Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика жокея - мобильного элемента дрозофилы, относящегося к группе LINE

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Характеристика жокея - мобильного элемента дрозофилы, относящегося к группе LINE"

АКАДЕМИЯ НАУК. СССР ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. U.K. КОЛЬЦОВА

ка пргсах рукописи

с

георгиев.* софия георгиевна

ХАРАКТЕРИСТИК ЯОКЕЯ - МОБИЛЬНОГО ЯЛПГЕНТ» ДРОЗОФИЛЫ, ОТНОСЯЩЕГОСЯ К. ГРУППЕ LliiE.

03.00.15-Генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени КДНЛИЛАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАЫ.

Москва-1991

Работа выпонена в Институте молекулярной Знгельгардта АН СССР и Институте биологии Кольцова АН СССР.

биологии им. В.А. развития им. Н.К.

Научный руководитель:

чл.-корр. АН СССР Ю.В. Ильин

Официальне оппоненты:

доктор биологических наук И.Я.Тимофеева

доктор биологических наук А.И.Иванов

Ведущее учреждение - ВНИИ генетики и селекции пром.

микроорганизмов

Залита состоится "/Ь" ■ 199рг. в "/V" часов

на заседании Специализированного совета Л 002.65.01 при Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова АН СССР по адресу: 117984 Москва, ул. Вавилова, д. 26

У' • х Автореферат разослан 7.>" апреля" 1991 г.

Ученый секретарь Специализированного совета

кандидат биологических наук (Е.М. ПротопопоЕ

Актуальность проблемы. Иобилыше элементы дрозофилы

представляет собой обиирную группу, в которую входят представите^:.

многих семейств. Около JOS генома О.те 1 annoaste- ппих-одитгу на

мобильные элементы. Многие из чих актив!'! гранскрибируются и играют

важную роль в мутагенезе у дрозэ*."-.^. (Около 702 спонтанных мутация

Y D.melanogaster вызвано Мобильными элементами. )

Мобильные элементы типа LINE (Long Interspersed Nuclear

Elements), обнаруженные y Drosophila melanogaster, являются иироко

распространенной группой, представители которой обнаружены у многих

4 5

эукариот. Количество их в геноме сильно варьирует, от 10-10 копия

.1 з геноме крьгсы до 30-40 копия I-элемента у D:melanogaster.

í

Структурная организация LINE принципиально отличается от других «¡обильных элементов тем, что они не содержат повторов на концах, эднако имеют А-богатуп последовательность и предшествуюкия ея :игнал для пслиаденилирования на 3' конце. В геноме копии LINE жружены дупликацией коротких последовательностей хозяйской ДНК. Зсе это позволяет отнести LINE к ретропозонам - геномным юследователькостям.образовавпимся путем внедрения в геном копия IHK, синтезированых на РКК путем обратной транскрипции. Однако

¡рямых данных, подтверждавших, что транспозиция LINE происходит

i

■ерез транскрипцию и обратную транскрипцию пока не получено, • что :вязано в первую очередь с трудностями в изучении транскрипции .INE. Изучение транскрипции LINE является зажным не только для [Онимания механизма их транспозиции, но и для понимания обгах ;акономер:;осте?.' транскрипции в клетках эукаркот.

Цель работы. В данной' работе мы ставили задачу 'характеризовать новая кобильныя эламент дрозофилы жокея, 1ТНОСЯСИЯСЯ к ретропозснш/. типа LINE, изучить его структурную

организацию, распространенность у различных видов дрозофилы и механизм его транскрипции.

Научная новизна - и практическая ценность 'работы. Изучена структурная организация и распространение двyx^ типов копий мобильного элемента жокея у различных видов дрозофилы- Обнаружено два типа транскриптов жокея, содержащихся в поли(А)+-РНК. Установлено направление транскрипции жокея и доказано, что транскрипты начинается внутри последовательностей мобильного элемента на расстоянии нескольких нуклеотидов от его 5'-конца. Путем анализа созданных конструкций, содержащих ген хлорамфениколацетилтрансферазы без промотора с присоединенными к нему 5'-концевой последовательностью одной из копий жокея с прилежащей к ней клеточной последовательностью, усеченными в различой степени слева, однозначно установлено, что транскрипция жокея целиком контролируется его внутренним промотором. Таким образом впервые для LINE установлено наличие внутреннего промотора. Показано, что жокеи транскрибируется РНК-полимеразой II, что является первым случаем, когда транскрипция гена, имеющего внутренний промотор осуществляется этой полимеразой.

