Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфофункциональные изменения элементов цитоскелета и вакуолярной системы опухолевых клеток на начальных этапах развития множественной лекарственной устойчивости

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Морфофункциональные изменения элементов цитоскелета и вакуолярной системы опухолевых клеток на начальных этапах развития множественной лекарственной устойчивости"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

V

На правах рукописи УДК 576.31

Ерохина Мария Владиславовна

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ЭЛЕМЕНТОВ ЦИТОСКЕЛЕТА И ВАКУОЛЯРНОЙ СИСТЕМЫ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК НА НАЧАЛЬНЫХ ЭТАПАХ РАЗВИТИЯ МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ

03.00Л1 - эмбриология, гистология и цитология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации иа соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1998 г.

Работа выполнена:

на кафедре цитологии и гистологии Биологического факультета МГУ в лаборатории генетики опухолевых клеток НИИ канцерогенеза ОНЦ РАМН

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Г.Е. Онищенко доктор медицинских наук, профессор АЛ. Ставровская

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор A.B. Зеленин кандидат биологических наук О.Ю. Иванова

Ведущее учреждение: Институт биологии развития им. А.Н. Кольцова РАН

Защита состоится " ^ " - 1998 г. в № часов

на заседании специализированного совета Д 053.05.68 при Московско: Государственном Университете им. М.В. Ломоносова (Москва, 119899, Воробьев! Горы, МГУ, Биологический факультет).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультет

МГУ.

Автореферат разослан " "_^ /-~1998 г.

Ученый секретарь специализированного совета Кандидат биологических наук

E.H. Калистратова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

Данная работа посвящена проблеме изменения фенотипа опухолевых клеток, выживающих в токсичном микроокружении и характеризующихся феноменом множественной лекарственной устойчивости (МЛУ).

Одним из важнейших механизмов лекарственной устойчивости (как в культуре клеток, так и в клиническом материале) является активный выброс токсичного агента из клетки во внеклеточную среду. На сегодняшний день известно три основных белка, осуществляющих транспорт лекарственных веществ из клеток млекопитающих во внеклеточную среду: Р-гликопротеин (Pgp) (Beck et al., 1991) , MRP (multidrug resistance protein) (Cole et al., 1993) и LRP (lung resistance protein) (Scheper et al., 1993). Наиболее хорошо охарактеризованным механизмом МЛУ является гиперэкспрессия Pgp - продукта гена MDR1. Pgp - высококонсервативный трансмембранный белок с молекулярной массой 170-190 kDa (Endicott et al., 1989). Pgp локализован на плазматической мембране, иммуноцитохимическими методами также определяется в местах синтеза белка (Willingham et al., 1987).

Известно, что клетки с шперэксирессией Pgp характеризуются изменением фенотипа, по сравнению с исходными клетками (Bidler et al., 1981, 1994). Это выражается в изменении морфологии (Абдряшитов и др., 1989), увеличении степени дифференцировки (Stromskaya et al., 1995), снижении опухолеродности (Абдряшитов и др., 1989; Biedler et al., 1994) и метастатического потенциала клеток (Shtil et al., 1994). Такие фенотипические изменения сопровождаются не только изменением в экспрессии генов дифференцировки, но и реорганизацией различных клеточных структур: элементов цитоскелета (Абдряшитов и др., 1989; Erokhina et al., 1994; Iîara et al., 1995), адгезивных свойств клеток (Biedler et al., 1994), межклеточных контактов (Абдряшитов и др., 1989), а также изменениями в состоянии элементов вакуолярной системы (Bobichon et al., 1992, 1996).

Локализация в большом количестве на плазматической мембране крупного интегрального белка, каким является Pgp, приводит к изменению архитектуры и

свойств мембраны (5шсгоре а а1., 1992). Как известно, между плазматической мембраной, элементами цитоскелета и вакуолярной системой существует тесная структурно-функциональная связь. Закономерно предположить, что при изменении характеристик плазматической мембраны клеток, выживших в токсичном окружении, может происходить реорганизация различных клеточных структур, и прежде всего элементов цитоскелета, как наиболее тесно ассоциированных с плазматической мембраной.

Мы также предполагаем, что изменения фенотипа клеток с гиперэкспрессией Р§р могут быть неслучайны и с точки зрения поддержания "резистентного" статуса клеток. Показано, что элементы вакуолярной системы (аппарат Гольджи и везикулы) могут участвовать в накоплении антрациклинов в клетках с гиперэкспрессией Pgp (МоНпагу й а1., 1995; 81ес1е1 й а1., 1995). Некоторыми авторами найдена корреляция между экспрессией белков промежуточных филаментов и уровнем резистентности клеток (Ваитап е1 а1., 1994; Сопйзгй й а1., 1995). Возможно, что участие элементов вакуолярной системы и цитоскелета играет немаловажную роль в обеспечении механизмов МЛУ, наряду с гиперэкспрессией Р§р. Таким образом, необходимо комплексное исследование элементов цитоскелета и вакуолярной системы в клетках с гиперэкспрессией Р§р.

Цель и основные задачи работы.

Имеющиеся в литературе данные об изменении клеточных структур при развитии Pgp-oпocpeдoвalшoй МЛУ получены на разных клеточных линиях и, как правило, при очень высоких уровнях устойчивости (в сотни и тысячи раз). Нам представляется, что особенно важно выявить возможные изменения различных клеточных характеристик (элементов цитоскелета и вакуолярной системы) на низких (начальных) уровнях развития МЛУ, так как 01га являются клинически значимыми и определяют дальнейшее развитие опухоли. На сегодняшний день не существует работ, представляющих собой комплексный анализ различных клеточных элементов и структур на первых этапах развития МЛУ, обусловленной гиперэкспрессией Pgp, также как и друпши белками-транспортёрами.

13 связи с этим, основной нелыо данной работы является: проанализировать остояпие различных элементов цитоскелета и вакуолярной системы клетки на ачальных этапах развития множественной лекарственной устойчивости, >бусловленной гиперэкспрессией Р§р.

Для решения этой цели были поставлены конкретные задачи: .. Изучить состояние актинового цитоскелета. I. Исследовать распределение микротрубочек :

- общей сети микротрубочек;

- тирозилированных микротрубочек;

- ацетилированных микротрубочек;

1. Исследовать распределение промежуточных (виментиновых) филаментов; •. Проанализировать состояние структуры аппарата Гольджи.

Изучить локализацию везикул с низким значением рН. ¡. Исследовать процессы внутриклеточного транспорта. . Изучить влияние брефелдина А (ВРА) на:

- структуру аппарата Гольджи;

- локализацию везикул с низким значением рН.

