Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение элементов цитоскелета и их связи с поверхностной мембраной культивируемых нервных клеток

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Изучение элементов цитоскелета и их связи с поверхностной мембраной культивируемых нервных клеток"

ОРДЕНОВ ЛЕНИНА И ДРУЖБЫ НАРОДОВ АКАДЕМИЯ НАУК УССР Ордена Трудового Красного Знамени Институт физиологии имени А. А. Богомольца

На правах рукописи

БЕРЕЗОВСКАЯ Оксана Леонидовна

У.11Н 577.32:576.3.086:83 + 576.ЗП.348.37/7

ИЗУЧЕНИЕ ЭЛЕМЕНТОВ ЦИТОСКЕЛЕТА И ИХ СВЯЗИ С ШВЕРХНОСИЮЙ МЕМБРАНОЙ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ НЕРВНЫХ КЛЕТОК

03.00.02 - Биофизика •

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Киев- 1990

Работа выполнена в Институте физиологии им.А.А.Богомольца АН УССР

Научный руководитель - доктор медицинских наук Г.Г.Скибо

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Кононенко H.H.; доктор медицинских наук Бершадский Л.Д.

Ведущая организация: Институт биологической физики АН СССР . >»

Защита диссертации состоится 990 г.

на заседании специализированного совета Д-016.15.01 при Институте физиологии им. A.A.Богомольца АН УССР (Киев, ул.Богомольца,4).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии им. А.Л.Богомольца АН УССР

Автореферат разослан "......".....................1990 г.

Ученый секретарь, специализированного совета доктор биологических наук

3.А.Сорокина-Марина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Согласно современным представлениям (Фултон,1987; Moris,1982: Pachter.1984 и др.)цитоскелет живых клеток представляет собой динамическую, тонко организованную систему, в значительной степени определяющую структуру клеток и их функциональные свойства. Состояние цитоскелетных элементов прежде всего обуславливает чрезвычайное многообразие формы и размеров нейронов с характерными дендритными и аксонными отростками; геометрические же характеристики нервных клеток тесно связаны с их физиологическими характеристиками. Сократительные элементы цито-скелета принимают участие в цитоплазыатическом транспорте различных веществ по нейрону; цитоскелет важен тем, что он поддерживает ростовые процессы в клетке, а также участвует в клеточной миграции в развивающемся мозге. Цитоскелетом определяется способность клетки прикрепляться к субстрату и образовывать контакты с другими клетками, свобода её передвижения. Усложнение структуры нейронов и приобретение ими окончательной "взрослой" формы в период пре-и раннего постнатального развития обуславливаются, очевидно, как генетической программой, присущей данному нейрону, так и функциональным взаимодействием с соседними клетками. Поскольку форма и размер нервной клетки определяются состоянием цитоскелетных элементов, то в основе изменения этих показателей в ходе развития лежат процессы, происходящие в цитоскелете. Поэтому очевидно, что изучение структуры нервных клеток и её изменений в процессе диф-ференцировки очень важно для понимания морфофункциональных свойств нейронов.

Большинство работ по изучению цитоскелета живой клетки проведено на нормальных пролиферирующих. или трансформированных линиях клеток (Свиткина и др.,1983; isenberg, 1978; Olmsted, 1984и др. )• Изучению цитоскелета в нейронах посвящено небольшое количество работ и проблема изучена недостаточно.

Каждый тип клеток имеет свой особый спектр цитоскелетных белков, присутствующих в определенном соотношении на различных стадиях развития и специфическим образом расположенных. Изменение структуры элементов цитоскелета в нейронах приводит к значительным нарушениям функции клеток, что проявляется в возникновении различных патологических состояний тканей и органов (напр., болезнь Альцгей-мера, скрэпи, куру и др.).

На основании физико-химических и биохимических исслчдопаний

были сделаны выводы о том, что с цитоскелетными элементами взаимодействуют определенные мембранные белки, относящиеся к разряду интегральных, обладающих латеральной подвижностью ( Flanagan, 1978; Ojaklan, 19S8 ). Известно, что большинство белков и липидов поверхностной мембраны гликозилированы ( Koszinowskl, Kramer, 1981 ). Гликопротеины и гликолипиды поверхностной мембраны объединяются термином гликоконыогаты. Углеводные детерминанты, распределение которых на поверхности клеток меняется в процессе дифференцировки, играют важную роль во взаимодействиях развивающихся клеток. Предполагают, что характер взаимодействия гликоконьюгатов мембраны с элементами цитоскелета может изменяться в процессе дифференцировки клетки ( Prives et.al. 1982 ). Поэтому изучение распределения углеводных детерминант, определённой специфичности и характера их связи с сократительными элементами представляют особый интерес для понимания клеточных механизмов нейроонтогенеда.

В нервных клетках предполагается специфическая функция фибриллярных структур - участие в процессе поддержания электрической возбудимости клеточной мембраны ( Matexnnoto, 1979; Fukruda, 1981 ). Однако, характер и механизмы этой связи выяснены ещё недостаточно^

Цель работы состоит в изучении распределения цитоскелетных элементов нервных и глиальных клеток на различных этапах дифференцировки и исследовании функциональной связи элементов цитоскелета с компонентами поверхностной мембраны нейрона.

Главные задачи.

1. С помощью моноклональных антител к цитоскелетным белкам изучить состав и распределение элементов цитоскелета интактных клеток эмбрионального спинного мозга в процессе развития.

2. Провести цитофотометрический анализ количественного содержания белков цитоскелета в различных отделах нейрона, на различных стадиях развития ив различных типах клеток.

3.Изучить ультраструктурные характеристики патологических изменений клеток после воздействия цитохалазина и колхицина, веществ, специфически разрушающих микрофилаыенты и микротрубочки соответственно .

4. Исследовать изменения распределения гликоконьюгатов поверхностной мембраны, используя меченные коллоидным золотом лектины,

при разрушении элементов цитоскелета.

