Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ретровирусоподобные частицы в культуре клеток дрозофилы

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Ретровирусоподобные частицы в культуре клеток дрозофилы"

АКАДЕМИЯ МУК СССР ИНСТИТУТ ОБПЕЙ ГЕНЕТИКИ км.Н.й.ВАВИЛОВА

На правах рукописи

Горелова Тат1зна Викторовна

УДК 575.224:577.213/217 РЕТРОВИР^СОПОДОБННЕ ЧАСТИЦЫ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК ДРОЗОФИЛЫ

03.00.15 генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Носква - 1951

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной генетики щьш организма Института обвей ; енетики иы.Н.Н.Вавилона АН СССР

Научный руководитель:

доктор биологических наук Н.Г.Шупне

Официальна оппоненты :

доктор недициисш наук, профессор Г.Д.Засугчы доктор ыедивчнсш наук А.Д.Альтатейн

Ведущее учреждение ;

при Институте общей генетики им.Н.И Вавилова АН СДР /117809, ГСП-1, Иосква Б-ЭЗЗ, ул.Губкина, д.З/.

С диссертацией '¿ото о знакомить с я в библиотеке Института общей генетики иы.Н,И.Вавилова АН СССР

Институт биологии развита им.В.К.Кольцова АН СССР

Б

/У

Защита состоится '¿¿У' Ь91г.

часов на заседании специализированного совета

Автореферат разопан " /2

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологически! наук

дарованного совета биологически! нау!

Г.Н.Полухина

ОБМ ХАРАКТЕРИСТИКА FABOTH-Актуальность проблема, ^реди различных классов ыобильннх генетике элементов (КГЭ), обнаруженных в клетках дрозофилы, copia-подобные элементы или цобильнке диспергированные гены (КДГ) представляют особьй интерес weorgiev,i964; Ильин,1932). Интенсивное изучение этих элементов показало, что они по своей структуре весьма схожи с провирусами ретроБнрусов позвоночных и могут использовать и,., своего перемещения механизм обратной транскрипции (Heine et al.,1980; Shiba et FiavelI ei al(1984; Arkhipova et

al.,19S4; Ильин и др., 1985; Arkhipova et al,, i9c5>. В настоящее время подобные элементы получили название ретротранспозонов. Однако, детали механизма перемещения ретротранспозонов ост^тся неясными,

Учитывая во'цожность генетических последствий, вЕзываеыых переме-яенияик элементов, изучение механизмов обеспечивающих и регулирюуших их транспорта представляется одной из актуальных задач современной генетики. Изучение ретротранспозонов представляет интерес и с ток .течки зрений, что они могут служить источниками обратной транскрипта зн в клетках, а обратная транскртщия, в свою очередь, играет значительную роль в-'реоргакпзгщгл генома зукариот (Baltimore,1985). Кроне того, ретро-транспозоны яроздфилн можно по ряду "¡ризнаков- счи.г тать эндогенна.« ретровирус-ау.;; дгозофклк, так что -их изучение может пролить свет на зЕолюа.а> р.гротраяспозонов зуйариот.-.

Цель и задачи исследования. Пель»-работа явилось изучение внутриклеточного распределения иктериедиатов' тракспо'зип;?о-нного цикла ретротранспозонов в различных пересеваемых линиях клеток Drosophila me lanogaster. Предстояло выяснить в каких клеточных- структурах происходит обратная транскрипция л каким образом она организована 5 клетках дрозофила. На основании полученных данных предстояло срав-; нить цикли транснози.щти ретротранспс:онов дрозофилы и репродукции ретрогирусоь позвоночных.

"аучная новизна. В кульг».вируещк клетках дрозофила было изучено распределение по субклеточный фраклш ивтериедяатов цикла транспозиции трег ргтротрансвозонов дрозофилы (НДР, НДГЗ к copiai. Было иоказаао, чт* иятериедкатнне Форыы, являющиеся продуктами обратной транскршщп рртротракспозонов, обнаруживаются в вирусоподобных частиках (БНЧЬ с кстсрыии также ассоциирована активность обратной траяскряптазы. Все зто позеояй.;т считать ЕПЧ обязательный лаеыентом ретротранспозгагаонного цикла. Такая коклартиеяталшгия процесса обратной транскрипции шеет, по-видкиоыу, важное регуляторнсе значение, Вирусоподобные частица с указанными характеристиками содержатся как в ядрахs так.и в цитопггзие клеток, Б среде культивирования клеток лини.: §7 j25D были обнаружена внеклеточные вирусоводоб-ные частицы, содержащие последовательности, гоыодогичные ретротранс-аозонан и обладающие обратнотранскриптаьйой активностью. Полученные данные позволили сравнить ыкл тргнсгозиций ретротракспозокоз и еыяби" его сходства л различия с ди.лоа реплмацш; ретроЕйрусов. .

