Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Функциональные свойства белков, кодируемых ретротранспозоном L1 генома человека
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология
Автореферат диссертации по теме "Функциональные свойства белков, кодируемых ретротранспозоном L1 генома человека"
На правах рукописи
ПИСКАРЕВА ОЛЬГА АЛЕКСАНДРОВНА
ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ, КОДИРУЕМЫХ РЕТРОТРАНСПОЗОНОМ 1Л ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА
03.00.03 - Молекулярная биология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Пущино - 2004
Работа выполнена в ВНТК мобильных генетических элементов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН
Научный руководитель' кандидат биологических наук В В Шматченко
i
Официальные оппоненты доктор биологических наук
профессор Н И Матвиенко
кандидат биологических наук A.B. Сиунов
Ведущая организация.
Институт молекулярной биологии им В А Энгелы ардта РАН
Защита состоится «/( »Д/ 2004г в «Д » часов на заседании диссертационного совета Д 002 038 01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биофизики клетки РАН по адресу 142290, г.Пущино, ИБК РАН
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НЦБИ РАН, г Пущино Автореферат разослан 1» 2004г
Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук ^ Т И. Смолихина
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Элементы LI или LINE-1 относятся к классу ретротранспозонов, не содержащих длинные концевые повторы (ДКП), и составляют приблизительно 17% генома человека Элементы этого класса реинтегрируют в геном через РНК-посредник при участии собственной обратной транскриптазы. В основном элементы LI генома человека (LIHs) функционально не активны, так как укорочены с 5'-конца и/или имеют внутренние перестановки и/или мутации, и только около 60 копий способны перемещаться в геноме. К настоящему времени клонированы полноразмерные "активные" копии LI Ну и определены их структурные особенности (Kazazian, 2001) Именно активные LI Я.? способны вызывать мутации, наследственные заболевания, генетическое разнообразие и полиморфизм, в то время как неактивные копии являются причиной неправильного кроссинговера, приводящего либо к делеции, либо к дупликации
Консенсусная последовательность 1ЛЯу протяженностью 6-7 тыс пар оснований содержит две не перекрывающиеся открытые рамки трансляции (ОРТ) Первая рамка кодирует белок со свойствами gag белков ретровирусов, вторая - белок с активностями эндонуклеазы и обратной транскриптазы При исследовании белка ОРТ1, р40, выделенного из клеток тератокарциномы человека, было обнаружено, что р40 имеет высокое сродство к РНК LI Ял (Hohjoh, 1996, 1997) и образует в цитоплазме клеток мультимеры (Holmes, 1992, Hohjoh, 1997) При изучении транспозиционной активности lAHs в культуре клеток было показано, что С - концевая область белка р40 содержит ряд консервативных аминокислот важных для транспозиции элемента LI (Mora, 1996) Кроме того, было обнаружено цис-активное функционирование LI Ял в процессе реинтеграции в геном (Moran, 1996, 1999, Goodier, 2000, Wei, 2001).
В двух независимых экспериментах было показано, что активность ОТ свойственна центральному домену белка ОРТ2, хотя другие выдвинутые предположения спорны, поскольку исследования проводились на частично очищенном препарате белка ОРТ2 (Clements, 1998), либо в клеточной системе in vivo (Dhellin, 1997) С помощью генетического метода определения частоты событий ретротранспозиции было показано, что делеции и мутации в последовательности ОРТ2 L\Hs приводят к инактивации транспозиционной активности элемента в культуре клеток человека (Moran, 1996). Недавно было показано, что интеграция элемента человека LI Я? в геном обеспечивается активностью обратной транскриптазы белка ОРТ2, причем в качестве праймера для построения кДНК используется З'-выступающий конец сайта мишени геномной ДНК (Cost, 2002) Такой механизм впервые был описан для ДКП -несодержащего ретротранспозона R2 Вт и получил название - обратная транскрипция, праймированая сайтом-мишенью (Luán, 1993) Таким образом, именно активность обратной транскриптазы является одним из важнейших факторов, определяющим возможность построения кДНК копии элемента и его дальнейшее встраивания в геном. —-
РОС НЛ';И'Щ4ЛЬНАЯ 6" М КА ( "Sir 2(H) 6 Р|,
Совокупность имеющихся данных, касающихся молекулярной биологии LIHs, оставляет открытыми ряд важных вопросов, решение которых является актуальным В частности плохо изучены функциональные и структурные свойства белка ОРТ2 LI Hs, так же как и особенности процесса, катализируемого этим ферментом, из-за отсутствия гомогенного и стабильного препарата фермента. Так же остается неясной роль р40 в транспозиции LIHs Кроме того, не выяснен механизм взаимодействия белков и РНК элемента в >
процессе доставки матрицы в ядро.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы было исследование функциональных свойств белков, кодируемых ДКП - несодержащим ретротранспозоном L1 генома человека. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи-
1) провести экспрессию открытой рамки трансляции 2 элемента LIHs в эукариотической системе;
2) выделить и очистить полноразмерный белок ОРТ2 LIHs и охарактеризовать его ферментативную активность;
3) исследовать ДНК-полимеразную активность белка ОРТ2 LIHs,
4) разработать модельную систему экспрессии элемента L1 в культуре клеток млекопитающих;
5) исследовать взаимодействие белков LIHs в процессе его экспрессии
Научная новизна
Впервые проведена характеристика ферментативной активности белка ОРТ2 элемента LIHs. Показано, что очищенный белок является Mg2+-зависимой ДНК-полимеразой и проявляет как РНК-зависимую, так и ДНК-зависимую ДНК-полимеразные активности, но не обладает активностью РНКазыН Впервые показаны процессивность и паузинг ОТ LIHs в процессе синтеза ДНК
В экспериментах по экспрессии ОРТ1 в клетках млекопитающих, впервые получены доказательства накопления белка ОРТ1 в цитоплазме клеток в виде неупорядоченных агрегатов
Предложена модельная система экспрессии элемента LIHs т vivo Впервые обнаружено, что белки элемента LIHs образуют структуры, подобные вирусным частицам. Вирусоподобные частицы имеют диаметр 92-95 нм и ассоциированы с ядерной мембраной.
Практическая ценность работы
Настоящая работа является частью фундаментальных исследований, посвященных изучению молекулярных механизмов транспозиционной активности элемента LIHs. Предложена методика очистки белка ОРТ2 LIHs из клеток насекомых, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом, несущим ОРТ2, позволяющая получать высокоочищенный препарат, сохраняя его ферментативную активность
Полученные в настоящей работе результаты могут быть использованы при реконструкции от vitro этапов транспозиции элемента LIHs, а так же при создании векторов для переноса генов
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на 18 Международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии «Beyond the Genome», Birmingham, UK, 2000; на Зимней школе молодых ученых, Москва, 2001, на Международной конференции "Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология", Москва, 2001, на итоговых конференциях ИБФМ РАН, Пущино, 2002, 2003; на XV зимней международной молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологи и биотехнологии", Москва, 2003, на 7-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века", Пущино, 2003, на семинаре в Национальном институте клеточной биотехнологии, Дублин, Ирландия, 2003, на конференции «Biotechnology, Cancer and Drug Resistance», Dublin, Ireland, 2003.
По материалам диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 2 статьи
Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования использованных в работе, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы Работа изложена на 102 страницах машинописного текста, содержит 18 рисунков, 2 таблицы Список использованной литературы включает 145 наименований, из них 140 иностранных
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Экспрессия гибридных белков элемента LIHs с целью получения поликлональных антител
С целью получения антител для поведения иммунохимического анализа экспрессии белков ОРТ1 и ОРТ2 элемента Lltfs в гетерологичных системах была использована pGEX - система экспрессии гибридных белков в бактериальных клетках. Все используемые в настоящей работе методы рекомбинантных ДНК выполнялись в соответствии с Sambrook et al ,1989
Для создания продуцента белка ОРТ1 (р40), ОРТ1 элемента L\Hs размером 1 т п о амплифицировали в ПЦР при помощи олигонуклеотидных праймеров 1 (5'- CGTACCATGGGGAAAAAACAGAACAGAAAAAC -3") и 2 (5'- TTAGTCGACTATGATGTTAGCTGGTGATTTTGC -3'); и клонировали в вектор pGEX-KG (Guan, 1991) по сайтам Neo I и Sal I, так чтобы ОРИ была в рамке с геном глутатион-Б-трансферазы (FST) Рекомбинантная плазмида, pGEX-p40, кодировала гибридный белок TST - р40 с молекулярной массой 68 кДа С целью получения антител против белка ОРТ2 элемента LI Hs, фрагмент полипептида ОРТ2 с 426 а.к по 558 а.к. был экспрессирован в виде гибридного белка с TST 0,4 тп.о. фрагмент ОРТ2 был встроен в вектор pGEX-KG по сайтам Xba I и Hind III. Рекомбинантная плазмида, pGEX-hRT, кодировала гибридный белок FST - hRT с молекулярной массой 42,6 кДа
Плазмидами pGEX-p40 и pGEX-hRT трансформировали клетки Е coli JM109 Экспрессию гибридного белка индуцировали добавлением ИПТГ до концентрации 1 мМ, анализировали в SDS-ПААГе (Laemmli, 1970), с
последующим иммунохимическим подтверждением, используя моноклональные тела против FST Растворимую фракцию гибридного белка очищали при помощи аффинной хроматографии на глутатион - сефарозе {Pharmacia), согласно прилагаемому протоколу Аффинно-очищенные гибридные белки использовали для получения соответствующих поликлональных мышиных антител Иммуноглобулиновые фракции из сыворотки крови мыши были очищены при помощи хроматографии на белок-А-сефарозе (Pharmacia).