Научная новизна и практическая ценность работы. Данные, полученные в настоящей работе, существенно дополняют представления о пространственной организации цитоскелета в нервных и глиальньгх: клетках. Показан характер распределения микротрубочек, микрофиламентов и нейрофиламентов нервной клетки в процессе её дифференцировки. Впервые был проведен количественный анализ содержания цитоскелетных белков в различных участках клетки в процессе дифференцировки и сравнение их содержания в различных типах клеток.

Обнаружено, что в культивируемых нейронах скопления актина локализуются не только в дистальных участках растущих нейритов, но и на протяжении отростков в области соединения их с субстратом, что может иметь значение и для установления межклеточных контактов.

Продемонстрировано, что в молодых развивающихся нервных клетках и в активно растущих отделах нейронов преобладают лабильные элементы цитоскелета, что может отражать один из механизмов формообразования у нейронов.

Показано, что несмотря на возможность небольшого прироста ту-булина за счет вновь синтезируемого, общее его количество в течении жизни клетки остается примерно постоянным. Происходит лишь перераспределение тубулина внутри клетки, связанное, вероятно, с активным процессом роста отростков.

Выявлена различная чувствительность нервных и глиальных клеток к агентам, разрушающим цитоскелетные структуры, кроме того, нейроны на различных стадиях развития по-разному реагировали на такие экспериментальные воздействия.

Получены новые данные, свидетельствующие о неодинаковой степени участия микротрубочек и микрофиламентов в процессах латеральной подвижности и асимметричном распределении гликоконыогатов поверхностной мембраны нейронов в различных отделах клетки и на разных стадиях развития.

Известно, что ряд заболеваний центральной нервной системы, например, болезнь Альцгеймера, связан с нарушением структуры цитоскелетных элементов нейронов. До настоящего времени вопрос о причинах возникновения этого заболевания и способах лечения остается нерешенным. Один из путей исследования - разработка модельных систем, основанных на выявленных патологических изменениях и учитывающих причины, которые могут их вызвать. Морфологическая картина патологических изменений клеток после воздействия определенных доз колхицина и при болезни Альцгеймера аналогичны, что дает розмож-

ность предполагать определенное сходство механизмов,лежащих в основе возникновения указанных патологий и использовать предлагаемую нами модель для изучения патогенеза этого заболевания.

Апробация работы. Основные положения работы были представлены на семинарах секции Нейрофизиологии Института физиологии им. А.А. Богомольца АН УССР (Киев,,1986-1990), 1У Всесоюзной конференции по патологии клетки (Москва, 1987), 1У Международном конгрессе по клеточной биологии (Монреаль, 1988, Канада), II Всесоюзном симпозиуме "Возбудимые клетки в культуре" (Пущино-на-Оке, 1989), Республиканской конференции "Применение Электронной микроскопии в медицине" (Ивано-Франковск, 1989), Международном симпозиуме "Функций нейро-глии" (Тбилиси, 1989), УШ Европейском конгрессе по нейрохимии (Лейпциг, 1990, ГДР), Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, б глав (I глава-обзор литературы, 2 глава-методы исследования, 3--5 главы- результаты собственных исследований, 6 глава-обсуждение полученных результатов ), выводов и списка литературы, содержащего 162 наименований. Работа изложена на страницах машинописного текста, иллюстрирована 30 рисунками, ,6 таблицами

. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ.

Моделью для изучения структурных характеристик элементов цито-скелета служили клетки диссоциированного спинного мозга и спиналь-ных ганглиев 12-14 дневных мышиных эмбрионов, развивающиеся в условиях монослойных культур. Культивирование проводили в среде, состоящей из минимальной среды Игла (50%).сыворотки плодов крупного рогатого скота (35%), эмбрионального 'экстракта (9%), сбалансированного солевого раствора Хенкса (5%), глюкозы (25мМ), инсулина (0,2 ед/ мл). Покровные стекла, покрытые 0,01% поли-Ъ-лизином или коллагеном, содержащие 1-2 капли клеточной суспензии, монтировали в камере Максимова или помещали в СО^-инкубатор (95% воздуха и 5% СО2', температура 35,5°С; влажность 90%). .

Изучение распределения элементов цитоскелета в клетках проводили с помощью иммунофлуоресцентного анализа с использованием моно-клопальных антител к основным цитоскелетным белкам: актину, тубулину белку пейрофиппментов, глиальному кислому фибриллярному белку. Покропив стгм;ля,с растущим на них монослоем клеток, отмывали от

питательной среды в солевом растворе и помещали в экстрагирующий раствор с 1% Тритона Х-100. Затем клетки инкубировали с меченными антителами. Для визуализации различных белков цитоскелета в одной клетке использовали двойное окрашивание при помощи пар ыоноклональ-ных антител, меченных флуоресцеинизотиоцианатом и родамином. Микроскопию флуоресцирующих клеток проводили посредством фотомикрос-' копа " орт си " (ФРГ)с набором соответствующих фильтров.. Подсчет • количества хромофора производили с фотопленки с помощью прибора "Морфоквант". Относительное количество хромофора определяли по формуле, выведенной из закона Бугера-Ламберта-Беера:

КС = ziB^skj , где

КС-относительное количество хромофора, I-интенсивность падающего светового пучка, 1о- интенсивность пучка после прохождения через фо-тометрируемое поле, 1-толщина обьекта.

Для ультраструктурного исследования в просвечивающем ЭМ культуры фиксировали в 2% растворе глютаральдегида, дофиксировали 1% 030^ на фосфатном буфере /рН 7,4/, обезвоживали и заключали в Аралдит. Ультратонкие срезы, контрастированию уранилацетатом и лимоннокислым свинцом, просматривали в электронном'микроскопе jem-ioo сх

Для изучения распределения гликоконьюгатов поверхностной мембраны культивируемых клеток использовали коньюгированные с коллоидным золотом лектины, которые обладают свойством специфически связываться с углеводными детерминантами строго определенной структуры. В работе использовали лектины: wga - агглютинин завязи пшеницы тгшсит vulgaris , углеводная специфичность - n -ацетил-Д-глюкозамин и n-ацетилнейраминовая кислота; и hpl -агглютинин из белочной железы виноградной улитки Helix pomatia , углеводная специфичность - n -аце-тил-Д-галактозанин. Для количественного определения закономерностей топографии поверхностных гликоконьюгатов проводилась статистическая обработка распределения гранул-маркеров с помощью анализатора изображений типа М0Р-АМ03 /фирма Рейхерт, Австрия/ и ЭВМ ИВК СМ-4.

