Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и характеристика культур соматических клеток дрозофилы

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Получение и характеристика культур соматических клеток дрозофилы"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ГЕНЕТИКИ ИМ.Н.И.ВАВИЛОВА

/г/&

На правах рукописи

КАКПАКОВ ВИТАЛИЯ ТУЯКОВИЧ

УДК 575.155:576.316.352.2:577.17.05

ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА КУЛЬТУР СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК ДРОЗОФИЛЫ генетика — 03.00.15 цитология — 03.00.17

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва— 1989

Работа выполнена в лаборатории биохимической генетики животных Института молекулярной генетики АН СССР и в лаборатории молекулярной генетики высших организмов Института общей генетики им.Н.И.Вавилова АН СССР.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Е.В.Ананьев

Институт общей генетики им.Н.И. Вавилова АН СССР, г.Москва;

доктор биологических наук, профессор К.Г.Газарян

Институт молекулярной генетики АН СССР, г.Москва;

доктор биологических наук Г.П.Пинаев Институт цитологии АН СССР, г.Ленинград.

Ведущее учреждение: Институт биологии развития иы.Н.К.Кольцо

ва, г.Москва.

Защита состоится "_" _ 1989 г. в_час.

на заседании специализированного совета Д.002.49.01 при . Институте общей генетики им.Н.И.Вавилова АН СССР.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им.Н.И.Вавилова АН СССР.

Отзывы на автореферат в 2-х экземплярах, заверенные печать просит направлять по адресу: 117809, Москва, ГСП-1, В-333, ул.Губкина,3, Институт общей генетики им.Н.И.Вавилова АН СССР, специализированный Совет.

Автореферат разослан "_" _ 1989 г.

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат биологических наук

Г.Н.Полухина

ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Культуры клеток, тканей и органов дрозо-лы является новой модельной системой, имеющей исключительные зможности для изучения общебиологических, генетических, виру-логических, биотехнологических и других проблем. Получение ге-. тически маркированных клеток дрозофилы в культуре имеет перво-епенное значение для проведения генетических исследований на вом уровне, основываясь на всем богатстве наших знаний по ге-гике дрозофилы.

В настоящее время в мире получены около 100 пересеваемых ний эмбриональных клеток и 4 линии постэмбриональных клеток эзоф!лн. Это уже дает огромные возможности для изучения биоло-а и генетики новой модельной системы - культуру соматических зток беспозвоночных и использовать их в решении кардинальных эблем.науки, медицины и сельского хозяйства.

Цели и задачи исследований. Основной целью настоящего ис-эдования является, во-первых, получение первичных и длительно ресеваемых (постоянных) линий клеток дрозофилы, изучение зако-лерностей их роста, проявления генетических признаков на кле-шом уровне; изучение закономерностей изменчивости и стабиль-:ти генетических маркеров в процессе длительного культивирова-I клеток, органов и тканей дрозофилы в норме и под влиянием раэ-гных биологически активных веществ; во-вторых, создание питанных сред, позволявших выращивать в культуре клетки разных на-сомых и на основе таких сред отработать методику получения пер-шых и пересеваемых линий клеток насекомых; в-третьих, выявить Ценности гормональной регуляции активности генов культивируе-: клеток дрозофилы. В соответствии с этим в задачи наших последний входило:

1. Подобрать оптимальный состав питательных сред для куль-ирования клеток насекомых.

2. Получить первичные культуры эмбриональных клеток, имаги-ъных дисков и слюнных желез дрозофилы.

3. Получить и охарактеризовать пересеваемые линии эмбрио-ьных клеток дрозофилы.

4. Выявить генетические маркеры соматических клеток дрозо-ы в культуре.

5. Изучить ряд вопросов гормональной регуляции активности ов на моделях культур клеток, тканей и органов дрозофин.

Научная новизна работы. В работе получены новые экспериментальные данные, которые легли в основу оригинальных научных разработок и развития нового направления в биологических исследованиях.

Впервые проведен детальный анализ состава питательных сред для культивирования клеток насекомых, необходимых для развития нового направления - изучения проблем генетики и биологии на клеточном уровне в культуре vitro •

В результате сложных и многоэтапных исследований по подбору состава культуральных сред были созданы три варианта питательных сред для культивирования клеток насекомых: универсальная полусинтетическая среда KI11IO (C4S), позволявшая получать первичные культуры эмбриональных и постэмбриональных клеток дрозофилы и культивировать линии клеток разных видов насекомых; химически определенная среда С50, пригодная для изучения пищевых потребностей клеток и изучения активности генов при воздействии биологически активных веществ; среда С55 (КПП), - наиболее простая по составу и технологии приготовления, удобная для выращивания большой массь клеток насекомых,необходимых для биотехнологических работ. Отра-оотана простая методика получения первичных культур эмбриональных клеток, имагинальных дисков и слкнных желез дрозофилы. Получены [4 длительно пересеваемых линий эмориональных клеток мух дрозофи-т дикого и мутантного генотипа,среди них первая в мире линия' S7J25Д. Изучены биологические особенности пересеваемых линий клеток. Выявлен ряд стабильных генетических маркеров соматических ¡теток дрозофилы в культуре, неооходимых для проведения генетических исследований.

Предложен простой и высокоэффективный спосоо получения первичных культур эмбриональных клеток.

Впервые детально исследована проблема изменчивости и стабильности кариотипа на модели непрерывно культивируемые в течение 22 лет клеток линии о7з25Д.

Изучена последовательность процессов цжЫеренцировки эмбриональных клеток в культуре, зависимость этих процессов от состава питательных сред, гормонов и концентраций различных цосавок биологического происхождения. Изучены параметры цифЪеренцировки имагинальных jдисков и зависимость этих процессов от возраста личинок - доноров,концентрации гормона линьки насекомых-ждистэрона Ь ote;¡c.

Изучен спектр иуТоь толатенш» хисюсои олюннгх .челез цро-

•офилы в условиях культивирования в различных питательных средах, ^держащих специфические индукторы генной активности.

Выявлен ряд особенностей биологии культивируемых клеток дро-офилы: устойчивость к аналогам пуриновых оснований из-за отсут-твия активности фермента ГЕРТ, способность клеток образовывать од действием Кон А полиплоидные клетки, превыкание клеток к гор-ону и др.

Практические результаты работы. Разработанные рецепты и тех-ология приготовления питательных сред для культивирования клеток асекомых широко применяются в научно-исследовательских учрежде-иях страны и защищены авторскими свидетельствами СССР на изобре-егаш (А.с.СССР Л 118312 от 22.05.1985; А. с.СССР № 1238384 от 5.02.1983 г.).

На основе простого способа получения первичных и пересевае-ых линий клеток насекомых (А.о.СССР № 1322672 от 08.03.1987 г.) элучены 14 незавимых длительно пересеваемых линий эмбриональ-ах клеток дрозофилы, которые широко применяются в качестве объята исследований молекулярной биологии и генетики, клеточной юлогии и биотехнологии в институтах АН СССР и АМН СССР.

Способ определения гормона линьки насекомых экдистерона I.с.СССР Я 11330605 от 22.08.1984 г.) и препарата "Ьиоспон" (томительное решение за № 4338911/15 от 30.01.1989 г.) имеют приме-зние в практике пчеловодства для нормализации жизнеспособности злабленных пчёл.

Апробация работы: Материалы диссертации были доложены и обведены на: симпозиуме по биологии культур клеток (Ленинград, 369), IX Международной эмбриологической конференции (Москва, 369), П Всесоюзном биохимическом съезде (Ташкент, 1939), Всесо-шом симпозиуме "Механизм действия гормонов" (Ташкент, 1976),

УП, УШ Европейской конференции по экспериментальной генетике юзофилы (Югославия, 1979; Финляндия, 1981; Англия, 1983), У и [ Международной конференции по культуре клеток беспозвоночных Швейцария, 1979; Япония, 1987), УХ Всесоюзном совещании эмбрионов (Москва, 1981), I, П, Ш Всесоюзном совещании по генетике >матических клеток в культуре (Москва, 1981, 1983, 1986),Ш, II, съездах ВОИС им.Н.И.Вавилова (Ленинград, 1977; Кишинев, 1981; юква, 1987), Ш Всемирном конгрессе по культуре клеток (Япония, >85), УП и УШ рабочем совещании по экдизону (Венгрия, 1983; 'Г, 1987), 1У, У, У1 Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные меха-:хмц генетических процессов" (Москва, 1979. 1982,1987), Х1У Ев-

ропейской конференции по сравнительной эндокринологии (Австрия, 1988). Апробация диссертации проведена на семинаре "Общая и молекулярная генетика" Института общей генетики им.Н.И.Вавилова АН СССР 13 января 1988 г.

Публикация результатов. По материалам исследований, представленных в диссертации, опубликовано 90 работ, получено 5 авторских свидетельств СССР на изобретения.

Объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, списка сокращений, материалов и методов, 5 глав, общего заключения и основных выводов, списка использованной литературы. Материалы диссертащи изложены на 3 40 страницах машинописного текста и включает 42 таблицы и 44 рисунка. Список использованной литературы включает 512 публикаций, в том числе 400 на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА

Материалом для исследования служилц:

1. Культуры мух дрозофила D.melanogaster И D.virilis нормального и мутантного генотипа.

2. Первичные культуры эмбриональных клеток, имагинальных ди< ков, слюнных желез личинок позднего третьего возраста.

3. Пересеваемые линии эмбриональных клеток дрозофилы и ряда других насекомых, полученные как нами, так и другими исследователями, из коллекции ИОГен (табл.1).

4. В работе использованы среды CI-C56, приготовленные нами и другими исследователями. Состав прототилной питательной среды, созданной В.А.Гвоздевым (CI5) и экспериментальных сред" (С46, С50 и С55) представлен в таблице 2.

Методика размножения мух. Б каждом опыте по первичному культивированию эмбриональных клеток использовали 30-120 тысяч мух, выращенных на нестерильном корме (Какпаков, 1977). Перед сбором яиц в течение 1-3 дней мух содержали на свежем дрожжевом корме. 3aiei их переводили в колпак с марлевой крышкой. В этой сосуд помещали чашки Петри диаметром 100 мм с кормом и водой. Через 4г-6 часов корм с отложенными яйцами помещали при +4°С на 12-14 часов. В сосуд помещали новые чашки с кормом на 12 часов. Перед сбором яиц с поверхности корма кисточкой,чашки просматривали под микроскопом для определения наличия в них личинок. Хранение яиц при +4°С в течение 14 часов не влияло на жизнеспособность эмбрионов.

Таблица I

Линии клеток насекомых, использованных в работе.

6 Л I п

_1_

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8. 9.

0.

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8,

9.

0.

1.

2.

3.

4.

5.

Название линии

2

^Вид

Сокращение

4

Кариотипх

5

Авторы

6

57^25 ВпГБр

67025 ВтА

67о25 ВтТ 67^25 Ба ДФ 67¡25 от ДаТ

67^25 Зш Да 67^25 ш ДБС 37^25 втвсв 67^25 Вт Д 67^25 ВтН

37^25 Вт ТА1 67¿25 Вт ТА2 67д25 Вт ТАЗ 67325 Вт ТА4 67о25 Ш ТА5 67;) 25 Вт ТА6

70123

75е7 ус 1

75е7 ус 2 75е7 3

75е7 75е7 75е7 75е7

4

чц 5 ус в 7

75^ 23итре17

Вт

ДР

ДА

Т

ф

ДаТ Да

ДБС.(Ж)

всв Д

Н

ТА-1 ТА-2 ТА-3 ТА-4 ТА-5 ТА-6

70123

vgI

УёЗ vg4 vg5

vgЬ ЧЕЛ

Ре(17,

33,34)

2Х-(бА(дишюид)