Научная новизна результатов исследования. В результате проведённых экспериментов нами впервые показано, что ыжившие в токсичном окружении опухолевые клетки не только приобретают тожественную лекарственную устойчивость, опосредованную гиперэкспрессией но фактически представляют собой морфологически новый тип клеток. Уже па ервых этапах возникновения и становления Pgp-зaвиcимoй МЛУ происходит пачительная перестройка элементов цитоскелета и вакуолярной системы езистентных клеток. Обнаружено, что при одинаковой выживаемости исходных леток и клеток с гиперэкспрессией Р§р в среде с брефелдином А, структура ппарата Гольджи нечувствительна к действию брефелдина А в клетках с инерэкспрессией Pgp. Полученные данные позволяют полагать, что данные

изменения не являются случайными и важны для выживания опухолевых клеток в среде, содержащей токсичные вещества.

Научно-практическое значение работы.

Выявленные изменения элементов цитоскелета и вакуолярной системы при сравнении чувствительных и резистентных опухолевых клеток могут быть характерны не только для клеток злокачественных новообразований, но и для нормальных клеток при их выживании в токсичном окружении. Эти наблюдения дают новые сведения относительно особенностей фенотипической изменчивости клеток млекопитающих, переживших стрессорныс воздействия и клеточных механизмов этой изменчивости.

Понимание ультраструктурных отличий исходных опухолевых клеток от их резистентных потомков может способствовать поиску новых мишеней для проведения химиотерапии.

Апробация работы.

Результаты работы были представлены на симпозиуме "Биология клетки в культуре" (Санкт-Петербург, 1992); на конференции по генетике соматических клеток в культуре (Москва, 1993); на международном симпозиуме "Биологическая подвижность" (Пущино, 1994); на международном симпозиуме "Цитоскелет и функция клетки" (Cold Spring Harbor, USA, 1995); на международном конгрессе по противоопухолевым препаратам (Paris, France, 1996); на международной конференции ISOBM (San Diego, USA, 1996); на 1-ом съезде онкологов стран СНГ (Москва, 1996); на международном симпозиуме по лекарственной устойчивости (Berlin, Germany, 1997); на заседании кафедры цитологии и гистологии биологического факультета МГУ.

Объем н структура диссертации.

Диссертация изложена на _ машинописных страницах и состоит из

следующих глав: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы. Иллюстративный материал представлен_ таблицами и_

рисунками. Список литературы влючает_ работы на русском языке и_работы

на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовались эмбриональные фибробласты сирийского хомяка, трансформированные вирусом саркомы Рауса, HET-SR-2SC-LNM (далее 2SC) (Deichman et al., 1988). Две независимые сублинии 2SC-LNM-1 и 2SC-LNM-2 (далее 2SC/20-1 и 2SC/20-2) с гиперэкспрессией Pgp (показана Вестерн-блот анализом, Erokhina et al., 1994) были получены в результате поэтапной селекции клеток колхицином (КХ) (Shtil et al., 1994). Клетки с гиперэкспрессией Pgp характеризуются уровнем устойчивости к КХ в 23 раза. Данные линии клеток также резистентны к винбластину (в 10 раз), фарморубицину (в 19 раз), доксорубицину (в 10 раз) и адриабластину (в 7 раз), т.е. обладают фенотипом МЛУ.

Для проведения иммунофлуоресцентных исследований клетки окрашивали при помощи моноклональных антител к тубулину для выявления общей сети микротрубочек (Sigma, Т-9026) и сети тирозилированных микротрубочек (Sigma, Т-9028) или к виментину (Sigma, V-6630) для выявления промежуточных филамептов. Для выявления клеточного компартмента с низким значением рН клетки окрашивали витальным красителем нейтральным красным. Аппарат Гольджи выявляли при прижизненном окрашивании Có-NBD-церамвдом (в конечной концентрации 1х10"5М; Molecular' Probes). Анализ движения внутриклеточных частиц проводился с помощью метода видеоусиления с дифференционно-интерференционным контрастом и фазового микроскопа с компьютерной обработкой. Для изучения структуры комплекса Гольджи и распределения везикулярных частиц был проведён анализ ультраструктуры клеток на серийных ультратонких срезах. Приготовление материала для электронно-микроскопических исследований проводилось по стандартной методике.

Выживаемость клеток в среде с брефелдином A (Sigma) определяли методами МТТ-аналаза и оценки прироста клеток. Структуру аппарата Гольджи

анализировали через 4 и 48 часов, а распределение компартмента с низким значением рН через 48 часов культивирования клеток в среде с брефелдином А (конечная концентрация 2.5 х 1СГ7 М).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Организация цнтоскелета в клетках с пшерэкспрессией PGP.

Нами изучена организация различных элементов цитоскелета: стресс-фибрилл актина, общей сети МТ, ацетшшрованных и тирозилированных МТ, промежуточных филаментов.

1.1. Стресс-фибриллы актина.

При флуоресцентном анализе (окрашивание TRITC-фаллоидином) было выявлено, что исходные фибробласты сирийского хомяка линии HET-SR-2SC-LNM не содержат стресс-фибрилл актина: при окрашивании TRITC-фаллоидином диффузно окрашивается вся цитоплазма. В отдельных клетках можно наблюдать редкие кластеры актина, разбросанные по цитоплазме или локализованные в области ламеллы, в районе плазматической мембраны.

Культура клеток, с гиперэкспрессией Pgp, достаточно гетсрогенна по степиш выраженности актиновых микрофиламентов. По данному признаку в ней можно выделить следующие типы клеток:

1. Основная часть (около 70%) популяции клеток сублиний 2SC/20-1 и 2SC/20-2 по характеру окрашивания TRITC-фаллоидином сходна с клетками родительской линии HET-SR-2SC-LNM: диффузно светится вся цитоплазма, стресс-фибриллы не выявляются.

2. В цитоплазме не содержащих стресс-фибриллы актина клеток, так же как и в клетках родительской популяции, могут выявляться кластеры актина. По сравнению с исходной линией, в резистентных популяциях число клеток, содержащих кластеры актина, заметно возрастает. Кластеры актина могут быть локализованы беспорядочно по всей цитоплазме или обнаруживаются исключительно на периферии клеток, локализуясь в области плазматической

мембраны (как правило, такая локализация характерна для клеток округло-отростчатой формы).

