Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Вирусоводобный структурный белок, кодируемый мобильным LINE-1 элементом генома человека

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Вирусоводобный структурный белок, кодируемый мобильным LINE-1 элементом генома человека"

РГб од

29

Нч права* рухоттипи

КЛНЛЛИН Л.ПККСЛНДР АРТУРОВИЧ

ВИРУСОПОДОБНЫЙ СТРУКТУРНЫЙ БЕЛОК, КОДИРУЕМЫЙ МОБИЛЬНЫМ ИМЕ-1 ЭЛЕМЕНТОМ ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискании уиеной степени . кандидата биологических наук

Пущено.1996

Работа выполнена в Институте биофизики клетки РАН и в Лаборатории мобильных генетических элементов Института биохимии и Физиологии микроорганизмов РАН.

)

Научный руководитель:

доктор биологических наук ИВАНОВ В. А.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук КАМЭОЛОВА С. Г.

кандидат биологических наук ЛЮБОМИРСКАЯ Н. В.

Ведущая организация:

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

Защита состоится " ^ " ^^Л ^дду г, в часов

на заседании диссертационного совета Д 200.23.01. при Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142292, Московская обл. , г. Пущино.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики клетки РАН.

Автореферат разослан " ¿У» Я. 1996 г.

Ученый секретарь

//¡и, /

диссертационного совета ^ \

кандидат биологических наук , //СМОЛИХИНА Т. И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Мобильные генетические элементы класса LINE и ретровирусы происходят, как предполагается, от общего древнего LI NE-подобного элемента-"предка" CTemin, 1989). Структурная организация этих «обильных элементов дает достаточно оснований для такого предположения: наличие двух специфических открытых рамок трансляции СОРИ - предполагаемый ген gag и 0РТ2 - предполагаемый ген pol) соответствует основному принципу генетической организации ретровирусов. С помощью компьютерного анализа в потенциальных белковых продуктах, кодируемых 0РТ2 мобильных элементов, как и в обратных транскриптазах ретровирусов, обнаружены высоко консервативные последовательности,

соответствующие характеристическим белковым доменам CXiong, Eickbush, 1989). Более того, затеи был экслрессирован предполагаемый ген pol LINE-подобного мобильного элемента жокей и идентифицирована рекомбинантная ДНК-полинераза, подобная обратным транскриптазам ретровирусов СIvanov et al. , 1991). На основании этих данных можно считать доказанной структурную и функциональную гомологию 0РТ2 мобильных элементов и гена pol ретровирусов.

В отношении белковых продуктов 0РТ1 ситуация не ясна. Вирусные структурные белки, кодируемые геном gag, не имеют явной гомологии с потенциальными белковыми продуктами 0РТ1' мобильных элементов. Таким образом, все вопросы, касающиеся структуры этих белковых продуктов и их функций в процессах репродукции мобильных элементов остаются пока открытыми.

Исследование вирусо-подобного структурного белка,

кодируемого мобильным LINE-1 элементом человека, представляет особый интерес: известно, что транспозиция такого элемента, сопровождающаяся его вставкой в функциональные гены, является причиной генетических болезней (Hutchinson et al.,1989), а структурный белок, как предполагается, служит необходимым компонентом системы транспозиции этого элемента, играя большую роль в определении ее механизма.

Поэтому представлялось целесообразный провести сравнительный компьютерный анализ потенциальных белковых продуктов. кодируемых 0РТ1 мобильных генетических элементов и белков Gag ретровирусов, используя новые программы и методы обработки данных. На основании этого анализа выбрать 0РТ1 мобильного элемента для последующего

клонирования и экспрессии, чтобы получить препарат белка, обладающий параметрами, необходимыми для будущих структурно-функциональных исследований.

Цель м основные задачи исследования

Целью настоящей работы явилась попытка найти открытую райку трансляции мобильного генетического элемента, кодирующую вирусо-подобный структурный белок с предсказанными уникальными свойствами и перспективой его исследования, чтобы затем клонировать, экспрессировать и получить препарат этого белка. с заданными параметрами. В соответствие с этим были поставлены следующие задачи:

Провести сравнительный анализ потенциальных белковых продуктов, кодируемых 0РТ1 мобильных элементов разных классов, и белков ретровирусов, кодируемых геном gag.

