Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурная организация мобильного элемента дрозофилы жокея

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурная организация мобильного элемента дрозофилы жокея"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ

На правах рукописи

ПРИЙМЯГИ Андрее Феликсович

УДК 577.21+575

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ МОБИЛЬНОГО ЭЛЕМЕНТА ДРОЗОФИЛЫ ЖОКЕЯ

03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1988

Работа выполнена в лаборатории подвижности генома Института молекулярной биологии АН СССР

Научный руководитель: доктор биологических наук Ю.В.Ильин

Официальные оппоненты: доктор биологических наук А.П.Рысков доктор биологических наук Е.В.Ананьев

Ведущее учреждение - Институт молекулярной генетики АН СССР

Защита состоится ¿/¿-О-^-Р 1988 г. в " часов на

заседании специализированного совета Д 002.79.01 при Институте

молекулярной биологии АН СССР по адресу: 117984, Москва В-334, ул.Вавилова, д.32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии АН СССР.

Автореферат разослан " ^

.1988 г.

Ученый секретарь специализированного Совета кандидат химических наук

....... 3

•'•".г J

~Ч

Актуальность проблемы. Одним из важнейших успехов молеку-•лярной-риологии и генетики последних десятилетий явилось открытие мобильных элементов. Сейчас ясно, что мобильные элементы широко распространены в геномах прокариотических и эукариотических организмов и играют важную роль в перестройках генома, его эволюции, мутационных процессах. Вездесущность мобильных элементов может рассматриваться либо как доказательство их важности для Функционирования клетки, либо как указание на то, что они способны одинаково успешно размножаться в составе геномов любого типа, являясь эгоистической ДНК.

У эукариот в настоящее время подробно изучено два типа мобильных элементов, кодирующих белки, необходимых для собственной транспозиции. Первый - это подвижные ретровирусопо-добные элементы, получившие в последнее время наименование ретротранспозонов. Сюда относятся МДГ (в англоязычной литературе copia like) дрозофилы, Ту элементы дрожжей, сами ретровирусы и некоторые другие семейства мобильных элементов сходной природы. Их характерным признаком является наличие прямых повторов длиной несколько сотен пар нуклеотидов по концам элементов. Второй тип элементов имеет большее сходство с транспозонами бактерий, поскольку содержит на своих концах инвертированные повторы. Типичными представителями мобильных элементов этого типа являются hobo и Р элементы дрозофилы.

Совсем недавно было начато изучение третьего типа мобильных элементов. Он не содержит никаких повторов по концам, но обычно имеет поли(А) последовательность длиной в нескольких десятков нуклеотидов на одном из них. Поскольку длина элементов этого типа составляет несколько тпн, они были названы LIME (Long INterspersed Elements - длинные рассеянные повторы). Некоторые особенности их структуры заставили сразу предположить, что первичным интермедиатом их транспозиции является транскрибируемая с них РНК, то есть они являются ретропозонами. Сейчас ясно, что LINE широко распространены в геномах высших организмов (у млекопитающих они составляют до 10% генома, они обнаружены также в хромосомной ДНК дрозофилы, кукурузы и трипаносомы). Первые данные о том, что клонированный нами мобильный элемент жокей не содержит никаких повторов по своим концам, заставили нас предположить, что он является LINE-элементом.

цель работы. Целью настоящего исследования было изучение первичной структуры нового мобильного элемента дрозофилы жокея. К моменту начета исследования ни один из LINE не был секвенирован полностью, и, таким образом, о кодируемой ими информации ничего не было известно.

Научная новизна и практическая ценность работы■ Как показано в настоящей работе, жокей действительно является LINE. Он вызывает в месте своего внедрения дупликацию хозяйской ДНК различной длины, лишен концевых повторов и заканчивается на 3'-конце олиго(<1А) последовательностью. При анализе последовательности жокея были обнаружены две длинных открытых рамки считывания, одна из которых содержит высокоспецифические аминокислотные участки, характерные для РНК-связывающих белков репликационно компетентных ретрови-русов, а другая содержит последовательности, гомологичные консервативным участкам обратных транскриптаз. Результаты данной работы могут быть использованы для дальнешего исследования повторяющихся последовательностей геномов на других объектах.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов и выводов. Работа изложена на 75 страница« текста и иллюстрируется 7 рисунками. Список цитированной литературы насчитывает 115 наименований.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Общая характеристика структурной организации жокея.

Первую клонированную нами копию жокея, названную J0, мы обнаружили при изучении молекулярной природы мутации

вызванной интеграцией в cut локус D.melanogaster составного мобильного элемента длиной около 10 тпн и состоящего из мдг4 и внедрившегося в него жокея IMizrokhi et al, 1985). Однако, в дальнейшем мы обнаружили, что прочитанная копия жокея не является полной, поскольку практически не содержит второй рамки считывания, которая, как мы предполагали, должна кодировать ревертазу. Тогда был предпринят поиск других копий жокея. Среди прочих была обнаружена копия длиной около 5 тпн, обозначенная нами как J1. Одновременно нами были выделены еще две копии жокея J3 и J4.

На рисЛ представлены рестриктные карты трех копий жокея и прилежащих к ним геномных последовательностей. Эти копии даны в одной и той же ориентации, при которой концевой олиго(аА), предшествующий дупликации хозяйской ДНК, находится справа. Как можно видеть по рестриктным картам, на протяжении первых 2 тпн клонированные копии жокея фактически не отличаются друг от друга.

К Э Я Р X В ННРХ

I_1_I_I_1_ш_

¿л

Я Р X В ННРХ _1_I_I_1_11_£]_

й н

р Р.

в р х в нн: р

I II I НИЦ

—

■ ЧкЬ ■

Рис. 1. Рестриктные карты полноразмерной (Л) и делетирован-ных ио и Л ) копий жокея. Жирная линия - ДНК жокея, тонкая линия - ДНК мишени. Пунктирная линия показывает последовательности жокея, отсутствующие в копиях Д) и Л по сравнению с Л. Секвенированные области подчеркнуты. 200-нуклеотидные АТ-богатые последовательности на концах элементов обозначены светлыми прямоугольниками. Обозначения рестриктаз: В~ВатН1, G-Bgl.II, Н-Н1п(1111, К-Крп1, Р-Рб«, Н-Есой1, Э-БаИ, Х-ХЬа!.

Геномный анализ также подтвердил.что сайты узнавания рестрик-тазами EcoRI, BamHI, HlndTII, локализованные в левой части полноразмерной копии жокея, идентично расположены в большинстве его копий [Mizrokhi et al, 1985). Дополнительный анализ клонированных копий на растепление еще несколькими рестриктазами подтверждает это положение.По рестриктным картам жокей похож на элементы Sancho 1 и Sancho 2 ICampusano et al,1985), причем полная копия J1 аналогична Sancho 1, а укороченные копии J0 и J4 похожи на Sancho 2, так что, видимо, речь идет об одном и том же мобильном элементе.

Влево от EcoRI сайта, на протяжении почти 350 пар нук-леотидов, четыре изученные копии элемента совершенно идентичны по нуклеотидной последовательности за исключением нескольких начальных нуклеотидов (см. рис.2D). Границы жокея с правой стороны оказались менее консервативными, однако секвенирование показало, что JO, J1, J4 оканчиваются справа олиго(йА), которой предшествует общая 200-нуклеотидная АТ-богатая последовательность. По-видимому, J1 является полной копией жокея, a J0 и J4 - его укороченными копиями, которые возникли вследствие делеции обширной области J1 длиной свыше 2 тпн (см.рис.1 ).