1}рдуче!нные данные и использование методические подходы позволяют осуществить более детальное изучение других LINE элементов-

Апробация рабрты. Основные научные результаты диссертации докладывались на Вколе по молекулярной биологии, (Усть-Нарва, 1968) и на совещании молодых ученых по применению молекулярно-биологически методов в речении проблем биологии развития (Москва, 19671.

Публикации. По теме диссертации опубликовано б печатных работ.

Структура и об-ьеи работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, изложения результатов, их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы (150 ссылок). Диссертация изложена на 100 страницах машинописного текста, содержит 13 рисунков и 1 таблицу.

к

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Характеристика геномных последовательностей жокея.

Мобильная элемент жокей был выявлен в мутации в локусе cut -ctMRpN10_ изолированной в системе близкородственных линий D.melanogaster ctMR2 [Герасимова и др. 1965].

На рис.1 приведены результаты гибридизации фрагмента локуса cut, в который произошла инсерция мобильного элемента из линий содержащих различные cut мутации а также нормальный локус cut- Если

б MP?

в линях ct и ct причиной возникновения мутаций явилось внедение мобильного элемента ИДГ4, "то в линии ctMRpN1° в МДГ4 в своп очередь внедрился новый, ранее не известный мобильная элемент, не имеющий повторов на концах. Этот элемент был назван жокей.

Для выяснения природы жокея ш переклонировали его внутренний Фрагмент Hindlll-EcoRI в плазмиду рис 19 - клон pjLl (рис.21 и провели его гибридизацию с геномными ДНК (рис.3).

Анализ результатов блот-гибридизации показал, что в случае рестриктаз, расиеплясдих жокей в двух местах (Pstl, Hiridlll+EcoRI), почти вся сгибридизовазшаяся метка выявляется в одной полосе. Не более 10%. всех копий жокея.. имеют различия по этим , сайтам. Следовательно, копии жокея в геноме имеет высокую ' степень гомогенности й практически не отличаятся по длине"области ст левого Pstl сайта до EcoRI сайта.

;t 2 2 2 - 3-(XL-.% 3

-05

EcoRl

Рис. 1. Блот-гибридизация геномной ДНК из эмбрионов мух разных линий D.melanogaster. обработанных рестриктазой EcoRI с уникальной последовательностью Xhol-Hindlll (7.0 т.п.н.! из "локуса cut.

Рис.2. Рестриктная карта района локуса cut. содержащего инсерцио, из линии ct^^1®, мобильного элемента ижея (копия J0) и его субклона pJLl- Двойная линия - последовательности МДГ4; ДКП МДГ4

заштрихованы. Скобкой обозначен фрагмент, использованный для

■

гибридизации. Обозначения рестриктаз: R-EcoRI. H-HindIII, 6-BelII. S-SalGI. X-Xhol. Г-Крп1. P-Pstl.

Наоборот, рестрикция Ферментами, не расщеп ляскими жжеп или распепляюшими его в одном месте, приводит к крайне гётерогено" картине, т.е. разные копии жокея окружены разыми последовательностями. Набор полос гибридизации отличается и У ДНК

близкородственных линия, обработанных одним и тем же ферментом,

«

расцеплявшим хокеп в одном месте.

££ о; X

+ •+■ +

Оо.о.о:ххсосо

-15 -12

Блот-г'ибридизация ; геномной ДНК' из мух линии

Рис.3

обработанной различными рестриктазами с рестриктаз те же, что' и на предыдущем рисунке

рл_1. Обозначения

Следовательно, расположение жокея варьирует на хромосомах у различных линия.Таким образом, по данным Слот-гибридизации жокеи

представляет собой типичный мобильный элемент, внутренние последовательности которого обладают высокой консервативностью.

По полученым впоследствии данным [Приямяги и др. 19883 жокей относится к мобильным элементам типа LINE и представлен в геноме двумя видами копий: полноразмерной (~5 тпн) и содержащей делецию части внутренних последовательностей (~.з тпн) (рис.4), одна из

которых и была обнаружена в случае мутации ct

mrpnio

И . Я г * В ннях

J, - I Г......... ' " "

Г Р ■•'..■•"rJ

* ' 2-

« Р * В нк Г

I'll illlu

, 1kb

G H

. i

Рис. 4. Рестриктные-карты длинной (J1! и коротких. (J0 и j4 I копия жокея. Обозначения рестриктаз те же, что и на рис.1. в последовательность жокея; — - геномные последовательности; □ -

200-нуклеотидная АГ-богатая последовательность; ----- показывает

последовательности жокея; отсутствувпие в копиях J0 и J4 по сравнение с J1. Скобками обозначены фрагменты, использованные для гибридизации.