3. В цитоплазме 25%-30% клеток с гиперэкспрессисй Р§р при окрашивании ТЫТС-фаллоидином, выяляются стресс-фибриллы актина. Среди клеток этой категории мы выделили несколько типов клеток по степени организованности и выраженности стресс-фибрилл актина в данной популяции клеток:

- клетки полигональной формы, содержащие короткие стресс-фибриллы актина, с беспорядочным их распределением по цитоплазме;

клетки полигональной формы, содержащие отдельные пучки микрофиламентов, идущие параллельно друг другу, часто из одного конца клетки в другой. В некоторых клетках, наряду со стресс-фибриллами, могут выявляться и кластеры актина;

- клетки, содержащие ярко выраженные стресс-фибриллы актина, идущие из одного конца клетки в другой. Пучки микрофиламентов в таких клетках распределены, как правило, параллельно друг другу вдоль длинной оси фибробласта. Часто, по своей морфологии, такие клетки напоминают нормальный фибробласт и имеют характерную для таких фибробластов ассиметрию: ведущий край и хвостовую часть.

Таким образом, уже на ранних этапах развития Pgp-onocpeдoвaннoй МЛУ в части клеточной популяции происходит восстановление стресс-фибрилл актина.

1.2. Микротрубочки.

Иммунофлуоресцентный анализ показал, что как в исходных клетках, так и в клетках с гиперэкспрессией Pgp, встречается два типа распределения микротрубочек (МТ): беспорядочное и радиальное. В большинстве клеток (90-95%) всех исследуемых сублиний МТ формируют густую беспорядочную сеть. МТ, в таких клетках, имеют очень плотную локализацию в центральной части клетки. Менее плотное расположение МТ наблюдается только на периферии клеток и в отростках.

Радиальное распределение МТ встречается значительно реже (5-10% клеток). Клетки с радиальным распределением МТ характеризуются наличием и

околоядерной зоне области с интенсивным характером свечения и с большим количеством МТ, радиалыю расходящимися во все стороны клетки. По-видимому, в данной области локализован центр организации МТ (ЦОМТ). Однако, до периферии клетки доходит небольшое число МТ и их распределение, в этой области клетки, достаточно рыхлое.

1.3. Тирозилированние микротрубочки.

Иммунофлуоресцентный анализ распределения тирозилированных микротрубочек (тМТ) в родительских клетках сублинии НЕТ-8К-28С-ПЧМ показал, что для тМТ, в данной культуре клеток, характерно ярко выраженное радиальное распределение (Рис. 1).

исходные клетки клетки с гиперэкспрессией Рдр

Рис. 1. Схема реорганизации пула тирозилированных микротрубочек в клетках с

гиперэкспрессией Р§р.

В клетках исходной линии, зона, характерная для локализации ЦОМТ, выявляется в виде узкой приядерной области, от которой радиалыю отходят пучки тМТ. Тирозилированные МТ, выявляемые в данных клетках, равномерно и достаточно рыхло, распределены по всей цитоплазме, доходят до периферии клеток и обнаруживаются в отростках. По данному признаку культура исходных клеток достаточно однородна.

В клетках, характеризующихся гипсрэкспрессией область локализации ЦОМТ, выявляется в виде значительно более обширной, чем в исходных клетках, околоядерной зоны. Данная область характеризуется интенсивным свечением и в ней

присутствуют многочисленные микротрубочки. Всю центральную часть клетки занимают толстые пучки тМТ, доходящие до периферии клетки, и также обнаруживаемые в отростках.

При окрашивании антителами к ацетилированному тубулину в цитоплазме всех исследованных сублшшй микротрубочки выявлены не были. В цитоплазме клеток в околоядерной области выявлялись 1-2 светящиеся точки, возможно, центриоли. В качестве положительного контроля на то, что данные антитела работают, является окрашивание данными антителами клеток линии ЗТЗ, трансформированных БУ-40. В клетках данной сублинии выявлялись ацетилированные МТ. В клетках культуры СПЭВ ацетилированные МТ не выявлялись, а имелось свечение точечных структур в околоядерной области (О.П.Кисурина-Евгеньева , личное сообщение).

Таким образом, уже на ранних этапах развития Pgp-onocpeдoвaннoй МЛУ происходит изменение состояния системы МТ, выражающееся в увеличении пула тирозилированных микротрубочек.

1.4. Промежуточные филаменты.

Иммунофлуоресцентпое окрашивание антителами к виментипу демонстрирует, что во всех клетках исследуемых сублиний виментиновые филаменты имеют беспорядочное или радиальное распределение. Наиболее часто (90%) встречаются клетки, где промежуточные филаменты (ПФ) формируют беспорядочную сеть. Радиальное распределение ПФ встречается достаточно редко (10%). Т.е. по данному признаку клетки исходной линии и с гиперэкспрессией Pgp не различаются.

Полученные данные показывают, что уже па ранних этапах Pgp-опосредованпон МЛУ некоторые из элементов цитоскелета (актиновый цитоскелет и тирозшшрованиые МТ) претерпевают реорганизацию, в то время как другие элементы цитоскелета (виментиновые филаменты и ацетилированные МТ) не изменены.

2. ЭЛЕМЕНТЫ ВАКУОЛЯРНОЙ СИСТЕМЫ В КЛЕТКАХ С ГИПЕРЭКСПРЕССИЕЙ PGP

Для анализа состояния и организации элементов вакуолярной системы на начальных этапах Pgp-опосредованной МЛУ нами была изучена структура аппарата Гольджи, локализация везикул с низким значением рН, характер внутриклеточного движения везикул, проведён ультраструктурньш анализ вакуолярного компартмента.

2.1. Аппарат Гольджи.

В клетках исходной родительской линии HET-SR-2SC-LNM комплекс Гольджи, выявляется в виде интенсивно светящейся, локализованной около ядра, достаточно компактной зоны. Аппарат Гольджи выглядит несколько вытянутым вдоль ядерной мембраны и тем самым напоминает форму "шапочки". Характер свечения в области локализации аппарата Гольджи можно охарактеризовать, как очень интенсивный. В некоторых клетках хорошо просматривается стопчатая структура аппарата Гольджи, когда при окрашивании C6-NBD-nepaMimoM, видны отдельные, вытянутые вдоль ядерной мембраны, интенсивно-светящиеся зоны. Такие зоны локализуются одна под другой и, тем самым, формируют стопку. Такая структура аппарата Гольджи может соответствовать "классическому" пластинчатому строению комплекса Гольджи (Рис. 2).

В клетках двух сублиний, 2SC/20-1 и 2SC/20-2, характерризующихся пшерэкспрессией Pgp, аппарат Гольджи, также как и в клетках исходной линии, выявляется в околоядерной области. Однако, структура его отличается от структуры аппарата Гольджи, характерной для клеток исходной линии. В резистентных клетках, при окрашивании Сб-ИБВ-церамщюм, можно выделить два основных типа окрашивания аппарата Гольджи, которые мы определили как: 1) однородно-диффузный; 2) в виде отдельных кластеров.