, Для исследования связи элементов цитоскелета с компонентами поверхностной мембраны использовали вещества, избирательно разрушающие микротрубочки (МТ -колхицин или микрофиламенты ОШ-цитохалазин.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Особенности распределения з^ментов цитоскелета в культивируемых

клетках спинного мозга. Иммунофлуоресцентный анализ.

Выявление распределения тубулина в нейронах на различных сроках культивирования показало, что для ранних этапов развития нервных клеток (6-7 дней in vitro -Д1У) характерна интенсивная реакция на этот белок, которая наблюдалась в телах нейронов и отсутствовала в отростках. Подобная концентрация тубулина в соме нейрона в данный период диффервнцировки соответствовала активному состоянию центра организации микротрубочек (ЦОМТ), расположенному, как известно, в околоядерной зоне клетки. По данным цитофотометрического анализа количество тубулина в этой области равно примерно 30 условным единицам. Данные морфометрических измерений занесены в таблицу (для удобства и большей наглядности ввели коэффициент хЮО).

По мере созревания нейронов тубулин из тел клеток перемещался в отростки, причем в отдельных из них интенсивность окраски существенно различалась. Это, по-видимому, может быть следствием различной функциональной нагрузки этих отростков на определенном этапе развития или связано с временной зависимостью формирования отростков у одного нейрона. Впоследствии отростки постепенно наполнялись тубулином при одновременном снижении интенсивности реакции в соме. В поздние сроки культивирования (18 Д1У) продукты реакции в телах морфологически зрелых клеток обеспечивали лишь слабое диффузное окрашивание; и почти весь тубулин концентрировался в отростках.

Сочетанное использование пар моноклональных антител позволило проследить распределение различных элементов цитоскелета в одной клетке. Так, при окрашивании клеток парой анти-Тб + анти-Ак было выявлено, что интенсивность иммунофлуоресценции с анти-Тб значительно превышала таковую с анти-Ак. При использовании для окраски элементов культивируемого монослоя пары анти-Тб + анти-НФ выявлены интенсивные свечения сомы и отростков нейронов с анти-Тб и диффузное, относительно слабое свечение с анти-НФ, возможно, вследствии того, что для окраски были использованы моноклональные антитела лишь к одному из трех основных белков нейрофиламентов. Более высокая концентрация анти-НФ наблюдалась в сомах нейронов, преимущественно в области отхокдения отростков и в их проксимальных участках. Реакция на актин в нервной клетке очень слабая: имеются лишь множественные ярко-опетящиеся локусы на протяжении нейронных отростков,

соответствующие, вероятно, фокальным контактам.

В диссоциированных культурах спинного мозга мышиных эмбрионов помимо нейронов находились другие типы клеток, без которых невозможно выживание и нормальное развитие нейронов in vitro . Это клетки нейроглии, фибробласты, эндотелий.

Фибробласты и протоплазматические астроциты - крупные клетки, которые хорошо распластываются по субстрату, поэтому в них удалось увидеть распределение отдельных фибрилл цитоскелета. МТ в этих клетках организованы следующим образом: самое интенсивное свечение при окраске клеток анти-Тб наблюдается в околоядерной зоне, где находится ЦОМТ. От перинуклеарного пространства радиально в сторону плазматической мембраны отходят единичные МТ, которые вблизи мембраны изгибаются и следуют параллельно поверхности клетки. В местах отхозде-ния отростков МТ собираются в пучки.

При иммуноцитохимическом окрашивании клеток моноклональными антителами к актину было показано, что структура актиновой сети у различных клеток подложки неодинакова. В теле фибробласта - единичные или в составе параллельных пучков филаменты пронизывали клетку по большой оси; в астроцитарной глии пучки филаментов пересекали цитоплазму клетки в различных направлениях, основная масса которых проходила через клеточный центр. В отростках интенсивная иммунофлуоресценция на актин наблюдалась под плазматической мембраной конуса роста, в местах, где образуются филоподии, способные быстро вытягиваться и втягиваться. В эндотелии основная масса актина расположена под мембраной, в центре клетки имеется лишь слабая диффузная окраска.

Интенсивная иммунофлуоресцентная реакция на кислый фибриллярный белок глии, позволяющая выявить распределение промежуточных филаментов в астроцитарной глии, обнаруживается в основном под мембраной и в местах отховдения отростков.

Изучение ультраструктурных характеристик патологических изменений культивируемых меток спинного мозга и спинальных ганглиев после воздействия веществ, специфически разрушающих МТ и

Одной из задач настоящего исследования было изучение особенностей взаимодействия элементов цитоскелета культивируемых клеток спинного мозга и спинальных ганглиев и компонентов их плазмолеимы. Проводили детальный анализ состояния элементов цитоскелета и других органелл клетки при различных режимах воздействия колхицина и цитохалазииа. On-

Таблица. Относительное содержание цитоскелетного белка в клетке ( М - м; в условных единицах).

Выявление тубулина.

область клетки тип клетки тело околоядерная область примембранная область проксимальный участок отростка дистальный участок отростка

Нейрон 6 Д1У (п=12) 19*1,4 30*1,6 н/о 6,75*1,0 __

10 Д1У (п=8) 24*1,4 28*1,5 28*1,5 39,6*10,1 44*10,2

18 Д1У (п=6) 7*Ь,58 13*0,7 н/о 35*4,80 63*8,2

Глиалнная клетка (п=15) 19*1,3 23*1,5 10*0,8 40*2,1 -

Выявление актина.

область клетки тело тип клетки околоядерная область отросток скопления на отростке конус роста места от- хождения филоподий

Нейрон (п=10) 14,9*1,1 14,9*1,1 15*1,1 44*2,0

Глия (п=7) 18,5*1,2 23*1,3 38*3,5 - 110*12 248*15

Фибробласт_ 39*2,3 н/о н/о

9*1 ,0 н/о примембранная область - 26*2,2

(п=8) Эндотелий

(п=8)

Выявление белка нейрофиланентов (п=Ю)

сома нейрона проксимальный уч.отр. дистальный уч. отр.