Однако, от остальных LINE,- укороченные копии которых бывает обычно усеченными с 5'-конца, жокей отличается высоким консерватизмом концевых областей. "Анализ аминокислотных

последовательностей в двух открытых рамках считывания С0РС1 показал, что в первой имеется гомология с последовательностями РНК-связываюцего белка репликационно компетентных ретровирусов, а во второй обнаружен .домен, характерный для РНК-зависимой ДНК-полимеразы различных LINE-

Видовая специфичность жокея.

Мы провели эксперименты по изучению последовательностей, гомологичных последовательностям жокея у различных видов дрозофилы: 0.erecta, D.teissieri, D.yakuba. D.mauritiana, D.simulans. D.sechelia, DЛebanonensis, D.pinícola, D.virilis. В ДНК трех последних видов методом Southern гибридизации не было обнаружено сколько-нибудь заметной гомологии с последовательостями жокея.

'Результаты гибридизации с ДНК остальных видов приведены на рис.5 и 6- В первом случае ^рис.5 1 мы сгибридазовали меченый EcoRI-PstI Фрагмент (1,9 т.п.н.1, содержащийся как в длинной, так и в короткой копиях жокея (см. рис.41, с ДНК различных видов, обработанной ферментами PstI или HindlII. Видно, что сильная гомология с этим Фрагментом выявляется еае у трех, наиболее Филогенетически близких к D.melanogaster видов. П£и этом, в случае рестрикции PstI во всех четырех видах четко выделяется полоса гибридизации (1,4 т.п.н.1, соответствусиая внутреннему Pstl-Фрагменту жокея. При использовании в качестве зонда Фрагмента HindlII (1,4 т.п.н.1, основная часть которого присутствует только в копии Ji можно судить о наличии в ДНК полноразмерных копий жокея. Как видно из рис.6 зти копии присутствует в ДНК мух всех четырех видов, а полосы гибридизации, соответствующие PstI (1,9 т.п.н.1 й HindlII (1,4 т.п.н.1 внутренним Фрагментам гпкея, выявляет у них высокую гомогенность.

« .§ "ф ta a? ф t «и)">>Ео

w <ц _

ti

Pstl Hind Ш

Рис.5. Блот-гибридизация ДНК из мух различных видов дрозофилы с EcoRI-PstI (1.9Т.П.Н.) фрагментом жокея. mel-D.melanogaster. se-D.seichenia, mau-D.mauritiana, sim-D.simulans, ег-D.erecta, tei-D.teissieri, ya-D.yakuba.

— 3 P — — 3 с © <B .5 i_ m « QJ fll Й С — —. E ,5.E_ и ® Ü >. E S E » о ® '

1,3 -

Pstl

Hindi

Рис.б. Блот-гибридизация ДНК из мух различных видов дрозофилы с НтпсИИ - Фрагментом жокея. Обозначения те же, что и на рис.5.

Слабая гибридизация зонда с Pstl - фрг»-"~'.том " .4 ~ " м-) (рис.61/ прису; с-твующим f> копилл, объясняется небольшим

перекрываямеченого зонда и этого фрагмента. Слабая гибридизация с фрагментом HindHI (1,4 т.п.н.1 (рис.51 из полноразмерноП копии объясняется таким же перекрыванием. Хотя представленные результаты не дают возможности точно оценить соотношение длинных и коротких копия в геноме, можно приблизительно оценить, что первых в 5-7 раз больше, чем вторых.

Таким образом, жокей имеет достаточно узкую вкдоспецифичность. Кроме melanogaster он обнаружен только у трех наиболее близких к ней видов: mauritiana, simulans и sechellia-

Обращает на себя внимание, что высокая гомогенность внутренних областей всех копий жокея, присутствующих а геноме, обнаруженная наш у D.melanogaster, сохраняется и у других видов. Всюду присутствует два типа копия - длинная и короткая, причем их соотношение примерно одинаково во всех четырех видах.

Возникновение жокея в геноме четырех видов дрозофилы произошло скорее всего до их разделения, на стадии популяции, являющейся их предшественником. Пользуясь данными о времени дивергенции этих видов , (.южно примерно оценить время внедрения от 150 до 300 лет то!*у назад. Однако, нельзя исключить и возможность независимого внедрения элемента в генош мух данных видов.

