гипотезы мы использовали клеточные линии H33-HNF4al и НЗЗ-Puro, ко-трансфицированные вектором, экспрессирующим и вектором, несущим устойчивость

к пуромицину, или только контрольным вектором, соответственно.

Мы воспользовались прямым методом определения кинетики пролиферации исследуемых культур. Причиной изменения кинетики пролиферации является сдвиг баланса между уровнем пролиферации и апоптоза в исследуемой клеточной линии. На рис. 1 видно, что количество клеток в контрольной культуре НЗЗ-Puro в процессе культивирования увеличивается существенно быстрее, чем число клеток и к 6 дню эксперимента

превышает его в 2 раза.

Рисунок 1. Влияние экзогенной экспрессии

HNF4al на скорость роста клеток НЗЗ. А. Кинетика пролиферации клеток НЗЗ-Риго и H33-HNF4al in vitro. 5xlO4 высевали на 6-см чашки Петри и подсчитывали ежедневно. Б. Кривые роста опухолей у мышей, подкожно

инъецированных 5x10' клеток линий НЗЗ-Puro ИЛИ НЗЗ-HNF4al.

Уровень

пролиферации H33-HNF4ol и НЗЗ-Puro определяли с помощью включения в ДНК 5-BrdU. Оказалось, что клетки, экспрессирующие HNF4al, в 1,5 раза хуже включают метку, чем контрольные клетки,

трансформированные пустым вектором (43,2% и '1,5% соответственно). Эти данные указывают на антипролиферативный эффект экспрессии HNF4al в ПС.

Ре-экспрессия HNF4al снижает скорость роста 6ГК in vivo. Для проверки гипотезы об антипролиферативном эффекте HNF4al и его влиянии на скорость роста опухолей in vivo, совместно с О.В. Морозовой был проведен туморогенный тест, результаты которого приведены на рис. 1.

У мышей, которым были инъецированы клетки линии H33-HNF4al, наблюдалось значительное снижение скорости роста опухолей по сравнению с животными, инъецированными НЗЗ-Puro: через 7 недель роста in vivo средний размер опухоли составил 17 000 мм3 в случае НЗЗ-Puro и 50 мм3 для H33-HNF4al.

Таким образом, ре-экспрессия HNF4al в клетках дедифференцированной ГК мыши оказывает ингибирующий эффект на рост опухолей in vivo и in vitro. Механизм, с помощью которого способен подавлять рост ГК, не ясен, но, учитывая тот факт, что

Б.

Время роста опухоли, дин

транс-фактор, можно ожидать, что, по крайней мере, часть этих изменений должна происходить на транскрипционном уровне. Основываясь на этом предположении, для поиска возможных эффекторов антипролиферативной функции HNF4a мы проанализировали транскрипционные изменения, произошедшие в ходе опухолевой прогрессии в исследуемой системе.

Гиперэкспрессия TGFP респонсивных генов при одноступенчатой прогрессии ГК.

Гены, максимально активированные при прогрессии ГК

СВАсс Название ДбГК/мПО ■фикция

Регуляция транскрипции

АА028696 МЬЬ-1 ¿п? 3.9 ТФ

АА059953 Белок А холодного шока 3.9 ТФ, репрессор

Передача сигнала

АА068125 Гиппокалик-подобныв белок 1 5.9 Связывание Са

АА274099 вег/Шг киназа 17Ь 3.9 Проапоптотическая активность

Проли4 «рация

№12504 Остеокласт- стимулирующий белок 1 8.3 Связывание с-ягс

АА119595 Докериый белок 1 6.4 МАРККК каскад

АА200942 8сЫаГеп4 6.6 Контроль пролиферации

АА547555 сйс28 протеин-кнназа 1 3.7 Регуляция клеточного цикла

АА066180 ЛаминА &1 Поддержание ядерной структуры

Метаболизм

№11965 Енолаза ЗЪ 8.1 Гликолиз

АА498546 ТШМ37 6.9 Функционирование иероксисом

№74835 Гексокнназа 1 5.8 Гликолиз, глюконеогенез

АА512478 Цнтохром с оксндаза \Иа субъедпинца 5.2 Окислительное фосфорилированне

АА518639 Атъдолаза 1А 4.4 Гликолиз

Внутриклеточный транспорт

№64715 Протеолнпид 2 62 Транспорт ионов

АА543796 Цитохезин 3 53 Везикулярный транспорт

АА444689 Гомолог сииаптотагмина II 3.8 Везикулярный транспорт

Подвижность и тканевая органнзация

АА466198 Фшшмнн-подобный белок 5.1 Локомоция, связывание актина

АА230451 Калгранулнн А 5.1 Связывание промежуточных филаментов

теге-веспо юивкые геи ы

АА268592 ТОРЬ-нидуцнруемый белок 68 кИа 4.4 Взаимодействие клеток с£СМ

АА145458 Фнброиектин 1 3.8 Компонент ЕСМ

АА231358 Гомолог белка теплового шока 20-кД 3.8 Шалерон-иодобная активность

№66757 Глюкокортикоия-иидуцируемыМ фактор 4.0 ТФ

4А060863 ТОГЫ-иидуцируемый белок 4 3,7 ТФ, репрессор

АА124340 Тет^ рецептор Ш 3.5 ко-рецепгор к ТБРЪ2

АА518165 Ингибитор мегаллопротеииж 2 (ПМР2) 3.7 ингибитор металлопротеаз

Неклассифицированные последовательности

АА518354 ЕЭТз, гомологии не выявлено 4.»

АА000873 ЕСТ», гомологий ие выявлено 4.7 ?

АА500968 ЕСТ;, гомологий не выявлено 4.0

АА124495 Е8Гг, гомологий не выявлено 3.9 ч

АА125404 ЕСТз, гомологий не выявлено 3.8 7

Таблица 1. Гены, наиболее значительно гиперэкспрессированные при прогрессии ГК по данным

гибридизации с кДНК микрочипами. ДбГК/мГК - соотношение нормализированных значений экспрессии гена в 6ТК и мГК. ESTs - последовательности с невыясненными функциями белковых продуктов. GB Асе - номер последовательности в геномном банке.

Для изучения изменений в характере экспрессии генов, сопровождающих прогрессию ГК в исследуемой модели, Н.Л. Лазаревич (Лазаревич, 2003) были проанализированы спектры экспрессии генов в мГК, 6ГК и НЗЗ по сравнению с нормальной печенью взрослой мыши с помощью гибридизации с микрочипами, содержащими кДНК 9 000 мышиных генов. После компьютерного анализа полученных результатов были сформированы списки генов, экспрессия которых наиболее существенно изменилась в 6ГК и НЗЗ по сравнению с мГК и нормальной печенью мыши табл. 1.

Всего было выявлено 250 генов, экспрессия которых при прогрессии повышается, и 380 генов, экспрессия которых падает более чем в 2 раза (бГК/мГК>2 или <0,5 соответственно) (Лазаревич, 2003). Более половины наиболее значительно репрессированных генов кодирует сывороточные белки, синтезируемые в печени, и маркеры печеночной дифференцировки. Эти результаты отражают процесс утраты дифференцировки, характерный для прогрессии ГК.

В таблицу 1 включены некоторые гены, изменение уровня экспрессии которых в 6ГК относительно мГК составило не менее чем 3,5 раза. Среди наиболее гиперэкспрессированных генов можно выделить несколько групп: транскрипционные факторы; белки, участвующие в передаче сигнала или контролирующие пролиферацию; метаболические ферменты; транспортные и адгезионные молекулы, а также ряд неохарактеризованных пока последовательностей кДНК (Е8Тб). Значительная часть генов, экспрессия которых наиболее существенно повысилась в 6ГК и/или НЗЗ по сравнению с мГК (7 из 26 генов с известной функцией) оказались ТОБР-индуцируемыми, что указывает на вовлеченность этого сигнального пути, в прогрессию опухолей печени.

Исследование спектров экспрессии TGFp-респонсивных генов и генов, участвующих, в TGFjJ-зависимом сигнальном пути, методом ОТ-ПЦР.

С помощью метода ОТ-ПЦР мы проверили некоторые закономерности, выявленные в ходе анализа результатов гибридизации с кДНК микрочипами (рис 2 и 3).

Экспрессия ТОБр-респонсивных генов может быть усилена несколькими способами, например, за счет гиперэкспрессии генов, кодирующих ТОБ|3Я1 или или членов этого

семейства, экспрессирующиеся в печени (ТОБр1 и Т0Б02).

Мы установили, что транскрипция генов, кодирующих рецепторы обоих типов к Т0Б0, в ходе одноступенчатой прогрессии ГК значимо не изменилась. Аналогичные результаты были получены при изучении панели независимо индуцированных ГК с разнличым уровнем дифференцировки.