Анализ нуклеотидной последовательности жокея.

Первоначально была просеквенирована целиком копия жокея J0 длиной около 3 тпн, встроившаяся в мдг4, а также последовательность мдг4, явившаяся мишеньв для внедрения жокея. Это позволило точно определить границы элемента и дуплицировавшуюся последовательность хозяйской ДНК для этой копии. Полнора^мерная копия J1 была полностью секвенирована в своей правой части - от двойного Hind ill сайта до конца элемента. От этого же сайта до конца элемента была секвенирована также укороченная копия жокея J4. У копий J1,J3,J4 были также прочитаны участки влево от EcoRI сайта, то есть начала элементов и прилежащие последовательности. Все прочитанные участки на рис.1 подчеркнуты.

На рис.2 приведены нуклеотидные последовательности полноразмерной копии жокея J1 и участков копий J0 и J4 от мест их расхождения с последовательностью J1. Для J1 последовательность от 600 до 2002 нуклеотида не определялась и дана такой, какой она найдена для копии J0. В предыдущем разделе уже были приведены

данные свидетельствующие в пользу правомерности такой замены. Так, судя по рестриктным картам, на протяжении первых 2 тпн клонированные копии жокея не отличаются друг от друга. Выборочное секвенирование последовательностей вокруг ЕсоШ сайта и двойного Н1пс1111 сайта в копиях .10, Л, подтверждает вывод об очень

высокой консервативности последовательности жокея. Наконец, наличие непрерывной белковой рамки на протяжении 2 тпн во всех секвенированных копиях также указывает на то, что эта область является консервативной и выполняет важную функцию.

Из рис.21) можно видеть, что с левой стороны различия между копиями жокея имеются только для первых двух десятков нуклеотидов. Незначительное варьирование нескольких нуклеотидов на 5'-конце жокея в секвенированных копиях можно объяснить вариациями сайта разрезания кольцевой ДНК, которая, возможно, является интермедиатом ретропозиции этого типа элементов. Следствием этого может быть, например, наличие 5'-олиго(с1А) в копии Л. Другим объяснением небольшой гетерогенности на 5'-конце элементов может являться их неточноё вырезание с последующей интеграцией в новое место генома при прямых транспозициях жокея, например, в процессе транспозиционных взрывов.

Все три анализированные копии жокея на протяжении последних 230 пар нуклеотидов почти не отличаются друг от друга и оканчиваются олиго(йА) разной длины. На расстоянии 8-19 пар нуклеотидов ей предшествует, как это характерно для большинства генов, транскрибируемых РНК полимеразой II,- сигнал для полиаденилирования А А ТА А А. Наличие на 3'-конце жокея олиго(с1А) последовательности вариабельной длина предполагает, что первичным интермедиатом его транспозиции является соответствующая ему поли(А)+РНК. Хотя в большинстве типов клеток транскрипты, содержащие последовательности и, очень гетерогенны по величине, в цитоплазме клеток тератокарциномы человека была детектирована поли(А) РНК длиной 6,5 тн, соответствующая полным копиям 1.1. В отличие от транскриптов 1.1, транскрипты жокея, как показано Мизрохи и соавт, 1988, значительно более гомогенны по длине и дают похожую картину распределения при анализе РНК из разных типов клеток. Так как длина основного транскрипта жокея совпадает по величине с секве-нированной копией Л, мы считаем длину полноразмерной копии жокея равной 5 тпн. Данные по геномному картированию с использованием различных Фрагментов Л подтверждают этот вывод.

А

catac£caacctqaa[¿cgtttltctcaatatttgtqccaca¿aatacttcqccaqtáadtt»catqaaqtCQctaa&tgcqattácaattqacgaCQcaátcatitacaaaa О AAftAflTCfirTCflCflTSGefiSftTSAGCftATCGAGTSGACGTSTTCftCftSflftSTCeCSftGArAAAftCSAAftACGTflflrTGrSfirCCftrCSCAÄfiCSrCrGCSCflSflrcsrSTGCrrATCrCÄ IZO CAAACAAAATCTATTTTTñGTCACTGCATAACGETGACGSCTTCGGTTCGC6AAACTTATCAGCfiACTAGCAfiTTTCTAñGCTGTGTTSTTTTTGCCCCTCGCCCT5CGCGCTGCBCAAS 240

IS1ALYGISIKTIDÎMENSF CGGGAGSTTGTTACAATTTACCTTACAftSTAAACCGGTAAATCTTATCGTGTTTASTAfiATATCAATTGCfiTTATACGGCATAAGTATAAAGACAATTGATATAATSEASAATTCATTTS 360 A6SRPSNGC2KFEKrtRKVAGVEPGELRSQLRASCAVVSPN CTCAfiTC6CGACCTAGCAATGGStSC6ATAAATTT6AGAAAAT6fiGGAAAGTASCAGGTETT6ASCCAGGAGAATTACGCTCCCfiACTCCSC6CCA6CTSTGCAETTSnrCCCCTflAC:C <80 lEGhPTBSAVSSLItVTlSGKTtlASVTCIISNVaANIIIClP TG6ftA66TftíBCCAACTCAATCTGCE5TCTCCfiGCTTAAT6GTGACAfiTCAGCAGCAACACCAñí6CñAGTfiTIACCTGCACTATTTCTAACSTñCABSCCñACATSftTCTGTACTCCTA 600 TYTDCTTVTTSICPTTPYBtiGLPTPlSSLPNKPSICANCPF CATACACTSATTÊCACAACCGTGACCfiCTAGCATTTËCCCAfiCIACBCCTTATGACAATGSACT6CCGACACCTCT5ÎCftTCACTGCCCAATAA6CCATCTAftA6CGAATTSCCCCTTTC 720 QAHIRTVNRKRKGVSapPLPILTPSPSRKTKRQATItPLNE fiAGCACAT6ATCSTACI6TCAACAGGAAACGAAAASSCET6TCT£AGCCCCCATTA££TATCCTCACCCCTTCTCCAAGCC6TAAAACTAAAAGOCAGOCCHCTATGCCACTCAATGAGG S40 EASTSTAAALKNNRFALLSAEAENtlEaDVSDAOSSIEÜSA fiGGCnCTACCTCCACTGCAGCAGCATIAAAIAACAAICGCnC6CGCnTT6TCCGC16AAGCGGAGAAIATGGAGCAAGACGIGTCGGATGCT6ATICTGACATTG5A5ACTCT6CTG 960 ASBGSeSSfiKVSItPfÄfCVPSVSIPVTLERSLMLSTeSSK CCCGAGATGGTSGTGGACAATCCGCTftAATATASChAACCCCCAGCCATAT6CGTACCAA6TGTAAGCGATCCGGTCftCCTTSGAACGSGCTCTCAATCTGAGCACCGGCTCCTCAAACT 1080 yïIRISRFGVSRIlfTAHPDAFRTAVKELHKLNCQFHHHQL ACTACATCCGCATTTCTAGATTTGuTGTfiTCCAGAATCTATACAGCCAñCCCTGAT6CTTTCCGCACCGCTGTAAAA6AñCTAAHTñA6TTAAAríGTCfiATTCTGóCAíCACCñACTTA ¡200 к EEKPïRVVLKGIH.ANVPSSaiEQAFSllHGYEVLNIïCPR AAGAAGAAAAACCCTACAGAGTAGIGUTÂAAËGfiArCCATBCTAATGTTCCTAGTTCSCASAÎAGAACAfiGCATTTASTSSTCACEGCTATGAGSlCCTTftflTATCTATTGCCCCASAA 1Î20 K3DWtCNlQVNEDDKEATkNFKTRßNLF*INLKß6PNYkE3 AGTCTGACÍGGAAGAACATTCA&STAAACGAAGATGfiTAATGAAGCTACññAAAHCTTCAAñACTAGñCAAAATTT6TTTTATATTAATCTTAAACAA6GCCCGAAT6TTAAAGAGTCTC 1440 L к. I.TRieRÏBVTVERATIlRKELLJ CQRCStFBHSENfC fi Q TTAAGATHACTCGACTTG6CA6AT«CASA6TCACTGTTGAGC6CGCTACACGTAGAMAGAACIGCTSCAAT6"tCAAAGATGCCAAATIIITGGACACTCTfiAGAACI6TIGCGCCCAGG 1540 D P 1 CBt'CSGPHHTSFALC Í S D V С t CÍUCSSDHVSTBKSC P AT[CTAIIIGTGGTAAAI6ÎAGÎG5ICCCCATATGAC£GSGITC6CTnGTGCATAAGIGACGTATGinGTGTATAAAnGTGGTBGTGAICHTGICTC6ACASACAAAAGCTGCCCTG 1680 VRAEtflKKLKPRSRlPHINHIfiTLKPPQRSSSGYlPAEAL TCAGAGCAGAGAAAGCCA'ÍGAAGCIAAAACCAAGGTCCAGGCTAGCGATGACTAATAAThITGCCACACICAAhCCTCCACAACGTTCTTCAAGCGGTTAKTACCAGCTGAGGCATTAA 1800 RTNISYAÍIARRNITSGRARATVBAEVIF'TSBNSlNNKFil GASCCAACATCTnîATGCTGATAITGCTCGACGCAACftCGACTCAATCTAG8GCTCG16CTACT6TSCA66Ct6AA6TTAIACCAACGTCGGACAATASCC7TAACAAIAAAItTAI6A 1920 TIDNSIRAINTRHDEIFKLIHETVEANKAFRELVQVLIÎR CGTTaGACÎlhCrCCArrCGeSCCArMArACeASAAreaiICSA«CÎArTrAiîSC7-rArACACeAAflCTeTA6HGGC;TAATAAhSCTTICASAeAACT6fiTÎC«G6TTCTAATTHCACSTA 2040