Экспрессия белка ОРТ2 элемента LI в клетках насекомых Sf2\ ОРТ2 элемента LI клонировали в донорную плазмиду pFastBacl ("Gibco") по сайтам Sal] и SacI из плазмиды pSM42 (любезно предоставленной Prof Н Н Kazazian), обработанной предварительно эндонуклеазами рестрикции Sali и SacI, с образованием плазмиды pFastBac-hRT. Рекомбинантную плазидную ДНК pBac-hRT использовали для получения рекомбинантного бакуловируса при помощи транспозон-зависимой интеграции, подробно описанной в протоколах Gibco (Luckow, 1993) Для получения контрольного бакуловируса использовали вектор pFasBacl Рекомбинантными бакуловярусами инфицировали культуру клеток Sf21 (King, 1992) После 72 часов инфекции продукцию белка ОРТ2 в клетках насекомых подтверждали иммунохимическими методами Дополнительно экстракты инфицированных клеток анализировали на присутствие ОТ активности по включению меченного [3H]dTTP в полимерную форму на гомогенной матрице поли(гА)-олиго(с1Т) Выделение рекомбинантной ОТ из клеток насекомых Sf 21 Методика выделения обратной транскриптазы LIHs из клеток насекомых 5/21, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом, несущим ОРТ2 LIHs, включала три этапа, получение осветленного экстракта клеток насекомых, хроматографию на SP-сефарозе в линейном градиенте 0,25 - IM NaCl и гепарин-сефарозе в ступенчатом градиенте 0,5 - 1 М. Фракции, содержащие ОТ активность, анализировали в SDS-ПААГе с последующим окрашиванием серебром и иммуноблотингом, объединяли, добавляли глицерин до конечной концентрации 50% и хранили на -70°С Концентрацию белка оценивали по методу Бредфорда (Bradford, 1976).
РНК-зависимая ДНК полимеразная реакция
РНК-зависимую ДНК полимеразную (обратно транскриптазная, ОТ) активность определялась по стандартной методике Реакционный буфер содержал следующие компоненты: 50 мМ Трис-HCl (pH 8 0), 50 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 10 мМ ДТТ, поли(гА)-олиго^Т)12 (Sigma, 0,5 А umts/мл) and 1 мкМ [3H]dTTP (Amersham, 3300 с.р m /pmol), и препарат фермента. Образцы инкубировали при 37°С в течении 15 мин Реакцию останавливали, помещая образцы на лед Включенную радиоактивность измеряли методом сцинцилляций в жидкой фазе В качестве контроля использовали коммерческий препарат ОТ MMLV (Promega)
Реакция элонгации праймера Элонгацию праймера на гетерогенных РНК- и ДНК - матрицах LIHs в присутствии рекомбинантной ОТ проводили в реакционном буфере описанном выше с модификациями. Смесь, содержащую
все компоненты за исключением dNTP, преинкубировали при 37°С в течении 5 минут Затем вносили dTTP, dCTP, dGTP в концентрации 20 мкМ каждого и [а-32Р] dATP, реакцию проводили при 37°С Синтез ДНК останавливали добавлением равного объема формамидного буфера нанесения, с последующим прогреванием Продукты реакции анализировали электрофорезом в 6% ПААГе, содержащим 7 М мочевины
Гетерогенные матрицы РНК - матрицу LIHs синтезировали in vitro в Т7 системе транскрипции согласно протоколу фирмы "Fermentas" В некоторых случаях РНК метили при помощи [а-32Р] UTP Полученные РНК-матрицы размером 450 н и 1200 н экстрагировали кислым фенолом, с последующим переосаждением спиртом (Sambrook, 1989)
Синтез ДНК - матрицы LI Hs проводили с использованием Taq-полимеразы в условиях ПЦР с одним праймером на предварительно линеризованной плазмидной ДНК Фрагмент ДНК размером 415 н извлекали из геля после электрофореза, экстрагировали фенол/хлороформом и переосаждали спиртом (Sambrook, 1989) Полученные таким способом гетерогенные матрицы отжигали с соответствующими праймерами
Активность РНКазы Н определяли в буфере, описанном выше и содержащем гибрид [32Р]РНК-олигонуклеотид и препарат фермента Образцы инкубировали при 37 °С в течении 60 мин Продукты гидролиза анализировали электрофорезом в 8% ПААГе, содержащим 7 М мочевины
Конструирование и экспрессия элемента LI Hs в клетках млекопитающих Рекомбинантные плазмиды, содержащие ОРТ1 LI Hs и реконструированный элемент LI Hs, собирали на основе вектора pEGFP-N3 (■Clontech) по сайтам подходящим для клонирования Были получены следующие конструкции р-р40, несущая ОРТ1, p-p40-EGFP, содержащая последовательность ОРТ1 слитую в рамке с геном EGFP и pLl, содержащая ОРТ1 (GenBank accession number М19503) и ОРТ2 элемента LI Us (GenBank accession number M80343)
Полученными конструкциями трансформировали культуру клеток яичника китайского хомячка СНО-К1 с помощью липосомального реагента FUGENE согласно прилагаемым рекомендациям фирмы "Roche" Эффекивность трансфекции составляла 30% для контрольной плазмиды pEGFP-N3 После 48-72 часов инкубации при 37°С экстракты трансфицированных клеток анализировали SDS - электрофорезом с последующим иммунным окрашиванием поликлональными антителами против р40 Трансформированные клетки использовали для всех видов микроскопических исследований
Флюоресцентная микроскопия проводилась на микроскопе Leica при длине волны 480-490 нм Микрофотосъемку проводили фотокамерой Nikon
Конфокальная микроскопия проводилась на микроскопе Zeiss, длина волны 488 нм, фильтр LP505, иммерсионные объективы Plan Neofluor 40Х/1,3 и Oil DIC Plan Apochromat 63X/1,4 Oil DIC Программное обеспечение Zeiss LSM Image.
Трансмиссионная электронная микроскопия проводилась на микроскопе JEM 7А. В работе использовали стандартную процедуру подготовки образцов для электронно-микроскопического исследования (Уикли, 1975) После 72 часов трансфекции клетки СНО-К1 фиксировали глутаровым альдегидом, обезвоживали, контрастировали солями тяжелых металлов, пропитывали смолой Эпон 812 (Serva) и полимеризовали Серийные ультратонкие срезы толщиной 60-80 нм получали на ультрамикротоме LKB III (Швеция) Препараты просматривали и фотографировали с помощью электронного микроскопа JEM 7А (Япония) при ускоряющем напряжении 75 кВ
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Экспрессия белка ОРТ2 элемента LI генома человека в клетках насекомых Л/21.
ОРТ2 элемента LIHs была клонирована под контроль полиэдринового промотора в векторную ДНК pFasBacl Полученная конструкция pBac-hRT отличалась от описанной ранее отсутствием 6 Iiis на N-конце белка (Шматченко 1999) Рекомбинантными бакуловирусами инфицировали культуру клеток насекомых 5/21 (King, 1992) После 72 часов инфекции продукцию белка ОРТ2 в клетках насекомых подтверждали иммунохимическими методами (рис. 1) Дополнительно экстракты инфицированных клеток анализировали на присутствие ОТ активности по включению меченного [3H]dTTP в полимерную форму на гомогенной матрице поли(гА)-олиго(ёТ)
MW, кДа 250 — 150 ->
100 ->
75-»
50-»
OTLIHs
ШШШг
Рис. 1. Иммунохимическое выявление белка ОРТ2 в клетках насекомых 3/21
1) Белки клеток 5/21, инфицированных бакуловирусом (контроль),
2) Белки клеток 5/21, инфицированных бакуловирусом с ОРТ2
Как видно из рис 1, полноразмерный белок ОРТ2 LI Hs с ожидаемой молекулярной массой 150 кДа синтезируется только в клетках насекомых, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом Bac-hRT Кроме того,
анализ активности ОТ в экстракте клеток насекомых, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом Вас-Ы^Т, показал, что в присутствии матрици поли(гА)-олиго(с1Т) идет эффективное включение [3Н]<ЗТТР, в то время как в экстракте клеток насекомых, инфицированных контрольным вирусом, ОТ активность отсутствовала
Таким образом, в бакуловирусной системе экспрессии был успешно синтезирован белок ОРТ2 элемента ЫЯ?, который имел молекулярную массу 150 кДа и проявлял ОТ активность
Получение гомогенного препарата обратной транскриптазы элемента
1ЛЯ$.
Для получения препарата функционально активной обратной транскриптазы ретротранспозона ЫЯу была разработана методика очистки фермента из клеток насекомых, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом ^якагеуа, 2003) Процедура очистки включала три этапа получение осветленного экстракта клеток насекомых, хроматография на ЯР-сефарозе и гепарин-сефарозе (Табл 1) Все операции по выделению фермента проводились при 4°С
Как видно из таблицы 1, на этапе очистки на 8Р-сефарозе резко возрастала ДНК-полимеразная активность, по-видимому, эта стадия позволила освободиться от сопутствующих ингибиторов ДНК-полимеразной активности Кроме того, из электрофореграммы фракций после БР-сефарозы с ОТ активностью видно, что на этой стадии была удалена большая часть балластных белков (рис 2) Известно, что обратные транскриптазы прочно связываются с гепарином Аффинная хроматография на гепарин-сефарозе была использована в качестве заключительного этапа очистки фермента, что позволило дополнительно очистить и сконцентрировать фермент (рис 2) Выход гомогенного препарата фермента составил -1,6 мкг/мг белка клеток насекомых с удельной активностью не менее 388 ед. акт/мкг (Табл 1, рис 2) ДНК-полимеразная активность фермента сохранялась стабильной в течение более 12 месяцев
Таблица 1. Очистка рекомбинантной обратной транскриптазы из клеток насекомых 5/21
Этапы очистки
Экстракт
БР-сефароза
гепа£ин-сефароза
Белок (мкг)
ТУзУ
19,7 2Д
Общая активность (единицы")
1146 814
Удельная активность (единиц/мкг белка)___
0,17 58,2 387,9
Степень очистки
1
342 2282
а Одна единица активности обратной транскриптазы определялась как количество фермента необходимое для включения 1 ртЫ [3Н]дТТР в полимерную форму на поли(гА)-олиго((ЗТ) за 15 минут при 37°С
М\У, кДа
1 2 3 4 5
50 —►
Рис. 2. Электрофоретический анализ белковых фракций с ОТ активностью в процессе хроматографии
1 - 3 - фракции после БР-сефарозы, 4,5 - фракции после гепарин -
Оптимумы ДНК-полимеразной активности обратной транскриптазы петоотпанспозона ЫДу.
