Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Закономерности изменений скелетных структур ядра и цитоплазмы при дифференцировке клеток in vitro

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Закономерности изменений скелетных структур ядра и цитоплазмы при дифференцировке клеток in vitro"

Р О С С И И С К А Я А К А Д Е М И Я НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ Институт цитологии и генетики

АЛЕКСАНДР ЮЛЬЕВИЧ

ЗАКОНОМЕРНОСТИ ИЭШЖНИИ СКЕЛЕТНЫХ СТРУКТУР ЯДРА И ЦИТОПЛАЗМЫ ПРИ ДИФФЕРЕНЦИРОВКЕ КЛЕТОК' IH VITRO

Клеточная биология - 03.00.25

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

на правах рукописи УЖ 576.311.32:578.340.32/33

К Е Р К И С

Новосибирск 1992

Работа заполнена в Институте цитологии я генетики СО РАН г.Новосибирск-

доктор биологических наук, Богданов Юрий Федорович Институт обшей генетики РАН, г.Москва

доктор биологических наук, Каракин Евгений Иннокентьевич Институт цитологии и генетики СО РАН, г.Новосибирск

доктор биологических наук, Мертвецов Николай Павлович Институт биоорганической химии СО РАН, г.Новосибирск

Институт биологии развития Н.К. Кольцова РАН, г. Москва

___ 1992 г. на С^Щ^^^А

заседании специализированного совета по защите диссертаций на . соискание ученой степени доктора наук (Д-002.11.01) при Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г.НоЕосибирск-ЭО, проспект академика Лаврентьева, 10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН

Диссертация в форме научного доклада разослана 1992 года.

Ученый секретарь Специализированного совета | доктор биологических наук А.Д.Груздев

Официальные оппоненты :

Ведущее учреждение:

Защита состоится "Х/Г "

Общая характеристика работы

Акт2альность_темы^

В настоящее время очевидно, что все основные этапы клеточной дифференцировки - от транскрипции до экспрессии тканеспецифических признаков, определякщих фенотип клетки, -осуществляются через цепь сложных структурных межклеточных и внутриклеточных взаимодействий (Schiwa, 1986; Porter, 1987). Как показали молекулярно-цитологические исследования последних лет, структурами, интегрирующими большинство внутриклеточных и многие межклеточные процессы, являются цитоскелет (или цитоматрикс) и ядерный матрикс (Porter, Tucker, 1981! Поглазов,_ 1983; Pollard, 1984; Clarke, 1984:). Сложная система филаментов цитоскелата и ядерного матрикса, взаимодействуя с плазматической мембраной с одной стороны и ядерной оболочкой - с другой, обеспечивают динамическую пространственную гетерогенность цитоплазмы и ядра и компартментализащш метаболических процессов в клетке (Исаева, 1991 ),

Непрерывно растет количество данных о биохимии,молекулярной организации, .генетике скелетных структур клетки. Выделены и охарактеризованы многие структурные и регуляторные белки, интенсивно изучаются механизмы их функционального взаимодействия. В последние годы были проведены исследования организации цитоске-лета на клеточном уровне у разных типов клеток и при различных воздействиях, приводящих к злокачественной трансформации (Васильев, Гельфанд, 1982; Дугина, 1989; Свиткина, 1990).

Однако, при всем обилии сведений о молекулярной организации и структуре элементов цитоскелета, практически отсутствуют данные о закономерностях реорганизации и роли отдельных (в частности, актиновых) компонентов цитоскелета в процессах цитодифференцировки. А это очень важно, поскольку именно динамическая перестройка цитоскелета обеспечивает пространственно-временную организацию общеметаболических" и специализированных биосинтетических процессов в цитоплазме в ходе дифференцировки клетки.

Для успешного решения вопроса о закономерностях реорганизации цитоскелета в ходе цитодифференцировки необходимы, по

крайней мере, два условия: адекватные методы исследования и сравнительно-цитологический подход с вовлечением в эксперименты возможно более широкого спектра типов клеток равных уровней дифференцировки и разных организмов. В настоящее время большинство успехов в исследовании субклеточных механизмов цитодифференцкровки связано с использованием клеток, сохранивших потенции к дифференцировке in vitro. В условиях культуры, когда клетки свободны от большинства контролирующих влияний организма, изменяя условия культивирования, можно экспериментально моделировать различные типы дифференцировки. В этом смысле миогенез in vitro является наиболее удобной и часто используемой исследователями моделью цитодифференцировки.

Известно, что большинство последовательных событий миогенеза могут происходить при полном подавлении транскрипционной активности ядра, а реализация программы миогенеза во многом регулируется цитоплазмой. Поэтому очевидно, какое огромное значение в , пространственно- упорядоченной организации событий миогенеза принадлежит цитоскелету. В процессе дифференцировки миобласта формируется миофибриллярный сократительный аппарат - стабильная, не подвергающаяся структурным изменениям система, тогда как цитоскелет немышечных юлеток представляет собой в высшей мере динамичную структуру. Сравнивая строение цитоскелетных структур мышечных и немышечных клеток, трудно объяснить различия в их структурной организации, поскольку их белковый состав практически одинаков. Ответить на этот вопрос можно только зная четкую локализацию основных белков и их перераспределение в ходе миогенеза. Поэтому очень важно получение экспериментальных фактов, объясняющих закономерности перестройки немышечного цитоскелета в сократительные мышечные структуры.

Другим важным аспектом изучения закономерностей пространственной организации скелетных структур в ходе дифференцировки является экспериментальное доказательство участия актинового цитоскелета в компартмент.рлизации метаболических процессов и поддержании функционально - обусловленной упоря-1 доченности цитоплазмы мышечных и немышечных клеток.

Важнейшую роль в пространственной организации экспрессии

тканеспецифических генов в диЗференцнровке играют структуры ядерного матрикса (Berezney, Cofiey, 1977; Hancock, 1982; Збарский, 1985). Показано, что передача регуляторных сигналов от плазматической мембраны к ядру может происходить за счет взаимодействия структурных компонентов цитоскелета и ядерного матрикса ■ посредством ядерной мембраны ( Penman et all, 1982; Bissel et all, 1982).

Гибриды соматических клеток могут стать новой, нетрадиционной моделью для изучения роли элементов ядерного матрикса в пространственной организации ядра. Внутри гибридного ядря, где сосуществуют хромосомы разных типов клеток (а часто и разных достаточно далеких видов) особо наглядно должна проявляться роль ядерного матрикса как скелетной структуры, обеспечивающей функциональную совместимость хромосом двух различных геномов. Естественно, что степень такой совместимости непосредственно влияет как на стабильность генома, так и на уровень экспрессии отдельных признаков родительских клеток. В этом смысле гибридные клетки можно рассматривать как некую модель цитодифференцировки, на которой, комбинируя известные функционально - морфологические признаки родительских клеток, можно изучать' экспрессию этих признаков в различных по хромосомному составу гибридных клонах и исследовать динамику изменений связанных с ними элементов ядерного матрикса.

Весь вышеописанный круг проблем и определил цели и задачи настоящей работы.

Цбль_и_задачи_исследования^ целью настоящего исследования было: I) на конкретных примерах с использованием современных методов получить экспериментальные подтверждения ведущей роли актиновых цитоскелетных структур в структуризации цитоплазмы и компартментализации основных метаболических процессов в клетке; 2) установить закономерности изменений отдельных элементов цитоскелета в ходе цитодифференцировки культуры клеток различного происхождения; 3) изучить структурные аспекты взаимодействия "чужеродных" геномов в ядрах гибридных клеток и исследовать влияние этих взаимодействий на экспрессию в гибридах определенных морфологических признаков родительских клеток.

Достижение поставленной цели потребовало выполнения трех

последовательных, тесно связанных между собой, задач:

1. Разработку комплекса универсальных методических приемов, необходимых для направленного электронно-микроскопического изучения предварительно выбранных клеток, что позволило бы совмещать световой и электронно-микроскопический уровни изучения клеток культуры ткани.

2. Изучение закономерностей проявления отдельных признаков цитодифференцировки клеток различного происхождения в условиях in vitro. Эта часть работы включала в себя:

а) исследование особенностей дифференцировки клеток первичной культуры хондробластов зачатка конечности куриного эмбриона:

б) изучение особенности дифференцировки спикулогенных клеток в однослойной культуре эмбриональных клеток морского ежа;

в) анализ динамики изменений цитоскелета в клетках культуры тератокарциномы при экспериментальной индукции дифференцировки:

г) выяснение роли актинового скелета мышечных и немышечных клеток в компартментализации некоторых общеметаболических процессов в цитоплазме;

д)сравнительный электронно-микроскопический анализ структурно-функциональной организации дифференцирующейся культуры миогенных клеток куриного эмбриона и клональной культуры миобластов крысы линии L-6 при экспериментальном изменении направления цитодифференцировки;

е)иммуно-фдюоресцентный и иммуно-электронномикроскопический анализ распределения ряда белков актинового цитоскелета в миобластах и исследование роли этих белков в экспрессии признаков мышечной дифференцировки миогенных клеток;

3. Исследование закономерностей экспрессии признаков морфофункциональной дифференцировки в клетках гибридных клонов различного происхождения, что включало в себя:

а) анализ динамики изменений ультраструктуры ядра и цитоплазмы в процессе образования гибридов соматических клеток;

б) изучение изменений структурной организации гибридных клонов различного происхождения в зависимости от хромосомного состава гибридного ядра;

в) определение особенностей субмикроскопической организации ядер клеток гибридных клонов.

Н§2Чная_новизна^

Разработан новый метод, позволявший совмещать световую авторадиографию и цитохимию с анализом ультраструктуры определенных клеток, находящихся на разных этапах дифференцировки.

Впервые продемонстрирована возможность широкого и обратимого изменения степени и направления дифференцировки миогенных клеток гтри изменении условий культивирования in vitro. При этом экпериментально показано, что в допускающих мышечную дифференцировку условиях элементы цитоскелета немышечного типа могут служить основой для сборки постепенно замещающего его опорно- сократительного аппарата дифференцированных мышечных клеток.

Методами световой и электронномикроскопической иммуноцито-химии с использованием моноклональных антител к белкам цитоскелета доказано, что степень упорядоченности пространственной организации сократительного аппарата дифференцирующегося миобласта связана с распределением в цитоплазме специфического бежа Z-ли-ний а -актинина, что свидетельствует о его участии в регуляции процесса миофибрилогенеза.

Впервые описана ультраструктура культивируемых in vitro дифференцирующихся спикулогенных клеток морского ежа. Показано, что спикулогенная клеточная культура может служить новой удобной моделью для изучения клеточной дифференцировки, маркером и конечным этапом которой является образование скелетных спикул. Степень экспрессии и пространственная упорядоченность спикулогенеза зависит от условий культивирования и коррелирует с развитием структур цитоскелета в цитоплазме клеток.

Показано, что переход из пролиферирукщего в дифференцированное состояние в хондробластах осуществляется за счет пространственно - временного разобщения специфических синтезов в цитоплазме, в котором, по-видимому, важную роль играют элементы актинового цитоскелета.

Впервые продемонстрировано, что цитоплазматический фермент глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа тесно ассоциируется с актиновыми микрофиламентами как мышечных, так и немышечных клеток, что говорит о его участии в компартментализиции процессов общеклето-

чного метаболизма.

Впервые проведено комплексное иммунофлюоресцентное и электронно-микроскопическое изучение культуры клеток терато-карциномы мши, моде лиру адих ранние стадии развития. При индукции цитодифференцировки морфогеном формирующиеся элементы актинового цитоскелета служат самыми ранними индикаторами ее начала, тогда как организованные структуры других элементов цитоскелета появляются позднее.