Изучить структуру и физико-химические свойства потенциального вирусо-подобного белка, кодируемого 0РТ1 LINE-1 элемента человека.

Получить клон-суперпродуцент вирусо-подобного белка, кодируемого LINE-1 элементом человека.

Экспрессировать, выделить и очистить соответствующий рекомбинантный белок естественного размера ("дикого типа"), пригодный, по известным параметрам, для последующего структурно-Функционального анализа.

Научная новизна и практическое значение работы

Проведенный всесторонний компьютерный анализ потенциальных белковых продуктов, кодируемых 0РТ1 мобильных элементов различных типов, позволил выбрать как объект для экспериментального исследования предполагаемый вирусо-подобный ген gag С0РТ1) LINE-1 элемента человека. Ны клонировали и экспрессировали эту последовательность и получили высокоочищенный рекомбинантный белок. В процессе настоящего исследования была разработана методика клонирования и экспрессии, которая дала возможность сконструировать рекомбинантную ДНК, пригодную для синтеза белка в клетках Е.coli с целью получения продукта "дикого типа", наиболее соответствующего природному белку." Впервые примененный для gag-подобных белков мобильных элементов метод очистки позволил выделить электрофоретически гомогенный препарат белка, по параметрам пригодный для дальнейшего использования в

экспериментах по анализу третичной структуры.

Практическое значение настоящей работы определяется, прежде всего тем, что результаты, полученные здесь, необходимы для развития исследований структуры и функции белков. колируемых мобильными генетическими элементами. В результате настоящей работы получен высокоочшценный стабильный препарат вирусоподобного структурного белка, кодируемого ЫИЕ-1 элементом человека. Параметры полученного препарата, а также данные экспериментального и компьютерного анализа свойств белка являются достаточными для последующего определения условий кристаллизации его и корректного планирования рентгено-структурных исследований.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы были представлены на Международной конференции "Гены, белки и компьютеры" (Честер, Великобритания, 1992), Международном симпозиуме по биотехнологии (Майами, США, 1993), 11-ом Международном биофизическом конгрессе (Будапешт, Венгрия, 1993), Международной конференции по молекулярному моделированию (Шопрон, Венгрия, 1994), научном семинаре Института ■ биофизики клетки РАН (Пушино. 1996). По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Объем и стриктура диссертации

Диссертационная работа включает в себя введение, обзор литературы, описание материалов и методов, изложение результатов и их обсуждение, а также заключение, выводы и список цитируемой литературы, содержащий 98 авторских ссылок. Работа изложена на 103 страницах машинописного текста, иллюстрирована 9 рисунками и 3 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При работе с бактериальными культурами £.coll использовали среду LB (Маниатис и др., 1984): триптон - 10 г.; дрожжевой гид-ролиэат -5г.; NaCl - Юг.; дистиллированная вода - до 1 л. г рН - ?,4. В качестве твердой полноценной среды использовали агаризо-ванную среду LB CL-arap, 1,5Х агара).

Трансформацию клеток Е. со 11 плазпидной ДНК проводили по методике, предложенной Кушнером в 1978 г. (Маниатис и др., 1984).

Для выделения плазмидной ДНК E.coli в аналитических целях применяли метод температурного лизиса (Маниатис и др., 19845.

Рестрикция ДНК проводилась в универсальном буфере V—Is 40 мМ Tris-HCl, ; 6 мМ HgCl2x6H20! 6 иИ NaCl; 6 мМ 2-меркаптоэтанол; рН=7, 4; при 37* С в течение 1 часа.

Лигирование ДНК проводили в лигазнои буфере следующего состава: 50 мИ Tris-HCl: ЮмМ MgCl2î 20 иМ дитиотрейтол; 1 мМ АТФ; рН=?, 8. Добавляли 0,2 ед. ДНК-лигазы на 1 мкг ДНК для лигирования "липких концов" и 2 ед. на 1 мкг ДНК для лигирования "тупых концов". Реакцию лигирования проводили при 10-12*С в течение 16-20 часов или при 20" С в течение 4 часов.