Рисунок 2. Изменения экспрессии генов, контролирующих пролиферацию и апоптоз при одноступенчатой прогрессии ГК. ОТ-ПЦР анализ уровней экспрессии мРНК в мГК-2 (дорожка 1), мГК (2, 3), 6ГК (4, 5), нормальной печени (6) и культуре НЗЗ (7, 8). Для контроля равенства количества РНК, взятой в реакцию, приведены результаты ОТ-ПЦР с праймерами к GAPDH. А. Гены, вовлеченные в TGFp сигнальный путь. Б. TGFp респонсивные гены. В. Гены участвующие в контроле пролиферации и апоптоза.

Из 3 членов семейства TGFP, экспрессирующихся у млекопитающих, в гепатоцитах показана экспрессия только TGFpi и TGFP2. С помощью метода ОТ-ПЦР мы показали, что уровень экспрессии гена TGFpi в ходе прогрессии практически не изменился, а ген TGF02 оказался гиперэкспрессирован в 6ГК и НЗЗ по сравнению с печенью и мГК (рис. 2.). В большинстве изученных нами низкодифференцированных ГК ген TGFfSz также был гиперэкспрессирован, в то время как уровень экспрессии не коррелировал с уровнем

дифференцировки и скоростью роста опухолей (рис. 3.).

Таким образом, в быстрорастущих низкодифференцированных мышиных ГК наблюдается гиперэкспрессия гена которая могла стать причиной аутокринной

стимуляции сигнального пути и респонсивных генов мишеней.

Первичная культура нормальных мышиных гепатоцитов (НМГ) используется в качестве модельной системы для изучения процессов, происходящих при регенерации и канцерогенезе. Известно, что в течение первых 20 минут после гепатоэктомии гиперэкспрессируется TGFP2 (Bissell et al., 1995), а несколько позже (через 12 часов) усиливается транскрипция TGFPi (Bissell et al., 2001). Данных о характере экспрессии членов семейства TGFP в НМГ в литературе нами не обнаружено.

Методом ОТ-ПЦР мы показали, что в НМГ, начиная со вторых суток культивирования, наблюдается гиперэкспрессия гена транскрипция которого остается на том

же уровне, что и в печени (рис 4).

Хотя согласно литературным данным активность членов семейства TGFP контролируется в основном на уровне трансляции, секреции или активации латентных комплексов (Massague, 1998; Massague et al., 2000; Bissell et al., 2001; Piek and Roberts, 2001), в

последнее время появились данные о существовании регуляции количества TGF[5l (Wu et al., 2000; Blanche re et al., 2002) и TGFp2 (Wu and Kumar, 2000; Samatar et al., 2002) на уровне транскрипции. Полученные нами результаты не исключают возможности регуляции активности этих цитокинов ¡(как TGF01, ТНК И TGFJ32) на других уровнях, но свидетельствуют о наличии изменений в уровне транскрипции.

Рисунок 3. Изменения в экспрессии генов, контролирующих пролиферацию и апоптоз в панели независмо индуцированных ГК с различным уровнем дифференцировки. ОТ-ПЦР анализ уровней экспрессии мРНК в нормальной печени (дорожка 1), дифференцированных ГК (2-6) и дедифференцированных ГК (7-13). Для контроля равенства количества РНК, взятой в реакцию, приведены результаты ОТ-ПЦР с праймерами к HPRT. А. Гены, вовлеченные в TGFj3 сигнальный путь. Б. TGFp респонсивные гены. В. Гены, участвующие в контроле пролиферации и апоптоза.

Мы установили, что в 6ГК и НЗЗ

фмвроиекгнн гиперэкспрессированы TGFP-

ICIf ^ респонсивные гены, кодирующие TSC-22,

аЗ интсгрин фибронектин и циклин G (рис. 2).

Существование обратной корреляции

между уровнем экспрессии этих генов и

уровнем дифференцировки в опухолях

печени было подтверждено при анализе

панели независимо индуцированных ГК

мышей (рис. 3).

Рисунок 4. Активация транскрипции гена TGFPj в первичной культуре нормальных мышиных гепатоцитов. ОТ-ПЦР анализ уровней экспрессии мРНК генов TGFpi И TGFPj в нормальной печени (П) и двухдневной культуре нормальных мышиных гепатоцитов (НМГ) (2 сутки). Для контроля равенства количества РНК, взятой в реакцию, приведены результаты ОТ-ПЦР с праймерами к GAPDH.

Фибронектин - основной компонент ВКМ печени и многих других органов (Ffrench-Constant, 1995). Через интегриновые рецепторы фибронектин способен активировать внутриклеточные сигнальные пути, контролирующие пролиферацию и подвижность. В 6ГК и НЗЗ, а также в низкодифференцированных ГК отмечено появление альтернативно сплайсированной формы фибронектина (720 п.н., верхняя полоса на рис. 2 и 3), содержащей EDA-домен, которая характерна для быстро пролиферирующих и низкодифференцированных.

тканей (Ffrench-Constant, 1995; Manabe et al., 1999). По литературным данным, TGFßz участвует в регуляции сплайсинга фибронектина (Li et al., 2000).

Ген TSC-22 кодирует высококонсервативный транс-фактор, содержащий мотив «лещиновая молния», способный гетеродиммеризоваться и модулировать активность других транскрипционных регуляторов (Kester et al., 1999).

Мы показали, что в ряду мГК, 6ГК, НЗЗ наблюдается увеличение экспрессии гена циклина G, практически отсутствующей в нормальной печени мыши, при этом в культуре клеток 6ГК уровень экспрессии этого гена максимален. Увеличение экспрессии циклина G характерно для большинства изученных нами низкодифференцированных ПС. Уровень транскрипции циклина G контролируется TGFß (Home et al., 1996; Jensen et al., 1998).

В мГК и 6ГК наблюдается повышение уровня экспрессии гена TGIF по сравнению с печенью, в НЗЗ уровень его экспрессии достигает максимума. Аналогичная зависимость между повышением уровня экспрессии TGIF и падением уровня дифференцировки опухолей наблюдается в панели независимо полученных мышиных ПС. Этот транскрипционный фактор, согласно литературным данным (Melhuish et al., 2001), может входить в состав ДНК-связывающего комплекса вместе со SMAD белками и участвовать в выборе генов-мишеней TGF|3 и изменении уровня их экспрессии.

Экспрессия другой мишени транс-фактора Tbi-68, значительно повышена в мГК

по сравнению с печенью, а в 6ГК и НЗЗ она падает. Tbi-68, согласно литературным данным, способен взаимодействовать с киназой фокальных контактов (FAK), а также активировать апоптоз (Billings et al., 2002; Kim, J.E. et al., 2003; Kim, MO. et al., 2003). Падение его экспрессии в дедифференцированных ПС может приводить к их нечувствительности к про-апоптотическому воздействию TGFp\

Мы обнаружили, что падение уровня дифференцировки ПС сопровождается повышении экспрессии генов аЗ субъединицы интегринового рецептора и виментина (рис. 3). Согласно литературным данным (Giannelli et al., 2002), TGFßi может активировать экспрессию гена аЗ субъединицы интегрина, что приводит к приобретению клетками опухоли подвижности, а также способности к инвазии и метастазированию. Ген виментина в норме не экспрессируется в гепатоцитах, но в ходе эпителиально-мезенхимального перехода (Thiery, 2002) наблюдается активация его транскрипции и замена цитокератиновых филаментов на виментиновые, что способствует клеточной подвижности.

Таким образом, в изученных нами ПС не происходит изменения уровней экспрессии гена, кодирующего TGF|3i, а также его рецепторов обоих типов. При этом наблюдается усиление транскрипции ряда мишеней зависимого сигнального пути (фибронектин, TSC-

22 и др.) в 6ГК, НЗЗ и во многих низкодифференцированных ПС. Возможно, это связано с гиперэкспрессией TGFß2, наблюдаемой в ПС с низким уровнем дифференцировки.

Изменения уровней экспрессии генов, участвующих в контроле пролиферации и апоптоза в гепатоцитах.

Fas - член суперсемейства «рецепторов смерти», один из основных индукторов апоптоза в гепатоцитах (Nagata, 1997; Ashkenazi et al., 1998; Faubion et al., 1999). Во многих ПС наблюдается репрессия гена Fas, приводящая к значительному снижению уровня апоптоза (Natoli et al., 1995; Higaki et al., 1996; Nagata, 1997; Faubion and Gores, 1999). По результатам ОТ-ПЦР ген Fas гиперэкспрессирован в мГК, но в 6ГК и НЗЗ его экспрессия значительно снижена (рис. 2). В дифференцированных ПС так же наблюдается некоторое усиление экспрессии Fas, но в опухолях с низким уровнем дифференцировки происходит подавление его экспрессии (рис. 3).