Максимально высокое включение меченного [3Н]сПТР в полимерную форму на гомогенной матрице поли(гА)-олиго(с!Т) рекомбинантой обратной транскриптазой LlЯs наблюдалось в следующих условиях 100 мМ NаС1, 50 мМ КС1, 10 мМ ОТТ, при рН 8 0 На рис 3 представлены данные влияния температуры на проявление РНК-зависимой ДНК-полимеразной активности
10 20 30 40
о
Температура, С
Рис. 3. Влияние температуры на РНК-зависимую ДНК полимеразную активность фермента
ОТ реакцию проводили, как описано в Материалах и методах, при различной температуре Активность выражали в % от максимального значения
Установлено, что полимеразная активность фермента при 30°С и при 48°С ниже в 2 и в 3 раза, соответственно, чем при 37°С, в то время как, при 42°С полимеразная активность уменьшается незначительно Температурным оптимумом активности рекомбинантной обратной транскриптазы элемента 1Л№ является 37°С
Влияние двухвалентных катионов на ОТ активность.
Зависимость ОТ активности белка ОРТ2 Ll#.s от концентрации ионов Мп и ионов Mg представлена на рис 4 Максимальное включение меченного [ H]dTTP на матрице поли(гА)-олиго^Т) в присутствии ионов Мп2+ наблюдалось в узком диапазоне концентраций этого катиона 0,3 - 0,6 мМ МпС12, повышение концентрации катиона до 1мМ и выше сильно ингибировало ДНК-полимеразную активность фермента (рис 4А) Сравнивая влияние обоих катионов, обнаружено, что в присутствии ионов Mg2"1" каталитическая активность фермента выше в ~3 раза, чем в присутствии ионов Мп2+ Присутствие двухвалентных катионов в реакционной смеси требуется для полимеразной активности большинства ДНК-полимераз и обратных транскриптаз, изученных к настоящему времени (Skalka, 1993, Taube, 1998, Peracb, 1999) Рис 4Б иллюстрирует РНК-зависимую ДНК-полимеразную активность фермента в широком диапазоне концентраций ионов Mg2+
Данные по влиянию двухвалентных катионов на ОТ активность исследуемого фермента позволяют сделать вывод о том, что обратная транскриптаза LlHr является Mg-зависимой ДНК - полимеразой
Рис. 3. Влияние двухвалентных катионов на ОТ активность белка ОРТ2 \.\Hs
ОТ реакцию проводили, как описано в Материалах и методах (А) Различные концентрации МпСЬ (Б) Различные концентрации М§СЬ
Специфичность к субстратам Изучена каталитическая активность фермента на разных субстратах, перечисленных в табл 2. В стандартных условиях инкубации максимальное включение радиоактивномеченного [3Н](1ТТР в полимерную форму обнаружено на матрице поли(гА)-олиго(с1Т) и составляло 388 единиц на мкг белка, тогда как поли(гС)-олиго(сЮ)]2-18 - 67 единиц На матрице ДНК-типа поли[с1(А-Т)] активность фермента составила меньше 6 % от активности на поли(гА)-олиго((1Т) Кроме того, ОТ активность на гетерогенных матрицах РНК- и ДНК-типа не превышала значений, полученных на поли[с1(А-Т)] (табл. 2).
Сделан вывод, что обратная транскриптаза ретротранспозона 1.1 № проявляет как РНК - зависимую, так и ДНК - зависимую ДНК - полимеразные активности. Высокая ОТ активность на матрице поли(гА)-олиго(с!Т), по-видимому, связана с высокой аффинностью фермента к такому типу матриц По-видимому, такое сродство является основной причиной накопления копий элемента в АТ-богатых областях геномной ДНК в процессе эволюции
Таблица 2. Каталитическая активность рекомбинантной обратной транскриптазы h\Hs на различных субстратах
Субстрат
поли(гА) - ОЛИГО(с1Т)12 поли(гС) - олиго(сЮ)12 поли[с!(А-Т)] РНК IЛНч/ олигонуклеотид о ц ДНК фага Ml 3/ олигс^^отеотид_
Удельная активность (pmole/мкг белка)
Удельная активность
(в % относительно поли(гА) - олиго(ёТ)12)
388 100
67 17,3
21,2 5,5
22,3 5,7
20,6 5,3
Синтез ДНК обратной транскриптазой ретротранспозона Lilis.
Процесс синтеза ДНК состоит из трех этапов инициации, элонгации и терминации синтеза Инициация синтеза белком ОРТ2 ретротранспозона LIHs, называемая обратной транскрипцией, праймированной сайтом-мишенью (Luán, 1993), была описана ранее (Cost, 2002). Принимая во внимание, что белок ОРТ2 Ll#s является РНК-зависимой ДНК-полимеразой, важно подчеркнуть актуальность изучения синтеза ДНК на РНК-матрице
В настоящей работе мы исследовали способность ОТ L1H? элонгировать цепь ДНК на гетерогенной матрице LI Hs РНК и ДНК типа Для изучения синтеза ДНК белком ОРТ2 элемента Ll№ были подготовлены два типа субстратов L\Hs фрагмент РНК размером 450 н с отожженным на 3' - конце с олигонуклеотидом (21 н), и одноцепочечный фрагмент ДНК 415 н с
отожженным на 3' - конце с олигонуклеотидом (25 н) Реакцию элошации вели в условиях, описанных в материалах и методах Продукты ДНК-полимеризации анализировали высокоразрешающим электрофорезом в денатурирующих условиях.
Из экспериментальных данных (рис 5) синтеза ДНК видно, что продукт полимеризации на РНК-матрице имел длину 450 н и соответствовал размеру
* исходной матрицы При синтезе ДНК на ДНК-матрице размер продукта полимеризации ОТ LIHs также совпадал с размером исходной матрицы и составил 415 нуклеотидов Полученные результаты подтверждают, что
* обратная транскриптаза ретротранспозона LI Hs может эффективно использовать в качестве субстрата не только РНК, но и ДНК
Кроме того, данные синтеза ДНК белком ОРТ2 LI Hs хорошо иллюстрируют особенности процесса полимеризации на РНК-матрице Как видно на рис 5 при построении ДНК накапливаются промежуточные продукты полимеризации Известно, что процесс обратной транскрипции может обрываться в определенных местах РНК-матрицы, что, по-видимому, связано с диссоциацией комплекса фермент-субстрат Такие места остановки на матрице при синтезе ДНК называют паузингом и описаны для всех изученных к настоящему времени ОТ (Williams, 1990, Isel, 1997, Avidan, 1998, 2002, Harrison. 1998, Taube, 1998, Werner, 1999) Сравнение последовательности РНК-матрицы и мест остановки синтеза ДНК показало, что ОТ LI Hs делает «паузы» в GC-богатом участке РНК матрицы Продолжение полимеризации ДНК происходит в результате реинициации этого процесса. «Паузы» синтеза можно объяснить относительно низким сродством фермента к GC-последовательностям, приводящим к диссоциации комплекса фермент-матрица По-видимому, это свойство белка ОРТ2 LI Hs является одной из причин высокого содержания укороченных и неактивных копий элемента LI Hs в геноме человека
В настоящей работе также была изучена процессивность ОТ элемента LI Hs Максимальное количество нуклеотидов, включенное ферментом в полимерную форму до диссоциации комплекса субстрат-фермент, называют процессивностью ДНК-полимеразы (Werner, 1999) Чтобы непосредственно исключить повторное связывание фермента с субстратом, в одну из реакционных смесей были введен конкурирующий субстрат, тн «ловушка», действие которого заключалось в связывании свободных молекул фермента
Рис 6 иллюстрирует процессивность ОТ элемента Ll#.s при синтезе ДНК на РНК-матрице LI Hs В эксперименте использовали 450 н и 1200 н РНК-► матрицы с отожженным на 3' - конце олигонуклеотидом (21 н ) В присутствии
конкурирующего субстрата размер продукта полимеризации на 450 н РНК-матрице составлял -430 н и был несколько короче, чем продукт синтеза в и отсутствии «ловушки» Такое различие можно объяснить тем, что 5'-концевой
участок РНК-матрицы образует «шпильку», которая приводит к остановке полимеризации ДНК В условиях избытка свободных молекул фермента происходит реинициации синтеза ДНК и достраивание кДНК В присутствии «ловушки» этот процесс не происходит и накапливается укороченный ДНК-
Рис. 5 Синтез ДНК ОТ ЫНэ на ДНК- и РНК-матрицах \ЛНв
1 - на ДНК- матрице размером 415 н , ОТ 0,2 ед /мкг матрицы,
2 - на РНК-матрице, размером 450 н , ОТ 0,2 ед /мкг матрицы,
3 - на РНК- матрице, размером 450 н , ОТ 1,0 ед /мкг матрицы
Рис. 6. Процессивность ОТ на
РНК-матрице Ы Я«.
1 - РНК-матрица, размером 1200 н,
2 - РНК-матрица, размером 1200 н и «ловушка»,
3 - РНК-матрица, размером 450 н ,
4 - РНК-матрица, размером 450 н и «ловушка»
продукт При полимеризации на РНК-матрице длиной 1200 н., как в присутствии, так и в отсутствии «ловушки» видны остановки синтеза ДНК и образуются промежуточные продукты полимеризации размером около 600 н Таким образом, количество нуклеотидов, включенное ОТ LIHs в полимерную форму на РНК LI Я* до диссоциации комплекса фермент-матрица, составляет не менее 600
Из литературных данных известно, что высокую процессивность проявляют полимеразы в составе мультимерных комплексов Например, ДНК-полимеразы, участвующие в репликации геномной ДНК, способны полимеризовать до 1000 нуклеотидов до диссоциации комплекса субстрат-фермент (Kelman, 1998) Низкая процессивность показана для ретровирусных обратных транскриптаз, что, по-видимому, является основной причиной высокой изменчивости ретровирусного генома (Huber, 1989; Kohlstaedt, 1992; Katz, 1990, 1994; Werner, 1999) Процессивность ОТ ДКП-несодержащего ретротранспозона была впервые показана для ОТ элемента R2 Вш и составила 580 нуклеотидов, значительно выше, чем процессивность хорошо изученной
ретровирусной ОТ AMV (Bibillo, 2002) Таким образом, можно сделать вывод, что в настоящей работе впервые показана высокая процессивность белка ОРТ2 LiHs на РНК элемента LIHs, которая составляет не менее 600 н .