Для приготовления агарозного геля использовали 0,7-0,8/. агарозу. Гели представляли собой горизонтальные пластины, размером 200x180x3 мм или 100x80x3 мм. Электрофорез вели при комнатной температуре в горизонтальных камерах в трис-боратном буфере.

Амплификацию проводили, используя амплификатор Genefimp PCR System 2400 CPerkin-Elmer Corporation). Стандартная реакционная смесь (V=100 мкл) содержала 50 мМ КС1, 20 мИ Tris-HCl СрН 8.4), 2 мМ flgC12, 200 цМ каждого dNTP, .0.5 uM каждого олигонуклеотидного траймера, 1 пг Фаг-лямбда-CDU ДНК и 2.5u Тац ДНК-полимеразы. Реакцию инициировали нагреванием С94*С в течение 3 мин). Затем провели амплификацию в следующем режиме: 30 циклов С 94*С в течение 30 с; 48"С в течение 30 с; 72*С в течение 40 с). PCR-продукт был очищен и клонирован в трансляционном векторе pET15b (Novagen)

Для очистки синтезированного белка индуцированные клетки собирали посредством центрифугирования. Клетки ресуспендировали в буфере А С50 мМ фосфат Na, рН Э. О, 300 мМ NaCl) и "озвучивали" в ледяной бане (4 раза в течение 30 с). Клеточные обломки и нерастворимый материал собирали центрифугированием. Осадок растворяли в буфере Б (8 M мочевина, 100 иМ фосфат Na, 10 мМ Tris-HCl, рН 8.0) и центрифугировали (16000 х g, 15 мин, при 4"С). Супернатант наносили на колонку с Ni-NTA (Qiagen), предварительно уравновешенную буфером Б. Колонку промывали 10 объемами буфера Б и 5 объемами буфера В С8 M мочевина, 100 мМ фосфат Na, 10 мМ Tris-HCl, рН 6.3). Рекомбинантный белок элюировали буфером В, содержащим 100 мМ имидозол. Диализ проводили против буфера Г С25 иМ фосфат Na, рН7,6, 250 п» NaCl. 7 мМ 2-меркаптоэтанол).

В качестве источников данных о нуклеотидных и аминокислотных последовательностях использовали банки данных SUISSPROT. EMBL, GenBank. Были отобраны 19 последовательностей 0РТ1 мобильных элементов и 89 последовательностей Gag-белков ретровирусов. Для поиска гомологии среди последовательностей, отобранных из банков аанных, применяли пакет программ GeneBee (Леонтович и др., 1990).

Физико-химические параметры исследуемых белков, рассчитывали : помощью программы PHYSCHEM, входящей в состав пакета программ PC/Gene.

Анализ точности предсказания вторичной структуры белка проводили при поиоши программы ASSP CRussel, Burton, 1993).

Для определения границ участков наибольшей консервативности з наборе выравненных аминокислотных последовательностей использовали программу ProAnal CEroshkin et al. . 1993).

Построение множественного выравнивания аминокислотных тоследовательносгей провопили при помощи пакета программ GeneBee ¡Бродский и др., 1991а).

РЕЗНЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Консервативно области структурных вирусных белков в ютонциалькых белковых продукта« 0РТ1 мобильных элементов

Функциональные белки капсида ССА) и нуклеокапсида CNC), юдируемые геном gag ретровирусов, имеют консервативные сайты, (грающие важную роль в их функционировании. Для белка СА таким гайтом является главная область гомологии MHR Cmajor homology *egion), а для белка NC - область "цинковых пальцев". Мы провели юиск названных консервативных участков в потенциальных белковых |родуктах 0РТ1 мобильных элементов различных классов.