Представленные в работе данные i-шеют как вдето теоретический, так и практическим интерес для далънешк исследований ретрстраяспозо-нов, Поскольку перемещение иобильных элеиевтое, в той ч«сле и ретро-транедозоков, может приводит: к различным генетический последствиям весьма важный оказывается знаки иеханкзнов иг "ерецещенкя и ор-аки зации этого процесса в клетка«., что позволяет подойти к изучению аегакнзмов регуявди транспозиций к, в буцрма, контроля над ними, Сходство организации циклов транспозиции ре1ротраяспозоиов и прови-русов р^тровйрусов подчеркивает вознохнр эволюционную взаимосвязь .ретроэлементов. Практическая ценность данной работы состоит в том, что ретротранспозочы иогут рассматриваться как перспективные зукари отические векторы, подобно вектора« на основе ретровкрусов. газрабо таь'кке ковке методические подгодн ыогут быть использованы для вьще-яения и изучения иобкльннх эяеиентов б другие органигнаг.

Апробанкя работа. Результата чссладозашй докладывались на Y к YÏ Всесоюзных симпозиумах "йолекулярше механизмы генетические иропессов" (Носква, 1953,1367), на Y Всесоюзном биохтшческсн с*е?-де (Киев,1955), на III Кегдународясы конгрессе по клеточные культурам {Япония., 1955), на TI двусторонней симпозиуме СССР-ФРГ по структуре и функционированию генома. (Ленинград, 1985), на III Всесоюзной конференции по генетике соматических клеток в культуре (Москва,1956), на II Европейской конгрессе по клеточкой биологии (Венгвдя.iS8§).

Об'ец работа. Диссертация состоит из введения, лбзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на ^^'^странидгг, иллюстрирована ^таблицами и /у^ рисунками. Список литературы включает Jj^y работ, в той числе /¡fif на иностранные: язнках.

РЕЗУЛЬТАТЫ Я ОБСЩЕЕИЕ.-1. Внутриклеточное распределение яятериедиатоЕ обратной гранскриппик никла транспозипий ретротранспозонов.

Для изучения интерыедиатов пккла ретротранспозиции ЩГ1, МДГЗ и copia клетки нескольких пересеваемых линий Drosophila melanogaster Фракдионировали различными „етодаш на ядерную, цитопл а з и атиче с к ую и мембранную фракпии. Для этого нами были использованы три методически? подхода: 1) метод замораживания - оттаива*пи {Heine et al.. 1980), 2) метод Неймана, основанный на лизисе клеток с помощью Тритона XI00 {Penman S..Î9S9}, 3) метод Рея и Стабяфилда, при которой бе? использования каких-либо детергентов разорение клеток проводится в буфере на основе гексиленглшш (Wray, Stabblеfield, 1970). При анализе препаратов нуклеиновых ккслст все три метода дают одинаковые результаты. Однако, поскольку при изучении клеточных

структур, г- которкх протекает обратная транскрипция ретротранспозо-на, ии использовали тсько «етод Ргя и Стаблфилда, все вриводиине в зтой глазе результаты по характеристике субклеточна яукл°иноБкх кислот-получчш с помощь» этого метода фракционирования клеток.

Ез препаратов суицарви нуклеикэвнх кислот каждой субклеточной фракции меток дрозофилы линии 6750 (дапее I тексте От) (Какпаков я др.. 1967/ выделали полиаденмированну» РНК на колонке с ".оли(71-сефарозой. После фракционирования в агарозкоь: ге;.е при денатурирую-шк условиях и переноса на нктроцеллмознке фильтры материал гибри-дизовали с Р-иечеными последовательностями разкьк рг-ритргнспозовов. Проверенным анал-з показал ¡Рис.!.), что в каждой субклеточной Фракции обнаруживается нолкоразнериая 1ши(А+)РКК ретрстранспозонов.