Активность РНКазы Н Подавляющее большинство обратных транскриптаз помимо ДНК-полимеразной активности проявляют активность РНКазы Н Сравнительный филогенетический анализ аминокислотной последовательности этого домена проводят для изучения дивергенции внутри классов и семейств ретроэлементов и их эволюции и классификации (Malik, 1999, 2001) Поскольку белок ОРТ2 относят к древнему семейству ревертаз, то теоретически предсказанные свойства и прямые экспериментальные данные могут не совпадать
Для выявления активности РНКазы Н белка ОРТ2 Ll#.v реакционная смесь содержала гибрид [32Р]РНК-олигонуклеотид и препарат фермента Образцы инкубировали при 37 °С в течение 60 мин Продукты гидролиза анализировали электрофорезом в 8% ПААГе, содержащим 7 М мочевины Из экспериментальных данных, представленных на рис 7 видно, что обратная транскриптаза Ll//s не гидролизует РНК в гибриде РЖ-ДНК, в отличие от ретровирусной обратной транскриптазы MMLV Отсутствие активности РНКазы Н является уникальным свойством полноразмерного белка ОРТ2 элемента L\Hs Полученные данные являются прямыми доказательствами ранее проведенного компьютерного анализа аминокислотной последовательности белка ОРТ2, не выявившего консервативных доменов РНКазы Н (Malik, 2001, Ostertag, 2001).
А Б
450 н
450 н
РНКазаН
220 н 190 н
190 н
220 н
Рис. 7 Определение активности РНКазы Н белка ОРТ2 ретротранспозона ЫНь.
(А) Схематичное представление эксперимента по выявлению активности РНКазы Н, (Б) Электрофореграмма продуктов гидролитического расщепления РНКазы Н Дорожки 1 -инкубация в присутствии ОТ ММЬУ (Ргоп^а), 2 - инкубация в присутствии ОТ ретротранспозона Ы, 3 - инкубация без фермента, 4 - гибрид [12Р]РНК - олигонуклеотид,
Локализация белка р40 элемента L1 Hs в клетках млекопитающих
С целью изучения локализации белка ОРТ1 элемента L1 Hs в клетках млекопитающих была разработана модельная система экспрессии ОРТ1 в культуре клеток яичника китайского хомячка СНО-К1 ОРТ1 элемента L1 Hs была клонирована в эписомальный вектор под контроль конститутивного промотора цитомегаловируса Были получены следующие конструкции рекомбинантная плазмида р-р40, несущая ОРТ1 и p-p40-EGFP, содержащая последовательность ОРТ1 слитую в рамке с геном EGFP Плазмида р-р40 направляла синтез белка р40 в трансформированных клетках СНО-К1 Плазмида p-p40-EGFP кодировала химерный белок p40-EGFP, состоящий из 310 а к белка ОРТ1 и 233 а к белка EGFP, рассчитанная молекулярная масса гибридного белка составила -60 кДа Необходимо подчеркнуть, что в процессе конструирования рекомбинантной плазмиды были сохранены все консервативные последовательности и домены белка р40, необходимые для успешной транспозиции элемента Llfís (Moran, 1996) Иммунохимический анализ экстрактов клеток трансформированных рекомбинантными плазмидами подтвердил синтез белка р40 и гибридного белка p40-EGFP (рис 8) Сравнивая рассчитанную молекулярную массу р40, ~40 кДа, с экспериментальными данными (рис 8), видно, что разница составляет ~7кДа Этот факт можно объяснить аномальной подвижностью щелочных белков в системе Лэммли и наличием посттрансляционных модификаций белка р40 Компьютерный анализ аминокислотной последовательности белка ОРТ1 элемента L1 Hs предсказал наличие следующих сайтов модификации фосфорилирование, N -i ликозилирование, меристилирование, амидирование Совокупность модификаций р40 может увеличить молекулярныю массу белка на 2-5 кДа
Следующим этапом исследований было изучение локализации белка р40 после его трансляции в животных клетках С этой целью проводили флюоресцентую микроскопию живых клеток СНО-К1, трансфицированных плазмидой рр40-ЕСРР и вектором рЕОРР-Ю, в качестве контроля Результаты
Рис. 8 Иммунохимический анализ экстрактов трансформированных клеток СНО-К1
1 Белки клеток СНО-К1, трансфицированных р-р40,
2 Белки клеток СНО-К1, трансфицированных рЕОРР-Ю,
3 Белки клеток СНО-К1, трансфицированных р-р40-ЕСРР
16,5 —>
экспрессии белков представлены на рис 9 Сравнивая локализацию хромофора зеленого флюорусцентного белка в клетках, синтезирующих EGFP и гибридный белок р40 - EGFP, видно, что последний накапливается только в цитоплазме. Ранее проведенные биохимические исследованиях белка ОРТ1 LIHs, выделенного из клеток тератокарциномы человека показали, что р40 образует мультимеры ассоциированные с РНК элемента ЫЯу (Holmes, 1992, Hohjoh, 1997). Сходные результаты были получены и для белка ОРТ1 элемента L1 генома мыши (Kolosha, 1997) Однако, являются ли эти структуры упорядоченными оставалось не ясным
Рис. 9 Флюоресцентная микроскопия трансфицированных клеток СНО-К1, экспрессирующих белок р40 слитый с зеленым флюоресцентным белком Иммерсионный объектив, увеличение 1000Х (А) клетки СНО-К1, трансфицированные рЕОРР-ЫЗ, (Б) клетки СНО-К1, трансфицированные рр40-ЕСРР
Рис. 10 Конфокальная микроскопия клеток СНО-К1, синтезирующих белок р40 слитый с зеленым флюоресцентным белком
Последующее исследование химеры р40 - EGFP т vivo с помощью конфокальной микроскопии подтвердило, что белок р40 действительно локализуется только в цитоплазме, и образует неупорядоченные структуры (рис 10) Известно, что полипептидная цепь белка ОРТ1 элемента LIHs образует специфическую структуру, т н. «лейциновый зиппер», которая отвечает за формирование белок - белковых взаимодействий (Holmes, 1992) Полученные экспериментальные данные подтвердили, что «лейциновый зиппер» белка р40 способствует формированию неупорядоченных агрегатов По - видимому, для образования упорядоченных частиц элементом L1 необходимо участие обоих белков и РНК элемента или дополнительных
клеточных факторов Таким образом, нами получены прямые доказательства накопления белка р40 в цитоплазме в процессе экспрессии элемента ЫЯ? Впервые показано, что белок р40 формирует неупорядоченные агрегаты
Образование вирусоподобных частиц белками элемента Ы
С целью изучения взаимодействия белков элемента ЫНз в цитоплазме во время их трансляции, нами был сконструирован химерный элемент Ы#5, в 1
котором под контролем промотора цитомегаловируса последовательно находятся ОРТ1 и ОРТ2 Полученной конструкцией трансформировали клетки СНО-К1 В контрольной трансформации использовали вектор рЕОРР-№ Для «
электронно-микроскопического исследования использовали
трансформированные клетки СНО-К1, подготовленные по стандартной процедуре (Уикли, 1975), с последующим приготовлением серийных ультратонких срезов (60-80 нм).
Результаты трансмиссионной электронной микроскопии представлены на рис 11 На электронных микрофотографиях клеток, трансфицированных рекомбинантной плазмидой с химерным элементом ЫЯя, видны вирусоподобные частицы, которые отсутствуют в клетках контрольных образцов Наблюдаемые частицы ассоциированы с ядерной мембраной и имеют форму и морфологию характерную для вирусоподобных частиц При большем увеличении хорошо видна структура частиц, диаметр которых составляет -9295 нм
Рис. 11 Электронная микроскопия клеток СНО-К1, трансфицированных химерным элементом Ы№.
А, Б Клетки СНО-К1, трансформированные рекомбинантной плазмидой, несущей химерный 1ЛЯ? Ассоциация вирусоподобных частиц (ВПЧ) с ядерной мембраной (ЯМ) В Клетки СНО-К1, трансформированные вектором рЕвРР-Ю
Полученные данные позволяют предположить, что образование вирусоподобной частицы элементом ЫЯ.у происходит при участии белков первой и второй рамки ретротранспозона. Вероятно, что формирование частиц необходимо для сохранения целостности РНК мобильного элемента Поскольку последовательности белков элемента не содержат специальных сигналов для проникновения в клеточное ядро, то, по-видимому, доставка матрицы и обратной транскриптазы к геномной ДНК осуществляется во время митоза Мы предполагаем, что ассоциация вирусоподобных частиц с ядерной мембраной является необходимым условием для процесса реинтеграции элемента Ы//л
ВЫВОДЫ:
• Проведена бакуловирусная экспрессия ОРТ2 мобильного элемента L1 генома человека Разработана методика хроматографической очистки белка ОРТ2, проявляющего активность обратной транскриптазы
• Впервые показано, что белок ОРТ2 элемента L1 Hs является магний-зависимой ДНК-полимеразой и проявляет как РНК-зависимую, так и ДНК - зависимую ДНК - полимеразную активность
• Впервые показаны высокая процессивность обратной транскриптазы элемента Ll/ís-, которая составила не менее 600 н , и паузы синтеза ДНК на L1-матрице
• Обратная транскриптаза ретротранспозона L1 Hs не проявляет активности РНКазы Н, характерной для обратных транскриптаз ретровирусов и ретротранспозонов.
• Эксперименты по экспрессии элемента L1 Hs in vivo показали, что белок ОРТ1 накапливается только в цитоплазме клеток и формирует неупорядоченные агрегаты.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИИ
1 Пискарева О А., Бэррон Н, Клайнс М, Шматченко В В Цитоплазматическая локализация белка р40 мобильного элемента L1 генома человека in vivo Докл Акад. Наук 2004 (в печати)
2 Piskareva О А, Denmukhametova S V , Schmatchenko V V Functional reverse transcriptase encoded by the human LINE-1 from baculovirus -infected msect cells // Protein Expression and Purification - 2003 - V 28 -№ 1. - P. 125-130.
3 Piskareva О , Schmatchenko V Immunodetection of ORF1 protein encoded by the LI retrotransposon in human cell line// Abstract Book of Biotechnology, Cancer and Drug Resistance Conference - Dublin, Ireland, 7-8 July 2003 -N28.
4 Пискарева О А, Шматченко В.В. Анализ последовательности белка ОРТ2 элемента L1 человека // Тезисы 7-ой Путинской школы-
конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" - Пущино. -апрель2003 - С 364.
5 Пискарева О А, Шматченко В В Характеристика обратной транскриптазы ретротранспозона L1 человека // Тезисы XV зимней международной молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологи и биотехнологии" - Москва -февраль2003 -С 28.
