Зависимость строения аппарата Гольджи от состояния клеточного центра в гепатоцитах мыши

Сысоева, Вероника Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Зависимость строения аппарата Гольджи от состояния клеточного центра в гепатоцитах мыши
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Зависимость строения аппарата Гольджи от состояния клеточного центра в гепатоцитах мыши"

На правахрукописи

СЫСОЕВА ВЕРОНИКА ЮРЬЕВНА

ЗАВИСИМОСТЬ СТРОЕНИЯ АППАРАТА ГОЛЬДЖИ ОТ СОСТОЯНИЯ КЛЕТОЧНОГО ЦЕНТРА В ГЕПАТОЦИТАХ МЫШИ

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2004

Работа выполнена на кафедре клеточной биологии и гистологии Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор Онищенко Галина Евгеньевна

Официальные оппоненты

доктор биологических наук Марина Николаевна Болтовская кандидат биологических наук Елена Ивановна Домарацкая

Ведущая организация

Российский Государственный Медицинский Университет

Зашита состоится

2004 г. в 15 часов 30 минут на заседании Диссертационного

Совета Д.501.001.52 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, д. 1, корп. 12, МГУ, Биологический факультет, ауд.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. MB. Ломоносова.

Автореферат разослан « о/Ш^^М-Щ 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Калистратова Е.Н.

«Чтобы предмет стал интересным, достаточно на него долго смотреть» Гюстав Флобер

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Показано, что центриолярный аппарат и элементы щггоскелета играют важную роль в организации клеточных органелл, и в частности аппарата Гольджи (Lippincott-Schwartz,; 1998; Glick, 2000; Rios, Bornens, 2003). Объектами таких исследований являются главным образом клетки перевиваемых культур.

Данные, полученные при исследовании клеток in situ, свидетельствуют о том, что в онтогенезе многоклеточных организмов центросома динамично изменяется (Ralston, 1993). В дифференцированных клетках состояние клеточного центра и полярная организация клетки может быть различной в зависимости от выполняемых ею функций (Москвин-Тарханов, Онищенко, 1978; Tassin et al., 1985; Bloom, Fawcett, 1986; Абумуслимоз и др., 1991; Снигиревская, Комиссарчик, 1995; Ladinsky et al., 1999; Rubina et al., 1999; Krioutehkova, Onishchenko, 1999). Вступление клеток в пролиферацию, изменения функциональной активности в ходе клеточного цикла или под действием внешних факторов, а также в результате трансформации приводит к реорганизации клеточного центра (Онищенко, 2000).

Преобразования аппарата Гольджи, происходящие в онтогенезе, а также организация комплекса Гольджи в специализированных клетках описана недостаточно. Например, известно, что в дифференцированных гепатоцитах клеточный центр неактивен, как центр организации микротрубочек (ЦОМТ) (Онищенко, Ченцов, 1986). Возникает вопрос, как в этих условиях организован аппарат Гольджи, учитывая высокую функциональную активность клеток печени.

При регенерации печени гепатоциты вступают в клеточный цикл. Этот процесс сопровождается активацией центросомы в качестве центра организации микротрубочек (Онищенко, Ченцов, 1986). Таким образом, пролиферирующие гепатоциты представляют собой подходящую модель для изучения реорганизации аппарата Гольджи в клетках in situ в ходе клеточного цикла и исследования роли центросомы в этих преобразованиях.

frac НАЦИОНАЛЬНАЯ СИСЛЯОГЕКА

о?™

клеток, которое в свою очередь определяется уровнем дифференцировки, плоидностью клеток, интенсивностью тканеспецифических синтезов и другими факторами.

6 клетках печени в норме события цснтриолярного и ядерного цикла координированы. Однако, известны случаи, когда репликация центриолей может идти независимо от репликации ДНК (Stublefield, De Foor, 1972; Rattner, Phillips, 1973; Kuriyama et al., 1986; Gart et al., 1990; Sluder et al., 1990; Balczon et al., 1995). На гепатоцитах регенерирующей печени разработана модель Gj-блока при действии дипина (Урываева, Фактор, 1988), позволяющая вызвать разобщение центриолярного и ядерного циклов в гепатоцитах (Крючкова и др., 1986). Применение гидроксимочевины, блокирующей клетки на границе G]/S, дает возможность исследовать, как в этих условиях ведет себя аппарат Гольджи и центросома.

Для решения вопроса о зависимости параметров аппарата Гольджи от уровня синтетической активности удачным объектом являются линии гепатокарцином, растущие in vivo и в суспензии, для которых описаны признаки утраты тканеспецифических синтезов (Энгельгардт и др., 2001; Варга и др., 2001; Кудрявцева и др., 2001; Лазаревич 2003). Дель и задачи исследования. Основная цель настоящей работы состояла в выявлении того, как в гепатоцитах структурно-функциональное разнообразие клеточного центра сказывается на параметрах и топологии аппарата Гольджи: в онтогенезе, в клеточном цикле, при блоке пролиферации, а также при разных вариантах трансформации гепатоцитов мыши. Предполагалось сопоставить характер организации центросомы и отдельных элементов цитоскелета с расположением и тонким строением аппарат Гольджи. В работе были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать организацию и параметры аппарата Гольджи в области клеточного центра в гепатоцитах интактной и регенерирующей печени мыши.

2. Исследовать особенности строения клеточного центра и аппарата Гольджи в гепатоцитах печени новорожденных пятидневных мышей.

3. Используя воздействие гидроксимочевиной (Gj/S блок) и д и п и((н блж)| а пролиферирующие гепатоциты, проанализировать влияние ядерного и центриолярного циклов на параметры аппарата Гольджи при блокировании клеточного цикла.

4. Исследовать организацию центросомы и параметры аппарата Гольджи в клетках гепатокарцином, отличающихся по выраженности тканеспецифических признаков.

Научная новизна работы. В работе предложен морфометрический метод, основанный на статистической обработке измерений длин диктиосом аппарата Гольджи в области клеточного центра на электронно-микроскопическом уровне. Анализ средних значений длин диктиосом позволяет сопоставить организацию аппарата Гольджи в гепатоцитах на

! 2

, у.»•-<•.*'i ••

разных стадиях онтогенеза, в разных фазах клеточного цикла и при блокировании гепатоцитов в Gj/S и G2 фазах, а также в разных вариантах гепатокарцином.

Впервые показано, что в печени взрослых животных аппарат Гольджи гепатоцитов, находящихся в Go фазе клеточного цикла (фаза пролиферативного покоя), представлен диктиосомами небольшой протяженности, локализованными в разных участках цитоплазмы гепатоцита. Причем, размер диктиосом аппарата Гольджи в области клеточного центра не зависит от гиоидности клетки.

В работе впервые in situ исследован характер взаимосвязи между ядерным и центросомным циклами и преобразованиями аппарата Гольджи. Показано, что в пролиферирующих гепатоцитах в ходе клеточного цикла длины диктиосом аппарата Гольджи в области клеточного центра увеличиваются, начиная с фазы, и достигают максимальных размеров к фазе, а в фазе-уменьшаются.

Важными следует считать данные о том, что гидроксимочевина, вызывая блок гепатоцитов на границе фаз, не оказывает разобщающего действия на центриолярный и ядерные циклы. Судя по структуре центросомы и параметрам аппарата Гольджи, данный агент инициирует переход гепатоцитов в Go фазу, в отличие от клеток СНО (Balczon et al., 1995).

Новыми являются данные о том, что в печени взрослых животных в гепатоцитах фазы, лишенных радиальной системы микротрубочек, присутствуют плотные пучки промежуточных филаментов, оплетающих центриолярные цилиндры. Это позволяет предположить, что в данном типе клеток в организации промежуточных филаментов принимает участие именно центросома.

Впервые показано, что строение клеточного центра и параметры аппарата Гольджи гепатоцитов в раннем постнатальном развитии имеют признаки, характерные для гепатоцитов печени взрослых животных в Gi фазе клеточного цикла.

Новыми явились данные о том, что в разных вариантах гепатокарцином по мере утраты клетками тканеспецифических свойств наблюдается снижение средней протяженности диктиосом в области клеточного центра при сохранении его активности в качестве ЦОМТ.

Практическое значение работы. Метод измерения длин цистерн аппарата Гольджи и последующей оценки изменений его морфологии может быть применен не только для анализа гепатоцитов, но и для других типов клеток in situ и клеток перевиваемых культур. Кроме того, параметры аппарата Гольджи можно использовать, как показатель степени утраты трансформированными клетками тканеспецифических функций, что, возможно, найдет свое применение в онкологии.

Знание вероятных вариантов ультраструктурных перестроек клеточного центра и аппарата Гольджи позволяет разработать критерии для оценки функционального состояния гепатоцитов при таких процессах, как изменение функциональных нагрузок, вызванных, например, изменением рациона питания, при патологиях в результате химических и инфекционных воздействий, при репаративных процессах и в ходе трансформации. Апробация работы. Результаты диссертационной работы представлены на XVIII Российской конференции по электронной микроскопии (Черноголовка, 2000) и на I Съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург 2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано четыре печатные работы. Структура и объем работы. Диссертация состоит из глав «Введение», «Обзор литературы», «Объекты и методы исследования», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на страницах, включает 25 иллюстраций, 26 гистограмм, 2 таблицы и список литературы из 412 публикаций,

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Объекты исследования. Исследования проводились на гепатоцитах мышей линии СВА/С57В16 (питомник «Столбовая» РАМН).

Во всех экспериментах кусочки ткани для фиксации и получения отпечатков брали из разных долей печени.

1. В работе использованы кусочки печени 3-х новорожденных пятидневных мышей весом 4 г. (15 гепатоцитов)

2. Для исследования ультраструктуры гепатоцитов разной плоидности интактной печени использовали кусочки и отпечатки печени мышей 2-3 месячного возраста весом от 19 до 28 г. (9 гепатоцитов in situ, и 14 гепатоцитов на отпечатках)

3. Для исследования гепатоцитов на разных стадиях клеточного цикла получали отпечатки регенерирующей печени на покровных стеклах. (16 гепатоцитов в Gi фазе клеточного цикла, 14 гепатоцитов в S фазе клеточного цикла, и 6 гепатоцитов в Gi фазе клеточного цикла.

Регенерацию печени вызывали удалением 70% печени по методу Хигтинса и Андерсона под эфирным наркозом (Higgms, Anderson, 1931).

Для идентификации гепатоцитов в разных фазах клеточного цикла на отпечатках печени использовали радиоавтографический метод двойного мечения (Онищенко и др., 1978). Дополнительным маркером положения исследуемой клетки в цикле служило строение центриолярного комплекса (Онищенко, Ченцов, 1986). Гепатоциты интактной печени считали находящимися в Go-фазе.

4. Для исследования гепатоцитов регенерирующей печени, заблокированных в Gi фазе, мышам вводили раствор гидроксимочевины («Serva») в дозе 152мкг/г в 0,3 мл физиологического раствора через 30 часов после частичной гепатэктомии. Затем животных забивали через 36 и 44 часа после операции. Контрольным животным проводили ложную операцию (исследовали 6 гепатоцитов через 36 часов и 9 гепатоцитов через 44 часа).

5. Для получения популяции гепатоцитов, находящихся в фазе, использовали модель, разработанную в лаборатории цитологии Института Биологии Развития (Урываева, Фактор, 1988) За 2 часа до частичной гепатэктомии внутрибрюшинно вводили дипин (Химико-фармацевтический институт им. С.Орджоникидзе) в дозе 60 мг/кг в 0.2мл физиологического раствора, а затем через 2 часа после введения делали стандартную частичную гепатэктомию под эфирным наркозом. Кусочки печени брали через 44,72 и 96 часов. (Проанализировано 4 гепатоцита через 44 часа, 2 гепатоцита через 72 часа и 7 гепатоцитов через 96 часов)

6. В работе исследованы фрагменты двух вариантов медленнорастущих высокодифференцированных гепатокарцином сохранивших эпителиальный фенотип и основные печеночные маркеры, и клетки быстрорастущей гепатокарциномы мыши in vivo. Гепатокарциномы были выращены in vivo и выделены из брюшной полости мыши. Также исследованы клетки суспензионной гепатокарциномы, выращенные в пластиковых флаконах на среде DMEM («Sigma») с добавлением 10% фетальной коровьей сыворотки («Gibco»). Все гепатокарциномы любезно предоставлены для электронно-микроскопического исследования Н.В.Энгельгардт (лаборатория иммунохимии НИИ Канцерогенеза РОНЦ им. НН.Блохина РАМН). (Исследовано 7 клеток медленнорастущих гепатокарцином in vivo, 6 клеток быстрорастущей гепатокарциномы in vivo и 10 клеток суспензионной гепатокарциномы)

Электронная микроскопия. Для электронно-микроскопического исследования образцы печени, отпечатки печени и клетки гепатом фиксировали 2.5 % глутаровым альдегидом («Sigma») в смеси с 2 % формалином на 0.1М фосфатном буфере (PBS, «ICN»). После дофиксации 1% раствором OsO4 клетки обезвоживали по стандартной методике и затем заключали в эпон 812 («Fluka»).

Отобранные клетки и кусочки печени резали на серийные ультратонкие срезы (200250 срезов) на ультрамикротоме LBK-II.

Серийные ультратонкие срезы монтировали на бленды, контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца и анализировали с использованием электронных трансмиссионных микроскопов HU 11, HU-12, JEM-100В, JeoI-lOOCX.

Методы измерения. Измерения протяженности цистерн аппарата Гольджи проводили на негативах, предварительно отсканированных и отредактированных программой Adobe Photoshop 5.5 («Adobe Systems Incorporated»). Для количественной оценки параметров аппарата Гольджи применяли программу Image-Pro Plus 3.0 («Media Cybernetics») с последующей статистической обработкой результатов.

Для калибровки изображения и проведения измерений использовали поперечное сечение проксимального конца центриолей (0.2 мкм). На серийных ультратонких срезах отдельных клеток измеряли длины профилей всех диктиосом аппарата Гольджи в районе клеточного центра, попавших на срез. Измерения проводили в радиусе 3,5 мкм от группы центриолей (Схема 1). В случае если две диктиосомы находились на расстоянии, меньшем или равном поперечному сечению цистерн, их длины суммировали и считали одной диктиосомой. В настоящем исследовании нас интересовала в первую очередь максимальная протяженность диктиосом. Если на срезе в составе диктиосомы были хорошо различимы несколько цистерн, то измеряли одну - самую длинную - и это значение принимали за длину дикгиосомы. Измерепия везикул, локализованных в зоне клеточного центра, не проводили. Каждая из исследованных клеток была представлена разным числом изображений ультратонких срезов, проходящих через область клеточного центра. В разных клетках было сделано от 2 до 146 измерений.

Схсма1. Область гепатоцита, в которой проводили измерения длины диктиосом аппарата Гольджи. В каждой из диктиосом измеряли длину одной самой длинной цистерны.

Методы статистической обработки. Поскольку плоскости срезов ориентированны произвольно относительно стопок цистерн аппарата Гольджи, все измерения считались случайными измерениями и были использованы для статистической обработки данных.

По результатам измерений строили гистограммы распределения длин дикгиосом в клетках разных групп для анализа характера распределения

Применяя статистический пакет Microsoft Excel (Корпорация Microsoft), определяли среднее значение длины диктиосомы и стандартную ошибку для множества измерений, относящихся к эксперименту Среднее максимальное значение длины диктиосомы для каждого эксперимента получали, как среднее значение максимальных длин диктиосом всех клеток, исследованных в эксперименте

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Аппарат Гольджи гепатоцитов интактной печени взрослых мышей

Проведен статистический анализ длин диктиосом аппарата Гольджи для клеток интактной печени, а также морфологическое изучение диктиосом аппарата Гольджи в области цитоплазмы, прилегающей к центриолям. Выявлено преобладание в составе аппарата Гольджи диктиосом сравнительно небольшой длины

Для решения вопроса о том, зависит ли общая протяженность диктиосом аппарата

Гистограмма1 Суммарные чипы диктиосом аппарата Гольджи в области клеточного центра гепатоцктов интактной печени. Каждой клетке соответствует один столбик. Высота столбика складывалась из длин диктиосом аппарата Гольджи, измеренных на четырех срезах, содержащих центриоли. В основании каждого столбика располагается фрагмент, соответствующий максимальному значению длины диктиосомы аппарата Гольджи для данной клетки. Рядом с номером клетки указана ее плоидностъ

Гольджи от плоидности клетки, были проведены измерения длин цистерн аппарата Гольджи для гепатоцитов разной плоидности. Исследовали по четыре случайных среза, проходящих через область клеточного центра, для семи клеток (гистограмма 1). При условии, что толщина диктиосом во всех случаях одинакова, и толщина срезов одинакова, можно ожидать, что суммарная длина диктиосом аппарата Гольджи в области, прилежащей к центриолям, коррелирует с его объемом. Пользуясь этим допущением, была сделана попытка оценить общую протяженность диктиосом аппарата Гольджи, окружающих центриоли, и сопоставить этот показатель с плоидностью клетки. Расчет плоидности каждой клетки проводили, исходя из диаметра ядра, измеренного на световом уровне (Бродский 1966), а также исходя из числа центриолей, которое, как известно, соответствует плоидности гепатоцитов (Оншценко 1978). Анализ данных, показал, что корреляция между плоидностью и суммарной длиной диктиосом аппарата Гольджи, окружающих группу центриолей, отсутствует.

Сопоставление максимальной протяженности диктиосом аппарата Гольджи и числа центриолей в клетке показало также отсутствие связи между длиной диктиосом в области неактивного клеточного центра и числом центриолей, входящих в его состав (таблица 1).

Полученные результаты отнюдь не означают, что в гепатоцитах разной плоидности нет разницы в общем объеме аппарата Гольджи. Присутствие диктиосом в апикальных участках цитоплазмы гепатоцитов указывает на локализацию отдельных компонентов аппарата Гольджи в тех участках цитоплазмы интактных гепатоцитов, где осуществляются активные процессы секреции. Исходя из данных литературы о росте общего уровня

Таблица 1. Максимальные значения длин цистерн аппарата Гольджи, ассоциированных с центриолями. Интактная печень. В последнем столбце указало число измерений, сделанных на всех срезах, проходящих через область, содержащую центриоли.

№ максимальное

клетки значение Число число

длины центриолей промеренных

цистерны (мкм) в данной клетке диктиосом

1 0,453 2 1

2 1,012 4 1

3 1,167 2 2

4 1,228 2 3

5 1,459 4 7

6 1,588 4 И

7 1,688 4 11

8 1,762 2 7

9 1,794 2+2 17

10 1,921 2+2 27

11 2,008 8 20

12 2,068 2 10

13 2,127 2 7

14 2,386 2+2 15

синтетических процессов в полиплоидных гепатоцитах при увеличении их плоидности (Бродский, Урываева 1981), можно ожидать, что в функционально активных клетках большая часть диктиосом сконцентрирована на периферии. В этом случае весьма вероятным представляется, что диктиосомы на периферии клетки и в ее центральной части отличаются по степени участия в секреторных и транспортных процессах.

Отличительным признаком центросомы гепатоцитов интактной печени является присутствие плотных пучков промежуточных филаментов, оплетающих центриолярные цилиндры. Мы предполагаем, что в отсутствии радиальной системы микротрубочек, поддержание полярности гепатоцитов интактной печени осуществляется при участии сети промежуточных филаментов.

2. Аппарат Гольджи гепатоцитов регенерирующей печени В ходе клеточного цикла, индуцированного частичной гепатэктомией, аппарат Гольджи в области клеточного центра гепатоцитов претерпевает следующие изменения. Отдельные диктиосомы, характерные для гепатоцитов, находящихся в фазе, при переходе клетки в фазу преобразуются в единый комплекс цистерн, локализованный вблизи группы центриолей (гистограмма 2). При этом максимальная протяженность диктиосом в области клеточного центра в S фазе увеличивается более, чем в два раза по сравнению с фазой и в 13 раза по сравнению с Gi фазой. Затем при переходе гепатоцитов в G2 фазу наблюдается уменьшение размеров диктиосом по сравнению с S фазой. По-видимому, по мере расхождения диплосом, происходит разъединение общего протяженного комплекса Гольджи на два отдельных, окружающих каждую группу центриолей, или разборка диктиосом при подготовке клетки к митозу (Схема 2).

Для модели пролиферирующих гепатоцитов детально описаны изменения центриолярного аппарата в ходе клеточного цикла и показана активация центросомы, как центра организации микротрубочек при вступлении клеток в пролиферацию после частичной гепатэктомии (Онищенко, Ченцов, 1986). Можно полагать, что основную роль в преобразованиях комплекса Гольджи в области клеточного центра играет именно изменение активности центросомы в ходе клеточного цикла.

Вступление гепатоцитов в клеточный цикл при получении пролиферативного стимула приводит к возобновлению функций клеточного центра, связанных с нуклеацией микротрубочек, и сопровождается постепенным исчезновением плотных пучков филаментов, характерных для гепатоцитов интактной печени. Т.е. можно говорить об изменениях функций клеточного центра в ходе регенерации по отношению к микротрубочкам и промежуточным филаментам. Таким образом, активность центросомы, как центра организации промежуточных филаментов в гепатоцитах, можно рассматривать,

как один из морфологических маркеров положения гепатоцитов в клеточном цикле. Это заключение, несомненно, требует дополнительной проверки с использованием иммунохимических методов и количественной оценки содержания и состава промежуточных филаментов. Выдвинуто предположение, что тканеспецифические промежуточные филаменты в отсутствие радиальной системы микротрубочек берут на себя и функции организации коротких диктиосом аппарата Гольджи.

Схема 2. Выход гепатоцитов та фазы погож и вступление в клеточный цикл.