В заключение можно заметить, что по-сравнению, например с ?-элементом, внедрение которого в популяции D.melanogaster произошло з течение нескольких последних десятилетий , лакей .существует у мух комплекса melanogaster ужэ дочтатсчно долгое время.

ТРАНСКРИПЦИЯ ЖОКЕЯ.

Выявление двух основных транскриптов хокея.

Для исследования транскрипции жокея была выделена поли!А)* и поли(А) РНК из D.melanogaster на разныых стадиях развития и из культуры клеток дрозофилы. После электрофореза в денатурируя нем агарозном геле и переноса на Фильтр РНК гибридизовали с фрагментом Hindlll-EcoRI из плазмиды pjll (см. рис.21. Этот фрагмент содержится как в длинной, так и короткой копиях жокея.

В поли(А)" РНК не удалось выявить транскриптов жокея. Б поли(А1+-Фракции РНК были обнаружены два основных транскрипта жокея, величиной 5,1 т.н. и 2,7 т.н., соответствушше по размерам полной и укороченной копиям жокея (рис.7). Выявление транскриптов жокея в поли(А )+-со держащей РНК согласуется с данными о наличии сигнала для полиаденилирования на его 3'-конце.

Два основных транскрипта жокея были обнаружены на разных стадиях развития D.melanogaster линии Oregon RC= у мух, личинок и куколок (рис.7). Эти же транскрипты были обнаружены у мух линии Canton-S и в культуре клеток Schneider- Таким образом, транскрипция жокея не зависит от стадии развития и происходит как у мух, так и в культуре клеток.

Определение 5'-концов транскриптов.

Два основных транскрипта аюкея хороио соотносятся по своим размерам с двумя типами его копий, присутствуяцими в геноме. Чтобы выяснить, содержатся ли 5'-концевые последовательности жокея в этих транскриптах мы провели Northern-гибридизашт лоли( А 1^-содержацей РНК из мух, и личинок с фрагментом KpnI-EcoRI (см.рис.41, содержании начальную последовательость жок^я из копии J0 и часть МДГ 4.

1 234 5

P;ic.7. Гибридизация внутреннего фрагмента жокея HindIII-EcoRI с полисА1+РНК из мухп), личинок(2) и куколок(З) линии Oreson RC, из мух линии Canton SC4) и из культуры клеток Schneider(S).

12 3 45 6 7

• 7,0- m ©

Рис. 8. Гибридизация KonI-EcoRKl-21, PstI-HindIIH3-5) фрагментов жокея и нелодируош.ея и кодиругтаея цепея HindIII-EcoRI Фраг;.;знта(6,7) с полис А)+?НК из мух(1 ,3,6,71, куколок(41, и личкнок(2,3! линии Canton S-

На рис.6 видно, что оба транскрипта гибридизуются с 5'-концевыми последовательностями жокея. В этом случае так же выявляется транскрипт НДГ4 длиной 7,0 т.н. Такой же результат был получен для поли(А1*РНК из куколок и культуры клеток.

Таким образом, оба транскрипта жокея содержат его 5'-концевые последовательности.

Короткий транскипт соответствует копии жокея с делецкея внутренних последовательностей.

Чтобы выяснить, является ли короткая - РНК транскриптом . укороченной копии или продуктом сплайсинга, мы провели Яог^Ьегп-гибридизацио поли1А)+ РНК О.те1аповаз1ег на различных стадиях развития с фрагментом Рб^-ЖпсИИ. содержащимся только в полноразмерной копии жокея Л. Только верхняя полоса гибридизуется с этим Фрагментом во всех поли(А1+ РНК (рис.8).

Таким образом, длинный транскрипт, гибридизуюциися с Фрагментами КрпХ-ЕсоЯ1, Жп<Ш1-Есой1 и РэП-ШпсИИ является транскриптом полноразмерной ' копии жокея, а короткий, гибридизуопийся с Фрагментами Крп1-ЕсоР(1 и Жп<1111-Е«Ш. транскриптом копии, содержащей ' делецию. При этом отновенме интенсивности полос, соответствующих длинному и короткому транскриптам, примерно соответствует соотноиению длинных и коротких копий жокея в анализируемых линиях, т.е., большинство копия жокея транскрибируется.

Направление транскрипции жокея.