6 Пискарева О А, Шматченко В В. GAG-подобный белок мобильного элемента L1 генома человека обеспечивает ренатурацию комплементарных последовательностей нуклеотидов // Тезисы Международной конференции "Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология" - Москва - октябрь 2001 -С. 122.
7 Пискарева О А , Шматченко В В Транзиентная экспрессия зеленого флюоресцентного бежа в клетках млекопитающих, инфицированных бакуловирусом, несущим ген GFP // Тезисы Зимней школы молодых ученых - Москва - февраль 2001
8 Schmatchenko V V, Denmukhametova S V , Piskareva О A Reverse transcriptase encoded by the human LI retrotransposon' effect of deletions on the reverse transcriptase activity // Abstract Book of 18th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology "Beyond the Genome" -Birmingham, UK.- July 2000. - P.225.
Работа частично поддержана грантом European Molecular Biology Organisation (ASTF 62-2003)
Принято к исполнению 21/01/2004 Заказ № 19
Исполнено 22/01/2004 Тираж 100 зкз
ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095)318-40-68 www autoreferat ru
РНБ Русский фонд
2006^4 4739
/
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Пискарева, Ольга Александровна
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ.
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Организация генома человека и мобильные элементы.
1.2. Строение и механизмы транспозиции мобильных элементов генома человека.
1.2.1. Транспозоны.
1.2.2. LTR - содержащие ретротранспозоны.
1.2.3. LTR - несодержащие ретротранспозоны.
1.2.4. SINE.
1.3. Жизненный цикл LTR - несодержащего регротранспозона L1.
1.3.1. Транскрипция.
1.3.2. Процессии г.
1.3.3. Трансляция
1.3.4. Белок ОРТ 1.
1.3.5. Белок ОРТ2.
1.3.6. Нос ггрансляционные модификации белков и образование рибонуклеопротеинового комплекса.
1.3.7. Доставка в ядро.
1.3.8. Интеграция в геномную днк.
1.4. Образование инверсий и делеций элемента L1.
1.5. Образование укороченных копий L1.
1.6. Перемещение элементов L1 по геномной ДНК.
1.6.1. Гомологичная рекомбинация.
1.6.2. Транспозиционная активность элементов LI.
1.6.3. Частота транспозиций элементов L I.
1.7. Клеточные функции элемента LI
1.7.1. Влияние на экспрессию генов.
1.7.2. Восстановление двухцепочечных разрывов ДНК.
1.7.3. Реорганизация генома.
1.8. Практическое применение элементов L1.
1.8.1. Филогенетические маркеры.
1.8.2. Система случайного мутагенеза.
1.8.3. Вектор для переноса генов.
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
2.1. Материалы и реактивы.
2.1.1. Реактивы.
2.1.2. Штаммы H.coh и культуры клеток.
2.1.3. Вектора.
2.1.4. Олигонуклеотиды.
2.1.5. Основные буферы и растворы.
2.1.6. Бактериальные среды.
2.2. Методы рекомбинантных днк.
2.3. Клонирование и экспрессия OPTI и фрагмента ОРТ элемента LIHs в клетках \i.coli.
2.4. Выделение и очитка рекомбинантных белков из клеток И.соЧ.
2.5. Получение поликлональных мышиных антител.
2.6. Клонирование и экспрессия ОРТ2 элемента Llf/,v, кодирующей обратную транскриптазу в клетках насекомых Sf 21.
2.6.1. Получение рекомбинантной бакмиды, несущей ОРТ2 Ll//,s.
2.6.2. Получение рекомбинантного бакуловируса, несущего ОРТ2 UHs.
2.6.3. Определение титра рекомбинантного бакуловируса.
2.6.4. Наращивание и хранение рекомбинантного бакуловируса.
2.6.5. Экспрессия ОРТ2 элемента L\Hs в клетках насекомых Sf 21.
2.7. Выделение рекомбинантной ОТ элемента L\Hs из клеток насекомых Sf 21.
2.8. Конструирование и экспрессия элемента L\H.s в клетках млекопитающих
2.9. Культивирование клеток эукариот.
2.10. Выделение ядер клеток млекопитающих.
2.11. Аналитические методы.
2.11.1. РНК-зависимая ДНК-полимеразная реакция.
2.1 1.2. Получение гетерогенных матриц.
2.11.3. Реакция элонгации праймера.
2.11.4. Определение активности РНКазы Н.
2.11.5. Гель-электрофорез НК в денатурирующих условиях.
2.1 1.6. SDS-электрофорез белков.
2.1 1.7. Окрашивание белковых гелей ни гратом серебра.
2.1 1.8. Иммуноблотинг.
2.11.9. Определение концентрации белка.
2.12. Микроскопия.
2.12.1. Световая микроскопия.
2.12.2. Флюоресцентная микроскопия.
2.12.3. Конфокальная микроскопия.
2.12.4. Трансмиссионная электронная микроскопия.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Экспрессия гибридных белков элемента L\Hs с целью получения поликлональных антител.
3.2. Экспрессия белка ОРТ2 элемента LI Hs в клетках насекомых S
3.3. Получение препарата обратной транскриптазы элемента LI Hs.
3.4. Оптимумы ДНК-полимеразной активности обратной транскриптазы элемента L I Hs.
3.5. Влияние двухвалентных катионов на активность ОТ элемента L\Hs.
3.6. Специфичность к субстратам ОТ элемента LI Hs.
3.7. Синтез ДНК ОТ элемента U//.v.
3.8. Активность РНКазы Н ОТ элемента L\Hs.
3.9. Локализация белка р40 элемента LI Hs в клетках млекопитающих
3.9.1. В клетках человека линии HeLa белок р накапливается в цитоплазме.
3.9.2. В клетках хомяка CHO-KI in vivo белок р40 элемента L1//.S накапливается в цитоплазме.
3.10. Образование вирусоподобных частиц белками элемента L\Hs.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Функциональные свойства белков, кодируемых ретротранспозоном L1 генома человека"
Актуальность проблемы
Элементы L1 или LINE-1 относятся к классу ретротранспозонов, не содержащих длинные концевые повторы (LTR), и составляют приблизительно 17% генома человека. Элементы этого класса реингегрируют в геном через РНК-посредник при участии собственной обратной транскриптазы. В основном элементы L1 генома человека (Ll//.v) функционально не активны, так как укорочены с 5'-конца и/или имеют внутренние перестановки и/или мутации, и только около 60 копий способны перемещаться в геноме. К настоящему времени клонированы полноразмерные "активные" копии L\Hs и определены их структурные особенности (Kazazian Н., 2001). Именно активные LIHs способны вызывать мутации, наследственные заболевания, генетическое разнообразие и полиморфизм, в го время как неактивные копии являются причиной неправильного кроссинговера, приводящего либо к делеции, либо к дупликации.
Консенсусная последовательность L\Hs протяженностью 6-7 тыс. пар оснований содержит две не перекрывающиеся открытые рамки трансляции (ОРТ). Первая рамка кодирует белок со свойствами gag белков ретровирусов, вторая - белок с активностями эндонуклеазы и обратной транскриптазы. При исследовании белка OPT I, р40, выделенного из клеток тератокарциномы человека, было обнаружено, что р40 имеет высокое сродство к РНК LI//.S (Hohjoh Н., 1996, 1997) и образует в цитоплазме клеток мультимеры (Holmes S., 1992, Hohjoh Н., 1997). При изучении транспозиционной активности LI/7.S в культуре клеток было показано, что С - концевая область белка р40 содержит ряд консервативных аминокислот важных для транспозиции элемента LI (Moran J., 1996). Кроме того, было обнаружено цис-активное функционирование L1//.S в процессе реинтеграции в геном (Moran J., 1996, 1999, Goodier, 2000, Wei W„ 2001).
В двух независимых экспериментах было показано, что активность ОТ свойственна центральному домену белка ОРТ2, хотя другие выдвинутые предположения спорны, поскольку исследования проводились на частично очищенном препарате белка ОРТ2 (Clements А., 1998), либо в клеточной системе in vivo (Dhellin О., 1997). С помощью генетического метода определения частоты событий ретротранспозиции было показано, что делеции и мутации в последовательности ОРТ2 L1//.S приводят к инактивации транспозиционной активности элемента в культуре клеток человека (Moran J., 1996). Недавно было показано, что интеграция элемента человека L\Hs в геном обеспечивается активностью обратной транскриптазы белка ОРТ2, причем в качестве праймера для построения кДНК используется З'-выступаюгций конец сайта мишени геномной ДНК (Cost G., 2002). Такой механизм впервые был описан для LTR - несодержащего ретротранспозона R2 Вт и получил название - обратная транскрипция, праймированая сайтом-мишенью (Liian D., 1993). Таким образом, именно активность обратной гранскриптазы является одним из важнейших факторов, определяющим возможность построения кДНК копии элемента и его дальнейшее встраивания в геном.
Совокупность имеющихся данных, касающихся молекулярной биологии LI//.V, оставляет открытыми ряд важных вопросов, решение которых является актуальным. В частности плохо изучены функциональные и структурные свойства белка ОРТ2 Llf/.v, так же как и особенности процесса, катализируемого этим ферментом, из-за отсутствия гомогенного и стабильного препарата фермента. Так же остается неясной роль р40 в транспозиции L\Hs. Кроме того, не выяснен механизм взаимодействия белков и РНК элемента в процессе доставки матрицы в ядро.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы было исследование функциональных свойств белков, кодируемых LTR- несодержащим ретротранспозоном L1 генома человека. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
Г) провести экспрессию открытой рамки трансляции 2 элемента L\Hs в эукариотической системе;
2) выделить и очистить полноразмерный белок ОРТ2 L1/7.V и охарактеризовать его ферментативную активность;
3) исследовать ДНК-полимеразную активность белка ОРТ2 LI Hs;
4) разработать модельную систему экспрессии элемента L1 в культуре клеток млекопитающих;
5) исследовать взаимодействие белков L I Hs в процессе его экспрессии.
Работа выполнена в ВНТК мобильных генетических элементов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН в соответствии с планом научно-исследовательских работ.
Научная новизна
Впервые проведена характеристика ферментативной активности белка ОРТ2 элемента LI Hs. Показано, что очищенный белок является Mg2+-зависимой ДНК-полимеразой и проявляет как РНК-зависимую, так и ДНК-зависимую ДНК-полимеразные активности, но не обладает активностью РНКазыН. Впервые показаны процессивность и паузинг ОТ L\Hs в процессе синтеза ДНК.