При однородно-диффузном типе окрашивания область локализации аппарата Гольджи не характеризуется ярким свечением и выглядит как достаточно рыхлая, однородно-светящаяся структура. Данный тип является преобладающим и встречается примерно в 85% клеточной популяции.

При втором типе характера окрашивания (15% клеток), аппарат Гольджи также выявляется в околоядерной области, но выглядит в виде зоны, содержащей отдельные кластеры. При этом, кластеры характеризуются интенсивным свечением. Расположение кластеров может быть компактным, когда несколько кластеров локализуется рядом друг с другом, образуя единую зону, или достаточно разбросанным. В этом случае, кластеры располагаются на некотором отдалении друг от друга и между ними имеются области, которые не окрашиваются Сб-КВБ-

исходные клетки клетки с гиперэкспрессией Рдр

Рис. 2. Схема структуры аппарата Гольджи и распределения везикулярного компартмента в исходных клетках и в большинстве клеток с гиперэкспрессией

Р8Р-

Таким образом, структура аппарата Гольджи претерпевает реорганизацию уже па начальных этапах развития Pgp-onocpeдoвaннoй МЛУ: от пластинчатого комплекса в клетках исходной линии к диффузной структуре в большинстве клеток с гиперэкспрессией Р§р.

2.2. Везикулярный компартмент с низким значением рН.

При окрашивании нейтральным красным гранулы красителя сегрегируют в клеточном компартменте с низким значением рН, к которому относятся: лизосомы, эндосомы, гладкие пузырьки и отдельные элементы комплекса Гольджи (Булычёв и др., 1991).

Прижизненное, кратковременное (15 минут) окрашивание клеточного везикулярного компартмента с низким значением рН витальным красителем нейтральным красным показало, что, как в клетках родительской линии НЕТ-БЫ-28С-ЬЫМ, так и в клетках с гаперэкспрессией Р§р сублиний 25С/20-1 и 28С/20-2 встречается два основных типа клеток по характеру окрашивания нейтральным красным:

I тип: клетки характеризуюется компактной, полярной локализацией гранул красителя;

II тип: гранулы красителя распределены дисперсно по всей цитоплазме.

В зависимости от исследуемой сублинии, соотношение этих двух клеточных типов сильно изменяется.

70% клеток исходной сублинии НЕТ-8Е-28С-1ЛШ по характеру окрашивания нейтральным красным относятся к первому типу (Рис.3). В таких клетках гранулы нейтрального красного располагаются непосредственно в околоядерной области.

% клеток с данным распределением гранул

80

60

40

20

2БС

.....- дисперсное

28С/20-1

I] - компактное

Клеточные

25С/20-2 линии ] - неокрашенные клетки

Рис. 3. Гистограммы распределения гранул нейтрального красного в клетках исходной сублинии и с гиперэкспрсссией Р%р (среднее ± ст.откл.).

Расположение гранул красителя полярно, так как они имеют локализацию только с одной стороны ядра. Отдельные гранулы красителя, при такой компактной локализации, могут встречаться в области ламеллы и в отростках клеток, но они немногочисленны. Дисперсное распределение гранул нейтрального красного встречается в 20% клеточной популяции (Рис. 3).

В 75%-80% клеток с гиперэкспрессией Pgp обоих сублиний, 2SC/20-1 и 2SC/20-2, встречается дисперсное распределение по цитоплазме гранул нейтрального красного. Гранулы красителя встречаются как во всей околоядерной области, так и в области ламеллы, доходя до края клетки. При компактной локализации (I тип) гранул нейтрального красного в клетках сублиний с гиперэкспрессией Pgp наблюдается картина, сходная с той, что мы описывали для клеток исходной линии (встречается в 10%-12% клеток). Примерно 10%-15% клеточной популяции не окрашивались нейтральным красным во всех исследованных сублиниях (Рис. 3).

Таким образом, уже на начальных этапах развития Pgp-опосредованной МЛУ происходит изменение локализации везикулярного компартмента с низким значением рН: компактная, полярная околоядерная локализация в клетках исходной сублинии переходит преимущественно в дисперсную в клетках с гиперэкспрессией

Pgp-

2.3. Движение внутриклеточных частиц.

Использование метода видеоусиления с дифференционно-интерференционным контрастом позволяет проводить прижизненное наблюдение за внутриклеточными частицами диаметром 0.1 микрон и больше (митохондрии, эндосомы, лизосомы) (Brady et al„ 1988).

В исходных клетках линии HET-SR-2SC-LNM большинство цитоплазматических везикул (диаметр 0.2-0.3 микрона) локализуется в центральной перинуклеарной области цитоплазмы, немногочисленные везикулы и митохондрии встречаются в ламелле. Движение везикул в таких клетках практически отсутствует: везикулы, как правило, неподвижны, редко наблюдаются колебательные движения и направленное движение в сторону ядра или к плазматической мембране.

В клетках с гаперэкспрессисй Ряр сублинии 2&С/20-2 (для данного анализа использовались, в основном, клетки этой культуры) везикулы диаметром 0.2-0.3 микрона также локализуются преимущественно в околоядерной зоне и немногочисленные митохондрии располагаются в зоне ламеллы. Но, в противоположность к исходным клеткам, в области ламеллы появляются многочисленные, меньшего диаметра везикулы (диаметр 0.1 микрон) с активным броуновским характером движения. Такие везикулы броунируют во всех направлениях, мгновенно появляясь и исчезая из поля зрения, что создаёт трудности в определении скорости их движения. До конца области ламеллы такие везикулы не доходят и их слияния с плазматической мембраной мы не наблюдали. Активное движение многочисленных мелких частиц (с диаметром 0.1 микрон) создаёт впечатление "кипения" цитоплазмы резистентных клеток.

Количество везикул на площади ламеллярной цитоплазмы равной 10 микрон в резистентной сублинии увеличено в среднем в 3.3 раза (10-18 в чувствительных клетках против 34-95 в резистентных сублиниях).

2.4. Анализ интенсивности внутриклеточного движения.

Для анализа интенсивности внутриклеточного движения в фибробластах исходной культуры НЕТ-5К-28С-ЬЫМ и фибробластах сублинии 25С/20-2, характеризующихся гиперэкспрессией Pgp, был использован метод построения спектров Фурье усредненных по всему сечению. Данный метод позволяет описать двигательные процессы в выбранной точке (линии сечения) клетки.

Сравнение характеристик частот интенсивности движения (усредненных спектров Фурье) показало, что в клетках исходной линии НЕТ-8Н-25С-1^М более выраженными являются низкие частоты в диапозоне от 0 до 0,55 Гц. На частотах свыше 10 Гц присутствуют пики - 12,3 Гц, 12,8 Гц и 13 Гц.