20 * .1,3 33 * 1,6 14,3 * 1,2

н/о - не определяли;

"-" - отсутствует

тимальньш состоянием клетки для решения настоящей задачи исследования, как мы полагали, было такое, когда при нарушении целостности микротрубочек и микрофиламентов поверхностная мембрана оставалась пригодной для цитохимических и электрофизиологических исследований.

При 30 минутной экспозиции клеток с колхицином на соме нервных клеток (12 дней ¡n vitro ) появлялись небольшие выпячивания, отмечалось повышенное содержание филаментов. Однако часть МТ сохранялась в нормальном состоянии.

При инкубации клеток в течении I часа в растворе колхицина нейроны (12 Д1У) претерпевали необратимые изменения, а именно: внутриклеточные органеллы практически полностью разрушались. Наблюдали деструкцию мигоховдрий, что проявлялось в повышении их электронной плотности, изменении формы (они становились круглыми), нарушении крист. Отмечалась дезинтеграция цитоплазмагического матрикса, рибосомы собирались в комки, наблюдались локальные просветления цитоплазмы. В глиальных клетках после часового воздействия колхицнна выявлялись в больших количествах сохраненные МТ. Особенностью ультраструктуры глиальных клеток при таком режиме воздействия было появление множества зрелых и формирующихся контактов десмосомального типа либо между прилегающими клетками, либо между близко подходящими мембранами одной клетки.

Оптимальным временем инкубации оказалась 40 минутная экспозиция, поскольку МТ в нейронах были полностью разрушены, но нейроны сохраняли жизнеспособность. При данном режиме обработки (15 Д1У,Ю мМ колхицина, 40 мин.) были выявлены некоторые патологические изменения морфологии нейрона, которые выражались в появлении различного рода новообразований и изменении структуры некоторых органелл.

Как правило, первичное воздействие колхицина проявлялось на МТ, расположенных в соме нервной клетки, тогда как в отростках сохраня- . лись единичные полимеризованные МТ. При действии колхицина общей реакцией клетки было формирование новых конусов роста на покоящихся местах сомы и нейритов. Количество таких конусов превышало таковое в контрольных образцах. Наряду с этим, в цитоплазме клетки появлялось множество вакуолей. После воздействия колхицина на соме нервной клетки появлялись многочисленные выросты различных размеров. При значительных увеличениях электронного микроскопа можно было видеть, что выросты заполнены филаментозным материалом.

В некоторых случаях (у 5 Д1У нейронов) имели место изменения структуры митохондрий: они становились электронношютными, нвблю.ца-

лась их вакуолизация, деструкция крист. В соме нейронов появлялись амилоидные тельца, агрегаты аморфного электронноплотного цитоплаз-матического материала, многослойные мембранные неоформленные структуры. При инкубации, клеток с колхицином как в соме нейрона,' так и в его отростках отмечали скопление большого количества филаментов, которые располагались либо неупорядоченно: одиночные волонна густо разбросанные по цитоплазме нейрона, либо образовывали пучки, составленные из одиночных прямых волокон или (реже) спирально изогнутых.

При инкубации культивируемых нервных клеток спинного мозга мышиных эмбрионов с колхицином мы наблюдали в цитоплазме нейронов (в единичных случаях в глиальных клетках) появления пучков или клубков, состоящих из спирально закрученных парных филаментов. Образование таких филаментозных скоплений и других аномальных структур, типа аморфных агрегатов белка -амилоида, выявленных нами, сходно с появлением ней-рофибриллярных клубков при болезни Альцгеймера. .

При влиянии цитохалазина (ВДмМ, 12 час.) на клетки 5 дневной культуры эмбрионального спинного мозга в цитоплазме нервных и (иногда) глиальных клеток появлялись клубки, образованные одиночными, закрученными петлями волокнами 7-10 нм в диаметре. Некоторые клубки были построены из концентрически расположенных колец. Под влиянием цитохалазина происходила агрегация актина с формированием больших эвдоплаэматических масс. В теле нейрона увеличивалось количество лизосом. Митохондрии оставались светлыми с неповрежденными кристами; в хорошем состоянии находились стопки цистерен аппарата Гольджи, а танже отдельные элементы цитоскелета - микротрубочки и промежуточные филаменты.

При обработке 12 дневной культуры цитохалазином (20 мМ, 20 час.) и 21 дневной культуры (20 мМ, 24 час.) наблюдали аналогичные изменения структуры клеток, появлялись также многочисленные арборизации, выросты цитоплазмы; под плазматической мембраной (параллельно поверхности клетки) располагались пучки филаментов. В соме клетки клубки с концентрически расположенными волокнами собирались в мультиструктурные агрегаты. При инкубировании клеток с цитохалазином имел место последующий рост нейритов с образованием конусов роста и многочисленными МТ и НФ вдоль отростка. В конусе роста после цитохалаэиновой обработки пучки МТ и НФ оканчивались проксимально относительно кончика нейрита (как и в интак-тных отростках). Однако микрофилаыентная решетка, которая в необработанных цитохалазином нейронах определяет границы конуса роста и заполня-етего выпячивания -филоподии- отсутствовала в клетках, растущих с

цитохалазином, в этом месте наблюдался неясный гранулярный матрикс, заключающий в себе гетерогенное скопление везикул.

В нервных клетках, развивающихся 21 день ¡n vitro можно было наблюдать формирование миелиновой оболочки вокруг аксонов.

Электронноцитохимическое выявление распределения гликоконыо-гатов поверхностной мембраны культивируемых клеток после разрушения их цитоскелета.

Анализировали распределение комплексов wga—alM hpl— au , соответствующих определенным углеводным детерминантам, на различных участках клетки (сома, отросток) и в разные сроки культивирования после избирательного разрушения элементов цитоскелета.