В экспериментах по экспрессии ОРТI в клетках млекопитающих, впервые получены доказательства накопления белка ОРТ! в цитоплазме клеток в виде неупорядоченных агрегатов.
Предложена модельная система экспрессии элемента L\Hs in vivo. Впервые обнаружено, что белки элемента L\Hs образуют структуры, подобные вирусным частицам. Вирусоподобные частицы имеют диаметр 9295 нм и ассоциированы с ядерной мембраной.
Практическая ценность работы
Настоящая работа является частью фундаментальных исследований, посвященных изучению молекулярных механизмов транспозиционной активности элемента LIHs. Предложена методика очистки белка ОРТ2 LIHs из клеток насекомых, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом, несущим ОРТ2, позволяющая получать высокоочищенный препарат, сохраняя его ферментативную активность.
Полученные в настоящей работе результаты могут быть использованы при реконструкции in vitro этапов гранспозиции элемента LI / /л, а так же при создании векторов для переноса генов.
Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Пискарева, Ольга Александровна
ВЫВОДЫ:
Проведена бакуловирусная экспрессия ОРТ2 мобильного элемента L1 генома человека. Разработана методика хроматографической очистки белка ОРТ2, проявляющего активность обратной гранскриптазы. Впервые показано, что белок ОРТ2 элемента LI//.S является магний-зависимой ДНК-полимеразой и проявляет как РНК-зависимую, гак и ДНК - зависимую ДНК - полимеразную активность. Впервые показаны высокая процессивность обратной транскриптазы элемента Ll//,v, которая составила не менее 600 н., и паузы синтеза ДНК на L1-матрице.
Обратная транскриптаза ретротранспозона L1//.V не проявляет активности РНКазы Н, характерной для обратных транскриптаз ретровирусов и ретротранспозонов.
Эксперименты по экспрессии элемента LI Hs in vivo показали, что белок ОРТ! накапливается только в цитоплазме клеток и формирует неупорядоченные агрегаты.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, суммируя данные обеих частей настоящей работы, целью которой было исследование функциональных свойств белков, кодируемых LTR- несодержащим ретротранспозоном LI генома человека, можно прийти к следующему заключению.
Высокая ОТ активность, проявляемая белком ОРТ2 элемента LI Hs на матрице поли(гА)-олиго(ёТ), по-видимому, облегчает синтеза кДНК в реакции обратий транскрипции, праймированной сайтом-мишенью и объясняет накопление копий элемента Ll/Y.s в АТ-богатых областях геномной ДНК человека в процессе эволюции. В то время как, высокая процессивность обратной транскриптазы элемента L\Hs и паузы синтеза ДНК в GC-богатых последовательностях РНК LI Ял, по-видимому, являются одной из причин высокого содержания неактивных и укороченных копий элемента LI Hs в геноме человека.
Свойства белка р40 элемента L\Hs, накапливаться в цитоплазме клеток и формировать неупорядоченные агрегаты, позволяют предположить, что, белки элемента L\Hs, взаимодействуя с собственной РНК, образуют РНГ1 частицы необходимые для сохранения целостности РНК элемента. А отсутствие в последовательности белков элемента LI Hs специальных сигналов для проникновения в клеточное ядро свидетельствует в пользу того, что доставка матрицы L\Hs в составе РНП частиц к геномной ДНК осуществляется во время митоза.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пискарева, Ольга Александровна, Пущино
1. Альберте Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки, под ред. Георгиева Г.П. // М.: Мир, 1995;
2. Методы культивирования клеток // Сборник научных трудов. Л.: Наука, 1988;
3. Сингер М., Берг П. Гены и геномы, под ред. Янковского Н.К. // М.: Мир, 1998.
4. Уикли Б. Электронная микроскопия для начинающих. М.: Наука, 1975.
5. Adey N.B., Tollefsbol Т.О., Sparks А.В., Edgell М.Н., Hutchison C.A. Molecular resurrection of an extinct ancestral promoter for mouse LI // PNAS. 1994. - V. 91. - N. l.-P. 1569-1573;
6. Andersson G., Svensson A., Setterblad N., Rask L. Retroelements in the human Ml 1С class II region // TIG 1998. - V. 14. - P. 109-114;
7. Arning S., Gruter P., Bilbe G., Kramer A. Mammalian splicing factor SF I is encoded by variant cDN As and binds to RNA // RN A. 1996. - V. 2. -P. 794-810;
8. Asch H.L., Eliacin E., Fanning T.G., Connolly J.L., Bratthauer G., Ascli B.B. Comparative expression of the LINE-1 p40 protein in human breastcarcinomas and normal breast tissues // Oncol. Res. 1996. - V. 8. -P.239-247;
9. Avidan O., Hizi A. The processivity of DNA synthesis exhibited by drug-resistant variants of human immunodeficiency virus type-1 reverse transcriptase // Nucleic Acids Research. 1998. - V. 26. - N. 7. - P. 17131717;
10. Avidan О., Meer M., Oz I., Hizi A. The processivity and fidelity of DNA synthesis exhibited by the reverse transcriptase of bovine leukemia virus // Eur. J. Biochem. 2002. V. 269. - P. 859-867;
11. Badge R., Alisch R., Moran J. ATLAS: a system to selectively identify human-specific LI insertions // Am. J. Hum. Genet. 2003. - V. 72. - P. 823-838;
12. Barabano S., Huber W., Jenny A., Keller W. The 30-kD subunit of mammalian cleavage and polyadenilation specifity factor and its yeast homolog are RNA-binding zinc finger proteins // Genes Dev. 1997. - V. 11. P. 1703-1716;
13. Benjes S., Morris C. A full-length and potentially active LINE element is integrated polymorphically within the IGL locus in a genomically unstable region of chromosome 22 // Hum. Genet. 2001. - V. 109. - P. 628-637;
14. Berg J. Zinc fingers and other metal-binding domans. Elements for interactions between macromolecules // .I.Biol.Chem. 1990. - V. 265. P. 6513-6516;
15. Bibillo A., Eickbush T. High processivity of the reverse transcriptase from a non-long terminal repeat retrotransposon // J. Biol. Cliem. 2002. - V. 277. - P. 34836-34845;
16. Bibillo A., Eickbush T. The reverse transcriptase of the R2 non-LTR retrotransposon: continuous synthesis of cDNA on non-continuous RNA templates // J. Mol. Biol. 2002. - V. 316. - P. 459-473;
17. Blum, H., Beier, H., and Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins RNA and DNA in polyacrylamide gels // Electrophoresis. 1987.1. V. 8. P. 93-99;
18. Boeke J.D., Pickeral O.K. Retroshuffling the genomic deck // Nature.1999. V. II. P. 108-109;
19. Boeke J.D. LINEs and Alus the polyA connection // Nat. Genet. - 1997. -V. 16. - P. 6-7;
20. Boissinot S., Chevret P., Furano A.V. LI (LINE-1) retrotransposon evolution and amplification in recent human history // Mol. Biol. Evol.2000. V. 17.-P. 915-928;
21. Bradford M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. - V. 72. - P. 248-254;
22. Bratthauer G., Fanning T.G. Active LINE-1 retrotransposons in human testicular cancer // Oncogene. 1992. - V. 7. - P. 507-510;
23. Brattliauer G., Cardiff R.D., Fanning T.G. Expression LINE-1 retrotransposons expression in human breast cancer // Cancer. 1994. V. 73. - P. 2333-2336;
24. Bratthauer G., Fanning T.G. LINE-1 retrotransposon expression in pediatric germ cell tumors // Cancer. 1993. - V. 71. - P. 2383-2386;
25. Brown P.O., Bowerman В., Varmus H.E., Bishop J.M. Correct integration of retroviral DNA in vitro // Cell. 1987. V. 49. P. 347-356;
26. Burke T.W., Kadonaga J.T. Drosophila TF1ID binds to a conseved downstream basal promoter element that is present in many TATA-box-deficient promoters // Genes Dev. 1996. - V. 10. - P. 71 1-724;
27. Burwinkel В., Kiliman M. Unequal homologous recombination between LINE-1 elements as a mutational mechanism in human genetic disease // J.Mol.Biol. 1998. - V. 277. - P.513-517;
28. Bushman F.D., FujiwaraT., Craigie R. Retroviral DNA integration directed by HIV integration protein in vitro // Science. 1990. - V. 249. - P. 15551558;
29. Cantrell M., Grahn R., Scott L., Wichman H. isolation of markers from recently transposed LINE-1 retrotransposons // Biotechniques 2000. - V. 29. - P. 1310-1315;
30. Chamboissier M.C., Busseau F, Prosser J., Finnegan D.J., Bucheton A. Identification of a potential RNA intermediate for transposition of the LINE-like element I factor in Drosophila melanogaster // EMBO J. 1990. - V. 9. - P. 3557-3563;
31. Chen F., MacDonald C.C., Wilusz J. Cleavege site determinants in the mammalian polyadenilation signal // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. -P. 2614-2620;