* H Т Q F TL К IGIUNARGLTRGSEELR 1FLS0HD IDVMLTT I p k »

TTCCTAAAIGACTCAAGCAHCCTTAAAAATCG6ATT6I6GAACGi;TCGtG6íiTTAHCAAGGG6CTCTGA6Gft6CTTCGGATATTCCTCAGC6ATCACGfirArAGACGTAATGCTrACCAC 21Í0

EÎHHRVGQRIïLPGïlHYHAHHPSGNS'RlàGSAVlIKSRLC GSAAhCACACftTGCGftGTTGGTCAGCGCATCTATCTCCCAGSGTArCTrATGTATCACSCCCACCACCCCAGTGGTAACAGTAGfiGSîGGCTCTGCAGICATCATAAAATCTAGACTTTG 2280

hSPLJPlSTNDRQÏARVHLQÎSVGTVTVAAVYLPPAERUI ïCACAGCCCTCTSAC«CCIATCICTHCTSAlSACfiGGEAGAIAGCGAGAGTGCACCT6CAAACATCGSTTG66ACCGÎCACTGTAGCTGCTGTTTATCTACCTCChGCAGAAAGAT6GfiT 2400

VÎDFKSKFAALGNKFlAGGGYRAk'HAHHSNP RSCPRGKRt A3TAGATGACTTCAAATCCATSTTTGCTGCGTTAGGCAACAAftTTTATT6CTGGTGGÎ6ftTTACAATGCCAAACATGCATGGTGGGGGAACCCfiAGATCCTGTCCTAGA5BÎAftAATGTT 2520

QEVIAHGQÏQVLATGEPTFYSYKPLLTPSAL11FFITC6YG BíAABAAGTCATTGCACATGGGCASTACCAAGTTCTSGCTACEBÍCGAAHCAGTTTtTACTCTTACAACtCTTTBnAACACCATCAeCKTTGATITTTTTATAACCTSTBEGTACGB 26W

HGRLOVarLSELSSDHLFILAVLHATPLKKPSRVRLLAHN CATGGGCAGGCTABAT6TACAAhCTCTCCAGBAACTCTCGTCGGACCATCTTCCTAITCTG6CT6TATT6CACGCTAC6CC6TTAAA6AAACCACAACGCGTAC6HCTACTTGCCCATÎiA 2760

я J I N ¡ F fc THLEaLSEVNHBILEAvalBîiATSLFHSXLSEA TGCTGACATAAACAÎATTCAAAACCCATCTT6AACAGCTGASTGftBBTAAATATGCAAHTTCTSGAbGCGGT63ACATTGATAAT6CCACAA6CCTTTTCATGASCAAACÏAAG7GAS6C 2880

AQLAAPRNRHEVEAFRPIBLPSSILALLRLKRRVRKEYAR TGCTCAECTT6CTGCflCC6AEAHATC6SCAT6AASrASSG6CCTrCAEAi:CACrrCfiACrrCCrTECASTATATr6SCACrGCTCABe:TAAAACEAA6AGTTC6AAAA6ftArST6CTA6-3000

TGDPRK8Q1HSRLANCIHKALARRKQA01IITFLIIN1.6AÜA JA[ASeTGATtaCGCAT6CAACAiAT[CACASTAG6CI66CCAfiCTGCCTGCAIAAGBCCCTTGCTCBAABAAAGCA6GCCCAAATAbATACCTTCn6BATAACTT66BTBCT6ACBC 3120

STNYSLMRlTKRFKAttPTPKSAlKNPS6SMCRT3LEKTEV 6ASCfiCAAftTTACTCACTBT5GCGTATCACGAAAC66TTCAAAGCTCA6CCCACCCCAAAATCA6CAATCAAAAATCCSTCT66TGBCTG6TBTCGCACÎABCTTGGAAAAftACTGAABT 3240

FANNLEÖRFTPYNYAPESLCRSVEEYLESPFQHSLP L S A V GTTCGCTAACAACCTTGHGCAACGTTTTACACCCTATAACTATSCACCGGAAAGTCTCTGTCGTCAGGTTGAAGAATMCTT6GAATC6CCCTTTCAAAT6AGCCTGCCTCT8AGT6CTGT 3340

TLEEVKtiL fAKLPLKKAPGEDLLDWRTlRLLPPQALfiFLft CACACIGBAAGAAGIGAAbAAlTTAAIABCCAAGCTBCCACTTAAGAAAGCICCTGBAGfiASATCTTCTTBATAATAGAACCftTTAGACTTCTCCCAGATCAAGCATTBCAGTTCCTTGC 3480