Важно также было выяснить, идет ли транскрипция жокея с одной или двух цепей днк и, если с одной, то в каком направлении.

Для получения одноцепочечных проб центральный фрагмент жокея ЖпаШ-ЕсоКХ выл переклонирован в Фаг ЛЗ в двух ориентациях.

Полученные высокомеченные пробы были сгибридизованы с лоли(А!+ РНК <рис.8>. Оказалось, что только одна цепь гибридизуется с обеими транскриптами жокея. Важно, что это именно та цепь, в которой имеются две ОРС. Не было обнаружено даже слабой гибридизации с другой цепьо.

В транскрипции жокея участует РНК-полимераза II. Чтобы выяснить, какая РНК-п'олимеграза участвует в транскрипции жокея, мы изучали влияние ог-аманитина на транскрипцию жокея в культуре клеток.

В качестве положительного контроля использовали актиновый ген 0.те1аподаБ1ег, который транскрибируется РНК-полимеразой II, и ИДГ4 который, хотя данных об этом еще не сутествовало, подобно проретровирусам позвоночных также должен транскрибироваться РНК-полимеразй II- В качестве отрицательного контроля использовали ген 55 РНК дрозофилы, транскрибируемый РНК-полимеразой III-

К культуре клеток в логарифмической фазе роста добавляли

«-аманитин, а еще через 5 часов в эту и контрольную чашей

з +

Н-уридин. Выделенную после пятичасовой инкубации поли(А) и

поли(А1~РНК после частичного дробления щелочью гибридизовали в

растворе с фильтрами, на которые была нанесена ДНК соответствуют«

генов. После отрывки считали включение Н-уридина.

В табл.1 приведены результаты двух независимых экспериментов.

Видно, что транскрипция жокея снижается а-аманитином до 30%, а

актинового гена и ИДГ4 до 20Х от уровня без ч-аманитина- Уровень

транскрипции 5Э РНК остается без изменений. Таким образом, жокея

относится к последовательностям, транскрибируемом РНК-полимеразой

И-

Табл.1.Влияние а-аманитина на транскрипции жокея и других генов дрозофилы в клетках культуры.

РНК Ген С а-_1манитином. Без а-аманитина. Ингибирование

имп/мин имп/мин а-аманитином, %

(А!+ Обцее 2,2хЮ6 5хЮ6 44

включение

3Н-уридина

ЛЗэкей 310 650 30,5

300 1140

Актин 460 3040 17,7

5ео 2640

МДГ4 750 4030 17,9

940 5290

(А)" Общее 2,9xlOß 3,7x10® 76

включение

3Н-уридина

5S РНК 2200 1750 93

1650 2140

Примечание. Н-уридин добавляли в обе чашки после того, как одну из них в течение 5 часов инкубировали с а-аманитином (20мкг/кл). С Фильтрами гибридизовали 1/2 поли(А!+РНК и 1/20 псли(А)~РНК.

. РЕГУЛЯТОРНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИЕ ТРАНСКРИПЦИЮ ЖОКЕЯ. Одним из наиболее важных вопросов, касающихся LINE, является вопрос о наличии у них собственных промоторов. Решение этого вопроса затрудняется в одних случаях крайне слабой транкрипцией LINE, a s других невозможностьв выявить среди Солького количества транскриптов элемента дискретный транскрипт, соответствующий полной

N

копии.

В нашем ' случае этих трудностей ; удалось избежать. Удалось выявить два основных транскрипта, соответствующих по длине двум

типам копия жокея, присутствующим в геноме, и содержащих 5'-концевые последовательности элемента. Хотя существование этих транскриптов само по себе является косвенным подтверждением наличия у жокея собственого промотора, тем не менее можно предположить, что транскрипция жокея начинается- от клеточных промоторов, под которые могли попасть некоторые копии элемента. В этом случае, расстояние

ч

от начала транскрипции до последовательностей жокея будет разным для разных копиия элемента и 5'-концевые области транскриптов будут отличаться по длине. Наоборот, если жокея имеет собственный промотор, длина 5'-концевых областей транскриптов будет примерно одинакова.

Для выяснения этого вопроса ш провели анализ 5'-концевых областей транскриптов жокея методом удлинения затравки, который позволяет определить 5'-концы РНК с точностью до нескольких нуклеотидов.

Транскмпты жокея имеют один фиксированный сайт инициации, соппадаюция с началом элемента.

