Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетические стратегии изучения клеточного цикла у Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Омельянчук, Леонид Владимирович, Новосибирск

- / • О / г^ & 4 ~ у

Сибирское Отделение Российской Академии Наук Институт цитологи и генетики

на правах рукописи

ОМЕЛЪЯНЧУК ЛЕОНИД ВЛАДИМИРОВИЧ

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ СТРАТЕГИИ ИЗУЧЕНИЯ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА

У ОЯОЗОРН11Л \iELANOGASTER

Специальность 03.00.15 - генетика

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

И Л V

-......-..... »Мук

ЕЛ к России

Новосибирск - 1999

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..................... 4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ . . .......... 9

Генетические феномены в первых делениях дробления D.melanogaster....................

1.1. Организация первых делений дробления ....

1.2. Радиационный мутагенез при облучении зрелых спермиев 11

1.2.1. Доминантные летали ...............

1.2.2. Рецессивные летали................

1.2.3. Хромосомные аберрации.............. 12

1.2.4. Потери палочкообразной хромосомы.........

1.2.5. Изменение в зиготе интактных хромосом матери под воздействием облученных хромосом самца........ . 13

1.3. Теоретические представления о механизме возникновения хромосомных аберраций..............................14

1.4. Другие генетические феномены в первых делениях дробления 18

1.4.1. Потери кольцевой хромосомы . v.........

1.4.2. Индукция изохромосом ...............

1.4.3. Rex-индуцированное расщепление компаундов . ....

1.4.4. Разделение соматического и полового путей..... 21

1.5. Мутации, нарушающие деления дробления. . ....... . 22

3.5.1. Потери хромосом, индуцированные мутацией cdld . .

1.5.2. Мутация paternal loss (pal).............

1.5.3. Мутация mitotic loss inducer (mit).......... 23

1.5.4. Мутации ghu и mh................

Заключение к разделу

«Генетические феномены впервых делениях дробления» ... 24 Генетический контроль клеточного цикла у D.melanogaster 26

1.6. Методы поиска мутаций клеточного деления

1.6.1. Мейотические мутации.........

1.6.2. Мутагенчувствительные мутации . . . .

1.6.3. Метод поздних деталей.............. 29

1.6.4. Другие методы.................. 33

1.7. Методы тестирования эффекта мутаций клеточного деления 34

1.7.1. Мейотический кроссинговер у самок........

1.7.2. Нерасхождение и потери хромосом в мейозе.....

1.7.3. Материнский эффект на точковые мутации и транелокации, индуцированные в зрелых спермиях........... 36

1.7.4. Нестабильность хромосом в митозе......... 37

1.7.5. Цитологическое изучение деления клетки....... 40

1.7.6. Биохимические методы тестирования эффекта мутаций . 47

1.8. Классификация мутаций клеточного деления по фазе

их действия в онтогенезе................ 48

1.9. Первичная структура генов, вовлеченных в деление клетки, и функция их продуктов...............51

Заключение к разделу

«Генетический контроль клеточного цикла»....... 54

Приложение к обзору литературы:

Алфавитный каталог упоминаемых мутаций .... ... 58 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ......... 64

2.1. Условия проведения опытов............

2.2. Линии D.melanogaster, использованные в работе ....

2.3. Условия проведения радиобиологических экспериментов . 67

2.4. Синтез балансерных линий.............

2.5. Приготовление цитологических препаратов...... 68

2.6. Гибридизация in situ................

2.7. Структура транспозона и метод получения инсерций . . 69

2.8. Выявление активности бета-галактозидазы в тканях. . . 71

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ............... 73

ЗЛ.Сложные хромосомные перестройки и локальность взаимодействия разрывов в ядре............ 74

3.2. Неполные транслокации и вероятность "сшивки"

липких концов хромосом..............................84

3.2.1. Эффект мутации musl04 на полные и неполные трансло кации.................... 101

3.3. Классическая теория образования перестроек хромосом

с локальным взаимодействием хромосомных разрывов . . 104

3.3.1. Параметры модели..............................105

3.3.2. Доминантные летали..............

3.3.3. Двуразрывные транслокации......................108

3.3.4. Перестройки высокого порядка.........