Итак, в работе прослеживаются преобразования не только центросомы, но и диктиосом аппарата Гольджи в области клеточного центра в ходе интерфазы клеточного цикла гепатоцитов и при переходе клеток в состояние покоя. Судьба цистерн, расположенных в других областях цитоплазмы, при вступлении гепатоцитов в

пролиферативный цикл остается невыясненной На основании проведенных исследований возникла гипотеза о возможной неоднородности дихтиосом аппарат Гольджи в пределах одной клетки Выяснение биохимических и функциональных особенностей цистерн, расположенных в области клеточного центра и в других компартментах клетки, представляет собой отдельную перспективную задачу

3. Клеточный центр и аппарат Гольджи гепатоцитов новорожденных мышей Из литературы известно, что первые две недели постнатального развития печени мыши характеризуются процессами чередующихся делений и вступлением образовавшихся гепатоцитов в дифференцировку (Урываева, Ланге 1971, Бродский, Урываева 1981, ОаЬап, М1ёд1е1оп 1982, ОшёоШ й а1 2003) Кроме того, по наблюдениям разных исследователей в этот период происходят изменения ультраструктуры гепатоцитов, которые заключаются в перераспределении органелл клетки и изменении их морфологии (№ога 1957, Бреслер и др 1969, Калашникова 1971, МЩиПпа е1 а1 1978, 8Ыщш 1984) Принято считать, что перестройка компартментов гепатоцитов в этот период, пролиферация и полиплоидизация отражают процессы дифференцировки, связанные со становлением

Гистограмма 2 Сравнение средних и средних максимальных длин дихтиосом аппарата Гольджи ассоциированных с центриолями. Гепатоциты интаггаой и регенерирующей печени мыши, гепатоциты печени новорожденных мышей.

функциональной и морфологической полярности гепатоцитов в ходе онтогенеза (2аге1 1998,

2001). Однако, исследования структуры клеточного центра и организации аппарата Гольджи в гепатоцитах новорожденных мышей in situ в этот период не проводились.

На серийных ультратонких срезах гепатоцитов проанализировано строение клеточного центра в раннем постнатальном развитии. Обнаружено, что в гепатоцитах новорожденных пятидневных мышей организация клеточного центра соответствует строению клеточного центра гепатоцитов Gj фазы регенерирующей печени. Пучки промежуточных филаментов, характерные для гепатоцитов печени взрослых животных, в клеточном центре гепатоцитов новорожденных мышей не встречаются.

Параметры диктиосом аппарата Гольджи в области клеточного центра сопоставимы со средними значениями длин диктиосом аппарата Гольджи, полученными для клеток регенерирующей печени взрослых мышей, находящихся в фазе клеточного цикла (гистограмма 2).

Работы, посвященные изучению пролиферативных процессов в печени новорожденных мышей, показали, что в этот период паренхима печени представлена в основном диплоидными клетками. Эти данные подтверждают результаты наших наблюдений. Поскольку известно, что интенсивность синтетических процессов зависит от

плоидности гепатоцитов (Бродский, Урываева 1981), а также от размеров и возраста животного и рациона питания (Кудрявцев 1991, Калашникова 2003), можно ожидать, что

Схема 3. Преобразования клеточного центра и аппарата Гольджи в онтогенезе гепатоцитов

общий объем аппарата Гольджи в гепатоцитах новорожденных животных меньше по

сравнению с полиплоидными гепатоцитами.

Суммируя данные, полученные для гепатоцитов интактной печени взрослых и новорожденных мышей, можно заключить, что общая картина становления полярности с участием клеточного центра в ходе онтогенеза выглядит следующим образом. На ранних стадиях развития в пролиферирующих гепатоцитах центросома активна, как центр организации микротрубочек. На этом этапе в центральной части клетки формируются диктиосомы аппарата Гольджи, ко-локализованные с центросомой. Можно допустить, что, центросома необходима при становлении полярности гепатоцитов в серии чередующихся митозов в первые две недели постнатального развития, после чего происходит обратимая инактивация центросомы.

Гепатоциты характеризуются низкой пролиферативной активностью, они выходят в фазу Go, но при этом в клетках наблюдается высокий уровень тканеспецифических синтетических процессов. В это время полярность каждого гепатоцита поддерживается благодаря межклеточным взаимодействиям. Диктиосомы аппарата Гольджи перемещаются в апикальную часчь гататоцигов, где их присутствие наиболее целесообразно (схема 3).

При выходе из Go и вступлении гепатоцитов в цикл в результате химического или физического повреждения печени наблюдается активация центросомы. Центриоли возвращаются в центр клетки и определяют направление оси последующего деления. Процесс поддержания структуры сложно организованных эпителиев решается в этом случае за счет правильной ориентации митотического аппарата.

Поддержание диктиосом небольшого размера, по-видимому, не требует присутствия центросомных микротрубочек. Данные об обнаружении у-тубулина на поверхности мембран аппарата Гольджи в клетках печеночного происхождения (Chabin-BIion et я1. 2001) позволяют также предположить, что функция организации микротрубочек при дифференцировке клеток переходит от центросомы к цистернам аппарата Гольджи и не является основной для центросомы.

4. Клеточный центр и аппарат Гольджи гепатоцитов регенерирующей печени при действии гидроксимочевины

В гепатоцитах регенерирующей печени при действии гидроксимочевины через 36 часов после частичной гепатэктомии строение клеточного центра отличается от гепатоцитов S фазы клеточного центра. Центриоли не имеют процентриолей, характерных для этой фазы цикла, и вместе с тем содержат сателлиты, регистрируемые в гепатоцитах G1 фазы. Таким образом, можно утверждать, что воздействие гидроксимочевины в данном случае вызывает блок центриолярного цикла в G1 фазе и препятствует началу дупликации центриолей. Из данных литературы известно, что действие гидроксимочевины на культивируемые клетки

СНО (культура клеток яичников) блокирует синтез ДИК на границе Gi-S фаз. При этом показано, что в клетках репликация центриолей продолжается (Balczon et al. 1995). Воздействие гидроксимочевиной на ресничный эпителий ноги моллюска Lyranaea stagnalis также не препятствует образованию центриолярных цилиндров de novo и их превращению в базальные тела, а, возможно, интенсифицирует процессы центриоле- и цилиогенеза и индуцирует дифференцировку клеток (Домарацкий, Онщденко, 2001). По-видимому, в гепатоцитах, которые с одной стороны, в отличие от клеток СНО, являются дифференцированными клетками, а с другой стороны, в отличие от терминально дифференцированных клеток ресничного эпителия, способны вступать в пролиферацию, существует строгий механизм, осуществляющий координацию центриолярного и ядерного циклов.

В части гепатоцитов при действии гидроксимочевины через 44 часа после частичной гепатэктомии организация клеточного центра имеет черты, характерные для гепатоцитов Go фазы. Область клеточного центра не содержит микротрубочек, появляются пучки промежуточных филамеитов, оплетающие цептриоли. Эти изменения дают повод говорить о том, что нарушение функций центросомы в условиях Gi-блока при действии гидроксимочевины инициирует переход центросомы в Go фазу и активацию ее, как центра организации промежуточных филаментов.

В условиях действия. гидроксимочевины диктиосомы аппарата Гольджи, сосредоточенные в области клеточного центра, в среднем не превышают параметров, характерных для аппарата Гольджи в гепатоцитах G1 фазы регенерирующей печени, и достоверно уменьшаются по мере утраты центросомой активности, как ЦОМТ (гистограмма 3).

Представляется перспективным использование гидроксимочевины, которая вызывает блок гепатоцитов на границе Gi/S фаза, для исследования вклада аппарата Гольджи в работу пунктов проверки (check points), действующих на этой стадии клеточного цикла.

5. Аппарат Гольджи гепатоцитов регенерирующей печени при действии дипина Действие дипина в сочетании с операцией частичной гепатэктомии вызывает разобщением центриолярного и ядерного циклов (Крючкова и др. 1986).

Через 44 часа после операции в популяции преобладают гепатоциты в 8 фазе. К концу третьих суток (до 72 часов) около 80% клеток переходит в 02 фазу (Урываева и др. 1979, Фактор и др. 1979). Через 96 часов после операции по содержанию ДНК клетки по-прежнему находятся в 02 фазе, однако организация центриолярного аппарата в части клеток соответствует 01 фазе (Крючкова и др. 1986).

Анализ организации комплекса Гольджи в области клеточного центра гепатоцитов регенерирующей печени при действии дипина выявил следующие факты. 1. В ходе регенерации при действии дипина средняя протяженность диктиосом аппарата Гольджи растет, достигая, параметров, характерных для гепатоцитов вг фазы 2. Вместе с тем, максимальная протяженность цистерн в клетках, заблокированных в Ог фазе, значительно выше, чем соответствующие значения для клеток регенерирующей печени (гистограмма 3)

Гистограмма 3. Сравнение средних и средних максимальных значений длин диктиосом в гепатоцитах в 01 и 01-блоках и гепатоцитов интактной и регенерирующей печени.

Вопрос о зависимости событий, происходящих в интерфазе в ходе клеточного цикла, и преобразованиях аппарата Гольджи стоит в связи с представлением о морфологическом и, возможно, функциональном взаимодействии центросомы и комплекса Гольджи во многих типах исследуемых клеток. Существование агентов, разобщающих центриолярный и ядерный цикл, позволяет выяснить, определяются ли преобразования аппарата Гольджи событиями центриолярного цикла, или увеличение объема аппарата Гольджи происходит параллельно увеличению генома, или объема клетки в целом.

При действии дипина центросома дуплицируется и приобретает черты, характерные для 01 фазы, с удвоенным числом центриолей в то время, как состояние ДНК соответствует 02 фазе. В отличие от дипинового блока, при действии гидроксимочевины мы не наблюдали разобщения центриолярного и ядерного циклов При постановке экспериментов

предполагалось, что если преобразования аппарата Гольджи связаны с центриолярным циклом, то при действии дипина будет наблюдаться увеличение средних размеров диктиосом аппарата Гольджи, а при действии гидроксимочевины параметры аппарата Гольджи увеличиваться не будут. Если же изменения комплекса Гольджи не зависят от событий клеточного центра, то параметры аппарата Гольджи при и блоке будут сопоставимы с величинами, полученными для гепатоцитов в фазах соответственно,

в регенерирующей печени, не обработанной блокирующими агентами.

В действительности оказалось, что изменения аппарата Гольджи не укладываются ни в один из вариантов развития событий. В обоих случаях при блоке клеточного цикла наблюдалось некоторое снижение средней протяженности диктиосом, по сравнению с не подвергавшимися воздействиям пролиферирующими гепатоцитами. Возможно, уменьшение длин диктиосом связано с подавлением синтетической активности гепатоцитов в результате воздействия данными агентами.

Ни в случае Gi-блока, ни в случае в^-блока не наблюдается стабилизации средней длины диктиосомы. Уменьшение протяженности диктиосом происходит в то время, как количество ДНК остается неизменным. При этом число центриолей в одном случае растет, а в другом случае не изменяется. Единственным фактором, который, на наш взгляд, может играть роль в уменьшении длины диктиосом, является изменение активности клеточного центра в качестве ЦОМТ. Так, при действии дипина прохождение центросомы по циклу сопровождается изменением способности нуклеировать микротрубочки. Вероятно, при переходе центросомы в фазу в условиях повышенной активности центросомы активизируется антероградный транспорт. При действии гидроксимочевины, наоборот, происходит возврат центросомы в состояние, которое сопровождается инактивацией центросомы, как ЦОМТ.

В то же время, средняя максимальная протяженность диктиосом аппарата Гольджи в гепатоцитах при действии гидроксимочевины и дипина превышает средние максимальные значения для гепатоцитов фазы, соответственно. Если бы максимальные длины

диктиосом были выше только при действии дипина, тогда можно было бы говорить о зависимости этого показателя от числа центриолей в клеточном центре. Однако, при действии гидроксимочевины увеличения числа центриолей не наблюдается, а максимальная протяженность диктиосом возрастает, хотя и не так сильно, как при действии дипина.

Исходя из гипотезы о разных функциях микротрубочек, отличающихся по степени стабильности (KaIbowski et al 2000), можно предположить, что стабильные микротрубочки участвуют в агрегации диктиосом и формировании крупного аппарата Гольджи в области клеточного центра, а по лабильным микротрубочкам осуществляется антероградный

транспорт от аппарата Гольджи к другим компартментам клетки. Тогда изменения аппарата Гольджи можно трактовать следующим образом. В условиях воздействия гидроксимочевины средняя длина диктиосом аппарата Гольджи падает параллельно снижению активности клеточного центра до уровня Go фазы. В случае дипинового блока центриолярный цикл может сопровождаться изменением состава микротрубочек в клетке, при котором в определенный момент остаются только стабильные микротрубочки, которые аккумулируют оставшиеся короткие диктиосомы и способствуют образованию двух - трех длинных диктиосом. При этом антероградный транспорт не поддерживается. Как только через 4 суток центриолярный аппарат достигает Gi фазы, начинается образование лабильных микротрубочек и разборка длинных диктиосом в ходе антероградного транспорта. В дальнейшем планируется проведение детальных иммунохимических исследований состава микротрубочек при разных вариантах блокирования продвижения гепатоцитов по циклу.

Представленные рассуждения позволили предположить, что в гепатоцитах регенерирующей печени общий объем аппарата Гольджи, по всей вероятности, зависит от ядерного цикла, а протяженность диктиосом аппарата Гольджи в области клеточного центра регулируется активностью центросомы, как ЦОМТ, и составом микротрубочек.

5. Клеточный центр н аппарат Гольджи в клетках гепатокарцином

Для оценки зависимости размеров и локализации аппарата Гольджи от уровня тканеспецифических синтезов были исследованы три варианта гепатокарцином, различающиеся по этому признаку (Варга и др., 2001). Кроме того, анализируемые в настоящей работе клетки гепатокарцином отличаются по степени выраженности полярности плазматической мембраны и скорости пролиферативных процессов (Энгельгардт и др., 2000; Кудрявцева и др., 2001; Лазаревич 2003). Поэтому было проведено исследование особенностей организации центросомы в клетках, различающихся по этим параметрам.

Обнаружено, что клетки всех типов исследованных гепатокарцином имеют активный клеточный центр, основные черты которого соответствуют строению клеточного центра в гепатоцитах Gi фазы. Центриоли содержат сателлиты, активные, как ЦОМТ. В большинстве исследованных клеток область клеточного центра содержит микротрубочки. Наряду с этим в клетках медленнорастущей гепатокарциномы in vivo присутствуют пучки промежуточных филаментов, не обнаруженные в других гепатокарциномах. По всей вероятности, присутствие пучков промежуточных филаментов, характерных также для гепатоцитов интактной печени, связано с гипертрофией адгезионных контактов и изменением состава внеклеточного матрикса, описанных в этом типе гепатокарцином

(Кудрявцева и др, 2001)

Сопоставление длин диктиосом комплекса Гольджи для трех вариантов гепатокарцином с данными для гепатоцитов интактной печени показало, что существует зависимость организации и параметров аппарата Гольджи от интенсивности тканеспецифических процессов (гистограмма 4)

В клетках медленнорастущей гепатокарциномы ш vivo параметры аппарата Гольджи сопоставимы с данными для гепатоцитов регенерирующей печени, находящихся в Gj фазе клеточного цикла. Однако, средние размеры диктиосом в клетках медленнорастущих гепатокарцином ш vivo достоверно ниже, чем в гепатоцитах Gj фазы Более четкое сходство обнаруживается при сравнении параметров аппарата Гольджи в гепатоцитах медленнорастущих гепатокарцином и в гепатоцитах новорожденных мышей

(гистограмма 2, 4) Такое сходство можно объяснить, с одной стороны, присутствием активного клеточного центра, а с другой стороны, боле низким уровень синтетических процессов в гепатоцитах новорожденных мышей и в клетках медленнорастущей гепатокарциномы по сравнению с гепатоцитами интактной печени

Гистограмма 4. Сравнение средних и средних максимальных длин диктиосом аппарата Гольджи ассоциированных с центриолями в клетках разных вариантов гепатокарцином и в гепатоцитах интактной печени.

В клетках быстрорастущей гепатокарциномы in vivo, аппарат Гольджи представлен диктиосомами, протяженность которых ниже, по сравнению с клетками медленнорастущей

гепатокарциномы in vivo. Средние значения длин диктиосом аппарата Гольджи в клетках быстрорастущей гепатокарциномы in vivo сопоставимы только с параметрами диктиосом в гепатоцитах интактной печени. Однако максимальные средние значения достоверно ниже, чем в гепатоцитах интактной печени.

В клетках быстрорастущей суспензионной гепатокарциномы аппарат Гольджи представлен короткими диктиосомами, параметры которых достоверно ниже аналогичных показателей в гепатоцитах интактной печени (гистограмма 2,4).

Следует отметить, что в отличие от клеток гепатокарцином, растущих аппарат Гольджи в клетках суспензионной гепатокарциномы располагается только в области, прилежащей к центросоме. Т.е. переход клеток гепатокарциномы к росту в суспензии принципиально меняет организацию комплекса Гольджи. Причинами такого изменения могут являться нарушения функций центросомы, высокая пролиферативная активность клеток, утрата тканеспецифических синтезов, а также нарушение клеточной полярности.

ВЫВОДЫ

Исследования центросомы и аппарата Гольджи, локализованного в области клеточного центра, показали:

1. Структурная организация и активность клеточного центра в гепатоцитах зависит от степени дифференцировки, положения в клеточном цикле, а также уровня опухолевой трансформации клетки.

2. В онтогенезе мыши дифференцировка гепатоцитов сопровождается инактивацией центросомы, как центра организации микротрубочек.

3. Локализация и размеры комплекса Гольджи в гепатоцитах зависят от характера активности центросомы (активная или неактивная центросома).

4. В гепатоцитах Go фазы интактной печени аппарат Гольджи вокруг неактивного, как ЦОМТ, клеточного центра представлен диктиосомами малой протяженности.

5. Впервые исследованы преобразования аппарата Гольджи в клеточном цикле в гепатоцитах печени мыши. Показано последовательное увеличение длины диктиосом аппарата Гольджи при активации центросомы в качестве ЦОМТ в фазах и снижение протяженности диктиосом з G2 фазе при подготовке к митозу.

6. Воздействие гидроксимочевиной на пролиферирующие гепатоциты приводит к задержке центросомного цикла и преобразований комплекса Гольджи в G\ фазе, а затем к инактивации клеточного цешра и уменьшению протяженности диктиосом до

параметров Go фазы.

7. При воздействии дипином, блокирующем пролиферацию гепатоцитов в Gj-фазе, средние значения длин диктиосом не превышают протяженности диктиосом, характерных для гепатоцитов в G2 фазе; при этом протяженность отдельных диктиосом достигает больших величин, что, вероятно, связано с продолжением центросомного цикла.

8. При опухолевой трансформации клеток центросома приобретает черты, характерные для гепатоцитов Gi фазы. Параметры аппарата Гольджи- в этих условиях уменьшаются по мере утраты клетками гепатокарцином тканеспецифических признаков.

Список работ опубликованных по теме диссертации:

1. Сысоева В. Ю., Онищенко Г. Е. Строение аппарата Гольджи в разные периоды

клеточного цикла в гепатоцитах мыши in vivo. 2000, Тезисы докладов XVIII

Российской конференции по электронной микроскопии, Черноголовка, С. 315.

2. Сысоева В Ю., Онищенко Г.Е. Изменения строения аппарата Гольджи гепатоцитов

мыши в клеточном цикле. 2003, Биологические мембраны т. 20, №4, с.288-300.

3. Гольдина ТА, Сысоева ВЮ, Онищенко Г.Е. Изменения состояния клеточного

центра и аппарата Гольджи при дисплазии и опухолевом росте в печени TGFa/C-

MYC-трансгенных мышей. 2003, Цитология, т. 45(9), стр. 864.

4. Сысоева В.Ю., Оншценко Г.Е. Центросома и аппарат Гольджи в онтогенезе

гепатоцитов мыши. 2003, Цитология, т. 45(9), Стр. 934.

Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 11.03.2004 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 1,25. Тираж 80 экз. Заказ 268. Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.ВЛомоносова.

N2 - 6 4 7 0

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сысоева, Вероника Юрьевна

Введение

Обзор литературы.

Печень.

Ультраструктура гепатоцитов.

Полярная организация гепатоцитов.

Полиплоидия.

Регенерация печени.

Печень в онтогенезе многоклеточных организмов.

Клеточный центр.

Центросома в клеточном цикле. разобщение центросомного и ядерного циклов.

Комплекс Гольджи.

Локализация аппарата Гольджи в клетках.

Биогенез аппарата Гольджи.

Аппарат Гольджи в клеточном цикле.

Аппарат Гольджи в интерфазе и при блоке клеточного цикла.

Аппарат Гольджи и клеточный центр.

Промежуточные филаменты. разные варианты взаимного расположения аппарата Гольджи и клеточного центра.

Центросома и аппарат Гольджи при дифференцировке клеток.

Гепатокарциномы, гепатомы.

Объекты и методы исследования.

Результаты и обсуждение.

1. Аппарат Гольджи гепатоцитов интактной печени взрослых мышей. длина диктиосом аппарата Гольджи, расположенных вокруг центриолей, в гепатоцитах интактной печени. сопоставление максимальной протяженности диктиосом аппарата Гольджи и числа центриолей в клетке. сопоставление рашеров аппарата Гольджи в области клеточного центра с плоидностью гепатоцитов интактной печени.

2. Аппарат Гольджи гепатоцитов регенерирующей печени гепатоциты С ¡фазы. длина диктиосом аппарата Гольджи, расположенных вокруг центриолей, вгепатоцитах (7/ фазы. гепатоциты Я ф азы. длина диктиосом аппарата Гольджи, расположенных вокруг центриолей, в гепатоцитах Б фазы. гепатоциты С^ фазы. длина диктиосом аппарата Гольджи, расположенных вокруг центриолей, в гепатоцитах С.? фазы регенерирующей печени. сопоставление длин диктиосом аппарата Гольджи в клетках интактной и регенерирующей печени.