При гепатоканцерогенезе часто наблюдается изменение в уровне экспрессии генов семейства bcl-2, участвующих в опосредованной митохондриями индукции апоптоза. Было показано, что антиапоптотические члены семейства bcl-XL (Valdes et al., 2002; Valdes et al., 2004) и bcl-2 (Feldmann, 1997), гиперэкспрессируются в низкодифференцированных ПС, защищая их от апоптоза.

В нашей системе ген bcl-X[, гиперэкспрессирован в 6ГК и НЗЗ, при этом в печени и мГК уровень его экспрессии очень низок. Изменение уровня транскрипции гена bcl-2 было менее выраженным, но имело такое же направление, как у гена Ьс1-Хь В низкодифференцированных ПС эти гены, как правило, так же гиперэкспрессированы.

Экспрессия гена Ало J был обнаружена в мГК и в нормальной печени, но полностью отсутствовала в 6ГК и НЗЗ. Согласно литературным данным, TGFPi способен активировать экспрессию гена Апо J (Jin et al., 1997), который в свою очередь способен запускать апоптоз и влиять на уровень дифференцировки эпителиоцитов.

Уровень экспрессии гена c-fos повышен в 6ГК по сравнению с мГК и нормальной печенью, в то время как в ЮЗ его экспрессия полностью пропадает (рис. 2). По литературным данным (Mikula et al., 2003), для начальных этапов гепатоканцерогенеза характерна активация протоонкогена c-fos, которая может индуцироваться однако в ходе прогрессии уровень

его транскрипции значительно снижается.

Итак, в ходе прогрессии в исследуемой системе произошла активация генов, обладающих анти-апоптотическим эффектом или участвующих в контроле пролиферации. Для многих из этих генов показана возможность активации по механизму.

Кондиционированная среда НЗЗ обладает цитопротективным эффектом.

В процессе культивирования НЗЗ нами было замечено, что кондиционированная среда с клеток НЗЗ (КС-НЗЗ) значительно стимулирует жизнеспособность ряда других клеточных

линий. Мы предположили, что НЗЗ секретирует в среду фактор, оказывающий сильный анти-апоптотический эффект и способный стимулировать пролиферацию клеточных линий различного происхождения.

Для анализа этого эффекта мы решили изучить способность КС-НЗЗ защищать клетки реферной линии фибробластов человека (СопА) от апоптоза. Для индукции апоптоза мы использовали этиловый эфир метансульфониевой кислоты (ЭМС) и 5-фторурацил (5-ФУ). Антиапоптотические свойства КС-НЗЗ измеряли с помощью теста на цитотоксичность с использованием тиозалила синего (Mikula et al., 2003).

В серии пилотных исследований мы подобрали оптимальные условия эксперимента. Затем мы показали, что в присутствии 5-ФУ наблюдается падение количества выживших клеток до 41% от контрольного уровня, в то время как при совместной инкубации КС-НЗЗ и 5-ФУ количество выживших клеток возрастало до 86% (более чем в 2 раза). При использовании в качестве цитотоксического агента ЭМС, эффект был еще более выраженным, 37% и 80% соответственно (рис. 5). При этом КС-НЗЗ в отсутствие химических индукторов апоптоза не стимулировала увеличение количества живых клеток.

Рисунок 5. КС-НЗЗ обладает цитопротективным эффектом. Ицдукция апоптоза в клетках СопА под действием ЭМС. В экспериментах использованы антитела к TGFß2 (0,3 нг/мл), а также кондиционированная среда линии РСЗ (РСЗ) и очищенные препараты (1

нг/мл) в качестве контроля.

Исходя из данных об

увеличении уровня

транскрипции гена

полученных методом ОТ-

ПЦР, и результатов определения количества TGFßi в КС-НЗЗ методом ELISA (см. ниже или

рис. 11), мы предположили, что действующим началом КС-НЗЗ может быть TGFß2, который

секретируется клетками НЗЗ в среду культивирования.

Для проверки этой гипотезы мы использовали ингибирующие моноклональные антитела к TGFßi, способные необратимо и специфично связывать этот цитокин. При добавлении антител к в среду в контрольных клетках и клетках, обработанных только КС-НЗЗ или

только цитотоксическим агентом, различий в количестве выживших клеток с результатами предыдущих экспериментов не наблюдалось. При одновременной инкубации КС-НЗЗ,

индукторов апоптоза и антител к TGFßj цитопротективный эффект КС-НЗЗ был значительно снижен (до 25%) (рис. 5).

В параллельных экспериментах мы использовали кондиционированную среду клеточной линии РСЗ (КС-РСЗ), которая по литературным данным (Lu et al., 2004) секретирует TGFpY КС-РСЗ оказывает сходный с КС-НЗЗ эффект, защищая клетки от цитотоксических агентов. Добавление антител к TGFp2 к КС-РСЗ, так же, как в случае с КС-НЗЗ, подавляет цитопротективный эффект.

В качестве позитивного контроля были использованы очищенные препараты или

TGFßi, которые при добавлении в среду культивирования вместе с ЭМС или 5-ФУ оказывали цитопротективный эффект лишь незначительно слабее, чем КС-НЗЗ. Этот эффект полностью снимался добавлением антител к в смесь с в то время как в смеси с

антитела не подавляли цитопротективный эффект (рис. 5).

Полученные результаты указывают на то, что антицитотоксическое действие КС-НЗЗ, по крайней мере частично, определяется присутствием в ней TGFßj. Секреция TGFß2 является, по-видимому, следствием гиперэкспрессии гена TGFß2 в клетках дедифференцированной ГК. Аутокринная стимуляция клеток 6ГК при секреции этого цитокина представляется важным механизмом приобретения опухолевыми клетками независимости от наличия ростовых факторов и уклонения от программы апоптоза при прогрессии ГК в исследуемой системе.

КС-НЗЗ подавляет химически индуцированную активацию белка р53.

Одним из основных путей индукции апоптоза в клетке является активация белка р53, которая может приводить как к аресту клеточного цикла, так и к апоптозу (Vousden, 2000; Копнин, 2000; Hahn and Weinberg, 2002). Мы предположили, что цитопротективный эффект КС-НЗЗ основан на ее способности подавлять активацию р53.

Для проверки этой гипотезы были использованы клетки линии СопА, содержащие ген бета-галактозидазы Kcoli под контролем регуляторного района гена MDM2 человека. При активации р53 в этих клетках включается экспрессия репортерного гена бета-галактозидазы, активацию которого можно выявить с помощью окрашивания in situ. Доля окрашенных клеток отражает уровень активации р53. Для активации р53 были использованы доксирубицин (Доке) и ЭМС.

В ходе предварительных исследований были подобраны оптимальные условия эксперимента. В этих условиях при воздействии Доке р53 активируется в более чем в 84% клеток, в то время как при одновременной инкубации с КС-НЗЗ количество клеток с активированным р53 снижается в 1,6 раза, до 52%. При использовании ЭМС количество клеток с активированным р53 составляло 85% и снижалось под воздействием КС-НЗЗ до 45%, что соответствует падению в 1,9 раза (рис 6).

Рисунок 6. КС-ЮЗ подавляет активацию р53, вызванную химическими индукторами. Количество клеток с активированным р53 при воздействии ЭМС. В экспериментах использованы антитела к ТОррг (0,3 нг/мл), а также кондиционированная среда линии РСЗ (РСЗ) и очищенные препараты Т0РР[ и ТСБрг (1 нг/мл) в качестве контроля.

Исходя из

полученных результатов

была высказана гипотеза об участии ТвРр2 в этом эффекте КС-НЗЗ. Для того, чтобы проверить

эту гипотезу, мы обработали КС-НЗЗ антителами к ТвРрд. Действительно, такая обработка КС-

НЗЗ приводит к снижению ее способности подавлять активацию р53 (75% при воздействии

Доке и 77% при воздействии ЭМС).

В клетках, обработанных Доке или ЭМС и КС-РСЗ, также наблюдалось подавление активации р53 (с 92% до 57% при воздействии Доке и с 91% до 47% при воздействии ЭМС). Добавление антител к ТОрРг в среду РСЗ, так же, как в случае с КС-НЗЗ, снижало степень подавления активации р53 (до 75-78%).

Чистый цитокин ТОБР2, взятый в качестве позитивного контроля, так же, как и ТвРРи при добавлении в среду культивирования вместе с Доке или ЭМС приводил к снижению уровня активации р53 (с 92% до 45% при воздействии Доке и с 91% до 55% при воздействии ЭМС). Этот эффект полностью снимался добавлением антител к ТОРр2 в смесь с ТОГРг, в случае ТОБИ антитела были неэффективны (рис. 6).

Таким образом, мы показали, что ТОРРг, содержащийся в КС-НЗЗ, способен подавлять активацию р53, вызванную химическими индукторами. Снижение уровня активации р53 под воздействием может способствовать уклонению от апоптоза и/или снижению

чувствительности к антипролиферативным сигналам в клетках 6ГК и является важным этапом прогрессии в исследуемой системе.