гипотетраплоид

4Х+8А(тетрапл.) 2Х+4Аа

2Х+4А Т(Х:3)§

2Х+4А(диплоид)§ 2Х+4А (дишюид) § 2Х+4А§ 2Х+4А§ 2Х+4А§

4Х+6А§ ЗХ-ЙА3 6Х+7А§ 5Хч5А§ 5Х+8А§

ЗХ4йА(тетрапло-

ИД * А 2Х+4А*

Х0+4А§

Х0+4А§ ХУ+4А§

ХУ+4А;2Х+4А§ 2Х-ЙА

Х0+6А;2Хч6А ХУ46Л 2Х+4А рХ

Какпаков и др., 1969

Какпаков и др., 1971

Какпаков, 1982

Какпаков и др., 1971

ЗсЬпвайег , В1шпеп1;1№1

1978 Какракои^^

Н1п*. ,1980

3

П

И

II

и

(I

Eij 2 j 3 4 5 6

' 26, 753I2 Dm pe3 pe 3 2X+4A pX Hink ,1980

I 27. 85 ¿16 DmOrH OrR 2X+6A Какпаков и ДР., 1987

J 28. 85KI DmGBI — n— G-8X 2Х-ИЗА —

1 29. 79j7 On 3g Dv Dv ХУ+10А Брауде-Золо-та^ева и др.,

J 30. Kc Dm KoH.KcO X0+4A;2X+4A§ Schaleer , ■ Ohgnessian 1970

! SC- S=.2j S=3 S2, S3 гипотетраплоид Schneider, 197

, 32. DV D2 — u— DVD2 анеуплоиды Schneider , Blumental , 1978

J 33. & M2 GM2 гипотетраплоид Mosna , Doli: 19/

I 34' KUH DHI5.33 Dh Dii 15; Dh 33 циплоид Sondorraeijer et al. ,I98C

\ 35. Mos 20A1 .Aedes agyrti M циплоид: ХО+ЮА Varma , Pudney Д969

J 36. G2 Dm G2 гипотетраплоид Schneider, Blumental 1978

1---

Примечание: 67525Ä - линия диплоидных клеток дрозофилы, полученная 25 октября ( 3 ) 1967 г. (согласно номенклатуре, принятой для обозначения мутаций дрозофилы (ündsiey , Grell # 1968). х - указан кариотип модельного класса. § - не учитывались микрохромосомы 4-й пары. а - разрыв одной из аутосом в районе центромеры. ve- мутация - зачаточные крылья (vg - 2,67). ре - линия клеток с эу-гетерохроматиновой перестройкой,

м (I) Pgd-Kz /Др(1 1 ,f) R, сопровождающейся эффектом положения (ре - position effect ) для генов, приближенных к гетерохроматину. Da- сестринская сублиния,чувствительная к экдистерону. DaT (X; 3) - сестринская сублиния с транслокацаей Х-хромосомы на 3-ю аутосому, устойчивая к экдистерону. TA-I-TA-6 - клоны клеток, полученные из анеуплоидной сублинии 67 j25 Um ДА, которая произошла от родительской линии 67 j 25 to Др.

ЗС - клетки,способные расти на среде С46 _без сьшоротки.

ЗД - клетки, растущие кратковременно в среде С50 без сыворотки.

г - Drosoptiila virilis, Puffed-40.

i - Drosophila hydei.

в - Drosophila melanogaster.

) - KOMap Aedeo aSgyrti.

Таблица 2

Составы экспериментальных питательных сред для культивирования клеток дрозофилы (мг/ЮОО мл).

1

Компоненты Ссепы

CI5 С 46 С55 С50 '

I 2 3 4 5 i

4000 4000 4000 4000 1

аН2Р04.Н2 500 500 500 500 1

Ш 1560 1600 1600 1600 ,

а НС03 350 350 350 350 i

;аС12.6Н20 500 50 500 500 i

5С12.6Н20 2500 250 2500 2500 1

'рис основной 3000 3000 1000 1000 ¡

»еноловый красный 10 10 10 10 ,

'идролизат лактальбумина 17500 X 10000 X I

дрожжевой экстракт 1500 2000 750 - '

'люкоза (Д+ ) 5000 5000 5000 3000 ¡

!ахароза 5000 - - - ,

'лутатиоя 5 - - 1

[икотинамид адениндинук- 5

¡еотиц - — - _ l

[блочная кислота 670 - - _ 1

[нтарная кислота 60 - - - 1

ксуснокислый натрий 25 - - - .

,-Аминоки слоты:

Тирозин 940* 400 - 300 i

Цистеин ЖЯ-Н^О 1070* 250 250 100 1

Гистидан НС1-Н20 500* 400 + 400 ¡

Лейцин 2000* 250 + 300 ,

Аргинин НС1 200* 400 + 400 i

, I i -----1 2 3 4 5

1 Бета-аланин - - _ 500

. Епицин 560* 400 + 300

1 Сертн 840х" 350 + 300

I 4-оксипролин 270* 500 + 1500

1 Фенилаланин . 790* 200 + 200

! Лизин НИ 2000* 800 + 1000

1 Глуташновая кислота

(св. осн.) 2250* 800 + 800

1 Аспарагиновая кислота 3250* 250 + 300

1 Глутамин 1200* 600 + 1000

1 Триптофан 100-1220*' 100 100 100

1 Метионин 168* 500 + 500

, Треонин 970* 500 + 400

1 Изолейцин 1200* • 200 + 200 •

I Валин £20* 300 + 300

1 Альфа-аланин 377* • 500 + 500

1 Витамины:

' Пантотенат калыщя 0,02 0,02 0,02 4

' Холин хлорид 0,02 0,2 0,2 50

1 Фолиевая кислота 0,02 0,02 0,02 4

1 Инозит 0,02 0,02 0,02 7,2

I Ниавднамид 0,1 0,1 0,1 4

' Пиридоксин 0,02 0,02 0,02 4

Рибофлавин 0,02 0,02 0,02 0,4

1 Тиамин 0,02 0,02 0,02 4

1 Витамин 0,02 - - 4

1 Аскорбиновая кислота , 100 - - -

' Витамин А 0,2 - - -

, Парааминобензоная кислота 0,02 - - -

1 Биотин 0,02 - - -

I РН 7,2 7,2 7,2 6,9

1 Осмотическое давление 0,82°С 0,87°С 0,89°С

' (величина Д ) 0,87°'

Примечание: * - содержание в среде аминокислот рассчитано на ос

ковании данных по аминокислотному составу. ¿;актальбу мина (Гауровитц, 1955); "+" - концентрация компонен та такая же, как в среде CIS; х - вместо гидролиза та лактальбумина добавлялась смесь всех аминокисло1

- э -

етодика cciopa и стерилизации яиа. Смытые с поверхности корма йца помещает в шприц с капроновым фильтром. Яйца многократно ромывали водопроводной водой при интенсивном встряхивании, ля удаления хорионовой оболочки яйца помещали на 2-3 мин в 3% аствор гипохлорита натрия, затем отмывали по стандартной мето-йке (Хорикава, Фокс, 1964; Гвоздев, Какпаков, 1988). В резуль-ате сравнения существующих способов получения стерильных яиц ами предложено устройство для получения стерильных яиц и сус-ензни клеток (Гвоздев, Какпаков, 1X8). Отработана схема полу-ения стерильных яиц и аксенных (безмикробных) культур мух,не-бходимых .для культивирования имагинальных дисков и слюнных елез личинок третьего возраста.

пособ получения линий эмбриональных клеток дрозофилы. Для по-ышения эффективности способа получения линий эмбриональных леток дрозо(|шш наш предложена схема стерилизации яиц 60-80$ танолом в течение 5-15 мин и 90-9в%-ным этанолом 10-20 мин. йца гомогенизировали в среде без сыворотки и (фильтровали через теклянный фильтр № 2; клетки осаждали двухэтапным центрифуги-ованием при 800-1500 об/мин в течение 2-5 мин и при 1500-2000 б/мин в течение 3-5 мин. Полученные клетки культивировали в итательной среде, содержащей 10-15% эмбриональной телячьей сы~ оротки и 2-5% экстракта куколок насекомых. В среде С46 получе-ы линии эмбриональных клеток дрозофилы способные расти при поименном содержании эмбриональной телячьей сыворотки (Какпаков др., 1987).

Для изучения первичных культур и линий эмбриональных клеток розофилы использованы стандартные методы культур клеток и гене-ики соматических клеток.

етопика получения первичных культур целых имагинальных дисков, герильную линию мух получали по описанной ранее методике (Как-аков, 1977). Для изоляции имагинальных дисков, отмытые от кора личинка третьего возраста собирали в чашки Петри с 0,5 мл пи-ательной среды. С помощью вольфрамовых игл изолировали дисковые омплексы, переносили их с помощью силиконизированных пипеток в овую каплю среды, содержащую 10% ЭТС. Диски тщательно отмывали т гемолимфы и очищали от трахей г._ро::эсом в три последующие апли среды, затем .диски переносили в среду для культивирования, ценку выживаемости клеток проводили по пятибальной системе.

Получение клеточной суспензии иа имагинальных дисков провс дили по методике Garcia-Beiiido,Hothiger , 1378. В результате сравнения 12 способов культивирования клеток и фрагментов имаги нальных дисков выбран наиболее эффективный способ культивирования.

Первичное культивирование слккных желез D.virilis и анализ спектра пуфов проведены Е.В.Полуэктовой (Институт биологии развития им.Н.К.Кольцова АН СССР) с использованием среды химиче ски определенного состава С50.

Синтез ДНК в клетках определяли по ранее описанной метода (Тарантул и др., 1971; Кубанейшвили и др., 1983).

Анализ кариотипа проводили на высушенных препаратах метафе ных пластинок, приготовленных по общепринятой методике в нашей модификации (Гвоздев, Каклаков, 1968; Какпаков и др., 1969,1971

Активность ферментов определяли в неочищенных экстрактах i ранее описанному методу (Какпаков и др., 1969).

Антитела против клеток насекомых получали по общепринято? методике (Какпаков, 1Э57).

Реакцию аглютинации клеток антисыворотками и Кон А провода ли по общепринятым методикам.

Окраска хромосом азотнокислым серебром для выявления я.дрыч КОВОГО организатора проводили по методу Munke, Schmiadi (1279)

Изучение конверсии гормонов в культуре клеток проводили совместно с A.üubendorfer (Цюрихский университет, Швейцария) пс методике, описанной mbendorfer (Т986).

Анализ спектра аминокислот в питательных средах С45 и С50 после культивирования клеток дрозофилы проводили в автоматическом аминокислотном анализаторе "Бэкман-Мультихром" в совместнс работе с P.Borner (Цюрихский университет, Швейцария).

Все полученные количественные данные обрабатывали статиста чески по общепринятым методам.

ЗКСПШИШ'ГАЛЬНЛЯ ЧАСТЬ I. ПОДБОР ОПТИМАЛЬНОГО СОСТАВА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРВД Д):Н КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК НАСЕКОМЫХ.

Успехи получения линий клеток беспозвоночных связаны с ра: раооткой сред для их культивирования. Все известные среды (бодо ЬО вариантов) включают по меньшей мере одну добавку неопределе! ного состава в виде гемолимфы, гидролизата оелков или сыворотга кропи позвоночных кивотных.

- II -

Первая разработанная для эмбриональных клеток дрозофилы эда HI5 ( Horikawa , Pox , 1964) оказалась пригодной толь-даш получения первичных культур эмбриональных шеток дрозофи-. Первой удачной средой для получения линий клеток оказалась еда CI5, созданная В.А.Гвоздевым в 1967 году на основе данных

составу гемолимфы дрозофилы (Гвоздев, Какпаков, 1938). На ой среде нами была получена первая в мире пересеваемая линия бриональных клеток дрозофилы 67о25Д (Какпаков и др., 1969). ределекие параметров роста клеток дрозофилы на известных I-CI8) и экспериментальных средах (CI9-C56) позволил разрабо-гь оптимальные варианты питательных сред для культивирования эток насекомых и изучить возможности упрощения состава суще-вукщих сред. Показано, что клетки дрозофилы линии 67о25Д мог расти на разных средах, но в присутствии сыворотки крови звоночных животных. Наибольший урожай клеток был при культиви-вании в среде С39. Снижение осмотического давления среды в а раза (среда C4I) не влияло на рост клеток. Клетки дрозофилы гивно росли на полусинтетических питательных средах, содержа-х дрожжевой экстракт и чистке аминокислоты вместо гидролизата ктальбумина (среда Шнейдер, С46, С47). Клетки могли долго пас-роваться в среде ь-15 с сывороткой. Удаление сыворотки вкзы-ю гибель клеток. Показано, что удаление из среды С39 органи-ских кислот (среда С43) приводило к снижению урожая клеток в а раза. Однако при изготовлении больших количеств среды типа Э возникают трудности с очисткой органических кислот, поэтому кассовых культурах удобнее использовать более простые среды па G46 или G55.

В среде С46 активно росли клетки разных видов насекомых: эзофилы, комара, шелкопрядов и совок .

Отмечено, что по другому критерию оценки качества среды -эсобности клеток расти в редком засеве, лучшей оказалась сре-С46. Так клетки 67^25Д активнее росли в редком засеве в "бед-Я" среде С46, не содержащей аскорбиновую кислоту, глутатион, зтеин, ко энзим А, янтарную и гблочную кислот, ацетата натрия сахарозы, но в присутствии 5$ ЭТ'".

В других опытах показано, что клетки могли расти в редком ;еве в некоторых средах без обогащения их экстрактом куколок, гт клеток отмечен в средах С46 и С39 без экстракта, тогда как i их роста в других средах (С45 и С47) добавление экстракта

куколок было обязательным.