3.3.5. Определение величины локального объема ..... 110

3.3.6. Кривая доза-эффект для транслокаций . ...........111

3.3.7. Частоты перестроек высокого порядка..... . 112

3.3.8. Микрораспределение дозы в ядре........ .

3.4. Транслокационный механизм потерь хромосом ... 116

3.5. Митотические обмены, индуцированные в гиперплоидном спермии...................... 124

3.5.1. Делеции в заданном плече хромосом и хроматидные обмены в гиперплоидном спермии........ ....

3.5.2. Стадия формирования обменов в гиперплоидном спермии. 133

3.5.3. Могут ли митотические обмены быть нереципрокными (неполными)?...................... 138

3.6. Локализаця обменов и их отрицательная интерференция при митотическом кроссинговере............. 145

3.7. Поиск инсерций энхансерной ловушки, вызывающих

аномалии деления клетки................. 149

3.7.1. Идентификация гена leopard nuclei......... 150

3 .7.2. Инсерции v27 и vI58............... 153

3.7.3. Свойства инсерции v40, нарушающей функцию центросом 155

3.8. Определение паттерна экпрессии генов клеточного деления в тканях дрозофилы.................. 167

3.9. Поиск инсерций в гены клеточного деления по паттерну экспресии...................... 170

3.10. Поиск мутаций, нарушающих расхождение хромосом,

в клонах зародышевой линии............. 183

3.10.1. Поиск мутаций, нарушающих расхождение хромосом, в клетках зародышевого пути самцов...........

3.10.2. Поиск мутаций, нарушающих расхождение хромосом, в

клетках зародышевого пути самок..............187

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ..............................197

БЛАГОДАРНОСТИ....................206

ВЫВОДЫ..............................................207

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. ... . . ...................210

ВВЕДЕНИЕ

Циклические изменения эукариотических хромосом, происходящие в делящихся клетках, известны уже более 100 лет. Клеточным циклом называется чередование интерфазы, включающей стадии GI, S и G2, и непосредственно процесса деления клетки (митоза или мейоза). «Мобильные» стадии клеточного цикла можно изучать как цитологически, так и цитогенетически, изменяя протекание этих стадии под действием мутации. В то же время процессы, происходящие в интерфазе, практически недоступны для цитологического исследования. Поэтому развитие генетического подхода к анализу этой стадии клеточного цикла представляется более перспективным.

Известно, что наибольшие успехи в изучении генетического контроля клеточного цикла были получены при использовании дрожжей, как экспериментальной модели. Однако, деление клетки у дрожжей имеет существенные отличия от деления клетки у высших эукариот. Так, например, у дрожжей веретено деления строится внутри ядра и его образование не связано с распадом ядерной оболочки. Кроме того, хромосомы дрожжей не имеют структурной организации, типичной для высших эукариот - прицентромерных гетерохроматиновых районов, состоящих из повторяющихся последовательностей ДНК. Эти структурные особенности не могут не найти своего отражения в различии генетического контроля клеточного цикла у низших и высших эукариот. Дрозофила, как модельный объект, имеет ряд объективных преимуществ по сравнению с дрожжами: хорошую морфологию метафазных хромосом, различные типы деления в различных тканях, а также возможность на этом объекте исследования связи пролиферации и дифференцировки. Это дает основание утверждать, что проблема изучения клеточного цикла на модели D.melanogaster является актуальной в плане исследования общих принципов организации деления клетки.

У дрозофилы имеется определенный круг генетических феноменов, отражающих структуру и поведение хромосом в интерфазе. Это относится к событиям, происходящим в первом делении дробления. Интерфаза первого деления дробления дрозофилы - удобная модель для исследования, достоинством которой является высокая стабильность параметров клеточного цикла и большой материал по радиобиологическому изучению этой стадии развития у дрозофилы. Отметим, что именно в первом делении дробления формируются сложные хромосомные перестройки, изучение топологии которых позволяет провести существенную детализацию механизма образования структурных изменений хромосом в интерфазе.