Подавление синтеза ТСГ|$2 в культуре клеток 6ГК.

На основании полученных результатов нами была сформулирована гипотеза об участии ТСРр2 в контроле пролиферации и апоптоза при прогрессии ГК мышей. Для ее проверки мы провели трансформацию культуры НЗЗ ретровирусным вектором рЬРСХ, экспрессирующим малые интерферирующие РНК к гену и содержащим ген устойчивости к

пуромицину (Ьи е1 а1., 2004). В качестве контроля мы использовали тот же вектор,

экспрессирующий малые интерферирующие РНК к гену GFP (MHGFP), не экспрессирующемуся в эукариотических клетках.

После отбора клеток на устойчивость к антибиотику пуромицину было изолировано 10 отдельных клонов í(H33-mhTGFP2 КЛ 1-10), остальные клетки были объединены в смешанную культуру (H33-mhTGFP2 смесь).

Уровень экспрессии гена TGFßj в клонах H33-MmTGFß2 проверяли методом ОТ-ПЦР. Результаты, представленные на рис 11, показывают, что наибольшее падение экспрессии TGFß2 наблюдается в клонах 1,3 и 7.

Снижение уровня секреции белка TGFß2 клетками, трансформированными pLPCX MiTGFßi, определяли с помощью набора для ELISA - Quantikine-Human TGFß2 Immunoassay, R&D Systems Для дальнейших исследований были использованы клоны НЗЗ-миТвРРг 1,3 и 7, в которых наблюдалось двукратное снижение количества секретируемого TGFß2 по сравнению с контрольной культурой, трансформированной MHGFP (НЗЗ-MHGFP) В смешанной культуре количество TGFßj также было снижено, но в меньшей степени, чем в клонах. В клонах НЗЗ-миТСРрг 2, б, 11 и 12 снижения секреции TGFß2 в среду культивирования не наблюдалось.

Согласно литературным данным (Massague, 1998; Oklu et al., 2000), большая часть TGFß, секретируемого клетками, неактивна Цитокин связан с LAP-пептидом, который препятствует взаимодействию с рецепторами. Методом ELISA может быть определена только активная форма цитокина Для определения общего содержания в среде необходимо активировать

его с помощью воздействия экстремальных значений рН. Из результатов измерения количества активного и общего TGFß2 в кондиционированной среде (рис. 11) видно, что их соотношение для КС-НЗЗ или кондиционированной среды клеточной линии H33-MHTGFp2 (КС-НЗЗ-составляет приблизительно 1 к 10, что соответствует соотношению между этими формами TGFß2 в других клеточных линиях (Lu et al, 2004)

Таким образом, при трансформации клеток НЗЗ ретровирусным вектором, экспрессирующим нам удалось подавить продукцию белка в отдельных клонах

и смешанной культуре

Подавление продукции TGFßi приводит к ухудшению ростовых характеристик НЗЗ in vitro и in vivo.

Исходя из нашей гипотезы, подавление синтеза должно было привести к

снижению скорости роста клеток. Для проверки этого предположения мы исследовали способность клеток H33-mhTGFP2 к росту in vitro с помощью нескольких методов.

Мы провели сравнение кинетики пролиферации клонов 1, 7, смешанной культуры НЗЗ-MiiTGFßi и клеточной линии ЮЗ-MHGFP. Усредненные результаты 3 независимых экспериментов приведены на рис. 7. Количество клеток НЗЗ-MHGFP увеличивалось быстрее,

чем количество клеток H33-mhTGF(J2 смесь или кЛ 1,7, и к 7 дню эксперимента превышало его в 1,8 раза.

Скорость пролиферации клонов 1 и 3 H33-mhTGFP2 и линии H33-MHGFP определяли с помощью включения в ДНК 5-BrdU. Клоны H33-miiTGF|52 в 1,5 раза хуже включали метку, чем H33-MHGFP, ЧТО свидетельствует о падении скорости пролиферации в ГК со сниженным уровнем продукции TGFp2 (кл 1 - 41,2%, кл 3 - 43,75% и H33-MHGFP - 65%).

Согласно литературным данным (Lu et al., 2004), инактивация TGFP2 приводит к снижению способности клеток образовывать клоны. Для изучения этого эффекта мы использовали клоногенный тест, отражающий способность клеток к росту в большом разведении и количество жизнеспособных клеток. Типичные результаты нескольких параллельных экспериментов представлены на рис 8. Клетки кл 3 и 7 образуют

значительно меньше клонов, чем контрольная культура H33-MHGFP, кроме того, эти клоны существенно меньше по размеру.

Рисунок 7. Падение продукции снижает

ростовой потенциал НЗЗ. А. Сравнение кинетики

пролиферации кпекж НЗЗ-MHGFP И НЗЗ-mhTGFPi in vitro. Б. Кривые роста опухолей у мышей, подкожно

инъецированных 5x106 клеток линий H33-MHGFP ИЛИ НЗЗ-

mhTGFPj.

Из полученных

результатов следует, что подавление продукция TGFP2 в клетках НЗЗ приводит к снижению их ростовых характеристик in vitro.

Для изучения

влияния снижения

продукции белка TGFp2 на скорость роста опухолей in vivo был проведен туморогенный тест. Клетки линии H33-MHGFP, КЛОНСВ

1, 7 или НЗЗ-миTGFP2 смесь были инъецированы подкожно конгенным мышам (рис. 7).

На 46 сутки средний размер опухолей H33-MHGFP более чем в 3 раза превышал этот показатель для НЗЗ-MhTGFPj кл 1 или 7 (113000 мм3 и 33625 мм3 соответственно). Средний размер опухолей, образовавшихся при инъекции клетками H33-ivmTGFp2 смесь, был больше, чем размер опухолей H33-mhTGFP2 кл 1 или 7, но меньше, чем у контрольных опухолей НЗЗ-MHGFP (86475 мм3), что пропорционально падению уровня секретируемого TGFPj в этих культурах.

Мы сравнили уровень клеточной смерти в опухолях НЗЗ, НЗЗ-м иТСРрги H33-MHGFP С помощью выделения низкомолекулярной фракции ДНК из образцов соответствующих опухолей. В опухолях НЗЗ и НЗЗ-MHGFP низкомолекулярная фракция ДНК отсутствовала. В тоже время из образцов H33-mhTGFP2 такая фракция ДНК была получена, при этом «апоптотическая лестница» была размыта благодаря присутствию разноразмерных фрагментов ДНК, что указывает на наличие в этой опухоли одновременно высокого уровня некроза и апоптоза (рис. 9).

Рисунок 8. Снижение продукции приводит к

подавлению способности НЗЗ к колониеобразованию. Результаты окраски

гематоксилином клонов, выросших через 2 недели роста из 500 клеток линии НЗЗ (А) и НЗЗ-mhTGFPj клон 3 (Б).

Таким образом, в

соответствии с нашей

гипотезой, падение уровня

белка TGFP2 приводит к снижению скорости роста дедифференцированных клеток ПС как in

vitro, так и in vivo, а также к усилению апоптотических и некротических процессов при росте in

vivo.

Рисунок 9. Снижение продукции TGFp; привозит к повышению уровня апоптозав ГКш vivo. Результатывьщетениянижомолекулярной фракции ДНК из опухолей НЗЗ (1), H33-MHGFP (2) и H33-MuTGFp2 клон

1(3).

Подавление продукции TGFp2 приводит к ослаблению цитопротективного эффекта КС-НЗЗ. Если TGFp2 является фактором, определяющим антиапоптотическое действие кондиционированной среды, подавление продукции этого цитокина должно было привести к снижению цитопротективного эффекта среды, продуцируемой

клетками НЗЗ-МиТСРРг (КС-НЗЗ-МиТСРРг) по сравнению с КС-НЗЗ. Для проверки этого предположения был использован тест на цитотоксичность с использованием тиозалила синего как было описано ранее.

Рисунок 10. Цитопротективный эффект КС-НЗЗ снижается при падении количества ТСРр2 в кондиционированной среде. А.

Результаты измерения количества выживших клеток при воздействии ЭМС и КС-НЗЗ-миТОКр2 с помощью тиазолила синего. Б. КС-НЗЗ-миТСКРг обладает пониженной

способностью подавлять

активацию р53, вызванную химическими индукторами.

Полученные результаты приведены на рис. 10. Цитопротективный эффект KC-H33-mhTGFP2 клонов 1, 3 и 7 был снижен в 1,5 раза по сравнению с KC-H33-MHGFP, что соответствует снижению количества TGFß2 в КС этих клонов, согласно данным ELISA (рис. 11). Добавление антител к TGFp2, так же, как и в случае с КС-НЗЗ, приводит к дальнейшему подавлению цитопротективного эффекта.