Для этого мы выбрали более строгие условия для выделения :онсервативной области, которая затем была использована при гаиске. Выделенная нами область Сем. рис.1) несколько отличается it приведенной в литературных источниках Сем. например Mammano et il. , 1994), но она включает в себя все канонические, гункционально важные консервативные остатки. Мы полагаем, что акая область более строго отражает очертания консервативного айта в силу того, что она была получена на основании анализа сего массива данных об аминокислотных последовательностях белков

КАПСИД

A SAGSBLV GAGtFIVPE GAGtHIVlO GAGtHTLlA GAGtBAEVM GAGtAVItlC GA&eiOlTVB

В DHTKJOC CLIMED

LHDEL С LTR)

Dili329? (LTR)

SCTY117X СLTR)

tivsjj>a33svefvi<2slisl - HHR aLRiB4Ki3DySSriD23 DI R23»Ki3PFHDY VD 33 31l23le^ yhafve3j Т1Т2ВШЗзраагке2Я

di t?s'si33fudr«n2a glk2i><e3s yetfiздз

NLK£QPNVK£SLKI Т2И FQL2SEfti3FUUDAKV23 IYI33IK33IKILIR^3

TII3ILI^winvsd33

ННКЛЕОКАПСИД

GAQtBASUH KDQS^VScergjjuikdSPKRPR

GAGtFIVPE GPVSFNSUVCrSLARQ^UKK

GAGtFLV KDU3A¥9tEK&3iJVRD93KRPR

GAGSGALV mi3AY3CEKG]JUAHE3PRKKH

GAGtHLVAV KDQ30Y«itEKGjjUfiKD3PKKPR

GAGtSMRVH ---3PR3«GF3UflSE3?SRLD

GAGtSMSAV KDO^YS^EKGDUDEEQnPACT

GAGtRSVP RER3Qb9<Er№j^AKQ9U(RSG

GAGtHTLlA PGP9>L93DPTJQUKRD9>RI.KP

DHTKJOC (LINE) ZHCIN4E СLINE3 DTIFACT СLINE) DWDOC (LINE) BMMAG СLTR) DHCOPIA СLTR)

Lia3aB3aiFc33KNY3AUDPi ptr9jq3lhfgsrara9i>giyy plr3KX3LRFG3>API9QLET PVQ3TN3QEYG3rKAY3rLKSV DYV^SSlET53LRRM33KN&L KUK3HH3JRE&2I KKD3FHYKR

Рис.1. Консервативные участки рвтровирусных gag белков СА) к соответствующие участки в потенциальных белковых продуктах мобильных элементов СВ). Консервативные аминокислотные остатки выделены. В последовательности капсидного белка вируса BLV показана область MHR Сmajor homology region).

капсида ретровирусов, а также методического подхода, при котором для выделения консервативной области использовались наиболее различающиеся последовательности.

Мы провели поиск участков, гомологичных данной области в последовательностях белковых продуктов 0РТ1 мобильных элементов. Результаты этого поиска представлены на рис. 1. Видно, что, из проанализированных 19 последовательностей участки, сходные с областью MHR белков СА обнаружены лишь в четырех. При этом один из белковых продуктов кодируется мобильным элементом жокей дрозофилы и относится к классу LINE-подобных элементов, а остальные последовательности кодируются элементами Del, TY11? и 29?, которые принадлежат к классу LTR-сояержаших элементов. Видно, что в целом обнаруживается значительное сходство в последовательностях сайтов, многие консервативные остатки также присутствуют. Интересно отметить лишь отсутствие консервативной ароматической аминокислоты Сфенилаланин или тирозин в вирусных белках СА), в потенциальных белковых продуктах 0РТ1 мобильных элементов. Известно, что замена этого остатка на неполярный Снапример, на аланин) приводит к значительным нарушениям процесса сборки капсида вирусных частиц.

Аналогичная методика для выделения консервативного сайта и поиска гомологичных с ним областей была применена в отношении белков NC. В результате мы получили область длиной 22 аминокислотных остатка, включающую характерный мотив "цинковый палец" С три цистеина и гистидин). Для поиска гомологии был использован набор из 9 выравненных последовательностей, представленных на рис. 1. Поиск гомологии позволил выявить 6 последовательностей, кодируемых мобильными элементами, несущих данный сайт Сем. рис.1). Видно, что все упомянутые аминокислоты, необходимые для образования характерной пространственной структуры "цинкового пальца" представлены в них. Следовательно, можно предполагать, что данные белковые продукты могут обладать способностью к связыванию нуклеиновых кислот.