В качестве затравки мы использовали Фрагмент Sau3A - EcoRI длиной 247 п.н. из копии жокея J1-. Позиция этого фрагмента на

сиквенсе от +103 до +350 начиная от левого конца жокея и он

\

присутствует практически во всех его копиях. Для повышения чувствительности метода фрагмент был переклонирован в фаг ШЗ mpll-Далее, с помою,о синтетической затравки бал синтезирован высоко меченый одноцепочечныя фрагмент, который гибридизовали с поли(А1* РНК или с тРНК (контроль). При этом обиая длина Фрагмента была 264 нуклеотида (247 нклеотидов фрагмента $эиЗА - EcoRI и 17 нуклеотидов затравки для М131. В качестве маркера использовали секвенировакныя по Нахсаму и Гилберту HindlII -EcoRI Фрагмент из копии Л (750

п.н.), содержания, кроме последовательностей жокея, и прилежащие к ним геномные последовательности.

Результаты эксперимента приведены на рис.9. Можно видеть, что РНК жокея имеет строго фиксированный сайт инициации, находящийся в самом начале элемента, который с учетом точности эксперимента может варьировать для разных копий не более, чем на один - два нуклеотида. На рисунке отмечено истинное положение сайта инициации транскрипции (с учетом 17 нуклеотидов последовательоности M13I, которое соответствует началу жокея. Таким образом, обнаруженная гомогенность 5'-концов жокея является сильным аргументом в пользу внутреннего, расположения его промотора.

Изучение сайта инициации транскрипции на отдельной копки

жокея.

Для этой цели мы использовали полноразмерную копию жокея JI и имевщусся у нас плазмиду pRSV-CAT, содержащую ген хлорамфениколацетилтрансферазы бактерий (CAT), подставленный под промотор вируса саркомы Рауса. Была создана конструкция ja (см. материалы и методы), в которой Фрагмент Hindlll - EcoRI, содержащий нетранслируемые последовательности левой части жокея (350 п.н.) из копии Л с прилежащими к ним геномными последовательностями (400 п-н. ), бал присоединен к Hindill - Pstl Фрагменту из плазмиды pRSV-CAT (2,18 т.п-н.), содержащему ген CAT без промотора.

ДНК этой плазмиды трансформировали клетки культуры Schneider 2, через 2 суток выделяли поли(А1+ РНК и изучали транскрипцию конструкции JA методом удлинения затравки.

. В качестве затравки в этих экспериментах использовали высоко меченый одноцепочечныи Hindill - PvuII Фрагмент гена CAT, прилегающий к последовательностям жокея в конструкции ja. Фрагмент

был предврительно переклонирован в фаг Ml3 mpll. Меченая затравка длиной 183 нуклеотида включала в себя 150 нуклеотидов Фрагмента Hindlll - PvuII гена CAT, 17 нуклеотидов праямера и 15 нуклеотидов полилинкера из Ml 3 (см. материалы и методы). а. ' ' <5.

-dnaÜ"

R1

RNA

•t ншлатккккшпммткпбм

Рис.9.а. Определение точки

инициации транскрипции в

хромосомных копиях жокея. 32

Р-мечеиая одноцепочечная ДНК длиной 264 н. после отжига с поли(А)+РНК из культуры клеток Schneider 2 (дорожка 5) или с тРНК (61 и синтеза кДНК. Дорожки 1-4 -сиквексовыи маркер. Стрелкой показано истинное положение сайта инициации. б.Нуклеотидная последовательность 5'-концевого района жокея (обозначена заглавными буквами I и прилегающей к нему клеточной ДНК (строчные буквы 1 из копии jl.

•»-40*-

1 2 34,

й: ч...

3-501- --ь,:;? ш —<89— fc|

S Рис.10. Определение точки инициации

I ,

fe транскрипции в трансфецированних С Ч?

S копиях жокея. ^Р-меченая

одноцепочечная ДНК длиной XS3 н.

после отжига с поли(А)+РНК из

культуры клеток Schneider 2

трансформированной конструкциями JA

и JC (дорожки 2, 3) или с тРНК (11.

•f—331— • Сиквенсовый маркер (4).

( 17тег-праймер был помечен

то

г P-ATPI. В качестве маркеров молекулярного веса использовали примененные Mspi-Фрагменты риС19. Цифры рядом с сиквенсом указывают положение нуклеотидов, ближайиих к месту инициации транскрипции (см.рис.961.