3. Клеточный центр и аппарат Гольджи гепатоцитов новорожденных мышей. длина диктиосом аппарата Гольджи, расположенных вокруг центриолей, для гепатоцитов новорожденных мышей. длина диктиосом аппарата Гольджи, расположенных вокруг центриолей, в гепатоцитах новорожденных мышей первого и второго типов. аппарат Гольджи в области неактивного клеточного центра в гепатоцитах интактной печени существует в виде коротких диктиосом в отсутствие радиальной системы микротрубочек роль промежуточных филаментов. диктиосомы аппарата Гольджи в гепатоцитах интактной печени имеют небольшую протяженность независимо от плоидности клетки. входе клеточного цикла протяженность диктиосом аппарата Гольджи возрастает. микротрубочки участвуют в формировании протяженных диктиосом аппарата Гольджи в области клеточного центра. нарастание общего объема аппарата Гольджиможет быть связано с увеличением объема клетки. уменьшение длины диктиосом аппарата Гольдлси при переходе гепатоцитов в С2 фазу.

Организация клеточного центра и комплекса Гольджи в гепатоцитах новорожденных мышей. возможная роль клеточного центра в организации полярности гепатоцитов.

4. Клеточный центр и аппарат Гольджи гепатоцитов регенерирующей печени при действии гидроксимочевины. гепатоциты регенерирующей печени через 36 часов после частичной гепатэктомии при действии гидроксимочевины. длина диктиосом аппарата Гольджи, расположенных вокруг центриолей, в гепатоцитах регенерирующей печени через 36 часов после частичной гепатэктомии при действии гидроксимочевины. гепатоциты регенерирующей печени через 44 часа после частичной гепатэктомии при действии гидроксимочевины. длина диктиосом аппарата Гольджи, расположенных вокруг центриолей в гепатоцитах регенерирующей печени через 44 часа после частичной гепатэктомии при действии гидроксимочевины.

5. Аппарат Гольджи гепатоцитов регенерирующей печени при действии дипина. гепатоциты регенерирующей печени через 44 часа после частичной гепатэктомии при действии дипина .120 длина диктиосом аппарата Гольджи расположенных вокруг центриолей в гепатоцитах регенерирующей печени через 44 часа после частичной гепатэктомии при действии дипина. гепатоциты регенерирующей печени через 72 часа после частичной гепатэктомии при действии дипина. длина диктиосом аппарата Гольджи, расположенных вокруг центриолей, в гепатоцитах регенерирующей печени через 72 часа после частичной гепатэктомии при действии дипина. гепатоциты регенерирующей печени через 96 часов после частичной гепатэктомии при действии дипина.А24 длина диктиосом аппарата Гольджи, расположенных вокруг центриолей, в гепатоцитах регенерирующей печени через 96 часов после частичной гепатэктомии при действии дипина.

6. Клеточный центр и аппарат Гольджи в клетках гепатокарцином.

Медленнорастущие гепатокарциномы in vivo. длина диктиосом аппарата Гольджи в области клеточного центра в клетках медленнораступцих гепатокарцином in vivo.

Быстрорастущая гепатокарцинома in vivo. длина диктиосом аппарата Гольджи в области клеточного центра в клетках быстрорастуи^ей гепатокарциномы in vivo.

Клетки гепатокарциномы, растущей в суспензии. длина диктиосом аппарата Гольджи в области клеточного центра в клетках быстрорастуи^ей гепатокарциномы в суспензии.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Зависимость строения аппарата Гольджи от состояния клеточного центра в гепатоцитах мыши"

Показано, что центриолярный аппарат и элементы цитоскелета играют важную роль в организации клеточных органелл, и в частности аппарата Гольджи (Lippincott-Schwartz,; 1998; Glick, 2000; Rios, Bornens, 2003). Объектами таких исследований являются главным образом клетки перевиваемых культур.

Данные, полученные при исследовании клеток in situ, свидетельствуют о том, что в онтогенезе многоклеточных организмов центросома динамично изменяется (Ralston, 1993). В дифференцированных клетках состояние клеточного центра и полярная организация клетки может быть различной в зависимости от выполняемых ею функций (Москвин-Тарханов, Онищенко, 1978; Tassin et al., 1985; Bloom, Fawcett, 1986; Абумуслимов и др., 1991; Снигиревская, Комиссарчик, 1995; Ladinsky et al., 1999; Rubina et al., 1999; Krioutchkova, Onishchenko, 1999). Вступление клеток в пролиферацию, изменения функциональной активности в ходе клеточного цикла или под действием внешних факторов, а также в результате трансформации приводит к реорганизации клеточного центра (Онищенко, 2000).

Комплекс Гольджи функционально и топологически связывают с клеточным центром (Rogalski, Singer, 1984; Но et al., 1990; Kreis, 1990; Moskalewski, Thyberg, 1992; Cole, Lippincott-Schwartz, 1995; Drubin, Nelson 1996; Takatsuki et al., 2002) С другой стороны, очевидно, что размеры аппарата Гольджи могут зависеть от функционального состояния клеток, которое в свою очередь определяется уровнем дифференцировки, плоидностью клеток, интенсивностью тканеспецифическихсинтезов и другими факторами.

В клетках печени в норме события центриолярного и ядерного цикла координированы. Однако, известны случаи, когда репликация центриолей может идти независимо от репликации ДНК (Stublefield, De Foor, 1972; Rattner, Phillips, 1973; Kuriyama et al., 1986; Gart et al., 1990; Sluder et al., 1990; Balczon et al., 1995). На гепатоцитах регенерирующей печени разработана модель йг-блока при действии дипина (Урываева, Фактор, 1988), позволяющая вызвать разобщение центриолярного и ядерного циклов в гепатоцитах (Крючкова и др., 1986). Применение гидроксимочевины, блокирующей клетки на границе Gi/S, дает возможность исследовать, как в этих условиях ведет себя аппарат Гольджи и центросома.

Удачным объектом для решения вопроса о зависимости параметров аппарата Гольджи от уровня синтетической активности являются линии гепатокарцином, растущие in vivo и в суспензии, для которых описаны признаки утраты тканеспецифических синтезов (Энгельгардт и др., 2001; Варга и др., 2001; Кудрявцева и др., 2001; Лазаревич 2003).

Основная цель настоящей работы состояла в выявлении того, как в гепатоцитах структурно-функциональное разнообразие клеточного центра сказывается на топологии аппарата Гольджи в онтогенезе многоклеточных животных, в клеточном цикле, при блоке пролиферации, а также при разных вариантах трансформации гепатоцитов мыши. Предполагалось сопоставить характер организации центросомы и отдельных элементов цитоскелета с тонким строением аппарат Гольджи в области клеточного центра. Анализ диктиосом аппарата Гольджи локализованных в других областях цитоплазмы в настоящей работе не проводился.

Исследование проводилось на клетках печени новорожденных мышей, интаюгной и пролиферирующей печени взрослых животных, при химических воздействиях, вызывающих блокирование пролиферации на границе Gj/S и в G2 фазе. Зависимость структуры и организации аппарата Гольджи от интенсивности тканеспецифических процессов исследовали на клетках гепатокарциномы растущей in vivo и в суспензии, в разной степени утративших нормальный фенотип и связь с внеклеточным матриксом в результате трансформации.

Полученные результаты должны способствовать пониманию роли центросомы в становлении и поддержании закономерной топологии аппаратаГольджи в онтогенезе, при дифференцировке и трансформации гепатоцитов.

В работе были поставлены следующие задачи:1. Исследовать организацию и параметры аппарата Гольджи в области клеточного центра в гепатоцитах интактной и регенерирующей печени мыши.

3. Используя воздействие гидроксимочевиной (Gj/S блок) и дипином (G2 блок) на пролиферирующие гепатоциты, проанализировать влияние ядерного и центриолярного циклов на параметры аппарата Гольджи при блокировании клеточного цикла.

Обзор литературы ПеченьПечень млекопитающих - крупная железа, выполняющая эндо- и экзокринные функции в организме. В постнатальном развитии в печени секретируется желчь, белки сыворотки крови, витамины и компоненты липопротеинов; накапливается гликоген. Другой важной функцией печени является детоксикация вредных веществ и продуктов обмена.

Печень - паренхиматозный орган, состоящий из нескольких долей и объединенный соединительнотканной оболочкой. Структурно-функциональной единицей печени является печеночная долька, ассоциированная с веной артерией и желчным протоком. Печень представлена клетками нескольких типов: гепатоциты, холангиоциты, эндотелиальные клетки, клетки каналов Геринга, ямочные (pit) клетки, клетки Купфера, звездчатые клетки печени.

Эндотелиальные клетки образуют выстилку синусоидов. Холангиоциты выстилают крупные желчные протоки. Клетки каналов Геринга имеющие в цитоплазме большое количество тонофиламентов, образуют переход от междольковых желчных протоков к тяжам печеночных клеток. В отличие отгепатоцитов они располагаются на базальной мембране. Ямочные или pit клетки локализуются в пространстве Диссе. Их относят к клеткам иммунной системы. Клетки Купфера выполняют фагоцитарную функцию. Внутридольковые соединительно-тканные звездчатые клетки в разных условиях способны преобразовываться в миофибробласты или липоциты. Они участвуют в поддержании гомеостаза внеклеточного матрикса печени, процессах восстановления печени - регенерации и фиброзе, контролируют выработку, накопление и расход витамина А и, возможно, являются стволовыми соединительнотканными клетками. (Афанасьев и др. 1989, Киясов и др. 1997)Гепатоциты составляют основную массу печеночной паренхимы и обеспечивают выполнение большинства разнообразных функций органа. Среди функций, выполняемых дифференцированными гепатоцитами, можно выделить синтез белков плазмы крови - альбумина, протромбин и др. Важной функцией гепатоцитов является образование и накопление гликогена. Гепатоциты осуществляют синтез и секрецию желчных кислот (Shiojiri, 1984; Афанасьев и др., 1989; Zaret, 1998,2001).

В работах, посвященных исследованию морфологии печени в норме и при самых разных воздействиях, отмечается функциональная и морфологическая неоднородность гепатоцитов, связанная с особенностями организации печени и различиями в кровоснабжении центролобулярных и периферических гепатоцитов.

Выделяют темные и светлые гепатоциты, в разном соотношении представленные в печени. Темные клетки обнаруживают только в периферических отделах дольки (Бекетова, Секамова, 1975). Не отличаясь по степени полиплоидизации, способности синтезировать ДНК и РНК, по общему содержанию белка эти две группы клеток, тем не менее, по-разному окрашиваются цитоплазматическими красителями. На электронно-микроскопическом уровне цитоплазма клеток печени различается по плотности.

Исследование ультраструктуры и синтетической активности митохондрий показало, что темные клетки, находятся в состоянии покоя и специфической деятельности, сопряженной с высоким уровнем биоэнергетических и биосинтетических процессов. Светлые клетки характеризуются, как имеющие высокий энергетический потенциал и сниженный уровень биосинтетических процессов (Бекетова, Секамова, 1975) Предполагается, что темные гепатоцитымогут превращаться в светлые, и наоборот, под действием ряда внешних факторов влияющих на функциональную активность клеток печени. Соотношение этих двух групп клеток непостоянно и может варьировать при функциональных нагрузках, повреждениях, изменениях внешней среды, а также в ходе онтогенетического развития (Калашникова, 1971; Ченцов, Косых, 1995).

Ультраструктура гепатоцитовНа световом и электронно-микроскопическом уровне гепатоциты выглядят как крупные многоугольные клетки 20-25 мкм в диаметре, четко отграниченные друг от друга. Мембраны двух соседних гепатоцитов располагаются параллельно. В печени различают клеточные контакты разных типов: плотные, и десмосомы. В местах схождения плазматической мембраны нескольких гепатоцитов локализуются желчные капилляры, в которые вдаются многочисленные микроворсинки.

Округлые светлые ядра гепатоцитов имеют хорошо различимую ядерную оболочку, немногочисленные глыбки хроматина и от 1 до 4 нуклеолонемных ядрышка. Гепатоциты млекопитающих содержат 1 или 2 ядра. Показано, что в нормальной печени существует прямая корреляция между содержанием ДНК в ядрах и их объемом, которая изменяется при воздействиях на орган (Бродский, 1966).

Цитоплазма гепатоцитов печени взрослых животных имеет сложное строение и разделена на компартменты в соответствии с выполняемыми функциями. Известно, что одна из основных тканеспецифических функций гепатоцитов - синтез и секреция сывороточных белков тесно связана со степенью развития эндоплазматического ретикулума (ЭПР) (Dallner, De Pierre, 1982; David, 1985).

Некоторые авторы указывают на разницу в организации цитоплазмы, и в частности ЭПР, у центролобулярных и периферических гепатоцитов. У мышей СзНА и беспородных крыс в центролобулярных гепатоцитах обнаружены особенно крупные тела Берга, которым на электронно-микроскопическом уровне соответствуют канальцы гранулярного ЭПР, расположенные параллельными рядами. Цитоплазма периферических гепатоцитов более однородна (Бреслер и др., 1969).

В работах, где исследуется ультраструктура гепатоцитов встречаются описания диктиосом аппарата Гольджи локализованных в разных участках цитоплазмы (Бреслер и др., 1969). Калашниковой описана локализация аппарата Гольджи вблизи желчных капилляров в виде цистерн небольшой протяженности в гепатоцитах разных видов млекопитающих и рептилий. У личинок форели описана локализация аппарата Гольджи между ядром и желчным капилляром (Калашникова 2003). В целом, особенности локализации диктиосом аппарата Гольджи в гепатоцитах разных позвоночных исследователи объясняют разницей в рационе питания и факторами внешней среды (Бреслер и др., 1969,Калашникова 2003).

Форма и расположение митохондрий в клетках печени разнообразны и также, по мнению исследователей, зависят от функционального состояния и местоположения клетки в дольке (Бреслер и др., 1969; Бекетова, Секамова, 1975; Калашникова, 2003). В центролобулярных гепатоцитах крыс и мышей многочисленные митохондрии имеют вид нитей около 2-3 мк в длину, нередко складывающихся в короткие цепочки. В гепатоцитах периферических отделов дольки большинство митохондрий имеет вид округлых образований диаметром около 1-1.5 мк с меньшим количеством крист. Установлена обратная зависимость между весом животного и концентрацией внутренних мембран митохондрий (Анацкая, 1989).

Первичные лизосомы чаще встречаются в центролобулярных гепатоцитах в области желчных капилляров. В гепатоцитах периферических отделов дольки первичные лизосомы топографически не связаны с желчными капиллярами. Аутофагические лизосомы встречаются вблизи плазматической мембраны центролобулярных гепатоцитов и содержат фрагменты митохондрий и ЭПР (Бреслер и др., 1969; Анацкая, 1989; Калашникова, 2003).

Гликоген, по мнению большинства микроскопистов, в гепатоцитах существует в виде розеткообразных гранул или в неагрегированном виде так называемого «бесструктурного вещества». Его содержание также коррелирует с положением гепатоцита в дольке (Бреслер и др., 1969; Кудрявцев и др., 1979; Анацкая, 1989; Кудрявцева и др., 1989; Калашникова, 2003).

Гранулы, содержащие нейтральные жиры организованы в более крупные липидные вакуоли в клетках периферических отделов дольки (Кудрявцев и др.,1979; Анацкая, 1989; Кудрявцева и др., 1989).

У ряда организмов в гепатоцитах накапливаются специфические вещества или продукты распада (Калашникова 2003).

Клеточная поверхность гепатоцитов имеет базолатеральный компартмент, контактирующий с пространством Диссе, и соседними клетками; и апикальный компартмент обращенный в просвет желчных капилляров. Одним из отличий плазматической мембраны апикальной и базолатеральной поверхностей гепатоцитов, является неоднородность липидного и белкового состава, который сохраняется благодаря плотным контактам (Ihrke et al., 1993; Ihrke et al., 1998; Zegers, Hoekstra, 1998).

Некоторые авторы выделяют еще и третью зону плазматической мембраны - не участвующую в процессах секреции (Bender et al., 1998).

Неоднородность плазматической мембраны формируется и поддерживается определенными механизмами и транспортными процессами внутри клетки (Westermann et al. 1996; Roma et al., 1998, 2000). Выяснение этих механизмов является на сегодняшний момент одной из основных задач клеточной биологии.

Полярная организация гепатоцитовГепатоциты взаимодействуют друг с другом, образуя трабекулы или печеночные балки (Keller, Simons, 1997). Различают апикальную часть - в местах формирования желчных капилляров между двумя и более клетками. В апикальном направлении гепатоциты осуществляют секрецию желчи. В просвет желчного капилляра обращены микроворсинки. Изменение просвета желчных капилляров отмечается при изменении функциональной нагрузки, заболеваниях печени, и служит одной из морфологических характеристик состояния гепатоцитов (Калашникова, 2003).

К пространству Диссе обращена базальная или синусоидальная часть гепатоцита. В пересинусоидальное пространство гепатоциты секретируют глюкозу, жиры, мочевину, белки плазмы крови. Для этой области характерны обширные участки в которых локализуется основная масса гликогена, большое количество везикул в цитоплазме и микроворсинок на поверхности. Число и размер ворсинок варьируют в зависимости от расположения гепатоцита в дольке и в зависимости от функциональной активности гепатоцита (Бреслер и др., 1969).

В конце 60х годов по результатам исследований структурно-химическойорганизации гепатоцитов был сделан вывод о пространственном разделении основных ферментных систем внутри каждой клетки.

В рамках обсуждения путей внутриклеточного транспорта в разных типах клеток в обзоре Келлера и Симонса предложена схема пост- Гольджи транспорта в гепатоците: 1. в сторону синусоидальной поверхности плазматической мембраны, содержащей микроворсинки; 2. в сторону апикальной мембраны, формирующей желчный капилляр, через базолатеральный компартмент путем трансцитоза (Bomsel, Mostov, 1991; Mays et al., 1994; Keller, Simons, 1997).

Биполярная организация гепатоцитов характерна для всех классов позвоночных, начиная с рыб. В процессе эволюции изменения в строении печени сводились к увеличению контакта гепатоцитов с кровью и формированию сложно организованной системы балок и желчных капилляров (Калашникова, 2003).

Взаимодействие клеток с внеклеточным матриксом, клетками соединительной ткани и соседними гепатоцитами является одним из ключевых факторов в определении полярности гепатоцитов, регуляции пролиферативных процессов и тканеспецифических функций гепатоцитов (Albrecht, Hansen, 1999; Hansen, Albrecht, 1999). В ряде работ, посвященных вопросам адгезии клеток, обсуждаются пути регуляции процессов взаимодействия клеток и передачи сигнала внутрь клетки с участием белковых комплексов, входящих в состав разных клеточных контактов (Boccaccio et al., 2002; Matsui et al., 2002; Braga, 2003; Balda, Matter, 2003; Rosario, Birchmeier, 2003).

Отличительной особенностью гепатоцитов млекопитающих является отсутствие базальной мембраны, или базального слоя, подстилающего эпителиальный пласт. Базальная мембрана в основании гепатоцитов описана только в печени ланцетника. Элементы прерывистой базальной мембраны обнаружены в пространстве Диссе в печени рептилий (Калашникова, 2003). У млекопитающих наличие базальной мембраны описано только в печени жвачных животных (Wright et al., 1983).

ПолиплоидияПолиплоидизация - процесс, свойственный большому числу клеточных систем у растений, насекомых, млекопитающих и птиц (Epstein, 1967; Swartz, 1967; Nagl, 1978; Uryvaeva, 1981; Бродский, Урываева, 1981; Зыбина, 1986; Урываева, 1987; Анацкая, 1989; Анацкая, Кудрявцев, 1993, 1997; Анисимов, 1998;Guidotti et al., 2003). Гипотеза, предложенная в начале 80 годов, связывает полиплоидизацию клеток с возникновением на определенных стадиях онтогенеза конкурентных отношений между пролиферативной и тканеспеиифической функциями за единые источники энергии, субстраты, системы белкового синтеза, синтеза липидов мембран, и внутриклеточного транспорта (Бродский, Урываева, 1981).

Известно, что гепатоциты млекопитающих в основной своей массе полиплоидны, хотя выраженность этого явления не одинакова у различных видов.

В настоящее время выявлены основные механизмы смены клеточных классов при постнатальном росте печени мыши (Uryvaeva, 1981; Урываева, 1987). Печень взрослых мышей состоит в основном из высокополиплоидных клеток (моно- и биоктаплоидов). 50-60% гепатоцитов взрослых мышей двуядерные (Урываева, 1987). Однако, мыши карликовых линий, живут с низкоплоидной печенью.

Показано, что в печени молодых мышей сохраняется фракция диплоидных неделящихся гепатоцитов, которая способна вступать в пролиферацию при стимуляции разного рода воздействиями. Тем не менее, эти клетки не относятся к стволовым, так как численность диплоидных клеток при многократных стимуляциях пролиферации снижается (Урываева, Фактор 1979).

По данным литературы состав и структура популяции гепатоцитов различаются у разных видов животных, что, по мнению некоторых исследователей, объясняется разницей в скорости роста и весе животных разных видов (Бродский, Урываева, 1981; Gahan, Middleton, 1982; Кудрявцев и др., 1984; Анацкая, 1989; Штейн, 1991). По мере увеличения веса тела животных конкурентные отношения между тканеспецифическими и пролиферативными функциями в клетке уменьшаются, приводя к снижению числа полиплоидных клеток в печени крупных животных (Кудрявцев, 1991).

Помимо генетических особенностей организма, степень полиплоидизации гепатоцитов зависит от состояния органа, веса и возраста конкретного животного, степени нагрузки на орган и различных внешних факторов. Так, печень голодавших в раннем постнатальном развитии мышей низкоплоидна (Naora, 1957; Swartz, 1967). При увеличении скорости роста животных наблюдается возрастание плоидности гепатоцитов (Анацкая, 1989).

По данным одних исследователей, в различных участках интактной печени»не выявлено существенных отличий в соотношения гепатоцитов разной степени плоидности (Завадская, 1989). По другим данным, в перипортальной области печени преобладают низкоплоидные клетки, и существует зональность некоторых функциональных показателей, направленная от периферии к центру дольки. Воздействие на печень вызывают неоднородную реакцию полиплоидизации вдоль печеночной балки (Фактор и др., 1979). Например, в печени с ярко выраженным циррозом, обнаружено накопление высокоплоидных клеток и колебание числа одноядерных клеток в разных микроучастках (Завадская, 1989).

В период старения человека обнаружены прямые переходы одноядерных клеток 2с-4с, что, по мнению исследователей, является ответом на усиление гибели клеток и атрофию печени (Кудрявцев и др., 1991; Штейн, 1991).