Мы решили проверить, как повлияла инактивация TGFßj на способность КС-НЗЗ блокировать активацию р53, вызванную химическими индукторами. Оказалось, что КС-НЗЗ-MHTGFP2 клонов 1, 3 и 7 обладает меньшей способностью подавлять активацию р53, чем КС-НЗЗ-MHGFP (рис. 10). Как и в предыдущих экспериментах, добавление антител к TGFß2 к КС-практически полностью подавляло способность ингибировать

активацию р53, вызванную химическими индукторами.

Эти результаты подтверждают наш вывод о том, что TGFß2 определяет как цитопротективный эффект, так и способность КС-НЗЗ подавлять активацию р53.

Введение MHTGFp2 привело к подавлению экспрессию ряда TGFß респонсивных генов в культуре 6ГК.

Методом ОТ-ПЦР нами были исследованы изменения, произошедшие в уровнях

экспрессии генов в H33-MüTGFß2. В клонах 1, 3, 7 и смешанной культуре H33-MHTGFßj

наблюдалось снижение количества мРНК, кодирующей ген TGFßj, по сравнению с НЗЗ и НЗЗ-

MHGFP. Уровень подавления транскрипции TGFß2 в клонах был более значительным, чем в

смешанной культуре, что согласуется с результатами ELISA (рис. 11).

Рисунок 11. Изменения Е экспрессии генов,

произошедшие в НЗЗ при подавлении продукции А. ОТ-ПЦР анализ уровнек экспрессии мРНК в нормально? печени (дорожка 1), НЗЗ (2), НЗЗ-MHGFP (3),H33-MHTGFß2 смесь (4) и НЗЗ-MHTGFßj клоны 1 (5) 3 (6), 7 (7) и 6 (8). Дня контроля равенства количества РНК, взяток в реакцию, приведены результаты . ОТ-ПЦР с праймерами к GAPDH Б. Для сравнения приведены результаты измерения количества активного и общего i

кондиционированной среде методом ELISA в пкг на 1x10' клеток. Пробы расположены таь же, как на рисунке А.

Недавно опубликованы

данные о том, что обработка

некоторых клеточных культур

может приводить к подавлению количества в клетке либо на белковом (de Lucas

et a!., 2004), либо на транскрипционном уровне (Berasain et al., 2003). Исходя из этих результатов, можно было предполагать, что наблюдаемая нами при одноступенчатой прогрессии ГК репрессия гена HNF4a может быть связана с активацией TGFß сигнального пути. В таком случае можно было ожидать, что подавление продукции в культуре НЗЗ

приведет к активации транскрипции Однако методом ОТ-ПЦР нам не удалось выявить

экспрессию гена

В клонах 1 и 7, в меньшей степени в клоне 3 и смешанной культуре была снижена транскрипция генов аЗ субъединицы интегринового рецептора и фибронектина, однако мРНК EDA+ варианта присутствовала в клонах хотя ее количество было снижено, так

же как и общее количество мРНК фибронектина.

Мы показали, что в клонах наблюдается снижение уровня транскрипции

транс-факторов TGIF и TSC-22.

Одной из возможных причин снижения уровня пролиферации и скорости роста клеток H33-MHTGFp2, по нашему мнению, является снижение уровня экспрессии гена, кодирующего циклин G, который участвует в TGFP-зависимом контроле пролиферации. Одновременно в этих клеточных линиях было снижено количество мРНК гена bcl-Хц который активируется во многих опухолевых клетках в ответ на обработку TGFP и придает им нечувствительность к апоптозу, индуцируемому этим цитокином.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что частичное подавление синтеза TGFP2 в культуре клеток 6ГК привело к падению уровня экспрессии TGFP-респонсивных генов и снижению ростовых характеристик опухоли как in vitro, так и in vivo. Уменьшение уровня

вызвало снижение ее цитопротективного эффекта и способности подавлять транс-активационные свойства р53.

Заключение.

На модели одноступенчатой прогрессии ГК нами ранее было показано, что в основе целого ряда изменений, приводящих к развитию высоко злокачественного фенотипа ПС, лежит снижение уровня экспрессии основного транскрипционного регулятора генов печени -Подавление транскрипции приводит к утрате эпителиальной морфологии и подавлению

синтеза многих дифференцировочных маркеров.

В этой работе мы показали, что ре-экспрессия HNF4al в культуре клеток низкодифференцированной ГК помимо частичной реверсии уровня дифференцировки и морфологических свойств опухоли, приводит к значительному снижению ростового потенциала трансформированных клеток in vivo и in vitro. Согласно нашим данным, одной из причин снижения скорости роста при ре-экспрессии является замедление пролиферации в два

раза по сравнению с контрольными клетками. Это первое указание на то, что нарушение функции гепато-специфических транскрипционных регуляторов может стать причиной изменения пролиферационного статуса трансформированных гепатоцитов.

Мы показали, что в 6ГК и культуре ее клеток наблюдается активация TGFp-зависимого сигнального пути, вызванная гиперэкспрессией Мы установили, что снижение уровня

дифференцировки, наблюдаемое при нарушении межклеточных контактов или контактов клетка-ВКМ (в первичной культуре НМГ), или в процессе гепатоканцерогенеза (панель ГК с различным уровнем дифференцировки), приводит к активации транскрипции гена TGFP2, НО не TGFpi. Следствием активации экспрессии в дедифференцированных ГК стало усиление

транскрипции ряда генов, некоторые из которых могут способствовать

ускорению роста ГК.

Мы установили, что TGFp2, секретируемый клетками НЗЗ в среду культивирования, может оказывать цитопротективный и антиапоптотический эффект на трансформированные клетки различной видовой и тканевой специфичности. В основе антиапоптотического эффекта, оказываемого TGFP2 на клеточные культуры, согласно нашим данным, лежит подавление транс-активационных свойств опухолевого супрессора р53. Подобный эффект TGFP2 ранее не был описан.

С помощью метода РНК интерференции мы подавили синтез TGFp2 в клетках НЗЗ. В полученных клонах H33-MHITGFP2 подавление синтеза TGFP? привело к снижению экспрессии ряда генов-мишеней, а также к замедлению роста ГК in vitro и in vivo.

Таким образом, в ходе одноступенчатой прогрессии ГК наряду с репрессией гена HNF4al наблюдается усиление ростовых характеристик опухолей. Мы продемонстрировали, что транскрипция HNF4al влияет на скорость роста ГК in vitro и in vivo, но вопрос о механизмах такого влияния не был однозначно решен в ходе нашей работы. Хотя наше предположение о том, что гиперэкспрессия гена в дедифференцированных ГК способствует ускорению их

роста, подтвердилась, проведенные исследования не дали однозначного ответа на вопрос, связаны ли меязду собой активация TGFP сигнального пути и подавление экспрессии HNF4al в ходе прогрессии ГК. В клонах H33-M«TGFp2 мы не обнаружили восстановления синтеза мРНК этого гена, но возможно, что уровень подавления синтеза TGFp2 в НЗЗ был не достаточен для реактивации экспрессии Мы рассчитываем, что разработка и использование более эффективных механизмов инактивации синтеза помогут получить однозначный ответ на этот вопрос.

Два новых вопроса, появившихся в ходе нашей работы, остались не решенными. Различаются ли сигнальные пути и эффекты, индуцируемые и каким образом

активация пути приводит к подавлению транс-активационных способностей

р53? Хотя ответ на эти вопросы выходит за рамки исследования механизмов прогрессии ГК, они, безусловно, представляют большое фундаментальное значение и будут решены в ходе дальнейших исследований

выводы

1. Показан противоопухолевый и антипролиферативный эффект ре-экспрессии HNF4al в гепатокарциномах мышей.

2. В системе одноступенчатой прогрессии ГК выявлена активация TGFP сигнального пути и усиление транскрипции ряда респонсивных генов.

3. Впервые описана гиперэкспрессия гена TGFp2 в культуре нормальных мышиных гепатоцитов и при прогрессии опухолей печени.

4. Выявленные закономерности подтверждены при анализе независимо индуцированных ГК мышей с различным уровнем дифференцировки.

5. Описан цитопротективный и антиапоптотический эффект продукции TGFP2 на трансформированные клетки.

6. Впервые показана способность TGFP2 ингибировать транс-активационные свойства р53.

7. Инактивация TGFP2 в клетках дедифференцированной ГК приводит к снижению скорости пролиферации клеток в культуре и замедлению роста опухоли in vivo.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ДО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Е.В. Варга, ОА. Черемнова, Д.А. Овчинников, А.Ю. Шапигузов, Е.И. Кудрявцева, О.В. Морозова, Н.В. Энгельгардт и Н.Л. Лазаревич. Экспрессия тканеспецифических генов при прогрессии гепатокарцином мыши. "Генетика", 2001, т. 37, N 6, с. 803-810.