Формирование сложных хромосомных реорганизаций было описано Дубининым и Хвостовой (1935), авторами классической теории (Ли, 1963), позднее Робертсом (Roberts, 1970) и группой Хилликера (Ebert et al., 1989).

Однако, какой-либо разбор формирования сложных хромосомных перестроек в радиационной генетике отсутствовал. Кроме того, существовал ряд малоизвестных феноменов, происходящих на этой стадии развития. К таким полностью «забытым» явлениям относятся неполные транслокации, впервые описанные И.Б. Паншиным, и ранний митотический кроссинговер, описанный Э.А.Абелевой. Потенциальные возможности использования этих явлений для анализа клеточного цикла не были реализованы. Настоящая работа отчасти заполняет этот пробел.

Существенная часть настоящей работы посвящена методам генетической диссекции «мобильных» стадий клеточного цикла с помощью мутаций. Работы по поиску генов клеточного цикла у дрожжей существенно опережают развитие этой отрасли у дрозофилы за счет использования более эффективных методов скрининга, учитывающих особенности биологии этих организмов. Поэтому задача построения генетических скринингов на дрозофиле, приближающихся по эффективности к аналогичным процедурам у дрожжей является актуальной.

Появление новых генетических конструкций на основе Р-элемента расширило возможности генетического анализа у дрозофилы. Так, стало возможно наблюдение за экспрессией гена, содержащего инсерцию, в тканях; кроме того, наличие инсерции облегчало процедуру клонирования гена. Трансгенные конструкции на основе генов дрожжей, перенесенных в геном дрозофилы, позволили получить линии дрозофилы, в которых можно индуцировать высокий митотический кроссинговер в определенном плече хромосомы. Развитие методов скрининга мутаций по делению клетки, основа которых была заложена отечественными авторами (Булат и др., 1983), дало нам возможность создать эффективные селективные процедуры на дрозофиле.

Цель работы. Настоящая работа посвящена изучению клеточного деления с помощью анализа аномалий этого процесса, вызываемых облучением, или действием мутаций, нарушающих протекание клеточного цикла.

В работе решались следующие конкретные задачи:

1. Изучение механизма возникновения различного рода хромосомных изменений (формирование сложных перестроек, неполных транслокаций, потерь хромосом и др.) и его связь со структурными особенностями строения ядра в первом делении дробления.

2. Разработка теоретической модели механизма формирования хромосомных перестроек, описывающей известные феномены образования доминантных деталей, транслокаций и пр. с единых позиций.

3. Создание коллекции инсерций «энхансерной ловушки» (enhancer trap) в гены, отвечающие за деление клетки.

4. Анализ паттерна экспрессии генов, соответствующих инсерциям, с помощью репортерной бета-галактозидазы и выявление консенсусного паттерна для всех генов коллекции

5. Создание и апробация метода паттернов для поиска новых генов клеточного деления.

6. Разработка метода идентификации мутаций мейотических генов, использующего нерасхождение хромосом в гомозиготных по мутации клонах зародышевой линии.

Научная новизна. Анализ индуцированных радиацией перестроек хромосом позволил сделать ряд новых заключений о механизме их формирования: в образовании аберраций участвуют пространственно сближенные хромосомные разрывы, вероятность «сшивания» хромосомных разрывов слабо зависит от дозы облучения и корректно описывается классической теорией образования хромосомных перестроек, Показано, что потери хромосом, считавшиеся ранее отдельным классом событий, являются событиями транслокационного типа.

Впервые обнаружен митотический кроссинговер, индуцируемый в гиперплоидном спермии дрозофилы. Показана преимущественная локализация митотических обменов в прицентромерных районах хромосомы, что не связано с компактной структурой гетерохроматина. Обнаружена отрицательная интерференция митотических обменов, которая объясняется существованием в первом делении дробления между гомологичными хромосомами зон соматического синапсиса, внутри которых облегчено прохождение обменов.