У животных с хроническими поражениями печени доля двуядерных клеток может составлять 40%. Восстановление массы органа в этом случае осуществляется за счет гипертрофии клеток (Завадская, 1989).

Предполагается, что увеличение плоидности клеток в ряде случаев может являться результатом накапливающихся нарушений в геноме клеток или следствием нарушений митотических процессов (Бродский, Урываева, 1981). Однако, полиплоидия клеток млекопитающих чаще всего свидетельствует о терминальной дифференцировке клеток и носит функциональный и приспособительных характер.

По мнению исследователей роль клеточной полиплоидии может состоять в следующем.

1. Обеспечивается генетическая защищенность полиплоидов в условиях высокого уровня спонтанных повреждений хромосом в гепатоцитах и структурных перестроек хромосом. Показано, что при возрастании уровня плоидности в 2 раза уровень активности фермента репарации ДНК увеличивается в 20 раз. (Кудрявцев, 1991).

2. Полиплоидные клетки способны к связыванию большей дозы канцерогена.

3. Обеспечивается увеличении дозы гена (Johnston, Mathias, 1972), аследовательно - возрастание количества РНК и интенсификация белковых синтезов. Показано, что на всех сроках постнатального развития гепатоциты крыс накапливают белок строго пропорционально степени их плоидности. Т.е. функциональная активность полиплоидных гепатоцитов возрастает пропорционально плоидности (Кудрявцев и др., 1979; Бродский, Урываева, 1981; Шалахметова и др., 1981; Ни и др., 1988; Кудрявцев, 1991).

4. Возникает возможность осуществления постнатального и регенераторного роста органа параллельно эндо- и экзокринным синтезам.

5. Изменяется соотношение поверхности и объема ядра (Бродский, Урываева, 1981; Завадская, 1989; Анацкая, 1989). Полиплоидизация клеток приводит к увеличению их объема. В ряде работ показано, что в гепатоцитах параллельно увеличению плоидности клеток наблюдается увеличение количества белка (Бродский, Урываева, 1981; Шалахметова и др., 1981; Завадская, 1989).

В литературе до сих пор дискутируется механизм образования полиплоидных клеток в печени. По мнению большинства авторов, полиплоидизация гепатоцитов осуществляется путем смены ацитокинетических и полных митозов двуядерных клеток со слиянием хромосомных наборов (Урываева, Ланге, 1971; Бродский и др., 1973; Бродский, Урываева, 1981; Урываева, 1987; Guidotti et al., 2003). Однако до сих пор обсуждается возможность образования двуядерных клеток путем слияния соседних гепатоцитов. Еще одно объяснение появления клеток большей плоидности - нарушение механизма цитокинеза (Guidotti et al., 2003). Открытым остается вопрос о возможности эндоредупликации гепатоцитов.

При регенерации печени после частичной гепатэктомии или при химическом повреждении печени, в ней наблюдается резкое снижение числа двуядерных клеток, что, по мнению исследователей, объясняется «нормализацией» протекания митозов (Урываева, Фактор, 1979; Урываева, 1987).

Выявлено, что на начальных этапах активации пролиферации гепатоцитов после частичной гепатэктомии, ключевую роль играет комплекс MEK/ERK (Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase/Extracellular Signal-Regulated Kinase), который запускает каскад сигналов прохождения клеткой Gj фазы и затем, способствует накоплению мРНК циклина D (Talarmin et al., 1999).

Установлено участие циклина D в прохождении клетками Gi фазы, повышении уровня синтеза белков, росте клеток и вступлении гепатоцитов в пролиферацию после частичной гепатэктомии. Циклин D также стимулирует активацию циклина А, и активацию киназ, ассоциированных с циклинами Е и А (Albrecht, Hansen, 1999).

Показано, что воздействие рапамицина блокирует экспрессию циклина D1, что приводит к остановке пролиферации первичных гепатоцитов в культуре и ингибирует регенерацию клеток после частичной гепатэктомии (Nelsen et al., 2003).

В одной из последних работ, где исследуются механизмы полиплоидизации гепатоцитов крысы in vivo, проанализировано участие белка р53 в аресте клеток в Gi фазе в ответ на тетраплоидизацию. Известно, что при повреждениях ДНК или нарушениях цитокинеза индуцируется экспрессия гена р53 и р53-регулируемых генов. Предполагается, что подавление пролиферативной активности клеток опосредуется белком р53 через активацию р53-зависимых генов, таких как ингибитор циклинзависимых киназ - р21Сф1; циклина G и проч. (Еремеев, 2001). Оказалось, что в гепатоцитах, в отличие от клеток HeLa, белок р53 не приводит к Gi аресту клеток после нарушения цитокинеза (Guidotti et al., 2003).

Обнаружено, что у мышей с нарушением экспрессии генов р21, Skp2, ERCC1 содержание одноядерных полиплоидных клеток в печени выше по сравнению с печенью мышей дикого типа (Guidotti et al., 2003).

Наряду с общими для всех клеток последовательностями сигналов, приводящими к делению клеток, гепатоциты имеют и свои особенности регуляции запуска и протекания пролиферативных процессов.

Показано, что гепатоциты интактной печени характеризуются низким уровнем синтеза цитокинов, отвечающих за гомеостаз, развитие некроза, и синтез белков острой фазы. Гиперпродукция цитокинов вызывает нарушения функций печени и приводит к дисплазии печени. Уровень цитокинов в печени повышается при действии различных стимулов в результате повреждения, а также при развитии неопластических процессов (Tilg 2001).

Известно, что многие клетки in vitro, прошедшие одну из «контрольных точек» митотического цикла — в поздней Gi фазе - становятся способными к репликации ДНК в отсутствии ростовых факторов. In vivo, трансфекция клетокпечени мышей циклином Е приводит к запуску репликативных процессов и, в дальнейшем, к гиперплазии печени (Nelsen et al. 2001).

На поздних этапах регенерации печени после частичной гепатэктомии, в гепатоцитах появляются эндогенные негативные факторы (белок р21С1р| -ингибитор Cdks, и компонент системы репарации gadd45), образование которых зависит от синтеза белка. Негативный контроль пролиферации существует непродолжительное время, после чего система регуляции пролиферации гепатоцитов возвращается к исходному состоянию. Контроль перехода и поддержания гепатоцитов в состоянии покоя связан с высокой протеолитической и фосфатазной активностью. Сдвиг метаболизма приводит к активации пролиферативных процессов (Еремеев, 2001).

Последние данные литературы указывают на возможность регуляции уровня циклинов в клетке в ответ на изменение межклеточных взаимодействий, увеличение синусоидального пространства, или просвета желчных капилляров, физические и химические повреждения части популяции гепатоцитов. Так, одним из стимулов к пролиферации клеток печени является набухание клеток, вызывающее реорганизацию цитоскелета и активацию каскада цитоплазматических сигнальных факторов и факторов пролиферации, а также транскрипцию ранних генов пролиферативного ответа (Kim et al., 20016).

Регенерация печениСпособность печени к восстановлению после травмы или патологических процессов обнаружена при изучении патологий у человека и животных. Основным источником для восполнения клеточных потерь при поражениях органа являются дифференцированные гепатоциты. В процессы восстановления массы печени вносят вклад пролиферация, полиплоидизация и гипертрофия гепатоцитов. Преобладание одного из названных процессов при регенерации печени зависит от возраста и видовой принадлежности организма, а также от функциональной нагрузки (Сидорова, 1967; Лиознер и др., 1972; Сидорова, Юдина, 1976; Кудрявцев, 1991; Кудрявцев и др., 1991; Fauso, 2000).

В частности: 70-80% репаративного роста нормальной и цирротически измененной печени крыс после частичной гепатэктомии осуществляется за счет пролиферации гепатоцитов. Остальные 20-30% приходятся на клеточную гипертрофию (Бреслер и др., 1969). В печени человека, важным фактором принормальном и репаративном росте является увеличение числа клеток путем полных митотических делений диплоидных гепатоцитов (Кудрявцев и др., 1982; Завадская, 1989). При хроническом повреждении, рост печени у человека и крыс осуществляется за счет полиплоидизации и гипертрофии (Завадская, 1989; Кудрявцев, 1991). В патологически измененной печени идет преимущественная пролиферация клеток с относительно низкой плоидностью (Завадская, 1989).

Регенерирующая печень мыши представляет собой удобную модель для исследования процессов, происходящих в гепатоцитах на разных стадиях клеточного цикла. Детально изучена кинетика вступления клеток в пролиферацию, длительность каждой фазы цикла и особенности пролиферации клеток разных классов плоидности (Фактор, 1971; Фактор, Урываева, 1972; Урываева, Фактор, 1974). Обнаружено, что параметры клеточного цикла отличаются для клеток печени мышей разных линий (Лиознер и др., 1972; Сидорова, 1967); торможение митотической активности выявлено у гипофизэктомированных мышей (Сидорова, Бардик, 1971). Показано, что различные повреждающие воздействия вызывают вступление в цикл основной массы гепатоцитов (Урываева, Фактор, 1975). В результате, возрастает плоидность и размер гепатоцитов.

На ультраструктурном уровне в гепатоцитах регенерирующей печени крыс обнаружены конденсация матрикса митохондрий, снижение количества гликогена и исчезновение телец Берга в первые часы после операции (Cardoso et al., 1980). Зафиксировано появление «липидного материала» в межклеточном пространстве. Через 24 часа авторы констатируют увеличение пространства Диссе и длинны микроворсинок на поверхности гепатоцитов, а также расширение перинуклеарного пространства, канальцев ЭПР и цистерн аппарата Гольджи. Регистрируется увеличение размеров ядер и гипертрофия ядрышек. Митохондрии перераспределяются в околоядерную область и набухают. Изменяется состав и локализация лизосом, активируются некоторых лизосомные ферменты (Adams, 1963). Обнаружено перераспределение лизосом в околоядерную область (Маянская и др., 1977). Максимум морфологических изменений в клетках печени крысы, и увеличение массы органа происходит в первые трое суток после частичной гепатэктомии и завершается делением гепатоцитов. Затем строение большинства гепатоцитов приближается к норме.

При регенерации печени имеет место количественное и качественноеизменение синтеза белков плазмы, а также усиление синтеза собственных белков печени (Абелев и др., 1963а, б). Зарегистрированы резкие колебания количества гликогена в гепатоцитах печени после частичной гепатэктомии (Бреслер и др., 1969; Кудрявцев, 1991).

Установлено, что в печени крыс после частичной гепатэктомии происходит падение уровня синтеза полисахаридов в аппарате Гольджи, что приводит к изменению состава внеклеточного матрикса (Ма1Биуа е1 а1., 2001).

Следует также отметить, что описанные изменения зависят от локализации гепатоцитов и функциональной нагрузки, поскольку регенерация печени не препятствует ответу клеток печени на внешние сигналы. Так, стимуляция желчеобразования приводила к усилению регенеративных процессов.

На ультраструктурном уровне при длительных хронических повреждениях печени исследователи в одних случаях описывают усиление накопления гликогена пропорциональное тяжести поражения (Кудрявцева и др., 1989), а в других случаях - обеднение клеток гликогеном, вплоть до полного его исчезновения (Вакулин, Якобсон, 1975). При циррозе печени в клетках наблюдают вакуолярную и жировую дистрофию, гипертрофию гранулярного ЭПР, уплотнение матрикса митохондрий. В гепатоцитах цирротической печени после частичной гепатэктомии также отмечается гипертрофия отдельных органоидов клетки и в том числе аппарата Гольджи (Калашникова, 2003).

При острой адаптации гепатоцитов к повышению концентрации глюкозы в среде, происходят изменения строения митохондрий; при субстратной индукции перестраивается ЭПР и митохондрии; при гормональной индукции — ядра, митохондрии и ЭПР (Бреслер и др., 1969; Калашникова, 2003). При повреждениях печени отмечается снижение некоторых тканеспецифических функций в пролиферирующих гепатоцитах (Урываева, 1987). При циррозе описывают смещение аппарата Гольджи от желчного капилляра к плазматической мембране, увеличение десмосом и отходящих от них пучков филаментов (Вакулин, Якобсон, 1975). Исследователями высказывалось предположение, что увеличение аппарата Гольджи в цирротически измененной печени является отражением компенсаторных реакций гепатоцитов. Нарушение компенсаторной функции аппарата Гольджи при многократном воздействии повреждающего агента, по мнению авторов, приводит к некрозу гепатоцитов. Количественного анализа перестроек аппарата Гольджи в этих работах не проводилось.

В ряде случаев при патологических состояниях, экспериментально индуцированном канцерогенезе мобилизуется система резервных стволовых клеток печени. Основным претендентом на роль стволовых клеток печени, в современной литературе являются овальные клетки или их предшественники (Урываева, Фактор, 1979; Schwarze, 1984; Fauso et al., 1987; Урываева, Фактор, 1988; Радаева, Фактор 1990 а,б; Радаева, 1991; Фактор, Радаева, 1991; Schwarze, 1991; Урываева, 1997; Novikoff, Yam, 1998; Darlington, 1999; Lowes et al., 1999; Paku et al., 2001; Малайцев и др., 2002). Они появляются в явном виде спустя 1-3 недели после индукции пренеопластических процессов, гепатоканцерогенезе и некоторых других формах патологии печени (Фактор, Радаева, 1991; Урываева, 1997; Lowes etal., 1999).

Овальные клетки имеют значительные морфологические отличия от гепатоцитов, но при определенных условиях способны дифференцироваться в гепатоциты (Фактор и др., 1990; Энгельгардт и др., 1991). Окончательное восполнение утраченной в ходе гепатоканцерогенеза ткани происходит за счет вновь образованных гепатоцитов. Другая часть овальных клеток, инфильтрующих паренхиму, развивается по холангиоцитарной линии дифференцировки и формирует систему разветвленных протоков, организованных по типу желчного эпителия (Урываева, Фактор, 1988; Радаева, 1991).

Печень в онтогенезе многоклеточных организмовХарактерной особенностью эмбриональной печени в первой половине эмбриогенеза является наличие многочисленных очагов кроветворения. В последнюю неделю эмбриогенеза происходит постепенное замещение сетчатой структуры дольчатой и непрерывное совершенствование строения сосудистых долек. Однако, даже в первые дни после рождения, структура печени не соответствует организации печени взрослых животных. В течение последней недели эмбриогенеза и в первый день после рождения происходят существенные изменения в строении и цитохимии паренхиматозных клеток. Округлые митохондрии собираются в околоядерную область и сливаются в нитевидные структуры. Уменьшается количество глыбок хроматина (Калашникова, 2003).

Аппарат Гольджи по наблюдениям многих авторов, исследовавших клеткипечени разных животных и человека, на ранних стадиях эмбриогенеза расположенный вокруг ядра в виде сетки, перемещается к участку плазматической мембраны, образовавшей к этому времени желчный капилляр. Изменение размеров цистерн в этот период трактуется, как показатель интенсивности секреторных процессов. Причем авторы особо отмечают, что перемещение уже сформированного аппарата Гольджи не связано с образованием желчного капилляра (Макаров, 1953; Маховер, 1965; Бреслер и др., 1969; Калашникова, 1971, 2003).

Увеличивается количество и длина цистерн ЭПР, а также общая базофилия цитоплазмы. Начиная с 18 суток в гепатоцитах эмбрионов крыс возрастает количество гликогена. Его отложения занимают значительные участки цитоплазмы и представляют собой «бесструктурные зоны». У 21 дневных крысиных эмбрионов и новорожденных крысят содержание гликогена в печени резко падает.

Различий в строении клеток разной локализации эмбриональной печени, характерных для гепатоцитов взрослых животных, не обнаружено.

Все эти изменения трактуются авторами цитируемых работ, как ранние проявления дифференцировки, сопряженные с инициацией генов, отвечающих за специфические для печени синтетические процессы (Zaret, 1998, 2001; Darlington, 1999).

В печени куриного эмбриона морфологическая дифференцировка гепатоцитов заканчивается перед вылуплением, т.к. с 13 суток развития эмбрион переходит на частичное кишечное питание. Начиная с 6 суток эмбрионального развития цыпленка начинается формирование желчных капилляров и увеличение везикулярного компартмента в этой области. Аппарат Гольджи увеличивается и смещается по направлению к желчному капилляру (Калашникова, 19816).

В печени млекопитающих после рождения происходит полиплоидизация клеток. При этом у животных разных видов степень полиплоидизации клеток и кинетика полиплоидизации могут различаться очень существенно (Бродский и др., 1973; Nagl, 1978; Завадская, 1989; Штейн, 1991; Zybina, Zybina, 1996; Анисимов, 1998).

Паренхима печени новорожденных мышей содержит диплоидные клетки, которые интенсивно делятся, увеличивая свою численность. Уже в первые дни постнатальной жизни, появляются двуядерные 2сх2 гепатоциты, затемодноядерные 4с, позднее — 4сх2, и т.д. Такая последовательность становления классов гепатоцитов была найдена в результате морфологических и цитофотометрических исследований (Epstein, 1967; Урываева, Ланге, 1971; Бродский и др., 1973).

В печени 7-13 дневных мышей линии CBA\C57BL около 10% всех гепатоцитов находятся в клеточном цикле (Урываева, Ланге, 1971; Бродский и др., 1973), причем популяция состоит из диплоидных и тетраплоидных клеток. Считается, что у новорожденных и молодых до 4 недель мышей в митоз входят главным образом диплоидные клетки. Существуют данные об импульсном характере пролиферации гепатоцитов (Miljutina et al., 1978)У крыс пролиферативные процессы в диплоидной печени продолжаются в течение первых трех недель, после чего идет интенсивная полиплоидизация клеток. Морфологическая дифференцировка гепатоцитов крыс по данным Калашниковой завершается к 30 суткам после рождения животного, что связано с изменениями рациона питания. Показано, что задержка перевода крысят с молочного питания на самостоятельное препятствует дифференцировке гепатоцитов (Калашникова, 2003).

В раннем постнатальном развитии у крыс (первые 14 суток) наибольший вклад по сравнению с другими периодами вносят пролиферация (61-68%) и гипертрофия клеток (30-39%), которая обусловлена увеличением числа и размеров органелл вследствие интенсификации функции печени. Полиплоидизация вносит заметный вклад (34-47%) в увеличение массы печени в период с 14 по 60 сутки. Рост печени крыс от 2 до 6 месяцев обеспечивается в основном пролиферацией гепатоцитов (76%) (Кудрявцев, 1991).

Показано, что в первые четверо суток после рождения у крыс наблюдаются резкие изменения в гепатоцитах, такие как, уменьшение количества гликогена, появление большого количества пероксисом и гипертрофия митохондрий (Калашникова, 1971; Ульянова, Котовский, 1971). Исследователи объясняют эти изменения переходом на молочное питание, и адаптацией всего организма к изменившимся внешним факторам (Калашникова, 2003).

В работе Калашниковой на отдельных ультратонких срезах печени новорожденных крыс отмечено, что в 1-4 сутки развития в одних клетках аппарат Гольджи в виде везикул располагается у желчного капилляра, а в других клетках локализован около ядра в виде мелких цистерн (Калашникова, 1971, 2003).

Позднее с 4 по 14 сутки отмечено общее увеличение размеров аппарата Гольджи и прилегающего к нему везикулярного компартмента, локализованных около желчных капилляров (Калашникова, 1971; Ульянова, Котовский, 1971). В этот период в печени идут активные митотические процессы и встречаются отдельные крупные гепатоциты (Калашникова, 1971). Первые двуядерные клетки в печени крыс - около 4.6% обнаруживают на 22 сутки постнатального развития (СшёоШ' е1 а!., 2003). По наблюдениям исследователей, морфологические изменения заканчиваются в печени крыс к 30 суткам постнатального развития. Задержка процессов полиплоидизации гепатоцитов наблюдается при изменении в режиме и рационе кормления.

Постнатальный рост печени человека осуществляется преимущественно за счет митотических делений диплоидных гепатоцитов. Увеличение массы печени в постнатальном развитии более чем в 12 раз происходит за счет гипертрофии. По данным литературы (Кудрявцев и др., 1991; Штейн, 1991), у человека около 90% клеток в период интенсивного роста (до 20 лет) составляют диплоидные одноядерные гепатоциты. Относительное число двуядерных клеток с диплоидными ядрами увеличивается до 7% к 20 годам. Полиплоидные клетки встречаются у новорожденных в небольшом количестве.

В первые годы после рождения в печени человека, как и в печени грызунов, преобладает пролиферативная активность, в ходе старения процессы полиплоидизации следуют схемам, описанным для печени грызунов. В качестве особенностей процесса полиплоидизации гепатоцитов в онтогенезе у человека авторы отмечают: 1. прямые переходы 2с-4с при старении; 2. отсутствие снижения пролиферативной активности гепатоцитов с увеличением степени их плоидности.

Как основная причина изменений ультраструктурной организации клеток печени в постнатальном развитии млекопитающих, исследователями называется изменение пищевого режима - переход сначала на молочное, а затем на смешанное питание (Калашникова, 1971).

В печени старых крыс наблюдается увеличение расстояния между соседними гепатоцитами, изменения в структуре коллагеновых волокон, увеличение площади десмосом и толщины отходящих от них филаментов. В клетках зарегистрировано уменьшение относительных объемов митохондрий, гранулярного ЭПР и комплекса Гольджи. В ядре увеличивается содержаниегетерохроматина, а в цитоплазме часто встречаются лизосомы (Ульянова, Котовский, 1971; Калашникова, 2003).

В паренхиме печени человека после 45 лет нарастает число полиплоидных клеток, достигая 25% в период старения (единичные - 16с) (Кудрявцев и др., 1982; Завадская, 1989; Штейн, 1991). К 90 годам диплоидные одноядерные клетки составляют порядка 60%.

Популяция гепатоцитов у взрослых животных представлена долгоживущими необновляющимися клетками, потенциальная длительность жизни которых и число репродуктивных циклов не ограничены. В интактной печени взрослых мышей гепатоциты находятся в обратимой Со фазе митотического цикла и лишь в единичных случаях - в 01 фазе (Ьа^Ьа, 1963; Онищенко, 1989). В нормальной печени практически отсутствуют клетки, длительно находящиеся в вг фазе.