Опыты с клетками линии 67о25Д, растущими в среде С46, пока зали, что.стимуляция роста отмечается при засеве клеток в срЪлу содержащую 15% ЭТО, 10% экстракта куколок дрозофилы и 50% среды, кондиционированной гомологичной культурой клеток.

Разные культуры различались по эффективности посева при культивировании в обогащенных средах.

Получение сублиний клеток, пдособных расти в среде без сывороточных белков.

Путем .длительной многэтапной адаптации клеток линии 57о25Д нам удалось получить сублинию клеток 67з25ДБС, клетки которой могут расти в разных средах без сыворотки СС39, С42, С45; С46, С47, С48, С55, Шнейдер и L-I5).

Клетки другой линии 7Stj7 Dv 3g способны расти в среде С46 без сыворотки без предварительной длительной адаптации. То есть из 55 вариантов экспериментальных сред удалось выращивать эмбриональные клетки без добавления сыворотки только в средах C4S и С55, однако в присутствии гидролизата лактальбумина или дрожжевого экстракта. Целью дальнейших исследований были попытки приготовления среды, полностью лишенной неопределенных компонеь тов.

Химически определенные среды для культивирования клеток дрозофилы.

При разработке рецепта химически определенной питательной среды, в первую очередь, был выбран солевой раствор идя ее приготовления (табл.2).

Далее исследования проводились в двух направлениях: I) упрощение полусинтетической среды С55 'с целью замены дрожжевого экстракта и гидролизата лактальбумина определенными витаминами и ашнокислотами; 2) использование сред, богатых аминокислотами. и витаминами, применяемых дяя культивирования клеток млекопитающих, например,

На ? испытанных вариантах химически определенной среды (ХОС) на основе солевого состава среди 0Д9 (Х0С1-Х0С7/ клетки дрозофилы быстро погибали. Путем замены дрожжевого экстракта среды С40 набором витаминов по среде Дальбекко получена среда С50, в которой удалось наблюдать рост клеток субллнии оЪ 25ДБС в течение четырех пассажей без добавления сыворотки. В этол среде моуло изучать пищевке потребности клеток насекомых а пер-

ичное культивирование слюнных желез личинок дрозофилы.

тилизация аминокислот культивируемыми клетками дрозофилы.

Для выяснения утилизации аминокислот клетками дрозофилы ис-ользованы 3 линии клеток дрозофилы, растущих в среде С 46 без ызоротки. Показано, что через 8-10 дней культивирования клеток бщее содержание аминокислот в среде значительно не уменьшалось табл.3). Несмотря на активный рост клеток, утилизация аминокис-:от била низкой (5-25%).

Таблица 3

Утилизация аминокислот культивируемыми клетками D.melanogaster (67о25Д и 75323 ре34) и и^гШв (7^3 7Д у38 ) при росте в среде С46 без сыворотки в течение 8 дней.

Линия клеток

Количество аминокислот (в наномолях)

до культивирован!

АК

КП

после культивирования

АК

КП

7д25Д '5} 23 ре34 '9д7 Д уЗБ

3376,52+2,066 3376,52^,066 3375,52+2,066

;(99) ;(99) "(99)

2609,32±27,03 2521,40^31,66 3191,93^84,314

23 25 5

(99) (98) (96)

1римечание: АК - количество аминокислот в 40 мкл среды (в наномолях); % - процент утилизации от контроля; КП - коэффициент пролиферации клеток, в скобках указан процент живых клеток.

)днако не все аминокислоты среды используются одинаково. Так, при сультявировании клеток трёх разных линий в средах С46 и С50 вы-звлено, что из 20 аминокислот для роста необходимыми являются 15. 1ричем 9 аминокислот используются в меньшей степени (5-50%): зерин, валин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, фенилалашш, триптофан, аргинин. Содержание 5 аминокислот падает от 50 до 100%: дастеин, апарагиновая и глутаминовая кислоты, ^-аланин, пропин. Зодерхание же «¿-аланина увеличилось на 200%-, а тирозина на 20%. 5 отмечено изменения концентрации глутамина, глицина, метионина, греонина.

Таким образом, изучение параметров роста эмбриональных клеток дрозофилы в культуре, определение утилизации аминокислот поз-

во лило создать варианты питательных сред для клеток дрозофилы, пригодных для культивирования эмбриональных и постамбриональных клеток, тканей и органов дрозофилы.

2. ПЕРВИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ ШЕРИОНАЛЬНЫХ И ПОСТШЕРИОНАЛЬШХ КЛЕТОК

ДРОЗОФИЛЫ.

Выживаемость эксдлантированных эмбриональных клеток дрозофилы.

Оптимальной температурой для размножения клеток дрозофилы является +25-+28°С. При +30-+31°С, за исключением клеток терморезистентных мух, рост клеток прекращается. (См.главу 4).

Показано, что оптимальным материалом для получения суспензии клеток являются эмбрионы 4-18 час развития при +25°С. Клетки эмбрионов 2-2,5 час развития не выживают во всех использованных условиях культивирования. На выживаемость эмбриональных клеток существенно влияют агенты, используемые для снятия хорионо-вой оболочки и стерилизации яиц. Обычно использует гипохлорит натрия, сулему, бензалконий, этиловый спирт. Наиболее простым и высокоэффективным способом является обработка эмбрионов гипо-хлоритом натрия и этиловым спиртом.

Предложенный нами простой способ стерилизации яиц этанолом, позволяет получать живые клетки дрозофилы и комара, способные длительно расти в первичных культурах, а затем получать из них пересеваемые линии клеток. Этот способ защищен авторским свидетельством СССР на изобретение (Какпаков и др., 1987).

На выживаемость клеток в культуре влияет способ дезагрегации яиц. Наиболее эффективным является механический метод мягкого разрушения с использованием стеклянного гомогенизатора (Гвоздев, Какпаков, 1938).

Клетки дрозофилы в первичных культурах в течение четырех месяцев остаются жизнеспособными.

Рост и цшЮерениировка эмбриональных клеток дрозофилы при культивировании в разных средах.

Показана возможность роста и сходная последовательность дифференцировки клеток из 5-18 час яиц в первичной культуре в разных питательных средах: CI2-CI8, С39, С42, С45, С48 (КЖО), С47 и Шнейдер. Наиболее детально описана последовательность событий дифференцировки клеток, растущих в среде CI5.

Как правило, в течение первых 2-7 дней в стеклу прикреплялось около 50/2 клеток. Плававшие в среде клетки на более позд-

них сроках культивирования могли дифференцироваться, образовывая различные структуры и синтезируя пигмент. Поэтому наблюдения проводили за клетками, прикрепившимися к стеклу, и за клетками, ш-вавдими в толще среды.

Основные типы прикрепленных к субстрату эмбриональных клеток дрозос&илы в культуре.

Через 2 часа после эксплантации наблюдалось оседание клеток на субстрат и начало их агрегации. На 2-е сутки в части агрегатов отмечены активные сократительные движения и пульсация, по-видимому, за счет образования комплексов .дифференцированных машечных и нервных клеток. Эти изменения свидетельствуют о детерминированности дифференцировки меток бластем эмбрионов к моменту их эксплантации. Об активном метаболизме клеток свидетельствовало закисле-ние культуральной среды.

Через 5-10 дней наблюдали ряд морфологических типов клеток. Основную массу составляли округлые мелкие клетки .диаметром 5-10 мкм, образовывающие агрегаты активно делящихся клеток.

Небольшая часть клеток образовывала пучки фабробластов различных размеров с характерными плотными включениями в цитоплазме, окружающими ядро (макрофаги). Встречались одиночные многоядерные (до 5-10) фибробласты длиной 50-80 мкм и шириной 6-12 мкм (мио-циты), дегенерировавшие через 15-20 дней культивирования; крупные быстрэ.дегенериружщие многоядерные полигональные клетки диаметром 20-35 мкм, часто имеющие 2-4 ядра. Отмечены однослойные образования крупных одноядерных клеток диаметром 20-35 мкм, лежащих вплотную к агрегам из мелких клеток, способных к делению в течение 120 цней культивирования.

В результате активного митотического деления клеток агрегатов они увеличивались в размере и становились многослойными. На 3-10 день наблюдалось интенсивное образование фибробластов, а к 30-60 дням пояазлялись многослойные агрегаты, соединенные тяжами Ьибробластоподобных клеток.

Синтез ДНК в различных типах в культуре.

Через 2-4 .дня культивирования в небольших агрегатах равномерно распределялись клетки, включающие %-тишгиш. К 10-му дню )бнаруживались многочисленные меченые одноядерные фибробласты, жружающие агрегаты из мелки/ клеток, многоядерные фибробласты и срупные двуядерные полигональные клетки. В дальнейшем часть мел-

ких клеток в агрегатах отмирала, что приводило к неравномерному включению метки в агрегатах.

Таким образом, к концу срока наблюдения (120 дней) в первичной культуре эмбриональных клеток дрозофилы можно констатировать наличие четырех типов клеток, активно синтезирующих ДНК: а) мелкие клетки в агрегатах; б) $ибробластоподобные клетки; в) клетки с крупными ядрами, внутри которых, по-видимому, находятся "гигантские" меченые хромосомы; г) эпителиопоцобные клетки лежащие вне агрегатов из мелких клеток.

Определение митотического индекса (МИ) культур в процессе их культивирования показало, что в первые 7-10 .дней он составлял 0,1-0,5$, Следует отметить, что образование многослойных агрегатов из плотно лежащих мелких клеток затрудняло точное определен!] МИ. В последующе 20-30 дней МИ достигал до 0,6-3,8%, а затем,к 40-70 дню, падал цо 1,7-0,4$. Однако и на 40-120 дни сохранялись отдельные многослойные агрегаты интенсивно делящихся мелких, клеток.

Хромосомная характеристика клеток первичных культур.

Подсчет числа хромосом в первичных культурах показал, что i течение 120 дней культивирования клетки сохраняют диплоидное чис ло хромосом. Из 1410 проанализированных метафаз 10 клеток (0,7%) имели гаплоидный набор, 13 клеток (0,9%) - тетраплоидный набор хромосом. В клетках с 3,7 и 14-ю хромосомами не обнаружены хромосомы 4-й пары, что, вероятно, связано скорее с их очень мелкими размерами, а не с их элиминащей.

Таким образом, изучение процессов дифференцироки эмбрионаш ных клетокв первичной культуре в течение 120 дней культивирования позволило разделить их на 3 группы по типу дифференцировки: дифференцирующиеся и быстро достигающие терминальной дифференцировки; покоящиеся клетки, медленно достигающие дифференцировку i клетки неопределенного типа, даицие начало пересеваемым линиям клеток.

Исследование последовательности событий роста и .дифференцировки клеток в первичных культурах использовано нами, как тест, .для подбора оптимальных питательных сред. В этой системе были испытаны все 56 вариантов сред.

Из 307 опытов по первичному культивированию эмбриональных клеток 13 линий мух в 80% случаев (из 8027 культур удачных 6441 культура) удавалось получать .длительно переживающие культуры.

- 17 -

Получение пересеваемых линий клеток - явление достаточно дкое. Из 6441 первичной культуры были получены 14 линий пере-еваемнх клеток (0,2$). Показано, что способностью к неограпаянному росту обладают клетки, первично прикрепляющиеся к суб-¡трату, после длительного периода адаптации к условиям культу->ы.

Вагинальные диски. Имагинальные диски являются недифференцир- • анныма, но детерминированными зачатками, которые построены в гаде организованных пакетов клеток личинок некоторых голомета-галических насекомых (двукрылые, чешуекрылые). В процессе мета-юлизма они становятся имагинальными структурами (крылья, конеч-юсти, гениталии и др.).

Мц разрабатывали условия культивирования клеток имагиналь-шх дисков с целью создания тест-систем для оценки качества пи-;ательных сред для клеток насекомых и определения физиологически штимальных концентраций горюнов насекомых.

'ост и ди<М>еренцировка целых имагинальных дисков в разных условиях культивирования.

Через сутки после эксплантации целых глазо-антеннальных здсковых комплексов они теряли характерную для них морфологию [исчерченность), набухали, становились шаровидными. На более поздних сроках отмечали образование шаров клеток, происходящих аз дисков, что свидетельствовало о размножении клеток имагиналь-шх дисков.

Проведено 460 опытов по первичному культивированию целых »вагинальных дисков личинок 3-го возраста БгоэорЫДа те1апо-gaster и 1)говорЫ1а у1гШ8 . В этих опытах было испытано 20 вариантов питательных сред и 12 вариантов способов культивирования. Для культивирования целых имагинальных дисков лучше использовать среду типа С46, С47, а также ь-15, разработанную для выращивания клеток млекопитающих.

Рост колоний клеток в культуре фрагментов крьшовых имагинальных дисков дрозофилы.