Таким образом, в настоящей работе с помощью разработанных методов на достаточно широком круге клеточных моделей проведено комплексное исследование цитоскелета, выявлены общие закономерности его изменений в процессе клеточной дифференцировки.

Впервые исследован процесс образования гибридной клетки и механизм формирования гибридного ядра, также осуществлено морфологическое и морфометрическое исследование ультраструктуры серии гибридных клонов различного происхождения.

Предложен новый метод получения гибридов соматических клеток, исключающий цитотоксический эффект сливаюцих агентов на клетки-партнеры.

В ядрах гибридных клонов обнаружены ранее не описанные структуры, представляющие собой глубокие инвагинации внутренней мембраны ядерной оболочки. Эти структуры, являясь элементами ядерного матрикса, возможно участвуют в пространственной организации хромосом в гибридном ядре, обеспечивая тем самым стабильность гибридного генома.

Пгактическо§_значение_. Разработанный метод предварительного выбора клеток увеличивает эффективность и точность электронной авторадиографии. Использованный в работе комплекс связанных между собой методов может быть применен в большинстве электронно-микроскопических исследований, поскольку он позволяет на одном и том ке объекте совмещать изучение на тканевом, клеточном и ультраструктурном уровнях, что весьма важно для решения многих сложных вопросов клеточной биологии. В настоящее время этот метод применяется в ряде лаборатрий Института цитологии и генетики, Новосибирском госуниверситете и Медицинском институте, Научно-исследвательском институте молекулярной биологии НПО "Вектор", Санкт-Петербургском госуниверситете, Институте

цитологии РАН. Полученные в работе результаты позволяют понять и изучать причины и клеточные и субклеточные структурные механизмы возникновения ряда мышечных патологий.

Новый метод получения гибридов соматических клеток позволяет изучить ранние этапы формирования гибридных клеток и оценить возможный уровень спонтанного образования генетически нестабильных клеток в организме человека при иммунологических конфликтах, связанных с переливанием крови.

Основные положения и выводы работы включены в прогрс.;.1у лекций и практических занятий по курсу "Клеточная биология" в Новосибирском Госуниверситете.

Апробация_работы Результаты работы докладывались на IX, X, XI, XII Всесоюзных конференциях по электронной микроскопии {1973, 1976, 1979 1 988 гг.); на У, УП, УП, Всесоюзных конференциях."Структура и функция клеточного ядра" (1975, 1980, 1984 гг.); на Всесоюзном симпозиуме "Методы подготовки слогных объектов и анализ электронно-оптических изображений" (Петрозаводск, 1976 г.); на III и У съездах ВОГИС (1977 и 1987 гг.); на Х1У Международном генетическом конгрессе (1988 г.); на У Всесоюзной конференции "Физиология и патология соединительной 1 ткани" (Новосибирск, 1980г.); на 5-ом Съезде по практической и экспериментальной медицине (Берлин, 1981г.); на III Всесоюзной конференции по патологии клетки (Москва, 1982г); на II Всесоюзной конференции по морской биологии (Владивосток, 1982 г.); на 7-м Всесоюзном совещании эмбриологов (Ленинград, 1986г); на Всесоюзной конференции по генетике соматических клеток (Звенигород, 1986г.); на Всесоюзном совещании "Биология клетки в культуре" (Ленинград, 1988г.); на 6-м и 9-м Европейских конгрессах по электронной микроскопии (Манчестер, 1972г. и Йорк, 1988г., Англия); на Международном симпозиуме "Молекулярная организация биологических структур" (Москва,1989г.); на П-ом Европейском совещании по ядру {Суздаль,1989г.); на 3-ем Балканском электронно-микроскопическом конгрессе (Афины, 1989 г..Греция.), на Всесоюзной конференции "Функциональная 1 морфология клетки" (Санкт- Петербург,1991), на Всесюзных конференциях по программе "Геном человека"

(Переславль-Залесский, 1990, 1991 гг.). Кроме того, результаты

диссертации обсуждались на межлабораторных семинарах И отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН.

' В качестве диссертации представляется совокупность около 50 печатных работ, опубликованных в центральных отечественных и зарубежных журналах и сборниках.

Все экспериментальные данные получены автором лично или при его непосредственном участии.

Отдельные этапы работы выполнялись в соавторстве с сотрудниками ряда лабораторий Института цитологии и генетики СО РАН, а также Института цитологии РАН, Института биологии моря ДВНЦ РАН и Анатомического института Университета Фридриха Шиллера, г.Йена, Германия. Фамилии соавторов, которым автор глубоко благодарен, указаны в списке публикаций по теме диссертации. В начале каждой главы в скобках перечислены порядковые номера статей, по материалам которых написана данная глава.

Материал и методики (I, 2, 3, 5, 8, 9. 17, 19, 26, 35) В работе использовались различные клеточные модели, характеристика которых дана в соответствующих главах настоящего реферата и публикациях. При проведении экспериментов мы в каждом случае старались использовать комплексный подход в исследованиях функциональной морфологии изучаемой клетки. Он включал в себя, с одной стороны, весь арсенал светомикроскопических методик: цитохимию, авторадиографию, иммунофлюоресцентный анализ с использованием разнообразных поли- и моноклональных антител (АТ) И комплекс современных электронномикроскопических методов (ЭМ) -с другой стороны: провечивапцую и сканирующую ЭМ, ЭМ цитохимию и иммуноцитохимию с применением АТ,.меченых коллоидным золотом, и заливкой в водорастворимые среды, ЭМ авторадиографию и морфометрический анализ. Мы применяли как стандартные методики, так и существенно модифицированные оригинальные разработки. Они подробно изложены в прилагаемых публикациях.

В основе такого комплексного подхода лежит разработанный автором метод предварительного прицельного выбора определенных

клеток для ЭМ анализа, который позволяет совмещать световую авторадиографию и цитохимию с изучением ультраструктуры определенных клеток, находящихся на разных стадиях дифференцировки. Абсолютно все эксперименты, описанные в настоящей работе, были выполнены с использованием этого метода, что позволило существенно повысить достоверность и воспроизводимость получаемых результатов.

Принцип разработанного метода состоит в следующем: клетки выращивали в напыленных углеродом (для лучшего отделения от заливочной среды) чашках Петри. Вся процедура фиксации, дегидратации и заливки проводилась непосредственно в чашках. После полимеризации залитые плоскопараллельные препараты, которые по всем параметрам соответствуют светооптическим препаратам, отделялись на холоду от стекла и на них с помощью специального устройства под световым микроскопом отмечались и вырезались нужные клетки, с которых на ультратоме Ultracut Е (Reichert-Jung, Австрия) получали ультратонкие срезы и исследовали их в электронном микроскопе JEM 100С (JEOL,Япония).

Для иммуноцитохимических исследований использовались моноклоналыше- антитела (МКА) к различным компонентам цитоске-лета как отечественные ( Институт цитологии РАН, г.Санкт-Петер-бург и ИЦиГ.СО РАН, г.Новосибирск), так и импортные (Amercham, Англия, и Sevac, Чехословакия). Для иммунофлюоресцентного анализа клетки, выращенные на покровных стеклах, префиксировали формалином и глютаровым альдегидом, обрабатывали Тритоном X-IOO, затем дофиксировали формалином. После обработки овальбумином клетки инкубировали с исследуемыми антителами и вторыми антителами, меченными FITC, и исследовали в люминесцентном микроскопе ЖМАМ - И-1.

Электронная иммуноцитохимия проводилась на срезах клеток, заключенных вышеописанным методом плоскопараллельной заливки в низкотемпературную водорастворимую смолу lowicryl К 4 М. Ультратонкие срезы монтировали на никелевых сетках, иммуноцитохимическое окрашивание с использованием комплекса белок А - коллоидное золото проводили по методу Бендаяна (Bendayan,1984).

Экспериментальная часть ^^£П§В™§нта^ное_изменеше_направле|шя_даЗ^

1.1 Особенности дифференцировки хондрогеныых клеток зачатка конечности куриного эмбриона в условиях in vitro.

( 6. 7 )

В этой части работы мы методами световой и электронной радиоавтографии исследовали ультраструктуру клеток первичной дифференцирупцейся культуры хондробластов зачатка конечности куриного эмбриона с целью изучения временной и пространственной организации протекающих в одной клетке в ходе ее цитодифференцировки двух тканеспецифических для хрящевых клеток продуктов - хондроитин-сульфата и коллагена.

ЭМ изучение клеток культуры хондробластов на разных стадиях дифференцировки выявило существенные различия в строении пролиферирупцих клеток. клеток промежуточной стадии и дифференцированных хондробластов (степень дифференцировки определяли с помощью совмещения специфической окраски на хондроитин-

з

-сульфат и авторадиографически путем включения в клетки Н-тими-дина и меченного по s- пролина). В процессе дифференцировки происходят заметные изменения в субмикроскопическом строении клеток, что выражается в уменьшении числа свободных полирибосом а также изменяется характер их расположения в цитоплазме, увеличивается число мембран ЭПР и резко активируется аппарат Гольджи. Морфометрический анализ изменений ультраструктуры клеток разной степени дифференцировки показал, что площадь поверхности мембран ГЭР увеличивается в дифференцированных хондроцитах по сравнению с первичными хондробластами в 5 раз, одновременно площадь мембран гладкого ЭПР уменьшается в 1,3 раза. Интересно, что в процессе дифференцировки увеличивается зональность расположения органелл в цитоплазме, наблюдается четкое обособление зон, занятых "полями" свободных полирибосом, от районов сосредоточения мембран ГЭР. Морфологические наблюдения показывают, что такая гетерогенность обеспечивается пучками микрофиламентов цитоскелета, которые часто видны на электроннограммах. ЭМ-авторадиографическое изучение интенсивно-

о

сти включения Н-пролина в клетки на разных стадиях дифференцировки показало, что клетки дифференцированные, с хорошо развитым гранулярным ЭР, меченый пролкн не включают, в отличие от клеток ранних стадий со слабо выраженными морфологическими хондрогенными признаками. Это говорит о том, что основная масса коллагена синтезируется в хондробластах на ранних этапах цитодифференцировки, о чем свидетельствует включение метки в районы, содержащие скопления полисом этих

QR

клеток. Напротив, s-сульфат включается в основном в сильно дифференцированные клетки, что указывает на синтез в таких клетках мукополисахаридов. Ультраструктура клеток на этой стадии {сильное развитие ГЭР,' гипертрофия аппарата Гольдки, появление продукта во внеклеточном матриксе) подтверждают подобное предположение.

Пространственно-временное разобщение двух специфических синтезов в хондрогенных клетках обусловлено, по всей вероятности, конкуренцией за системы белок-синтезирупцего аппарата клетки и может обеспечиваеться двумя путями: за счет пространственного разграничения синтезов, а также с помошью долгоживущих РНК, кодирующих синтез коллагена, поскольку показано, что интенсивный синтез коллагена в хрящевых клетках осуществляется не за счет вновь образованных полирибосом, а на уже предсуществуших в ранних хондробластах стабильных информасомных комплексах, состоящих из полисом и иРНК (Мазуров, 1972). Например, у лягушки иРНК, кодирующая синтез коллагена, накапливается в цитоплазме уже на стадии бластулы, тогда как синтез коллагена регистрируется значительно позднее ( Rollins, Flickinger,1972 ). В последнее время появились данные (Garrone, 1991) о том, что подобные долгоживущие комплексы могут ассоциироваться с актиновыми фибриллами в цитоплазме клеток, что подтверждает наши ранние морфологические наблюдения.