Данные морфометрического анализа выявляют интересные особенности свойств поверхности мембраны культивируемых клеток после разрушения МТ и Ш, которые сложно выявить при визуальном анализе препаратов. Одной из таких особенностей является неодинаковое распределение гликоконьюгатов на поверхности различных участков нейрона - отростках и соме. Количество wga-au коныогатов на соме 5-ти и 15-ти дневных нейронов после разрушения МТ больше, по сравнению с отростком. Эта разница более значительна на 15-е сутки культивирования. Однако характер расположения гранул на соме и отростках одинаковый - кластерный. Более резкими, по сравнению с нормой, являются изменения в распределении гликоконьюгатов после разрушения Ш. Расположение гранул на соме 5-ти и 15-ти суточных нейронов остается кластерным, однако размеры кластера у клеток 5 Д1У с разрушенными МФ в 2,5 - 3 раза больше, по сравнению с размерами кластера у таких же 5 Д1У клеток после разруше -ния их микротрубочек. У 15-ти суточных клеток с разрушенными МТ или МФ размеры кластеров и плотность гранул на участке в 100 нм примерно одинаковые.

Интересным представляется тот факт, что кластерный характер распределения гликоконьюгатов на отростках 5-ти и 15-ти суточных нейронов, который характерен для интактных клеток и для тех же клеток после обработки колхицином, при разрушении микрофиламентов меняется. Расположение wGA-Au коньюгатов становится равномерным и упорядоченным на отростках 5-ти дневных клеток или в виде редких единичных гра нул у 15-ти Д1У клеток. Такие данные свидетельствуют о более актив-

ной рапи микрофиламентов, по сравнению с микротрубочками, в перемещении и сгруппировании в определенном месте на мембране отростка комплексов с м-Ас-о-а1с углеводной детерминантой. Причем степень участия элементов цитоскелета в процессе латеральной подвижности компонентов мембраны различна в разных отделах клетки и на разных стадиях развития.

Плотность распределения нрь-Аи коныогатов на соме нейрона в 12-ти суточных культурах после разрушения элементов цитоскелета несколько меньше, чем на отростках; т.е. расстояние между группами гранул на ссме незначительно больше, чем на отростках. Если сравнивать распределение гранул нрь-ли на соме и отростках нервной клетки в норме и при разрушении МТ или МФ, обращает на себя внимание тот факт, что при влиянии колхицина и цитохалазина интервал между группами гранул на соме значительно уменьшается. На отростках изменение значения этого параметра не однозначно: при разрушении МТ. расстояние между нрь--аи коньюгатами уменьшалось по сравнению с нормой, а при разрушении мф - увеличивалось. Таким образом, можно предположить, что Ш проявляют сократительную активность, а МГ служат для них опорой и осуществляют некоторое натяжение (растяжение) актиновых филаментов.

При сравнительном анализе распределения wga.au коныогатов на соме 5-ти и 15-ти дневных нервных и глиальных клеток после разруше-нияния элементов цитоскелета было установлено, что при таком же кластерном характере распределения гранул на соме обоих типов клеток интервалы между кластерами и количество гранул в них у нейронов были, как правило, больше, по сравнению с глией. На отростках глиальных клеток расстояния между группами гранул были примерно в 2,5 раза больше, чем на соме.

Количество гранул нрь-аы в группах на поверхности сомы и отростков нервных клеток, а также плотность распределения метки была значительно ниже, по сравнению с глиальными клетками. Это свидетельствует о более низком содержании адгезивных и-Ас-паа! остатков на поверхности мембраны нервной клетки. В то же время было выявлено, что при разрушении элементов цитоскелета наблюдалось увеличение плотности метки на мембране нейронов, по сравнению с нормой, Плотность гранул нрь-Аи увеличивалась и на соме и на отростке. Плотность wga.au на соме 5-ти дневных клеток в три раза увеличивалась, а на мембране от-росткч примерно в два раза снижалась после разрушения цитоскелета. Можно предположить, что насть детерминант перемещалась на сому.

Математически смоделированная "типичная" латеральная топография меченного золотом лектина у^ал на плазмолемме культивируемых нейронов спинного мозга после разрушения МТ (колхицин) или МФ (цито-халазин).

1000

}1000

SÙO 1000

membrane abscissa, шп

SÙO 1000

membrane abscissa, шп

5 дней in vitro , колхицин;

15 дней in vitro ,колхицин;

I I I I I I I I I I Г I I I I I I

600 1000 membrane abscissa, nm

g 1000

a

4 750 (0

I : Ï 600

0

5

t 250

1

I a

... к» ' * f- Л1* .0,

• y.-i '

600 ■1000 membrane abscissa, nm

5 дней in vitro ,цитохалазин;

15 дней in vitro ,цитохалазин.

- м -

обсуждение результатов;

В настоящее время имеется ряд данных, полученных на различных типах клеток о том, что клеточное узнавание и формирование специфических контактов или многоклеточных связей опосредуется активностью клеточной мембраны и связанных с ней компонентов. Такими компонентами являются поверхностные рецепторы, внутримембранные частицы и цитоскелетные структуры, - микротрубочки и микрофиламенты ( Ahuja к.к

1965; Chaver, Anderson, 1985 ). В ДВННОЙ работе МЫ ИЗуЧЭЛИ распределение цитоскелетных элементов в культивируемых клетках спинного мозга на различных этапах их дифференцировки, анализировали количественное соотношение цитоскелетных белков в различных отделах одной клетки и исследовали функциональную связь различных фибриллярных структур с компонентами поверхностной мембраны нервных и глиальных клеток.

Для анализа пространственной организации элементов цитоскелета в целой клетке, а также для определения белкового состава филаментов был использован иммунофдюоресцектный метод с использованием монокло-нальных антител к основным белкам цитоскелета: тубулину (МТ), актину (МФ), 160 кД белку нейрофиламентов и кислому фибриллярному белку глии.