ЯЯГ1 " НДГ» - copia

и- L ' - . "

• 2s. .. . -fei-i >

фш Щ ' s." - •

■TÙ & vr p -

' $ —t ¿.- <-? . : -f * \ i : ?

Щ t-л ■

у; sri

h : es

cï'-' ■■

i'v „ 3 i? • -

f" %t г ■ïi *

9 Ц m 5 ц m ' su.",

Рис Л, Гибридизация ЙДН, КДГ5 и copia о Фракционированной при денатуриругда условияг пояи(АОРНК из ядерной (Я), цито-плазматической (Ц) и мембранной (К) фракций клеток линии 67j25D, Стрелкой отмечена и одноразмерная поли(А*)Ш ретротранспозонов.

йз наших предыдущих работ, прозедеяных совместно с сот.рулнлкаш; лаборатории Ю,В. Ипыша ( Институт молекулярной биологии АН СССР) (АгкЬ1роуа е! а!,.1984; Ильин и др.,1985; АгкЫро\а ег а!,,1956) было известно, что тотальные клеточные препараты поли(А+)РНК содержат РНК-ДНК гибридные иолекулы ретротранспозонов. Поэтому мы проверили вмененные полк(А-НРНК из субклеточных фракций на присутствие в них аналогичных гибридных структур. Для этого гель с препаратами Фракаионироранкых солиаденилироЕгянкх РНК субклеточных фракций перед переносом яа нктроделлюлозяин фильтр обрабатывали О,5 К МаОН, гидролизу я всю РНК, находящуюся, в предполагаеуоу комплексе. йгавля-еше затеи зоны гибридизации в области полноразыернкх молекул ИДГ были обусловлен« только присутствием цепочки ДНК в составе гибридного комплекс (Рис.2!. Проведенный анализ показал, что гибридные ыолекулн присутствуют во всех субклеточных'фракциях.

| . КГ1 КГ; ссгха

| ^ — ■ — ..

7*

| . <3 '4 М Й и м Я Ц М.

Рис.2. Обнаружение гибридных РНК-ДНК молекул ретротранспозонов в субклеточных Фракциях клеток линии 67.

ДоЕСйялтельни: анализ препаратов поли(А*)?ВК обработанных РШ'азой 2 высокой ¡¿sSSC) и низкой (0, íг.°5С) ионных силах перед фракционированием в агарознои геле показал, что они ничем не отлкча^с?. от РНК-ДНК комплексов, обдаруяенн'гг ранее s тстальннг лрепарзтаг куклекно-з;К кислот из целых клеток дрозофилы {Arüüpova et al., i9v4; Ильин к др.. i965; Arkhipova et ai.,1986). За полнотой гидролиза РНК,следили •¡о переходу уридккосой метки s кислоторастворкцую Фракцию. Н-уридин добавляли б среду культавярозагиа.клеток б концентрации 25 икли/кз за сутки до опыта. Полученные данные указывают на то, что основная ыаоса трансхриптов КДГ, независим от ks внутриклеточной локализации, воБлечеп в процесс обратной транскрипции, в результате большая часть РНК ретротранспозонсв оказывается £ составе полноразмерных РпК-ДНК гибридных молекул.

2. Вирусоподобные частицы из субклеточна фракций.

Ко времени качала наших работ ухе было известно, что в культуре клеток дрозофилы присутствуют вирусоподобные частицы (БИЧ), содержащие последовательности ретротракспозона copia и обладающие обратно-транскриптазной активностью (Shiba et al.,1983). Авторы указывали-на исключительно ядерную локализацию ВЯЧ и отмечали, что ВПЧ содержат только РНК-последовательность ретротранспозона copia. Кроме того, анализируя фракцию ВПЧ, авторы не обнаружили б них последовательностей других ретротранспозонсв (Ш, 17.6 и 2S7). В то же вре-' № Хейне с соавторами выделил подобны? ВПЧ, содержащие обратнотранс-криптазную активность, из цитоплазмы клеток дрозофилы (Heine et al., I960). При анализе дрожжевых клеток, индуцированных к транспозиции, îy-БПЧ также были обнаружены в цитоплазме, и лишь очень «алая их часть находилась в ядерной Фракции (Gariinkel et al.,1965},

Данные предыдущей главы нашей работы указывают на то, что пятерке диаты' обратной транскрипции рпротранспозонов" локализована как ь