В литературе интенсивно обсуждается вопрос о сходстве и различиях клеточных механизмов постнатального роста печени с механизмами репаративной регенерации. Данные, полученные до сих пор, свидетельствуют, что в раннем постнатальном развитии до 14 суток, в печени крыс пролиферативные процессы и гипертрофия клеток преобладают над вкладом полиплоидизации в увеличение массы печени (Сидорова, 1967).

Исследователи считают, что основными проявлениями дифференцировки гепатоцитов в ходе эмбрионального развития является усложнение ультраструктуры гепатоцитов: увеличение ЭПР, появление гликогена, нарастание числа митохондрий и формирование желчных капилляров. В постнатальном развитии дифференцировка также описывается, как нарастание числа органелл и их перераспределение в клетках. Механизм, поддерживающий определенное число и локализацию органелл не обсуждается (Калашникова, 1971,2003).

Регенерация печени и репаративный рост печени при циррозе связаны главным образом с клеточной пролиферацией, вклад гипертрофии и полиплоидии незначительны.

Таким образом, несмотря на активное изучение процессов в печени на тканевом и ультраструктурном уровне, исследование аппарата Гольджи, играющего важную роль в тканеспецифических синтезах и возможно, встановлении полярной организации дифференцированных гепатоцитов не проводилось. Данные о локализации и размерах аппарата Гольджи носят отрывочный и описательный характер. Главным образом небольшие стопки цистерн описаны вблизи желчных капилляров. Ни в одной из работ не обсуждается положение аппарат Гольджи в гепатоцитах по отношению к центросоме. Не обсуждается изменение объема аппарата Гольджи в гепатоцитах разной плоидности, хотя неоднократно показано, что в гепатоцитах пропорционально увеличению объема ДНК увеличиваются синтетические процессы.

Клеточный центрКлеточный центр играет важную роль в организации компартментов в клетке. Обнаруженный сначала на световом уровне, а затем подробно описанный на электронно-микроскопическом уровне, клеточный центр представляет собой совокупность структур, в той или иной степени представленных в разных типах клеток. Центросома - одна из составляющих клеточного центра участвует в формировании микротрубочек на протяжении всего клеточного цикла. Она состоит из центриолей и перицентриолярного материала (Воробьев, Надеждина, 1987). Окружающие центросому микротрубочки, а также располагающиеся в этой зоне везикулы, образуют центросферу (Онищенко, 1993).

Центриоль представляет собой полый цилиндр, образованный 9 триплетами микротрубочек диаметром 0,2-0,3 мкм. Длина центриолярного цилиндра - 0,3-0,7 мкм. Пространство между триплетами заполнено электронно-плотным аморфным материалом, называемым центриолярным матриксом (Воробьёв, Надеждина, 1987; Альберте и др., 1994). Размеры центриолярного цилиндра несколько варьируют в разных типах клеток. Гепатоциты в частности, имеют центриоли диаметром 0,2-0,25 мкм, и длиной - 0,35-0,5 мкм (Онищенко, Ченцов; 1986).

В зависимости от положения центриоли в пространстве различают ее дистальный и проксимальный концы. Угол наклона триплетов увеличивается по длине цилиндра в проксимальном направлении (Воробьев, Надеждина, 1987; Andersen, 1999).

Число, размеры и расположение сателлитов варьирует в разных клетках. На одну центриоль может приходится 1-5 сателлитов. (Vorobjev, Chentsov, 1982; Lange et al., 2000). Сателлит имеет «головку» и конусовидное поперечнополосатое основание, которое крепится к 2-3 триплетам центриоли одновременно (Воробьев, Надеждина, 1987; Зиновкина, Надеждина, 1996). Показано, что головки сателлитов могут служить центрами организации микротрубочек (ЦОМТ) (Vorobjev, Chentsov, 1982). Встречаются неактивные, как ЦОМТ сателлиты - без головок (Онищенко, Ченцов, 1986). В постсинтетическом периоде интерфазы сателлиты исчезают; одновременно с этим процессом появляется фибриллярное гало, которое в митозе служит центром образования микротрубочек веретена деления (Vorobjev, Chentsov, 1982).

Материнская центриоль способна образовывать первичную ресничку. Одновременно она может иметь сателлиты, от которых отходят микротрубочки. In vitro ресничка чаще образуется в покоящихся клетках, in vivo реснички обнаруживают в пролиферирующих эмбриональных клетках (кардиомиобластах и миобластах). Клетки печени лишены ресничек, но при высадке в культуру, в покоящихся гепатоцитах реснички могут появляться.

Дочерняя центриоль не имеет придатков и сателлитов, 2/3 её внутреннего объёма занимает осевая структура, от которой по направлению к микротрубочкам отходят радиальные элементы. Такое образование получило название "ось соспицами". Дочерняя центриоль, как правило, неактивна как центр организации микротрубочек, или ассоциирована с фибриллярным материалом, который служит центром организации микротрубочек (Schliwa, 1978; Vorobjev, Chentsov, 1982; Быстревская и др., 1988).

В большинстве исследованных животных клеток ультраструктура центриолей удивительно консервативна, в то время как другие компоненты центросомы могут быть выражены в разной степени, или не присутствовать совсем.

В литературе обсуждают такие функции центриолей, как репликация, формирование разных категорий микротрубочек в течение клеточного цикла, возможность образовать материнской центриолью первичную ресничку, организация перицентриолярного материала и центросомы (Vorobjev, Chentsov, 1982; Быстревская и др., 1988; Joshi, 1994; Marshall, 2001).

Перицентриолярный материал в интерфазе может быть представлен в форме перицентриолярных придатков, сателлитов, центров организации микротрубочек (ЦОМТ), центросомного матрикса, а в митозе организован в виде гало (Vorobjev, Chentsov, 1982; Онищенко, 1993, Krämer, Но, 2001).

Исследование бесцентриолярных клеток и экспериментально индуцированное разрушение центриолей показало, что функцию нуклеации центросомных микротрубочек выполняют компоненты перицентриолярного материала. В перицентриолярном материале часто располагаются свободные центры нуклеации (затравки) микротрубочек, имеющие вид колец и спиралей диаметром около 30 нм (Зиновкина, Надеждина, 1996). Они получили название фокусов схождения микротрубочек (Воробьев, Надеждина, 1987). Кроме того, в области клеточного центра обнаруживаются плотные т.н. "вирусоподобные частицы" (ВПЧ); функция их пока не известна.

Известно большое число белков входящих в состав центросомы (Зиновкина, Надеждина, 1996). Центриоли состоят из глютаминированного а- и ß-тубулина. Один из постоянных компонентов центросомы - у-тубулин. Ему отводят роль "затравки" для нуклеации микротрубочек (Joshi, 1994; Balczon, 1996; Andersen, 1999). Перицентрин - структурный белок перицентриолярного материала, участвует в пространственной организации сборки микротрубочек. Центрин (Са2+-связывающий белок, кальтрактин) - основной белок исчерченныхкорешков, обнаружен также в сателлитах и перицентриолярном матриксе; участвует в дупликации центриолей (Salisbaiy, 1995). Недавно в работе Gromley с соавторами описан белок центриолин, ассоциированный с материнской центриолью, а именно с сателлитами. По мнению авторов, этот белок участвует в терминации процесса цитокинеза, а также регулирует вступление клеток в S фазу клеточного цикла (Gromley et al., 2003). В зрелой материнской центриоли присутствует белок ценексин (Зиновкина, Надеждина, 1996; Lange et al, 2000). Антитела к белку РСМ-1 - окрашивают область центросомы. Этот белок ассоциирован с микротрубочками в цитоплазме клеток культуры (схема. 1). В цилиарных клетках и эпителии почки белок РСМ-1 локализован в апикальной части. В печени этот белок обнаружен в области желчных капилляров. По электронно-микроскопическим данным белок РСМ-1 локализуется на сателлитах. Предполагается, что характер распределения этого белка в интерфазе определяется его взаимодействием с микротрубочками через динеин (Marshall, 2001; Kubo, Tsukita, 2002). C-Napl - соединяет проксимальные концы центриолей в интерфазе через киназу Nek2 (Mayor et al., 2000). p210 - белок, связывающийся с придатками центриолей, играет роль во взаимодействии с плазматической мембраной (Marshall, 2001). Приведенный выше список далеко не полон и продолжает пополняться. В состав центросомы входит также большая группа моторных белков.

Распределение некоторых центросомных белков свойственно большинству исследованных клеток и может изменяться только в ходе клеточного цикла. Локализация других белков варьирует в зависимости от типа клеток, степени их дифференцировки, поляризации и характера взаимодействия с внеклеточным матриксом. Например, центриолин, ассоциированный с сателлитами в перевиваемой культуре, in situ в клетках ресничного эпителия уха мыши окрашивает нецентросомные ЦОМТ в апикальной части клетки (Gromley et al., 2003).

Таким образом, структура клеточного центра представлена целым комплексом органелл. И, вероятно, функциональная активности центросомы в конкретной клетке зависит от составляющих ее компонентов (Онищенко, 2000).

Центросома в клеточном циклеНа протяжении клеточного цикла строение и функции центросомыизменяются (Vorobjev, Chentsov, 1982; Онищенко, Ченцов, 1986; Воробьёв, Надеждина, 1987; Онищенко, 1993; Krämer, Но, 2001; Marshall, 2001). К числу основных преобразований следует отнести изменения центриолярного аппарата, изменение химического состава центросомного материала, типа и числа микротрубочек, формируемых центросомой в разные периоды клеточного цикла. Значение таких преобразований оказывается решающим при вступлении клеток в митоз и образовании полюсов веретена деления, нуклеации митотических микротрубочек и сегрегации хромосом.

В Gi периоде в диплоидной клетке присутствуют две центриоли, одна из которых может содержать сателлиты. В S-периоде на боковой части цилиндра существующих центриолей происходит закладка и рост процентриолей. Рост дочерних центриолей продолжается и в С2-периоде. Все центриоли на этой стадии формируют диплосомы, сателлиты обнаруживаются лишь изредка и при этом лишены головки. Обычно, вместо них около обеих материнских центриолей начинает образовываться фибриллярное гало - центр организации микротрубочек веретена деления (Vorobjev, Chentsov, 1982). Образование гало наблюдается и в клетках, заблокированных в G2 фазе, т.е. до вступления клеток в митоз (Крючкова и др., 1986).

Выделяют несколько «контрольных точек», в которых события клеточного и центриолярного цикла однозначно совпадают в разных типах клеток: репликация центриолей в S периоде, преобразования центриолей в митозе, в результате которых материнская и дочерняя центриоли предшествующего клеточного цикла становятся морфологически и функционально эквивалентными, разъединение диплосомы в Gi фазе (Воробьев, Надеждина, 1987). Другие события центриолярного цикла не имеют такой строгой связи с клеточным циклом.

Зависимость центриолярного цикла от клеточного доказана не только в результате морфологических исследований, но и подтверждена биохимически. Показано, что дупликация центриолей, идущая в S периоде, зависит от активности циклинов Е и A (Winey, 1999; Marshall, 2001). Распад диплосомы (или разъединение материнской и дочерней центриолей) так же, как и терминация роста, регулируется циклинами.

Однако, в последние годы становится все более очевидным, что не только ценросомный цикл зависит от клеточного. Существует, по крайней мере, несколько точек в клеточном цикле, когда его продолжение зависит от событийцентросомного цикла. В литературе выделяют еще одну функцию центросомы в интерфазе - прогресс клеточного цикла (Сгот1еу еХ а1., 2003).

Так, разъединение центриолей является обязательным в клеточном цикле и всегда предшествует началу синтеза ДНК. Показано, что разрушение центриолей препятствует инициации репликации ДНК в следующем митотическом цикле (ШЬекоу е1 а!., 1995; КЪоф'акоу, Шескг 2001). Сгош1еу с соавторами обнаружено участие одного из белков материнской центриоли - центриолина в регуляции вступления клеток в Б фазу и терминации митоза (Сгош1еу е1 а1., 2003). Выявлено, что белок р27, блокирующий образование центриолей, ингибирует активность циклина Е (Ьасеу еХ а1., 1999). Увеличение числа центриолей в экспериментах с цитохалазином Д приводят к блоку двуядерных нетрансформированных клеток в С( фазе клеточного цикла (АпскеаББеп е1 а1., 2001). Проводимые в этой области работы указывают на существование механизма, объединяющего центриолярный и ядерный циклы.

Действительно, в большинстве клеток ядерный и центриолярный циклы взаимосвязаны (Онищенко, 1978; УогоЬ^еу, СЬе^БОУ, 1982; Онищенко, 1989; 1993; 1лп§1е, БаНзЬагу, 1999). Имеет место корреляция между числом центриолей и хромосомных наборов (Москвин-Тарханов, Онищенко, 1978; Онищенко, 1989).

Центриолярный цикл пролиферирующих гепатоцитов при регенерации имеет сходные черты с центриолярным циклом в других клетках (Онищенко, Ченцов, 1986; Онищенко, 1993). В фазе половина из имеющихся в гепатоците центриолей несут придатки и сателлиты, служащие центрами организации цитоплазматических микротрубочек. В Б фазе происходит закладка дочерних центриолей и их рост. В С2 фазе продолжается рост дочерних центриолей ивокруг диплосом образуется фибриллярное гало, которое выполняет функцию центров организации митотических микротрубочек. В то же время, центриолярному циклу гепатоцитов присущи и свои особенности. Гепатоциты отличаются от клеток пролиферирующих культур тем, что после получения стимула их пролиферативная активность продолжается лишь в течение одного митотического цикла, и после прохождения митоза они оказываются в С0 фазе.

Таким образом, морфологические характеристики центриолярного комплекса в гепатоцитах на разных стадиях клеточного цикла могут служить для идентификации положения гепатоцита в клеточном цикле и позволяют судить оклассах плоидности исследуемых гепатоцитов (Онищенко, Ченцов, 1986).разобщение центросомного и ядерного циклов В ряде случаев, репликация центриолей может идти независимо от репликации ДНК (Stublefield, De Foor, 1972; Rattner, Phillips, 1973; Kuriyama et al., 1986; Gart et al., 1990; Sluder et al., 1990;, Balczon et al., 1995; Tanaka et al., 1998). Такое явление характерно для терминальной дифференцировки некоторых типов клеток и может сопровождаться аномалиями в числе и строении центриолей. Аномальное число центриолей, связанное с нарушением клеточного цикла, встречается при патологических процессах, в трансформированных клетках, а также может быть индуцировано целым рядом агентов.

В качестве ингибиторов клеточного цикла используются такие вещества, как тимидин, кофеин, метотрексат, колхицин, афидиколин, гидроксимочевина, дипин и др. Среди перечисленных, только некоторые агенты отмечены, как нарушающие регуляцию центросомного цикла. Мы рассмотрим действие на центриолярный цикл двух агентов: гидроксимочевины и дипина.гидроксимочевина Существующие в литературе данные свидетельствуют, что воздействие на клетки гидроксимочевиной приводит к разобщению хромосомного и центросомного циклов (Balczon et al.; 1995).

Активное изучение механизма воздействия гидроксимочевины обусловлено широким применением этого агента в комплексной химеотерапии раковых больных. Гидроксимочевина обратимо ингибирует репликацию ДНК, подавляя действие рибонуклеотид редуктазы и снижая уровень Cdc25A фосфатазы (Lagergren, Reichard, 1987; Досон и др., 1991; Molinari et al., 2000). По данным литературы, воздействие гидроксимочевиной блокирует ядерный цикл в Gi или в ранней S фазе, не препятствуя дальнейшему прохождению центриолярного цикла (Tomita, Рlager, 1979; Morgan, Straus, 1980; Maurer-Shultze et al., 1988; Cao et al., 1991; Balczon etal., 1995).

Обнаружено, что воздействие гидроксимочевины в концентрации 0,5мг/г веса приводит к гибели основной массы клеток, находящихся в S фазе. Клетки, находящиеся в Gi фазе, устойчивы к воздействию гидроксимочевины. Показано, что нечувствительные к цитотоксическому воздействию гидроксимочевины клетки Gi фазы накапливаются на границе G\/S и после снятия воздействиябыстрее вступают в митоз, чем контрольные клетки (Маигег-БЬи1ие е1 а1., 1988).

На клетках китайского хомячка СНО, заблокированных гидроксимочевиной (2шМ) на границе й^Б фаз, доказана возможность многократной репликации центросомы в отсутствии синтеза ДНК и митоза. Уровень мРНК, кодирующей РСМ-1, в норме падающий в йг периоде, при обработке гидроксимочевиной остается высоким, что, по мнению авторов, и объясняет способность центросомы пройти несколько независимых циклов удвоения (Ва1сгоп е1 а1., 1995). Показано, что недостаток в среде культивирования ростовых факторов препятствует репликации центросомы.

В работе авторы обсуждают вопросы регуляции клеткой процессов репликации центросомы на молекулярном уровне и на основании полученных результатов отдают предпочтение теории, согласно которой существует отдельный механизм активации и инактивации репликации центросомы в соответствии с циклом соматической клетки (Ва1сгоп е1 а1., 1995).дипинПоказано, что дипин также в определенных условиях воздействия, приводит к разобщению ядерного и центриолярного циклов (Фактор и др., 1979; Крючкова и др., 1986; Онищенко, 1989).

Дипин относится к классу полифункциональных алкилирующих соединений, обладающих ярко выраженными мутационными свойствами. Этот препарат вызывает одинарные и двойные разрывы молекулы ДНК и межнитевые и внутринитевые сшивки. В результате возникают поломки хромосом в клетках, прошедших фазе синтеза ДНК.

На гепатоцитах регенерирующей печени мыши разработана и детально изучена модель репопуляции печени, поврежденной действием дипина. Введенный в концентрации 60 мкг/г за 2 часа до частичной гепатэктомии, дипин приводит к длительной (до 20 суток) синхронизации популяции гепатоцитов в йг фазе, (Фактор и др., 1979). На этой модели проведено исследование строения центриолярного комплекса (Крючкова и др., 1986). Анализ структуры центриолярного комплекса выявил разобщение центриолярного и хромосомного циклов в регенерирующих гепатоцитах мыши в результате Сг блока. В течение 37 суток после операции структура центриолярного аппарата в гепатоцитах изменяется, приобретая последовательно черты центриолей Сг, а затем С| фаз, после чего в печени появляются клетки имеющие структуру центриолярногокомплекса, характерную для во фазы (Крючкова и др., 1986).

Организация центриолярного комплекса при действии дипина соответствует в основных чертах морфологии центриолей в гепатоцитах регенерирующей печени. Но существуют два важных отличия. Во-первых, при действии дипина в гепатоцитах почти полностью отсутствуют микротрубочки, как ассоциированные с перицентриолярными сателлитами, так и свободно лежащие в районе клеточного центра. Во-вторых, при задержке в С2-периоде происходитразобщение центриолярного и хромосомного циклов таким образом, что центриолярный цикл оказывается более продвинутым по сравнению с хромосомным. Следовательно, анализ гепатоцитов, блокированных в 02-фазе дипином, позволяет предполагать, что данное воздействие влияет на центросому, ингибируя ее активность в качестве центра организации микротрубочек, но не изменяют цикла репродукции центриолей.

Однако до сих пор остается неясным, как изменяется перицентриолярный материал центросомы при блоке клеток в разных фазах клеточного цикла -происходит ли его увеличение:1. пропорционально увеличению числа центриолей;2. пропорционально увеличению объема всей клетки.

3. пропорционально увеличению только ее генетического материала.

На сегодняшний день нет возможности одновременно проанализировать динамику изменения числа центриолей, объема центросомного материала и количества ДНК в клетке на свето- или электронно-микроскопическом уровнях. На светомикроскопическом уровне, препятствием для такого рода исследований является, в первую очередь, отсутствие маркеров, специфичных только для центриолей, которые бы выявляли число центриолярных цилиндров в клетке. На электронно-микроскопическом уровне сложно составить представление о составе и локализации компонентов центросомного материала в объеме клетке в ходе клеточного цикла и при дифференцировке.

Как уже упоминалось, центриолярный цикл объединен с морфофункциональными преобразованиями фибриллярного материала, также являющегося компонентом центросомы. В определенные моменты клеточного цикла изменяется состав центросомы - отдельные компоненты ее могут выявляться в разных компартментах клетки (КиЬо, ТБикИа, 2002). В ходеклеточного цикла изменяется и активность центросомы, как центра организации микротрубочек.

Высказывалось предположение, что на активность центросомы в качестве центра организации микротрубочек влияет число активных центриолей, входящих в ее состав (Sato et al., 1983; Kuriyama, 1984).

Разнообразные аномалии центриолярного и центросомного циклов обнаружены в опухолевых клетках. Существует предположение, что нарушение числа центриолей, или неправильное распределение центросомного материала в полюсах веретена деления может быть причиной образования анеуплоидных клеток, дающих начало клону опухолевых клеток в результате неправильного распределения генетического материала между дочерними клетками (Lingle, Salisbury, 2000).

Вероятно, взаимосвязь событий клеточного цикла, процессов репликации центриолей и их расхождения к полюсам во время митоза обеспечивают поддержание постоянного числа центриолей и количества центросомного материала в клетке. Нарушение этой взаимосвязи может наблюдаться в случае изменении хода клеточного цикла при дифференцировке.

Комплекс ГольджиСтруктура, описанная как комплекс Гольджи, была обнаружена в начале 20 века, В процессе исследования многими авторами выдвигались разные гипотезы, касающиеся связи архитектуры и функций аппарата Гольджи, однако ясности в этом вопросе до сих пор нет (Насонов, 1923; Уэйли, 1978; Shima et al., 1997). Отдельные наблюдения указывают на то, что в разных типах клеток расположение и организация аппарата Гольджи зависят от функций, выполняемых этими клетками, степени их дифференцировки или видовой специфичности (Калашникова, 1981а, 2003; Shorter, Warren, 2002). В ряде работ обсуждается морфология и преобразования, которые претерпевает комплекс Гольджи при изменении уровня белкового синтеза в клетке; при действии разных факторов; в результате трансформации. Открытым остается вопрос об изменениях аппарата Гольджи в ходе клеточного цикла и при его нарушениях.