Изучена .динамика дифференцировки клеток и образования колоний в эксплантатах фрагментов глазных и крыловых имагинальных дисков личинок позднего 3-его возраста и.у1гШвпри культивировании в среде С46 с 10% ЭТС и 2% экстракта мух.

Фрагменты крьшовых дисков в культуре слипались в большие конгломераты живых клеток, которые образовывали пузыристые раз-

растания.

Клеточные агрегаты, мигрировавшие из фрагментов имагиналь-ных дисков, образовывали плотные многослойные колонии размножающихся, округлых и полигональных клеток. При пересевах эти клетки образовывали рыхлый монослой.

При культивировании фрагментов крыловых и глазных дисков показано, что между 10 и 20 .днями культивирования число колоний увеличивается в 2 раза. К 30-му дню живыми оставались 80-90/5 клеток, но уже к 60-му .дню культуры погибали.

Результаты экспериментов по культивированию 3014 имагинальных дисков дрозофилы показали:

1) Наиболее удобным является метод культивирования фрагментов имагинальных .дисков в колонке-капле, описанной Дюбендорфером (1980).

2) Для успешного культивирования необходима тщательная отмывка имагиналышх да сков от гемолимфы и освобождение их от трахей.

3) В использованных условиях культивирования суспензия дисковых клеток погибает в течение первых двух недель, даже при самых мягких методах дезагрегации, в то время как эксплантированные целые диски могут переживать в культуре до четырех месяцев.

4) В культуре фрагментированных на 2гЗ части крыловых имагиналь-ных дисков дрозофилы активный рост клеток отмечается в зоне разреза.

5) Фрагменты крыловых имагинальных дисков при их культивировании в среде С47, содержащей 1Ь% неинактивированной ЭТО и 10$ гомологичного экстракта мух, образовывали шарн, заполненные раз-множащимися метками в течение 30 дной культивирования.

Таким образом, подобраны оптимальные условия для первичного культивирования целых имагинальных дисков и их фрагментов в течение 30 дней, что важно для изучения как вопросов роста постэмбрис нальных клеток, так и закономерностей дифференцировки определенных тканей в культуре.

Слюнные железы.

Культивирование слюнных жслоз личинок дрозо^шш позволяет изучать действие отдельных генов в специализированных органах. Хромосомы слюнных желез отвечают специфической реакцией на изменение условий внешней среди ооразованием строго определенного спектра пуфов. Ото позиолнеа визуально наолюц^ть за [иботои определенных генов в отпит на воздействия опологичооск ,1кт;ичшх по-ществ.

- 19 -

В совместных работах с Е.В.Полуэктовой были разработаны оп-шальные условия культивирования слюнных желез ü.vtrilia . По-азано, что удобным возрастом личинок - доноров слшных желез ушитая личинки 48-го часа 3-го возраста. Наибольшое сходство /■ффинга хромосом слшных желез в культуре с контролем наблюдать при культивировании желез в средах С46 и С50.

Число изменившихся районов в хромосомах слюнных желез при гльтивировании в среде С50 било больше, чем in vivo на всех срав-1ваемых сроках.

Характер отклонения пуффинга от стандарта зависел от продол-1тельности культивирования (рис.1). Структрные изменения хромо->м при культивировании желез in vitro совпадали с пуффингом n vivo в 21-м районе, при эшом в 18 районах они совпадали и ю срокампоявления с определенными часами развития личинки.

Эксплантация слюнных желез в среде С50 индуцирует появление ¡которых пуфов не функционирующих в норме, блокирует образова-ie ряда пуфов, сдвигает сроки функционирования и последователь->сть появления отдельных пуфов.

Проведенные исследования по первичному культивированию слюн-IX желез личинок позднего третьего возраста позволили определить юки переживания слюнных желез в питательной среде С50 и картину менчивости спектра пуфов.

ПЕРЕС ЕВ АЕШЕ ЛИНИИ ШБРИОНАЛЬШХ МЕТОК ДРОЗОФИЛЫ.

Получение пересеваемых линий клеток дрозофилы долгое время ¡тавалась нерешенной проблемой. Поэтому необходимо было разрабо-1-ть целый ряд методов получения и поддержания пересеваемых линий [еток. Нами получены 14 пересеваемых линий эмбриональных клеток roaophila melanogaater И Drosophila virilis , которые 0ТЛИ-

иотся друг от друга как по генотипу, так и по морфологии и ха-1ктеру роста клеток. В таблице I и 4 представлены некоторые ха-.ктеристики различных линий клеток насекомых.

Основные данные по характеристике пересеваемых in vitro юриональных клеток дрозофилы получены на клетках линии 6?) 25Д.

.пия 67.125Д.

Первая в мире.линия пересеваемых эмбриональных клеток 67j25Д лучена из 53-х дневной первичной культуры эмбриональных клеток rophila inelanoga3ter Oregon R-G в среде CI5, содержащей

i ЭТС и 2-IO/á экстракта куколок дрозофилы (Какпаков и др. ,1969).

0,5 2 4- б g '¿4 IT ---'-'-- 1-'-i '

50 5г уз

Рис.1. Динамика отклонений от стандартного спектра пуфов i разных сроках развития личинок 3-его возраста (I) D.virilis и при культивировании желез in vitro (: По оси абсцисс ~ сроки (в час) инкубации желез в среде С50 (I) и периоды развития личинок СП.); юоси ординат - число изменившихся районов.

- 21 -

После пересева первичной культуры появились очаги активно азмножавдихся клеток. Второй пассаж был проведен через 94 дня. :ерез 25 недель после эксплантации клетки пересевали каждые (-7 .дней в разведении 1:5-1:40. В настоящее время эта основная оцительская линия находится в криоконсервации. Из этой линии утем клонирования и адаптации к различным питательным средам олучены различные сублинии и клоны, обладающие определенными исловыми и структурными изменениями каротина. Одна из дочерних ублиний 67j25 Dm+D (рис.2) в дальнейшем обозначаемая 67л25Д рошла к сентябрю 1989 г. 1100 последовательных непрерывных еже-едельных пассажей, сохраняя основные параметры роста, характер-ые для культуры эмбриональных клеток. Из родительской линии был олучен ряд триллоидных, тетраплои.дных и анеуплоидных сублиний.

корость роста клеток.

Время удвоения популяции клеток 67j 25 в на 10-м пассаже в реде CI5, содержащей 15% ЗТС в экстракта куколок, составляло коло 24 час. При посеве клеток 7-8x10° клеток/мл максимальный ост наблюдали на 2-3 сутки культивирования. При этом матотиче-¡шй индекс был равен 5-10%.

В последущих пересевах при использовании среды С39, содер-ащей 10% ЭГС, клетки росли активно в первые 5 дней. К 7 дню

С

рътивирования максимальный урожай был равен, примерно, 25x10 теток/мл. При культивировании клеток в более бедной среде (G46) химически определенной среде С50 отмечается снижение как урожая хеток, так и скорости роста в поздних сроках культивирования зм.рис.3). За 7 дней культивирования клеток линии 67j25 fl в эеде С46 количество клеток увеличивалось в 15-30 раз. В другой ipoKo применяемой культуре клеток дрозофилы (s = 3) число кле-ж за 8-10 дней культивированных в среде Шнейдер, увеличивается 10-12 раз (Schneider , 1972).

Время генерации и длительность отдельных фаз клеточного цик-I клеток линии S7j 25 а , определенные по включению "%-тимидина i 200-м пассаже культивирования.равнялось приблизительно 2¿ час

- 3 час, s-13 час vi - Э часов). По данным Дольфини Dolfini et al., 1970) клетки линии Ксв среде Д20 имели время !нерании около 20 часов ( g¿ - 1,8 час, s - 10 час, 7,2 ica). To-есть, по соотношению отдельных периодов клеточного цик-I эти линии клеток дрозофилы близки между собой.

2 3

Ш 4

100

67j 2SS

Jäsr* 67j2SD£C fcu) 67JgSOc'B (cso)

- 2.00.

300

400

500 1000

1100

Число пассажей

Рис.2. Клоныи сублинии' Пересеваемой линии эмбриональных клетов дрозофилы.67125DmDp.

1. - диплоидная родительская линия 67j25 Dm+Bp

2. - анеуплоидная' сублиния 67j 25ДА и ее клоны; • 3. - тетраплоидная -сублиния 67j 25Т и ее клоны;

4. - диплоидная сублиния 67j25 Dm+D и ее варианты,

способные к росту в разных средах;

5. - клетки находятся в замороженном состоянии; В скобках - кариотип клеток;

X - половые , хромосомы; А - аутосомы; dr - разрыв ауяос< по центромере;Е sa - клетки чувствительные и ESr - уст< чивые к экдастерону (экдизону); Ad -сублиния клеток, растущих в среде без сыворотки; ДР - клетки растут в среде Д20; ДБС ( Übe или G) - клетки растут в среде 043 без сыворотки; ДСД - клетки растут в среде С50.

Таким образом, основные параметры роста, характерные для культуры эмбриональных клеток линии 67з25Д сохранялись на протяжении 22-х лет непрерывного культивирования.

Хромосомнад характеристика линий.

Детальный анализ караотипа культур клеток дрозофилы проведен, в основном, двумя грушами исследователей в Италии и Советском Союзе (Дольфини и др., 1970-1982; Какпаков и др., 1368-1983). Подробные сведения об изменении кариотипа в культивируемых клетках дрозофилы получены при анализе линии 67з 25Д и ее сублиний.

Первичная культура эмбриональных клеток дрозофшш, из которой впоследствии произошла линия 67а25Д, состояла из диплоидных клеток. К 70-му дню культивироЕашя их количество достигало 92$, 2% клеток имело гаплоидный а 6% - гило.щшлоидный набор хромосом.

Результаты длительного наблюдения за числом хромосом в линии представлены на рис.4. В течение первых 2,5 лет культура состояла преимущественно из диплоидных клеток. Затем появились анеуплоидные клетки, в основном, гипотетраплоидные (до 70%).

В 1981 году было отмечено резкое изменение структуры кариотипа: 84$ даллоидов содержали разрыв по центромере одной из ауто-сом 3-й пары; 12$ тетраплоидов имели такую же аберрацию; 4$ клеток были нормальными диплоидами. Длительное время в культуре преобладали тетраплоидные клетки с разрывом по центромере третьей пары (96%). Но в дальнейшем (через 47 пассажей) из культуры исчезли клетки с аберрантными хромосомами, а еще спустя 32 пассажа (950 пассаж с момента получения линии) нормальные диплоидные клетки практически вытеснили тетраплоидные и анеуплоидные. С этого времени, включая 1100-й пассаж культивирования, клетки линии 67325Д сохраняет диплоидный набор хромосом.

В целом, длительные наблюдения за состоянием кариотипа разных пересеваемых линий эмбриональных клеток дрозофилы позволяют сделать вывод об узкой изменчивости числа хромосом в клетке и о преимущественном сохранении околодиплоидного набора хромосом.

Биохимическая характеристика линий клеток дрозофилы.

В клетках линии 67о25Д содержится 1,9х10-12 г ДНК, 7хЮ~12 г РНК и бхЮ-'1-1 г белка. Такое содержание ДНК в 5 раз больше по сравнению с соматическими клетками дрозофилы в целом организма.

X 10^ клетох/ил

2'i -1

Рис.3. Кривая роста пересеваемой линии эмбриональных клеток 67д25Д, культивируемых в разных средах:

а - среда СЕ9, содержащая 10$ ЭТО; 6 - среда С46, содержащая 2-5$ ЭТС; в - среда С50, содержащая 5% ЭТС.

П68 1969 ige, 1П81 1983 1934 198б 1989 Рис.4. Изменчивость кариотипа клеток пересеваемой линии эмбриональных меток üroaophila raelanogaster 67j25I).

а - .диплоидные клетки; а - тетраплоидные клетки; И - анеушюидные клетки; щ - клетки с аберрацией хромосомы 3-й пары.

По вертикали - процент клеток данного типа; по горизонтали - год анализа.

Синтез белка в культуре клеток удается затормозить пуромща-гом (100 мкг на мл) на 85%. Пуромицин в диплоидной культуре клеток дрозофилы вызывает своеобразный эффект: через 6-12 час после íro добавления наблюдается увеличение числа клеток, однако их эазмеры уменьшаются. Поскольку в присутствии пуромицана не наб-[кдается заметного количества митотических фигур, можно предпола-'ать, что высокие концентрации пуромицина, по-видимому, вызывают »рагментащш клеток ( Tarantul et al. , 1971). Сходную картину [аблкдала Е.З.Кочиева при обработке клеток культуры 79f7Dv3g яклогексимидом (1-20 мкг на мл).