Распределение интенсивности окраски тубулина в соме малодиффе-ренцированных нейронов, установленное в наших исследованиях, совпадает с таковым в клетках нейробластомы (isenberg etat 1979 ), что, вероятно, может отражать одинаковое соотношение полимеризованных и деполимеризованных форм этого цитоскелетного белка в незрелом нейроне и клетке нейробластомы. Этот период развития нервной клетки, по-видимому, характеризуется синтезом тубулина и активным состоянием ЦОМТ. В более поздние сроки культивирования в соме имелась лишь слабая диффузная окраска, почти весь тубулин концент[ .фовался в отростках (см. табл.). Наблюдаемое явление согласуется с результатами измерения обьема недифференцированных и дифференцированных клеток нейробластомы и определения в них равновесной концентрации полимеризованных И деполимериз О ванных субьединиц тубулина ( Olmsted etaL, 1984 ). В цитируемой работе было показано, что, несмотря на возможность небольшого прироста количества тубулина за счет вновь синтезируемого, общее его количество в течение жизни клетки (в обеих формах - полимери-зованной и мономерной) остается примерно одинаковым. В пользу этого

предположения свидетельствуют данные работы Pearson et al„ (1988), которые изучали динамику уровней мРНК тубулина в нейронах ствола мозга крыс после перерезки нервов. У контрольных животных уровень экспрессии гена тубулина был слабым; после отсечения нерва наблюдалось значительное увеличение уровня мРНК тубулина, сопровождавшее весь процесс регенерации нервных отростков.

В процессе перемещения тубулина из сомы в отростки можно было наблюдать, что разные отростки в процессе дифференцироыси имели неодинаковое количество тубулина, что, видимо, является следствием различной функциональной нагрузки отростков на определенном этапе развития. Аналогичная гетерогенность распределения тубулина описана для аксонов функционально различных нейронов центральной и вегетативной нервной системы в начальный период их дифференцировки. Показано, что растущие аксоны нейронов спинного мозга и сетчатки отличабтся значительно большим количеством МТ, имеющих особую организацию, по сравнению с нервными клетками симпатических и спинно-мозговых ганглиев, а также клеток клона NO 108-15 ( Tsui et ed., 1984 ).

При сравнении интенсивности иммунофлуоресцентной реакции на актин в нервных и ненервных клетках (фибробласты, протоплазматические астроциты) растущего монослоя, оказалось, что содержание актина в нейронах намного ниже, чем в ненервных элементах; это и обуславливает по всей вероятности, более высокую подвижность последних.

Слабая иммунофлуоресцентиая окраска нейронов с анти-НФ связана, очевидно, с тем, что мы использовали моноклональные антитела лишь к одному из трех основных белков нейрофилашнтов. Полученные данные позволяют нам судить о распределении ® в клетке, поскольку известно ( Shaw, Weber, 1981), что распределение этих белков идентично, т.е. все три полипептида входят в состав каждого отдельного нейрофиламента. Более высокую концентрацию анти-НФ мы наблюдали в соме и проксимальных участках отростков нервных клеток. В связи с вышеизлиженным интересны результаты биохимических исследований Moris and Lasek (1982), КОторые изучали равновесие между г.олимеризованными и мономерными формами различных тинов фибриллярных структур в аксоплазме кальмара. В своих опытах они показали, что более 95% белка ® сохраняется в полимерной форме, в отличие от актина и тубулина, у которых в такой форме находятся 27% и 15%, соответственно. Таким образом, в развивающейся нервной ткани, когда изменяется степень пластичности, и - молодых растущих отделах нейрона -отростках- преобладают более лабильные элеме-

•- Ь -

нты цитоскелета, т.е. микротрубочки и микрофиламенты.

Исследование взаимодействия компонентов поверхностной мембраны с элементами цитоскелета проводили путем разрушения последних. Для этой цели использовали вещества, специфически разрушающие МТ (колхицин) или Ш> (цитохалазин). Колхицин - высокотоксичное вещество, помимо первичной реакции - деполимеризации МТ, при более длительном приложении действует на все системы клетки, вызывая впоследствии гибель нейрона. Для культивируемых нейронов спинного мозга таким временем была часовая инкубация клеток в среде с колхицином (10 мМ), после чего изменения вызванные колхицином были необратимыми. Интересно, что ненервные клетки (фибробласты, астроциты) при тех же режимах обработки колхицином оставались практически без изменений, более того, в них наблюдали сохраненные МГ. Вопрос о таких различиях реакции нервных и глиальных клеток на действие колхицина остается неясным. Либо это связано с различными типами МТ в этих клетках, либо мембрана глиальных клеток менее проницаема для колхицина.

При 30-ти минутной экспозиции клеток с колхицином мы наблюдали, что часть МТ в отростках нейронов сохранялась в полимеризованном состоянии, после 40 минутного воздействия колхицина видны были лишь единичные МТ. Вероятно эти МТ относятся к классу стабильных МТ. Donoso (1986) предположил, что различия в стабильности могут быть следствием изменений или различий в аксоплазматических компонентах, которые прямо или косвенно участвуют в поддержании структурной целостности или стабильности МТ. Несколько иначе объясняют наличие лабильных и устойчивых к действию антимитотических веществ МТ в цитоплазме клеток ЗТЗ (линия фибробластов) ,Hela, PtK 2 ( Piperno et al. (1987). Авторы обнаружили, что в состав стабильных МТ входит ацетилированный сС—тубулин. Возможно, наблюдаемые нами после влияния колхицина МТ в отростках нейронов также являются ацетилированными по -тубулину.

Представляет интерес вопрос о механизме возникновения новых структур и вакуолей в ответ на действие колхицина. Некоторые авторы считают, что увеличенное количество вакуолей в клетке, наблюдаемое при некоторых патологических воздействиях, а также при старении, образуется за счет эндоплазматического ретикулума и связывают этот феномен с нарушением синтеза белка (Квитницкая-Рыжова, 1989). Однако мы склонны считать, что новообразованные везикулы появляются за счет раздувания и фрагментации цистерен аппарата Гольджи. В пользу этого свидетельствуют некоторые факты. Известно, что в норме 60-180 ны пузыри