Для изготовления сиквенсового маркера также использовали рекомбинантный фаг MI3 три, содержащий упомянутый выше фрагмент Hindlll - EcoRI жокея, присоединенный по затупленному сайту EcoRI к Smal - PvuII Фрагменту CAT. Готовый маркер содержит 17 нуклеотидов праймера и 16 нуклеотидов М13, однако, использованный здесь Фрагмент гена CAT на 4 нуклеотида длиннее аналогичного из конструкции JA (подробнее см. материалы и методы), что надо учитывать при использовании данного маркера.

Результаты опыта приведенные на рис.10, показывает (дорожка 2 I, что сайт инициации транскрипции конструкции JA находится внутри последовательностей жокея в позиции +5 по карте сиквенса (см.

рис. 961, что коррелирует с результатами опытов по анализу транскрипции хромосомных копия жокея.

Опыты на САТ-скстеие- Существование у жокея внутреннего промотора.

Для прямого доказательства внутреннего расположения промотора жокея нами был использован ряд конструкция, аналогичных конструкции JA,- в которых клеточные последовательности и последовательности

ч

жокея, были в разноя степени усечены слева (см. материлы и методы).

Получеными конструкциями трансформировали клетки культуры Schneider

и следили за зкспрессиея гена CAT, добавляя в лизат клеток 1 4

С-хлорамфеникол.

На рисунке 11а представлены результаты транзитной экспрессии САТ-конструкций. Как можно видеть, удаление геномной последовательности (конструкции jB и JCI не влияет на экспрессии, однако, удаление уже первых 12 нуклеотидов жокея полностью ее выключает.

Для исключения влияния прилежащей к жокею последовательности ДНК на транскрипцию элемента мы определили сайт инициации транскрипции для самой короткой из работающих конструкция JC и сравнили ее с самой длинной из конструкция - JA (см.рис.10). Меченая затравка для конструкции JC применялась та же, что и для конструкции ja. Как видно из рис.10, саят инициации транскрипции X совпадает с таковым для ja.

Для исключения артефактов на уровне трансляции мы подтвердили эти результаты на уровне транскрипции методом Northern-гибридизации (рис.116), используя в качестве пробы одноцепочечнып HindIII -PvuII Фрагмент гена CAT. Действительно, самая короткая из работающих конструкция - jC, имеет транскрипт в 2 т.п.н.,

2кь-

Рис.11 а. Транзитная экспрессия САТтконструкций, сделанных на основании лидерноя части жокея и длинного концевого повтора ИДГ4-Схематично показаны использованные конструкции (последовательность жокея обозначена жирной .линией) и приведены результаты их экспрессии в культуре клеток дрозофилы.

б.Эксперименты по Northern-гибридизации для конструкций JC и JD-Фрагмент, использованный для гибридизации обозначен скобкой (рис.11а).

соответствующий по длине расстоянию от начала последовательностей жокея до конца САТ-последовательностей. В случае JD транскрипция полностью отсутствует. -

Наконец, для исключения возможной артефактнои остановки обратной транскрипции при синтезе кДНК мы подтвердили полученный результат si анализом.

Полученные результаты показывают, что жокеи транскрибируется автономно с ' внутреннего промотора, причем удаление первых двенадцати нуклеотидов полностьо инактивкрует его активность, а

клеточные последовательности не влияет на его транскрипции.

Гомогенность геномных копил жокея, показанная в опытах по блот-гибридизации, достаточно активная транскрипция и гомогенность транскриптов отличает жокея от других LINE. Так, большинство копия I-элемэнта дрозофилы содержат делеции разного типа. Многие LINE, как, например, мобильныя элемент L1 позвночных, обладают краянея гетерогенностью 5'-концов, что может зависеть как от множественных транскрипционных стартов внутри элемента, так и от того, что при обратной транскрипции ревертаза часто не доходит до 5'-конца РНК.

• Краянея гетерогеностью отличаются и транскрипты L1•

В случае жокея, как показано в данной работе, транскрипция всегда начинается 5'-конца, что и является фактором, определяющим гомогенность жокея. Эти данные, а так же отсутствие транскрипции антисмысловоя цепи жокея в совокупности позволяют предположить независмость транскрипции жокея от окружающих его последовательностей. Однако, прямое докозательство того, что жокея содержит последовательности, необходимые для правильной инициации собственноя транскрипции, были получены в опытах на САТ-системе.

Из сказанного не следует, что энхансера. расположенные вне жокея не будут влиять на его транскрипцию. Но и в их отсутствие жокея способен правильно и достаточно активно транскрибироваться.