Специальный интерес представляет исследование в культуре леток дрозофилы синтеза специфических белков, контролируемых звестными генами. В различных пересеваемых линиях (67з25Д,ТА-1, А-2, ТА-3, ТД-4) клеток дрозофилы не било обнаружено активности ледуицих ферментов: алкоголь дегидрогеназы, -глицерофосфат егидрогеназы (йрштейн В.Я., 1971) и амилазы (Гвоздев и др., 981), которые, по данным ряда авторов, появляются (или активи-уются) на более поздних стадиях онтогенеза дрозофилы ( Horikawa ; al. , 1967; Wright , Shaw > 1970). Из трех изозимов гексо-аназы, выявленных у взрослых мух, в разных сублиниях клеток об-эруживается только один из них (Гвоздев и др., 1981). Следова-эльно, несмотря на .длительное культивирование эмбриональных кле-ак дрозофилы, целый ряд генов в этих клетках находится в блоки-эванном состоянии. Наш исследованы изменения и jß-эстераз ходе культивирования клеток линии 79f7 Dv3s методом электро-эреза в лолиакриламидном геле (Байканова и др., 1986). Показано, го изменения изозимов происходили постепенно в фазе активного зста клеток и в стационарной фазе. Они подобны изменениям спект-а эстераз in vivo при развитии от личиночной стадии к иыаги-шьной.

В экстрактах клеток диплоидной линии 67j 25Д, обладаниях 'неких кариотипом (XX), было обнаружено три изозима 6-фосфо-шконатдегщрогеназн (ФГД). Такой спектр устойчиво сохранялся i протяжении всего периода изучения культуры от 20 до 1000 -го 1С сажа. -

При увеличении дозы Х-хромосомы пропорционально увеличивайся и образование ФГД.

Таким образом, в пересеваемых линиях и сублиниях эмбрио-шьннх клеток дрозофила активно синтезируется ФГД, структурный 'ен которого сцеплен с полом. В .диплоидных клетках с женским

кариотипом обе хромосомы участвует в образовании ФГД, а тетра-плоидных вдвое больше ФГД, чем в диплоидных клетках (Каклаков j др., 1969).

Чувствительность культур клеток дрозофилы к вирусам.

В настоящее время известен целый ряд РНК-содержацах вирусов, которые реплицируются в клетках дрозофилы (Плюс, 1981).

Совместно с сотрудниками НИИмикробиологии и эпидемиологии им.Н.Ф.Гамалеи (Медведева Г.И., Beскина С.Г.)'-и НИИ вирусологи им.В.И.Ивановского АМН:СССР (Федорова и др., 1974) проведена серая экспериментов по изучению чувствительности клеток дрозофилы в культуре к разным группам вирусов: миксовкрусы (вирус истинной чумы кур - шташ Вейбридж, вирус ложной чумы кур, вирус гриппа - штамм А (НГА/wsK ); арбовирусы (вирус Тюлений, западного энцефаломиелита лошадей и весенне-летнего клещевого энцефалита); бакуловирусы (ВЯЛ американской белой бабочки, ВЯЛ капустной совка и шелкопряда). При заражении бакуловирусами на лвдалось резкое увеличение морфологии клеток и их вакуолизация но размножения вирусов не наблюдалось (Федорова и др., 1974). Микровирусы и арбовирусы не влияли на жизнеспособность клеток. Показана способность вируса клещевого энцефалита к длительному (до 50 дней)щрсистированию в пересеваемой линии эмбриональные клеток дрозофилы.

4. ЕЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ СОМАТИЧЕСКИХ МЕТОК ДРОЗОФИЛЫ IB VlTRí

Использование культивируемых in vi-tro клеток дрозофилы в генетических экспериментах требует выявления стабильных генет! ческих маркеров соматических клеток.

Хромосомные маркеры культивируемых клеток дрозосЕилы.

Клетки дрозофилы in vitro, как показали наши исследована могут быть маркированы по типу и числу половых хромосом (табл. Так, У-хромосома явилась маркером клеток двух изученных линий (75e7vg 7 и 73f7Df3g ). Путем клонирования получен ряд анеу] лоидных сублиний, характеризувдихся необычным соотношением чи ла половых хромосом и аутосом (Х:А). Увеличение числа Х-хромо-сом наблвдалось, как правило, в тришгоидных и гипотетраплоидн: сублиниях (ТА I - ТА 6). Соотношение Х:А во всех линиях сохра ется на протяжении длительного периода культивирования клеток

В клетках линий 75e vg I, Д I, КсЙ стабильно присутствов ла только одна Х-хромосома. Тетрашюидный вариант линии КеН -

Таблица 4

Хромосомные маркеры пересеваемых линий эмбриональных клеток дрозофилы.

Линия Гено- Модальный класс Структура кариотйпа клеток" модального класса

тип пассажа число ¡сле- п число хромосом дан- маркеры

хромо- ГОК ной пары

сом

¡7j25Dp 500 8 96 2 2 2 2 2 -

¡7j25D __ »1 1060 7 97 2 I 2 2 I Т(4;Ю

¡7j25№ 300 8 97 2 2 I 2 I 2хх

>7j25Da — 150 7 90 2 I 2 I 2 II(X; 3)

¡7325T и 200 14 95 4 2 4 4 2 21(4;Х)

>7325 TAI — 200 13 90 4 4 3 3 3 -

¡7325 TA2 __ tr 200 13 90 4 3 2 3 3 2х

¡7325 ТАЗ — 100 16 85 4 6 3 4 3 -

¡7325 TA5 100 17 90 4 5 4 4 4 -

¡7325 TA6 500 12 99 3 3 3 3 3 -

Г5323ра34 ЭП 300 9 95 2 2 2 2 2 (I)

?Ь&7 vgl 3K 200 7 97 2 I 2 2 2

75е7 vg5 и 200 8 96 2 2 2 2 2

75е7 vg7 200 8 90 2 2 2 2 2

35hl60rR х>У 91 8 50 2 2 2 - 2 ГГ(3;3)

35KI G81 ttm1" 22 8 90 2 2 2 12 I 1Др4

Kcl 10 8 96 2 2 2 2 2 -

KcH 200 6 95 2 I 2 2 I -

KcO 177 12 , 90 4 2 4 4 2 -

JM2 ПШ+ 22 16 • 85 4 4 4 3 2 2хх

% 300 7 50 2 I 2 I 2 II(Х;3)

Д2 Вт* 30 9 88 2 2 2 2 3 -

100 16 90 4 4 3 2 3 2Х,3ХХ

s=3 ya 200 13 90 4 2 4 4 3 -

79f7Dv3g Pu-4£ 300 II 96 2 2x5 - - I

ШИ №14 T>h+ 91 12 70 2 2x5 - - 2 хо

SUIí ШЗЗ Dk1" 30 12 60 '2 2x5 - - 2 ХУ

Примечание: Т - транслокация хромосом; - разрыв по центромере хромосомы 2 - пары с образованием двух телоцентриков ( ъ ); хх - разрыв по центромере хромосомы 3 - пары с образование,'.: 2-х телоцентриков; Др - дупликация; del - выпадение хромосомы; Dv - D.virilia Ш - i),hydei + - дикий тип.

сублиния КсО - отличнчается присутствием всего двух (вместо че-' тырех) Х-хромосом.

Для маркирования и идентификации половых хромосом в различных линиях может быть использована специфическая окраска районов ЯО половых хромосом с помощью азотнокислого серебра. У дрозофилы по районам ЯО идентифицированы половые хромосомы от сходных по форме и размеру аутосом, возникших в результате разрывов по центромере метацентриков с образованием телоцентрических хромосом.

Таким образом, в культивируемых in vitro клетках дрозофилы найдены перестроенные маркерные хромосомы, которые могут служить генетическими маркерами данной культуры. Линии клеток можно маркировать как по общему числу хромосом в клетке, так и по соотношению половых хромосом и аутосом. Характерная .для каждой линии структура кариотипа сохраняется при длительном культивировании клеток в стабильных условиях.

Биохимические маркеры пересеваемых линий клеток дрозофилы.

Резистентность к аналогам пуриновых оснований является широко используемым маркером в генетических исследованиях. При изучении чувствительности пересеваемых .диплоидных эмбриональных клеток дрозофилы к аналогам цуриновых оснований выявлено; линия клеток 67025Д обладает устойчивостью к 6-меркаптопурину и 8-азагуа-нину. Показано, что эти аналоги в высоких концентрациях (100 мкг/мл) существенно не влияют на рост клеток дрозофилы, тогда как клетки млекопитающих погибали при их концентрации на 1-2 порядка ниже. В то же время обнаружена чувствительность клеток .дрозофилы к аналогам аденина: 8-азааденину и 2,6-диаминопурину (Моисеенко, Какпаков, 1974).

При определении активности ферментов АФРТ и ШТ выявлено,'чт в клетках всех исследованных линий отсутствует активность энзима 1ФРТ при сохранении нормальной активности АФРТ, сравнимой с активностью в клетках китайского хомяка, определяемой при тех же условиях.

Таким образом, устойчивость клеток дрозофилы к 6-Ш и 8-AF объясняется отсутствием активности фермента ГФРТ. Чувствительность клеток к аналогам аденина коррелирует с наличием активности фермента АФРТ.

Отсутствие активности 1ФРТ показано также в экстрактах мух нескольких линий, что позволяет сделать заключение о природном характере резистентности клеток дрозофилы к аналогам гуанина

и гипоксантина. По нашим данным, клетки комара обладают такой же природной резистентностью к б-МП и 8-АГ.

В культурах клеток дрозофилы были обнаружены маркеры,отсутствующе в мухах. В линиях 67з 25Д и 79 г?ИуЗс выявлены два минорных гистоновых белка ДЗ и Д4, которые можно использовать как специаифческие маркеры этих клеток (Иванченко и др., 1985).

Особенность реакций клеток дрозофилы я комара в культуре на конканавалин А.

Показано, что добавление КонА в концентрации 100 мкг/мл вызывает агглютинацию клеток комара и дрозофилы в культуре, начиная с первых 10-30 ман. Через 24 ч агрегация возрастает. Агрегаты включают от 50 до 70% двуядерных и 1-35? трехядерных клеток. При этом цитоплазма клеток вакуолизируется, границы между клетками становятся нечеткими, в некоторых случаях наблюдается выталкивание ядра из клеток. Через 48 час при усилении вакуолизации клетки начинают гибнуть. Зависимость образования двуядерных клеток от концентрации Кон А показана на рис.5. Максимальное количество двуядерных клеток (около 80$) 'обнаруживается при добавлении 200 мкг/мл КонА. Однако показано, что эти клетки не способны к дальнейшему делению даже при удалении лектина. Количество образовавшихся двуядерных клеток зависит от концентрации клеток при посеве и типа культуры. Так, клетки сублинии Да образовывали в два раза меньше двуядерных клеток, чем клетки сублинии Да Т (X; 3), что мажет свидетельствовать о различии поверхностных свойств клеток этих сублиний.

Через 24 час после удаления лектина из среда при уменьшении числа двуядерных клеток отмечается резкое увеличение количества тетраплоидов. Это наводит на мысль, что в .двуядерных клетках происходят синхронные митозы (рис.о). При повторной обработке клеток КЗн А можно получить до 20% активно делящихся октаплоидных клеток.

Для выяснения вопроса образуются ли двуядерные клетки под действиеп Кон А в результате слияния клеток или же непосредственной причиной их образования является нарушение деления, сопровождающееся полашхоидизацией, одна часть популяции клеток была помечена с помощью %-зимидина. Обнаружено, что в 90$ случаев оба ядра в двуядерных клетках либо содержали метку, либо были не мечеными. Количество .двуядерных клеток, содержащих

Двуядерные клетки, %

90 -i

70 -

50 -

•г.О -

10

¡1

А fl

50

40 ?0

?л> 10

Л

о i ю so юо :юо

Кон А, мкг/мл

24 Ati 72 96 чпо \

Рис.5. Образование дву-ядерных клеток лиши G7¿ 25Д, при действии Кон А.

24 48 72 96 час

Рис.6. Полиплоидазация клеток дрозофилы (а) и комара (б) под действием. Кон А (100 .мкг/мл). I - .двуядерные клетки в контроле; 2 - тетраплоидные клетки в контроле; 3 - диплоиды в среде с Кон А; 4 - тетраплоиды в среде с Кон А. Стрелки указывают время добавления (вверх) и удаления (вниз) Кон А.

1дра на разных стадиях синтеза не превышало 10$. Если бы мече-ше и немеченые клетки одной сублиний сливались бы друг с дру-том с одинаковой вероятностью, то ядра в двуядерных клетках на >азных стадиях синтеза наблюдались бы в половине клеток. По-ви-симому, большинство полиплоидных клеток являются результатом поликариоцитоза , вызываемого нарушением деления клеток.