Основные функции аппарата Гольджи — участие в биогенезе мембран, синтез сфиногмиелина и большинства гликосфинголипидов, посттрансляционнаямодификация и сортинг белков в соответствующие транспортные везикулы -характерны для всех клеток. Однако даже в пределах одной ткани морфология и функциональная активность комплекса Гольджи, присущая каждой клетки варьирует в соответствии с целым рядом внутриклеточных и внеклеточных факторов. Такими факторами могут являться активность тех или иных генов, положение клеток в цикле, полярность клетки, организация цитоскелета, направление транспортных потоков, активность клеточного центра. В качестве внешних факторов следует отметить взаимодействие с внеклеточным матриксом и соседними клетками, гормональную и функциональную активность организма, и также целый спектр физических и химических воздействий, которому подвергаются клетки.

На световом уровне комплекс Гольджи в клетках млекопитающих описан, как сетчатая структура, которая обычно расположена с одной стороны от ядра. Наряду с локальной выделяют диктиосомную или диффузную форму организации аппарата Гольджи, когда отдельные стопки цистерн - диктиосомы - распределены по объему клетки (Алов и др., 1966; Shorter, Warren, 2002; Colanzi et al., 2003). Каждая диктиосома состоит в среднем из 3-10 уплощенных цистерн удаленных на 15-20 нм друг от друга. Цистерны 2-3 соседних стопок могут быть соединены уплощенными тубулами. Тубулы диаметром 40-90 нм образуют ветвящиеся сплетения на цис- и транс- полюсах стопок аппарата Гольджи. Трехмерные реконструкции позволяют получить картину сложно организованной системы цистерн окруженных везикулами (Альберте и др., 1994; Clermont et al., 1995; Mironov et al., 1997; Миронов и др., 1998; Glick, 2000; Barr, 2002; Shorter, Warren, 2002).

На электронно-микроскопическом уровне с использованием иммунохимических методов (Ladinsky et al., 1999; Jesch, 2002; Lowe, 2002; Shorter, Warren, 2002) аппарат Гольджи в клетках позвоночных описан как стопки плоских цистерн полярных по составу белков и липидов.

У низших организмов и высших растений аппарат Гольджи существует в виде дискретных стопок, распределенных по всей цитоплазме (Satiat-Jeunemaitre, Hawes, 1994; Zeng, Locke, 1993; Stanley et al., 1997; Benchimol et al., 2001).

В дрожжевых клетках аппарат Гольджи представлен в виде единой структуры, ассоциированной с ЭПР и везикулярным компартментом (Morin-Ganet et al., 2000).

Локализация аппарата Гольджи в клеткахРасположение аппарата Гольджи около ядра на стороне, обращенной в направление секреции, характерно для многих секреторных клеток. В поляризованных клетках, имеющих апикальную и базолатеральную поверхности, различают два направления везикулярного транспорта. Доставка к базолатеральной поверхности во всех типах поляризованных клеток осуществляется через транс сеть аппарата Гольджи (TGN). Транспорт к апикальной поверхности различается в разных типах клеток.

В таких клетках, как гепатоциты, сортируемые молекулы сначала переносятся от аппарата Гольджи к базолатеральной поверхности плазматической мембраны, а затем путем трансцитоза передвигаются в апикальную часть (непрямой транспорт) (Bomsel, Mostov, 1991; Keller, Simons, 1997; Zegers, Hoekstra, 1998). Предполагают, что такие сложные перемещения осуществляются за счет специфической для поляризованных эпителиальных клеток организации микротрубочек (Mays et al., 1994).

В работах, где исследуется ультраструктура гепатоцитов, встречается описание диктиосом аппарата Гольджи, локализованных в разных участках цитоплазмы (Бреслер и др., 1969).

Калашниковой описана локализация элементов аппарата Гольджи вблизи желчных капилляров в виде цистерн небольшой протяженности в гепатоцитах рептилий, белого медведя и ламантина. Ядра у этих животных расположены рядом с базальным участком плазматической мембраны гепатоцитов. Однако отмечено, что у ламантина цистерны аппарата Гольджи встречаются и у ядра. Кроме того, в печени ламантина встречаются гепатоциты с разной организацией органелл. У личинок форели описана локализация аппарата Гольджи между ядром и желчным капилляром (Калашникова, 2003). В целом, особенности строения гепатоцитов разных позвоночных исследователи объясняют разницей в рационе питания и факторами внешней среды (Калашникова, 2003).

В ряде работ, касающихся полярности клеток, обсуждается пост-Гольджи транспорт: размеры везикул или тубул, сливающихся с плазматической мембраной, возможность дополнительной сортировки везикул в субапикальном компартменте (Keller, Simons, 1997; van IJzendoorn, Hoekstra, 1999; Polishchuk et al., 2000). Показано, что TGN компартмент хорошо развит в клетках с обширной лизосомной системой и сравнительно небольшими секреторными гранулами. Вклетках, формирующих средние и большие секреторные гранулы, TGN компартмент не развит, или совсем отсутствует (Clermont et al., 1995). В настоящее время активно дискутируется вопрос о регуляции процессов формирования везикул и слияния их с определенными компартментами. Одну из основных ролей в этом процессе отводят протеинкиназе A (Muniz et al., 1997).

Локализация и обмен мембранными компонентами между аппаратом Гольджи, ЭПР, TGN компартмента и плазматическая мембрана зависит от цитоскелетных структур и координируется работой Rho-GTPa3 (Thyberg, Moskalewski, 1985; Kreis et al., 1988; Pelham, 1991; Мажуль, 1997; Scales et al., 1997; Миронов и др., 1998; Ladinsky et al., 1999; Glick, 2000; Barr, 2002; Shorter, Warren, 2002; Wang, Hong, 2002).

Биогенез аппарата ГольджиИсследование клеток в культуре, клеток дрожжей и низших многоклеточных организмов сформировало представления о функциональной и морфологической связи вакуолярных систем в клетке и биогенезе комплекса Гольджи.

Ранее существовало представление о постоянных компартментах — аппарате Гольджи, ЭПР, плазматической мембране, между которыми курсируют везикулы с модифицируемыми белками, специфически сливаясь с этими компартментами (Kreis, 1990; Duden et al., 1991; Bannykh, Balch, 1997; Hong, 1998). Вновь синтезированные белки транспортируются из ЭПР в цис-компартмент аппарата Гольджи, проходят процедуру модификации, перемещаясь постепенно в транс-компартмент и затем поступают к месту назначения в клетке (плазматическая мембрана, лизосомы, ЭПР) или экскретируются. Освободившиеся трансмембранные белки, выполняющие рецепторные функции, возвращаются обратно в аппарат Гольджи (Thyberg, Moskalewski, 1985; Mironov et al., 1997; Мажуль, 1987; Bannykh, Balch, 1997; Barr, 2002; Shorter, Warren, 2002).

Последние исследования позволили выдвинуть гипотезу, согласно которой происходит постепенное созревание элементов ЭПР, содержащих вновь секретированные белки, и переход их в цис-компартмент аппарата Гольджи и затем в транс-часть аппарата Гольджи (Bannykh, Balch, 1997; Mironov et al., 1997; Миронов и др., 1998; Ladinsky et al., 1999; Glick, 2000; Barr, 2002). Этот процесс осуществляется при участии везикул (экзосом), покрытых белками - клатрином, СОР I и COPII (coat protein) (Duden et al., 1991; Мажуль, 1997; Bannykh, Balch,1997; Scales et al., 1997; Ladinsky et al., 1999). В процессе созревания экзосомы к ней присоединяется белковый комплекс, содержащий динеин, в результате чего она перемещается по микротрубочкам в направлении к клеточному центру и рядом расположенному комплексу Гольджи, формируя новую цис- цистерну или сливаясь с уже существующей. Источниками энергии для везикулярного транспорта служат АТФ и ГТФ (Мажуль, 1997).

Большое внимание в последние годы уделяется структурным или матриксным белкам golgins (в число которых входят GM130, Р115, golgin-45, giantin, GRASP и др.), входящим в состав аппарата Гольджи. Активность белков относящихся к этой группе регулируется малыми GTF-азами. Раскрыты такие функции этих белков, как участие в узнавании, присоединении и слиянии везикул, связывание везикул с цитоскелетом и, возможно, формирование «матрицы» или «скелета» аппарата Гольджи при его разрушении (Chan, Fritzler, 1998; Jesch, 2002; Barr, Short, 2003). К структурному компоненту мембран аппарата Гольджи относят также комплекс, образуемый p-спектрином и анкирином (Beck et al., 1997).

Существует две основные модели, описывающие процесс образования аппарата Гольджи (Lippincott-Schwartz et al., 1989; Rossanese, Glick, 2001; Barr, 2002; Jesch, 2002; Lowe, 2002; Shorter, Warren, 2002; Colanzi et al., 2003).

Согласно первой модели, аппарат Гольджи - органелла, зависимая структурно и функционально от ЭПР. Аппарат Гольджи образуется в результате последовательного встраивания в цистерны ЭПР, содержащие секретируемый белок, определенных ферментов, которые участвуют в процессе созревания (модификации) этого белка. Т.е. аппарат Гольджи является динамичной системой, а не постоянной органеллой в клетке (Lippincott-Schwartz et al., 1989; Boevink et al., 1998; Мажуль, 1997; Morin-Ganet et al., 2000; Ward et al., 2001; Barr, 2002; Jesch, 2002).

В пользу этой модели говорят результаты воздействия на клетки брефельдином А, в которых показано обратное встраивание белков аппарата Гольджи в ЭПР с участием элементов цитоскелета (Lippincott-Schwartz et al., 1989).

Другим доказательством зависимости аппарата Гольджи от ЭПР служат исследования клеток с гиперэкспрессией белка Sari р. Обнаружено, что нарушения в транспорте СОР II везикул (осуществляющих транспорт от ЭПР каппарату Гольджи) у мутантов по Sarlp белку (GTFa3a, участвующая в образовании СОР II везикул) препятствуют образованию аппарата Гольджи (Jesch, 2002).

В рамках этой модели, обсуждается возможность формирования аппарата Гольджи de novo при участии только ЭПР. При этом предполагается, что матриксные белки аппарата Гольджи встраиваются в мембрану из цитозоля, а вся система динамического равновесия создается за счет взаимодействия Sari-СОР II и ARF-1 коатомеров (Ward et al., 2001; Lowe, 2002).

Другая модель подразумевает существование независимой структуры в клетке, представляющей собой комплекс цистерн, которые содержат ферменты, необходимые для посттрансляционной модификации белков (Jesch, Linstedt, 1998; Shima et al., 1998; Pelletier et al., 2000; Lowe, 2002; Shorter, Warren, 2002; Seemann et al., 2002). Доказательством справедливости этой точки зрения может служить работа, проведенная на клетках африканской зеленой мартышки ВС-С1 с использованием световой и электронной микроскопии. Авторы отделяли часть цитопласта, не содержащую диктиосом аппарата Гольджи, и наблюдали, возникает ли в цитопластах аппарат Гольджи из ЭПР. Оказалось, что в цитопластах, которые изначально лишены структур, относящихся к аппарату Гольджи, но имеющих в своем составе цистерны ЭПР, образование диктиосом аппарата Гольджи de novo не происходит. На основании проведенных исследований авторы делают вывод о независимости аппарата Гольджи от ЭПР (Pelletier et al., 2000).

Во фракциях, полученных из митотических клеток, биохимическими методами удается идентифицировать отдельно везикулы, относящиеся к ЭПР, и структуры содержащие белки аппарата Гольджи. Т.е. в митотических клетках, разборка аппарата Гольджи осуществляется не за счет прекращения процесса его пополнения везикулами из ЭПР, как предполагалось согласно первой гипотезе, а имеет место разборка протяженных цистерн аппарата Гольджи и их преобразование в везикулярный структуры, содержащие белки аппарата Гольджи (Jesch, Linstedt, 1998; Shima et al., 1998; Seemann et al., 2002).

Еще одним подтверждением (Lowe, 2002) независимости структуры аппарата Гольджи от ЭПР является формирование в области центросомы ленто-подобных структур, состоящих из матриксных белков аппарата Гольджи при действии брефельдина А или при нарушении транспорта СОР II везикул.(Seemann et al., 2002). Именно структурные белки семейства GRASP и giantin, формирующие эти ленто-подобные структуры, по мнению авторов, осуществляют взаимодействие с элементами цитоскелета и центросомой, определяя в конечном итоге морфологию аппарата Гольджи в интерфазе, митозе, а возможно и при построении аппарата Гольджи в дочерних клетках (Jesch, 2002).

В недавнем обзоре, обсуждающем архитектуру и наследование аппарата Гольджи, авторы высказали предположение, примиряющее две описанные точки зрения на автономность комплекса Гольджи (Shorter, Warren, 2002). По мнению авторов, сложная архитектура аппарата Гольджи предполагает процедуру автономной репликации, которая представляет собой строгое разделение некоей «основы» (состоящей из белков матрикса - giantin, Golgi spectrin, GM130 и проч.), между двумя дочерними клетками, в то время как везикулы, выполняющие функции сортинга и синтеза фосфолипидов могут формироваться de novo. Вероятно, в определенных условиях наличие этой «матрицы» позволяет клетке быстро собрать аппарат Гольджи, синтезировав в ЭПР de novo резидентные белки, и создав дополнительные везикулярные структуры (Shorter, Warren, 2002).

Аппарат Гольджи в клеточном циклеИзвестно, что в ходе клеточного цикла органеллы клетки претерпевают изменения, связанные как с их репродукцией, так и с особенностями функционирования в разных фазах цикла. При делении клетки ее органеллы распределяются между двумя дочерними клетками, причем одни, после строгого удвоения, разделяются в ходе митоза; другие - распределяются случайным образом. Впервые, процесс разделения органелл был описан в начале 20 века. В процессе сперматогенеза Wilson наблюдал разделение митохондрий. Позднее в разных объектах, большей частью in vitro, было описано изменение числа органелл, их размеров и функциональной активности в ходе клеточного цикла (Robbins, Gonatas, 1964; Johnston, Mathias, 1972; Маянская и др., 1977; Kuroiwa et al., 1977; Posakony et al., 1977; Hochhauser et al., 1981; Kuriyama, Borisy, 1981; Борисов и др., 1982; Lai et al., 1982; Vorobjev, Chentsov, 1982; Борисов, Булычев, 1983; Быков и др., 1985; Воробьев, Надеждина, 1987; Онищенко, 1993).

Аппарат Гольджи, с одной стороны, динамически связан с ЭПР и везикулярным компартментом. А с другой стороны, в отличие от других мембранных органелл, в пролиферирующих клетках аппарат Гольджитопологически связан с клеточным центром, который при вступлении клетки в митоз разделяется и претерпевает значительные изменения.

Возникает вопрос: каким образом осуществляется подержание определенного числа единиц аппарата Гольджи в клетке? 1. Если происходит формирование его de novo, тогда (учитывая, что матриксные белки, составляющие основу аппарата Гольджи, остаются, даже когда происходит разборка цистерн) следует искать механизм, который позволяет этим структурным элементам самоорганизовываться, создавать структуру и контролировать ее конечный размер. 2. В противном случае матриксные белки в виде «осевой» структуры существуют, удваиваются и передаются дочерним клеткам, тогда существует механизм сопряжения «цикла аппарата Гольджи» и клеточного цикла. 3. Или же происходит постепенное наращивание аппарата Гольджи в течении Gj, S, G2 фаз, затем фрагментация и разделение пула везикул, как это, по-видимому, происходит в случае с митохондриями, ЭПР и лизосомами.

В рамках описанных выше моделей биогенеза комплекса Гольджи в литературе обсуждаются, прежде всего, вопросы наследования комплекса Гольджи дочерними клетками, а также регуляция метаболизма отдельных ферментов и фосфолипидов. Значительно меньше работ касается преобразований аппарата Гольджи в интерфазе.

Работы по исследованию поведения аппарата Гольджи в митозе ведутся главным образом на клетках культуры ткани. Показано, что при делении клеток млекопитающих происходит разборка комплекса Гольджи на отдельные мелкие диктиосомы и везикулы, которые равномерно распределяются между двумя дочерними клетками. Механизм распределения фрагментов аппарата Гольджи до сих пор не выяснен окончательно. Расчеты, проведенные для клеток линии HeLa, показали, что распределение фрагментов комплекса Гольджи между дочерними клетками осуществляется с большей точность (50±6%), чем можно было ожидать при случайном распределении (32.5%). Таким образом, предполагается наличие специального механизма в клетке для разделения везикулярного компартмента аппарата Гольджи в митозе (Shima et al., 1997).

Распределение везикул аппарата Гольджи в митотических клетках территориально связано с центросомой и напрямую зависит от целостности сети микротрубочек и работы динеинов. Одна субпопуляция везикул аппарата Гольджи локализуется в непосредственной близости от полюсов веретенаделения, в то время как другая субпопуляция везикул распределяется по всей цитоплазме делящейся клетки (Sfiima et aL 1998). Разрушение сети микротрубочек в митозе приводит к агрегации отдельных везикул в единый кластер, что свидетельствует об активном участии м и кро тру бочковых моторов в, казалось бы, случайном распределении везикул по цитоплазме митотической клетки.

Затем в каждой из дочерних клеток вновь формируется аппарат Гольджи Эти процессы описывали в разных типах клеток на световом и электронном уровне (Lucocq et aL 1987; Lucocq. Warren, 1987; Lippincott-Schwartz et at, 1989; Moskalewski, Thy berg, 1992; Shima et al, 1997; Cabrera-Poch et ai„ 1998, Zaal et aL, [999; Shorter, Warren. 2002).

Восстановление аппарата Голь лжи в дочерних клетках и дальнейшее его перемещение из проксимального положения по отношению к оси деления в дистальное происходит в связи с центросомой {Moskalewski, Thyberg, J 992).

При более детальных исследованиях на клетках позвоночных показана двухстадийность разборки единого аппарата Гольджи в клетках в культуре при вступлении их в митоз (Rossanesc, Click, 2001), На первой стадии происходит распад единой структуры на мелкие диктиосомы, а на второй стадии вплоть до телофазы в митотических клетках обнаруживают диффузное свечение при окраске клеток антителами к белкам аппарата Гольджи (схема. 2).,;nd ClickilfijUiirt Ht'js4'in:'i vсч-ема 22. Схема h j обзора Rossanese. Glick. 2001Разрушение и сборка АГ (зеленый) в митотических клетках позвоночных.

ШК1 - mitogen-activatedprotein kinase kinase iPlk - Polo-like kinaseCdc2 - mitotic kinaseNSF, p9 7 fusion proteinsPP2A - protein phosphatase2ACKJl - casein kinase ПКроме того, доказано, что в образующихся фрагментах комплекса Гольджи митотических клеток, сохраняется полярность в распределении белков цис-, медиа, и транс- компартментов аппарата Гольджи (Shima et al., 1997).Shima с соавторами подсчитали число и размер фрагментов, на которые распадается комплекс Гольджи в митотических клетках HeLa, предварительно заблокированных на границе Gj/S тимидином и афидиколином (Shima et al., 1997). Было показано, что около 130 фрагментов размером от 0.2 до 0.9 мкм (около 35% везикул имело диаметр 0,45мкм) равномерно распределено в цитоплазме митотической клетки. Эти данные согласуются с результатами, полученными при электронно-микроскопическом исследовании митотических кластеров аппарата Гольджи (Lucocq et al., 1987; Lucocq, Warren, 1987).

Формирование единого аппарата Гольджи в дочерних клетках также идет ступенчато. Сначала появляются мелкие цистерны 1-3 мкм. Последующее объединение занимает в клетках Hela 1-2 часа после вступления дочерних клеток в G| фазу и выглядит, как увеличение тубуляриых элементов и присоединение крупных фрагментов друг к другу (Shima et al., 1997).

В эмбрионе Drosophila mel. на стадии синцития, а также после целлюляризации аппарат Гольджи на световом уровне выглядит как мелкие гранулы. В митозе целостность этих структур сохраняется (Rossanese, Click, 2001), в то время как аппарат Гольджи культивируемых клеток Drosophila mel. при вступлении их в митоз разбирается полностью. Авторы отмечают, что процесс разборки мелких диктиосом в митотических клетках не зависит от наличия микротрубочек, а определяется иными факторами, которые исчезают при переходе клеток к росту в культуре (Stanley et al., 1997).

В клетках эпидермиса насекомых в митозе аппарат Гольджи также сохраняет свою структуру (Zeng, Locke, 1993)У растений и грибов в митозе в отличие от клеток животных полной разборки диктиосом не происходит. Предполагают, что сохранение морфологической целостности аппарата Гольджи в этом случае необходимо для синтеза и секреции компонентов клеточной стенки в ходе митоза (Warren, 1993; Shima et al., 1997; Rossanese, Glick, 2001).

Рядом авторов предложен принципиально другой механизм удвоения аппарата Гольджи, при котором параллельно идут процессы наращивания цистернс латеральной стороны и разделение диктиосомы в центре (Тгоуег, Cameron, 1980; Garcia- Herdugo et al., 1988; Hager et al., 1999).

В литературе высказывались разнообразные предположение о причине разборки аппарата Гольджи в клетках животных. Например, что процедура разборки цистерн аппарата Гольджи необходима для создания пула мембранных везикул идущих в последствии на построение мембран дочерних клеток. Была также высказана гипотеза, что разрушение цистерн необходимо для экспонирования ме.мбран-связанных регуляторных белков, таких как фосфолипаза D, протеипкипаза С, регуляторная субъедипица протеиикипазы Л, циклин В2 (Jakman et al., 1995; Ktistakis et al., 1995; Shima et al., 1997).

На молекулярном уровне процесс фрагментации аппарата Гольджи в митозе представляется исследователям, как цепь события, ключевыми звеньями которой является фосфорелирование комплексом циклима B-CDK1 белка GM130. Это делает невозможным дальнейшее присоединение СОР1 везикул к цистернам аппарата Гольджи. Равновесное состояние присоединения/отделения везикул смещается, и аппарат 'Гольджи превращается в компартмепт, в разных клетка представленный в большей степени 50-70 нм везикулами, или цистернами небольшой протяженности. Этот компартмент содержит все известные резидентные и матриксные белки аппарата Гольджи за исключением р115, pill спектрина и Гольджи-анкирина (Shorter, Warren, 2002).