Консервативные участки в последовательностях 0РТ1 мобильных элементов

В ходе настоящих исследований ны попытались также провести выравнивание и последующий поиск консервативных участков в последовательностях белковых продуктов 0РТ1. Мы полагали при этом, что если в этих последовательностях имеются участки, важные

в Функциональной или структурном отношении, они будут сохраняться в аминокислотных последовательностях у различных видов мобильных элементов.

В результате этих исследований мы получили наборы выравненных последовательностей различных групп мобильных

ЫКЕ-ЭЛ8М8НТЫ СИТСгМ50К ОТЬР11Р№'К1г!$г2№Х>А НЗИЗЬИЧЕ НГТКЦЕИКЕЫф^ШаЭ^а ОКТШОС СШУ30А0301Е03аШР&3 УОНЮЮиЗЕ КТТЫАЬ№Ш11122^23*2 ошми йзркуаиуьпктяЕття

РПГЯСТ IТГЕЗНК1РЕI I ЙУ^Г V ТВТЙ316 нккгнЕкшЕнЭ^таА^Эак БШООС АТУТРАЕ 11 ЕАЭ25ШГЗА

консенсус иимимниииииш:<;т;1:иыЯ

Ретровирвсы БАОМиЕШ БЕьктцвидда1Я'лдд:<жо

ЬТК-содержашиэ элементы

0ПС0Р1А тфЦШи.Ь00Е1К1КфНШГГЗКК«ИШ<Ш

ВНПАБ КЗЕ11КОЗЬЕйЕЕ2ЬЕУККАиТ1,АЬЗЬЕААЕЫ)А

БОНША ЬЗЬЗРТКЕНКЕРНЕЗЗНТ^НЗОРЗНПОЗНТЕКЕ

отзхте ЕЗЫЕКЬРТШУЬК11Ш2*РВЬНЗЫНШ1ЕКС

0Н13297 БиРТЬКАЭ,аАЕЕ21 аТРДУКЬЬЕМРНЕТРУ Ш}3

СТОУРЗУ 1КЗУРВГЗеУШЕУУАГО0АА1УАУЕШШУРКЗ

ЗСТУ117Х 11РКООСжЕ1№ОНТУЕЕНАУ1ШТРОА7АРРШ|Ь

2НВ31К£Т И,0ф£ААЗААН</ЗА1.ЕЗТТАТЕ0МЫ,0№301УЕ

ЫЩЕЬ ВДйЕЗНРЭЛ^Е^ЗйЬЫРР 1ГШ)РСР1,ЕАШ1и1

0101X412 1,ТМЗЕЕАААЭ?ЗУ IИЕ УАСТУРЕГОМШ НШИ1

консенсус

Рис.2. Консервативные участки в 0РТ1 различных мобильных элементов. Показан сходный участок ретровирусного белка р19 (матрикс). Выделены аминокислоты, совпадающие с консенсусной последовательностью.

элементов: ElNE-подобных и LTR-содержаших (рис. 2). Полученные данные свидетельствуют о, том, что большинство иследованных здесь белков имеют в данной области альфа-спиральную структуру. Используя матрицу весов аминокислот по предпочтению к образованию альфа-спирали, для обоих классов элементов удалось выявить центральную область - своеобразное ядро с консервативным составом. В белках мобильных элементов класса LINE обнаружили достаточно устойчивый мотив: *******LKAARE*G (пороговая вероятность появления аминокислоты, использованная для построения мотива, составляет 0,35; * - остатки с выраженностью ниже пороговой). В результате анализа ретровирусных белков GAG такую же область обнаружили а белках онковирусов саркомы и миелоцистоматоэа: в N-терминальной области белка матрикса р19 (см. рис. 2; здесь представлена область белка лишь одного вируса, так как соответствующие последовательности других практически одинаковы). Она обладает значительным сходством с соответствующей областью потенциальных белковых продуктов 0РТ1 LINE-подобных мобильных элементов. Консервативный мотив для потенциальных белков LTR-содержащих мобильных элементов значительно менее выражен. Такой мотив (на уровне вероятности 0,35) выглядит как:

Чтобы представить предполагаемую третичную структуру идентифицированных консервативных областей, мы провели поиск этих участков аминокислотной последовательности в банке белков с известной третичной структурой ("BR00KHAVEN"). В результате такого анализа мы отобрали из банка по одной последовательности, обладающей наилучшей степенью сходства первичной структуры с исследуемыми консервативными областями 0РТ1 LINE-подобных и LTR-содержащих мобильных элементов. Эти области представляют собой L-образные участки алы?а-спирали.