[_1ЕЯ8У1!>У6<РРИЙЙК5Й511111Н1<:7БК7Р70УР8УДР7 тйА7А77СДЙС«6Е677Е776А76776ВСТАС7ТТЕС6ййй6ЕТТБ6йййТЕББЕ6й6Сй7йй77й7БА7СЕй7ййБйС7Б6ЙАААЙЕЙСЕ6йСЙБйЕБ776АС!Е67ЙЕйебСЕСЙЕ 3600

51.1Р516К1НЕ111-11-НИ11ТС*11УТКй1РКР»Р6Г1)|.8Н6 ЕАБС77йС7ЕСЕй7Е7С7Б687ААйДТ7й7Е6й6ЙБВЕ7БЙ7ЕтйАСйВБСТБС7ЕйЕЙ7ВСйАВБА7Б77АЕСАЙА6С5йПСССААНтгаБТ7786ЕПСС867Т6ЕАБЕАЕБ6 3720

Т Р Е О 1- Н 8 V V N Р й I- Е й К Е № Г Е У й V 6 й Р I Р I В 8 й Р 8 В V Н Н Р 5 ТЙСТЕЕ7БАБСЙЙС7АЕЙ7Й6ШЙ67БАДСТ77БЕ7Е7ЕВАЙ6Е7А76ВЙЙАЙЕЙЙББАБ7А76САБ7ЙБВ7БЕЕ777Е776Й7Й77ЕАДСАВ6ЕА7776ЙЕА6ЙБТС7Б6ЕАЕЕСГ66 38«

I I У К й К К I Г Р Р 6 I V I V V К Б Г I Е Е Д Г Г Н У Б V Р 6 У К 3 Б I К Р ! ЕС7СС787ЙСАЙА8Е8ЙАБЙ6БСТ6Т7ЕЕЕБСС8СЙБС7Й7Й777ББТ7Б7ТЙАЙЙБ777СЕ76БАЙБААЕЕСДСА77С£АЕВТЕ7Е7Б776А7Б8Б7ДЕЙАА7ЕА7СЙЙ7СЙЙБЕСАА7 3940

ДЙБУР868У18РТ1.УБУРЙ8РНР1Н7РУ7ЕУ8ЕЕ0У11Й7 ТБСЙБСТББЙ6ТТССГСЙА6БЙЙ6СБТТСТТББСССАЙСССТЙТЙСТСЙВТТТТТБСТТСББЙСЙТБССТЙСТСНСЙСЙССЙ8ТСЙСАБЙББТАБАСБЙАБЙЙ8АТБТБСТСЙТЙБССЙС «80

УЙ&87ЙУ1ТК8К5!1йА7Б818ЕУ18йР86ЦЙЕН»НУВ1а С7ЙЕБС7БЙС6Й7АЕ7БС7БТЕЕ7СЙСЕЙАЙЙ57ЙЙАА57Й7ЕЕ76БС7БСЕЙС77С7БЕ7С7АСЙББАД7ЙСЕ7Б5А7БСА77ЕЕА8ЕАА78БЕЕТ6Й8ААЕ7ББЙАТ6ТБЕБЕАТЕАЙ 4200

йЕКЕййУ7РАНД7В5СРБУ51Н8Д1..1РННВАУЕУ181710 ЕБП6АЗЙЙБТ676ЕЕЙЙ7Б76ЙЕ6ПЕ6ЕСЙЙЕСБЙАЕЙББ7А,;Е7Б7Е£6667БГСЙ67Е7ЕДЙ7Б6АЙЕЙЕ76Й7ЕА6ЙЕЙСШСЙББС77Й7АЙЙ7ЙЕСПБ87АТ7ЙЕСЕ7СБА 4320

8К17Р8|;К1ТН188ЙРД7»УАДН8И1.]ЙРДНК1-31-6С|;УН ТД66ЙЙ5СТСАСС7ГСЙ5СЙББСАИ1САСАААТА11СЙ8САА6С8Т1СА66ЙССАЙ66ТТ6СТС65ЙТ8ТСП6БПСЙТТБСЙССАС6СЙЙСЙАЙСТ6ТСВСГТБВСТВСАЙ6Б7САА 4440

1УК5;1АРЕ1.РУБ1.аУУ51й6К5Н1НИ:11! I I 8 А К 7 I. Д Д I 5 1йТТТйСАй6ТССАТЙТТБ6СССССТБССТ6ТТСТЙСББССТ6САВБТЙТЙСБ5САТТБСТБСБЙА8А6ТСАССТТЙАТЙА5ЙТССБ8ЙТТ7ТЙСА6БСБЙЙ6АСС7ТЙЙБЙЙ8ШТ1С 4540

БЙРЙУНДТДи1ЕДВ1КУРк1.6ВК1.(ЗН1й8КУНЕ(11НУНРН 66Е6БЕ7ЕЕ778Б7й7й7ВйБйАСййБйБДСй7С6ЙАЕБЕ6ДССТСнйББ76ЕСЕййй17йЁ6йеДСйА6Е7ЕСй6ААЕА7С6ЕСЕЙЙЙАД7А7А7Б6ЙАй6БЕТ7Ай7Е7АЕАССССЙА 4480

81ЙЙК1.БТЙЙУУЙАРРР7ДУКД!\1КДННРН01РН1.У17* СА6СС7йБ[ЙА66нйбиАББййаБСйБП6'1ББ7Сйй7БИБ№ОТС56йПй£ЙБ7МйййБЙЙБЙС7СЙА8СБЙСАССйСССТСЙ76ЙСС7ССС7АЙП7ББ7777БЙСС7АБЙЙ 4800 йБ7Е77йБП7ТДДЙД77СДПДЕДД7Дй7САйА7АААТДАТААТТаСТДТБТТй7АТСААЕТАПйШТТС7ЕЕЕ7й7СЙ77777йВй77ЙДйай7Е7Е77й67С77ДД67ААСЕДА6 4920 йCйEA77S7нAйfl7AflйД7flй777ftflSCftSД7Cflfifl77ДДБ77BCCSCA7ESБTflAEAS7GCБTTШEflAflTflflTfiAAЙftCftTCATftйAfiflAflftftftAflйa^-atacaaaattaatqзtq¡^ 50(5

В

тб7ТЙ77йййй77ЕЙ77йБЙЙ7йй7ЕЙЙЙ7ЙШДД7Ай77АС7Д7ШД7А7ЕАДС7й77А7ЙА7ТС7ЕСС7й7Ш7777йБ6Д77ййййй7ЕТ677йБ7С77АА87ААСМДВДС 2712 «Й7Т87ЙАЙАТЙЙЙЙТЙ1УПТАЙБЕ№А7ЕЙЙЙПЙЙ877ВЕЕВЕА7БВВ7ЙАЕЙ676С6776Й7ЕЙЙЙ7АД7АЙЙЙЙСЙ7СЙ7ЕА7Д7АЙЙ6ЙСС7ССЕ7ЙЙСЕ76БГ777БЙСЕ7АБ 2822 йййеТС77й67иТАЙМТТСД7ТйШТтСтТШТМтТЙСТй78Т7й7й7СййС7й77ЙТАй77СТСССТй7СА7ТТ77АББЙТТйййййТС7БТТЙ8ТСТТМ6ТЙАСС 2932-ЙАБЙЕАЕА7767ДЙАА7ААЙЙ7ЙЙ777ДЙ8ЕА6Д7СЙАА7ТАЙВТТБСЕБСЙТББ8ТЙЙСЙ6Т6Е6ТТБЙТЕЙЙЙТАЙТАЙЙАЙЕЙТЕЙ7£87Д7Й7АЙ77ДЙЙЙЙААЙАДАЙЙЙЙЙЙЙЙ 3072 ЙАЙЙЙАЙАЙЙ