В то же время установлено, что часть белков аппарата Гольджи при вступлении клеток в митоз остаются ассоциированными с центросомой, а не с везикулами. К этой группе относятся в частности белки TGN38 и golgin-97 (Takatsuki et al., 2002).

Инъекция в клетки NRK антител к белку GRASP65 приводит к ингибированию фрагментации аппарата Гольджи и препятствует вступлению клеток в митоз, не затрагивая при этом ядерный и центриолярный циклы. Искусственная фрагментация аппарата Гольджи, вызванная воздействием брефельдином А или нокодазолом, в этих условиях позволяет клеткам вступить в митоз. Кроме того, на модельной системе показано, что в отсутствие cdc2 можно добиться фрагментации и дисперсии аппарата Гольджи воздействием только митотическими киназами - MEKl(mitogen-activated protein kinase kinase 1) и Pololike киназой (Acharya et al., 1998). На основании этих данных авторы делают вывод, что фрагментация аппарата Гольджи - это не последствие вступленияклетки в митоз, а один из ключевых моментов регуляции клеточного цикла. Причем белку GRASP65 отводится одна из главных ролей в этом процессе, но только в том случае, когда он локализован в перицентриолярной области в составе аппарата Гольджи (Sutterlin et al., 2002).

Любопытно, что у дрожжей отсутствие белка GRH1 (гомолога GRASP65) вызывает нарушения веретена. Таким образом, по мнению авторов, может осуществляться контроль наследования всех, и в том числе структурных компонентов аппарата Гольджи. В противном случае клетки не переходят к анафазе (Barr et al., 1997; Shorter, Warren, 2002).

Как упоминалось выше, во фрагментации аппарата Гольджи принимают участие Polo-like киназа 1 (PIkl), которая фосфорелирует Grasp65, и МЕК.1, которая активирует ERK.2 (extracellular signal-regulated kinase) (накапливающуюся в позднем G2 в ядре и цистернах Гольджи). Показано, что ERK2 в тирозин-фосфорилированиом состоянии также вызывает фрагментацию цистерн аппарата Гольджи (Cha, Shapiro, 2001; Shorter, Warren, 2002; Colanzi et al., 2003).

Второй этап фрагментации на отдельные везикулы идет по COPI-зависимому пути, когда отщепление СОР1 везикул, идущее по периферии, захватывает около 65 % всех цистерн. Другой путь - COPI независимый, в ходе которого плоские цистерны превращаются в гетерогенные тубуло-везикулярные профили. Высказываются предположения о возможных повреждениях фосфолипидного слоя, или так называемая релаксация скелетного матрикса (scaffold) аппарата Гольджи при вступлении клетки в митоз, следствием которых может быть изменение формы цистерн. Кроме того, в митозе нарушается COPII везикулярный транспорт между разными компартментами клетки. Молекулярные механизмы всех перечисленных нарушений в настоящее время активно исследуются и широко дискутируются в литературе (Rossanese, Glick, 2001; Shorter, Warren, 2002).

В телофазе в условиях низкой активности CDK1 происходит формирование коротких одиночных цистерн, которые затем нарастают с латеральной стороны. После достижения критического размера диктиосомы собираются в области центросомы (Shima et al., 1998; Rossanese, Glick, 2001; Seemann et al., 2002; Shorter, Warren, 2002).

Восстановление структуры аппарата Гольджи детально изучено в бесклеточиых моделях. Показано, что добавление к фрагмеитировапномукомплексу 1'ольджи очищенных компонентов цитозоля интерфазиой клетки, таких как NSF, a-SNAP и y-SNAP не приводит к полному восстановлению структуры, аналогичной той, которую можно наблюдать в интактной клетке. Инкубация фрагментов Гольджи с очищенными белками р97 и р47 напротив, вызывает генерацию длинных одиночных цистерн. Эти цистерны объединяются в стопки в присутствии pi 15 (белка посредника, связывающего giantin на поверхности COF1 везикулы и GM130 —матриксный белок цистерн аппарата Гольджи) (Shorter, Warren, 1999,2002).

Существуют данные о снижении активности ферментов комплекса Гольджи при вступлении клеток в митоз и уменьшении общего количества белка приходящегося па клетку (Борисов и др., 1982; Zhang et al., 2000).

Аппарат Гольджи в интерфаге при блоке клеточного циклаСинтез и модификация белков в клеточном цикле, как правило, начинает преобладать в начале или ссрсдинс Gi фазы, достигая своего пика к S фазе. При вступлении клеток в Gi фазу исследователи в большинстве случаев отмечают снижение количества белка на клетку, которое связывают с уменьшением объема цитоплазмы дочерних клеток в два раза по сравнению с материнской, деградацией белков и отсутствием или снижением в митозе синтетических процессов (Sluder et al., 1990; Matsuya et al., 2001; Doi et al., 2002).

Исследования морфологических преобразований и локализации аппарата Гольджи в интерфазе носят описательный характер и проведены на клетках перевиваемых клеточных линий разного происхождения и разной степени трансформации.

В клетках культуры почки эмбриона кролика комплекс Гольджи по данным Керкис и Христолюбовой достигает максимального развития в S фазе (Керкис, Христолюбова, 1971). А в фибробластах китайского хомячка и в L-клетках максимального развития аппарат Гольджи достигает в S и ранней G2 фазах (Старосветская, Казаньев, 1977; Борисов и др., 1982). В клетках HeLa исследователи отмечают максимальное увеличение аппарата Гольджи к началу G2 фазы (Erlandson, de Harven, 1971).

В пролиферируюших макрофагах уровень синтеза фосфатидилхолина, входящего в состав мембран аппарата Гольджи, увеличивается в Gi фазе. В G2 фазе в этих клетках прослеживается низкий уровень синтеза и деградации фосфолипидов (Jackowski, 1996).

Одним из подходов, позволяющих выяснить динамику преобразований аппарата Гольджи в интерфазе, а также оценить соотношение размеров комплекса Гольджи и положения клетки в цикле, является применение агентов, блокирующих клетки в разных фазах цикла. Этот подход может бьпъ использован для выявления и анализа обратной регуляции ключевых этапов клеточного цикла в зависимости от состояния, активности и положения в клетке аппарата 1 ольджи.

Так, Shima с соавторами исследовали биогенез аппарата Гольджи в клетках HeLa, заблокированных на границе Gj/S фаз афидиколином. Было обнаружено увеличение компартмента Гольджи параллельно с увеличением размера клетки. Интересно отметить, что после удаления блокирующего воздействия клетки проходили митоз, но в них обнаруживалось большее по сравнению с необработанными клетками число кластеров Гольджи (Shima et al., 1997,1998). 11а световом и электронно-микроскопическом уровнях при действии афидиколина на этих же клетках, Tanaka с соавторами обнаружили частичную разборку цистерн аппарата Гольджи до везикул и кольцеобразную локализацию его элементов в области клеточного центра в 20% клеток (Tanaka et al., 1998). Вероятно, реорганизация аппарата в этих условиях связана с изменением функциональной активности центросомы при нарушении клеточного цикла.

В другой работе Doi с соавторами исследовали уровень синтеза одного из резидентных белков аппарата Гольджи в ходе клеточного цикла и при его блоке. Измеряли количество белка р138 и ДНК, приходящееся на клетку. Эти показатели оценивали в популяции интактных клеток человека линии KB и в условиях блока клеточного цикла па границе Gj/S с использованием тимидина, а также при задержке в G2 /М, при действии этопозида. Показано, что количество белка р138 в интактных клетках увеличивается в интерфазе и падает при вступлении клеток в митоз. Блок клеток в S фазе и на границе G2/M не приводит к изменению уровня синтеза белка pi 38. В работе сделан вывод, что количество резидентного белка аппарата Гольджи скорее определяется размером клетки или количеством ДНК, приходящегося на клетку, чем положением клетки в цикле или активностью соответствующих циклинов (Doi et al., 2002).

В ряде работ обсуждается зависимость преобразований аппарата Гольджи от активности циклинов и ииклин-зависимых киназ (CDK). Известно, что разборка аппарата Гольджи регулируется фосфорелированием определенных групп белков (Misteli, Warren, 1995; Lowe, 2002), но до сих пор неясно, какиепротеинкиназы отвечают за этот процесс. Так, доказанным считается взаимосвязь между активностью комплекса циклинов B1-CDK1 (вызывающего конденсацию хромосом, реорганизацию сети микротрубочек и ядерных ламинов) и разборкой аппарата Гольджи (Drawnam et al., 2001). С другой стороны, показана ко-локализация циклина В2 с аппаратом Гольджи в интерфазе и митозе. Возможно, такое взаимодействие играет важную роль в инициации определенных этапов клеточного цикла при изменении морфологии аппарата Гольджи (Jaclanan et al., 1995). Кроме того, обнаружено, что с мембранами аппарата Гольджи ассоциированы различные белки-рецепторы в неактивном состоянии, например, Ras, АКАР450 и FIG-ROS. Можно допустить, что изменение морфологии аппарата Гольджи приводит к освобождению и активации рецепторов, запускающих, или ингибирующих определенные процессы в клетке (Shorter, Warren, 2003).

В условиях подавления синтеза ДИК афидиколином максимальный уровень фосфолипидов отмечен в S фазе. Дальнейшего синтеза фосфолипидов не происходит, что свидетельствует о связи процессов синтеза фосфолипидов с клеточным циклом (Jackowski, 1996).

Таким образом, исследования последних лет указывают на непосредственное участие некоторых циклинов в реорганизации комплекса Гольджи в клетках. Показано, что размеры и функциональная активность аппарата Гольджи в разных клетках, в той или иной степени, зависит от событий клеточного цикла.

Вместе с тем, обнаружено, что существует и обратная зависимость прохождения клетками определенных фаз клеточного цикла от преобразований комплекса Гольджи в клетке. Эти данные позволили высказать предположение о возможном участии аппарата Гольджи в регуляции клеточного цикла.

Аппарат Гольджи и клеточный центрПредположения о структурной и функциональной связи клеточного центра с аппаратом Гольджи высказывались неоднократно и были основаны в первую очередь на многочисленные наблюдения ко-локализации аппарата Гольджи и клеточного центра в культивируемых клетках и в клетках с выраженной полярностью (Rogalski, Singer, 1984; Но et al., 1990; Kreis et al., 1988; Kreis, 1990; Moskalewski, Thyberg, 1992, Снигиревская, Комиссарчик, 1995; Cole, LippincottSchwartz, 1995; Drubin, Nelson, 1996; Mironov et al., 1997, 2000; Shima et al., 1998; Schliwa et al., 1999; Онищенко, 2000; Takatsuki et al., 2002; Rios, Bornens, 2003). Аппарат Голь лжи и клеточный центр участвуют в разных физиологических процессах в клетке, таких как везикулярный транспорт продуктов эпдо- и экзоцитоза, поляризация, движение, дифференцировка, а также внутриклеточная сигнализация, клеточный цикл и апоптоз.

Реорганизация клеточного центра и иакуолярной системы сопровождает и такие явления, как слияние клеток (Но et al., 1990; Онищеко и др., 1994; Яровая, Онищенко, 1994; Яровая и др., 1997), трансформацию, действие химических агентов, в том числе: воздействующих на аппарат Гольджи (Alvarez, Sztul, 1999), нарушающих клеточный цикл (Tanaka et al., 1998), развитие множественной лекарственной устойчивости (Ерохина и др., 1997), и т.д. В частности показано, что при образовании поликарионов в результате слияния клеток, восстановление цитоскелета сопровождается формированием единого клеточного центра и объединением вокруг пего всех цистерн аппарата Гольджи (Но et al., 1990; Deng et al., 1992; Онищенко и др., 1994).

В ряде работ отмечается независимость событий клеточного и цептриолярпого циклов и преобразований в структуре аппарата Гольджи. Так, на клетках NRK показано, что певступлснис клеток в митоз в результате нарушение фрагментации аппарата Гольджи не препятствует дупликации и расхождению центриолей (HinchclitY, Sluder, 2001). В другой работе, показано возрастание количества резидентного белка аппарата Гольджи р138 в клетках, где нарушена репликация центриолей (Doi et al., 2002).

Т.е., в литературе описаны факты, указывающие как на функциональную связь клеточного центра и аппарата Гольджи, так и данные о независимости этих структур в ходе клеточного цикла.

Ко-локализация аппарата Гольджи и центросомы описана в большинстве клеток в культуре ткани, а также в некоторых типах клеток in situ (Phillips, Rattner, 1976; Geiger et al., 1982; Nemere et al., 1985; Schliwa et al., 1999; Онищенко, 2000).

В клетках культуры ткани клеточный центр топологически совпадает с центром организации микротрубочек, поэтому об изменениях происходящих с клеточным центром в клетках перевиваемых культур судят главным образом по перемещению центра организации микротрубочек и по изменению количества исостава микротрубочек. Участие других элементов цитоскелета в локализации клеточного центра и изменении его активности обсуждается значительно реже.

Традиционно, микротрубочкам отводят центральную роль в пространственной организации и динамике органелл вакуолярной системы. Лабильная система микротрубочек и ассоциированных с ними моторов и регуляторных белков позволяет клетке оперативно реорганизовать систему мембранных органелл в ответ на внутриклеточный или внешний сигнал (Thyberg, Moskalewski, 1985; Terasaky et al., 1986; Kreis et al., 1988; Kreis, 1990; Cole, Lippincott-Schwartz, 1995; Karcher et al., 2002; Rios, Bornens, 2003).

Число микротрубочек, их длина, стабильность и расположение в клетке варьируют в зависимости от типа клетки. Определяющим фактором в строении сети микротрубочек является наличие и уровень активности центросомы.

В ходе клеточного цикла регуляция транспорта по микротрубочкам зависит от состава микротрубочек, активности и локализации моторных белков, их взаимодействия с микротрубочками и мембранами органелл. Так, в митозе отмечают нарушение движения везикул к плюс концу микротрубочек - от ЭПР к аппарату Гольджи. Активность минус-концевого мотора динеина в митозе сохраняется, обеспечивая удержание пула везикул в полюсах веретена деления, и последующее распределение компонентов аппарата Гольджи между дочерними клетками (Allan, Vale, 1991).

Распространенный подход к решению вопроса о роли центросомы в становлении внутриклеточной полярности и организации аппарата Гольджи -нарушение сети микротрубочек. Показано, что эта воздействия приводят к изменению локализации и целостности аппарата Гольджи. При обработке клеток таксолом цистерны аппарат Гольджи связываются с «минус» концами микротрубочек, которые, в свою очередь, как известно, ассоциированы с ЦОМТ (Rogalski, Singer, 1984). Разрушение системы микротрубочек при действии иокодазола приводит к дезорганизации аппарата Гольджи и перераспределению его структур от ядра на периферию клетки, что доказывает роль интерфазных микротрубочек в сохранении единого аппарата Гольджи и поддержании его перинуклеарной локализации. (Rogalski, Singer, 1984; Thyberg, Moskalewski, 1985; Ho et al., 1990; Minin, 1997; Миронов и др., 1998). Обратная сборка фрагментов цистерн аппарата Гольджи после действия нокодазола на клетки Vero, по данным Но с соавторами, зависит также от микротрубочек и не чувствительна к коллапсупромежуточных филаментов и воздействию цитохалазина D (Но et al., 1989).F.ine один подход к исследованию взаимодействия аппарата Гольджи с микротрубочками - изучение митотических клеток. Показано, что только некоторые этапы разборки аппарата Гольджи и его распределение между дочерними клетками зависят от микротрубочек веретена. (Lucocq et al., 1989; Shima et al., 1998). Сборка аппарата Гольджи в поздней телофазе начинается с объединения в перицентриолярном регионе мембранных структур размером 1 - 3 мкм независимо от наличия микротрубочек. Таким образом, вопрос об участии других элементов цитоскелета или дополнительных механизмов в митотических преобразованиях аппарата Гольджи остается пока открытым.

Б клетках интактной печени in situ описаны единичные микротрубочки, часто располагающиеся на периферии клетки и не связанные с центросомой. При активации клеточного центра при регенерации печени число микротрубочек, отходящих от центриолей, возрастает в ходе клеточного цикла (Онищснко, Чепцов, 1986). К уменьшению числа микротрубочек приводит блок гепатонитов в Ог фазе (Крючкова и др., 1986). Участие микротрубочек в организации аппарата Гольджи в гепатоцитах in situ в литературе не обсуждается.

В выделенных первичных гепатоцитах микротрубочки формируют радиальную сеть с центром в области центросомы и сгущениями на периферии клеток (Novikofï et al., 1996). В клетках «гепатоцито-подобной» линии WIF-B микротрубочки радиально отходят от апикальной мембраны («желчных капилляров»), где в этом типе клеток концентрируются у-тубулин, а также актиновые филаменты (Ihrke et al., 1993). Микротрубочки, по данным литературы, участвуют в поддержании везикулярного транспорта в апикальной зоне культивируемых гепатоцитов (Durand-Schneider et al., 1991). Базолатеральный компартмент, по результатам исследований, не зависит от сети микротрубочек (van Ijzendoorn et al., 1997). Показано, что функционирование везикул, относящихся к базолатеральпому компартмепту, тормозится при разрушении актиновых микрофиламентов (Roma et al., 2000).

Транспорт от ЭПР к аппарату Гольджи происходит при помощи моторного белка динеина, двигающегося по направлению к минус концам микротрубочек (Hirada et al., 1998; Kreis, 1990; Corthesy-Theulas et al., 1992). Динеин прикрепляется к мембранам при помощи динактинового комплекса, увеличивающего активность дииеипа (Roghi, Allan, 1999; Lippincott-Schwartz,1998; Karcher et a.l, 2002).

Роль кинезинов, по-видимому, заключается в обратном транспорте везикул от транс- Гольджи сети в сторону ЭТТР (Lippincott-Schwartz et al., 1995; Cole, Lippincott-Schwartz, 1995; Karcher et al., 2002). Кроме того, показано, что именно кинезины участвуют в перемещении фрагментов аппарата Гольджи на периферию клетки по стабильным микротрубочкам при действии иокодазола (Minin, 1997).

Помимо моторных белков с цистернами аппарата Гольджи ассоциированы MAP белки. Показана ко-локализация МАР-2 белка с мембранами аппарата Гольджи в норме, при обработке клеток монензином и нокодазолом была (Allan, Kreis, 1986). Для периферического белка цис- цистерн аппарата Гольджи - СМАР-210 продемонстрирована ассоциация с минус концами микротрубочек (Infante et al., 1999).

По мнению одних исследователей, ко-локализация аппарата Гольджи и центросомы необходима для позиционирования аппарата Гольджи, обеспечивающего транспорт между компартментами клетки в иитоплазме (Kreis et al., 1988; Rios, Bornens, 2003).

Другие авторы считают, что взаимодействие цистерн аппарата Гольджи с микротрубочками необходимо для перемещения элементов, входящих в состав аппарата Гольджи и тем самым поддержания его формы, но не является определяющим фактором при позиционировании его в клетке (Shorter, Warren, 2002).

Результаты недавних исследований указывают на участие белков аппарата Гольджи в стабилизации «минус» концов микротрубочек. О стабилизирующей роли аппарата Гольджи также может свидетельствовать тот факт, что в интерфазных клетках аппарат Гольджи взаимодействует главным образом со стабильными микротрубочками (устойчивыми к воздействию низких концентраций нокодазола - 100-300пМ) (Magdalena et al., 2002).

Отдельные факты, обнаруженные при исследовании аппарата Гольджи, указывают на участие других компонентов цитоскелета в организации аппарата Гольджи.

Еще в конце 80 годов прошлого века было обнаружено, что разборка и сборка аппарата Гольджи - многостадийный процесс, отдельные стадии которого по-разному зависят от энергоресурсов клетки и изменения температурного режима, что косвенным образом указывает на участие в организации аппаратаГольджи разных систем клетки (Turner, TartakofT, 1989).

Более детальные исследования, проведенные на клетках культуры НеТ-а, показали, что при действии нокодазола во фрагментах цистерн аппарата Голь лжи сохраняется полярность в расположении белков-маркеров цис- медиа- и трапс-компартмеитов аппарата Гольджи и TGN. Это свидетельствует о том, что микротрубочки не участвуют в поддержании полярности цистерн аппарата Гольджи (Shima et al., 1997). Возможно, эту функцию выполняет комплекс (i-спектрина и апкирина, который формирует сеть на поверхности ире- Гольджи везикул и Гольджи цистерн (Lippincott-Schwartz, 1998).

Существует группа белков аппарата Гольджи, которая остается ассоциированной с центросомой в течении всего клеточного цикла, при разрушении сети микротрубочек, а также при действии брефельдина A (Shima et al., 1997; Takatsuki et al., 2002).

Трехмерная реконструкция аппарата Гольджи в области клеточного центра в клетках поджелудочной железы выявила взаимодействие микротрубочек только с цис- компартмептом аппарата Гольджи. Авторы считают, что микротрубочки не участвуют в организации медиа- и транс компартмснтов (Marsh et al., 2001; Rios, Bornens, 2003).

Кроме того, известно, что транспорт от аппарата Гольджи к плазматической мембране может осуществляться без участия микротрубочек (Lippincott-Schwartz, 1998).

Большой интерес вызывают недавние исследования на клетках печеночного происхождения линий WIF и FAO, которые показали, что аппарат Гольджи может сам нуклеировать микротрубочки при участии у-тубулина, локализованного на внешней стороне мембраны. Авторы работы также высказали предположение, что цистерны аппарата Гольджи способны участвовать в стабилизации микротрубочек (Chabin-Brion et al., 2001).

При исследовании трихомонад показано, что разрушение микротрубочек нокодазолом не вызывает фрагментации аппарата Гольджи в этом организме. Вероятно, функцию поддержания целостности аппарата Гольджи у трихомонад выполняют парабазальные филаменты, контактирующие с цистернами аппарата Гольджи в этих клетках (Benchimol et al., 2001).