В фибробластах линии 28С/20-2, в противоположность клеткам исходной линии, на низких частотах наблюдается только один ник в области 0,9 Гц. В области же распределения высоких частот - 11,8 Гц.

Согласно данному методу наличие низкочастотных компонент (диапазон до 1 Гц) отражает движение везикулярных частиц при пересечении ими линии сканирования. Таким образом, сдвиг пика в диапазоне распределения низких частот в клетках с гиперэкспрессией Р§р сублинии 2БС/20-2 свидетельствует о большей скорости движения везикулярных частиц в клетках данной сублинни. Наличие пиков в области 11-13 Гц свидетельствует об иных процессах внутриклеточной динамики, например, об образовании токов цитоплазмы, анализ которых не входил в задачу данного исследования.

Таким образом анализ характера и интенсивности внутриклеточного движения везикул показал, что уже начальные этапы развития Pgp-onocpeдoвaнlloй МЛУ сопровождаются увеличением в ламеллярной цитоплазме количества везикул и интенсивности их движения.

2.5. Ультраструктура.

Нами был проведён электронно-микроскопический анализ серийных срезов фибробластов сирийского хомяка исходной линии НБТ-ЗИ-25С-ЬКМ и полученной из неё сублинии 25С/20-2, характеризующейся Р£р-опосредованной МЛУ.

В цитоплазме клеток исходной сублинии определяются вакуолярные структуры, которые преимущественно располагаются в околоядерной области. Аппарат Гольджи локализован в непосредственной близости от ядерной мембраны. Цистерны аппарата Гольджи формируют стопчатую структуру. В центре клетки видны немногочисленные первичные лизосомы и мелкие везикулы. Несколько вторичных лизосом определяются на периферии клетки. На периферии клетки расположены и скопления митохондрий. Хроматин равномерно распределён по всему ядру и в ядре определяется 1-2 ядрышка. Ядерная мембрана неровная, образует небольшие впячивания в кариоплазму.

При электронно-микроскопическом анализе клеток линии 28С/20-2 с гаперэкспрессиен Pgp, нами было обнаружено, что данная культура клеток гетерогенна по количеству, размеру и распределению по цитоплазме вакуолей. По данному признаку, нами были выделены 2 группы клеток:

1) Клетки этой группы характеризуются наличием в цитоплазме многочисленных вакуолей, которые заполняют как центр клетки, так и периферию. В центральной части клеток, в непосредственной близости от ядра, имеется область, которая по своей ультраструктуре, резко отличается от остальной части цитоплазмы. Отличительной чертой этой "области" является наличие центриолей и многочисленных везикул. Везикулы разного диаметра локализованы отдельными группами или формируют многочисленные стопки. Стопки состоят, как правило, из 2-6 везикул и представляют собой, по-видимому, "разбухшие" цистерны аппарата Гольджи. В клетках также содержаться многочисленные первичные и вторичные лизосомы, которые могут встречаться в околоядерной области, в центре и на периферии клеток. Большая часть вторичных лизосом и митохондрий локализуется на периферии клеток. Описанный выше вид клеток преобладает в культуре.

2) В отличие от клеток 1-ой группы, вокруг центриолей в околоядерной области располагаются не многочисленные везикулы, а несколько (как правило, 3-4) стопок аппарата Гольджи. При этом, цистерны стопок имеют вытянутую и продолговатую форму, а не преимущественно округло-везикулярную, как это было в клетках 1-го типа. В клетках также содержаться многочисленные первичные и вторичные лизосомы, которые могут встречаться в околоядерной области, в центре и на периферии клеток. Большая часть вторичных лизосом локализована на периферии клеток. Там же встречаются и скопления митохондрий.

Ядра, как в клетках 1-го, так и 2-го типа, содержат, как правило, 1-2 ядрышка (редко 4). Хроматин равномерно распределён по ядру, иноща образуя небольшие скопления в районе ядерной мембраны. Ядерная мембрана неровная и образует небольшие впячивания в кариоплазму.

Таким образом, ультраструктурный анализ состояния вакуолярного компартмента показал, что уже на ранних этапах развития Pgp-onocpeдoвaнnoй МЛУ происходит увеличение объема вакуолярного компартмента в цитоплазме.

Полученные данные показывают, что клетки исходной лиши и клетки с гиперэкспрессией отличаются по характеру организации элементов

вакуолярной системы. Уже на начальных этапах развития Pgp-опосредованной МЛУ происходит:

1) увеличение вакуолярного компартмента,

2) изменение структурной организации аппарата Гольджи,

3) перераспределение везикулярного компартмента с низким значением рН,

4) увеличение активности движения везикул.

Все эти изменения свидетельствуют об изменении состояния и организации вакуолярного компартмента клетки при развитии Pgp-опосредованной МЛУ.

3. ЭЛЕМЕНТЫ ВАКУОЛЯРНОЙ СИСТЕМЫ В КЛЕТКАХ С ГИПЕРЭКСПРЕССИЕЙ PGP ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ БРЕФЕЛДИНОМ А

Как было показано, исходные клетки и клетки с гиперэкспрессией Pgp характеризуются разной организацией элементов вакуолярной системы (описано в предыдущем Разделе 2). Для изучения особенностей организации и функционирования элементов вакуолярной системы в клетках, используются различные блокаторы мембранного транспорта. Одним из таких блокаторов является брефеддин A (BFA), который и был использован для дальнейшего изучения особенностей организации и функционирования элементов вакуолярной системы в исходных клетках и в клетках с гиперэкспрессией Pgp.

3.1 Определение чувствительности клеток к брефелдину А.

Чтобы исключить вероятность того, что BFA является субстратом для Pgp, была определена выживаемость исходных клеток и клеток с пшерэкспрессией Pgp в среде с BFA двумя методами: методом МТТ-анализа и методом оценки прироста клеток. Полученные результаты показали, что индекс выживаемости 50% (IC50) клеток исходной сублинии и клеток с гиперэкспрессией Pgp в среде с BFA составляет:

HET-SR-2SC-LNM

4.46 ± 0.66 х 10 "7 М

2SC/20-1 2SC/20-2

4.51 ± 0.41 х 10 '7 М 4.42 ± 0.44 х 10 "7 М

Т.е. выживаемость клеток исходной сублинии и клеток с Pgp-оносредованной МЛУ в среде с BFA практически совпадают. Следовательно, клетки с гиперэкспрессией Pgp не обладают резистентностью к данному агенту и BFA не является субстратом для Pgp.

3.2 Аппарат Гольджи.