ядрах, гак и в цитоплазме культивируемых меток, Однако, оставалось неясны» где именно локалкзван синтез интериедиатоЕ ретготранспози-ции и во всех ли случаях он протекает внутри вирусоподобных частиц, Для того чтобы получить ответ на поставленный Еопрос культивируешь клетки дрозофилы линии 67J26D (йакпаков и др., 1967). Кс (Echaiier et al.,1970) и Schneider2 (Schneider,1972) разделяли на ядерную, цито-плазнатическу» и мембранную фракции и Еируссподобкые частицы (ВПЧ) каждой фракции очишали в градиенте плотности сахарозы (20Х-50Х). Поскольку дальнейший анализ внутриклеточных ВПЧ предполагал определение активности обратной транскриптазн ассоциир.ванной с частицами, при разделении субклеточных фракций исключалось воздействие любых детергентов. Исследование фракции мембран, как компонента цитоплазмы клеток, ин предприняли исходя из морфологического сходства ВПЧ дрозофилы и интрадистернальнкх A-частиц грызунов (Heine et al.,i960), -В каждой субклеточкой Фракции ВПЧ исследовали активность обратной транскриптазн и анализировали нуклеиновые кислоты, входящие в состав зтих частиц. Активность обратной транскриптазн определяли как на экзогенной' матрице поли(рС);олиго(дГ), специфичной именно для РКК-зависимой ДНК-полкмеразы (Verma Т.,1977), так и в эндогенной реакции на матрице, существующей в вирусоподобной частице. Рез';льтаты анализа приведены в таблице 1. В качестве контроля были проанализированы также вирусоподобные частица кз клеток Drosophila virilis и Broso-phila hydei, для которых не описаны последовательности ретротраяс-позоков, Полохктельнш контролен служила активност. ревертазн мьзи-ного вируса лейкемии (Rauschler ííuLV). Б эндогенной и экзогенной реакциях использовали равные по содержанию белка аликвоты ВПЧ, Эндогенную реакция проводили б присутствии 100 ыкг/ил актиномицина Д, концентрации, достаточной для полного подавления ДНК-зависимых поли-ыераз. Об эффективности синтеза судили по уровню включения меченого дЦТФ, Фоновое включение (без матрицы) было порядка 500 инп/нин.

Таблица i

Источник ИЧ

Активность fИМП/НИН)

экзогенная эндогенная

ллра (Dr.celanogcster) гитопла змз 1 Гг. ¡ne 1 arwaster ) мембраны ( Dr.œelanogaster) глеткк (Dp.'hyàei) . клетки (Dr-virilis) Lauscher HuLV

6350 5970 5800 53ö 550 49250

1200 il 00 470 ISO 6990

Как видно из приведенной таблица, вирусододобкне частицк обладающие обратнотранскридтазной активность» обнаруживаются б каждой из изучении?' субметочных фракций. Наличие субклеточных БИЧ не зависит от линии клеток: опита проведенные на линиях Кс и Schneider2_дали результаты аналогичные приведенный б таблице 1. Результаты полученные в эндогенной реакпии свидетельствуют о тон, что вирусоподобные частицы содержат все субстрате, необходкыше для процесса обратной транскрипции.

Следующий этап работы состоял в определении состава нуклеиновых' кислот внутри Ш. Поскольку из цели клеток дрозкфплк были наделен п промежуточные форин никла обратной транскршшм ретротрансао-зоков, мы надеялись идекг.м'ипировать подобные интерыедиатк Екутри В!™. если именно s зтой структуре локализован синтез новых копий ретрстран спо з оное,

НуклеиноБне кислоты, выделенные по кетоду МакКензи (McKenzie et al., 1975} из ядерной к дитоплазматической фракций ВИЧ линии клеток Dm, разделяли б условиях денатурирующего гель-электрофореза и после песекгса на нитродевимозный фильтр гибридизовали с меченная последовательностями }ЩГ1 я ЕДГЗ. Ва рисунке 3 представлены результат:-: такого анализа.

а

го QO-7

й.Ь— Js t?

f'V* -5.5

I

0.5

i 2 3 4

i Z 3 k

Рис.!. Елот-гнализ нуклеиновых кислот ядерной (1,2) и цитоплазма-тической (3,1) фракции ВПЧ клеток пинии Dm после гель-злектрсфореза в денатурирующих условиях. Гибридизация с МДГ1 (А), с НДГЗ (5). Препараты тотальных нуклеиновых кислот ВПЧ не обработанное (1,3) и обработанные щелочью (2,4) для удаление РНК. В качестве маркера размеров .использовали HindIII-перэвар ДНК фага лямбда.