32. Clements A.P., Singer M.F. The human LINE-1 reverse transcriptase: effect of deletions outside the common reverse transcriptase domain // Nucleic Acids Res. 1998. - V. 26. - P. 3528-3535;
33. Cost, G., and Boeke, J.D. Targeting of human retrotransposon integration is directed by the specificity of the L I endonuclease for regions of unusual DNA structure // Biochemistry. 1998. - V. 37. - P. 18081-18093;
34. Cost GJ, Feng Q, Jacquier A, Boeke JD. Human LI element target-primed reverse transcription in vitro // EMBO J. 2002. - V. 21. - P. 5899-5910;
35. DeBerardinis R.J., Gabriel A., Swergold G.D., Kazazian H.H. Jr. Many human LI elements are capable of retrotransposition // Nat Genet. 1997. -V.I6. - P. 37-43;
36. DeBerardinis R.J., Kazazian H.H. Jr. Analysis of the promoter from an expanding mouse retrotransposon subfamily // Genomics. 1999. - V. 56. -N.3.-P. 317-323;
37. Deragon J.M., Sinnett D., Labuda D. Reverse transcriptase activity from human embryonal carcinoma cells NTera2DI // EMBO J. 1990. - V. 9. -P. 3363-3368;
38. Dhellin 0., Maestre J., Heidmann T. Functional differences between the human LINE retrotransposon and retroviral reverse transcriptases for in vivo mRNK reverse transcription // EMBO J. 1997. - V. 16. - N. 21. - P.6590-6602;
39. Dombroski B.A., Mathias S.L., Nanthakumar E., Scott A.F., Kazazian H. Jr. Isolation of an active human transposable element // Science. 1991. -V. 254. - P. 1805-1808;
40. Dombroski B.A., Scott A.F., Kazazian H.H. 2 Additional potential retrotransposons isolated from a human Ll subfamily that contains an active retrotransposable element // PNAS. 1993. - V. 90. - N. 14. - P. 6513-6517;
41. Dongmei et al. Reverse transcription of R2Bm RNA is primed by a nick at the chromosomal target site: A mechanism for non-LTR retrotransposition //Cell. 1993. V. 72. P. 595-605;
42. Duvernell D., Turner B. Swimmer 1, a new low-copy-number LINE family in teleost genomes with sequence similarity to mammalian Ll //
43. Mol.Biol.Evpl. 1998. - V.15. - P.1791 -1793;
44. Eichinger D.J., Boeke J.D. A specific terminal structure is required for Ту 1 transposition // Genes Dev. 1990. - V. 4. - P. 324-330;
45. Feng Q., Moran J., Naas Г., Boeke J., and Kazazian H. Human LI retrotransposon encodes a conserved endonuclease required for retrotransposition // Cell. 1996. - V. 87. - P. 905-916;
46. Feng Q., Schumann G.,Boeke J.D. Retrotransposon R1 Bin endonuclease cleaves the target sequence // PNAS. 1998. - V. 95. - P. 2083-2088;
47. Fitch D., Bailey W., Slightom J. Duplication of the gamma-globin gene mediated by 11 long interspersed repetitive elements in an early ancestor of simian primates // PNAS. 1991. - V. 88. - P. 7396-7400;
48. Geisse S., Gram H., Kleuser B. Eukaryotic expression systems: a comparison // Prot. Exp. Pur. 1996. - V. 8. - P. 271-282;
49. Goodier J., Ostertag E., Du K., Kazazian H.Fl.Jr. Transduction of 3'-flanking sequences is common in LI retrotransposition // Hum.Mol.Genet.- 2000. V.9. - P. 653-657;
50. Goodwin Т., Ormandy J., Poulter R. LI-like nonOLTR retrotransposons in the yeast Candida albicans // Curr.Genet. 2001. - V. 39. - P. 83-91;
51. Guan, K. L., and Dixon, J. E. Eukaryotic proteins expressed in Escherichia coli: An improved thrombin cleavage and purification procedure of fusion proteins with glutathione S-transferase // Anal. Biochem. 1991. V. 192.- P. 262-267;
52. Harrison G., Mayo V., Hunter E., Lever A. Pausing of reverse transcriptase on retroviral RNA templates is influenced by secondary structures both 54 and 34 of the catalytic site // Nucleic Acids Res. 1998. - V. 26. - N. 14. -P. 3433-3442;
53. Hirose Y., Manley J. RNA polymerase II is an essential mRNA polyadenilation factor// Nature. 1998. - V. 395. - P. 93-96;
54. Hohjoli 11., Singer M.F. Cytoplasmic ribonucleoprotein complexes containing human LINE-I protein and RNA // EMBO J. 1996. - V. 15. -N. 3. - P. 630-639;
55. Hoh joh H., and Singer M. J. Ribonuclease and high salt sensitivity of the ribonucleoprotein complex formed by the human LINE-I retrotransposon // J. Mol. Biol. 1997.-V. 271.-P. 7-12;
56. Hohjoh H. and Singer M. Sequence-specific single-strand RNA binding protein encoded by the human LINE-I retrotransposon // EMBO J. 1997. - V. 16. P. 6034-6043;
57. Holmes S.E., Dombrowski B.A., Krebs C.M., Boehm CD., Kazazian H.H. Jr. A new retrotransposable human LI element from the LRE2 locus on chromosome Iq produces a chimaeric insertion // Nat. Genet. 1994. V. 7.-p. 143-148;
58. Huber H., McCoy J., Seehra J., Richardson C. // J. Biol. Chem. 1989. -V. 264. - P. 4669-4678;
59. Hughes J., Coffin J. Evidence for genomic rearrangements mediated by hyman endogenous retroviruses during primate evolution // Nat. Genet. -2001. V. 29. - P. 487 -489;
60. Isel C., Ehresmann C., Keith G., Ehresmann В., Marquet R. Two step synthesis of (-) strong-stop DNA by avian and murine reverse transcriptases in vitro // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25. - N. 3. - P. 545-552;
61. Janicic N., Pausova Z., Cole D., Hendy G. Insertion of an Alu sequence in the Ca(2+)-sensing receptor gene in familial hypocalciuric hypercalcemia and neonatal severe hyperparathyroidism // Am. J. Hum. Genet. 1995. -V. 56. - P. 880-886;
62. Jurka J. Sequence patterns indicate an enzymatic involvement in integration of mammalian retroposons // PNAS. 1997. - V. 94. - P. 18721897;
63. Katz R.A., Merkel G., Kulkosky J., Leis J., Skalka A.M. The avian retroviral IN protein is both necessary and sufficient for integrative recombination in vitro // Cell. 1990. - V. 63. - P. 87-95;
64. Katz R.A., Skalka A.M. // Annu. Rev. Genet. 1990. - V. 24. - P. 409445;
65. Katz R.A., Skalka A.M. //Annu. Rev. Biochem. 1994. - V. 63. - P. 133173;
66. Kazazian H.H. Jr., Wong C., Youssoufian H., Scott A.F., Phillips D.G., Antonarakis S.E. Haemophilia A resulting from de novo insertion of LI sequences represents a novel mechanism for mutation in man // Nature. -1988,-V. 332. P. 164-166;
67. Kazazian H.H. Jr. Mobile elements and disease // Curr. Opin. Genet. Dev. -1998. -V. 8.-P. 343-350;
68. Kazazian H.H. Jr., Moran J.V. The impact of LI retrotransposons on the human genome // Nat. Genet. -- 1998. V. 19. - P. 19-24;
69. Kimberland M.L., Divoky V., Prchal J., Schwahn U., Berger W., Kazazian H.H. Jr. Full-length human LI insertions retain the capacity for high frequency retrotransposition in cultured cells // Hum. Mol. Genet. 1999. -V. 8. - P. 1557-1560;
70. King, L.A., and Possee, R.D. "The Baculovirus Expression System. A laboratory guide." 1st ed., Chapman & Hall, London. 1992;
71. Kingsmore S., Giros В., Suh D., Bieniarz M., Caron M., Seldin M: Glycine receptor beta-subunit gene mutation in spastic mouse associated with LINE-1 element insertion//Nat. Genet 1994. - V. 7. - P. 136-141;
72. Kohlstaedt L., Wang J., Friedman J., Rice P., Streitz T. // Science. 1992.1. V. 256. P. 1783-1790;
73. Kohrman D., Harris J., Meisler M. Mutation detection in the med and medJ alleles of the sodium channel Scn8a. Unusual splicing due to a minor class AT-AC intron // J. Biol. Cliem. 1996. - V. 271. P. 17576-17581;
74. Kuroda, K„ Geyer, H„ Geyer, R„ Doerfler, W„ and Klenk, H. D. (1990) The oligosaccharides of influenza virus hemagglutinin expressed in insect cells by a baculovirus vector // Virology. 1990. - V. 174. P. 418-429;.
75. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature (London). 1970. -- V. 227. - P. 680685;
76. Lander E.S., Linton L.M., Birren В., Nusbaum C. et al. Initial sequencing and analysis of the human genome // Nature. 2001. - V. 409. - P. 860921;
77. Leibold D.M., Swergold G.D., Singer M.F., Thayer R.E., Dombroski B.A., Fanning T.G. Translation of LINE-1 DNA elements in vitro and in human cells // PNAS. 1990. - V. 87. - P. 6990-6994;
78. Luan D., Komi an M., Jakubczak J., Eickbush T. Reverse transcription of R2Bm RNA is primed by a nick at the chromosomal target site: a mechanism for non-LTR retrotransposition // Cell. 1993. -V. 72. P. 595-605;
79. Luan D., Eickbush T. RNA template requirements for target DNA-primed reverse transcription by the R2 retrotransposable element // Mol. Cell. Biol. 1995. - V. 15. - P. 3882-3891.