Для выяснения влияния BFA на элементы вакуолярной системы в исходных клетках линии HET-SR-2SC-LNM и сублиний 2SC/20-1 и 2SC/20-2 с Pgp-опосредованной МЛУ, была использована субтоксичная доза BFA (2.5 х 10 "7 М) Дозы BFA, превышающие IC50, уже через 12-18 часов вызывали гибель клетог (клетки округлялись и откреплялись от подложки). Анализ структуры аппарат; Гольджи был проведён через 4 и 48 часов после воздействия BFA. В контрольны; клетках, не подвергавшихся обработке BFA, при окрашивании Сб-КВБ-церамидоь аппарат Гольджи выявляется в виде структур, описанных в Разделе 2.1.

В культуре клеток исходной линии HET-SR-2SC-LNM через 4 часо] воздействия BFA встречается несколько вариантов локализации аппарата Гольджи.

• В 30% клеток аппарат Гольджи не выявляется. В таких клетка; наблюдается диффузное свечение по всей цитоплазме.

• Около 50% клеток имеет дезорганизованный аппарат Гольджи: едина: стопчатая структура комплекса Гольджи распадается на отдельные кластер! (степень кластеризации может быть различной). При этом, кластеры могут быт] расположены не только в околоядерной области, но и быть разбросаными по Bcei цитоплазме.

• Около 10% клеток имеют частично разобранный аппарат Гольджи. Пр] окрашивании Cö-NBD-церамидом аппарат Гольджи выявляется в околоядерно1 области в виде остаточной структуры.

О Около 10% клеток имеют "плотную" околоядерную локализацию комплекса Гольджи, идентичную контрольному варианту.

В некоторых клетках можно видеть вытянутые светящиеся структуры. Исходя из данных литературы эти структуры могут соответствовать нитчатыми структурам, образованным слившимися лизосомами и эндосомами (Wood, 1991, 1992, 1994).

В двух сублиниях с фенотипом МЛУ, 2SC/20-1 и 2SC/20-2, аппарат Гольджи выявляется во всех клетках и, при этом, характер окрашивания не отличается от того, что наблюдается в контроле.

Прижизненное окрашивание Сб-КВО-цсрамидом структуры аппарата Гольджи через 48 часов инкубации в среде с BFA показало, что в культуре клеток исходной сублинии встречается несколько типов клеток, отличающихся друг от друга по характеру окрашивания Cö-NBD-церамидом после воздействия BFA.

□ В подавляющем большинстве (80%) исходных клеток по всей цитоплазме наблюдалось слабое свечение, с чуть большей интенсивностью в околоядерной области. Т.е. в большинстве клеток исходной лиши исчезло компактное расположение аппарата Гольджи в околоядерной области.

□ В 12% клеток структура аппарата Гольджи была сохранена частично, имея вид "диффузной" области, расположенной в районе впячивания ядра или остаточных кластеров. В этих клетках имеются изменения в структуре аппарата Гольджи, хотя и не произошло его полной разборки.

□ В 8% клеток структура аппарата Гольджи выявлялась в виде "плотной" околоядерной зоны, которая является типичной для контрольных клеток, необработанных BFA. Таким образом, небольшая часть клеточной популяции исходных клеток оказалась нечувствительной к обработке BFA.

В клетках с гиперэкспрессией Pgp после инкубации их в среде с субтоксичной дозой BFA в течете 48 часов структура аппарата Гольджи при прижизненном окрашивании C6-NBD-uepaMiuiOM выявляется во всех клетках. Можно видеть, что аппарат Гольджи имеет околоядерное расположение и

характеризуется "дискретно-диффузным свечением". Последовательность измененш структуры аппарата Гольджи под воздействием ВРА представлена на Рис.4.

исходные клетки

Рис. 4. Схема преобразований структуры аппарата Гольджи под действием ВРА й исходных клетках и в клетках с гиперэкспрессией Р2р.

Таким образом, уже на начальных этапах развития Pgp-onocpeдoвaннoй МЛ1 происходит изменение не только структуры аппарата Гольджи, но и ег< чувствительности к токсичному действию ВРА: структура аппарата Гольдш оказывается нарушена под действием ВРА в клетках исходной сублинии I сохраняет свою целостность в клетках с гиперэкспрессией Р^р

3.3. Везикулярный компартмент с низким значением рН.

С помощью метода окрашивания нейтральным красным был проведён анали; распределения везикул с низким значением рН в исходных клетках линии НЕТ-ЙК 28С-ОШ и в двух сублиниях, 28С/20-1 и 28С/20-2, характеризующих« шперэкспрессией Pgp при воздействие субтоксичной дозы ВРА (2.5 х 1СГ7 М) I течение 48 часов. Мы сравнивали только одноядерные, хорошо распластанные клетки.

Как было показано, распределение гранул нейтрального красного изначально отличается в клетках исходной линии и в клетках сублиний с гиперэкспрессией Pgp: в клетках исходной сублинии HET-SR-2SC-LNM преобладает околоядерное компактное распределение гранул красителя, в резистентных 2SC/20-1 и 2SC/20-2 -дисперсное, что можно наблюдать и в контрольных вариантах. Примерно от 10% до 15% клеток не окрашивались нейтральным красным, как в контрольных вариантах, так и в обработанных BFA клетках.

При обработке BFA в течение 48 часов клеток исследуемых сублиний значительно снижается количество гранул красителя в цитоплазме обоих типов клеток, по сравнению с контрольным вариантом. Через 48 часов инкубации в среде с субтоксичной дозой BFA в цитоплазме обоих типов обработанных BFA клеток можно видеть отдельные, преимущественно дисперсно локализованнные гранулы красителя.

Культура \клсток 2SC 2SC/20-1 2SC/20-2

Локализация гранул^. -BFA +BFA -BFA +BFA -BFA +BFA

Околоядерное 66,8±3,6 31,4±7,9 7,0+3,1 8,0±8,0 5,3±2,6 8,0±8,0

Дисперсное 16,9±2,5 45,4±12,2 69,4±5,4 77,3±6,1 85,3±3,3 88,7±4,5

Табл. 1. Таблица локализации гра\сул нейтрального красного в клетках исходной сублинии и с гиперэкспрессией Р§р при воздействии ВРА в течение 48 часов

(среднее ± ст.откл.).

Однако, при сравнении локализации гранул красителя в цитоплазме клсто) выявлены следующие различия (Табл. 1). В исходных клетках при действии BFA в ' раза снижается количество клеток с компактным околоядерным распределению гранул красителя и возрастает с дисперсным распределением гранул по Bcei цитоплазме. В обработанных BFA клетках с пшерэкспрессисй Pgp характс] локализации гранул красителя, по сравнению с контролем, практически н изменился.

Таким образом, воздействие BFA в течение 48 часов приводит к сниженш гранул нейтрального красного в клетках всех исследованных сублиний и изменяег их локализацию на более дисперсную в клетках исходной сублинии.