Нечеткие дорожки соответствуют препаратам тотальных нуклеиновых кислот ВПЧ, четные - препаратам, обработанным в О,5К КаОН перед переносом из геля на нитроцеллюлозу. Основная часть детектируемого материала связана с Бксокоиолекулчрньаш последовательностям: ретро-транспозонов. После деградации последовательностей РНК щелочь» количество материала на дорожке уменьшается, но размер детектируемых молекул остается прежним. Обнаруженные полноразмернне последовательности ДНК ретротранспозонов подтверждают присутствие характерных РНК-ДНК комплексов внутри вирусоподобной частицы. Fit провели детальный анализ интермедиатов КДГ1, ассоциированных с ядерными ВПЧ из клеток линии Du (Рис. 4-).

4 О

23.7 -

1:1 = 9. w - ' ■

_ 2 2 _ i

— lis — ' F I i

- - - 0.5 - i

12 3 £,5

Рис.4. Интерыедиаты ретротралспозона КДП, Еыделенчне из ядерной Фракции ВПЧ клеток Dm.

Условия злектофореза декатурируюсие (1-3), натиЕные (4, 5). Гибридизация с целкы ДКП КДП (1), с (И-цепью ДКП КДГ1 12), с (-)-цепью ДКП КДП (3|.

Препарат на дорожке 5 обработан РНКазои в 0,lxSSC. Гибридизация с цельш НДГ1 ¡4, 5),

Нуклеиновые кислота ядерных ВЕЧ после электрофореза в денатурирующих условиях к обработки геля в 0,5 Н КаОН переносили на нитроцеллюлозу и гибридизовали с печеной последовательностью ДКП КДП. На радиоавтографе наблюдали полосы гибридизации, соответствующие полно-размеркой.ДНК ретротранспозона и последовательности ДКП. Если гибридизацию проводили раздельно с плюс- и минус- цепями ДКП, тогда плюс-цепь детектировала полноразмерную цепь ДНК ретротранспозона, а никус-цепь - только последовательность ДКП. Электрофорез в нативных условиях показал, что нуклеиновые кислота ядерных ВПЧ представлены пол-норазиерньш РНК-ДНК гибридными иолекуланк. Обработка РНКазои в низкой ионной силе или в 0,5 К НаОН обуславливает большую подвижность в геле ДНК-компоненты гибридной иолекулы. которая соответствует подт~-ности одяонитчатой линейной ДНК размером в 7 т.н. (Рис.4,дор.4 к 5}'.

- и -

Таким образом, анализ нуклеиновых кислот внутриклеточных вирусоподобных частиц показал, "то все интермедиа™ обратной транскрипции ретротранспозонов, выделенные ранее нз целых клеток (АгШроуа е! а!.. 1554; Ильин и дрм 1985;'АгШроуа е1 а1,,198б), локализованы внутри БПЧ. Двунитчатых молекул ДНК ретротранспозонов в составе ВИЧ мы не обнаружили.

с. Характеристика вирусоподобных частиц в градиенте плотности

сахарозы.

Культивируемые клетки дрозофилы линий Кс и Гт разделяли на ядерную, мембранную и цитоплазматическую фракции как уже было описано. Из кгтсдой фракции выделяли препараты БПЧ к фракционировали их в градиенте плотности сахарозы (20Х-50Х). Количество нанесенного на градиент материала субклеточных ЕИЧ пропорционально соответствовало их внутриклеточному распределению. После центрифугирования в каждой фракции градиента определяли активность обратной транскриптазы и наличие последовательностей ретротранспозонов. Эти эксперименты проводились с целью выяснить связаны ли между собой зоны градиента сахарозы, содержащие активность обратной транскриптазы и последовательности нуклеиновых кислот, гомологичных ргтротранспозонаи, поскольку, только в случае совпадения этих зон, можно говорить о том, что мы имеем дело с частипзмк. в которых проходят основзые события процесса ретротранспозипии.