Таким образом, в результате воздействия Кон А на клетки [асекомых обнаружено новое явление, не характерное для клеток шекопитаищах - образование полиплоидных клеток. По-видимому, юлишюидизация клеток насекомых под действием Кон А происходит «opee за счет деления ядер без цитотомии, чем за счет слияния леток.

проявление маркеров термочувствительности и термоустойчивости

; первичной культуре.

Проявление признака термоустойчивости ( ) и термочувст-ительности ( ts ) изучено на клетках первичных культур эмбрио-OB мух TR-32 И ts403 .

Клетки из эмбрионов мух tr-32 имеют более высокую выживае-ость при повышении температуры культивирования до +32°С. То-есть, ризнак термоустойчивости мутаптных мух tr-32 проявляется в летках первичных культур. Анализ выживаемости и дифференцировки леток дрозофилы с мутациями ts и тн показывает, что оба эти ризнака проявляются в клетках in vitro и могут служить марке-ами соматических клеток дрозофилы в культуре.

цепленные с полом гоны как стабильные маркеры соматических деток црозоДшш in vitro .

для еценленних с иолом генов дрозофилы описано явление дозо-ой компенсации, суть которого состоит в т.лм, что транскрипцион-ая активность одной Х-хромосоки самид оказывается вдвое выше, см каждой из двух Х-хромосом самок. В результате этого происходит уравнение суммарной активности генов Х-хромосом у обоих плов мух. Однако, оставалось невыясненным, будет ли проявляться {«Гект компенсации дозы гена в клетках in vitro , имеющих одну дпе Х-хромосомы.

Для этого иослоцована активность фермента фумаразы (К4> .2.1.2), .ген l'uh которого локализован в Х-хромосоме (I - 19,9) хорошо ниншготся в лпчишеах и взрослых мухах ( Pipkin et al,, ./77).

Дяя изучения дозовой компенсации гена определяли активность фумаразы и вычисляли ее отношения к активности <*. -глицеро-фосфатдегидрогеназы, ген которого локализован в аутосоме.

Определение спектра изоферментов Рик и ©¿-СрйЬ при электрофорезе в полиакриламидном геле показало, что клетки линии Кс1 и КсН гомозиготны по изученным ферментам, тогда как клетки линий 67Я25Д и 67^25ДБС - гетерозиготны (выявляются по две полосы изо-зимов уиЬ и^-вр^ ).

Таблица 5

Отношение активности фумаразы к активности -глицеро-фосфатдегидрогеназы в пересеваемых линиях эмбриональных клеток дрозофилы.

| Линии клеток Пассажи Кариотип Х:А Активность йтоларазн

Активно ст ь о«. - ШДГ

1 КсН 80-100 IX : 2А 0,5 0,163+0,008

1 Кс1 1-10 2Х : 2А 1,0 0,175+0,011

' 6?д 25ДБС 180-200 2Х : 2А 1,0 0,151^0,002

1 6?з25Л 600-320 2Х : 2А 1,0 0,172+0,006

Анализ соотношений активности этих энзимов выявил, что сублиния КсН (Х:А = 0,5) и Кс1 (Х:А=1),- а таке 67^25ДБС и 67^25Д (Х:А=1) близки между собой (табл.5). Следовательно, в культуре клеток проявляется дозовая комплексация сцепленных с полом генов.

Такие культуры могут служить моделью дня изучения механизма дозовой компенсации на клеточном уровне.

5. ПРОБЛЕМА ГОРМОНАЛЬНОЙ РЕГУЛЯЦИЙ АКТИВНОСТИ ГЕНОВ В КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК, ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ ДРОЗОФИЛЫ.

У насекомых в процессах линьки и метаморфоза участвуют два основных гормона. На личиночной стадии развития сбалансированно . действуют экдизон и ювенильный гормон. Ивенильный гормон препятствует метаморфозу в целом, экднзон стимулирует линьку.

Культивирование различных клеток, тканей и органов насекомых, специфически реагирующих на гормоны, дает широкую возмож-

- зз-

юсть для изучения действия гормонов на процессы, связанные с меточным делением, дифференцировкой и регуляцией активности генов в клетках высших организмов.

Проведено сравнение ростингибирухщей активности природного гормона <х-экдизона,сго производным экдистероном (ЭС) и синтетическими аналогами: панастероном А и 2-дезокси--экдизоном.

^-Экдизон при концентрации 0,1-0,01 мкг/мл незначительно стимулировал рост клеток. Увеличение концентрации «.-экдизона Ю 5 мкг/мл приво.дит к подавлению роста клеток. Экдистерон в сонценграции 0,1 мкг/мл полностью подавлял рост клеток дрозофи-ш, так как и его синтетические аналоги панастерон А и дезок-зиэкдизон.

Показано, что рост ингибирующее действие ЗС обратимо и не зависит от присутствия в среде для культивирования сывороточных Зелков. Действие ЭС и ювенильного гормона (КГ1) видоспецифично.

Обнадежено, что клетки сублинии ДаТ (Х:3) более резистентны * ЭС, чем исходная линия 67125Д. Они могут расти в присутствии [000-кратной концентрации ЭС.

Таким образом, гормоны насекомых " <=с.-вкдизон, 2-дезокси- -эВдизон, ^-экдизон, панастерон А, ювенильные гормоны (КЛГ—I и иГ-2) специфически подавляют рост длительно пересеваемых дишгои.д-iыx эмбриональных клеток .дрозофилы.

Другой реакцией культур на добавление гормонов является из-.№нение морфологии клеток и характера роста культур.Под действи-зм ЭС клетки линии 67;)25Д не образовывали характерные .для этой 1инии многослойные агрегаты клеток. Через 48 час после добавления гормона к двухдневной культуре большая часть клеток теряла зпособность прикрепляться к суострату, хотя за указанный срок оост-ингибирукщее действие гормона не проявлялось. Эти наблюдения свидетельствуют об изменении адгезивных свойств клеток под влиянием ЭС.

Влияние ЭС на синтез макромолекул.

Несмотря на вариаоильность включения [леченых предшественников б разных опытах, выявляется слодуицая закономерность влияния гормона на синтез макромолекул: ингибированис синтеза РНК более, чем в два раза наблюдается через 24 час, а через 18 час - инги-бирование синтеза РНК выражено сальнее (в 2-5 раз).

Синтез ДНК не подавлялся через 24 час после добавления ЭС.

Однако, через 48 час, как правило, наблюдалось сильное его снижение. Таким образом, под влиянием 2С в первую очередь подавляется синтез РНК, а затем уже ДНК. Интенсивность включения урацила и ^С-лизина уменьшается значительно быстрее, чем замедляется рост клеток. Следовательно, включение этих меченых предшественников, по-видимому, отражает скорость новообразования РНК и белка.

Выявлено, что ЭС может действовать как на активно делящиеся клетки, так и на клетки, находящиеся в стадии покоя. То-асть для специфического действия гормона не обязателен синтез ДНК.

Влияние экдистерона на поверхностные свойства клеток дрозофилы.

Экдистерон (X) вызывал снижение способности клеток прикреп ляться к субстрату, что может свидетельствовать об изменении свойств их поверхностных мембран.

Так, через 48 час действия гормона способность клеток к агглютинации падала с 60-70% до 5-10%. При увеличении времени эксе зиции ЭС практически полностью подавлялась способность клеток к агглютинации.

Действие X на агглютинацию клеток специфично. Другие ингибиторы клеточного деления (оксимочевина, дбц-АМФ, 5-ВДУ), останавливающие рост клеток не влияли на их агглютинабильность.

Для выявления возможных изменений антигенов клеточной поверхности под действием X были получены антитела к антигенам клеток, обработанных ЭС.

В реакции преципитации с перекрестным истощением антител не удалось выявить антигенных различий клеток, обработанных и не о< работанных ЭС. В опытах по цитотоксическому действию изучаемых антисывороток на клетки разных ланий дрозофилы показано, что антисыворотки ЭСГ и ЭС+ в разведении 1:32 и 1:64 вызывают 100% табель клеток. Таким образом, индуцированные экдистероном изменения поверхности клеточной мембраны, по-видимому, не связаны с появлением новых антигенов. Скорее всего, при действии ЭС происходит перераспределение или усиление синтеза ранее существующих поверхностных белков.

Способность линий эмбриональных клеток к конверсии -экдизона в Й> -ЭКШ130Н (экдистерон).

По данным виьепйоггег (1986), линии клеток дрозофилы отличаются по способности к конверсии гормона. Так, из трех изучен-

- as -

i линий одна ( s =3) сально конвертировала °с-экдизон, вторая :) - незначительно, третья (Д2) - не проявляла конверсии.

В совместной работе с д-ром Dubendorfer изучена способ-;ть к конверсии гормона клеток трех полученных нами линий 'j 25Д, 75j23pe34, 79Щ v3g ) с использованием %- -экдизона. же 72-х час инкубации клеток с гормоном конверсии %- ос-экди-га в ^8-экдизон была обнаружена в клетках линии 79 £7 Uv3g .virilis). В линиях клеток D.melsnogaster (67325Д и ?5о23ре34) ютной конверсии об-экдизона не обнаружено (рис.7).

Таким образом, из изученных в мире в настоящее время шести ий, клетки двух ( s= 3 и 79f7 Dv3g ) культур оказались спо-1ными к конверсии аб-экдизона в .уЗ-экцизон, клетки 4-х линий конвертируют гормон.

гинальные диски как тест-система для определения оптимальной иологическоц концентрации экдистероидов.

Глазо-антеннальнке диски личинок D.meianogaster позднего тьего возраста могут дифференцироваться в среде G39 без гор-;а в течение 17 недель с образованием пигментированных глазных уктур. Добавление <х и .уб-экдизонов в определенных концент-иях вызывает полную дифференщровку клеток в течение 4-х дней, опление пигмента б глазном зачатке зависит от концентрации монов, от возраста личинок-доноров дисков и от качества хмельной среды. В предложенных условиях культивирования имаги-ьных .дисков выявлена концентрация гормона, вызывающая 100$ ференцировку клеток. Таким образом, культуры геногинальных ков могут быть использованы в качестве тест-системы .для выявил гормонов-экдистероидов в среде.

уквдя гормонами активности "ранних" пуфов в политенных мосомах слюнных желез Dro3ophila virilis in vitro .

Экдистерон специфически активирует определенные гены поли-ных хромосом слюнных желез двукрылых, что приводит к появле-целой серии "ранних" и "вторичных" пуфов. Образование пуфов ывает стимуляцию синтеза м-РНК, которая передает информацию ДНК к цитоплазме и приводит в действие механизм синтеза на осомах специфических белков, участвушцих в метаморфозе насе-нх (Филиппович, Кутузова, 1985).

Лолитеннне хромосомы слюнных желез дрозофилы представляют бную модель для изученияргуляции активности генов, индуви-

х 10

3

10 о

10 о 20 10

ев +

79*70435 ( 118 )

П 6?л25Г>

( 824)

7?о23т)е34 ( 303)

5 Ю 1Г ^

Фракции ТСХ

Е

Рис.7. Профили тонкослойных хроматограмм радиоактивных

экцистероидов, экстрагированных из культур клеток

ЫговорЬИа melanogaster (б7о25И, 75о23ре34).

и ВгозорЬИа ухгШа (7Э£7ИуЗе ) после инкуое

ции в среде с 0,1 мкКа ^Н-^-экщшоном в течение

72 час. В контроле хроматография меченого оС-экщг= на фирмн УЕ»/ без инкубации.

уцированный биологически активными веществами. Работу опреде-енного гена можно определить по спектру пуфов, которые пред-тавляют собой активно работающие (транскрибирующиеся) гены Beerman , 1955).

Закономерности экспрессии спектра пуфов при действии экзо-енного ЭС хорошо воспроизводятся в системе in vitro на изоли-ованных слкнных железах D.melanogaster ( Ashbtmier , 1972; iichards , 1980) и D.virilis (Полуэктова И др., 1980, 1985, 987, 1988). Большинство районов хромосом чувствительны как к С, так и юзенильному гормону. Но в зависимости от состава плательной среды может изменяться как экспрессия отдельных пу-ов, так И срок ИХ функционирования ( iishburner , Richards > 97о; Полуэктова и др., 1980).

Влияние экзогенных гормонов на экспрессию пуфов исследовали хромосомах слкнных желез личинок 48 ч 3-го возраста, D.virilis оскольку на этом сроке развития в личинках мало эндогенного ормона. Слюнные железы культивировали в среде С50 в течение О глин - 24 ч с добавлением гормонов. Показана чувствительность ромосом к ЭС в процессе развития личинок возрастает, а чувстви— ельность к У? понижается (Полуэктова и др., 1980). Однако зави-имость эта не простая^большинстве районов хромосом существует, чевидно, периодичность по чувствительности к гормонам, т.е.од-и районы чувствительны к гормональному воздействию на протяже-ии всего периода культивирования, другие - только на определен-ых сроках и третьи реагируют неоднократно (табл.6).