Полученные данные показывают, что BFA оказывает разное действие к клетки исходной сублинии и клетки с гиперэкспрессией Pgp характеризующиеся разной организацией вакуолярпого компартмента цитоплазме. При одинаковой выживаемости в среде с BFA клеток все исследованных сублиний, в клетках исходной сублинии структура аппарат Гольджи и локализация везикулярного компартмента чувствительны токсичному действию BFA, тогда как в клетках с гиперэкспрессией Pgp BF. не влияет на структуру аппарата Гольджи и локализацию везикулярног компартмента. Снижение количества везикул с низким значением pi наблюдается в клетках всех исследованных сублиний.

ОБСУЖДЕНИЕ

Полученные нами результаты показывают, что клетки с гиперэкспрессией Pg (в двух независимо полученных сублиниях) характеризуется перестройкой элементе цитоскелета и вакуолярной системы уже на начальных этапах развития МЛУ. Дг выживания и адаптации опухолевых клеток в неблагоприятных условиях, п< водимому, необходимы не только экспрессия на плазматической мембране белк;

транспортёра (Pgp), но и изменение морфофункционалыюго состояния различных клеточных структур.

Во-первых, мы наблюдали реорганизацию актинового цитоскелета. Как мы предполагаем, наблюдаемые нами в цитоплазме клеток с гаперэкспрессией Pgp кластеры актина служат своего рода "затравкой" для реставрации стресс-фибрилл актина. Известно, что зоны нуклеации пучков актина связаны с областью плазматической мембраны (Веп£1850п е1 а1., 1988; ОкаЬе & Шгокаи-а, 1989, 1994). Мы предполагаем, что наблюдаемые нами различные типы актиновых структур в клетках с гиперэкспрессией Pgp, являются разными этапами процесса реорганизации актинового цитоскелета: образование кластеров актина в цитоплазме, вероятно, предшествует формированию стресс-фибрилл (Рис. 5).

— диффузное окрашивание а. _ кластеры актина

— стресс-фибриллы актина

Рис. 5. Схема реорганизации актиновых структур в клетках с гиперэкспрессией

Р8Р-

Не совсем ясно с чем связано увеличение пула именно тирозилированных МТ в клетках, характеризующихся гиперэкспрессией Рор. Одной из основных функции МТ в интерфазных клетках является обеспечение транспортного процесса. Возможно, что разные органеллы могут связываться с разными пулами МТ. Так как в клетках с гиперэкспрессией Pgp наблюдается увеличение объема периферийного

вахуолярного компартмента, мы предполагаем, что именно с пуло; тирозилировашшх МТ может быть связан транспорт на периферию клетк различных везикул.

Как показали полученные нами данные, исходные клетки и клетки пшерэкспрессией Pgp характеризуются разным структурно-функциональны состоянием элементов вакуолярной системы. Развитие Р§р-опосредованной МЛ сопровождается: реорганизацией структуры аппарата Гольджи (от пластинчатой более дискретной), изменением локализации везикулярного компартмента (с компактной околоядерной к дисперсной по всей цитоплазме), увеличение активности мембранного транспорта. Такие изменения, по-видимому, такж неслучайны и способствуют поддержанию резистентного фенотипа. Воздсйстви ВИА на исходные клетки и клетки с пшерэкспрессией Р£р выявило, чт особенности структурно-функционального состояние элементов вакуолярно системы определяют реакцию клетки на ВИА. В клетках с пшерэкспрессией аппарат Гольджи оказывается резистентен (не теряет своей структурно целостности) к действию В РА. При этом выживаемость исходных клеток и клеток пшерэкспрессией Pgp в среде с В РА одинакова.

Бобичон с соавторами (ВоЫсЬоп е1 а1., 1996) также указывают на "разбухшие цистерны аппарата Гольджи и локализацию многочисленных везикул в цитоплазм лимфобластов при развитиии Pgp-oпocpeдoвaннoй МЛУ. Имеются данные возможности накопления (изоляции) агентов круга МЛУ в везикулярно компартменте и в транс-цистернах аппарата Гольджи. В связи с чем обсуждетс вопрос о возможности функциональной активности Pgp не только на поверхност клетки, но и внутри цитоплазматических везикул (\У111ищ11ат й а1., 1987; МоНпаг е1 а1., 1994; ВоЫсЬоп е! а1., 1996). Возможно, что Pgp не только транспортируете внутри транспортных пузырьков к плазматической мембране, но и способен в ни проявлять функциональную активность, закачивая внутрь везикул лекарственны агенты.

ВБА - грибной метаболит, влияющий на сборку белков окаймления на мембранах аппарата Гольджи, что приводит к нарушению направленности мембранного транспорта в клетке (Рината й а1., 1988; Г-АрртсоИ-ЗйшаЛг е> а1., 1989). Схема предполагаемого влияния В РА на клетки исходной сублинии и клетки с гиперэкспрессией Pgp представлена на Рис. 6. Мы предполагаем, что В ГА в клетках исходной сублинии влияет на сборку белков окаймления на транспортных везикулах между эндоплазматическим ретикулумом и аппаратом Гольджи, а также между цистернами самого аппарата Гольджи, что и приводит к утрате аппаратом Гольджи своей структурной целостности в клетках данной линии. В связи с этим может происходить и уменьшение содержания везикул с низким значением рН в клетках исходной сублинии.

ЭР

Рис. 6. Схема предполагаемого воздействия ВГА на этапы экзоцитозного пути в клетках исходной сублинии (Л) и с гиперэкспрессией Pgp (Б). ЭР-эндоплазматический ретикулум, АГ-аппарат Гольджи, ПМ-плазматическая

мембрана.

В клетках с гиперэкспрсссией Pgp аппарат Гольджи сохраняет свок структурную целостность при воздействии BFA. Вероятно, что в этих клетка? транспорт от эндоплазматического ретикулума и между цистернами самого аппарат! Гольджи не нарушен. Однако, нарушается траенпорт от транс-цистерн аппарат: Гольджи, на что указывает снижение содержания в цитоплазме везикул с низки» значением pH.

Разный эффект BFA на исходные клетки и клетки с гиперэкспрессией Pg] может быть связан с изменением механизмов сборки белков окаймления н; мембранах аппарата Гольджи, что приводит к изменению структуры аппарат; Гольджи и делает его нечувствительным к воздействию BFA.