происходят в результате отпочковывания от аппарата Гольджи и сливаются после аксонного транспорта с плазмолеммой конуса роста (shea, Sapirstein , 1988). Кроме того МТ в интактных клетках связаны при помощи ЕСМ (НО кД) с цистернами аппарата Гольджи, где происходит накопление и сортировка белков, которые затем транспортируются ПО СИСТеме МТ К раЗЛИЧНЫМ ОТДОЛаМ КЛеТКИ ( Allan , Kreis, 1986). Возможно, информационные сигналы о том, сколько транспортировать везикул, передаются к аппарату Гольджи также ио системе МГ (Фултон, 1986). При деполимеризации МГ начинается беспорядочное отщепление вакуолей, которые заполняют цитоплазму клетки или скапливаются у поверхностной мембраны, образуя конусы роста. Известно, что колхицин вызывает ретракцию отростков ( Joshi et ai., 1985). Появление новых конусов роста можно также считать регенеративной функцией клетки: разрушение уже существующих отростков стимулирует образование новых. Ростом отростков могут также управлять локальные изменения адгезквности к субстрату, связанные с перераспределением гликоконьюгатов ( огалактозные остатки, NAcDG-ai ), отвечающих за адгезивность после воздействия колхицина и цитохалазина. Мы полагав ем, что наблюдаемое нами увеличение количества филаментов в ответ на разрушение МТ можно считать компенсаторной функцией клетки, свидетельствующей о том, что элементы цитоскелета являются тесно взаимосвязанными и взаимозависимыми компонентами одной системы: недостаток одних элементов цитоскелета компенсируется повышенным содержанием ДРУГИХ. В ПОЛЬЗУ ЭТОГО ПреДПОЛОЖеНИЯ свидетельствуют ДаННЫе Hoffman et ai(1987) о том, что при подавлении экспрессии гена нейрофи-ламентов уровень тубулиновой и актиновой мРНК в несколько раз увенчивался. В наших экспериментах при деполимеризации МТ уровень свободного тубулина в несколько раз возростает, а это, как известно (Фултон, 1987; oimsted et ai., 1984), может служить сигналом, подавляющим активность его гена. Возможно, что подавление экспрессии гена тубулина также сопровождается повышением активности генов нейро-филаментов и актина.

При инкубации культивируемых нервных клеток спинного мозга мышиных эмбрионов с колхицином мы наблюдали появление в цитоплазме нейронов пучков или клубков, состоящих из двух волокон, спирально закрученных одно вокруг другого, аморфных агрегатов белка - амилоида, миелоидных телец и др. Образование таких филаментозных скоплений и других аномальных структур типа аморфных агрегатов белка-амилоида,

выявленных нами, сходно с появлением нейрофибриллярных клубков при болезни Альцгеймера. Поскольку морфологическая картина патологических изменений нервных клеток под влиянием определенных доз колхицин1» и при болезни Альцгеймера аналогична, это дает возмож:-: ность предположить определенное сходство механизмов, лежащих в основе указанных патологий и использовать такие культуры в качестве моделей для изучения заболевания.

Химический состав поверхностной мембраны в определенные периоды жизни клетки может меняться как за счет внедрения новых компонентов, так и за счет встраивания определенных мембранных участков, которые затем либо деградируют, либо участвуют в меточном обмене (Moscona, 1974). Показано, что изменение свойств нейрона-льной плазматической мембраны может приводить к изменению поведения клеток при их взаимодействии ( Edelman , 1976). Оказалось, что поверхностные свойства нейрональных мембран формируются, в основном, терминальными углеводными остатками гликолипидов и гликопро-тепнов ( Barondes, 1970). Предполагают, что элементы цитоскелета-МТ и МФ - взаимодействуют с определенными мембранными гликопроте-идами, регулируя подвижность последних и определенное местоположение на мембране. Характер взаимодействия компонентов мембраны с цитоскелетом может изменяться в процессе развития (Prives et al, 1982 ),

Взаимосвязь МТ иМФ с компонентами поверхностной мембрани исследовалась на различных типах клеток - лимфоцитах, трансформированных клеточных линиях. На примере такого явления как кеппинг, было установлено, что при разрушении элементов цитоскелета кепы, образованные мембранными гликокомплексами на одном из полюсов клетки или в виде нескольких агрегатов, распадаются. Составляющие эти кепы молекулы равномерно распределяются по всей поверхности клетки. Считают, что для латерального перемещения белков в липидном бислое мембраны необходимо их прямое взаимодействие с МФ, причем микрофиламе-нты проявляют сократительную активность, а МТ служат для них опорой

( De Pétris, 1975; Nicolson ,1976 ; ФуЛТОН, 1987).

В наших экспериментах после разрушения цитоскелета ожидаемого равномерного перераспределения метки на мембране не произошло. В нервных клетках процесс взаимодействия элементов цитоскелета с компонентами поверхностной мембраны более сложный и неоднозначный. Кроме того, пошшо перераспределения метки на мембране, наблюдалось такта увеличение плотности гранул, по сравнению с нормой (Скибо с соав. 1988), свидетельствующее о появлении новых углеводных детерминант

на поверхности мембраны. За счет чего появляются дополнительные детерминанты, неизвестно. Возможно, что в результате разрушения элементов цитоскелета нарушаются упорядоченные процессы эндо- и экзоцитоза, в осуществлении 'которых, как известно, принимают участие МФ и МТ. После деполимеризации как МТ, по которым везикулы направлено движутся к поверхностной мембране или от нее вглубь клетки, так и Ш>, которые участвуют в образовании инвагинаций мембраны, происходит беспорядочное колебание мембраны с одной стороны (наблюдаемые нами выпячивания тела клетки, см.гл.4) и неупорядоченное стихийное сливание вакуолей с мембраной с другой стороны (экзоцитоз).• Можно предположить, что в результате этих процессов "резервные" мембраны с углеводны«! детерминантами, которые направлялись по системе МТ к растущему отростку или , в случае надобности, встраивались в соме, начинают стихийно встраиваться в мембрану, увеличивая тем самым плотность метки (инкубацию с леКтинои осуществляли после обработки колхицином и цитохалазином). Таким образом, можно предположить, что элементы цитоскелета выполняют также регуляторную функцию, удерживая у поверхности- мембраны резервные углеводные детерминанты и, в случае необходимости,(после получения сигнала) способствуют их встраиванию в мембрану.