Анализ нуклеиновых кислот ::г фракций сахарозного градиента, после обработки протенназсй, гель-зяектрофореза, переноса на нигроцеллк-лозный Фильтр гибридизации с соответствующими 'зондами, показал, что каждая субклеточная фракцш ЕПЧ содержит последовательности ретротранспозонов. На рисунке 5 представлено характерное распределение нуклеиновых кислот ретротранспозона НДГЗ во фракциях БПЧ из цито-плазматической и мембранной фракции культивируемых клеток линии Г;т,

Рис.5. Распределение нуклеиновых кислот ретротрансиозона НДГЗ ео фракциях ВПЧ из цитоплаэыатической (Ц) и мембранной (К) фракции культивируемых клеток линии ГЬ. Стрелкой отмечена полноразыерная последовательность ретротранспозона НДГЗ.

Уаксичуу распределения °ПЧ s градиенте плотности сахарозы для tzn субклеточниг Фраг.ции совпадает и приходится на плотность 1,2 г/ил, Такая плотность характерна длч интрапнстернальннх А-частиц грызунов, сходство с которыми отмечает see авторы изучагеие вирусоподобные частицы дрозофилы. Следует закетять, что несмотря на обаее сходство пропилеи распределения ШЧ трех субклеточньх фракции в градиенте плотноеги сахаре зк, наблюдались г определенные отличия в характере распределения, оссбезно вкразздке для цгябрзкной фракции, В клетках линии Dm количество частиц s мембранной Франции мало по сравнения с их содержанием б фракции клеток линии Кс.

Характерный для ь-*дсй субклеточной фракции ВПЧ профиль распределения г градиенте плотности сахарозы «охно об'яснить изменяющейся морфологией частиц, отрахащеи как раз.чне этапы формирования БПЧ, так и s цело« проц.кс-обратной транскрипции ретротранспозонов, который возможно ло-разноыу протекает в разных линиях клеток дрозофилы.

Следующий этап работы состоял в определении зоны градиента плотности сахароз;-.;, в которой локализована активность обратной транскра-птазн. На рисунке t. представлена данные, характеризующие активность обратной трзнс.кр:гпта?я БПЧ из клеток линии Dm. В реактло брали равные по соде?»2Нзг» белка аликвоты фракций градиента. Ах явность ре-вертазы определяли б ЗпДог:дНСй реакции, когда матрицей синтеза сяухлг молекула FKK, находящаяся внутри частицы, в присутствии 100 икг/ил ¿ктинмщиаа Д. 05 эффективности синтеза с «дня»: по уровне включения меченого дЦТФ. Из рисунка видно, что профиль распределения обратнотракск>иптазной активности БПЧ отличается в разных субклеточных фракциях, итя во всех фракциях имеются пики макснмуиа активности, совпадающие с зоной гибридизации последовательностей ретротранс-позоноб и приходящиеся на плотность градиента 1,2 г/мл. Основное отличие заключается в распределении активности по градиенту к величине шекмуна приходящегося на плотность с 1,2 г/ил, несмотря на то,

- *л -

что суммарная активность б каждой фракции практически одинакова (см. также Табл.Ц.

Рис.6. Распределение е градиенте плотности сахарозы (25?-50Х) ооратнотранскриптазной активности БИЧ ядерной (А], цитошшыатаческок (Б),иеморанной (В) Фракций меток линии 1ш.

Ордината слева - интенсивность включения, справа -плотность раствора-сахарозы по фракциям.

Наблюдаемые различия могут быть связаны с тем, что при выделении цитоплазнатической и мембранной фракций используемые методические приемы могут вызывать нарушение целостности ВПЧ, что сказывается на распределении их обратнотранскриптазной активности в градиенте сахарозы. Таким образом, на основании данных приведенных в этой главе ножке считать, что вирусоподобные частицы клеток дрозофилы присутствуют во всех исследованных нами субклеточных фракциях, с этими БЛЧ ассоциирована активность обратной тракскрилтазк и они содержат последовательности, гомологичные ретротракспозонам, в форце гибридных РНК-ДНК комплексов.

- iô -

•«. ги^/сопсдобные ^сты, содерхаяис

последователь: ост:: ретротрь.:-:с:К'":нсв.