С

ЕТЙ7СТЕСЕ6Й7С7Е7А77Б7ЙЕАЕЕЕСАЙЕЙБЕЕ7Й6ЕЙЙБЁЙЙБЕ7ЙББЙЙС7БСАБЕ7Б76Б7ЕЙЙ76Е7АБЕЕЕ7ЕА6СВЕ7АБАВ7СЙААЙБЙЙБЙС7СЙЙ8ЕБЙСА£ЕАЕСЕ7С 2310 А7БАСС7СССТйАЕСТБ5ТПтейШДейАй87Е77йБТ777ЙААЙ77Ей77ЙВай7йй7СйАА7ЙДА7АаТДД77АЕ7А7677А7й7САДС7А77А7АЙ7ТЕ7СЕС7Д7ЕА77777й8 2430 БЙ77ЙЙАЙЙ7Е7677АБ7ЕТ7ЙЙ6ТЙАЕЕААБЙСЙСЙ7ТБТЙАЙЙТЙАЙЙ7АЙ7Т7ЙЙБЕЙБЙ7ЕЙЙА77ЙЙВ776ЕСБСЙ7Б8Б7ЙЙЕЙБ76ЕВ776Д7ЕЙЙА7АД7ЙЙЙЙАСЙ7СЙ7Е 2550 Б7АДАДА

0

1агде1 дааааиидиидиаэади^лс^аШШаиаааа

70 д1сцас[Ыаса.—Т7СйБ7СБйС7С7ЕД8й... 3021Ьа5«... 8ЯЙЙДСДГШШДТЙШТ7А„аиааЫ<|сааи

11 а1сага1асааааййййй7ЕА77ЕАСй76ВБА6й.. .4983Ьа5е5., .АЙАЙАСЙ7СЙТ-----------йиаШасааааЦа

14 сШз1аиаиа-----ЙСЙПЕБЕА7БББЙ6Й.. ,23251)а5С5...ААААЙЕЙ7СЙ7Е87--------йва^акаиасасс

73 да1асссд4асад-----7А6Т7ЕБШББ8Й6Й...

Рис.2 Нуклеотидная последовательность жокея. А) последовательность полноразмерной копии аюкея (скомбинирована

из последовательностей J1 и J0 см. текст). Аминокислотные последовательности двух рамок показаны выше последовательности нуклеотидов. В) и С) нуклеотидные последовательности 3'-концевых областей J0 и J4 соответственно от мест их расхождения с поледователь-ностыо J1. Подчеркнуты: в нуклеотидной последовательности 200-нуклеотидная АТ-богатая зона, в аминокислотной - Cys-домены и обширная область гомологии различных LINE. D) Концевые участки различных копий жокея и последовательности прилежащей геномной ДНК. Строчными буквами показана хозяйская последовательность, дуплицированные последовательности генома подчеркнуты. Верхняя строка - последовательность мишени 1мдг4) для копии J0. Для J3 граница между жокеем и хозяйской последовательностью неизвестна и дана по аналогии с другими копиями жокея.

Интересно, что при более высоком разрешении основная полоса поли(А)*РНК жокея разделяется на две. По-видимому, обе они считы-ваются с полноразмерных копий жокея, различающихся только тем, что в них имеется одна или две 200-нуклеотидные концевые АТ-богатые нетранс пируете области. Наличие двух таких последовательностей на 3'-конце делетированной копии жокея J0 подтверждает такую возможность. Можно предположить, что копии жокея с дуплицированной АТ-богатой последовательностью могут терять одну из них на уровне ДНК вследствие рекомбинации по этой последовательности, а также при обратной транскрипции РНК из-за "перескока" на матрице синтезирующейся минус-цепи ДНК. Роль самой 200-нуклеотидной последовательности в Функционировании жокея остается неясной. Возможно, она участвует в терминации или в полиаденилировании транскрипта жокея. Во всяком случае, сигнал для полиаденилирования ААТААА находится внутри этой последовательности.

Проведенный анализ показывает, что 30 и J 4 могут быть получены из полноразмерной копии J1 удалением последовательности длиной более 2 тпн, при этом делеция для J0 и J4 осуществляется различным образом (рис.1,2). Так, у J4 отсутствует последовательность J1 с 2200 по 4668 нуклеотид, а у J0 - с 2600 по 4771 нуклеотид. Вместо них у J4 имеется вставка GATCTCTAT, а у J0

- 200-ну^леотидная АТ-богатая последовательность. В результате в укороченных копиях практически полностью отсутствует вторая рамка.

Известно, что внедрение мобильных элементов сопровождается удвоением короткой последовательности хозяйской ДНК. При внедрении LINE дуплицирующаяся ДНК не имеет постоянной длины и варьирует от нескольких до полутора десятков пар нуклеотидов. Как можно видеть из рис.2D, различные копии жокея окружены короткими повторами длиной: для J0 - 9-10 пн, J1 - 5-10 пн, J4 - 9 пн, которые, как мы считаем,возникли вследствие внедрения жокея в хозяйскую ДНК. В одном случае дупликация ДНК была подтверждена прямо, поскольку ранее была секвенирована последовательность ДНК мишени. При этом дуплицировавшаяся ДНК отличается одной нуклеотидной заменой от секвенированной последовательности (рис.2D). Неопределенность в длине повторов для J0 и J1 связана с тем, что неясно, куда отнести несколько концевых dA - к жокею или хозяйской последовательности, однако по аналогии с другими LINE логично предположить, что дупликация не имеет строго определенной длины.

Кроме основного транскрипта у жокея имеется более слабый транскрипт величиной порядка 2,7 тн [Георгиева С.Г. и др. 1988]. Вероятно| он транскрибируется с делетированных копий жокея, подобных тем, которые были секвенированы нами. Во всяком случае, по длине он совпадает с копией жокея J 4. для Li образование усеченных копий обычно связывайт с неполной обратной транскрипцией РНК этих элементов. Известно, что в геномах млекопитающих 3'-концевые последовательности Li значительно превалируют над их 5'-концевыми последовательностями. Подобный механизм может, вероятно, реализовываться и при обратной транскрипции РНК жокея. 1J недавно опубликованной работе приведена последовательность D элемента длиной 380 пар нуклеотидов, интегрировавшего в область гена dunce D.melanogaster [Pittler and Davis,1987). Сравнение ее с 3"-концевой частью J1 показало, что за исключением нескольких нуклеотидов эти последовательности полностью совпадают. Значительно чате, однако, делетированные tкопии жокея представлены последовательностями, в которых отсутствует фрагмент внутренней части этих элементов (см. рис.1,2). Для образования подобных копий возможно несколько объяснений. Одно из них заключается в том, что при обратной транскрипции РНК жокея, часть последо-

вательности не прочитывается из-за "перескока" фермента на матрице РНК. Это может быть связано, например, со сложной структурной укладкой РНК жокея. Другое объяснение, заключающееся в том, что обратной транскрипции подвергаются сплайсированные РНК жокея, кажется нам менее вероятным, так как анализ первичной структуры жокея не выявил характерных сигналов для сплайсинга внутри или вблизи делетированных участков.