При исследовании перераспределения гранул нрь на мембране нейронов после разрушения МТ и МФ было выявлено, что и на соме и на отростках плотность метки возросла-, по сравнению с нормой (Скибо,1988). Возможно, это связано с теми же бесконтрольными, произвольными Экзо-и эндоцитозами, в результата чего в мембрану встраиваются новые углеводные детерминанты. Увеличившее количество NAcDGai остатков, отвечающих за адгезивные свойства клеиш в сочетании с разрушением цитоскелета приводит к тому, что нейронн сильнее, по сравнению с нормой, распластываются по подложке.

Плотность распределения wga-au коньюгатов на соме также увеличилась. Однако, в данном случае, помимо возможного встраивания углеводных детерминант в мембрану происходит перераспределение гранул.с образованием более крупных кластеров (расстояние между кластерами несколько увеличивается). Учитывая данные Horst et «а., (I98v), исследовавших связь wga коньюгатов с МТ на ресничках фоторецепторов после удаления липидного бислоя Тритоном-Х-100, можно предположить, что большинство связанных \уоАГликоконыогатов имеют молекулярную массу примерно 600 кД, нечувствительны к предварительной обработке нейраминидазой и представляют собой гликопротеин. Авторы считают,

что этот гликоконьюгат можно соотнести с преобладающим связанным компонентом, видимым в цитохимических опытах (но^ с^а1, 1987). Возможно, в результате разрыва связи элементов цитоскелета с гликопротеином мембраны, последние свободно плавают в липидном би-слое мембраны и при "сталкивании" могут "слипаться", образуя более крупные кластеры.

0 связи элементов цитоскелета с компонентами поверхностной мембраны и о возможной роли фибриллярных структур в поддержании электрической активности поверхностной мембраны могут свидетельствовать данные, полученные в работе Мартынюк, Березовская (1990). Показано, что разрушение микротубулярной системы нейрона в ходе внутриклеточной перфузии колхицин-содержащим раствором сопровождается подавлением потенциалозависимого входящего высокопорогового кальциевого тока в плазматической мембране нейронов спинальных ганглиев мышиных эмбрионов.

ВЫВОДЫ

1. С помощью набора моноклональных антител к цитоскелетным белкам показано распределение тубулина, актина и белка нейрофиламентов в различных участках нейронов спинного мозга мышиных эмбрионов, растущих в монослсэ. Проведен количественный анализ содержания этих белков в клетках и показано различие цитоархитектоники фибриллярных структур нейронов и сопутствующих дифференцировке нейронов клеток глии и фг'бробластов.

2. В процессе дифференцировки происходит перераспределение тубулина из сомы нейрона в отростки с преимущественной локализацией в некоторых из них, возможно, функционально наиболее активных на определенном этапе развития.

3. Содержание актина в нейроне низкое, по сражению с глиальны-ми клетками, что связано с низкой мигрирующей способностью нервных клеток. Показано, что в культивируемых нейронах скопления актина локализуются не только в дистальных участках растущих нейритов, но и на протяжении отростков в области фокальных контактов между нейритами и подстилающим субстратом.

4. Распределение белка нейрофиламентов ограничено сомой и проксимальными участками нейритов. В развивающихся клетках, а также в молодых, растущих отделах нейрона -отростках- преобладают более ла-

бильные полимеры цитоскелета, т.е.микротрубочки и микрофиламенты.

5. При инкубировании культивируемых клеток спинного мозга с колхицином и цитохалазином — веществами избирательно разрушающими микротрубочки и микрофиламенты, соответственно, была выявлена раз-личныя чувствительность к этим агентам нервных и глиальных клеток. Отмечена большая резистентность глии к экспериментальным воздействиям. Нейроны на различных стадиях развития по-разному реагировали на воздействие: молодые, малодифференцированные клетки были более подвержены разрушениям, по сравнению с 15-20 дневными нейронами, развивающимися в культуре, у которых наблюдались уже сформированные синаптические контакты.

6. Морфометрический анализ данных о распределении углеводных детерминант поверхностной мембраны культивируемых клеток спинно;о мозга при разрушении различных элементов цитоскелета позволил установить, что микротрубочки и микрофиламенты играют активную роль в латеральной подвижности и ассиметричном распределений гликоконьюга-тов поверхностной мембраны нервных и глиальных клеток.

7. Показано, что элементы цитоскелета регулируют встраивание углеводных детерминант в поверхностную мембрану клетки. Степень участия микротрубочек и микрофиламентов в- этих процессах неодинакова в различных отделах клетки (сома, отросток) и на разных стадиях развития.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Скибо Г.Г.jБерезовская О.Л. Цитоскелет нервных клеток в процессе их дифференцировки. //Нейрофизиология.-1987.-т.19,№4.-С.558-567.

2. Березовская О.Л.,Скибо Г.Г.,Коваль Л.М. Изучение цитоскелетных элементов культивируемых клеток спинного мозга мышиных эмбрионов// 1У Всесоюзная конференция по патологии клетки.-1987.- Москва.-Тезисы докладов.- С.143

3. Скибо Г.Г..Березовская О.Л.,Коваль Л.М. ИммуноЦитохимическое исследование распределения цитоскелетных белков в нейронах спинного мозга.//Нейрофизиология.- 1988.- т.20,№ 5.- С. 618-623.

4. nerezovskaya О., Skibo G., Koval L. Dynamics of cytoskeleton elencnts of nerve cells developing in monolayer.//Proc. 4-th international Confirm nf Cell Bioloay, Canada.- 198a.- P.268.

5. Березовская О.Л., Скибо Г.Г., Коваль Л.М. Ультраструктурная патология культивируемых клеток нервной ткани при экспериментальном разрушении их цитоскелета //В сб."Ультраструктурные основы патологии органов и тканей".- Тбилиси.-1989.- С.34

6. Березовская О.Л.,Скибо Г.Г., Савина С.В. Ультраструктура культивируемых нейронов при разрушении их цитоскелета.//В сб."Применение электронной микроскопии в медицине".- Ивано-Франковск.- 1989.-С. 10.

7. Beresovskaya О., Skibo G.e Rusakov 1). The cytoskeleton-dependent topography of surface • membrane glycoconjugates of developing nerve cells.// 8-th ESN Meeting.- Leipzig 1990,- P. 59.