Оставалось кеяскь1« могут ли внутриклеточные Екрусоподобнке частили выходить кз клеток и с/шествовать s свободной форне, подобно тему, как зто происходит при ретровирусной инфекции. Ик проанализировали среду культивирования нескольких л>шй клеток дрозофилы: 67j25DîКаксакон и др.,-,Л), Кс(Echalier et al.,1970), GM2(Mcsna et al.,1972», Schneider2(Schneider, \\>~2), В опыт брали 5-б-ти дневную культуру. После осаждения клеток культуралькую среду центрифугировали при 100 ООО g в течение 75 минут так, гак зто делают для осахдения ргтроЕирусов. Полученный осадок фракционировали в градиенте плотности сахарозы и во Фракциях градиента определяли активность ■братной тран хриптазк и наличие последовательностей ретротранспозо-нов. Зондами служили ялазнидк, несущие последовательности НДГ1, 1!ДГЗ и copia. Енло установлено, что только внеклеточные частицы из линии 67J25D содержат последовательности данных гетротранедозонов. Результаты анализа нуклеиновых кислот средовнх БПЧ для НДГ1 представлены на рисунке 7.

Fhc. 7. Гибридизации с !-!ДГ1 нуклеино:ыз: /.пелот ЬПч из среды культивирования клеток линии pu.

Машшуа гибричкзаш: приходится на З-il пробы, что соответствует плотности 1,2 г/ид. Поскольку перед переносом нуклеиновых кислот на фильтр иь: обрабатывали гель в Û.5K SaOH, sa фильтрах оочгруызактся только- последовательности днк. что свидетельствует о наличии ео ehî клеточных частипах полноразнерных копий ДКК ретротрансдозонов. Следовательно, б средовых ВИЧ можно обнаружить те же промежуточные Формы цикла обратной транскрипции РНК мобильных элементов, которые были выделены из целых клеток и внутриклеточных ВИЧ. Аналогичные результаты были получены для ЙДРЗ и copia.

На рисунке 8 представлены данные, характеризующие активность обратной траяскриптазк внеклеточные БИЧ после центрифугирования в градиенте плотности сахарозы,

а

! • - !

к 6 зс

dcvçp icddiuuu

Рис.?. Распределение г градиенте плотности сахароза (20--60«) обратнотанскриптазной активности внеклеточных ВИЧ, . выделенных из среды культаЕироБакиз клеток лиши

Ордината слева - интенсивность включения, справа - плотность раствора сахарозы по фракциям.

1 - экзогенная активность в присутствии 0, бмй Кя++ при 25 С ,

2 - то же при 37 С ,

3 - активность в присутствий 1нИ Н^+т

4 - эндогенная акшвность

Видно, что экзогенная активность ревертазн. определяемая по уровню включения меченое ТТФ в п.рису степи матрицы поли(А) :опкго(дТ) и ионов UnH, имеет чэтко выраженный так с максимумом в плотности 1.Р г/ил , т,е, максимум активности совпадает с максимумом гибридизации зондов, содержащих последовательности ВДП, ИДИ и copia.

Интенсивность включения зависит от температуры, Так, зкличекле при .37 С оказывается на 30-50Х ниже, чрм при температура 25 С, при которой культивируются клерки дрозофилы (Рис.6,кривые 1 и 2), Интенсивность зьк>чгяия в присутствии конов Мпн оказывается г 5-Ю раз выше чем в присутствии ионов Hg+t (Рис.8,*ривые i и 3), Внеклеточные частицы проявляют также слабую эндогенную активность, когда матрицей служит РКК, находящаяся внутри частиц, Интенсивность ь/лючеляя дДТФ в этих условиях примерно з 8 раз нихе, чем при использовании шогенной матрицы. Эндогенная реакция проводилась z присутствии штиноницика Д. Описанные результаты практически полностью» совпадают с данными полученными ранее для внутриклеточных частиц и позволяют считать, рто выявленные наm внеклеточные частицы обладают именно обратнотрансритзной активностью.

Образование внеклеточных часгп при культивировании клеточных линий дрозофилы подчеркивает гомологию ретрсзирусов и НДГ-элементов и указывает на их связь с эволюции. Трудно предложить однозначную версию происхождения внеклеточных ВИЧ в линии клеток 67J25D к об'яснигь их отсутствие в линиях йс, Schneidet и GH2. Нельзя исключить возможность связывания ВПЧ ретротраиспозоыв с реовкрусаыи культивируемых клеток, Этим можно объяснить выход ВПЧ из клеток линии 67 Î25D, но тогда непонятым остается отсутствие ВПЧ в культуральной среде 'большинства других линий клеток, у которых также отмечено высокое содержание реовируов. СущестЕэнное отличие внеклеточных ВПЧ дрозофилы от ьнеклеточныхх ретрсзи-русов состоит в том, что в составе последних не обнаруживают по-

следователь:.. ДНК. Можно предположить, что ВИЧ реторотранспо-зонов дрозофилы выходят из клеток не в результате естественного цикл г репродукция, а высвобождается случайно при несдешмкческой распаде клеток. Однако, гибридизация со структурными генами показывает, что их последовательности отсутствует в !репарата* средовых БПЧ. Кроце тог©! количество частиц в среде всегда больше их содержаний в клетках и не зависит от числа нертвнх клеток в культуре.