Таблица 6

Реакция пуфинга хромосом слюнных желез личинок D.virilis на добавление гормонов к среде С-50

Гормон

Число изменившихся районов

постоянная

Чувствительност

однократная

неоднократная

о

КГ

57

40

17,5 12,5

56,2 52,5

26,3 35,0

летальный анализ спектра пуфов политенных хромосом слюнных :слеа под действием ЭС, проведенный Е.В.Полуэктовой с соавтора-¡11, выявил 5 индикаторных районов хромосом Х-А-6, 2-Д-З, З-С-1, 5-5-2 и 4-С-4, которые реагируют образованием пуфов в первые

5 мин экспозиции с ЭС и достигает минимума через 60 мин в зависимости от концентрации гормона в среде. Эти данные позволили разработать простой способ определения ЭС в среде (А.с.СССР & 1130605 от 22.08.1984).

Выявлено, что порог чувствительности пуфов к X для слюнных желез личинок D.virilis в культуре 0,01 мкг/мл. Это на порядок выше ПО сравнению С D.melanogast.;r(Richards, 1980).

Таким образом, изучено действие экдистерона и »венильного гормона (ШГ-1) на культивируемые in vitro эмбриональные и постэмбрио-нальне клетки дрозофилы. Каждый тип культуры позволяет изучать определенный круг проблем. При использовании пересеваеыых линий эмбриональных клеток можно получить большую массу генетически однородных клеток, необходимых для молекулярно-генетического исследования действия гормонов насекомых. Культура целых имагинальных дисков позволяет изучать сложные этапы дифференцировки имагинальных структур нормальных и мутантных мух. Культуры слюнных желез позволяют визуально наблюдать транскрипцию генов в гормон-специфических районах политенных хромосом. Культура имагинальных дисков и слюнных желез могут служить экспресс тест-системами .для выявления экдистерона в среде.

ОБЩЕЕ ЗШ1ЛЕНИЕ

Культивирование соматических клеток дрозофилы развивается в настоящее время в двух направлениях: in vivo - путем регулярных перевивок кусочков имагинальных дисков в брюшную полость взрослых мух-самок и in vitro - размножение клеток в искусственных питательных средах.

Первая в мире .длительно пересеваемая линия эмбриональных клеток дрозофилы 67о25Д выделена наш в 1967 году на среде CIb, созданной В.А.Гвоздевым, на основе известных к тому времени данных о составе гемолимфы дрозофилы.

Большинство известных линий получены из эмбрионов мух дикого типа. Л'шь несколько выделены нами и другими исследователями из эмбрионов мутантных мух.

В результате преодоления больших трудностей при подборе питательных сред и расширения наших знаний об особенностях обмена у насекомых, в частности, у дрозофилы появляется перспектива получения линий клеток не только из эморионов мутантных мух, но и из имагинальных дисков личинок мух, несущих определенные мутации,

аз личинок известного пола и стадии онтогенеза. Уже получены первые линии пост эмбриональных клеток из ткани крыловых дааг-гинальных дисков бабочек ( Lynn et al., 1982) и дрозофилы ( vi et al. j 1987).

Первичные культуры имагинальных дисков представляют собой удобную модель для изучения процессов дифференцировки и трансдетерминации в определенных условиях культивирования. В наших опытах удалось изучить влияние возраста личинок-доноров, состава питательных сред, концентрации гормонов и ингибиторов синтеза макромолекул на процессы клеточного деления и дифференцировки имагинальных дисков дрозофилы в культуре. Чрезвычайный интерес представляет углубленное изучение транскрипционной активности (пуффинга) в политенных хромосомах слюнных желез, культивированных в химически определенной среде С50. Изучение спектра пуффов в клетках слюнных желез дало возможность сравнить экспрессию транскрипции при культивировании in vitro со спектром пуффинга в личинках соответствунцего возраста. Кроме того, на модели культуры клеток слшных желез можно изучать эффект различных гормонов насекомых на экспрессию специфических горионом -индуцированных пуфов.

Полученные нами 14 линий эмбриональных клеток Drosophila melanogaster И Drosophila virilis уже сейчас широко ИСПОЛЬзуются в генетических и биологических исследованиях.

Разработанные рецепты и технология приготовления трех типов питательна сред для культивирования клеток насекомых выгодно отличается от существующих в настоящее время в мире 50 вариантов сред .для культивирования клеток насекомых, которые содержат неопределенные добавки в виде гемолимфы, гидролизатов и сыворотки крови позвоночных животных.

Среда С46 является первой полусинтетической универсальной средой, пригодной для получения пересеваемых линий клеток дрозофилы и массового размножения клеток комаров, шелкопрядов, клещей и совоК. Ота среда оыла использована для изучения пищевых потребностей, так как в ней можно было .длительно выращивать клетки дрозофилы определенных линий в среде без добавления сыворотки. Показано, что активно растущие клетки утилизируют только 25% аминокислот среды. Это свидетельствует о большом избытке их в используемых средах, концентрация аминокислот в которых столь .че вгсока, как в гемолимфе насекомого. Можно предположить, что

гемолимфа, как запасающий орган, содержит большое количество аминокислот, чем необходимо для активного роста клеток.

Данные по росту клеток в 55 вариантах питательных сред и утилизации клетками дрозофилы 20-ти аминокислот позволяют считать возможным создание .для клеток насекомых дешевых и простых по составу и технологии приготовления питательных сред.

Наблюдение на протяжении 22-х лет за непрерывно пересеваемой линией клеток 67л25Д показало, что стабильность культуры по ряду параметров зависит от стандартности условий культивирования. ,г...

Культивирование клеток насекомых отличается методически от культивирования клеток млекопитающих и растений.

Показано, что клетки эмбрионов в определенных условиях способны к неограничному росту. Однако происхождение клеток, дающих начало пересеваемым линиям, остается невыясненным. Постэмбриональные клетки гшагинальных дисков личинок по нашим данным обладают, как правило, ограниченным сроком жизни. Клетки имаги-нальных .дисков строго детерминированы и при культивировании подвергаются терминальной стадии специализации.

Культуры постэмбриональных клеток дрозофилы (имагинальные диски, слюнные железы) позволяют изучать процессы дифференциров-ки клеток и транскрипционную активность генов в контролируемых условиях in vitro .

В линиях эмбриональных клеток дрозофилы выявлены ряд призн! ков, которые могут служить надежными фенотипическими маркерами клеток. Возможность получения большой массы таких клеток позволяет широко использовать эти культуры в молекулярно-генетически и биотехнологических исследованиях.

Таким образом, культуры эмбриональных и постэмбриональных клеток дрозофилы являются новой перспективной модельной системой для решения многих вопросов биологии и генетики клеток вые ших организмов.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

I. Введен новый объект для генетических и биологических ис следований - первичные культуры эмбриональных и постэмбриональных клеток и пересеваемые (постоянные) линии эмбриональных клеток дрозофилы.

- 41 -

2. Созданы варианты питательных сред .для культивирования хеток насекомых: С45 (КИНО) среда, пригодная для получения ший клеток дрозофилы и культивирования клеток разных видов асекомых; С50 - среда химически определенного состава; С55 Ш) - наиболее простая по составу и технологии приготовления эеда, удобная .для выращивания большой массы клеток насекомых, эобходимых для биотехпологических работ. На клетках линий 7д25Д и 79г7 №гЗв , растущих в среде без сывороточных белков, ¿явлено, что для активного роста клеток дрозофилы необходимы

5 аминокислот: аспарагиновая и глутаминовая кислоты, серин.про-ш, валин, цистеин, лейцин, лизин, гистидин, триптофан, изо-эйцин, фенилаланин, аргинин, бета-аланин и тирозин.

3. Разработаны некоторые методические подходы культивиро-1ния эмбриональных и постэмбриональных клеток дрозофилы, изу-зна последовательность дифференцировки клеток в культуре.

а) Изучены процессы дифференцировки эмбриональных клеток первичной культуре в течение 120 .дней культивирования. По ти-у дифференцировки эмбриональные клетки в культуре можно раздень на три группы: быстро .дифференцирующиеся и достигающие эрминальной стадии специализации (нервные, мышечные клетки, 1бтки жирового тела, хитин-синтезирунцие клетки, меланоциты и жрофагоподобные клетки); покоящиеся клетки, которые дифферен-груются медленно (клетки трахей, имагинальных .дисков и др.); сетки неопределенного типа, дающие начало пересеваемым линиям лбриональных клеток.

б) Подобраны оптимальные условия .для изучения процессов афференцировки постэмбриональных клеток (имагинальные диски и ионные-жёлезы личинок третьего возраста) дрозофилы. Выявлена

зследовательность дифференцировки целых глаза-антеннальных дис-зв и фрагментов крыловых дисков в первичной культуре.

4. Получены и охарактеризованы 14 независимых новых линий лбриональных клеток D,melanogasteщ В,у1гШа .

а) На линии клеток о7^25Д показана возможность .длительного эпрерывного в течение 22 лет культивирования клеток (1100 пасса-зй или около 4000 клеточных поколений) с сохранением морфологии, корости роста и околодиплоицного набора хромосом.

б) В пяти пересеваемых линиях эмбриональных клеток обнару-зно пятикратное увеличение содержания ДНК на клетку.

в) Цитогенетический анализ 36 линий и сублиний клеток выя-ил определенные изменения кариотипа, сохранявшиеся на протяне-

НИИ длительного культивирования клеток: элиминация одной из X-хромосом или У-хромосом с образованием ХО генотипа; увеличение количества Х-хромосом без увеличения числа аутосом; транслокации типа Т(Х; 4) и Т(Х;3);увеличение гетерохроматинового при-центромерного района Х-хромосомы; присутствие анеуплоидных клеток с необычным соотношением половых хромосом и аутосом.

г) Показано проявление и длительпое сохранение в клетках дрозофилы в культуре эффекта дозовой компенсации сцепленного с Х-хромосомой гена, контролирувдего синтез фумарази.

5. Выявлены стабильныэ генетические маркеры клеток длитель но пересеваемых линий, позволящие использовать культуры клеток дрозофилы в генетических экспериментах.

а) Хромосомные маркеры; б) Спектр изозимов (фумараза, эстераза ,<ч-глицерофосфатдегидрогеназа, фосфоглюконатдегидрогена-за, гексокиназа), активность и алектрофоретическая подвижность которых зависит от стадии развития организма в онтогенезе; в) Экспрессия в клетках в культуре признаков термочувствительности и термоустойчивости; г) Высокая природная резистентность клеток насекомых к аналогам пуриновых оснований 6-меркаптопури-ну и 8-азагуанину, связанная с отсутствием в клетках дрозофилы и комара активности фермента гуанинфосфорибозилтрансферазы.

0. Выявлена особенность реакций клеток насекомых в культур на действие лектина Кон А. В культурах клеток дрозофилы и комар Кон А вызывает специфическую агглютинацию, не влияя на деление ядра и обратимо ингибируя цитотомию клеток. Эта реакция клеток насекомых на добавление лектина макет быть использована для направленной индукции полиплоидии.

7. Исследована реакция культур эмбриональных клеток, има-гинальных дисков и слюнных желез дрозофилы па действие гормонов насекомых.

а) На пересеваемых линиях эмбриональных клеток показана за висимость роста клеток от концентрации экдасторона; утрата чувствительности клеток к гормону при длительном воздействии; независимость чувствительности клеток к экдистерону от их плоид-ности; экдистерон подавляет синтез суммарной РНК и ДНК, но не влият на валовый синтез белков; зкдистерон и его аналоги вызыва ют цифференцировку клеток при отсутствии синтеза ДНК.

б) При изучении гормональной регуляции дифференцировки кле ток имагинальных дисков дрозофилы в культуре выявлено, что способность имагинальных .дисков в гормон-ицдуцированной дифференци

овке зависит от возраста личинок-доноров дисков; полнота и ско-ость дифференцировки клеток глазо-антеннальных имагинальных дис-ов по образоватш пигментов зависит от концентрации гормона.

в) Исследование влияния гормонов насекомых на пуффинг полненных хромосом слюнных желез личинок 48 ч третьего возраста i.virilis показало, что экспрессия пуффинга под действием гормо-ов'зависит от среды культивирования. Наибольшее сходство карти-ы пуффинга in vitro со спектром пуфов у личинок соответствукще-о возраста in vivcHa6mfla™ при культивировании слюнных желез в имически определенной среде С50. Выявлены пять "ранних" пуфов, ыстро и специфично реагирующих на добавление экдистерона в сре-у. Специфическая реакция политенных хромосом слюнных желез i.virilis в культура, также как дифференцировка глазных имаги-альных .дисков D.nelanoganterMOKeT быть использована в качестве кспресс-теста для определения физиологически оптимальных концент-аций гормона в культуральной среде.