Данная структура не обладает сходством с известными функциональными сайтами белков, например такими как "цинковый палец" или другим известным ДНК-связывакжим мотивом "спираль-поворот-спираль" (helix-turn-helix). Можно полагать, что эта область играет определенную роль в структурной организации молекулы в целом.

Гомологии вторичной структуры потенциальных белковых продуктов ОРИ и функциональных белков

Мы попытались подойти более строго к анализу вторичной и третичной структур белковых продуктов 0РТ1: провели моделирование их предполагаемой пространственной структуры. Был проведен поиск гомологии всех представленных белков - продуктов 0РТ1 мобильных элементов класса LINE с белками банка Brookhaven. Достаточно надежные, с точки зрения статистики, выравнивания удалось построить только для белка - продукта ОРИ мобильного LINE-1 элемента человека. Множественное выравнивание приведено на рис. 3.

LINE1 С 95) fikevenfeknleecitritntekCLKELffiLKTKARELREECRSLRSQC

к м ж им

TPMA-RABIT С 84) asInrrlqlweeeldpaqerlatflLOKLEEflEKAADESERGHKUIESRA

м:::: : м : к: :

К1Н2-SHEEP С 61) valQaqhnlrdslentltetearyscQLNQVQSLISNVESOLAElRGDL

LINE1 С142) DQLEERUSAHEDEMNErtKQeekf rekrlkr-ndesl ge 1udyvkrpnlrl

s Mil t м t: м и

TPMA-RABIT (131) UKDEEKftEIQEIOLKEAKHlaadadrkyeevarklwllesdleraaera ..... ! !

K1M2-SHEEP (108) ERQNQEVQVlldvrarlecelntyrelldsedckl

Рис. 3. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей белка 0РТ1 LINE-1 элемента человека и структурных белков: TPMA-RABIT - тропомиозин кролика; K1M2-SHEEP -кератин овцы. Область наибольшего сходства выделена заглавными буквами.

* - совпадающие аминокислотные остатки

: - аминокислотные остатки, сходные по физико-химическим свойствам.

Для набора выравненных последовательностей белков, сходных с белком 0РТ1 LINE-1 элемента чзловека, определена нижняя граница точности предсказания вторичной структуры - 68.38Х. Белки, с которыми имеет сходство изучаемый продукт 0РТ1, относятся к структурным: тропомиозин и кератин. В литературе имеются данные о сходстве белка 0РГ1 LINE-элемента кролика с кератином (Demers et al., 1989), - таким образом полученные факты могут способствовать

дальнейшему изучению этой проблемы.

Основываясь на полученных выше количественных оценках, можно полагать. что третичная структура изучаемых белков в рассматриваемых участках наибольшего сходства также будет сходна со структурой белков из банка РОВ. Мы построили схематическую модель трехмерного хода цепи альфа-углеродных атомов для белка из банка РОВ (тропомиозин), сходного с белком 0РТ1 элемента

человека. Этот участок представляет собой альфа-спираль Срис.4).

Рис.4. Схематическое изображение трехмерной стриктуры Стро-пониозин), гомологичной области лэйцинового зиппера 0РТ1 иЫЕ-! элемента человека.

Клонирование 0РТ1 ИЫЕ-! эленента человека в бактериальной системе экспрессии

Данные компьютерного анализа и моделирования структур на основании гомологии позволили нам выбрать С для дальнейшего исследования) из набора проанализированных последовательностей потенциальный белок, кодируемый мобильным ЬШЕ-1 элементом генома человека. Этот белок представляет несомненный интерес с практической стороны, так как 1ЛНЕ-1 элементы, имеющие широкое распространение в геноме человека, способны вызывать различные

мутации, приводящие к генетическим болезням, а также служить активаторами онкогенов. Потенциальный белковый продукт 0РТ1 данного элемента содержит нуклеотид-связываюший сайт, так называемый "лейциновый зиппер". Проведенный анализ показывает, что выбранный . белок наиболее сходен с тропомиозином. пространственная структура которого известна. Область сходства имеет значительную протяженность, кроме того, в ее пределах лежит указанный выше нуклеотид-связываюший сайт.