Несомненно, что для полного решения вопроса о происхождении внеклеточных ЬШ требуется специальные исследования. Остается открыты вопрос и об кнФекцконаости вирусоподобных частиц ретротранспозопов. Одним кз подходов к решению этой проблема ыояет стать разработка систеи совместного культивирования разных линий клеток, в геноме которых отсутствует то кпк иное семейство НДГ. Столь же перспективный'. представляются и исследования по экспресии ретротранспозонов в модельных системах клеток насекомых.

йа основании полученных данных можно лредллошг схему цикла ретротранспозшш ретротраяспозоное дрозс^клн (Рис.9).

5ыгт

НЕ&-

К?

I

МП.

«454« ?цг ^

г. ълт?*)^. <—>».

* »дт*»

Рис.5* Основные этапы предполагаемого цикла внутриклеточных *тракспоэици>5 регрстракспозоноБ дрозофилы.

Видно, что основные этапы это. о цикла практически полность» совпадают с фазами репликации ретрслфусов позвоночных. Однако, еще раз следует подчеркнуть, что особи г.оказатеяьств требует вывод о существовании внеклеточных форы ретротранспозонов. Если строгие доказательства их существования не будут получены, то транспозиции ретро-транспозоноз дрозофилы будут авлятся исключительно чну;ригеноияым процессом, в то Ереия как ретровирусы 'ъеют исключительно меягеном-нки транспозиционный цикл.

шводы.

1. Интермедиаты обратной транскрипции ретротранспозоно* локализованы в ядерной, цитоплазнатической и мембранной фракциях культивируемых клеток дрозофилы.

2. Процесс обратной транскрипции ретротргчслозонов протекает внутри вирусоподобных частиц, являвшихся Функциональными интериедиатаыи цикла ретротраясаозкций, что позволяет считать их ретровирусоподобньр'и частицами.

3. Ретровйрусоподобнке тстицы всех изученных пересеваемых лигой клеток дрозофилы обнаруживаются в ядерной, литоплазнатическоу а мдмбранной фр:кцтах клеток.

4. В пересеваемой линии клеток 67]2СЭ обнаружены внеклеточные "астата, сходные по своим характеристикам с внутриклеточными ретровирусоподобюши частицами. ■'

5. В отличие от ретрозируссг внеклеточные вирусоаодобние частиш содержат гибридные РНК-ДНК молекулы.

СПИСОК РАБОТ' 0ПУГЛ2К0ВАШК ВО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

. Sore1 ova T.V., Kubaneisimli H.S., Sycsir. S.V., Schuppe 5.G. Reverse transcription intern;diat.ec of mobile genetic elements in Drosophila melanofaster cells: DHA-REA complexes and virus-like particles. Acta Biologica Hungarica, i§86.v.37: ~ 3,7

2. Сеыин Б.В., Горелова Т.Р., КубанейзЕИли H.H., Еулпе Я.Г. Вирусоподобные частицы и ДЯК-РЧК комплексы, содержащие ыобильнне генетические злененты, в пересеваемых клетках дрозофилы. -Материалы III Всесоюзной конференция по генетике соиатических клеток в культуре, й.-, Наука, 1586, с.42-43,

3, Горелова Т.В., Луппе Н.Г. Внеклеточные вирусоподобное частицы, содержание последовательности, гомологичные мобильный диспергированный генетический элемента«. - Доклады АН СССР,1967,

т.293, 5.1, с,225-226.

4, Gorelova T.V,, Besnick S.L., Schuppe S.O. Retrotmsposcn transposition intermediates are encapsidateö into virus-like particles. FEBS Letters, v, 214, 1989, ps 307-310.

5. Schuppe E.G., Arkhipova I.R., Gorelova T.V., Ilyn Y.V, The forms of mobile dispersed elements in Drosophila cells. -III Intern. Cell Culture Congress, Sendai, Japan, 1935