2. N.L. Lazarevich, O.A. Cheremnova, E.V. Varga, D.A. Ovchinnikov, E.I. Kudrjavtseva, O.V. Morozova, D.I. Fleishman, N.V. Engelhardt, S.A. Duncan. Progression of HCC in mice is associated with a downreplation in the expression ofhepatocyte nuclear factors. Hepatology, 2004; 39, pp. 1038 -1047.

3. Varga, E.I. Kudryavtzeva, O.A. Cheremnova, D.A. Ovchinnikov, A.Y. Shapiguzov, O.V. Morozova, N.V. Engelhardt and N.L.Lazarevich (1999). The re-expression of liver-specific genes in dedifferentiated hepatocarcinoma variant. The American Society for Cell Biology 39 Annual Meeting, Washington, USA, December, Mol. Bid. Cell, 10 (S): 176.

4. N.L.Lazarevich, E.I Kudrjavtseva., E.V.Varga, O.V.Morozova, O.A.Chercmnova, D.A.Ovchinnikov, A.Y.Shapiguzov, and N.V.Engelhardt. A new model for studying of hepatocarcinogenesis in mice: slow growing and fast growing transplantable hepatocarcinomas. 16 Meeting of the European Association for Cancer Research, Halkidiki, Greece - 30 May-3 June 2000, Abstract book, p. 179-180.

5. N.L.Lazarevich, E.I Kudrjavtseva., E.V.Varga, O.V.Morozova, O.A.Cheremnova, D.A.Ovchinnikov, A.Y.Shapiguzov, N.V.Engelhardt. Multiple phenotypic alterations during in vivo progression of transplantable mouse hepatocarcinoma. FASEB Summer Research Conference "Mechanisms of Liver Growth and Differentiation in Health and Disease", Snowmass, Colorado, July 29-August 3,2000. Abstract book, 33.

6. D.A. Ovchinnikov, O.A. Cheremnova, E.V. Varga, E.I. Kudrjavtseva., O.V. Morozova, A.Y. Shapiguzov, N.V. Engelhardt and N.L. Lazarevich. Effects of HNF4 reexpression on the differentiation status of fast-growing mouse hepatocarcinoma. ELSO 2000 Meeting, Geneva, Switzerland, September 2-6, 2000. Eur. J. Cell Biol., 2000,v.52,suppl.52,p.ll7.

7. N.Lazarevich, E.Varga, O.Cheremnova, D.Ovchinnikov, E.Kudrjavtseva, O.Morozova, N.Engelhardt.Tumor progression on a new model of mouse transplantable hepatocarcinomas: comparative analyses of main properties and gene expression. 7th European Meeting on Hepatocarcinogenesis "From Basic Science to Treatment", October 12-15,2001, Castiadas, Italy, Abstract book, 88.

8. N.L.Lazarevich, E.V. Varga, E.I. Kudrjavtseva, O.A. Cheremnova, D.A. Ovchinnikov, O.V. Morozova, and N.V.Engelhardt. Studying of mechanisms involved in the maintenance of hepatoma differentiation status. Role of HNF4. European Cancer Conference ECCO-11,21-25 October 2001, Lisbon, Portugal, Eur. J. Cancer, 2001,37, Suppl 6,126-127.

9. N. Lazarevich, O. Cheremnova, E. Varga, D. Ovchinnikov, E. Kudrjavtseva, O. Morozova, D. Flcichman, N. Engelhardt. Comparative analyses of main properties and gene expression during mouse hepatocellular carcinoma one-step progression. European Association for Cancer Research (EACR) 17 Meeting, Rev. Oncol., 2002,4 (Suppl. 1): 91-92.

10. N. Lazarevich, O. Cheremnova, E. Varga, D. Ovchinnikov, D. Fleishman, E. Kudrjavtseva, O. Morozova, N. Engelhardt. Tumor progression of mouse transplantable hepatocarcinomas: analyses of biological properties and gene expression. FASEB Summer Research Conference "Mechanisms of Liver Growth, Differentiation and Molecular Pathogcncsis of Hepatic Diseases", Snowmass, Colorado, 2002, Abstract book, X-15.

11. Lazarevich, N.L., Cheremnova, O.A., Ovchinnikov, DA., Fleishman, D.I.,Morozova, O.V., Engelhardt, N.V. The role of hepatocyte nuclear factors in hepatocarcinoma progression. European Association for Cancer Research (EACR) 18 Meeting, 3-6 July 2004, Innsbruck, Austria. Proceedings Book, 230.

Отпечатано в копицентре Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус.

www.stprint.ru e-mail: zakaz@stprint.ru тел. 939-3338 Заказ № 74 тираж 110 экз. Подписано в печать20.10.2004 г.

120 77e

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Овчинников, Дмитрий Александрович

Список сокращений

Введение

1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Гепатоцеллюлярные карциномы.

1.1.1. Факторы риска возникновения ГК.

1.1.1.1. Хронический вирусный гепатит.

1.1.1.2. Вирус гепатита В.

1.1.1.3. Вирус гепатита С.

1.1.1.4. Химические канцерогены.

1.1.1.5. Наследственные генетические изменения.

1.1.2. Этапы гепатоканцерогенеза.

1.1.3. Генетические основы трансформации гепатоцитов. 2 Гепатоцитарные ядерные факторы и их роль в развитии и ^з функционировании печени.

1.2.1. Семейство 1ЮТ1.

1.2.2. Семейство С/ЕВР.

1.2.3. Семейство Н^З.

1.2.4. Семейство ИЧЕб.

1.2.5. Семейство ИЧЕ4.

1.2.6. Регуляция ГЯФ.

1.2.7. ГЯФ при патологиях.

1.2.8. ГЯФ и гепатоканцерогенез.

1.3. Модель одноступенчатой прогрессии ГК мышей.

1.4. Трансформирующий фактор роста р.

1.4.1. ТСЕр лигавд.

1.4.2. Рецептор к ТСЕр.

1.4.2.1. Рецепторы к ТСЕр 3 типа.

1.4.2.2. Рецепторы к ТСЕр 1 и 2 типов.

1.4.3. Взаимодействие ТСЕр лиганд - рецептор.

1.4.4. БМАБ белки.

1.4.5. ТСЕР сигнальный путь.

1.4.6. ТСЕр респонсивные гены.

1.4.7. Прекращение ТСЕр-зависимой сигнализации.

1.4.8. Белки, взаимодействующие с рецепторами к ТСЕр.

1.4.9. SMAD-независимая сигнализация.

1.4.10. TGFP сигнальный путь и канцерогенез.

1.4.10.1. Антиопухолевая активность TGFp.

1.4.10.2. Нарушения сигнального пути TGFp в опухолях. 58 1.4.103. Про-опухолевые эффекты TGFp.

1.4.11. Эпителиально-мезенхимальный переход и TGFp.

1.4.11.1. Эпителиально-мезенхимальный переход.

1.4.11.2. Роль TGFp в эпителиально-мезенхимальном переходе.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Список использованных растворов и сред.

2.2. Линии перевиваемых гепатокарцином. 66 23. Клеточные линии.

2.4. Трансформация клеток Е. ColL

2.5. Выделение нуклеиновых кислот.

2.6. Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозных гелях. Метод "Обратная Транскрипция — Полимеразная Цепная Реакция" (ОТ-ПЦР).

2.8. Тест на цитотоксичность с использованием тиазолила синего.

2.9. Измерение уровня активации белка р53.

2.10. Измерение скорости роста ГК in vitro и in vivo.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Модель одноступенчатой прогрессии гепатокарцином мышей.

3.2. Экспрессия HNF4al влияет на ростовые характеристики ГК. . Сравнение уровня апоптоза в ГК с различным уровнем

J.Z.I. , , /о дифференцировки. . . Влияние экспрессии HNF4al на уровень пролиферации и оп

5.Z.L. . . oU скорость роста 6ГК in vitro.

3.23. Ре-экспрессия HNF4al снижает скорость роста 6ГК in vivo. ^ Сравнение уровней экспрессии генов, вовлеченных в g^ контроль пролиферации и апоптоза, в 6ГК и мГК.

2 2 2 Гиперэкспрессия TGFp респонсивных генов при g^ одноступенчатой прогрессии ГК.

Исследование спектров экспрессии TGFp-респонсивных генов

3.3.2. и генов, участвующих, в TGFp-зависимом сигнальном пути, 83 методом ОТ-ПЦР. j 2 Изменения уровней экспрессии генов, участвующих в gg контроле пролиферации и апоптоза в гепатоцитах. . Кондиционированная среда НЗЗ обладает цитопротективным оа

J.4. , . о? эффектом.

2 g КС-ЮЗ подавляет химически индуцированную активацию ^ белка р53.

3.6. Подавление синтеза TGF02 в культуре клеток 6ГК.

3.6.1. Трансформация НЗЗ вектором, экспрессирующим ми TGF02«

3.6.2. Определение количества TGFfh в кондиционированной среде. ^ з Подавление продукции TGF02 приводит к ухудшению ^^^ ростовых характеристик НЗЗ in vitro и in vivo.