1.2 Роль цитоскелета в дифференцировке спикулогенных клеток морского ежа.

( 20,22,28 )

Модель раннего эмбриогенеза морского ежа очень - удобный объ- ект для изучения механизмов цитодифференцировки, поскольку

уже на стадии бластулы клетки первичной мезенхимы мигрируют в блас- тоцель и на стадии ранней гаструлы клетки, сливаясь отростками между; собой, образуют сетчатый синцитий, в каждой клетке кото- poro формируетсяя пара спикул личиночного скелета. (Okazakl, 1960,1975¡ Gustaison. Wolpert,1961). Каждая скелетная спикула представлена монокристаллом кальцита характерной формы, который образуется в результате внутриклеточного процесса минерализации, протекающего в специализированном участке цитоплазмы. Подбирая мягкие условия диссоциации клеток зародыша и состав среды, можно получить спикулогенез в условиях In vitro.В своих экспериментах мы использовали первичную культуру спикулогенннх клеток, в которых можно экпериментально моделировать разные этапы процессы спикулогенеза. Такая спихулогенная клеточная культура, обладающая четкими маркерами специфической дифференцировки (способность к образованию синцития и спикул) может быть использована для исследования особенностей экспрессии и механизмов регуляции морфологических признаков спикулогенеза в экспериментальных условиях в однослойной культуре.

В клеточной культуре наблюдается полноценная экспрессия цитодифференцировки спикулогенных клеток с образованием скелетных спикул. Однако отсутствие факторов, контролирующих пространственную упорядоченность клеток в организме эмбриона, приводит к нарушению организации мезенхимальшх синцитиев и продуцированных ими спикул. При воздействии на спикулогенную культуру цитохалазином или колхицином, нарушающими структуру што-скелета, наблюдается исчезновение отростков клеток и фрагментация синцитиев. Продуцируемые такими клетками спикулы теряют свою характерную форму правильных трезубцев и становтяся округлыми или неправильными многогранниками причудливой формы.( Исаева, 1991).

ЭМ исследования клеток спикулогенной культуры выявило полноценную экспрессию морфологических признаков цитодифференци-ровки первичномезенхимных клеток и синцитиев, ультраструктурными маркерами которой являются специфические спикулогенные вакуоли. Однако в условиях In vitro, в отличие от организма, где процесс образования спикул (т.е. дифференцировка) начинается только

после формирования синцития, образование множественных спикул может происходить в отдельной одноядерной внешне малодифференцированной мезенхимной клетке. Другими словам!, в условиях спикулогенной культуры мы наблюдаем разобщение нормальной последовательности событий цитодифференцировки, обусловленной, по всей вероятности, нарушением организации цитоскелетных структур, развитие которых,' в свою очередь, обусловлено адгезивностью клеток к субстрату и отсутствием в культуре специфических межклеточных взаимодействий.

1.3 Изменение цитоскелета при дифференцировке клеток куль туры тер атокарциномы мыши.

( 37,41,42,43.47 )

Выбранная нами для экспериментов нулипотентная линия клеток тератокарциномы мыши OTF9-63 {сублиния линии F-9) отличается тем, что процессы дифференцировки начинаются в ней только после воздействия морфогенами (мы использовали ретиноевую кислоту,меха- низм действия которой известен), при этом после обработки клетки начинают дифференцироваться в производные первичной энтодермы, моделируя тем самым самые ранние этапы эмбрионального развития (Casanova, Gräbel, 1988). Степень дифференцировки клеток опреде- лялась по наличию в мембране эмбрионального антигена, _ выявляемо- го специфическими моноклональными AT, а также с использованием морфологических свето- и ЭМ критериев.

В результате экспериментов по иммуноцитохимическому выявлению отдельных элементов цитоскелета с помощью моноклональных AT к отдельным элементам цитоскелета на разных этапах дифференцировки под действием ретиноевой кислоты оказалось, что структуры актинового цитоскелета формируются уже в течение первых суток после обработки морфогеном. В это время в клетке экспрессируется эмбриональный антиген, а в цитоплазме полностью отсутствуют какие-либо морфологические признаки дифференцировки. На третьи сутки по мере дифференцировки клеток начинают выявляться другие элементы цитоскелета - организованные пучки микротрубочек, промежуточные филаменты. На седьмые сутки окрашивание моноклональными AT к микрофиламину, а-тубулину, винкулину и

Р-актину Еыявляет наличие в цитоплазме клеток организованных структур всех компонентов цитоскелета. Актиновые филаменты формируют мощные подмембранные пучки, микротрубочки образуют плотную сеть вокруг ядра, и пучки, отходящие к периферии клетки. Окраска АТ к винкулину выявляет многочисленные четкие бляшки, расположенные в . местах контактов клеток между собой и субстратом. Описанные изменения происходят на фоне полного исчезновения эмбрионального антигена и появления в цитоплазме всего комплекса ультрасгруктурных признаков, характерных для дифференцированных клеток.

Подводя итог этой части работы, можно сказать, что на клетках тератокарциномы, моделирующих одну из самых примитивных дифференцировок стволовых эмбриональных клеток, нам удалось выделить несколько этапов формирования цитоскелета, происходящих в процессе их дифференцировки под действием морфогена. Представленные данные можно считать экспериментальным доказательством того, что цитоскелет является клеточной структурой, которая одна из первых подвергается изменениям в процессе цитодифференцировки и, являясь механизмом, обеспечивающим структурную целостность цитоплазмы и компартментализацию основных биосинтетических процессов, определяет путь дифференцировки на самых ранних ее этапах.

Следует отметить то обстоятельство, что основные структуры актинового цитоскелета формируются раньше, чем в клетках наблюдаются какие-либо морфологические изменения, поэтому они могут служить удобным маркером ранних стадий цитодифференцировки.

1.4 Ассоциация глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы с актиновым цитоскелетом мышечных и немышечных клеток.

( 39 )

Как уже упоминалосьь, современные представления о цитоскелете выходят далеко за рамки его чисто опорно-сократительной функции. В последние годы появились сведения о непосредственном участии цитоскелета в компартментализации основных метаболических процессов в клетке. Существование у некоторых цитоплазматических ферментов актинсвязываодей функции, кроме основной специфической, дает

право рассматривать цитоплазматические ферменты не как "растворимые" и функционирующие ' свободно в цитоплазме, а как ассоциированные с определенны?,я структурами актинового цитоскелета (W'olosawick, Porter, 1979: Ellisnan, Porter, 1980). Наиболее изученной моделью такого рода взаимодействий являются гликолитические ферменты, относящиеся к классу "растворишх" ферментов. В скелетной мышце из десяти ферментов гликолиза по крайней мере четыре связываются очень прочно с актинсодержашми филаментачи (альдолаза, фосфофруктокиназа, глицеральдегид- 3-фосфат- дегидрогепаза и пируваткиназа), тогда как другие шесть ферментов связываются в меньшей степени (Clarke et al.,1986). Значительная часть ферментов гликолиза в скелетной мышце связана непосредственно со структурами сократительного аппарата (тонкими актиновыми филаментами) и локализуются в I диске саркомера (Clarke, Masters, 1976).

В нашей работе, используя моноклинальные AT к Г65Д, мы впервые исследовали внутриклеточную локализацию этого важного фермента общеклеточного метаболизма, применяя методы световой и электронной иммуноцитохимии. Нам впервые удалось продемонстрировать, что моноклональные антитела против Г6ФД ассоциируются с актиновым цитоскелетом мышечных и немышечных клеток. В исследованных типах клеток методом непрямой иммунофлюоресценции обнаружены характерно расположенные светящиеся пучки филаментов. Расположение и характер упаковки светящихся пучков совпадает с локализацией актиновых филаментов, выявляемых специфическими к актину антителами и фаллоидином, меченым родамином, на контрольных препаратах. Иммуноцитохимическое изучение субклеточной локализации Г6ФД на электронномикроскопическом уровне с помощью комплекса AT- белок А- коллоидное золото также показало, что метка локализуется в районе расположения актиновых филаментов в цитоплазме и вокруг ядра.

Наши данные подтверждают развиваемые в последнее время представления, согласно которым многие ферменты общеклеточного метаболизма располагаются в цитозоле не случайным образом, а посредством тесной связи с элементами актинового цитоскелета. Такую ассоциацию Г6ФД и других ферментов с элементами цитоскелета можно рассматривать как универсальный

внутриклеточный механизм компартментализации метаболических процессов в цитоплазме клеток.

1.5 Влияние условий культивирования на направление дифференцировки первичных миобластов куриного эмбриона.

( 15, 16, 18, 21, 34 )

Миогенез in vitro является традиционной, достаточно хорошо изученной моделью цитодифференцировки. В условиях культуры можно добиться полноценной морфофункциональной дифференцировки миобластов и с помощью ряда экспериментальных приемов разобщить цепь событий миогенеза, характерных для дифференцировки в организме, а во многих случаях даке вообще изменить направление дифференцировки миобластов.

Мы проводили несколько вариантов экспериментов. В первом случае миобласты, изолированные из бедра 11-ти дневного куриного эмбриона высевались на твердый субстрат (чашки Петри или покровные стекла на полную среду. Через 3-4 суток в такой культуре происходит массовое слияние миобластов с последующим образованием типичных мышечных волокон, способных к сокращению непосредственно на ' стекле и обладавдих ультраструктурой, характерной для дифференцированных скелетномышечных клеток.

Па среде без эмбрионального экстракта слияние миобластов подавлено и культура представляет собой типичные одноядерные фибробластоподобные клетки без каких-либо признаков мышечной дифференцировки. Следует подчеркнуть, что превращение миогенных клеток в фибробласты обратило: после перевода на полную среду такие фибробластоподобные клетки начинают интёнсивно сливаться и через 24 часа степень дифференцировки (включая весь комплекс свето-, электронномикроскомических морфологических и функциональных признаков) не отличается от контрольной культуры, растущей на полной среде. При переводе в условия суспензионной культуры клетки образуют агрегаты, обладашие тканеподобной организацией. При этом из исходной морфологически однородной популяции миогенных клеток образуется целый ряд клеточных типов: от типичных мышечных клеток на поверхности агрегата, до. фибробластоподобных клеток, синтезирующих коллаген, хондробластов - и хондроцитов, и даже жировых клеток, во

внутренних областях агрегатов.

Как показали наши свето- и ЭМ исследования, в суспензии миогенных клеток куриного эмбриона организованное расположение в агрегатах клеток различных типов возникает не в результате пересортировки смеси различных клеток исходной клеточной популяции, т.к. аналогичные результаты были получены и на клональных клеточных линиях. Кроме того, возможность селективной пролиферации отдельных клеток-предшественников с последущей дифференциацией в хрящевые и жировые в центральных частях агрегатов кажется маловероятной, потому, что митотическая активность клеток агрегатов невысока и непродолжительна и составляет 1,6$ через 24 часа и 0,5% через 4 суток после начала культивирования суспензионной культуры.

Любопытно, что если образовавшиеся агрегаты перенести на твердый субстрат (в чашку Петри), то, в миосимпластах, образуших их наружную "капсулу", происходит разобщение отдельных признаков мышечной дифференцировки, представленных в норме единым комплексом событий миогенеза, строго скоординированными во времени и пространстве. Мы наблюдали как одноядерные клетки с четко дифференцированной саркомерной зоной, так и миобласты, многоядерность которых была практически единственным морфологическим признаком миогенеза. Можно было видеть также в пределах одной клетки весь спектр проявлений ультраструктурных признаков мышечной дифференцировки - от неполной экспрессии одного признака до координированого проявления всего комплекса структур зрелого скелетномышечного волокна.

Разобщение проявлений отдельных черт мышечной дифференцировки в суспензионной культуре миогенных клеток очень напоминает характерные для злокачественных миобластов отклонения от нормального миогенеза, которые обусловлены наследуемыми на клеточном уровне изменениями (Бахтин, Швембергер, 1981), тогда как нарушения миогенеза в суспензионной культуре носят скорее характер "фенокогшй" ' (т.е. они обратимы) наследственных изменений, описанных для малигнизированных клеток миогенного происхождения

Важно отметить, что через 3-4 дня после пересева агрегата в

его центральной части начинается размножение фибробластоподобных клеток, которые далее сливаются и дифференцируются в зрелые мио-тубы. При этом дифференцировке всегда предшествует распластывание клеток и связанное с ним развитие всего комплекса структур немышечного цитоскелета. Показано (Риг! а1.1980),что в мио-генной культуре, растущей в суспензионных условиях, присутствуют все основные белки, присущие дифференцированным мышечным клеткам, однако конечные этапы миогенеза, связанные с дифференциацией зрелых миотуб, не проходят. Предполагатся, что определенную роль в реализации терминальных этапов миогенеза могут играть регуляторные "минорные" белки (Пинаев,1981). Однако главную, на наш взгляд, роль играют зависимые от контакта с субстратом или другими клетками изменения плазматической мембраны и связанных с ней примембранных цито-скелетных комплексов и образующих их белков, которые образуют" своеобразную "канву" из элементов немышечного цитоскелета, как основы, необходимой для сборки элементов сократительного аппарата (зрелых миофибрилл) мышечной клетки.

1.6 Рот_отде^ных_бежов_цитоскелета_в

_мигентх_клеток_1п_уаЛго_ ( 33, 36, 44 )

Для экспериментального подтверждения наших морфологических наблюдений мы проследили за реорганизацией цитоскелета в клетках культуры первичных и перевиваемых миобластов в ходе их дифферен-цировки в зрелые миотубы, используя антитела к некоторым белкам мышечного и немышечного цитоскелета.

Полшслональные антитела к актину, главному белку микрофи-ламентов, выявляют в одноядерных миобластах цитоскелетную сеть, пронизыващую всю клетку, оплетающую ядро. После слияния в молодых миотубах актин распределяется диффузно по всей цитоплазме, что говорит о глубокой реорганизации системы актиновых фила-ментов на ранних этапах цитодифференцировки миобластов. Именно эти начальные этапы формирования миофибрилл являются ключевыми и наименее исследованными моментами этого сложного процесса.

Нам впервые удалось показать, что формирование тонких I актиновых филаментов, входящих в состав будущего саркомера,

происходит уже в цитоплазме малодифферепцированных клеток (у которых практически отсутствуют морфологические признаки дифференцировки) из вновь синтезированных мышечных изоформ актина (a-актина), и именно поэтому поликлональные антитела к актину не связываются с i-дисками саркомеров.

Согласно нашим данным, структурами, контролирушими начальные этапы миодифферендаровки, могут быть стресс-фибриллы (или нити натяжения), которые формируются в подмембранном слое миобластов при прикреплении их к субстрату. Из литературы известно, что стресс-фибриллы состоят из длинных пучков актиновых филаментов с периодически вкрапленными "плотными телами", с которыми ассоциируются а-актинин, гропомиозин. Кроме того, в них показано наличие миозина, который распределяется также прерывистым образом (Langaiiger et al., 1986, 1984а,b). Все эти белки представлены немышечными изоформвми. Обнаруженные во многих типах клеток, стресс-фибриллы отвечают за ригидность клеток и их подвижность, так как могут сокращаться и расслабляться (Amato, Taylor, 1986: Lin et al., 1988), являясь, по существу, немышечным аналогом миофибрилл или "цитомышца!ЛЯ", по определению Фултон (Fulton,1981).

С помощью световой и ЭМ иммуноцитохимии мы показали, что микрофиламин (актин-связанный белок), специфичный для стресс-фибрилл, локализуется четко в подмембранных стресс-фибриллах одноядерных миобластов. После слияния и начета формирования миофибрилл стресс-фибриллы начинают разрушаться и белок микрофиламин распределяется по цитоплазме миотубы диффузно (Крылова и др.,1987).

Одновременно с перераспределением белка стресс-фибрилл мы проследили распределение белка миодифферендаровки а-актинина. Моноклональные антитела к скелетномышечной изоформе а-актинина не выявляли белок в одноядерных миобластах. Появляясь только в слившихся миобластах, белок а-актинин локализовался вдоль стресс-фибрилл подмебранного слоя. В ходе дальнейшего созревания миотубы а-актинин перемещался в z-диски формирующихся саркомеров, которые в дальнейшем выстраивались, образуя миофибриллу с четко ориентированными Z-линиями.

Таким образом, в ходе цитодифференцировки миобластов

Схема I.

I. стресс-фибрилж: 2.Ы. -актинии: а. саркомеры: 4. 7, - диски.

20

происходит перестройка немышечного цитоскелета путем постепенной замены белков немышечного цитоскелета на мышечные изоформы. При этом структуры немышечного цитоскелета (стресс-фибриллы) являются основой для пространственно упорядоченной сборки формирушегося сократительного аппарата мышечных клеток. (Схема I).

При оценке результаты экспериментов с миогенными клетками возникает естественный вопрос: насколько универсальны сделанные нами заключения о роли актинового цитоскелета как фактора, обеспечив анцего направление клеточной дифференцировки. Для правильной интерпретации представленных данных нужно учитывать, что миогенез - это модель направленной дефинитивной дифференцировки, осуществляемой за счет уже предсуществупщх в миобласте нескольких программ (в виде долгокивущих мРНК и белков), преимущественная реализация одной из которых и определяет дальнейшую судьбу миобласта. Многочисленные опыты с использованием антибиотиков, цАМФ, 6-аминоникотинамида, бромдезоксиуридина свидетельствуют о посттранскрипционном уровне регуляции событий миогенеза

В рамки этой концепции хорошо укладываются полученные нами данные о цитоскелете как о динамичной структуре, канализирупцей основные процессы дифференцировки как миогенных, так и других типов клеток in vitro.

II.Исследование структурных механизмов экспрессии морфологических признаков дифференцировки в клетках гибридных клонов.

II.I. Закономерности формирования гибридных клеток под действием вируса Сендай и полиэтиленгликоля ( 10. II )

Эффективное функционирование различных геномов в объеме гибридного ядра, несомненно, связано с ядерным матриксом, как структурой, определяющей правильное пространственно упорядоченное положение функционально и морфологически различных хромосом в объеме гибридного ядра.■ Поэтому гибридные клетки являются весьма привлекательной моделью для изучения механизмов, участвующих в осуществлении пространственной

организации интерфазного ядра, от которой зависит экспрессия отдельных видо- и тканеспецифических генов, определяющих фенотип гибридной клетки.

Мы провели сравнительный электронномикроскогшческий анализ процесса образования гибридов соматических клеток под действием вируса Сендай, полиаткленгликоля (ПЭГ) В качестве партнеров по слиянию использовались перевиваемые фибробласты китайского хомячка, фибробласты норки и человека и клетки культуры гепатомы мыши. Методики культивирования, слияния клеток и отбора гетерокарионов и гибридных клеток подробно описаны в прилагаемых публикациях.

Под действием вируса происходит частичное разрушение плазматической мембраны клеток-партнеров, образование гетерокарионов происходит не синхронно, "перемешивание" родительких цитоплазм затруднено и. гетерокарионы могут наблюдаться в культуре в течении 9 суток после обработки вирусом. Характерной чертой вирус-индуцированных гетерокарионов яв- ляется то, цитоплазма слившихся клеток очень долго не смешивается. Как показали наши наблюдения, "перемешиванию" цитоплазмы препятствуют остатки плазматических мембран и пучки актиновых филламентов.Именно с этим связано иногда наблюдаемое длительное, до 9 суток сохранение в культуре многоядерных клеток. О возможности несмешивания родительских цитоплазм свидетельствуют также данные (31п18са1со et а1.,1969) о локализации активности глшозо -6- фосфатдегидрогеназы вокруг одного из ядер в двухсуточных гетерокарионах, образованных от слияния фибробластов человека с нормальной и нулевой активностью фермента.

При действии ПЭГ через 15 мин после обработки, клетки склеиваются, и уже через I час плазматические мембраны таких клеток полностью "растворяются". Аналогичный эффект ПЭГ оказывает и на внутриклеточные мембраны : наблюдается быстрое слияние митохондриальных, ядерных и других мембран. Обработка ПЭГ приводит к тому,что образование синкариона (слияние ядер) может происходить не только в митозе (как в случае с вирусом), но и на других стадиях клеточного цикла, что способствует более I синхронному образованию гибридных клеток, т.к. через 48 часов все гетерокарионы превращаются в синкарионы.

Таким образом, отличительной чертой ПЭГ-индуцированного слияния является быстрое и синхронное слияние клеток. Кроме того, согласно сделанным наблюдениям, обработка клеток ПЭГ вызывает определенного рода изменения не только в клеточной оболочке, но и в ядерных и цитоплазматических мембранах. В результате становится, очевидно, возможным "прямое" слияние ядер в .юбых стадиях клеточного цикла, а не только в митозе. В связи с этим такие явления, как предварительная конденсация, пульверизация хромосом и др., описанные при слиянии клеток в разных стадиях клеточного цикла, в ПЭГ-индуцированных гибридах должны оказывать более выраженный цитотоксический эффект.

II.2. Образование гибридных клеток при спонтанном слиянии спленоцитов и фибробластов { 29, 40, 45, 46, 48 ) Пря образовании гибридных клеток под действием вируса Сендай и ПЭГ нарушается структура плазматической, а в случае ПЭГ, и большинства внутриклеточных мембран, включая ядерную. Именно это, по-видимому, является причиной цитотоксического эффекта этих сливающих агентов и результатом наблюдаемых в гибридных клетках многочисленных хромосомных перестроек, затрудняющих локализацию генов на хромосомах и делающих невозможным изучение ранних стадий образования гибридной клетки.

Поэтому мы предложили способ получения гибридов нетрадиционным путем, в отсутствие каких-либо воздействий, а используя естественную способность лимфоцитов быстро внедряться в клетки-мишени. В качестве модели мы использовали фибробласты китайского хомячка и спленоциты мыши и лисицы, а также лимфоциты периферической крови человека.

Электронно-микроскопический анализ спонтанного слияния спленоцитов с фибробластами в процессе их сокультивирования без каких-либо сливающих агентов показал, что спленоциты способны активно вторгаться в цитоплазму фибробласта, при этом защищенное плазматической мембраной от действия лизосомных ферментов ядро спленоцита может сохраняться в интактном состоянии без заметных I морфологических изменений достаточно долго (до 72 часов). Часть ядер спленоцитов уже через 1-4 часа способна проникать в ядра

фибробласта Через 8-24 часа в ядрах отдельных фибробластов обнаруживаются блоки конденсированного хроматина из ядер спленоцитов Количество конденсированного хроматина в слившихся ядрах по мере культивирования уменьшается, что, вероятно, связано с его реактивацией.

Исходя из полученных данных, мы предложили два возможных пути формирования гибридных ядер: I) синкарион образуется в результате быстрого проникновения спленоцита непосредственно в ядро фибробласта с последующим разрушением плазматической и ядерной мембран первого; 2) в ядре спленоцита, находящегося в цитоплазме фибробласта через 15-20 часов сокультивирования может происходить фрагментация хроматина ядра на отдельные хромосомо-подобные блоки, каждый из которых окружен двойной мембраной, образованной, по-видимому, за счет разрушенной ядерной мембраны спленоцита. В этом случае синкарион образуется в момент митоза, когда отдельные окруженные мембраной фрагменты могут включаться в состав вновь формирующегося ядра фибробласта.

Приведенные данные демонстрируют возможность получения гибридных клеток путем сокультивирования фибробластов и спленоцитов с достаточно высокой частотой (Ю-4) без воздействия сливающих агентов и открывают ранее недоступные возможности для исследования клеточных механизмов формирования гибридного ядра. Кроме того, достаточно высокая частота спонтанного образования гибридов требует нового подхода в оценке возможных иммунологических конфликтов, связанных с переливанием крови у человека.

П.З. Электронно-микроскопическое исследование гибридных клонов, содержащих различное число хромосом ( 23 27, 31, 47 ) Как известно, после образования гибридной клетки в ядре происходит сегрегация хромосом преимущественно одного из родителей. Поэтому при последушем культивировании в образовавшихся гибридных клонах возникают различные сочетания хромосом родительских клеток, так что клетки разных гибридных клонов могут сильно отличаться друг от друга и от родительских клеток по многим морфологическим и функциональный параметрам.

В связи с этим возникает по крайней мере два вопроса:

1. От каких структурных механизмов ядра зависит стабильность генома гибридных клеток, а значит скорость элиминации хромосом в гибридном ядре.

2. Как специфическое взаимодействие разных геномов в ядре гибридной клетки отражается на степени экспрессии специфических биохимических и морфологических признаков дифференцировки гибридной клетки, чем, собственно, и определяется ее фенотип. Для ответа на эти вопросы мы провели цитогенетическое, электронно-микроскопическое, цитохимическое и морфометрическое исследование нескольких серий гибридных клонов, полученных от слияния клеток гепатомы мыши и фибробластов норки и фибробластов человека с фибробластами китайского хомячка.

В клетках, полученных методом соматической гибридизации, характер и степень проявления отдельных признаков цитодпфферен-цировки родительских клеток могут сильно варьировать. Сложные взаимодействия хромосом двух чужеродных геномов, объединенных в гибридном ядре, в одних случаях приводят к полному подавлению определенных родительских признаков, в других - к их совместному проявлению и, наконец, к реактивации признаков, отсутствующих у одного из родителей ( Рингерц, Сэвидж, 1979 ).

Мы изучали ультраструктуру клеток гибридных "клонов с известным числом хромосом, полученных от слияния клеток родительских линий, значительно отличающихся по степени еидовой и тканевой дифференцировок (а следовательно, и клеточному фенотипу), и, сопоставляя полученные электронно-микроскопические морфологические и морфометрические данные с результатами кариологического анализа этих клонов, показали влияние генотипа гибридной клетки на проявление отдельных морфологических черт дифференцировки.

В этой части работы были использованы субклон BW8 линии гепатомы мыцм BWTG3, перевиваемая линия фибробластов американской норки MVTK" и четыре гибридных клона 8mV5B, 8roV8, 8mV9, 8mV9A. Линия mytk- - это околодиплоидная линия, полученная из перевиваемой линии эмбриональных фибробластов MV и дефицитная по тимидинкиназе (Жданова и др., 1983).

Гибриды 8mV5B, 8mV8, 8mV9, 8mV9A получены от слияния клеток

гепатомы субклона В«8 и фибробластов линии норки линии MVTK~.Bce гибриды содержали два набора хромосом мыши и несколько хромосом норки (табл i).'

Таблица I

Содержание хромосом норки в гибридных клонах

Разные хромосомы норки в гибридных клонах

Номер

клона I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 II 12 13 14

8mV8 +

SmV9 + + +

8mV9A + + + + + + + 4 + + +

8mV5B + 4 + + + + + + + 4444 +

Электронно-микроскопический анализ показал, что родительские клетки имеют некоторые различия в своем строении. Для небольших по размеру, неправильной формы клеток гепатомы мыши характерны глубокие инвагинации ядерной мембраны, тогда как крупные, веретеновидные фибробласты норки обычно имеют округлое или овальное ядро, лишенное инвагинаций. Наличие "лопастного" ядра, являющееся характерным признаком опухолевых клеток, было использовано нами в качестве одного из морфологических маркеров, характерных для клеток гепатомы. Другим удобным маркером оказались митохондрии родительских линий. Крупные, округлые или овальные митохондрии из клеток гепатомы мыши характеризуются светлым матриксом и большим количеством четких крист. Для клеток мтак" характерны митохондрии вытянутой или причудливо изогнутой формы, электронноплотным матриксом и редкими, укороченными кристами. Кроме того, родительские клетки отличаются друг от друга двумя морфологически различными типами гранул. В клетках гепатомы мыши наблюдаются многочисленные, часто образующие скопления гранулы слабой электронной плотности, морфологически сходные с гранулами мукополисахаридов. Цитоплазма фибробластов норки насыщена темными электронноплотными гранулами, имеющими четкие границы.

Субмикроскопическое изучение клеток гибридных клонов продемонстрировало, что по большинству морфологических признаков, а также по раду количественных параметров органелл гибридные клетки существенно отличаются друг от друга и от родительских клеток. Для клеток гибридного клона 8mV8, содержащего только одну первую хромосому норки, характерна округлая, часто полигональная форма, отсутствие длинных отростков и ориентированного роста. По Енешним морфологическим признакам и характеру роста клетки этого клона напоминают клетки исходной линии BW8, однако превосходят их по размеру. Средняя площадь среза клетки клона 8ш78 составляет 113 мкм2, а клетки гепатомы мши 75 мкм2. Напротив, клетка клона 8тУ5В, содержащего все хромосомы норки, по своей внешней морфологии и размерам похожа на клетки другой родительской линии - фибробласты норки. Средняя площадь среза клетки клона 8ш75В и клетки линии ЮТК~ составляют соответственно 214 мкм2 и 205 мкм2;

Клетки клонов 8mV9 и 8mV9A, имеющие в геноме промежуточное относительно первых двух клонов число норочьих хромосом (соответственно 3 и II), по своей внешней морфологии такг:е занимают промежуточное положение. С одной стороны, они не похожи на первые два клона, а с другой, достаточно сильно отличаются как от родительских линий, так и между собой (Таблица 2).

Таблица 2.

Морфометрические характеристики изучаемых клонов.

Относительный

Тип Площадь среза Площадь среза ' объем ядра в %

гибрида клетки ядра ,т к объему клетки

x±s- х±а- x*s-

Е'Л'8 75.5*2.0 28.9*1 .2 38.7*1.3

MVTK" 204.5*9.2 42.0*2.3 22.2*0.8

8mV8 113.0*4.7 32.0*1.9 26.8*1.2

8mV9 131.9*3.5 48.1*2.0 36.2*1.8

8raV9A 147.3*4.6 52.2*2.5 38.8*1.2

Сопоставление результатов электронно-микроскопического и морфометрического анализов показало, что не только внешние, но и многие внутриклеточные морфологические параметры клеток изучен-

ных гибридных клонов существенно меняются в зависимости от количества хромосом норки, входящих в состав генома клетки.

Особенностью всех изученных гибридных клонов является сильная изрезанность поверхности ядра. Эта морфологическая особенность, свойственная клеткам гепатомы мыши, стойко наследуется во всех гибридных клонах, независимо от числа сохранившихся хромосом норки. Кроме того, в ядрах клеток клона 8mV9A, содержащего II хромосому норки, встречаются многочисленные олектронно-плотные скопления конденсированного хроматина, несвойственные другим изученным клеткам. Цитоплазма клеток гибридных клонов отличается от клеток родительских линий по строению ряда органелл, а также по их пространственному расположению. Особенностью строения клеток всех изученных гибридных клонов является присутствие в их цитоплазме гранул, свойственных обеим родительским формам. Кроме того, клетки всех изученных гибридных клонов характеризуются чрезвычайной изрезанностью поверхности ядра, что типично для клеток гепатомы мыши.

С другой стороны, в изученных клонах присутствуют отдельные признаки фибробластов. При этом степень проявления одного из таких маркерных признаков (наличие во всех четырех изученных клонах темных, электронно-плотных гранул, свойственных клеткам родительской линии mvtk"), не связана с увеличением количества хромосом норки в геноме гибридной клетки. Проявление других признаков - увеличение размера ядра и клетки в целом и изменение формы клеток (клетки клонов с большим содержанием хромосом норки приобретают веретеновидную, удлиненную форму) зависит, вероятно от "дозы" хромосом норки, сохранившихся в ядре клетки. Это неудивительно, поскольку известно, что увеличение размера генома приводит к увеличению ряда морфометрических параметров клетки (объема и поверхности клетки в целом и ее ядра) (Olmo, 1983). Кроме того, в гибридах клеток гепатомы мыши линии BWTG3 с фибробласгами разной видовой принадлежности подавляется синтез альбумина и а-фетопротеина, но сохраняется синтез сывороточных белков ( Szpirer, Szpirer, 1979).

Доминирование некоторых морфологических признаков клеток гепатомы свидетельствует о том, что в изученных гибридах подав-

ляются многие морфологические признаки, характерные для фибро-бластов. По-видимому, экспрессия морфологических признаков диф-ференцировки, которые собственно и определяют фенотип гибридной клетки, зависит от более сложных по сравнению с индивидуальными биохимическими маркерами клеточных механизмов, регулируших деятельность отдельных хромосом в ядре гибридной клетки.

Как отмечалось выше, во всех изученных гибридных клонах, даже в клоне 8mV8, где присутствовала только 1-я хромосома норки, были обнаружены темные гранулы, присущие клеткам линии MVTK-, Еместе со светлыми, характерными для клеток гепатомы мыши. Иными словами, добавление всего лишь одной хромосомы норки к геному мыши приводит к появлению морфологического признака, свойственного фибробластам. Возможно, в ряде случаев проявление морфологических признаков определенного клеточного фенотипа может определяться присутствием всего одной хромосога. В литературе имеются данные о том, что одна хромосома мозет контролировать способность опухолевых клеток к неограниченному делению (Evans et al., 1982).

Особенностью строения ядер клеток гибридного клока 8mV9A является наличие в них большого количества конденсированного хроматина. Этот клон содержит много хромосом норки, поэтому. можно думать, что в ядрах клеток этого клона не Еесь содержащийся в них генетический материал норки находится функционально-активным.

Таким образом, изучение особенностей ультраструктуры клеток ряда гибридных клонов, полученных от слияния клеток гепатомы и фибробластов, доказало довольно сложный характер наследования некоторых цитоморфологических признаков, свойственных клеткам родительских линий. Одни признаки стойко проявляются ео всех изученных клонах, тогда как наличие других связано, по-видимому, с присутствием в геноме гибридной клетки определенных родительских хромосом.

II.4. Особенности ультраструктуры ядер клеток; гибридных клонов ( 4, 12, 13, 14, 23, 24, 25, 38 47 ) В гибридном ядре в одном замкнутом объеме заключен

генетический материал клеток, часто отличающихся по числу, размеру, циклу репликации своих хромосом. Для нормального функционирования такого гетероплоидного ядра необходимо, чтобы все хромосомы занимали пространственно упорядоченное положение в объеме гибридного ядра. Поэтому при формировании гибридного ядра особо важное значение должна иметь структура ядерного матрикса.

В настоящее время существуют достаточно многочисленные данные о том, что отдельные элементы ядерного матрикса являются важными структурами, обеспечивашими функционально-упорядоченую внутреннюю структуру ядра. Так, показано, что в интерфазе хроматиновые фибриллы прикрепляются к ядерному матршссу, что обеспечивает высшие порядки организации хроматина (Сооск, Brazell, 1975), при этом в точках прикрепления инициируется транскрипция (Comings, Okada, 1976; Berezney. 1979) и, как правило, локализуются актиновые гены (Small et al., 1985), что указывает на важную роль этой структуры в организации активного хроматина (Lafond, Woodock, 1983). Элементы ядерного матрикса выполняют важные регуляторные функции, участвуя в процессе репликации и внутриядерного транспорта РНК ( Збарский, 1985 ). Они, по-видимому, способствуют правильному распределению митотических хромосом к полюсам клетки,* а в митозе могут трансформироваться в скэфолоподобные структуры хромосом ( Bekera et al., 1981 ). В целом ядерный матрикс является гибкой структурой, которая способна обратимо сокращаться, вследствие чего может изменяться объем и форма ядра в течение интерфазы (Berezney, Cofiey,1977). Было выяснено, что ламина, как один из основных его элементов, состоит из трех белковых компонентов, отличных от других белков ядерного матрикса. Она структурно взаимодействует с внутренней ядерной мембраной и ядерными поровыми комплексами, с одной стороны,- и элементами хроматина -с другой (Gerace, Blobel, 1980). В митозе ламина способна обратимо распадаться до мономерного состояия, при этом по крайней мере один из входящих в . ее состав белков остается связанным с мембранными фрагментами распадающейся ядерной оболочки. Известно, что фрагменты ядерной оболочки в митозе остаются' ассоциированными с отдельными хромосомами (Керкис; Христолюбова, 1971) и из них в телофазе начинается формирование

новой ядерной мембраны. По-видимому, посредством таких фрагментов оболочки могут обеспечиваться специфичность и число мест прикрепления хромосом к ламине и, таким образом, пространственная детерминация хромосом в интерфазном ядре.

Наше электронно-микроскопическое исследование гибридных клонов показало, что морфология ядер клеток практически всех изученных клонов сильно отличается от родительских появлением множественных глубоких инвагинаций ядерной мембраны, которые существенно увеличивают поверхность ядра.

Особый интерес представляют ранее не описанные структуры, обнаруженные нами в гибридных ядрах. Они на поперечных срезах представляют собой многочисленные округлые полости, ограниченные однослойной мембраной с внутренним сечением около 40 нм .В некоторых клонах доля ядер с такими структурами достигает 70$. На продольных срезах видно, что эти многочисленные трубчатые полости, окруженные хроматином, пронизывают все ядро во всевозможных направлениях и хорошо прослеживаются в ядре на значительном расстоянии. Анализ серийных срезов показал, что описанные структуры представляют собой длинные выросты внутренней мембраны ядерной оболочки, которые окружены плотно прилегающим к ним рыхлым хроматином. При введении в клетки 3Н-тимидина за 30 мин до фиксации, зерна серебра на электронно-микроскопических автографах локализуются в основном над хроматином, связанным с трубчатыми структура.1.™, что свидетельствует о достаточно высокой репликативной активности этих участков хроматина.

Чтобы оценить транскрипционную активность этих участков, мы провели на клетках, ядра которых содержали описанные аномальные структуры, гистохимическую реакцию на транскрипционно - активные районы хроматина по методу Френстера (Ргвпа1ег, 1971). На представленной фотографии видно, что электронно - плотные продукты реакции, как правило, обнаруживаются в ядрышке и хроматине, окружающем трубчатые полости, что говорит о том, что эти районы хроматина активны и в транскрипционном отношении.

Обработка клеток культуры раствором ДНКазы непосредственно перед фиксацией позволяет удалить большую часть хроматина из ядра. Если вслед за обработкой ДНКазой провести дополнительную

обработку клеток Тритоном Х-100 (т.е. провести процедуру, обычно используемую для выделения ядерного матрикса ), то на срезах можно видеть многочисленные элементы внутриядерного матрикса, ассоциированные с трубчатыми полостями, содержащие присущие этой структуре компоненты - поровые комплексы и ламину

Таким образом, ' проведенные исследования показали, что обнаруженные нами аномально многочисленные ядерные структуры, образованные инвагинациями внутренней ядерной мембраны, тесно ассоциированы с элементами внутриядерного матрикса, связанного с трансляционно и транскрипционно активным хроматином, который является, вероятно, частью хромосом, связанных с ламиной, которая определяет пространственную ориентацию в гибридном ядре.

Любопытно, что среди изученных клонов наряду с клонами, для которых характерны вышеописанные структуры, встречаются клоны, в ядрах клеток которых наблюдаются большие глобулы конденсированного электронно - плотного хроматина, занимающего в некоторых случаях до 35$ площади среза. Как показал морфометрический анализ, количество конденсированного хроматина не коррелирует с числом хромосом человека, присутствупцих в ядре гибридного клона (Таб.3).Необходимо отметить, что в ядрах, содержащих блоки конденсированного хроматина, как правило, отсутствуют трубчатые структуры .

Таблица 3

Относительное количество конденсированного хроматина в ядрах клеток гибридных клонов, полученных от слияния фибробластов хомячка и человека

Клон Площадь среза конденсированного хроматина, % от площади ядра X Площадь среза ядра клетки,$от площади клетки X Число хромосом человека

ЗЭг 18.02±0.03 34.62±0.02 11

ЗЭг-Э 35.16±0.Об З7.б4±0.02 16

ЗЭг-2 16.81±0.02 33.28±0.02 14

ЗЗг-12 15.86±0.03 33.12±0.01 20

Из представленных в этой части работы данных видно, что каждый из описанных способов слияния соматических клеток млекопиташих: вирус-индуцированное слияние, слияние с помощью полиэтиленгликоля или спонтанное слияние в результате внедрения спленоцита в клетку, - сопровождается определнными и различными изменениями структуры не только сливающихся клеточных поверхностей, но и других органелл клетки, в том числе и ядер. Эти особенности определяют не только эффективность и скорость слияния во всех этих случаях, ко и способ образования гибридного ядра. Последнее непосредственно определяет стабильность гибридного генома и дальнейшую судьбу гибридной клетки.

Геном гибридной клетки, есть результат слияния геномов двух родительских клеток, и наблюдаемые нами многочисленные инвагинации ядерной мембраны значительно увеличивают внутреннюю поверхность ядерной оболочки (а значит и возможность прикрепления хромосом), а такте поверхность ядерно - _ цитоплазматических контактов, что важно для осуществления нормального функционирования гибридного гетероплоидного ядра. Поэтому Функциональный смысл описанных длинных трубчатых выростов - это создание дополнительной поверхности внутренней ядерной мембраны и прилегазздей к ной лзмины, необходимей, по -видимому, для пространственно - упорядоченной организации гзпс;.<а гибридной клетки. В своих предположениях мы исходили из того, что при формировании в телофазе ядерной мембраны из фрагментов положение каждой хромосомы строго детерминировано в объэ»'э ядра. При образовании гибридов хромосома клеток достаточно далеких друг от друга видов с разней степенью синхронкЬсти репликации и связанные с фрагментами различных ядерных мембран сказываются заключенными в общем объеме гибридного ядра, и возможно, что из-за дефицита поверхности или отсутствия сродства к ламине новой ядерной мембраны часть хромосом не находит "своего" места на внутренней-поверхности гибридного ядра.

Действительно, если объем ядра растет пропорционально к3, то площадь поверхности ядра будет увеличиваться как и2, что в определенных случаях может приводить к относительному дефициту поверхности внутренней мембраны по отношению к количеству генетического материала, заключенному в ядре. Этот дефицит

может, по - видимому, компенсироваться наблюдаемыми нами инвагинациями внутренней поверхности ядерной оболочки.

Хромосомы, не связанные с ламиной ядерной мембраны, очевидно, не могут полностью деконденсироваться в интерфазе, что морфологически выражается в появлении в ядре блоков конденсированного хроматина, кокторые мы неоднократно наблюдали, как правило, в тех клонах, где было мало инвагинаций внутренней ядерной мембраны. Возможно, что такие пикнотические хромосомы чаще элиминируются из гибридного ядра, чем деконденсированные.

Как уже говорилось, при формировании в телофазе новой ядерной оболочки центрами ее образования являются, вероятно, фрагменты, ассоциированные с хромосомами. В гибридных ядрах при определенном соотношении родительских хромосом, связанных с различными фрагментами, может происходить образование избыточной внутренней мембраны ядерной оболочки (а значит и ламины), необходимой для прикрепления "лишних" хромосом. Эта избыточная ламина и образует описанные нами трубчатые внутриядерные структуры,- которые обеспечивают функционально необходимую ориентацию хромосом в объеме гибридного ядра, а тем самым и стабильность ее генотипа. При этом увеличение внутренней поверхности ядра происходит,, вероятно,, за счет лабильности элементов ядерного матрикса и не приводит, как это описано при полиплоидии, к значительному увеличению объема и формы ядра. (Nakanishi, Fujita, 1977; Бродский, Урываева, 1981)

Очевидно, что один из способов преодоления последствий возникающего в гибридном ядре дисбаланса между его объемом и поверхностью состоит в увеличении внутренней поверхности ядерной мембраны. Конкретно в изученных нами гибридах это выражалось в образовании пальцеобразных выростов внутренней мембраны ядерной оболочки, с прикрепленными к ним функционально - активнными хромосомами.

Заключение

Известно, что от степени прикрепления клеток, культивируемых in vitro, к твердому субстрату или друг к другу во многом зависит развитие их цитоскелета (Васильев, Гельфанд, 1981; Свиткина, 1990). У клеток, лишенных возможности прикрепления к

субстрату (а также у митотических клеток), актиновый скелет развит очень слабо и представляет собой изотропную сеть коротких неориетировалшх филаментов. Контакт клетки с субстратом индуцирует сборку элементов цитоскелета, которые, в свою очередь, обеспечивают определенное функционально упорядоченное распределение других субклеточных компонентов. Как видно из представленных нами данных, это определяет скорость, а в некоторых случаях и направление дифференцировки клетки.

Многие клетки куриного эмбриона в суспензионной культуре формируют трехмерные агрегаты с упорядоченной тканеподобной организацией. При этом в условиях суспензионного культивирования (отсутствие твердого субстрата) нарушается последовательность основных событий миодифференцировки, а в крупных агрегатах даже полностью меняется направление. После перевода агрегатов из суспензии на твердый субстрат в атипичных многоядерных симпластах, составляющих их основу, начинает проявляться немышечная подвижность: они расползаются, удлиняются и через некоторое время дифференцируются з зрелое мышечное волокно. В этих экспериментах особенно наглядно продемонстрирована роль твердого субстрата, как необходимого условия миогенеза in vitro.

Проведенное иммуно- цитохимическое и иммуно электронно-микроскопическое исследование процесса миофибриллогенеза в клетках клональной линии миобластов Ьб-Ji подтвердило это предположение, поскольку нам на конкретном примере удалось показать, что действительно, элементы немышечного цитоскелета -стресс-фибриллы в миобластах являются структурной основой для сборки миофибрилл из вновь синтезированных -изоформ мышечных белков.

Эксперименты на спикулогенной культуре морского ежа - модели, имитирующей события раннего эмбриогенеза, удивительным образом подтвердили наши наблюдения на миогенних клетт:ах. Так же как и в случае миогенеза, в условиях первичной спикулогенной культуры происходит разобщение нормальной последовательности событий цптодифференцировки (спикулогенеза). Подобное разобщение связано с нарушением организации скелетных структур, что объясняется изменением агдезивности клеток к субстрату и отсутствием в однослойной культуре специфичных для зародыша межклеточных

взаимодействий. При исследовании дифференцировки клеток культуры хондробластов также оказалось, что последовательное возникновение и пространственное разграничение двух

специфических для клеток хряща синтезов - коллагена и хондроитин-сульфата также связано с появлением и морфологической реорганизацией системы микрофиламентов в цитоплазме.

• Особенно наглядно видны изменения различных компонентов цитоскелета при изучении индуцируемой морфогеном дифференцировки клеток тератокарциномы,' моделирушей ранние этапы специализации стволовых клеток, где с помощью моноклональных антител нам удалось показать, что формирование организованных структур актинового цитоскелета предшествует появлению каких- либо других признаков дифференцировки.

Сейчас можно с уверенностью говорить, что совокупность большинства мофогенетических процессов в раннем развитии связана с перестройками мембранно-цитоскелетного комплекса, как опорно-двигательной системы клетки. Уже на самых ранних этапах развития локализованный в кортикальном слое комплекс актина с актин-связывавдими белками выполняет важную морфогенетическую функцию, обеспечивая как поддержание формы и исходную гетерогенность в яйце и зиготе, т.е. пространственную память зиготы, так и проявления подвижности, а также участвует в регуляции метаболизма: резкая активация белкового синтеза после оплодотворения коррелирует с изменениями состояния актина (Исаева, 1991). Именно гетерогенность цитоскелета яйца и создает систему координат, "регуляторную архитектуру" (Davidson, 1987) яйца и зародыша, обеспечивающую пространственную регуляцию дифференциальной активности генов в эмбриогенезе; структурные компоненты актинового цитоскелета в большой степени детерминируют клеточную и надклеточную морфологию развивающегося организма.

Вся совокупность приведенных ' в настоящей работе данных позволяет сформулировать представление, что в условиях in vitro актиновый цитоскелет является структурой, интегрирующей основные метаболические процессы в цитоплазме и служит необходимой "структурной" основой любой дифференцировки в клетках различного происхождения. Причем от характера пространственной организации

цитоскелета может зависеть не только упорядоченность и скорость, но в некоторых случаях и ее направление.

Поэтому, суммируя литературные и собственные данные, цитоскелет следует рассматривать как важнейший фактор посттранскрипционной регуляции экспрессии тканеспецифических признаков и как движущую силу "клеточного" морфогенеза.

Представленные нами данные проливают свет на ранее не изученные механизмы формирования гибридных клеток и закономерности наследования и экспрессии в них морфологических признаков родительских клеток.

Результаты впервые нами проведенного детального анализа гибридных клонов различного происхождения демонстрируют возможность нового подхода к изучению ультраструктурной организации клеток. Совокупность полученных данных об особенностях субмикроскопической организации гибридных клеток с разным генотипом позволяют говорить о закономерностях наследуемости и изменчивости ультраструктурных морфологических признаков, которые определяют цитофенотип. Приведенные данные говорят о принципиальной возможности и продуктивности исследований влияния генотипа на эти признаки т.е. экспериментальной "ультраструктурной" генетики, которая демонстрирует сложные и во многом еще непонятные особенности наследования этих признаков.

При исследовании структурных аспектов взаимодействия чужеродных геномов в гибридном ядре обращает на себя внимание роль впервые обнаруженных нами атипичных ядерных структур. Дополнительный мембранный компонент и связанные' с ним элементы ядерного матрикса обеспечивают пространственно упорядоченное расположение в ядре интерфазных хромосом, от которого зависит экспрессия отдельных тканеспецифических признаков родительских клеток, проявляющихся в гибридах. По-видимому, можно считать, что благодаря контакту хромосом с этими структурами обеспечивается стабильность генома гибридной клетки.

Обнаруженные закономерности в более широком аспекте-выходят за' рамки используемых нами моделей, поскольку проблема "совместимости" хромосом весьма актуальна при получении гибридов соматических клеток, в работах по реконструкции клеток, а также

при гибридизации животных и, особенно, при отдаленной гибридизации растений.

Основные выводы

1.Показана возможность полноценной морфо-функциональной диЗференцировки первичной культуры миобластов куриного эмбриона и зависимость направления цитодиффереренцировки от условий культивирования.

2.Сравнительно-цитологический анализ особеностей дифферен-цировки первичных культур миобластов, ходрогенных клеток куриного эмбриона, а также первичной культуры сгшкулогенных клеток морского ежа показал, что при всем различии морфологических черт, общим для процесса цитоди$ференцировки этих клеток в условиях культуры является разобщение нормальной, свойственной этим клеткам ln vivo, последовательности событий цитодифферэнцировки Это обусловлено нарушением организации цитоскелетных структур вызванным различной адгезивностью клеток к субстрату и отсутствием в культуре специфичных для нормального зародыша межклеточных взаимодействий.

3.Комплексный электронно-микроскопический, морфологический и иммуноцитохимический анализ процесса дифференцировки клеток в культуре позволяет обосновать предположение о ведущей роли цитоскелета в процессе цитодифференцировки:

а) исследования ультраструктуры миосимпластов суспензионой культуры после пересева на твердый субстрат показало, что в агрегатах, после пересева на переднем, ведущем крае миосимпласта после прикрепления к стеклу формируются структуры цитоскелета, характерные для фибробластов, обладающих немышечной подвижностью. Причем удлинение миосимпласта и степень экспрессии мышечных признаков коррелирует с упорядочением организации элементов немышечного цитоскелета: стресс- фибрилл и микротрубочек;

б) проведенное с помощью моноклональных антител свето- и электронно - иммуноцитохимическое исследование закономерностей изменения актинового цитоскелета в клональной культуре дифференцирующихся крысиных миобластов линии 16 подтвердило наши

морфологические наблюдения и показало, что предшествующие структурные элементы пемышечного цитоскелета миобластов -стресс-фибриллы - являются инициирующим и направлящим началом сборки миофибрилл из вновь синтезированных мышечных белков;

в) специфический белок мышечной дифференцировки а-актигшн отсутствует в одноядерных миобластах, появляется вскоре после начала слияния и локализуется вдоль стресс-фибрилл подмембран-ного слоя. В ходе дальнейшей дифференцировки этот белок перемещается сначала в формирующиеся зачатки г-дисков, а затем в г-диски формирующихся саркомеров, которые в дальнейшем выстраиваются вдоль продольной оси миофибриллы, образуя миофибрилллу с регулярно расположенными г-дискаш. Формирование миофибрилл сопровождается постепенной дезагрегацией стресс-фибрилл;

г) эксперименты по изучению дифференцировки клеток спикуло-генной культуры морского ежа, имитирующей события раннего эмбриогенеза, показали сходство наблюдаемых изменений с закономерностями, полученными на миогенных клетках. Так же, как в случае миогенеза, в клетках первичной спикулогенной культуры экспрессия специфической дифференцировки (форма, число, размер и расположение спикул) коррелирует с изменением организации цито-скелетных структур;

д) при изучении индуцированной морфогеном дифференцировки клеток культуры тератокарциномы мыши получены экспериментальные доказательства ведущей роли актинового цитоскелета как структурной основы ранних этапов дифференцировки стволовых клеток. Показано, что формирование организованных структур актинового цитоокелета предшествует началу морфо-функциональной цитодифференцировки.

3. Впервые с использованием иммунофлюорэсцентного и имму-но-электронномикроскопического анализа изучена внутриклеточная локализация цитоплазматического фермента глюкозо-6-фосфат-дегид-рогеназы. Показана его . тесная ассоциация с актиновыми микрофиламентами в цитоплазме как мышечных, так и немышечных клеток, что свидетельствует об участии актинового цитоскелета в компартментализации основных метаболических- процессов в цитоплазме.

4.Вся совокупность полученных в настоящей работе данных

позволяет сформулировать представление, что в условиях in vitro актиновый цитоскелет является структурой, интегрирующей основные метаболические процессы в цитоплазме, и служит необходимой структурной основой любой дифференцировки в клетках различного происхождения. От характера пространственной организации цитоскелета может зависеть не только упорядоченность и скорость, но, в некоторых случаях, и ее направление, т.е. экспрессия специфического клеточного фенотипа.

5. Впервые детальнр изучен процесс образования гибридной клетки и механизм формирования гибридного ядра под действием вируса Сендай и полиэтиленгликоля. Предложен новый метод получения гибридов соматических клеток исключающий цитотокси-ческий эффект сливающих агентов на клетки-партнеры. Предложенный метод позволяет исследовать самые ранние этапы формирования гибридных клеток. Высокая частота спонтанного образования гибридных клеток позволяет использовать их как перспективную модель в генетике соматических клеток и, кроме того, по-новому взглянуть на возможные цитогенетические последствия иммунологических конфликтов, возникающих при переливании крови у человека.

6. Продемонстрирован новый подход использования гибридов соматических клеток в качестве модели для изучения генетики и функции ультраструктурных компонентов клетки:

а) проведенное комплексное морфологическое и морфометрическое исследование ультраструктуры серии гибридных клонов различного происхождения с известным числом хромосом показало сложный характер наследования отдельных ультраструктурных морфологических признаков, характерных для клеток определенного родительского типа. Степень экспрессии отдельных признаков не всегда коррелирует с количеством хромосом, а может зависеть от присутствия в гибридном ядре определенной хромосомы одного из родителей;

б) при электронно-микроскопическом изучении ядер гибридных клонов различного происхождения обнаружены ранее не описанные трубчатые структуры, представляющие собой глубокие инвагинации внутренней ядерной мембраны, окруженные транскрипционно- и репликативно-активным хроматином;

в) для ядер, где отсутствуют описанные структуры, характерно присутстствие аномально больших блоков конденсированного неактивного хроматина:

г) электронно-гистохимическое изучение этих образований показало, что они связаны со структурами ядерного матрикса.

7. На основании полученных данных сформулировано представление о функциональном значении обнаруженных структур как механизма, обеспечивающего функционально упорядоченную организацию, нормальное функционирование хромосом в гибридном ядре и оказываюцего влияние на стабильность генотипа гибридной клетки.

8.Разработан новый метод предварительного выбора клеток для электронно-микроскопического анализа, который позволяет прицельно выбирать клетки и совмещать световую авторадиографию и цитохимию с анализом ультрастуктуры определенных клеток, находящихся на разных этапах дифференцировки.

Список основных публикаций по теме диссертации.

1. Христолюбова Н.Б., Керкис А.Ю. Применение метода "световой" авторадиографии для электронно-микроскопических исследований. // ЦИТОЛОГИЯ.- 1968.- T.IO, «II.- С.1496-1499.

2. Керкис А.Ю., Христолюбова Н.Б. Динамика изменений ультраструктуры клеток культуры ткани в клеточном цикле. // Цитология.- 1971.- Т.13, №4.- С.525- 529.

3. Khristolyubova N.B., Eerkis A.Yu. Preliminary Choice of a labelled cells as a method facilitating the application of electron autoradiography for the study of cell functional morfology. // In: Proc. 5th European Congress on Electron Microscopy, Manchester, London- Bristol.- 1972.- P.228-229.

4. Фокина H.A., Керкис A.D., Груздев А.Д. Контактирование политенных хромосом с ядерной оболочкой. // Цитология.-

1972.- Т.14, № 7,- С.830-835.

5. Керкис А.Ю., Христолюбова Н.Б. Метод выбора определенных меченых клеток для электронной авторадиографии. // Цитология.-

1973.-Т. 15, JÏ3.- С.358- 360.

6. Христолюбова Н.Б., Керкис А.Ю. Электронная авторадиография и морфометрия клеток культуры ткаки хондробластов на разных

стадиях дифференцировки. // Тезисы IX Всесоюзной конференции по электронной микроскопии, Тбилиси.- 1973.- С.418-419.

7. Керкис А.Ю., Христолюбова Н.Б. О временном, и пространственном разобщении специфических синтезов в процессе хондрогенеза (Э.М. исследование). // Онтогенез.- 1974.- Т.5, КЗ.- С.303-306.

8. Керкис A.D., Жимулев И.Ф., Беляева Е.С. Метод электронно-микроскопической авторадиографии для изучения структурно-функциональной организации определенных районов политенных хромосом. // Цитология.- 1975.-Т.17, »II.- C.I330-I33I.

9. Христолюбова Н.Б., Керкис А.Ю., Шилов А.Г., Киселева Е.В. Сравнительное изучение определенных клеток комплексом методов световой и электронной микроскопии, авторадиографии и морфометрии. // Симпозиум "Методы подготовки сложных объектов и анализ электронномикроскопических изображений", Петрозаводск, 1976.- С.97.

10. Керкис А.Ю., Урженко A.B., Жданова Н.С. Электронно-микроскопическое изучение слияния соматических клеток млекопитающих под действием инактивированного вируса Сендай. // Цитология.- 1978.- Т. 20, №10.- С.1203- 1205.

11. Kerkis A.Yu.., Zh.dan.ova N.S. Electronmicroscopic analysis of hybridisation of mammalian somatic cells under th.e influence of polyethyleneglycol. // 16 International Congress of Genetics, Moscow.- 1978.- Pt.2.- P.403.

12. Losecke W., Kerkis A.Yu., Linss W., Geyer G. DNase- a likely-probe of juxtatranscriptional DNP. // Acta histohemica.- 1980.-V.67.- P. 22-27

13. Керкис А.Ю., Жданова Н.С., Христолюбова Н.Б. Электронно-микроскопическое изучение соматических гибридов фибробластов китайского хомячка и человека. // Тезисы у Всесоюзной конференции "Физиология и патология соединительной ткани", Новосибирск.- 1980.- T.I.-C. 97-98.

14. Керкис А.Ю., Жданова Н.С. Нарушение процессов конденсации-деконденсации хромосом в ядрах гибридных клеток. // Тезисы VII Всесоюзной конференции "Струкрура и функция клеточного ядра". Харьков,- 1980.- С.23-24.

15. Керкис А.Ю., Исаева В.В. Обратимое подавление экспрессии мышечной дифференциации в однослойной культуре. // Цитология.-

1981.- Т.23, №3.- С.328- 332.

16. Керкис А.Ю., Исаева В.В. Электронно- микроскопическое изучение миогенных клеток куриного эмбриона в суспензионной культуре. // Онтогенез.- 1981.- Т. 12, JÍ3.- С.555-563.

17. Керкис А.Ю., Исаева В.В. Электронномикроскопическое изучение дифференцировки клеток миогенной культуры куриного эмбриона. // В книге "Успехи теоретической и прикладной генетики", Новосибирск.- 1982.- С.63-65.

18. Linss W. , Lemke С., Lagermann W. , Kerkis A.Yu. Gleichzeitige elektronenmikroskopishe Darstellung von vershiedenen Rezeptoren an der Oberflache erytroider Zöllen. // Anatomisher Anzeiger.-

1982.- Y.151.- P.511-514.

19. Исаева B.B., Керкис А.Ю. Скелзтогенез в культуре клеток эмбрионов морского esta. // Труды II Всесоюзной конф. по морской биологии, Владивосток.- 1982.- Т. 2.- С. 175-176.

20. Керкис, А.Ю., Исаева В.В. Особенности проявления морфологических признаков мышечной дифференцировки в суспензионной культуре миогенных клеток. // Цитология.- 1933.Т. 25, N 12.- С. I4II-I4I5.

21. Керкис А.Ю., Исаева В.В. Электронно- микроскопическое исследование спикулогенеза в культуре эмбриональных клетке* морского ежа Strongylocentrotus nudus.// Онтогенез.- 1934,- Т. 15, да.- С. 34-40.

22. Керкис А.Ю., Жданова Н.С., Христолгабова Н.Б. Электронно-микроскопическое изучение гибридных клонов фибробластов китайского хомячка и человека. // Вестник АМН СССР,- 1284.т.- С. 45-49.

23. Байбородин С.И., Керкис А.Ю. Морфологическое и морфометрическое исследование фибробластов с генетически обусловленными дефектами обмена. // Цитология и генетика.-1984,- №6.- С.403-406.

24. Керкис А,Ю. Особенности ультраструктуры ядер гибридных клеток. // Тезисы viii Всесоюзного симпозиума "Структура и функция клеточного ядра", 17, Пущино, 1984.

25. Прудовский И.А., Керкис А.Ю., Байбородин С.И., Христолюбова Н.Б., Зеленин A.B. Применение энуклеации клеток для изучения стабильности цитоплазматических органелл и организации

цитоплазмы. // Цитология.- 1985.- Т.27, JÎ7.-C.792-795.

26. Керкис A.D., Казанская Г.М., Жданова Н.С. Особенности субмикроскопического строения клеток гибридных клонов, полученных от слияния клеток гепатомы мыши и фибробластов норки и содержащих разное число хромосом норки. // Цитология.- 1986.-Т.28, Кб.- С.582-587.

27. Исаева В.В., Керкис A.D.. Чуриков Д.Ю. Влияние клеточной архитектоники на морфологическую экспрессию спикулогенеза в культуре клеток морского ежа. // Тез. 7 Всесоюзн. совещания эмбриологов. Онтогенез.- 1986.- T.I7, К5.- с.502.

28. Керкис А.Ю., Рубцов Н.Б., Закиян С.М. Спонтанное слияние спленоцитов лисицы с фибробластами китайского хомячка. // Тез. Всесоюзн. конф. по генетике соматических клеток, Звенигород.-1986.- C.II5-II6.

29. Байбородин С.И., Керкис А.Ю., Христолюбова Н.Б. Электронно-микроскопическое изучение ранних этапов образования реконструированных клеток в культуре. // Тез. Всесоюзн. конф. по генетике соматических клеток, Звенигород.- 1986.- С.91.

30. Керкис А.Ю., Казанская Г.М., Жданова H.Ç., Христолюбова Н.Б. Особенности ультраструктурной организации ядер гибридов соматических клеток. // Цитология,- 1987.- Т.29, »12.-C.I355-I36I.

31. Керкис А.Ю., Байбородин С.И., Рубцов Н.Б. Возможность получения гибридов соматических клеток путем спонтанного слияния спленоцитов лисицы и фибробластов китайского хомячка. // В кн. 5-й съезд ВОГИС, Москва.- 1987.- T.I.- С.119.

32. Крылова Т.А., Байбородин С.И., Фридлянская И.И., Керкис А.Ю., Галактионов К.И., Пинаев Г.П. Перераспределение белка массой 53кд в процессе миогенеза. // Тез. Всесоюзн. совещания "Биология клетки в культуре". Цитология.- 1987,- Т.29, №9.-С.1090.

33. Керкис А.Ю., Исаева В.В. Влияния прикрепления к твердому субстрату на структурную организацию скелетно-мышечных симпластов. // Цитология.- 1988,- Т. 30, № I.- С. 44-48.

34. Христолюбова Н.Б., Киселева Е.В., Лихошвай Е.В., Керкис А.Ю. Метод имунной электронной микроскопии в исследованиях структурно-функциональной оргнизации хроматина прокариот. //

Тез. 13 Всесоюзн. конференции по электронной микроскопии, Звенигород.- 1988.- C.II-I2.

35. Байбородин С.И., Керкис А.Ю., Фридлянская И.И. Применение метода иммунной электронной микроскопии для изучения перераспределния а-актинина в процессе дифференцировки миогенных клеток в культуре. // Тез. 13 Всесоюзн. конф. по электронной микроскопии, Звенигород.- 1988.- С.126.

36. Жданова Н.С..Керкис А.Ю. Способность к дифференцировке межвидовых гибридов тератокарциномы мыши. // Тез. Всесоюзн. конф. "Новые направления биотехнологии", Пущино, 1988.-С.56.

37. Kerkis A.Yu., Zhdanova N.S., Khristolubova N.B. Nuclear-matrix structural elements determining stability of genome of hybrid somatic cells. // Pros 9th European Congress on electron microscopy. Int. Phys. Conf. Ser. York, England.- 1988.- N.93.-V.3.- Ch.18.- P.489-490.

38. Usova O.Y., Nesterova T.B., Kerkis A.Yu., Bayborodin S.I., Bochkarev M.N., Zakian S.M. The study of intercellular association of glucose-6-phosphate dehydrogenase by monoclonal antibodies. // In book "Molecular organisation of biological structure", Moscow.- 1989.- P.177.

39. Kerkis A.Yu. Electron microscopical investigation of structural mechanisms of hybrid nucleus formation through spontaneous splenocytes-fibroblasts fusing. // Proc. 11th Nuclear workshop, Suzdal.- 1989.- P.106.

40. Serov O.L., Zhdanova N.S., Pack S.D., Lavrentieva М.Л., Shilov A.G., Rivkin M.I., Draber P., Kerkis A.Yu., Bayborodin S.I., Semenova L. A. The mink X-chromosom: organisation and inactivation. Ц Isozymes bulletin.- 1989.-V.22.- P.69.

41 Жданова H.C., Матяхина JI.Д., Байбородин С.И., Керкис А.Ю. Дифференцировка межвидовых гибридов клеток тератокарциномы мыши с клетками костного мозга амриканской норки. // Тезисы докл. Всесоюзн. конф. по генетике соматических клеток в культуре, Москва.- 1989,- С. 60-61.

42. Serov O.L., Zhdanova N.S., Pack S.D., Lavrentieva M.A. , Shilov A.G., Rivkin M.I., Matyakhina L.D., Draber P., Kerkis A.Yu., Rogozin I.В., Borodin P.M. The mink X-chromosome-organisation and inactivation. // Isozymes: structure and

function and use in Biology and medecine. Ed: Zen, Ichi, Ogita, Clement, Markirt.- 1990.- Y.344.- P.589-618.

43. Байбородин С.И., Керкис А.Ю. Перераспределение скелетно-мышечной изоформы а-актинина в процессе миодифферендаровки в культуре. // Тезисы 9 Всесоюзн. симп. "Биофизика и биохимия биологической подвижности", Тбилиси.- 1990.- С.132.

44. Керкис А.Ю., Байбородин С.И. Особенности образования гибридных клеток при сокультивировании спленоцитов и фибробластов. // Тезисы I Всесоюзн. конф. "Геном человека", Москва.- 1990.- С. 45.

45. Kerkis A.Yu. Electron, microscopic study of structural mechanisms of hybrid nucleus formation during spontaneous splenocytes-fibroblasts fusing. // In book "Nuclear structure and function", ed.«I.R.Harris.- 1990.- P.488-492.

46. ЯЩанова H.C., Байбородин С.И., Керкис А.Ю., Матяхина Л.Д., Серов О.Л. Поведение х-хромосомы во внутри- и межвидовых гибридах клеток тератокарциномы мыши РСС4 asal. // Онтогенез.-3991.- Т.22, Ji2. - С.158-167.

47. Kerkis A.Yu. .Zhdanova N.S. Formation and ultrastructure of somatic cell hybrids. // Electron Microscopy Rev.- 1992.- V.5. N1.- P.1-24.