Анализ кодирующей часта .жокея.

При анализе последовательности жокея выявлены две длинных открытых рамки считывания, расположенные последовательно в одной цепи ДНК. Во второй цепи ДНК достаточно протяженных открытых рамок считывания не обнаружено. Аминокислотные последовательности рамок для копии Л приведены на рис.2. Длина первой рамки, считая от первого метионина, составляет 567 аминокислот, второй -916. Первая начинается на 300 нуклеотиде, вторая заканчивается за 223 нуклеотида до конца элемента, перед АТ-богатой последовательностью. Вторая рамка сдвинута относительно первой на один нуклеотид влево и начинается внутри терминирующего сигнала первой, причем первой аминокислоте второй рамки также предшествует терминирующий сигнал. Интересно, что добавление одного нуклеотида в этой области (например между нуклеотидами 2048 и 2049 1 могло бы привести к образованию одной длинной непрерывной рамки считывания. Однако секвенирование последовательностей J0, Jl, J3, J4 не выявило в данной области никаких отличий. Таким образом, вероятнее всего предположить, что для трансляции второй рамки считывания необходимо либо образование РНК-транскрипта, начинающегося вблизи этой рамки, либо супрессия терминации со сдвигом рамки при трансляции полного транскрипта жокря. Известно, что супрессия терминации характерна для транс-криптов ретровирусов и, вероятно, многих мдг, но в подобных случаях зона перекрывания между двумя рамками имеет больший размер.

При анализе первой рамки считывания выявлена гомология с одним иЗ пептидов, который образуется при процессинге белкового продукта GAG гена и кодируется всеми репликационно компетентными ретровирусами. этот сильно основной белок непосредственно связывается с РНК ретровирусов и предполагается, что он участ-

вует в ее укладке. Его отличительным и высокоспецифичным признаком является наличие домена с характерным расположением цистеиновых и гиетидинового аминокислотных остатков следующего вида: CysX2CysX4HisX4Cys, (здесь X - любая аминокислота). У жокея, как и у большинства ретровирусов, гистидину в нем предшествует глицин. У многих,но не у всех ретровирусов эта последовательность является дуплицированной, причем расстояние между Cys-доменами составляет 5-12 аминокислот. Помимо ретро-вирусов точно такие же Cys-домени обнаружены в геномах интрацистернальных A-частиц, copia элемента дрозофилы и вируса мозаики цветной капусты. Известно, что все эти элементы реплицируются через обратную транскрипцию. Интересно, что за этим Cys-доменом у жокея следует похожая, но не идентичная последовательность (рис.2,3). Также, как и у ретровирусов, у жокея область внутри и вокруг Cys-домена содержит высокий процент основных аминокислот. Можно предположить, что подобно ретрови-русным, белок, кодируемый жокеем, участвует в укладке его РНК, способствуя обратной транскрипции. В целом же, по своей структурной организации, область, содержащая Cys-домены жокея имеет наибольшее сходство с соответствующей областью I и F элементов дрозофилы, которые также локализованы в их первых рамках считывания (рис.3). Недавно Cys-домены обнаружены у LINE млекопитающих (LI ), ingi элемента трипаносомы и у cin4 элемента кукурузы, но там они локализованы ближе к концу второй рамки, следом за областью, предположительно кодирующей ревертазу. У L1 Cys-домен имеет несколько другую структуру - CysX3CysX7HisX4Cys, при этом он не дуплицирован.

Обнаружение у жокея кодирующих последовательностей для РНК-связывающего белка предполагает, что подобно другим ретротранспозонам, транскрипты жокея организованы в рибонуклео-протеидные частицы, в которых ииущесшляется синтез комплиментарных копий ДНК. С другой стороны, Cys-домена найдены также и у некоторых регуляторных белков, таких, например, как фактор TFIIIA [Miller et al,1985 1, участвующий в транскрипции генов для 5S РНК. Поэтому не исключена возможность того, что кодируемый жокеем продукт влияет на его транскрипцию.

Вторая рамка жокея также содержит высококонсервативную последовательность, но значительно большей длины. Ее протяженность составляет около 400 аминокислот и она по всей длине

А

LlHs NRFÍTSSÉÍEftlIW5LPKKKBPGFÉSFTAÉFyKR¥KEELÍTFLLK^

Lind (lSPISPKElEAV!N5LPT№5PEPDGFSAEFÏIÎTFKE0L[Ptl.KtlFltt;iEV£6il.PN5FYE/>T!TUPKP8raPlKlEKFRPISUSIDiKIUKILAN

1 EEHITYLELSSaUTL-mCffMISYefiiœSHTTmn Jockey • LSAmEÉVWLÍAliPLtrKÁPGEK.«

-F* RP1ÍE1TK11XDH—LSFi.KSMYiiL'nPEfl'nOLPHSÀVRYik^

litgi ■ FSPITH6ELRRSIKLLPSGSftftGPDCLYMEBLBHL61TALHVVLRLFMESLBTGVVPPBMKT6Vni'ILKfl6rK№DtD5YOTTLT5CLCKVI1ERlIflft

LlHs áÍDQHtKKLimDÍVBHFá№^№№ttIRKSÍNI ISHI№TK isiDAECAFDKIQaPFflLKPLNELSIDGTYLK IÍRÁÍ YCKPTAtli ILMCOKL Lífítí ,

1 RLHHLVTYtíHLlilDKGFGFKlíuKSrSGCLLYy&YLITííE^MJITS—LVTLSFSRAFDSVByKSnôQLQEMKTËFKlIKYEK.KFHSNftKïTVRyfîPHTS

Joele» RLLTCmTMjwaFGFRLMira«^

F» PLHQííaTYHM!ÏFftHSF&FREEHBTlÉQVNRÍTTEIRTÁFÉYRÉYCTftVFLÉi/SQÁF^

Ir,31 RPP.BTVESatTPQ—aSGFRP6CSTLEaLLHVRftflLCH-HTHg?RTSflVF^DVEKaFi)îVI)HPi(lRREHHRaKVSFHiVKNC'.'SFLEHRTeRVfiFi<EKLF

LlHs EfiFPLKTGTRQGCF-ÚSPLLFWÍVLÉVLÁRñÍRQ£KEÍK6IÚE6KEEVKLÉLFñ3¿ -----éÁfiáíttÍS«F5tV56YÍ(ÍW5íSFLY

Lind EftIPLKSG TRGSCPL3P> LFHIVLEVLfiRftlRQSKElKSIQISKEEVKISLLADB«IV Y ï SEFKN-----STRELLNLIHSFGEVVGYKlNSHKStlñFLY

I SPLPLFN61P8ESPlSVlLFLIfifW:lS«HSL«K!K----------FSAYÄOTFFLnSFNKSäTliTWitLDHLFOOlEKMCSYSGftSLSLSKCEHLHl

Jockey SIKPl AfiSVPüGSyLEPTLYSVFÄSDrtPTHTpC'TEVDE------EDVLIATYMpTAVLTIiSKSILAÄTSSLÖEO

f» TVHTÍeÁSVP6GSVLGPTLYLÍyÍÁ¿ÍPÍ..............NSRLTVSTFÁDDTÁÍLSRSRSPÍOÁfÁSLALYLlD]KK¿LSD¿RÍ¿^

laqi RSSTFEfiCVPGGTVF-GSXilFUVnHSLSQRLfiEVPLLa----------H5FFfißPLTlLftRHTERDVIHHTLSCGlHVVL6WSKEYFHSVKVA<T^CTLF