Промежуточные филаментыВзаимодействие клеточного центра и промежуточных филаментов до сих пор остается слабо изученным, как в клетках культуры, так и в клетках in situ.

Промежуточные филаменты в одноядерных интерфазных клетках в культуре представлены главным образом виментиновыми филаментами, и образуют сгущение в области клеточного центра, от которого к периферии клетки расходятся пучки. В целом организация промежуточных филаментов в клетках культуры совпадает с распределением в них сети микротрубочек (Alieva et al., 1992). Вероятно, активная центросома в этих клетках принимает участие в организации виментиновых филаментов (Яровая, Онищенко, 1997).

В клетках разных тканей in situ той или иной степени диффереицировки и поляризации различия в локализации и составе промежуточных филаментов очень существенны. Как связаны разные типы промежуточных филаментов с центросомой, и что определяет организацию этих филаментов в отсутствие активной центросомы остается до сих пор неясным. Известно, что при выделении центриолей из самых разных объектов, они часто оказываются связанными с промежуточными филаментами (Nadezhdina et al., 1979; Воробьев, Надеждина, 1987). Причем, получение центриолей из печени цыпленка рекомендуется проводить на препаратах выделенных желчных капилляров, где концентрация промежуточных филаментов наибольшая (Nakagawa et al., 2001).

Именно взаимодействием с ядром и центриолями промежуточных филаментов, по мнению исследователей, объясняется сохранение обособленности хромосомных наборов и центриолей в митозе и корреляция между числом хромосомных наборов и центриолей даже в гетерокарионах (Петращук, Онищенко, 1994; Онищенко, 1993). Нельзя исключить, что одной из причин нарушения в распределении хромосом и центриолей в ходе митоза может быть изменение характера распределения промежуточных филаментов в клетках.

Относительно участия промежуточных филаментов собственно в организации и поддержании структуры аппарата Гольджи, известно, что микроинъекция в клетки культуры млекопитающих анштел к виментину не вызывает нарушения в организации аппарата Гольджи (Но et al., 1990).

В гепатоцитах интактной печени промежуточные филаменты представлены кератинами 8 и 18 (Franke et al., 1979, 1981; Lai et al., 1989; Ku et al., 1999). Виментин, характерный для клеток соединительной ткани, отсутствует. Насветовом уровне кератиновые филаменты заполняют всю цитоплазму довольно плотной сетью, образуя перинуклеарное кольцо и заметные сгущения в области желчных капилляров. Предполагается, что кератиновые филаменты могут соединять ядро и внутреннюю поверхность плазматической мембраны. Существуют данные об участии промежуточных филаментов в ассоциации ядра и центриолей в гепатоцитах (Nadezhdina et al., 1979). На электронно-микроскопическом уровне промежуточные филаменты также обнаруживают на периферии гепатоцита, где они связываются с десмосомами через семейство белков плакинов. В области ядра и аппарата Гольджи, по наблюдениям исследователей, пучки промежуточных филаментов выглядят более плотными, по сравнению с филаментами периферии (Franke et al., 1981; Онищенко, Ченцов, 1986).

Итак, учитывая незначительное количество микротрубочек характерное для гспатоцитов, можно предположить, что в условиях инактивации клеточного центра, как ЦОМТ, важную роль и поддержании полярности клеток печени, и организации аппарата Гольджи, в частности, играет система кератиновых промежуточных филаментов.разные варианты взаимного расположения аппарата Гольджи и клеточного центраВ эмбриогенезе, при дифференцировке и ряде патологических процессов внутриклеточная полярность проявляется по-разному. Изучение роли клеточного центра в создании внутриклеточной полярности в ряде работ проводится путем сравнения разных категорий дифференцированных клеток (Bomens, 1991; Kellogg et al., 1994; Schatten, 1994; Lippincott-Schwartz,1998; Онищенко, 2000). Такого рода сравнение позволило выделить следующие типы организации внутриклеточной полярности (Онищенко, 2000):В одних клетках аппарат Гольджи топологически и функционально ассоциирован с клеточным центром. Это явление характерно в первую очередь для активно пролиферирующих клеток (энтероциты крипты кишки, миобласты, клетки гемопоэтической ткани, созревающие мегакариоциты) (Москвин-Тарханов, Онищенко, 1978; Tassin et al., 1985; Комарова, Воробьев, 1994). А также для терминально дифференцированных клеток, в которых поддерживается активный синтез и секреция белков, как правило, в одном направлении. В таких клетках полярность в расположении органелл складывается с участиемцентросомы и образуемых ею микротрубочек (гранулоциты крови, плазматические клетки, эпителий желчного пузыря, фибробласты, и т.д.) (Bloom, Fawcett, 1986; Снигиревская, Комиссарчик, 1995).,Ко второму типу полярности относят клетки, в которых присутствует выраженный клеточный центр, но при этом цистерны аппарата Гольджи с ним не ассоциированы (например, почечный эпителий, мелапофоры, нейроны) (Bloom, Fawcett, 1986; Rubina et al., 1999). К этому же типу можно отнести и гепатоциты пролифсрирующсй печени, где наряду с активным клеточным центром окруженным цистернами аппарата Гольджи существуют и отдельные диктиосомы, ассоциированные с желчными капиллярами (Сысоева, Онищенко, 2000,2003).

Третий тип клеток, где сборка аппарата Гольлжи осуществляется без клеточного центра, но при наличии нецеитросомных микротрубочек. В этих случаях полярность создастся иным способом, например, за счст формирования микротрубочек в апикальной части клеток с участием плазматической мембраны или базальных телец (например эпителий ворсинки кишки, эпителий почки или ресничный эпителий). Аппарат Гольджи в таких клетках располагается над ядром в центральной части цитоплазмы (Sandoz et al., 1985; Комарова, Воробьев, 1994; Домарацкий, Онищенко, 2001).

К четвертому типу организации полярности относятся клетки, в которых отсутствует и клеточный центр, и единый аппарат Гольджи. Утрата клеточного центра в этих клетках сопровождается изменением внутриклеточной полярности и формированием высокодифференцированных структур сложной архитектуры, таких как мышечные волокна, зрелые мегакариоциты (Москвин-Тарханов, Онищенко 1978; Комарова, Воробьев, 1994; Dane, Tucker, 1994; Tucker et al., 1998). Эта категория клеток гетерогенна. Сюда относятся, например, зрелые яйцеклетки и мегакариоциты, утратившие полярность как таковую и не имеющие активного клеточного центра и единого аппарата Гольджи; мышечные волокна, в которых центральную часть клетки занимает сократительный аппарат; клетки Бальбиани (Москвин-Тарханов, Онищенко, 1978; Tassin et al., 1985; Абумуслимов и др., 1991; Krioutchkova, Onishchenko, 1999).

Таким образом, отсутствие клеточного центра, или снижение его активности, как центра организации микротрубочек, не всегда ведет к исчезновению аппарата Гольджи (Tassin et al., 1985; Bomens, 1991; Ralston, 1993;Оиищенко, 2000; Rios, Bornens 2002).

В интактных гепатоцитах, которые также можно отнести к последней группе, центросома неактивна как центр организации микротрубочек, единичные микротрубочки встречаются в разных участках цитоплазмы (Онищепко, Чепцов, 1986). Аппарат Гольджи в таких клетках в виде отдельных диктиосом локализован в разных участках цитоплазмы - главным образом в области желчных капилляров. При этом гепатоциты осуществляют двунаправленный эндо- и экзоцитоз и имеют ярко выраженную апикальную и базолатеральную поверхности, т.е. двуполярны (Сысоева, Онищенко, 2000,2003).

Итак, клеточный центр и отходящие от него микротрубочки, по сложившимся представлениям, выполняют ряд функций, связанных с организацией и локализацией аппарата Гольджи в большинстве исследованных клеток. Вместе с тем существуют и другие факторы, определяющие морфологию и функциональную активность аппарата Гольджи. К их числу можно отнести:1. разный уровень активности центросомы, как центра организации микротрубочек, характерный для клеток разных типов и разной степени дифферепцировки2. отсутствие по разным причинам радиальной сети микротрубочек в дифференцированных клетках in situ3. присутствие в некоторых типах клеток нецентросомных центров организации микротрубочек4. возможность участия цистерн аппарата Гольджи в организации микротрубочек5. взаимодействие мембран аппарата Гольджи с актиновыми филаментами через комплекс белков6. взаимосвязь между состоянием цитоскелета и характером взаимодействия клеток с внеклеточным матриксом и соседними клетками.

Установление полярносги - одно из основных событий при дифференцировке клеток и разделении функций к пределах клетки или функциональной единицы органа. Такие важные функции аппарата Гольджи, как сортипг везикул, созревание белков, участие в биогенезе клеточных мембран напрямую зависят от расположения и структурыкомпартмеитов в клетке. Выяснение этапов и механизмов поляризации клетки в широком смысле - одна из фундаментальных задач, решаемых в современной биологии.

Центросома и аппарат Гольджи при дифференцировке клетокСуществующие в настоящее иремя представления об изменениях, которые происходят в клетках в онтогенезе при дифференцировке, касаются в основном центросомы, как основного компонента клеточного центра (Москвин-Тарханов, Оиищенко, 1978; Вге е1 а!., 1990; Комарова, Воробьев, 1994). Преобразования, происходящие с другими цитоплазматическими органеллами клетки - лизосомами и митохондриями, аппаратом Гольджи и эндоплазматичсским рстикулумом обсуждаются значительно реже (Оиищенко, 2000). И это не случайно. Ведь именно активность центросомы, по мнению многих авторов, определяет организацию сети микротрубочек и, как следствие, всех остальных компонентов цитоплазмы и полярность клетки в целом (Ра\УсеИ, 1966; Вппк1еу е1 а1., 1975; Бершадский и др., 1979).

Выделяют разные варианты преобразования центросомы в онтогенезе многоклеточных организмов (Оиищенко, 2000).

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Сысоева, Вероника Юрьевна

выводы

Исследования центросомы и аппарата Гольджи, локализованного в области клеточного центра, показали:

Структурная организация и активность клеточного центра в гепатоцитах зависит от степени дифференцировки, положения в клеточном цикле, а также уровня опухолевой трансформации клетки.

В онтогенезе мыши дифференцировка гепатоцитов сопровождается инактивацией центросомы, как центра организации микротрубочек. Локализация и размеры комплекса Гольджи в гепатоцитах зависят от характера активности центросомы (активная или неактивная центросома). В гепатоцитах Со фазы интактной печени аппарат Гольджи вокруг неактивного, как ЦОМТ, клеточного центра представлен диктиосомами малой протяженности.

Впервые исследованы преобразования аппарата Гольджи в клеточном цикле в гепатоцитах печени мыши. Показано последовательное увеличение длины диктиосом аппарата Гольджи при активации центросомы в качестве ЦОМТ в 01 и Б фазах и снижение протяженности диктиосом в Ог фазе при подготовке к митозу.

Воздействие гидроксимочевиной на пролиферирующие гепатоциты приводит к задержке центросомного цикла и преобразований комплекса Гольджи в 01 фазе, а затем к инактивации клеточного центра и уменьшению протяженности диктиосом до параметров Оо фазы. При воздействии дипином, блокирующем пролиферацию гепатоцитов в Ог-фазе, средние значения длин диктиосом не превышают протяженности диктиосом, характерных для гепатоцитов в Ог фазе; при этом протяженность отдельных диктиосом достигает больших величин, что, вероятно, связано с продолжением центросомного цикла. При опухолевой трансформации клеток центросома приобретает черты, характерные для гепатоцитов 01 фазы. Параметры аппарата Гольджи в этих условиях уменьшаются по мере утраты клетками гепатокарцином тканеспецифических признаков.

151

Заключение

В работе предложен морфометрический метод, основанный на статистической обработке измерений длин диктиосом аппарата Гольджи в области клеточного центра на электронно-микроскопическом уровне. Анализ средних значений длин диктиосом позволяет сопоставить организацию аппарата Гольджи в гепатоцитах на разных стадиях онтогенеза, в разных фазах клеточного цикла и при блокировании гепатоцитов в в^Б и вг фазах, а также в разных вариантах гепатокарцином.

Впервые показано, что в печени взрослых животных аппарат Гольджи гепатоцитов, находящихся в во фазе клеточного цикла (фаза пролиферативного покоя), представлен диктиосомами небольшой протяженности, локализованными в разных участках цитоплазмы гепатоцита. Проведенные ранее исследования клеточного центра в гепатоцитах взрослых мышей свидетельствуют об отсутствии активности центриолей в качестве центра организации микротрубочек в этих клетках (Онищенко, Ченцов, 1986). Мы предполагаем, что в отсутствии радиальной системы микротрубочек, поддержание полярности гепатоцитов интактной печени осуществляется при участии сети промежуточных филаментов. Присутствие плотных пучков промежуточных филаментов, оплетающих центриолярные цилиндры, в данном типе клетках позволяет предположить, что в организации промежуточных филаментов принимает участие именно центросома.

В работе прослеживаются преобразования не только центросомы, но и диктиосом аппарата Гольджи в области клеточного центра в ходе интерфазы клеточного цикла гепатоцитов и при переходе клеток в состояние покоя. Судьба диктиосом, расположенных в других областях цитоплазмы, при вступлении гепатоцитов в пролиферативный цикл остается невыясненной. В ходе работы возникла гипотеза о возможной неоднородности диктиосом аппарат Гольджи в пределах одной клетки. Выяснение биохимических и функциональных особенностей диктиосом, расположенных в области клеточного центра и в других компартментах клетки, представляет собой отдельную перспективную задачу.

Впервые исследован характер взаимодействия между ядерным и центросомным циклами и преобразованиями аппарата Гольджи. При этом, сопоставляя центросомный цикл и параметры аппарата Гольджи, обращали

148 особое внимание на число центриолей. Обнаружено отсутствие корреляции между числом центриолей в клеточном центре и параметрами аппарата Гольджи.

Перспективной является использование гидроксимочевины, которая вызывает блок гепатоцитов на границе Gi/S фаза, а затем выход клеток в ДИКТИОСОМо. Судя по структуре центросомы и параметрам аппарата Гольджи, данный агент не оказывает разобщающего действия на центриолярный и ядерные циклы, в отличие от клеток СНО (Balczon et al., 1995). На этой модели в дальнейшем представляется целесообразным исследовать вклад аппарата Гольджи в работу пунктов проверки (check points), действующих на этой стадии клеточного цикла.

Важными следует считать данные о появлении одиночных диктиосом большой протяженности в клетках, где вызвано нарушение корреляции между ядерным и центриолярным циклами. Представляется интересным исследовать, какие классы микротрубочек формируются в гепатоцитах в условиях вг-блока при продвижении центриолей по циклу.

Впервые на серийных ультратонких срезах проанализировано строение клеточного центра гепатоцитов в раннем постнатальном развитии. Обнаружено, что в гепатоцитах печени новорожденных мышей центриоли и параметры аппарата Гольджи имеют признаки, характерные для клеток печени взрослых животных в Gi фазе клеточного цикла.

На основании исследования длин диктиосом в клетках разной степени полиплоидизации, имеющих клеточный центр разного уровня активности, сделан вывод, что протяженность диктиосом в области клеточного центра в гепатоцитах не зависит от плоидности клетки. Выдвинуто предположение, требующее дополнительных иммунохимических исследований на ультраструктурном уровне, что поддержание коротких диктиосом в гепатоцитах Go фазы осуществляется за счет кератиновых промежуточных филаментов. Исследование реорганизации промежуточных филаментов при дифференцировке, в ходе клеточного цикла и при трансформации гепатоцитов также представляет большой интерес.

Как уже отмечалось, в гепатоцитах присутствует большое число диктиосом, не ко-локализованных с клеточным центром. В настоящей работе, исследование этих диктиосом не проводилось. Вместе с тем, не вызывает сомнений, что данные компоненты аппарата Гольджи принимают непосредственное участие в синтетических процессах. По нашему мнению общий объем аппарата Гольджи, элементы которого располагаются в разных участках цитоплазмы, скорее всего, коррелирует с плоидностью клетки, объемом цитоплазмы и уровнем ее функциональной активности.

Большой интерес в плане изучения степени зависимости параметров аппарата Гольджи от интенсивности тканеспецифических синтезов вызывает дальнейшее изучение разных вариантов гепатокарцином, отличающихся по этому критерию. Наши данные указывают, что наблюдается снижение средней протяженности диктиосом в области клеточного центра по мере утраты клетками гепатокарцином тканеспецифических свойств. Возможная перспектива обнаружения прямой корреляции между общим объемом аппарата Гольджи и активностью определенных генов состоит в том, что параметры аппарата Гольджи можно использовать, как тест на определение степени опухолевой трансформации клеток.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сысоева, Вероника Юрьевна, Москва

1. Абелев Г.И. Альфа-фетопротеин: Биология, биохимия, молекулярнаягенетика. 1994, Иммунология. N 3. С. 4-9.

2. Абелев Г.И., Перова С.Д., Храмкова Н.И., Постникова З.А., Ирлина И.С.

3. Эмбриональный сывороточный а-глобулин и его синтез перевиваемыми гепатомами мышей 1963, Биохимия, т. 28, № 3, с. 625-634.

4. Абелев Г.И., Храмкова Н.И., Энгельгардт Н.В., Постникова З.А. Антигенныйсостав нормальных и опухолевых клеток печени. 1963, Вопр. онкол., т. 9(5), с. 33-43.

5. Абумуслимов С.С., Надеждина Е.С., Ченцов Ю.С. Множественныебесцентриолярные центры организации микротрубочек в гигантских клетках слюнных желез Chironomus cingulatus. 1991, Цитология, Т.ЗЗ, С.36-40.

6. Алиева Н. Анализ динамики межклеточных взаимодействий нормальных итрансформированных клеток в культуре. 1999, Автореф. Дис. к.б.н., М.

7. Алов И. А., Брауде А. И., Аспиз М. Е. Основы функциональной морфологииклетки. 1966, М., "Медицина".

8. Альберте Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж.

9. Молекулярная биология клетки. 1994, М., "Мир".

10. Анацкая О.В. Межвидовая вариабельность уровней плоидности гепатоцитов икардиомиоцитов млекопитающих и птиц и ее причины. 1989, Автореф. Дис. к.б.н., С-Пб.

11. Анацкая О.В., Кудрявцев Б.Н. Состав клеточной популяции паренхимныхклеток печени мышевидного хомячка (Calomyscus mystax). 1993, Цитология т. 35(10), с. 53.

12. Анацкая О.В., Кудрявцев Б.Н. Клеточная полиплоидия в сердце птиц. 1997,

13. Цитология, т. 39(1), с. 31-32.

14. Анисимов А.П. Клеточное размножение и соматическая полиплоидия втканях брюхоногих моллюсков: обзор. III Пищеварительная система. 1998, Цитология, т. 40(5), с. 372-383.

15. Афанасьев Ю.И., Юрина И.А., Алешин Б.И., Котовский Е.Ф., Ченцов Ю.С.,

16. Винников Я.А., Елисеев В.Г., Катинас Г.С., Субботин М.Я., Оганесян Т.Г., Радостина Т.Н. Гистология. 1989, М., Медицина, 672с.

17. Бекетова Т.П., Секамова С.М. Некоторые функциональные характеристики152темных и светлых клеток. 1975, Бюл.эксп.биол.и медиц. т. 80(7), с. 107109.

18. Белицкий Г.А. Повреждение клеток печени о-Аминоазотолуолом на раннихстадиях канцерогенеза. 1964, Цитология, т. 6(4), с. 504-507.

19. Борисов A.B., Булычев А.Г., Румянцев П.П. Изменения лизосом вэкспоненциально растущей, синхронизированной идифференцирующейся культурах L-клеток. 1982, Цитология. Т. 24. N 10. С. 1233-1237.

20. Борисов A.B., Булычев А.Г. Изменение активности лизосомных ферментов вмитотическом цикле L-клеток. 1983, Цитология. Т. 25. N 4. С. 452-457.

21. Бреслер В.М., Черногрядская И.А., Пильщик Е.М., Пылдвере Э.И., Шудель

22. М.С., Кудрявцева М.В., Селиванова Г.В., Розанов Ю.М., Моженок Т.П., Константинова И.М., Воробьев В.И. Нормальная и патологическая цитология паренхимы печени. 1969, JI, Наука, 272 с.

23. Бродский В.Я. Трофика клетки. 1966, М, Наука, 290 с.

24. Бродский В.Я., Фактор В.М., Урываева И.В. Особенности репродукциигепатоцитов в постнатальном развитии печени мыши. 1973, Арх.анат.гист.эмбриол. т. 65, с. 7-15.

25. Бродский В.Я., Урываева И.В. Клеточная полиплоидия. Пролиферация идифференцировка. 1981, М, Наука, 230с.

26. Быков А.М. Исследование митохондрий клеток культуры СПЭВ в ходеклеточного цикла в норме и после действия актиномицина Д. 1985, Автореф. Дис. к.б.н., М.

27. Быков А.М., Шорникова М.В., Ченцов Ю.С. Исследование хондриома в ходеклеточного цикла культуры СПЭВ. 1985, Биол. науки, N10, с. 27-34.

28. Быстревская В.Б., Личкун В.В., Антонов A.C., Перов H.A. Структурацентриолярного аппарата эндотелиальных клеток в эмбриональной и дефинитивной аорте человека. 1988, Онтогенез, Т.19. С.371-379.

29. Вакулин Г.М., Якобсон Г.С. Ультраструктурные изменения гепатоцитов вдинамике развития экспериментального цирроза печени у крыс. 1975, Бюл.эксп.биол.мед.,т. 80(9), с. 103-107.

30. Васильев Ю.М., Гельфанд И.М., Гельштейн В.И., Маленков А.Г.

31. Характеристики клеточных комплексов асцитной мышиной гепатомы 22. 1964, ДАН СССР т. 156, № 1,с. 168-170.

32. Варга Е.В., Черемнова O.A., Овчинников Д.А., Шапигузов А.Ю., Кудрявцева27.

Информация о работе

Сысоева, Вероника Юрьевна
кандидата биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.25

Диссертация

Зависимость строения аппарата Гольджи от состояния клеточного центра в гепатоцитах мыши - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы