Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Запрограммированные разрывы в ДНК при дифференцировке эмбриональных клеток

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Запрограммированные разрывы в ДНК при дифференцировке эмбриональных клеток"

Ма правах рукописи УДК 575.16+577.218

Ватолин Сергей Юрьевич

ЗАПРОГРАММИРОВАННЫЕ РАЗРЫВЫ В ДНК ПРИ ДИФФЕРЕНЦИРОВКЕ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ КЛЕТОК

Генетика - 03.00.15

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 1997

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

доктор биологических наук Серов О.Л. Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

доктор биологических наук Дымшиц Г.М. Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

доктор биологических наук Мертвецов Н.П. Институт биоорганической химии

СО РАН, г. Новосибирск

Институт биологии развития РАН, г. Москва

Защита диссертации состоится "/У" _1997 года

на и<ГР(?иН£!Ал_заседании диссертационного совета по

защите/диссертаций на соискание ученой степени доктора наук ( Д-902.11.01 ) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект акад. Лаврентьева, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан

- 12

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

С-Р/гТ^^, 1397 г.

Груздев А.Д.

Актуальность исследования. Дифференцировка - это фундаментальный процесс, опрцелякяний огромное разнообразие ооматеческих кнепж. Несмотря на значчтеленсе количество проводимых в данной области исследований, механизмы, упра&лхюгмеэтим сложнейшим процессом по-прежнему остаются малопонятными. Одной из актуальной проб-тем яаяясга? молекул5фно-генешческий контроль начальных этапов дифференниревки, в холе которых происходят- необратимые изменения, приводящие к потах плгорипошппкч о статуса 'ко имитирование клеток).

Среди oipoMHoro количества данных, проясняющих механизма поддержания гшюрипотентности и описьшающих процессы, ответственные за коммитирование и де-термитито клеток, за пиоюднис юды появилось мпо'лссгтво свидетельств mm. чю ряд типов клеточной дифференцировки сопровождается повышением уровней разрьшов в ДНК и связанных с ними сестринских хроматвдных обменов (СХО). Было продемонстрировано, что на некоторых этапах развития в клетках доимшангационных эмбрионов мыши повышается уровень сестринских хроматвдных обменов (Patkin et aL, 1594). Причем, повышение затрагивает только ссадии 8-клегочного эмбриона или ранней бла-стоцисгы. 1-4 клеточные эмбрионы также как бластоцисга перед имплантацией характеризуются низким уровнем СХО. сходным с таковым в клерках соматических теаней. Эт результаты косвенно свидетельствуют, во-первых, о формировании дополнительных од-нонитевых разрывов в ДНК бласгомеров ранних эмбрионов, во-вторых, о возможности реализации эшх разрывов в какие-либо рекомбинационные события, последствием чего является повышение уровня СХО. Согласно последним данным, события. приводящие к увеличению количества простых повторов, происходят на стадии 4-16 бласгомеров (Jansen et aL, 1994). Многие авторы полагают, что хроматидные обмены, гомологичная рекомбинация, а 'тюке процесс рсплнкптивной репарации могут быть ответственны за повышение мугабилыюеш минисателлитных последовательностей (Jansen et aL, 1994; Jaflrcys et al., 1994). Одновременно утверждается, что в основе всех этих явлений лежит возникновение разрывов в ДНК. Ранее были получены данные, что при дифференцировке in vitro лим-фоб.ласгов или миобласгов также характерно кратковременное повьпиение разрывов в ДНК до индукции дифференцировки (лимфобласгы) или на ее заключительных этапах (миобласгы, перед образованием многоядерной мышечной клетки).

Итак, в процессе дифференцировки самых разнообразных клелок, на различных этапах дифференцировки наблюдается повышение разрывов в

ДНК. Совместно с разнообразными модификациями белков составляющих основу хроматинового "скелета", этот процесс, по видимому, лежит в основе регуляции дифференциальной экспрессии генов, необходимой для специализации клеток в во время дифференцировки. Тем не менее достаточно трудно сделать какой-либо вывод о значимости этого процесса для реализации программы дифференцировки. Большинство исследователей использовали в качестве модельных систем популяции высокоспециализированных клеток. Для этого типа дифференцировки, особенно при использовании лимфобла-стических клеток, характерны как апоптотические явления, так и самые разнообразные перестройки генов, необходимых для успешного синтеза антител и им подобных молекул. Разрывы в ДНК либо уже предсуществовали в покоящихся лимфобластах и затем репарировались, или возникали на заключительных этапах дифференцировки, в случае миобластов. Значение разрывов для дифференцировки оговаривалось лишь гипотетически. Тем более связать этот феномен с такими фундаментальными процессами как коммитирование и детерминация, на основании этих фактов, было очень трудно. Этим можно объяснить угасший интерес в 90-х годах к возникающим при дифференцировке разрывам в ДНК. Более перспективные результаты были получены на доимплантационных эмбрионах мыши. Но исследование этого процесса на эмбрионах затруднено, во-первых, сложностью работы с микрообьектом и малым количеством исследуемых эмбриональных клеток, а во-вторых, на этих этапах развития в бластомерах изменяется практически "все" и достаточно быстро. Поэтому, оценить насколько важен феномен увеличения разрывов в ДНК, и вообще важен ли он, также весьма трудно.

Развитие методов получения линий тюрипотенгных эмбриональных стволовых (ЭС или ES) клеток непосрсдсгвсшю из ранних эмбрионов мыши открыло новые экспериментальные подходы к изучению раннего развития млекопитающих (Evans and Kaufman, 1981). При дифференцировке in vitro ЭС клетки образуют разнообразные клеточные типы, а при инъекции в бласгоцисгу активно участвуют в формировании всех тканей эмбриона Таким образом, эмбриональные стволовые клетки являются как бы связующим звеном между in vitro и in vivo системами. ЭС клетки являются "точной ко-

пией" плюрипотентных клеток раннего эмбриона. Дифференцировка in vitro ЭС клеток полностью находится под контролем исследователя, тем более это касается дифференнировки клеток тератокарциномы (нет индуктора -нет дифференнировки). Кроме того, появляется возможность оперировать огромными по сравнению с ранними эмбрионами, выборками плюрипотентных клеюк. Поэтому, мы попытались проанализировать динамику уровне однонитевых разрывов в ДНК при дифференцировке ЭС клеток и клеток тератокарциномы. Нам удалось ускшовить, что однонитевые разры-зы в ДНК обязательны для начальных этапов дифференнировки эмбриональных клеток и являются необходимой характеристикой переходного этапа от недифференцированного состояния к сосшянию коммнтировапнпй дифференцировки.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение динамики однонтевых разрывов в ДНК при дифференцировке эмбриональных клеток мыши in vitro и in vivo.

Задачи работы: 1) Методом дифференциальной окраски сестринских хроматвд мстафазных хромосом эмбриональных клеток провести анализ динамики уровня хрома-тдных обменов при in vitro д ифференцировке 2) Методом нуклеоидной седиментации в i радиогге сахарозы проанализировать в градиенте распределите нуклеоидов полученных из недифференцированных эмбриональных клегок и клегок, находядвкся на различных эгапах дифференцировки in vitro. 3) Методом микрогеть-электрофореза ДНК из индивидуальных клегок проанализировать уровень однонитевых разрывов в ДНК в недифференцированных кдегках и эмбриональных клегках находящихся на различных эгапах дифференцировки in vitro. 4) Методом микрогель-эдекгрофореза ДНК проанализировать урова п, од! loi пггевых разрывов в ДНК из доимплантациопных эмбрионов мыши, а также в ДНК отдельных б.'1асгомеров из этих эмбрионов. 5) Методом ник-трансляции точек разрывов в ДНК из недифференцированных клегок и клеток находящихся на различных этапах дифференцировки проанализировать динамику появления однонитевых разрывов в фанскрипционно активной ДНК и "скелетной" ДНК ассоциированной с белками ядерного матрикса.

Научная новизна. Впервые показано, что через 2-3 деления после индукции дифференцировки эмбриональных клеток in vitro значительно повышается уровень сесг-

ринских хроматцлных обменов. Дальнейшая дифференцировка сопровождается снижением количества СХО до уровня, характерного для i ¡сдиффереш сиро ванных клеток.

Методом нуклеоидной седиментации впервые показано, что через 2-3 деления после начала днффера шировки существенно изменяется распределение нуклеовдов в градиенте сахарозы. Появляются нуклеоцды с низкой скоростью седиментации. Недифференцированные клетки и клетки, находящиеся на более поздних этапах дифференцировки, характеризуются только бысгроседимеширующими нуклеоцдами.

Методом микрогахь-электрофореза впервые продемонстрировано, что дифференцировка in vitro линий плюрипотснгаых эмбриональных клеток сопровождается кратковременным увеличением уровня однонигевых разрывов в ДНК Дальнейшая дифффен-цировка сопровождается снижением количества разрывов в ДНК до уровня, характерного для недифференцированных клеток.

Методом микрогель-алектрофореза показано, что при нормальном развитии до-имплангационных эмбрионов мыши некоторые стадии (морула, после компактизации и перед кавитацией, соответственно 3-5 и 4 дня развития) также характеризуются повышенным уровнем однонигевых разрывов в ДНК по сравнению с 2-4 клеточными эмбрионами и бласшцисгой (соответственно 2 и 5 дней развития). Данное явление продемонстрировано как на целых эмбрионах, так и на отдельных бластомерах, изолированных из эмбрионов.

При локализации разрывов в геноме бьшо показано, что через 2-3 мигогических деления разрывы возникают в сходном количестве как в транскрипционно активных петлях хроматина, так и в "скелетной" ДНК, ассоциированной с белками ядерного матрикса.

Апробация работы. Материалы диссергации были доложены и обсуждены на 4 международных и 1 отечественной конференциях. "First integrated European conference on progress in embryo technology and genetic engineering in cattle and sheep breeding", Krakow, Poland, 1994; "Keystone symposia on Inductive interactions during vertebrate embryogenesis" Hilton Heard, USA, 1996; "Molecular Genetics of the mouse (10th International workshop)" Belgium, 1996; "XIX Annual meeting of the society of biochemistiy and molecular biology of Chile" Pucon, Chile, 1996; 5 Всероссийская планово-отчетная конференция по направлению "Генная и клеточная инженерия", Москва, 1995

Публикации. По материалам диссергации опубликовано 10 работ

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение), заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 102 страницах. Содержит 12 рисунков и 1 таблиц}'. Список литературы содержит 125 работ отечественных и зарубежных авторов.

Материалы и методы

Б работе использовалась кулыура нушшгаленшых клеток терашкарциномы мыши OTI-9-63 для ко юрой хорошо ¡пучены усювия и в!хмшьые параметры дифференци-ровки in vitro при индуцированной дифференцировке ретиноевой кислотой (1 мм/мл) в висцеральную эндодерму. В pu6oic испап.зояятась линия "X" клеюк мыши IIM-1. Клеточная линия охарактеризована как гопорипогешная по способности образовывать химерных живолшл иосле нньекцки б ¡¡алоао GLiuaounciu.

Дифференциальную окраску хроматвд получали по описанной ранее методике (Patkin et al., 1994). Нуклеоидную седимешацию проводили по методике описанной в Bryant et al. (1984). Мдарогель-электрофорез ДНК из эмбриональных клеток проводили по методике Singh et al., 1988. Выделение ядерного матрикса проводилось по методике описанной в Luderus et al., (1992) с незначительными модификациями.

Для локализации эмбрионального антигена ТЕС-1 на поверхности клеток терато-каршпючы и ЕСМЛ-7 на поверхности ЭС клеток был использован метод предложенный Kemler et al.. 1981. Помимо этого. ЭС клетки тестировались на экспрессию антигена TROMA-l (Brulet et al., 1980).

Результаты и обсуждение Динамика уровня СХО при дифферемцировке клеток тсратокарцино-

мы in vitro

После культивирования клеток в течении 2-х клеточных циклов с BrdlJ (бром-дезоксиурвдином), одна из хроматвд содержит его в 2 раза больше. Дальнейшая окраска позволяет выявить это различие как дифференциальную окраску сестринских хромапи. Хорошо известно, что BrdU является ицдукюром СХО. В связи с этим было необходимо определить минимальную концентрацию BrdU, ниже которой не наблюдается дифференциальная окраска сестринских хроматид. Для тератокарциномных клеток такая концентрация равнялась 0.3 рМ. Как видно in табл. 1 при этой кондагграции среднее число СХО на одну метафазу, в недифференцированных клетках, было приблизительно равно 6. Отметим. 1по число СХО в недифференцированных клетках культуры OTF9-63 ре;що пре-

вышает 10 обменов на мегафазу, что характерно только для 4% клеточной популяции ( табл. 1, рис. 1а).

Таблищ 1. Динамика уровня сестринских хроматвдных обменов при дифференцировке клеток тератокарциномы

Время культиви- Количество Среднее число Стандартная Процент кле-

рования с рети- проанажзиров СХО на мегафа- ошибка ток с Юибо-

ноевой кислотой анныхметафаз зу (±) лссСХО

(Ч«си) на мегафазу

0 50 6,1 03 4

13 39 7,2 0,4 15

24 49 92 0,4 35

36 39 1$ 0,4 18

48 40 5,7 03 13

72 40 6,1 0,4 10

96 40 5,0 03 3

После 20-36 часов от момента индукции дифференцировки под влиянием региное-вой киототы наблюдается появление более высокого процента клеток (приблизительно 30%) с повышенным уровнем СХО (10 или более на мегафазу) (Таб.1, рис. 1в). В среднем уровень СХО на мегафазу повышается до 13Д, то есть приблизительно в 2 раза При дальнейшей дифференцировке, после 48 часов от момента индукции, наблюдается постепенное снижение числа обменов. Результатом этого, является воосгановление первоначального уровня, характерного для недифференцированных тератокарциномных клеток (таб.1, рис.1 г, д, е, ж).Так как продолжительность клеточного цикла тератокарциномных клеток составляет приблизительно 12-14 часов, то кратковременное повышение СХО при индуцированной дифференцировке клеток приходится на 2-3 деление после начала индукции, а затем постепенно затухает на 6-7 делении. Первоначально предполагалось, что именно плюрипотенгный статус клеток характеризуется повышенным уровнем СХО, поскольку источником ЭС клеток служили плюрипогентные клетки с повышенным уровнем хроматвдных обменов (бласгомеры 8-клегочного эмбриона или клетки ВКМ). Наши эксперименты несколько изменили эту точку зрения. Условия блокирующие спонтанную диффе-ренцировку in vitro, не способствуют сохранению повышенного числа СХО в недифференцированных клетках. Оказалось, что повышенный уровень характерен только для переходных этапов, а именно, для клеток вступающих в процесс д ифференцировки.

Вл1Дина,шкачастотьгсесгртсю1ххроют1тньрс обменов придифференцировке клеток тераткарциномы. а- недифференцированные слегки, б, а г, д е, ж - дифферениировка в течении ахжветсгвенно 12 24, 36, 48, 72и 96 ч. X - количество СХО на мегафазу, Z - количество проанализированных клеток.

Анализ распределения 14С-нуклеоидов после центрифугирования в

градиенте сахарозы

Считается, что в основе образования СХО лежат разрывы в ДНК (Painter, 1980)

Олни.м га давно используемых методов анализа количества разрывов в ДНК является метод njicieon'mofi седиментации (Bryant et al.. 1984). Нуклеоиды получают мягким лизисом клеток на поверхност и фадиента, в результате чего получается практически интаклная су-перспирализованная ДНК с небольшим количеством белков. Разнообразные нарушения в слруклуре ДНК приводят к "раепдегению" нити ДНК и, как следствие, снижению скорости седиментации в сахарозном градиенте. Для определения положения нуктеоидов в rpa-диепте. после центрифугирования, ДНК анализируемых клеток предварительно метится 1JC- niMiunHOM в течении 1-го клеточного цикла.

Распределение 'Омеченных нуклеоцдов после цаприфушрования в сахарозном фадиенте, было проанализировано в недифференцированной культуре тератокарцином-ньк клеток и в культуре клеток культивировавшейся с ретиноевой кислотой 24,72 и 168 часов (рис. 2). На гистограмме распределения 'С-мсченного нуклеоида недифференцированных клеток видно, что пик 'Орадиоактивносга расположен около дна ценфифужной проб(фки. Таким образом для недифференцированных клегок характерны нуклоокды с

высокой скоростью седиментации. Через 24 ч. индуцировшшой ретиноевой кислотой дифференцировки помимо бысгроседиментирующих нуклеовдов появляются нуклеоиды с низкой скоростью седиментации (фракции 11-13) в количестве равном или несколько превышающем более "тяжелые" (рис.26). То есть для этой стадии дифференцировки характерно наличие двух четко различимых пиков '^-радиоактивности. Через 72 ч. дифференцировки тератокарциномных клеток количество "легких" нуклеовдов уменьшается и кроме того, скорость их седиментации увеличивается захватывая теперь уже фракции 9-12 (рис.2в). Что касается 168 ч. дифференцировки, то в этом случае распределение Ю-нуклеовдов практически не отличается от таковых свойственных недифференцированным клеткам (рис.3г).

Иа2 Гистограммы распределения мС-нуютеощов клеюк тератокарциномы после центрифугирования в градиенте сахарозы. а- недифференцированные клетки, б, в, г-днффе-ренщтровка в течении соответственно 24, 72и 168ч.; д-недифференщтрованные клети после культивирования в течении 2-х клеточных циклов с 0.3/лМ ВкШ. Х-номср фракции, 1-дно центрифужной пробирки; Х- отношение радиоактивности во фракции к общей радиоактивности обнаруженной в пробирке.

Оказалось, что использованная минимальная концентрация ВгсЮ (0.3 рМ) не способствует индукции разрывов в недифференцированных клетках тератокарциномы. Результаты этого положительного контрольного опыта представлены на рис.2д.

х

Д 19

0,04 0

-4 0,28 7 0,24

I 0,2 ' 0,16 0,12 о,ое2

Сходная картина наблюдалась при спонтанной дифференцировке Е5 клеток. Для недифференцированных Е5 клеток также характерны нуклеоиды с высокой скоростью се-димапации (фракции 4-5). Через 2-3 суток спонтанной дифференцировки (отсутствие в культуратьной среде фактора 1ЛР -ингибитора дифференцировки Е5 клеток), появляются менее подвижные нуклеоиды (фракция I !-!2) (рис.Зб). В недифференцированной культуре (рис.За) медленная фракция полностью отсутствует. Последующая дифференниревка (рис.Зв, г) соггровожлае1ся неторопливым уменьшением количества медленно сшшеши-рутошда нуклеоцдов и таким же постепенным увеличением скорости их седиме1ттации.

ПшЗ Гистограммы раегчречечения 14С-щклеоилов ЭС клеток носче шпрмфутровшпш в ipiviuarrcaixapoihi. а- нелиф4креч/чцчро&1нччые клетки, б, в, ч-дчкфференщгровка в чечен/at соответственно Д 6 /ч 10 сутк. Х-номер фрак/tnu ¡-дно центрифужной тчробирки; Z- от-¡юччченне рц'икхиепшноепт во фракции к общей рилааисптност обнаруженной в нро-б\чрке.

Итак, при шщуцированной и спонтанной дифференцировке in vitro наблюдается кратковременное появление нуклеоцдов с низкой скоростью седимет-апии, которые впоследствии исчезают при более продолжятслы гой дифференцировке. Считается, что ско-росп. селима гглции непосредственно зависит от количества разрывов в Д1 iK (Far/aneh et al., 1982). Кратковременное появление медленно едима пирующих нуклеоцдов можно связать с появлением большого количества разрывов в ДНК дифференцирующихся эмбриональных клеток на первых этапах дифференцировки. Впрочем, в изменении конфор-мационных свойстз нуклеоцдов дифференцирующихся клеток домшшруюпмо ро.ль мо-глт игрпп. другие факторы, помимо разрывов в ДНК (измена а и белковет о состав;! хрома 1 ш ia, мо, и 1ф| 1кация белков и т.п.).

1

г

19

Анализ динамики уровня однонитевых разрывов в ДНК методом микрогель-электрофореза ДНК индивидуальных клеток

Более убедительные доказательства появления ДНК-разрывов при in vitro диффе-ренцировке эмбриональных клеток были получены методом микрогель-электрофореза индивидуальных клеток. Анализировалась индуцированная региноевой кислотой (1 мкг/мл) дифференцирозка клеток тератокарциномы и спонтанная ES клеток мыши. На рисунке 4а показана гистограмма распределения длин треков ДНК полученных после щелочного электрофореза (рН > 13.0) ДНК индивидуальных недифференцированных клеток тератокарциномы. Длины треков ДНК не превышают 10 мкм (длины треков ДНК включают в оебя границы ядра). Картина резко меняется через 24 часа культивирования с региноевой кислотой (рис.46). В этом случае длины треков увеличиваются в 3-4 раза Примечательно, что поете гамма-общения недифференцированных клеток (200 рад/мин) наблюдается тождественная картина, а именно сходное увеличение длин треков (рис.4г). Через 48 часов индуцированной дифференцировки количество длинных треков уменьшается (рис 4в). На более поздних этапах дифференцировки (96 часов, 4г) обнаруживается уменьшение длин тросов. Большинство из них не отличаются по своей длине от таковых наблюдаемых у недифференцированных тератокарциномных клеток.

При оценке динамики двуншевых разрывов в ДНК в процеоое диффере! щировки тератокарциномных клеток оказалось, что в процессе индуцированной дифференцировки уровень двушпевых разрывов не изменяется. Для этой цели использовался микрогель-элсктрофорсз ДНК в нейтральном буфере (рН 7.5). Как в недифференцированных клетках, так и в клетках находящихся на различных этапах дифференцировки длина трека ДНК, после электрофореза в нейтральном буфере, не менялась. Д анный опыт позволяет предположить, что в процессе дифференцировки увеличивается уровень именно однонитевых разрывов.

Анализ масштабов никирования ДНК при дифференцировке ES клеток проводал-ся по сходной схеме. Анализировались недифференцированные клетки и клетки находящиеся в условиях спонтанной дифференцировки различное время: от 2 до 12 суток. Для недифференцированных ES клеток характерны очень короткие треки ДНК (рис.5а). Через 2 суток спонтанной дифференцировки in vitro обнаруживается значительное увеличение дайн треков, причем как и в случае с клетками тератокарциномы, длинны увеличены у большей части популяции клеток (рис.5б). На 4 сутки дифференцировки доля клеток с

длиииыми треками уменьшается (рис.5в). Дальнейшая дафференцировка Е5 клеток сопровождается плавным уменьшением этой доли и собственно длин треков (рис.5г, д). Гио-тограммы распределения дайн тросов ДНК неотличимы от недифференцированных клеток на 10и 12сулк!1дафференцировки(рис.5е,ж).

Итак, суммируя полученные данные можно сказать, что и в случае индуцироЕашой рети-ноевой кислотой диффсрешцгровки клеток тератокарциномы и при спонтанной даффе-рснцировке ЕЗ клеток, на 2-3 делений обнаруживается значительное повышение числа клеток с длинными треками ДНК. Поскольку длина трека однозначно зависит, при использованных условиях щеточного электрофореза, только от количества однонитевых разрывов а ДНК (ОНР), то можно угаервдпъ 'гго на этом этапе дифференцировки происходит массовое никирование (образование однонитевых разрывов) ДНК. Данные по лученные методом нуклеовдной седиментации и при анализе динамики уровня СХО подтверждают этот вывод.

П*;4 Гнсю/ришы распродажная дат треков ДНК на (¡юрсчраммпх посте микрогель-злек1рофореза тщшщптьных клеток щхпокирияюмы. и - ¡¡^¡фференщнрованные клетки, 6, д г-дифференцнровка в течении соотвеюжнно 24,48 и 96 ч. ооотпетсптпю: л -нет(рференщтрованнь1етегтшпослеу<1блучатявдоэе200радШя. Х-длпна трека ДНК, мш„ 2-числоклеюк.

Анализ динамики возникновения однонитевых разрывов в ДНК

ранних предимплантационных эмбрионов мыши Д 'я анатша использовались двух-, четырех- восьмиклегочные зародыши мыши. а также эмбрионы, находящиеся на стадии ранней морулы (-16 клеток, сразу же после ком •

пакгизации), поздней морулы (более 32 клеток), ранней бласгоциеш (начало кавтации) и поздней бласгоцисгы (непосредственно перед имплантацией).

ДНК зародашей на стадиях 2-4 клеток представлена в основном высокомолекулярными фрагментами и, как следствие этого, после проведенного алектрофореза, длинных треков ДНК не наблюдается. Сходная картина наблюдается после электрофореза отдельных ядер бластомеров 2 и 4 клеточных эмбрионов. ДНК сосредоточена внутри контуров ядра и практически не наблюдается ее сдвига. Появление наиболее длинных треков ДНК, а значит и наибольшего количества разрывов ДНК, наблюдается на электрофоре-граммах 8-клегочных зародышей и эмбрионов, находящихся на стадии ранней морулы Причем, при сравнен™ результатов in vitro и in vivo отмечается сходство как по длине трека так и в размере вдра. То есть, можно предположить, что на данном этапе эмбриогенеза происходит сравнимое с in vitro массовое никирование ДНК. При дальнейшем развитой эмбрионов мыши происходит уменьшение длин треков до уровня 2-4 клеточных эмбрионов. ДНК при этом практически не мигрирует за пределы фиксированного в агарозе эмбриона. То есп> на этих этапах развития количество ОНР возвращается к уровню характерному 2-4 клеточным эмбрионам.

Ас5 Гистограммы распределения длин треков ДНК на форетраммах после микрогель-электрофореза индивидуальных ЭС клеток а- недифференцированные клетки, б, в, г, &е, ждифференцировка в течешт соответственно 2 4,6,8,10 и 12 суток. Х-длина трека ДНК, мкм: ¿-количество клеток.

На основании полученных результатов можно с уверенностью утверждать, что на

определенных этапах развития эмбриона уровень ОНР повышается существенным образом. Важно отмешть, что, как и в случае вышеупомянутой дафференцироькк in vitro ЭС и тератокарциномных клеток, уровень ОНР для ранних предамплшггщионных эмбрионов после кратковременного повышения на 8-клеточшй стадии и стадии морулы, возвращался при дальнейшем развитии к батальному уровню (в данном случае к уровню 2-4 клеточного зародыша).

Первичная локализация однонитевых разрывов в ДНК, возникающих на начальных этапах дифференцировки в ДНК клеток тератокарциномы

Логичным продолжением данного исследования является выделение и структурно-функциональная характеристика последовательностей ДНК подвергающихся кратковременному пикированию на ранних этапах дифференцировки. Для того, чтобы выявить локализацию ОНР в ДНК было проведен анализ количества ОНР в ДНК-белковом комплексе ядерного матрикса и транскрипционных петлях хроматина методом ник-трасляции сайтов никирования. После ник-трансляции, хроматин обрабатывали ресгрикгазами до полного пиролиза. Затем, после центрифугирования, осадок, оосгоящий из ДНК-белкового комплекса ядерного матрикса, отделили от супернатанта, представленного растворимой фракцией ДН К петель хроматина.

Исходя го полученных результатов через 24 часа после индукции дифференциров-ки происходит увеличение радиоактивности как во фракции супернатанта так и в осадке. По сравнению с недифференцированными ¡слетками, наблюдаемое увеличение включения метки не превышает 1.5-2 раз. Дальнейшая дифференцировка сопровождается уже знакомым, постепенным уменьшением количества метки в ДНК. Через 96 часов после индукции ,;кфференщфовки, количество включившейся мелки в обеих фракциях вегзвращается кба-зальному уровшо, характерному для 1 елт icjxjxrpei п uipouai п и>к клеток.

Полученный результат позволяет сделать предположение, что программируемые разрывы ДНК возникают приблизительно в равном количестве в транскрипционно активных и неактивных участии генома.

Иммуно-флуоресцентный анализ экспрессии эмбриональных антигенов при дифференцировке эмбриональных клеток

Для подтверждения плюрипогеншого статуса эмбриональных клеток был использован иммунсн|щуоресцешный анализ экспрессии эмбриональных антигенов. ТЕС-1 является аналогом антигена SSEA-1 давно и широко используемого для этой цели (Solter and Rnowles, 1978). В исходной популяции клеток OTF9-63 практически все клетки содержат эмбриональный антиген ТЕС-1. Через 24 часа культивирования с региноевой кислотой порядка 10% клеток перестают экспрессировать антиген. На 7-е сутки от момента индукции дифференцировки наблюдаются единичные клетки содержащие этот антиген. В совокупности, это является индикатором того, что популяция довольно синхронно прошла дифференцировку под действием региноевой кислоты.

Большей асинхронности можно ожидать при спонтанной дафференцировке ЭС клеток, поскольку сама их дафференцировка как в суспензионной культуре, так и в монослое характеризуется способностью дифференцироваться в различные типы клеток. Возможно именно злим объясняется то, что общая картина динамики никования ДНК при дафференцировке НМ-1 клеток сходна с таковой для клеток OTF9-63, но более растянута во времени (рис. 5). На это указывают также данные по динамике экспрессии антигенов ЕСМА-7 и TROMA-1 в дифференцирующихся НМ-1 клетках. ЕСМА-7 является антигеном экспрессирукицимся на поверхности недифференцированных, плюрипошпных клеток. Антиген TROMA-1 локализуется на промежуточных филаменгах цигоскелега и его экспрессия характерна только для дифференцированных клеток. У плюрипотентных клеток он не обнаруживается. 62% недифференцированных ЭС клеток экспрессируют ЕСМА-7 и 15Уо TROMA-1. Через 6 дней дифференцировки только 10% клеток по-прежнему экспрессируют на своей поверхности ЕСМА-7. Процент клеток с TROMA-1 увеличивается до 78% На основании этих данных можно полагать, что процесс спонтанной дифференцировки ЭС клеток менее синхронен по сравнению с дифферевдировкой клеток тератокарциномы, что несомненно и отразилось на не столь выраженном повышении уровня разрывов в ДНК при дифференцировке ЭС клеток.

Какими бы ни были причины феномена повышения нестабильности ДНК на начальных этапах дифференцировки in vitro и in vivo, проведение тестов, использованных в данной работе, может оказаться полезным для регистрации ранних проявлений начинающейся дифференцировки. Это особенно относится к ЭС клеткам, у которых

начальные этапы процесса дифференцировки иногда происходят в скрытой форме без видимых фенотипических преобразований. В дальнейшем представляется возможным провести клонирование сайтов, по которым происходит кратковременное накопление одно-цепочечных разрывов ДНК в ядерном матриксе и в петлях хроматина и таким образом, вплотную подойти к выявлению причины наблюдаемого явления. Что касается судьбы разрывов в ДНК, то можно предположить, что часть из них репарируегся, не оставляя следа в геноме. Не исключено, однако, что часть из них реализуется в качестве СХО, посредством которых возможно создание многообразия в популяции эмбриональных клеток по характеру мепиирования отдельных генов. Также, часть их них могут бьпъ ответственны за повышение частоты рекомбинации минисателлигных последователь! юсгей ДНК, отмеченного недавно в раннем развитии ('агвеп е* а)., 1994). В любом случае, реткое | ювыше-ние уровня одноннтевых разрывов в ДНК несомненно оставляет "следы" в геноме, которые могут сохранятся на протяжении всего развития.

Выводы

1. Разрывы в ДНК при дифференцировке эмбриональных клеток носят массовый характер, то есть затрагивают значительную часть генома.

2 Установлено, 'гго максимальное количество одноцепочечных разрывов ДНК наблюдается: для тератокарциномных клеток во время 2-3 митоза с начала индуцированной диф-ференщфовки; для эмбриональных стволовых клеток во время 2-5 митоза с начала спонтанной дифференцировки; для ранних предимплшггадаонных эмбрионов на восьмикле-точ! юй стадии и I ш стадии морулы.

3. Резкое повышение уровня разрывов в ДНК носит кратковремегашш, трагаггорный характер, то есть количество разрывов быстро уменьшается при дальнейшей дифференцировке.

4. Методом ник-транстяции точек разрывов в ДНК показано, что в процессе дифференцировки клеток тератокар! шномы одам шгевые разрывы возникают как в' 'скелетной" ДН К ядерного матрикса, так и в ДНК петель хроматина. Через 24 часа с начала дифференцировки наблюдаега оошее повышение уровня одноштгевтлх разрывов ДНК.

5. Запрограммированное массовое повышение разрывов ДНК совпадает с начальными процессами коммутирования и потерей гпторшсггпгшэстл и возможно «шляется ¡с'почезым событием в этих процессах.

Список работ опубликованных по теме диссертации

1 .Sukoyan MA., Golubitsa A.N., Zhelezova A X, Shilov A.G.,Vatolin S.Y., Maximovsky L.P., Andieeva LE, McWhir J., Pack S.D., Bayborodin S.I., Kericis A.Y., Kizilova H.I., and Serov OL. Isolation and cultivation of blastocyst derived stem cell lines from American mink (Mustek vison) //Mol. Reprod-Dev. 1992. V. 33. P. 418431.

2£ukoyan MA, Vatolin S.Y., Golubitsa AN., Zhelezova AI., Semenova LA, and Serov OL. Embryonic stem cells derived from morulae, inner cell mass and blastocysts in mink: comparisons of their pluripotencies // Mol. Reprod. Dev. 1993. V. 36. P. 148-158.

3.VatoIin S.Y., Zhdanova N.S., Sukoyan MA., Serov O.L. Sister chromatid exchanges as a sensible test for in vitro differentiation of mink stem cells // "Proceedings of the first integrated European conference on progress in embryo technology and genetic engineering in cattle and sheep breeding". Krakow, Poland, 1994. P. 283.

4Serov O.L., Sukoyan MA, Vatolin S.Y., Golubitsa AN., Zhelezova A.I. Establishment of high-pluripotcntial embryonic stem cell lines derived from morula, inner cell mass and blastocyst of American mink (Mustella vison). // "Proceedings of the first integrated European conference on progress in embryo technology and genctic engineering in cattle and sheep breeding". Krakow, Poland, 1994. P. 284.

5.Ватолин С.Ю., Сукоян MA, Жданова H.C., Серов ОЛ. Новые индикаторы диффе-ренцировки эмбриональных клвгок // Государственная научно- техническая программа России "Новые методы биоинженерии", 5 Всероссийская планово-епчегная конференция по направлению "Генная и клеточная инженерия". Москва. 1995. С. 111.

6.VatolinS.Y., Okhapkina EV., Zhdanova N5., Serov OL. Scheduled perturbation in DNA during in vitro differentiation of mouse embryonic cells // Keystone simposia on Inductive interactions during vertebrate embiyogenesis. Hilton Heard, USA, 1996. P.56.

7.Ватолин С JO., Охапкина E.B., Жданова H.C., Серов О JI. Запрограммированное ни-кирование ДНК на ранних стадиях дифференцировки эмбриональных клеток in vitro // Докл. Акад Наук России. 1996. Т. 348. С. 834-837.

8.VatolinS.Y., Okhapkina E.V., Matveeva N.M., Shilov A.G., Zhdanova N.S. and Serov OL. Programmed perturbation in DNA breaks during in vitro differentiation of murine pluripo-tential embiyonic cells // Molecular Genetics of the mouse (1 Oth International workshop) Belgium, 1996. P. 017.

9Serov OL., Vatolin S.Y., Okhapkina E.V., Matveeva N.M., Shilov A.G., Zhdanova N.S. Mass DNA breaks during in vitro differentiation of mouse embiyonic cells II VIIPABMB Congress, Chili 16-21,1996. P. 448.

10.Vatolin S.Y., Okhapkina E.V., Matveeva N.M., Shilov A.G., Baiborodin S.I., Phili-monenko V., Zhdanova N5. and Serov OL. Scheduled perturbation in DNA during in vitro differentiation of mouse embiycnierived cells//Mol. Reprod. Dev. I997. V47.P. l-lO.