2 g 4 Снижение синтеза TGF02 приводит к ослаблению ^ цитопротективного эффекта КС-НЗЗ.

Введение mhTGF02 привело к подавлению экспрессию ряда ^^^ TGFP респонсивных генов в культуре 6ГК.

4. ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. HNF4al влияет на уровень пролиферации и скорость роста ГК.

4.2. TGFP сигнальный путь активирован в 6ГК.

TGF02, продуцируемый НЗЗ в среду, обладает цитопротективным эффектом. ^ Инактивация синтеза TGF02 приводит к ухудшению ростовых ^ ^ характеристик ГК.

Подавление синтеза TGFp2 привело к снижению уровня ^ экспрессии генов-мишеней TGF0.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Факторы, влияющие на пролиферацию и апоптоз в мышиных гепатокарциномах различного уровня дифференцировки"

Канцерогенез - сложный и многостадийный процесс, для реализации которого необходимо множество последовательных событий. Исследования показывают, что процесс появления опухоли можно условно разделить на 3 этапа. На первом этапе (инициация) происходит накопление мутаций в генах, приводящих к нарушению контроля пролиферации в клетках. В ходе второго этапа (промоция) трансформированные клетки, преодолевают сдерживающие влияние тканевого микроокружения и образуют пренеопластический фокус. На третьем этапе, получившем название прогрессия, происходит усиливающееся накопление генетических изменений, ведущее к приобретению клетками злокачественного фенотипа. Изменения, происходящие в трансформированных клетках на этой стадии, приводят к их клональной экспансии и образованию опухоли [1,2].

Одним из основных событий канцерогенеза является усиление пролиферации опухолевых клеток и уклонение их от программируемой клеточной смерти (апоптоза) [35]. На это направлены многие из генетических изменений, происходящих в опухолевых клетках.

Для большинства типов опухолей также характерна постепенная утрата маркеров дифференцировки и подавление экспрессии генов, препятствующих размножению опухолевых клеток (опухолевые супрессоры), или не требующихся опухоли для поддержания ее жизнедеятельности (антигенное упрощение) [6]. Поэтому снижение уровня дифференцировки также относится многими авторами к числу основных событий канцерогенеза [3-5].

Эти три основных признака опухолевой клетки (скорость пролиферации, уровень апоптоза и уровень дифференцировки) тесно связаны между собой. Изучение молекулярных механизмов, лежащих в основе взаимосвязи между этими процессами, является важным и перспективным направлением исследований в современной молекулярной биологии и онкологии. С их помощью могут быть расширены представления о взаимосвязи фундаментальных клеточных процессов и открыты новые мишени для лекарственной терапии, а также разработаны принципиально новые подходы к лечению рака.

В последние годы во всем мире наблюдается рост частоты возникновения гепатоцеллюлярных карцином (ГК) - наиболее часто встречающегося вида опухолей печени и одной из наиболее распространенных форм рака. Ежегодно в мире выявляются до 1 ООО ООО новых больных с диагнозом ГК [7, 8]. В некоторых регионах ГК являются основной причиной смертности от новообразований.

К факторам риска для возникновения ГК следует отнести вирусы гепатита В или С (НВУ или НСУ), ряд химических канцерогенов, цирроз печени любого происхождения и некоторые другие факторы [7, 9]. Быстрое распространение вирусов НВУ и НСУ ведет к увеличению частоты встречаемости ГК в мире. Изучение процессов, лежащих в основе появления ГК, привело к выявлению ряда генов, участвующих в возникновении и развитии этой патологии. К ним можно отнести гены, кодирующие факторы роста (Трансформирующий фактор роста ТвРа и -0, фактор роста гепатоцитов НОР и др.), их рецепторы, опухолевые супрессоры (р53 и рШэ и др.), молекулы межклеточных контактов и адгезии [10].

ГК в течение длительного времени являются моделью для изучения как общих, так и ткане-специф ических механизмов канцерогенеза. В этом типе опухолей было открыто явление ре-экспрессии эмбрио-специфических белков [11] и первый из онкоэмбриональных маркеров - альфа-фетопротеин (АФП) [12-14].

Накопленный массив данных о механизме контроля уровня дифференцировки, пролиферации и апоптоза делает ГК интересным объектом для изучения способов взаимодействия между этими процессами.

Недавно было показано, что прогрессия ГК может быть связана с нарушением функции гепатоцитарных ядерных факторов (ГЯФ), которые являются одними из основных регуляторов экспрессии генов, специфичных для печени [15, 16]. Важнейшим из ГЯФ во взрослой печени представляется ядерный рецептор гепатоцитарного ядерного фактора (1ЮТ4а1) [17]. Показана его связь с уровнем дифференцировки в ГК [18], но остается нерешенным вопрос о его связи с общими механизмами контроля уровня пролиферации и апоптоза.

Цитокины семейства ТСРР являются одними из основных кандидатов на роль связующего звена между печень-специфическими и общими сигнальными путями, задействованными в процессе канцерогенеза. Показано, что члены этого семейства участвуют в поддержании дифференцировочного статуса, а также в контроле пролиферации и апоптоза, как в печени, так и в других органах [19-22].

Данные о роли ТСРР в канцерогенезе противоречивы. ТСР01 был открыт как фактор, стимулирующий рост опухолей, но в дальнейшем было показано, что ТСБр! ингибирует рост и развитие многих типов опухолей [19]. В последнее время выяснилось, что эффект ТСРР зависит от стадии канцерогенеза и особенностей исходной ткани, из которой произошла опухоль [20,22,23].

Для изучения факторов, контролирующих апоптоз и пролиферацию, и их связи с уровнем дифференцировки опухолей мы использовали уникальную модель одноступенчатой прогрессии ГК, полученную и охарактеризованную в нашей лаборатории [24, 25], а также коллекцию независимо индуцированных ГК мышей с различным уровнем дифференцировки для проверки универсальности полученных результатов.

Цели и задачи исследования.

Цель настоящей работы состояла в поиске факторов, ответственных за различие в скорости пролиферации и уровня апоптоза между опухолями печени с различным уровнем дифференцировки, составляющими модель одноступенчатой прогрессии ГК. В ходе работы решались следующие основные задачи:

1. Изучение влияния HNF 4а1 на уровень пролиферации и апоптоза в ГК.

2. Анализ изменений экспрессии генов, участвующих в контроле пролиферации и апоптоза, при одноступенчатой прогрессии ГК.

3. Проверка универсальности выявленных закономерностей на панели независимо индуцированных ГК мышей с разным уровнем дифференцировки.

4. Идентификация фактора, ответственного за усиление пролиферации и снижение уровня апоптоза в ходе одноступенчатой прогрессии ГК.

5. Описание эффектов инактивации этого фактора на скорость роста ГК in vitro и in vivo.

Научная новизна и практическая ценность работы.

В течение длительного времени исследования генетических основ прогрессии ГК были сфокусированы на изучении функции основных клеточных онкогенов и антионкогенов в ходе гепатоканцерогенеза. В данной работе показано, что экспрессия гена гепато-специфического транскрипционного фактора HNF4al приводит к подавлению роста ГК, как in vitro, так и in vivo.

С другой стороны мы обнаружили, что клетки дедифференцированной высокозлокачественной. ГК секретируют фактор TGFP2, стимулирующий их пролиферацию и обладающий выраженным анти-апоптотическим эффектом.

Было показано, что в ходе прогрессии ГК, а так же при дедифференцировке нормальных мышиных гепатоцитов в культуре наблюдается гиперэкспрессия этого цитокина. Выявленная закономерность, скорее всего, носит универсальный характер, так как она была подтверждена в ходе исследований коллекции независимо индуцированных ГК с различным уровнем дифференцировки. Гиперэкспрессия TGFP2 сопровождается активацией многих TGFP респонсивных генов.

Впервые показана способность членов семейства TGFß (TGFßi, TGFß2) подавлять активацию р53. Можно предполагать, что этот эффект лежит в основе анти-апоптотического действия TGFß2

В работе продемонстрировано, что инактивация TGFß2 приводит к подавлению скорости пролиферации клеток и снижает скорость роста ГК у экспериментальных животных.

Изучение механизмов прогрессии опухолей печени относится к числу фундаментальных проблем современной онкологии и может способствовать разработке новых методов терапии злокачественных новообразований. В ходе работы выявлены потенциальные прогностические маркеры (TGFß2, фибронектин, Tbi68, TGIF) и мишени для терапии (TGFß2) ГК.

Апробация работы.