80. Luckow, V. A. Baculovirus systems for the expression of human gene products // Curr. Opin. Biotechnol. 1993. - V, 4. - P. 564-572;
81. Malik I I., Burke W., Eickbush T. The age and evolution of non-LTR retrotransposable elements // Mol. Biol. Evol. 1999. - V. 16. - P. 793805;
82. Malik H., Eickbush T. Phylogenetic analysis of ribonuclease H domains suggests a late, chimeric origin of LTR retrotransposable elements and retroviruses // Genome Res. 2001. V. 11. P. 1187-1197;
83. Mathews L., Chi S., Greenberg N., Ovchinnikov I., Swergold G. Large differences between LINE-1 amplification rates in the human and chimpanzee lineages // Am. J. Hum. Genet. 2003. - V. 72. - P.739-748;
84. Mathias S.L., Scott A.F., Kazazian H.H., Boeke J.D., Gabriel A. Reverse Transcriptase Encoded by a Human Transposable Element // Science. -1991. V. 254.-P. 1808-1810;
85. Martin S.L., Li J., Epperson L.E., Lieberman B. Functional reverse transcriptases encoded by A-type mouse LINE-1: defining the minimal domain by deletion analysis // Gene. 1998. - V. 215. - P. 69-75;
86. McCracken S„ Fong N„ Yankulov K„ Ballantyne S., Pan G„ et al. The C-terminal domain of RNA polymerase li couples mRNA processing to transcription // Nature. 1997. - V. 385. - P.357-361;
87. McDevitt M., Impriale M., All H., Nevins J. Requirement of a downstream sequence for generation of poly(A) addition site // Cell 1984. - V. 37. -P. 993-999;
88. McLuachlan J., Gaffney D., Whitton j., Clements J., The consensus sequence YGTGTTYY located downstream from the AATAAA signal is required for efficient formation of rnRNA 3'termini // Nucleic Acid Research 1985. - V. 13. - P. 1347-1368;
89. McMillan J., Singer M. Translation of the human LINE-1 element, LI Hs // PNAS 1993. - V. 90. - P. 11533-11537;
90. Mears M., Hutchinson С. The evolution of modern lineages of mouse Ll elements // J.Mol.Evol. 2001. - V. 52. - P. 51-62;
91. Miki Y., Nishisho I., Horii A., Miyoshi Y., Utsunomiya J., Kinzler K.W., Voglestein В., Nakamura H. Disruption of the APC gene by a retrotransposal insertion of Ll sequence in a colon cancer // Cancer Res. -1992 V. 52.- P. 643-645;
92. Minchiotti G., Contursi C., Di Nocera P. Multiple down stream promoter modules regulate the transcription of the Drosophila Melanogaster I, Doc and F elements // J.Mol.Biol. 1997. - V.267. - P.37-46;
93. Mizrokhi L., Georgieva S., Ilyin Y. Jockey, a mobile Drosophila element similar to mammalian LINEs, is transcribed from internal promoter by RNA polymerase 11 // Cell 1988. - V.54. P.685-691;
94. Morales J., Snow E., Murnane J. Environmental factors affecting transcription of the human L l retrotransposon. 11. Stressors. // Mutagenesis 2003,-V. 18.-P. 151-158;
95. Moran J.V., Naas T.P., Boeke J.D., and Kazazian H.H. High frequency retrotransposition in cultured mammalian cells // Cell. 1996. - V. 87. - P. 917-927;
96. Moran J.V., DeBerardinis R.J., Kazazian H.H. Jr. Exon shuffling by L l retrotransposition // Science. 1999. - V. 283. - N. 5407. - P. 1530-1534;
97. Morrish Т., Gilbert N., Myers J., Vincent В., Stamato Т., Taccioli G., Batzer M., Moran J. DNA repair mediated by endonuclease-independent LINE-1 retrotransposition // Nat. Gen. 2002. - V. 31. - P. 159-165;
98. Muratani K., Hada Т., Yamamoto Y., Kaneko Т., Shigeto Y., Ohue Т., Furuyama J., Higashino K. Inactivation of the cholinesterase gene by Alu insertion: possible mechanism for human gene transposition // PNAS. -1991. V. 88. - P. 11315-11319;
99. Naas T.P., DeBerardinis R.J., Moran J.V., Ostertag E.M., Kingsmore S.F., Seldin M.F., Hayashizaki Y., Martin S.L., Kazazian H.F1. An actively retrotransposing, novel subfamily of mouse LI elements // EMBO J. -1998. V. 17. - N.2. - P. 590-597;
100. Osheim Y., Proudfoot N., Beyer A., EM visualization of transcription by RNA polymerase II: downstream termination requires a poly(A) signal but not transcript cleavage // Mol.Cell 1999. - V.3. - P. 379-387;
101. Ostertag E M. and Kazazian H.H. Biology of mammalian L I retrotransposons // Annu. Rev. Genet. 2001. - V. 35. - P. 501-538;
102. Ovchinnikov I., Troxel A., Swergold G. Genomic characterization of recent human LINE-I insertions: evidence supporting random insertion // Genome Res.-2001.-V. II. P. 2050-2058;
103. Pavlicek A., Paces J., Zika R., Hejnar J. Length distribution of LINEs and processed pseudogenes of human endogenous retroviluses: implications for retrotransposition and pseudogen detection // Gene 2002. - V. 300. - P. 189-194;
104. Perou C.M., Pryor R.J., Naas T.P., Kaplan J. The allele mutation is due to a LINE I element retrotransposition // Genomics. 1997. - V. 42. - P. 366368;
105. Reynolds E.S., The use of lead citrate at high pH as an electronopaque stain in electron microscopy // J. Cell Biol. 1963. - V. 17. - P. 208-212;
106. Pfeiffer J., Topping R., Shin N., Telesnitsky A. Altering the intracellular environment increases the frequency of tandem repeat deletion during moloney murine leukemia virus reverse transcription // J. Virology. 1999.
107. V.73. N. 10. P. 8441-8447;
108. Piskareva O A., Denmukhametova S.V., Schmatchenko V.V. Functional reverse transcriptase encoded by the human LINE-I from baculovirus -infected insect cells // Prot. Exp. Pur. 2003. - V. 28. - N. I. - P. 125-130;
109. Prak E., Dodson A., Farkash E., Kazazian H.H. Jr. Tracking an embryonic LI retrotransposition event // PNAS. 2003. - V. 100. - P. 1832-1837;
110. Salem A., Myers J., Otieno A., Watkins W., Jorde L„ Batzer M. LINE-1 preTa elements in the human genome // J. Mol. Biol. 2003. - V. 326. P. 1127-1146;
111. Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
112. Sandmeyer S.B., Hansen L.J., Chalker D.L. Integratino specificity of retrotransposons and retroviruses // Annu. Rev. Genet. 1990. - V. 24. - P. 491-518.
113. Sassaman D.M., Dombroski B.A., Moran J.V., Kimberland M.L., Naas T.P., et al. Many human 11 elements are capable of retrotransposition // Nat. Genet. 1997. - V. 16. - P. 37-43;
114. Segal Y., Peissel В., Renieri A., de Marchi M„ Ballabio A., et al. LINE-1 elements at the sites of molecular rearrangements in Alport syndromediffuse leiomyomatosis // Am .I.Hum.Genet. 1999. - V. 64. -P.62-69;
115. Singer M.F., Skowronski J. Making sense out of LINEs: long interspersed repeat sequences in mammalian genomes // Trends Biochem. Sci. 1985. -V. 10. - P. 119-122;
116. Skalka, A.M., and Goff, S.P. Reverse Transcriptase // Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. - 1993;
117. Skowronski J., Fanning Т., Singer M. Unit-length line-1 transcripts in human teratocarcinoma cells // Mol. Cell Biol. 1988. - V. 8. - P. 13851397.
118. Smit A.F. The origin of interspersed repeats in the human genome // Curr. Opm. Genet. Dev. 1996. - V. 6. - P. 743-748;
119. Stoppa-Lyonnet D., Carter P., Meo Т., Tosi M. Clusters of intragenic Alu repeats predispose the human C I inhibitor locus to deleterious rearrangements// PNAS 1990 - V. 87.-P. 1551-1555;
120. Swergold G. Identification, characterization, and cell specificity of a human LINE-1 promoter// Mol. Cell Biol. 1990. - V. 10. - P. 67186729;
121. Szak S., Pickeral O., Landsman D., Boeke J. Identifying related LI retrotransposons by analyzing 3' transduced sequences // Genome Biol. -2003. V. 4. - P. 30;
122. Taube, R., Loya, S., Avidan, O., Peracli, M., and Hizi, A. (1998) Reverse transcriptase of mouse mammary tumour virus: expression in bacteria, purification and biochemical characterization // Biochem. J. 1998. - V. 329. - P. 579-587;
123. Trelogan S.A., Martin S.L. Tightly regulated, developmentally specific expression of the first open reading frame from LINE-1 during mouse embryogenesis // PNAS. 1995. - V. 92. - P. 1520-1524;
124. Vishvvanatha J., Jindal IT, Davis R. // J. Cell Sci. 1992. V. 101. P. 25-34.
125. Wallace M.R., Andersen L.B., Saulino A.M., Gregory P.E., Glover T.W., Collins F.S. A de novo Alu insertion results in neurofibromatosis type I // Nature. 1991. - V. 353. - P. 864-866;
126. Wei W„ Gilbert N., Ooi S.L., Lawler J.F., Ostertag E.M., Kazazian 11.H., Boeke J.D., Moran J.V. Human LI retrotransposition: cis preference versus trans complementation // Mol. Cell Biol. 2001. - V. 21. - P. 1429-1439;
127. Whitcomb J., Hughes S. Retroviral reverse transcription and integration: progress and problems // Annu.Rev.Cell Biol. 1992. - V.8. P. 275-306;
128. Williams K., Loeb L., Fryll M. Synthesis of DNA by human immunodeficiency virus reverse transcriptase is preferentially blocked at template oligo(deoxyadenosine) tracts // J. Biol. Chem. 1990. - V. 265. -N 30.-P. 1868-18669;
129. Woods-Samuels P., Wong C., Mathias S.L., Scott A.F., Kazazian H. Jr.,1
130. Antonarakis S.E. Characterization of a nondeleterious LI insertion in anintron of the human factor VIII gene and further evidence of open reading frames in functional LI elements // Genomics. 1989. V. 4. - P. 290-296;
131. Xiong Y., Eickbush Т.Н. The site-specific ribosomal DNA insertion element R IBm belongs to a class of non-long-terminal-repeat retrotransposons // Mol. Cell. Biol. 1988. - V. 8. - P. 114-123;
132. Xiong Y., Eickbush Т.Н. Functional expression of a sequence-specific endonuclease encoded by the retrotransposon R2Bm // Cell. 1988. - V. 55.-P. 235-246;4 145. Young M., Inaba H., Hoyer L.W., Higuchi M., Kazazian H.H. Jr.,
133. Yoshio M., Tohoku J. Disruption of the APC gene by a retrotransposal insertion of LI sequence in a colon cancer// Cancer Res. 1992. V. 52. -P. 643-645;
134. Я благодарю к.б.н. Снежкова Е В. за предоставленную культуру клеток насекомых Sf2l, а Деньмухаметову С.В. за рутинное ведение культуры и не только.
135. Я хотела бы выразить глубокую благодарность к.б.н. Шматченко Н А. за исчерпывающие консультации по очистке белков и предоставление х ро м а гографи ч ее к и х с м ол.
136. И, наконец, но не в последнюю очередь благодарю своих родителей за поддержку на протяжении всего периода выполнения исследований и подготовки диссер гаци и.
137. Работа частично поддержана грантом European Molecular Biology Organisation (ASTF 62-2003)
- Пискарева, Ольга Александровна
- кандидата биологических наук
- Пущино, 2004
- ВАК 03.00.03
- Структурное разнообразие и эволюция NON-LTR-ретротранспозонов суперсемейства Li из геномов растений
- Закономерности и биологические эффекты процесса транспозиций ретранспозонов в геноме Drosophila melanogaster
- Молекулярно-генетическая изменчивость, связанная с полуавтономными генетическими элементами дрозофилы
- Молекулярный анализ полной копии ретротрансозона репейник Drosophila melanogaster
- Полиморфизм вирусоподобных частиц ретротранспозонов в клетках дрозофилы и дрожжей