LlHs ÍKMROTESaÍH3ÉLPFTIftSKRÍKYLéÍ0¿TRDVKBLFKEÑYí.PLLKElKEDTÑK¿KNl^

LIM TKNK0AE^EÍPETTPFSIVTNNlKYLSVTLTKEVlííLYDKHFKSLKKEIl(EHLRRtí(''DLFC3t(IGRINlVKHAtLFKfiÍYPFSAlP3KlPTQFFlíELE5A

¡ CÍKRHCTEKlSCNHFBIPSyTSLKILSÍTLMNt'YKWNTHlííLLLf'KLKHííLNI IKCLS5LKFNEMTHTLLHVñKATIIñKL.EYSLFLY6Kñp^SILHKíK

Jockey ANKT6SÇPGV5LHSRL í RHHQAVKYLG ÎÎL ÔaKLTFSRHÎTH iaQAFRTKmPtiSHL t ÂpâMKLSL6CKVNÎ YKSI LAP^YSLDVYSIMi^HL.HK|R

F «i TLBRQDCPRIÜS1PLPw5eVTY«¥HL№^

Ingi SCTERHPLTLBLDBERlGftPRTPKLLSVTFBCLaSHftTHflflSTRRKUOFRLLKISaiSaSTWSPRRCVLRflFYLftLVaftHTHYStEftWYWgaWKRSRCLL В

Jockey LFYHJLKQGPHyKESLKlíRLGRYFVTVERftTRRKELLECQRCSIFGHSKííYCftCDPICGKEBEPHHlGFALClSDVCL—CINCGGDKVSTDKSCPVR

F« EPEí^PPRKMÉVHPIYKLBLLLHRRÍ ÍVÉEPHKRHAPVSCTWCQEYSHTRSY^

Jockey REKAfcKLKPRSRLPaTtfflifiTtrPPePSSSSViPSEALRTHISYftlJIfiRRNTTBSRñRATVQftEWiPÍEDKSLKNKFM.. 32 aa..LVQWL1TR-1PK«

Fu KÉLKIRLHKRMt4TftRVHt;DGLP?IPSETNPEVÍFSKÁft----SFAPHPTFHTHKTTFAKVLKSGHTPpfwSRTPKEV..31 ia.iíÓÑLVMSSNK»

Jockey jmPTUI6LMMGLTR65EÜRtFL$^^

F» *I№-TÜÍÁTHÑÁNGVSBRIU.ÉLfiQFL№iCHÍÍVK^

Jockey SVST-VTVftñVYLPPñERW I VDDFKSRFñALGUk-'F I ñGGüYHfiKKfiHHGNPRSCPR6KHLBE—Vi AH6Ö YÖVLATBEPTFYSYNPLLTPSALCFFITCG

F» DDNTLLTLftÁVYCPPRFTVLEAÉFLDFFBÁLSFÍÍFÍÁÁ&£YÑÁ

Jockey YGraLWTUELSSpHLHLMt^FLmWt^

F« lSRSLVKflECLPDLSSDHSPVLIriLRRYAENVKPPTRLTSSKTSHLRVKKYtSSHI^

Jockey . 6LPSS|ULLSLMVRmmBD™^

Fw Й1)—QÍEQLVHVKRRLRRÉÑQSSRSPTfiK8KLKVATRKLfiNñLKSEEDDDSRRYÍÉQ^

Jockey EVFñíííiLEQRFTPVHYAPESLCRQVEEYLESPFCflSLP......393 аа......rLBApLRRlS6ftPHYKRTRD[ERDLKVPKLGDKLBNIAaKY!1E

Fw (ITFAAHLSNVFTPHSATSTFALPSYPVHRHQOHTPiVF......382 аа......RA03KIL.fiTÍTGOTttYVRSEÑÍ№DÚNEP5VTÍlAÍTÉLKÉ

Рис. 3. Гомология между жокеем и другими LINE. А) Общая для LINE зона длиной 400 аминокислот, включающая в себя область гомологии с характерными доменами обратных транскриптаз ретровирусов. Двоеточиями и точками показано, что по меньшей мере, в четырех последовательностях в данной позиции находится идентичная или сходная аминокислота соответственно. Гомология между жокеем, I и F-элементами также показана двоеточиями и точками. LIMd - LINE мыши, LIHs - человека, Ingi . -трипаносомы, I, Fw - LINE дрозофилы . Б) Гомология между жокеем и F элементом в остальной области, не показанной в А). Fw является усеченным F элементом и поэтому большая часть ORF1 для него неизвестна.

хорошо выравнивается с последовательностями других LINE - Li элемента млекопитающих, Ingi элемента трипаносомы, I и F элементов дрозофилы (рис.3). Особенно высокая гомология выявляется между жокеем и тремя последними элементами. Приведенная на рис. 3 область, по-видимому, кодирует обратную транскриптазу, так как внутри нее можно выделить все сеьъ коротких консервативных участков, характерных для ревертаз ретровирусов. Похожие области найдены у вирусов гепатита В и мозаики цветной капусты, МДГ дрозофилы и дрожжей. Известно, что репликация всех этих элементов проходит через этап обратной транскрипции .их РНК.. Из рис.3 можно видеть, что помимо семи упомянутых выше консервативных участков, характерных для ревертаз ретровирусов, LINE содержат еш.е несколько консервативных доменов, свойственных, видимо, только им. Все это заставляет предположить эволюционное родство между различными LINE. Во всяком случае, в области, содержащей ревертазные домены, жокей обнаруживает значительно большую гомологию с LINE млекопитающих и трипаносомы, чем с МДГ дрозофилы. При этом гомология между LINE дрозофилы - I и жокеем ненамного выше, чем между жпкеем и остальными LINE, принадлежащими к эволюиионно далеко отстоящим друг от друга видам. Исключение составляет другой элемент дрозофилы - F, с которым жокей обнаруживает значительно большую гомологию, чем с другими LINE, причем не только в анализируемой области, но и по всей длине известной для него аминокислотной последовательности (около 40% гомологии). Заметим, что секвенированная Di Nocera и Casari, 1987

копия Иы элемента была 5'-усеченной, но можно думать, что гомология распространяется и на отсутствующий в данной копии район. Ип рис.3 видно, что последовательности обеих рамок Р элемента и жокея хорошо выравниваются между собой, причем принцип организации аминокислотных последовательностей на границе рамок (сдвиг второй рамки на один нуклеотид влево и присутствие в одинаковых позициях терминирующих кодонов) у них совпадает. Эти данные указывают на то, что Р элемент и жокей, по-видимому.

о о

Г--------Т-------"V

/

500

/

/

/

/

/

/

J0CK1 .SEX)

WINDOW, MATCH = 100 4Ь 1400. - 5040.

Рис.4 Dot matrix анализ последовательности жокея и F элемента. Последовательности жокея (от 1400-го нуклеотида на рис.2) и F элемента (5'-усеченная копия Fw>-изображены по горизонтали и вертикали соответственно. Критерием гомологии является совпадение 45 нуклеотидов из 100. Одна деление по осям соответствует 0,5тпн,

произошли от общего предшественника. Сравнение нуклеотидных последовательностей матриксным анализом также показывает родство протеин-кодирующих областей у обоих элементов (см.. рис.4). 2 то

же время в нетранслируемых районах никакой гомологии обнаружено не было.