Диссертация была апробирована на совместном заседании кафедры вирусологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова и лаборатории иммунохимии НИИ Канцерогенеза ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН 9 октября 2003 года. Материалы исследований, представленных в работе, докладывались на 1 конференции Европейской организации естествоиспытателей (Женева, 2000), 16, 17 и 18 конференциях Европейского общества исследователей рака (Халкидики, 2000; Гранада, 2002; Иннсбрук, 2004), 11 конференции Европейских раковых организаций (Лиссабон, 2001), конференциях «Механизмы дифференцировки и патогенеза печени» Федерации американских обществ экспериментальной биологии (Колорадо, 2000 и 2002) и на ученых советах НИИ Канцерогенеза ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых изданиях и 9 тезисов международных конференций.

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста (12 шрифт, полуторный интервал), содержит 22 рисунка, 6 таблиц. Состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследования», «Обсуждение результатов», «Выводы» и «Список литературы». Список литературы содержит 307 источников, в том числе 17 в отечественных рецензируемых изданиях.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Овчинников, Дмитрий Александрович

выводы.

1. Показан противоопухолевый и антипролиферативный эффект ре-экспрессии HNF4al в гепатокарциномах мышей.

2. В системе одноступенчатой прогрессии ГК выявлена активация TGFP сигнального пути и усиление транскрипции ряда респонсивных генов.

3. Впервые описана гиперэкспрессия гена TGFP2 в культуре нормальных мышиных гепатоцитов и при прогрессии опухолей печени.

4. Выявленные закономерности подтверждены при анализе независимо индуцированных ПС мышей с различным уровнем дифференцировки.

5. Описан цитопротективный и антиапоптотический эффект продукции TGFP2 на трансформированные клетки.

6. Впервые показана способность TGFP2 ингибировать транс-активационные свойства р53.

7. Инактивация TGFP2 в клетках дедифференцированной ПС приводит к снижению скорости пролиферации клеток в культуре и замедлению роста опухоли in vivo.

Заключение.

На модели одноступенчатой прогрессии ГК нами ранее было показано, что в основе целого ряда изменений, приводящих к развитию высоко злокачественного фенотипа ПС, лежит снижение уровня экспрессии основного транскрипционного регулятора генов печени — HNF4al. Подавление транскрипции HNF4al приводит к утрате эпителиальной морфологии и подавлению синтеза многих дифференцировочных маркеров.

В этой работе мы показали, что ре-экспрессия HNF4al в культуре клеток низкодифференцированной ПС помимо частичной реверсии уровня дифференцировки и морфологических свойств опухоли, приводит к значительному снижению ростового потенциала трансформированных клеток in vivo и in vitro. Согласно нашим данным, одной из причин снижения скорости роста при ре-экспрессии HNF4al является замедление пролиферации в два раза по сравнению с контрольными клетками. Это первое указание на то, что нарушение функции гепато-специфических транскрипционных регуляторов может стать причиной изменения пролиферационного статуса трансформированных гепатоцитов.

Мы показали, что в 6ГК и культуре ее клеток наблюдается активация TGFP-зависимого сигнального пути, вызванная гиперэкспрессией TGFP2. Мы установили, что снижение уровня дифференцировки, наблюдаемое при нарушении межклеточных контактов или контактов клетка-ВКМ (в первичной культуре НМГ), или в процессе гепатоканцерогенеза (панель ПС с различным уровнем дифференцировки), приводит к активации транскрипции гена TGFP2, но не TGFPi. Следствием активации экспрессии TGFp2 в дедифференцированных ПС стало усиление транскрипции ряда TGFP-респонсивных генов, некоторые из которых могут способствовать ускорению роста ПС.

Мы установили, что TGFP2, секретируемый клетками ЮЗ в среду культивирования, может оказывать цитопротективный и антиапоптотический эффект на трансформированные клетки различной видовой и тканевой специфичности. В основе антиапоптотического эффекта, оказываемого TGFP2 на клеточные культуры, согласно нашим данным, лежит подавление транс-активационных свойств опухолевого супрессора р53. Подобный эффект TGFP2 ранее не был описан.

С помощью метода РНК интерференции мы подавили синтез TGFp2 в клетках НЗЗ. В полученных клонах H33-mhTGFP2 подавление синтеза TGFP2 привело к снижению экспрессии ряда генов-мишеней, а также к замедлению роста ПС in vitro и in vivo.

Таким образом, в ходе одноступенчатой прогрессии ГК наряду с репрессией гена HNF4al наблюдается усиление ростовых характеристик опухолей. Мы продемонстрировали, что транскрипция HNF4al влияет на скорость роста ГК in vitro и in vivo, но вопрос о механизмах такого влияния не был однозначно решен в ходе нашей работы. Хотя наше предположение о том, что гиперэкспрессия гена TGF02 в дедифференцированных ГК способствует ускорению их роста, подтвердилась, проведенные исследования не дали однозначного ответа на вопрос, связаны ли между собой активация TGFP сигнального пути и подавление экспрессии HNF4al в ходе прогрессии ГК. В клонах H33-mhTGFP2 мы не обнаружили восстановления синтеза мРНК этого гена, но возможно, что уровень подавления синтеза TGFP2 в НЗЗ был не достаточен для pe-активации экспрессии HNF4al. Мы рассчитываем, что разработка и использование более эффективных механизмов инактивации синтеза TGFP2 помогут получить однозначный ответ на этот вопрос.

Два новых вопроса, появившихся в ходе нашей работы, остались не решенными. Различаются ли сигнальные пути и эффекты, индуцируемые TGFPi и TGFP2, и каким образом активация TGFP-сигнального пути приводит к подавлению транс-активационных способностей р53? Хотя ответ на эти вопросы выходит за рамки исследования механизмов прогрессии ГК, они, безусловно, представляют большое фундаментальное значение и будут решены в ходе дальнейших исследований.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Овчинников, Дмитрий Александрович, Москва

1. Faber, Е., The sequental analysis of liver cancer induction. Biochem Biophys Acta, 1980. 605: p. 149-166.

2. Pitot, H. and Y. Dragan, Facts and theories concerning the mechanisms of carcinogenesis. FASEB J., 1991. 5: p. 2280-6.

3. Hahn, W. and R.A. Weinberg, Rules for making human tumor cells. N Engl J Med, 2002. 347(20): p. 1593-1603.

4. Копнин, Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманиюь базовых механизмов канцерогенеза. Биохимия, 2000. 65(1): р. 5-33.

5. Hanahan, D. and R.A. Weinberg, The Hallmarks of Cancer. Cell, 2000. 100: p. 57-70.

6. Абелев, Г.И. Опухолевый рост как проблема биологии развития, ed. В.И. Гелыптейн. 1979, Москва: Наука. 148-173.

7. Feitelson, М.А., В. Sun, N.L. Satiroglu Tufan, J. Liu, J. Pan, and Z. Lian, Genetic mechanisms of hepatocarcinogenesis. Oncogene, 2002. 21(16): p. 2593-604.

8. Заридзе, Д.Г. Этиология, эпидемиология и патогенез злокачественных опухолей. Справочник по онкологии. Н.Н. Трапезников, Editor. 1996, КАППА: Москва, р. 425.

9. Лазаревич, Н.Л. Молекулярные механизмы прогрессии опухолей печени. Успехи биологической химии, 2004. 44: р. в печати.

10. Buendia, М.А., Genetics of hepatocellular carcinoma. Semin Cancer Biol, 2000. 10(3): p. 185-200.

11. Абелев, Г.И. Механизмы дифференцировки и опухолевый рост. Биохимия, 2000. 65(1): р. 127-38.

12. Abelev, G.I., Alpha-fetoprotein biology. Sov. Sci. Rev. D. Physicochem. Biol., 1993.11: p. 85-109.

13. Abelev, G.I., S. Perova, N.I. Khramkova, Z.A. Postnikova, and I. Irlin, Production of embrional alpha-globulin by the transplantable mouse hepatomas. Transplant. Bull, 1963. 1: p. 174-180.

14. Комов, Д.В. Опухоли печени, Справочник по онкологии. Н.Н. Трапезников, Editor. * 1996, КАППА: Москва, р. 275-293.

15. Spath, G.F. and M.C. Weiss, Hepatocyte nuclear factor 4 provokes expression of epithelial marker genes, acting as a morphogen in dedifferentiated hepatoma cells. J Cell Biol, 1998. 140(4): p. 935-46.

16. Duncan, S. A., Mechanisms controlling early development of the liver. Mech Dev, 2003. 120(1): p. 19-33.

17. Massague, J., TGF-beta signal transduction. Annu Rev Biochem, 1998. 67: p. 753-91.

18. Derynck, R., R.J. Akhurst, and A. Balmain, TGF-b signaling in tumor suppression and cancer progression. Nat Genet, 2001. 29: p. 117-29.

19. Piek, E. and A.B. Roberts, Suppressor and oncogenic roles of transforming growth factor-b and its signaling pathways in tumorigenesis. Advances in cancer research, 2001. 83: p. 1-53.

20. Bissell, D.M., D. Roulot, and J. George, Transforming growth factor b and the liver. Hepatology, 2001.34(5): p. 859-67.23