Искренне благодарю своих соавторов В.А.Гвоздева, Л.Г.Полу-арову, Л.М.Муховатову, Е.В.Полуэктову, В.Г.Митрофанова, .Г.Шуппе, Т.Я. Брауде-Золотареву, Е.В.Моисеенко, Е.В.Метаков-кого, М.Б.Евгеньева, Л.И.Корочкина, М.Ш.Кубанейшвили, '.М.Бияшеву, И.Ф.Мишунина, И.Ф.Иимулева, Е.С.Беляеву, а также сотрудников лаборатории биохимической генетики животных и мо-:екулярной генетики высших организмов за доброжелательность и гамощь в работе.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ,ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТИЛЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гвоздев В.А. .Какпаков В.Т. Культура эмбриональных клеток

Drosophila melanogaater in vitro.-Генетика,1968,т.4,JS2,с.129-147.

2. Gvozdev V.A..Kakpakov V.T. The medium for cell culture of Droso^ . phila melanogaater in vitro.-DIS(USA),1968,v.43,p.200.

3. Какпаков В.Т..Гвоздев В.А.,Платова Т.П..Полукарова Л.Г. Линии

эмбриональных клеток Drosophila melanogaater, пересеваемые in vitro.- Генетика ,1969, т. 5, И2. с. 67-75.

4. Какпаков В.А..Гвоздев В.А..Полукарова Л.Г..Бирштейн В.Я.,Платова Т.П. Культура эмбриональных клеток дрозофилы.Характер роста,кариотип и функционирование сцепленных с полом генов,- В сб: Структура и генетические функции биополимеров.1Л:1969,т.1,с.61-

. 77.

5. Какпаков В.Т.,Гвоздев В.А.,Бирштейн В.Я..Полукарова Л.Г.Фосфо-гликонатдегидрогеназа в пересеваемых сублиниях клеток дрозофиль

in vitro .-Второй Всесоюзный биохимический съезд.Ташкент,1969, с. 69.

6. Gvozdev V.A..Kakpakov V.T. Establishment of female embryonic ce] sublines of Drosophila melanogaater in vitro.-DIS (USA),1970,

v.45, p.110.

7. Гвоздев B.A.,Бирштейн В.Я..Какпаков В.Т..Полукарова Л.Г..Файзу-ллин Л.3..Герасимова Т.Н. Генная регуляция образования дегидро-геяаз глшсозо-б-фосфата и 6-®осфоглюкояата у Drosophila melano-gaster in vitro.-Отчетная конй.ШО ИАЭ им .И .В¿Курчатова.1.1:1970, с. 286-299.

8. Гвоздев В.А..Бирштейн В.Я., Какпаков В.Т..Полукарова Л.Г.Прояв-ление сцепленного с полом гена в пересеваемых сублиниях эмбриональных клеток дрозофилы.-Онтогенез, 1971,т.2,iS3,c.304-310..

9. Tarantul V.Z.,Kakpakov V.Т.,Gvozdev V.A. Protein,ENA and DNA synthesis in the established of diploid cells of Drosophila me-lanogaster in vitro.-DIS (USA),1971,v.47,p.76.

10. Гвоздев B.A..Какпаков B.T..Муховатова Л.Ы..Полукарова Л.Г..Тарантул В.З. Влияние экдистерона на рост клеток ."и синтез макромолекул в пересеваемых.культурах эмбриональных клеток дрозофил лн.-Онтогенез,1974,т.5,с.33-42.

Г. Какпаков В.Т..Шамшурин А.А.,Спектор В.И.,Мунтян Г.В.Подавление роста длительно пересеваемых линий эмбриональных клеток дрозофилы под действием гормонов насекомых и циклического АМФ.-Изв. АН Молд. ССР, с ер. биол. хим • наук. 1974 ,йЗ. с. 76-8I-.

I. Какпаков В.Т.,Гвоздев В.А. Культивирование клеток и тканей насекомых.-В кн:Нотоды биологии развития.М:Наука,1974, с.290-195.

3. Федорова Г.И.,Подчерняева Р.Я.,Амченкова А.М..Никитина Н.И., Блинова В.К.-,Веселовская О .В. .Какпаков В.Т .Изучение взаимодействия вирусов позвоночных и вирусов полиэдроза насекомых с пересеваемыми диплоидными эмбриональными клетками дрозофилы.-Цитология и генетика,1974,т.8,Js5, с.396-399.

4. Какпаков В.Т..Полукарова Л.Г.Полиплоидизация и слияние клеток насекомых под влиянием Конканавалина А.-ДАН СССР,1975,т.223,

. И,с. 209-212.

5. Моисеенко Е.В..Какпаков В.Т. О природной резистентности клеток дрозофилы к 6-меркаптопурину и 8-азагуанину;-Генетика,1975,т.П Ш, с.160-162.

5. Муховатова 1.1.1. .Какпаков В.Т.Влияние »¿и ¿-экдизона на дифферен-цировку имагинальных дисков дрозофилы,культивируемых ¿д vitr.-Онтогене з.1975.т.6,Ж.с.80-87.

7. Полукарова I.Г..Какпаков В.Т.,Гвоздев В.А.Хромосомная изменчивость в пересеваемых культурах эмбриональных клеток дрозофилы.-Генетика, 1975, т .II, JS5 ,с .46-50.

3. Kakpakov V.Т..Polukarova L.G.Effect of Concanavalin A on establi shed cultures of Drosophila and Mosquito diploid embryonic cells DIS (USA),1977,v.52,p.26.

). Kakpakov V.T.,Polukarova L.G.,Cherdanzeva E.M.Some new embryonic cell lines in Drosophila melanogaster.-DIS(USA),1977,v.52,p.110.

1. Какпаков В.Т.Генетика соматических клеток дрозофилЙ.-Труды 17 Всесоюзн.симп.Молекулярные механизмы генетических процессов.М: Наука,1979, с.16-17.

!. Kakpakov V.Т.Somatic cell genetics in Drosophila cell cultures. V International Conf.in Invertebrate tissue culture.Rigi,Swit-serland,1979t p.32a.

2. Kakpakov V.T.Stability of genetic marcers in Drosophila cell cultures.-VI EDRC.Kupari,Yugoslavia,1979,p.52.

3. Пслуэктова Е.В..Митрофанов В.Г..Какпаков В.Т. Действие гормонов насекомых на пуффинг хромосом слюнных желез Drosphila virilis Sturt., культивируемых in vitro Сообщение I. Изменение пуффин-га при культивировании желез в среде С50.-Онтогенез,1980,т.II, JS2, с. 175-180.

24. Какпаков В.Т.,Шуппе Н.Г. Дифференцировка эмбриональных и пост эмбриональных клеток дрозофилы в культуре.-Тезисы У1 Всесоюзн. совещания эмбриологовЛЛ:Наука,198Г,с.75.

25. Nikoshkov А.В..Kakpakov V.Т.Dosage compensation of sex-linked genes in established cell lines of Drosophila melanogaster.-DXS(USA),1981iv.56,p. 103-104.

26. Какпаков B.T. .Кубанейшвшш М.Ш,.Брауде-Золотарева Т.Я.,Ялакас М.Э.,Шуппе Н.Г.Генетические исследования на культурах клеток насекомых.-Материалы I Всесоюзн.совещания по генетике соматических кдеток в культуре.М:Наука,1981,с.46.

27. Гвоздев В.А. .Полукарова JI. Г. .Какпаков В.Т.Культивирование орга нов,тканей и клеток дрозофилы in vitro т- В кн:Биохимическая генетика дрозофилы.Н-ск:Наука,1981. с.126-156.

28. Какпаков В.Т.,Шуппе Н.Г.Соматические клетки дрозофилы в культур как модель для исследований по молекулярной генетике высших орг низмов.-В сб:Молекулярные механизмы генетических процессов.М: Наука,1882,с.37-48.

29. Kakpakov V.T..Poluektova Е.V..Mukhovatova L.M.Gorelova T.V., Braude-Zolotarjova T.Y..Sohuppe N.G.Somatic cell genetics in Drosophila.-VIII EDRC,Edinburg,England,1983.

30. Брауде-Золотарева Т.Я..Какпаков В.Т..Никошков А.Б.Получение и описание новой лпят эмбриональных клеток Drosophila virilis Тезисы U съезда ВОГИС им.Н.И.Вавилова.Кишинев:Штиинца,1982,4.1 с.38-39.

31. Кубанейшвили М.Ш..Какпаков В.Т.,Шуппе Н.Г.Регуляция синтеза рРН в пересеваемых линияхэ эмбриональных клеток дрозофилы.-Генетика 1983 ,t.I9,J:»6 ,с .1005-1012.

32. аолуэктова Е.В..Митрофанов В.Г..Какпаков В.Т.Способ определения экдистерона в культуральной среде.-А.с.СССР MI30605 от 22.08. 1984.

33. Ivanchenko М.,Braude-Zolotarjova Т.Y..Kakpakov V.Г.Histone extracts from nuclei of established Drosophila ¡bell lines contair two additional minor componenys. -DIS(USA),1985,v.61,p,90-91.

34. Ильин Ю.В.,Шуппе Н.Г. .Архипова И.Р.,Еаев А.А.щ. .Горелова Т.В., Джумагалиев Е.Б. .Какпаков В.Т. .Любомирская Н.В.Организация и транскрипция мобильных диспергированных генов .дрозофилы.-В сб: Молекулярные механизмы генетических процессов.М:Наука,1985,с.2( 27.

Какпаков В.Т..Шуппе Н.Г.Питательная среда для культивирования клеток насекомых.-А.с.СССР ЛП81312 от 22.05.1985. Полуэктова Е.В..Какпаков Е.Т..Митрофанов В.Г.Дифференцировка пу-фйинга хромосом слюнных'аелез Drosophila virilia §turt. в различных питательных средах.-Онтогенез,1985,т.16,В4,с.375-381. Kakpakov V.T.,Mukhovatova L.M, .Gorelova Т.V..Poluektova E.V. , Mitrofanov V.G.,Schuppe N.G.Cultivation of embryonic and post-embryonic Drosophila cells for their use in molecular-genetic studies.-Ill Intemat.cell culture congress.Sendai.Japan,1985. Какпаков В.Т.,Шуппе II.Г. Питательная среда КИЕ для культивирования клеток насекомых.-А.с. СССР Ш238384 от 15.02.1986. Какпаков В.Т..ЫуховатоЕа Л.1,1.,Шуппе Н.Г.Особенности хромосомной изменчивости в различных линиях и- клонах длительно перессваемых линий эмбриональных клеток дрозофилы.-Материалы Ш Всесоюзн.конф. по генетике соматических клеток в культуре.М:Наука,1986,с.112. Байкеяова А.А..Брауде-Золотарева Т.Я.,Какпаков В.Т..Иващенко Н.И. Корочкин Л.П.,Луппе Н.Г .Изменение спектра изоферментов эстеразы в ходе роста культур эмбриональных клеток Drosophila virilis Stur Онтогенез, 1986, т. 17 ,¿»5, с. 535-537.

Braude-Zolotarjova Т.Ya.,Kakpakov V.T.,Schuppe Я.G.Hale diploid embryonic cell line ofv Drosophila virilis.-In vitro,1986,v.22, Mo.8,p.431-384.

Какпаков E.T.,iiiynne H.Г.,Полуэктова Е.В..Митрофанов В.Г.Исполь-зование культуры соматических клеток дрозофилы для изучения регуляции активности генов.-Материалы У1 Всесоюзн.симп.Молекулярные механизмы генетических процессов.ЫгНаука,1987.с.26-27. Какпаков В.Т.,Зуппе Н.Г.,Брауде-Золотарева Т.Я.Способ получения линий эмбриональных меток насекомых.-А.с.СССР М322672 от 08. 03.198 .

Kakpakov V.T..Schuppe H.G.Steps of development of the genetics of Drosophila somatic cells in culture.-VII Internet.Conf.on Invertebrate and Pish tissue culture.Ohito,Japan,1987.

Какпаков Б.Т.Культивирование клеток и тканей беспозвоночных.-3 кн •.¡Дет оды культивирования клеток.Л:Кауяа, 1988, с. 241-250. /!ишуния И.Ф..Холодова Ю.Д, .Полуэктова Е.В..Митрофанов В.Г., Замах В.П..Богуславский В.А. .Какпаков В.Т.,Карлов В .г/1., Ворон-сов П.iJ. .Горбунова В.Д.Препарат для нормализации кизнеспособ-юсти осйабленных пчзл.-Пололсительное решение по заявке J/43379 :i/I5 от 30.01.1989.