Таким образом, полученные нами данные позволяют говорить о том, чт( возникновение и первые этапы развития Pgp-опосредованной МЛУ, сопровождают^ возникновением нового типа клеток. Резистентные клетки отличаются от исходны: родительских не только гиперэкспрессией Pgp, но и характеризуются новым; морфологическими особенностями. Такие изменения не являются случайными i сопровождают развитие МЛУ в двух независимо полученных сублиния: фибробластов сирийского хомяка гиперэкспрессирующих Pgp. Эти изменения такж могут быть связаны с отбором клеток с изменёнными сигнальными путями, при и; селекции колхицином. Изменение сигнальных путей может влиять не только н; регуляцию активности Pgp и онкогенов, но и иметь отношение к формировали» цитоскелетных структур и вакуолярного аппарата клетки. Открытым остаётс: вопрос о физиологической роли данных морфофункциональных изменений ] обеспечении механизмов МЛУ, что может являться предметом дальнейши; исследований.

ВЫВОДЫ

Первые этапы становления множественной лекарственной устойчивости обусловленной гиперэкспрессией Pgp в двух независимо полученных сублиния) фибробластов сирийского хомяка 2SC/20-1 и 2SC/20-2 сопровождаются:

1. Реорганизацией актинового цнтоскелета: в 25%-30% клеток с тшерэкспрсссией Р£р происходит восстановление стресс-фибрилл актина.

2. Увеличением пула тирозилированных микротрубочек: все клетки с ттерэкспрессией Pgp содержат толстые пучки тирозилированных микротрубочек; область центра организации микротрубочек обширна и характеризуется гатенсивным свечением. Другие элементы цитоскелета - виментиновые филаменты и щетшшрованные микротрубочки - не изменены.

3. Изменением структуры аппарата Гольджи: в клетках с пшерэкспрессией Р§р структура аппарата Гольджи характеризуется "диффузным" строением, тогда как аппарат Гольджи в исходных клетках представлен "плотной" пластинчатой лруктурой.

4. Изменением локализации и объёма везикулярного компартмента: в клетках : гиперэкспрессией Р§р везикулярный компартмент локализован преимущественно но всей цитоплазме, тогда как в большинстве исходных клеток его локализация наблюдается преимущественно в околоядерной области.

5. Изменением активности внутриклеточного движения: в ламелярной цитоплазме клеток с пшерэкспрессией Р§р возрастает содержание везикул диаметром 0.1 микрон с активным характером движения.

Изучение особенностей элементов вакуолярной системы в клетках с пшерэкспрессией Р§р при воздействии брефелдином А показало, что:

6. Индекс выживаемости 50% (1С50) клеток в среде с брефелдином А не отличается для исходной линии и сублиний с Pgp-oпocpeдoвaннoй МЛУ.

7. Аппарат Гольджи резистентен к действию брефелдина А в клетках с гаперэкспрессиен Р§р: структура аппарата Гольджи, как показывает метод прижизненного наблюдения, сохраняет свою целостность при воздействие брефелдином А в клетках с пшерэкспрессией Р§р и разрушается в исходных клетках.

8. Воздействие брефелдина А приводит к снижению количества везикул с низким значением рН как в исходных клетках, так и в клетках с гиперэкспрсссией

Pgp. При этом локализация везикулярного компартмента изменяется только исходных клетках в сторону дисперсного распределения но всей цитоплазме.

9. Полученные результаты свидетельствую о том, что уже на ранних этапг отбора клеток на повышение гипреэкспрессии Pgp (МЛУ) отбираются клетк: представляющие собой новый морфогенетический тип и характеризующие! комплексными изменениями цитоскелетных структур и вакуолярной систем клетки.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Erokhina M.V., Shushanov S.S., Shtil A.A., Sidorova T.A., Stavrovskaya AJ 1994. "Partial restoration of the actin cytoskeleton in transformed Syrian hamst fibroblasts selected for low levels of "typical" multidrug resistance", FEBS Letters, 34 p. 295-298.

2. Ерохина МЛ., Ставровская A.A., Онищенко Г.Е., 1997. "Реорганизащ элементов цитоскелета и вакуолярной системы в опухолевых клетках на рашп этапах развития множественной лекарственной устойчивости". "Цитология", 39(11), с. 1038-1045.

3. Ерохина М.В., Онищенко Г.Е., Ставровская A.A., 1998. "Алпар Гольджи резистентен к брефелдину А в клетках с гиперэкспрессией Pgf "Биологические мембраны", (в печати).

4. Ерохина М.В., Штиль A.A., Ровенский Ю.А., 1992. "Анализ свойс опухолевых клеток с различным метастатическим потенциалом". Тезисы симпозиу) "Биология клетки в культуре", Санкт-Петербург, "Цитология", с. 121.

5. Ерохина М.В., Штиль A.A., Шушанов С.С., Ставровская A.A., 19е. "Новые данные о механизмах снижения злокачественности опухолевых клеток низким уровнем множественной лекарственной устойчивости". Тезисы доклад конференции по генетике соматических клеток в культуре, Москва, с. 65.

6. Erokhina M.V., Onishchenko G.E., Stavrovskaya A.A., 1994. "Alteration of ysosomal localization and state of cytoskeleton in transformed hamster fibroblast iclccted of "typical" multidrug resistance". Abstracts of the International Symposium 'Biological motility", Pushchino, p. 221.

7. Erokhina M.V., Abdrjashitov R.I., Onishchenko G.E., Stavrovskaya A.A., 1995. "Restoration of actin cytoskeleton at various levels of P-glycoprotein-mediated multidrug resistance". Abstracts of the International Symposium "The cytoskeleton and :ell function", Cold Spring Harbor, USA, p. 52.

8. Erokhina M.V., Onishchenko G.E., Stavrovskaya A.A., 1996. "Partial ■estoration of actin stress fibres and alterations of Golgi complex in transformed Syrian lamster fibroblasts selected for low levels of "typical" multidrug resistance (T-MDR). Abstracts of the 6th International Congress on Anti-cancer Treatment, Paris, France, p.

9. Erokhina M.V., Onishchenko G.E., Sidorova T.A., Stavrovskaya A.A., 1996. 'The evolution of multidrug resistance is accompanied by the morphofunctional reorganization of cell vacuolar system". Abstracts of the XXIV Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine, San Diego, USA, p.

10. Epoxiraa M.B., Онищснко Г.Е., Ставровская A.A., 1996. "Изменение состояния вакуолярной системы и стресс-фибрилл актина в опухолевых клетках на ранних этапах развития множественной лекарственной устойчивости (МЛУ). Тезисы 1-го съезда онкологов стран СНГ, Москва, Материалы съезда, часть 1, с. 144.

И. Erokhina M.V., Onishchenko G.E., Stavrovskaya А.А., 1997. "The first steps of MDR are accompanied by the reorganization of cytoskeleton and vacuolar system". Abstacts of the 4th International Symposium on Cytostatic Drug Resistant, Berlin, p. 53.

186.

185.