Исходя из этого, предполагаемый ген gag (0РТ1) LINE-1 элемента человека был выбран в качестве объекта для конструирования рекоибинантной ДНК, обеспечивающей синтез соответствующего белка .в модельной системе экспрессии; и последующего получения препарата белка с параметрами, которые соответствуют условиям, необходимым для кристаллизации белка.

Мы выбрали систему экспрессии, основанную на использовании РНК-полимеразы фага Т7. Этот энзии обладает очень высокой активностью (по сравнению с РНК-полимеразой Е. coli) и избирательностью к специфическому промотору фага Г7, который не узнается РНК-полииеразой клетки-хозяина. Для клонирования и экспрессии применяли плазмидный вектор pET15b (Novagen), содержащий Т7-специФический промотор. В отсутствие Т? РНК-полимеразы транскрипция (посредством РНК-полимеразы Е.coli) рекомбинантных ДНК, находящихся под этим промотором, настолько низка, что позволяет клонировать очень токсичные гены. В' специальных условиях система Т7-экспрессии может быть строго селективной, т.е. экспрессия ДНК в клетке-хозяине может быть практически ограничена лишь клонированными генами. Поэтому тестирование и очистка рекомбинантных белков значительно облегчаются. В качестве бактерии-хозяина для экспрессии использовали клетки BL21 Е. coli. Этот штамм, как и все В-штакмы, дефектен по протеазам Ion и ошрТ, которые могут деградировать белки в процессе выделения и очистки. Таким образом, по крайней мере некоторые рекомбинангные белки, как можно предполагать, будут более стабильны в клетках BL21, чем в штаммах-хозяевах, которые экспрессируют названные протеазы.

Для очистки синтезированного белка мы впервые (для gag-подобного белка) предполагали использовать систему QIftexpress, гарантирующую высокую степень очистки рекомбинантного белка. Принцип очистки заключается в применении аФинкой хроматографии на колонке с носителем, имеющим высокое сродство к

гистидиновому олигопептиду, который "формируется" в виде гистидин(х6)-"хвоста" в процессе конструирования рекомбинантной ДНК, предназначенной для экспрессии.

Чтобы сконструировать гистидин(х6)-0РТ1 белок. Фрагмент ДНК LINE-1 элемента человека из клона CDU Сем. Skowronski et al., 1988), любезно предоставленного проф. М.Сингер Cprofessor Maxine Singer, National Institutes of Health, Bethesda, USA) длиной 1000 п. н. был амплифицирован посредством PCR с предварительным введением Ndel- и BamHl-сайтов в Up- и Low-праймеры, соответственно (рис 5).

5' - ТГСШТССССМШЛСМЫС- 3

ПяпШ

I Qp-pt (дрддпоявгомый гшк g«a) |

I /LOW, S' - ТТССАТССТГТАСАТПТСеС- 3'

PCR-амплификация

I

Рестрикция Ndel/BamHI

I

интеграция в вектор

Рис.5. Конструирование трансляционного вектора, кодирующего предполагаемый Саг-белок IIN2-1 элемента человека.

Полученная плазмида рЕИ-КЖ1! содержала регуляторные элементы фага Т7 для инициации транскрипции и трансляции: Т7 РНК-полимеразный промотор и стартовый сайт трансляции гена, кодирующего белок 10 этого фага. 'Репрессия транскрипции в плазмиде обусловлена высокой специфичностью Т?-промотора к гомологичной РНК-полимеразе и отсутствием этого энзима в клетке.

Синтез вирусоподобного структурного белка в клетках Е.Coli я его очистка

Активацию транскрипции в приготовленном соответствующем образом инокуляте с промотора Т7 осуществляли "добавлением" индуктора СТ7 РНК-полимеразыЗ. В качестве источника Т? РНК-полимеразы использовали бактериофаг СЕ6, который несет ген, кодирующий этот специфический энзим. Белковые продукты накапливались в тельцах включения клеток BL21 Е.coli. Очистку

30

Рис.6. ЭлвктроФореграмма белка ОРТ1 LINE-1 элемента человека, экспрессированного в пггаммэ BL21 Е. coll рекоябинантной плаэкидой pETLIORFl при использовании системы QIAexpress.