В случае жокея мы имеем первый пример, когда транскрипция при участии РНК-полимеразы II не зависит от окружающих ген последовательностей и регулируется последовательностями, лежащими внутри транскибируеиэя зоны. Возможно, такая же ситуация характерна и для других элементов типа LINE-

Использование внутренних промоторов не является необычным для эукариотических клеток. Оно часто встречается у генов.

транскрибируемых РНК-полимеразоп III. С другой стороны описан ряд случаев, когда у РНК-полимераэы III в инициации транскрипции участвовал внешний пр.' ютор или знхансер. Как бы то ни было, наши опыты-по изучению регуляции транскрипции жокея снимают еще одно принципиальное различие между трансляцией РНК-полимеразой П и РНК-пслкмгрззоя Ш, хотя качественные различия несомненно остаются.

выводы

1. Изучена транскрипция и геномное распределение в различных видах дрозофилы нового мобильного элемента Drosophila melanogaster жокея, относяиегося к распространенному у эукариот классу line-элементов.

2. В геноме D.melanogaster жокей представлен в основном двумя варианта)®! - полноразмерными копиями I ~ 5 тпн 1 и копиями с внутренней делецией (~3 тпн). Суд я по гибридизации с геномными блотами, подобные копии имеются в. геномах трех видов, наиболее близких к Orosophi-la melenosaster: D. mauritiana, D.simulans и D.sechellia, но отсутствуют у видов-- D.orena, . D.teissieri, D.yakuba, D.virilis, 0.lehanonensis, 0.Pinícola.

3. В отличие от болвиинства других известных LINE-элементов жокей активно транскрибируется. Его транскрипты обнаружены на разных стадиях онтогенеза и в культурах клеток D.melanogaster. Они точно соответствуют по длине геномным копиям жокея.

4. Транскрипция жокея осуществляется РНК-полимеразой II, идет только, с одной цепи, причем с той, которая содержит две длинные открытые рамки считывания, кодирующие белки, подобные генам gag и pol ретровирусов.

5. Анализ процесса инициации транскрипции, проведенный несколькими независимыми методами для геномных и трансфецированных копия жокея, показал, что транскрипция жокея начинается с самого начала элемента и целиком контролируется его внутренним промотором, причем удаление уже первых 13 нуклеотидов отменяет транскрипцию жокея. Подобная локализация промотора позволяет жокею полностью сохранять свою структуру при репликации его через обратную транскрипцию и хорош объясняет широкое распространение жокея и других LINE-элементов в геномах эукариот.

6. Таким образом, впервые, для гена транскрибируемого РНК-полимеразоя II, установлено существование внутреннего промотора, который является необходимым и' достаточным для правильной транскрипции этого гена.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Мизрохи Л.В., Георгиева С-Г-, Оболенкова Л.А., Герасимова Т.И., Ильин С. В- Клонировангз и молекулярный анализ нестабильных ct*1R2 и ctllRpN мутация Drosophila melanosaster, вызванных транспозициями ИДГ4. Докл. АН СССР, 1965, 265, 237-240.

2. Георгиева С,Г., Мизрохи Л.Ю. Клонирование и характеристика жокея, нового мобильного элемента О.melanosaster. Онтогенез, 1987, 1в, 436-443.

3. Ийзрохи Л.Ю., Георгиева С.Г., Оболенкова Л.А., Приямяги А.Ф., Герасимова Т.Н., Ильин • Ю.В. Природа нестабильных инсерционних мутация и реверсий в . локусе cut Drosophila melanosaster-молекулярный механизм транспозиционной памяти. Генетика, 1966, 24, 216-226.

4. Mizrokhi L.J., Georgieva S.G., Ylyin Y.V. Jockey, a mobile drosophila element similar to mammalian LINES, is transcribed from the internal promoter by RNA polymerase II. Cell, 198в, 54, 685-69t. "

5. Георгиева С.Г., Мизрохи Л.Ю., Кричевская А.А., Ильин Ю.В. Мобильный элемент дрозофилы жокей, являвшаяся типичным. LINE, транскрибируется с внутреннего промотора РНК-полимеразоя II. Генетика, 1966, 24, 1353-1363. • -

6. Мизрохи Л.Ю., Георгиева С-Г., Ильин -¡О.Е. Мобильный зледоит дрозофилы жокей транскрибируется с внутреннего промотора^ РНК-полимеазой II. Докл. АН СССР, 1966. 301," 1250-1254. \