Согласно сложившимся представлениям, наличие доменов, характерных для обратных транскриптаз ретровирусов, предполагает кодирование жокеем фермента с аналогичной активностью. Существование значительного числа копий жокея с делецией во второй рамке может означать возможность использования им обратной транс-криптазы in trans. Это делает менее универсальной модель, по которой новосинтезированная обратная транскриптаза LINE сразу же связывается и считывает именно ту РНК, с которой она транслировалась. Нельзя, однако, исключить частое появление делетиро-ванных копий жокея вследствие перескока фермента при обратной транскрипции полноразмерной матрицы.

В настоящее время большой интерес вызывает вопрос о транскрипции LINE в связи с наличием или отсутствием у них промоторных и регуляторных последовательностей. Согласно существующим представлениям при транскрипции LINE РНК полимеразоя II, новообразованные копии этих элементов, полученные с помощью обратной транскрипции и интегрировавшие в геном, будут лишены промоторов и, следовательно, будут являться псевдогенами. Таким образом, предполагается наличие большого количества нетранс-крибируемых и малого числа активных LINE. В рамках этой гипотезы транскрипция новых копий LINE возможна лишь при их интеграции рядом с хозяйским промотором. Для того, чтобы обойти эти трудности, выдвинуты предположения о существовании внутренних промоторов у LINE или о наличии нескольких тандемно повторяющихся промоторных последовательностей. Действительно, на 5'-конце двух L1 элементов мыши, были детектированы 200-нуклеотидные тандемно повторяющиеся последовательности, содержащие участки, напоминающие промоторные элементы. Такие последовательности, однако, не обнаружены у L1 элементов человека и крысы, а также у других LINE, в том числе и у жокея.

В работе Мизрохи и соавт. показано, что транскрипция жокея обеспечивается внутренним промотором, расположенным в самом начале элемента. Хотя делеционное картирование важной для транскрипции области проводилось для одной копии жокея (J1), эксперименты, показавшие фиксированность точки инициации для хромосомных копий жокея, позволяют распространить это утверждение на большинство его копий. Полученный результат снимает

имеющиеся трудности в объяснении механизмов экспрессии и широкого распространения LIME. Конечно, в настоящее время нельзя отбросить модели многократного повторенного промотора, основанного на анализе последовательностей L1 элементов мыши, однако изучение структуры других LINE показало, что дупликация последовательностей в начальной части этих элементов далеко не является универсальным принципом.

Обнаружение у жокея двух длинных открытых рамок считывания, обе из которых содержат домены, характерные для активных ретротранспозонов, показывает, что жокей сам кодирует функции своей транспозиции, обеспечивая образование новых копий ДНК на своей РНК. Мы не смогли выявить у жокея аминокислотных последовательностей, характерных для протеаз и эндонуклеаз, которые обычно кодируются геном POL ретровирусов и обнаружены у многих МДГ. Это предполагает, что что встраивание новых копий жокея в геномную ДНК происходит без участия активностей, кодируемых данным элементом и обеспечивается кле(очными ферментами. С другой стороны, отсутствие протеазного домена является косвенным свидетельством в пользу того, что трансляция второй рамки осуществляется с субгеномной РНК жокея и в этом случае не происходит посттрансляционного протеолиза, характерного для продуктов ретровирусов. В пользу этого соображения свидетельствует наличие у I элемента дрозофилы довольно обширной зоны со множеством стоп-кодонов, расположенной между двумя длинными рамками. С другой стороны, у L1 элементов млекопитающих Cys-домен и последовательности, гомологичные обратным ревертазам расположены в одной рамке вблизи друг друга.

Интересно отметить, что сравнение областей, содержащих гомологичные домены среди LINE, ретровирусов и подобных им мобильных элементов показывает, что с одной стороны LINE разных видов ближе друг к другу, чем к ретровирусоподобным элементам своего же вида,, а с другой стороны, LINE одного вида наиболее близки друг к другу. Эти обстоятельства делают нетривиальным вопрос о происхождении LINE и их эволюционной связи с ретровирусами и ретрови-русоподобными элементами.

Выводы.

Настоящая работа была посвящена изучению структурной организации мобильного элемента дрозофилы жокея. В ходе работы

1. .Определена первичная структура мобильного элемента D.mela-nogaster жокея (длина 5000 пар нуклеотидов), который по своим основным характеристикам является типичным LINE (лишен концевых повторов и заканчивается на 3'-конце олиго( dAi-последователь-ностью вариабельной длины).

2. В жокее обнаружены две длинных открытых рамки считывания -ORF1, длиной 567 аминокислот, и ORF2, 916 аминокислот, расположенные вплотную друг к другу со сдвигом в один нуклеотид. Судя по гомологиям, ORF1 кодирует РНК-связываюишй белок (nucleic acid binding protein), характерный для репликационно компетентных, ретровирусов, а 3'-концевая часть ORF2 - РНК-зависимую ДНК полимеразу.

3. Анализ домена (около 400 ак), соответствующего обратной транскриптазе, и сопоставление его с аналогичными последовательностями других ретротранспозонов, показывает тесное эволюционное родство жокея с LINE далеко отстоящих видов (млекопитающие, трипаносома, кукуруза), гомология с которыми у жокея выше, чем с МДГ того же вида.

4. Установлено, что по нуклеотидной и кодируемой им аминокислотной последовательностям, жокей наиболее; близок к другому LINE дрозофилы, F элементу, гомология с которым составляет 40-50%. Предполагается, что оба они произошли от общего предшественника.

5. Помимо полной копии, были секвенированы две укороченные копии жокея. В них отсутствует большая часть ORF2, однако остальные районы, в том числе и концевые области, являются высоко консервативными. В этом отношении жокея отличается от других LINE, укороченные копии которых обычно являются 5'-усеченными.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации.

1. Мизрохи Л.Ю., Приймяги А.Ф., Ильин Ю.В. Мобильный элемент дрозофилы жохей является ретропозоном и кодирует GAG специфическую белковую последовательность, характерную для ретро-вирусов. Докл. АН СССР. 1987, Т.294, С.1235-1239.

2. Приямяги А.Ф., Миэрохи Л.Ю., Ильин Ю.В. Мобильный элемент дрозофилы жокей является ЫЫЕ-элементом и содержит кодирующие последовательности, гомологичные некоторым белкам ретровирусов. Генетика, 1968, ЫоЗ , с.414-427.

3. Ильин Ю.В., Архипова И.Р., Приймяги А.Ф. Ретропозоны дрозофилы: структурная организация и механизмы транспозиции. Тезисы V Всесоюзного общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова. 1987, Т.6, С.,47.

4. Приймяги А.Ф., Мизрохи Л.Ю., Ильин Ю.В. Структурная организация нового мобильного элемента дрозофилы жокея. Генетика и селекция в научно-техническом прогрессе. Тезисы докладов IV конгресса Эст.ОГИС. Таллин, 1986, с.48-49.

Материалы диссертации были представлены на 8-м двустороннем советско-французском симпозиуме по молекулярной биологии белков и нуклеиновых кислот.