Слева указаны массы «маркерных белков (кДа). А - маркеры молекулярной массы; В - общие белки после индукции; С - нерастворимые С в 300 мМ NaCl) клеточные белки; D -клеточные белки Е.Coli; Е - экспрессированный белок.

5елка проводили в несколько этапов Сем. раздел "Материалы и <етоды исследования"). В проиесе диализа белок оставался :табильным, если его концентрация была менее 100 мкг/мл. Белковые збразцы на различных стадиях очистки были тестированы посредством электрофореза в ЭОЗ-ПАА геле. На рис. 6 представлена электрофореграмма белкового продукта экспрессии рекомбинантной плазмиды рЕТИОйН, содержащей 0РТ1 1ЛМЕ-1 элемента человека. Использование 01Аехрге5э системы позволяет получить

соответствующий высокоочищенный рекомбинантный белок. После электрофореза элюата белка в ЭОЗ-ПАА геле мы обнаружили единственный полипептидный компонент с молекулярной массой " 42 кДа. Эта величина близко соответствует размеру белка, рассчитанному на основании его предсказанной аминокислотной последовательности.

ВЫВОДЫ

1. На основании компьютерного анализа консервативных функциональных сайтов белков ретровирусов, кодируемых геном gag, показано родство ясследуемых белков с белковыми продуктами 0РТ1 мобильных элементов; впервые выявлено наличие ДНК-связываюших последовательностей и консервативных сайтов, характерных для gag-белков ретровирусов в потенциальных белковых продуктах 0РТ1 мобильных элементов.

2. Обнаружены новые консервативные участки в потенциальных белковых Продуктах 0РТ1 мобильных элементов различных классов, найдены гомологичные им участки в белках матрикса ретровирусов; проведено моделирование пространственной структуры этих участков.

3. Показано сходство пространственной структуры 0РТ1 мобильного LINE-1 элемента человека с известными структурами функциональных белков - тропомиозина и кератина; предсказана третичная структура СальФа-спираль) обнаруженного в 0РТ1 участка гомологии.

4. Разработана методика синтеза в Е.coli рекомбинантного белка естественного размера ("дикого типа"), кодируемого 0РТ1 LINE-1 элемента человека.

5. Получен клон-суперпродуцент, позволяющий производить этот ёелок в препаративных количествах.

6. Зкспрессирован. выделен и очищен этот вирусо-подобный структурный белок. Получен высокоочищенный препарат белка, стабильный в условиях, которые необходимы для его кристаллизации.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

X. Kanapin А. , Ilyin Vu. A concervative regions in potential ORFi products of mobile genetic elements of different classes./ International conference "Genes, proteins and computers". Chester, UK, 1992, August.

2. Kanapin A.. Brodsky L. , Ilyin Vu. Regions of 3D similarity in potential ORFI products of mobile genetic elements. / Miami Bio/Technology Uinter Symposia on Protein Bioingeneering, Miami, USA. 1993, January.

3. Kanapin A,, Ivanov V., Structural gomology of mobile genetic element protein product and functional proteins./ 11th International Congress of Biophysics, Budapest, Hungary, 1993, July.

4. Kanapin A., Ivanov V., Analysis of structural similarity regions in protein products of mobile genetic elements. / International symposium on molecular modelling in genetic and protein engeneering, Sopron, Hungary, 1994, June.

5. Канапин A. A. , Иванов В. A.. Ильин Ю. В. , Консервативные области потенциальных белковых продуктов 0RF1 мобильных элементов и белков ретровирусов, кодируемых геном gag. Мол. биология, 1995, N3, с. 522-529.

6. Granovsky I. Е., Kanapin А. А., Ivanov V. A. Expression and characterization of recombinant gag-like protein coded by ORFI of human mobile genetic LINE-1 element. Nucl. Acids Res. , 1996, in press.