Среди коллекции мутаций, полученных с помощью иммобилизации транспозона «энхансерной ловушки», обнаружены три, соответствующие ранее неизвестным генам деления клетки. Это инсерция PI03, нарушающая профазу митоза, инсерция v40, нарушающая расхождение центросом и инсерция 22w, нарушающая прохождение метафазы. Некоторые из полученных мутаций оказались аллелями известных генов, но поскольку локализация инсерций отличается, они позволяют выявить активность ранее неизвестных регуляторных элементов генов. Так, инсерция Р1003 указывает на роль гена hdc в функционировании гонад, инсерция vl58 детализирует данные о вовлеченности гена aar не только в процесс клеточного деления, но также и в процесс морфогенеза. Инсерция 2g - аллель гена СусВ - позволила выявить новый феномен - тканеспецифичность строения клеточного осциллятора имагинальных органов личинки.

Обнаружен консенсусный паттерн экспрессии генов клеточного цикла в тканях дрозофилы. Продемонстрирована эффективность обнаружения новых инсерций в гены клеточного деления с помощью предложенного нами метода паттернов.

На основе использования трансгенной конструкции FLP-FRT создан метод идентификации мутаций генов клеточного цикла в мозаичных клонах зародышевой линии. Показано, что эффективность этого метода превосходит известные до сих пор методы скрининга на дрозофиле.

Теоретическая и практическая ценность В работе предложена модификация классической теории формирования аберраций хромосом, учитывающая локальность взаимодействия хромосомных разрывов. Это дает возможность на основе нескольких параметров описать имеющийся на дрозофиле экспериментальный материал по возникновению перестроек, индуцированных облучением зрелых спермиев.

Разработанный нами метод поиска мутаций по клеточному делению в клонах зародышевой линии может быть использован для решения некоторых задач генетики развития. С его помощью можно надеяться выявить мутации, являющиеся медиаторами пролиферации и морфогенеза.

Полученные в работе результаты свидетельствуют о том, что тканеспецифичность строения клеточного осциллятора имеет место не только в раннем эмбриогенезе, но и на более поздних стадиях развития. Таким образом, получены свидетельства в пользу существования тканеспецифических мишеней в делящихся клетках, что дает потенциальные возможности для создания антипролиферативных препаратов с тканеспецифическим действием.

Апробация диссертации Часть данных диссертации, посвященных исследованиям радиационной изменчивости хромосом, докладывалась на V Всесоюзном совещании по проблемам биологии и генетики дрозофилы, 1987 г., г. Львов; 3-ей школе-семинаре по генетике животных - сентябрь 1989 г., г. Бийск; международном совещании «Cromosome transmission and Mitosis» 13-18 мая 1990 г. Ленинград; Ш Всесоюзной конференции по генетике и цитологии мейоза, сентябрь 1990 г. Новосибирск.

Остальные результаты представлены автором в апреле 1997 г. на семинаре лаб. Генетики эукариот ЛИЯФ (Гатчина), заседании кафедры генетики С.-Петербургского Университета, семинаре в ИОГен, Москва.

Структура диссертации Диссертация изложена на 227 стр., состоит из введения, и следующих глав: Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты, Обсуждение, Выводы. Список цитируемой литературы включает 280 наименований. Диссертация содержит 37 таблиц и 53 рисунка.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Генетические феномены в первых делениях дробления О. те1ап(^а81ег

Эукариотические организмы имеют два типа клеточного деления, регулярно сменяющих друг друга в жизненном цикле - митоз и мейоз. Периоды смены одного типа деления другим обладают определенными особенностями в плане структурно-функциональной организации ядра и требуют участия специализированных генов.

Первые опыты по радиационной генетике на дрозофиле состояли в облучении зрелых спермиев самцов и скрещивании с самками другого генотипа. Затем проводился систематический поиск мутаций, нарушающих протекание мейоза у самцов и самок. События, связанные с восстановлением индуцированных радиацией повреждений, происходят, в основном, в первом делении дробления, поэтому в ходе таких опытов были отобраны мутации, нарушающие первые деления дробления, причем методы скрининга не отличали их от мейотических мутаций. В итоге оказалось, что первое деление дробления было довольно хорошо изучено как в плане общих цитологических изменений во времени, так и в отношении генетического контроля.

В настоящей главе мы предприняли попытку суммировать данные о первых делениях дробления зиготы дрозофилы.

1.1. Организация первых делений дробления

У дрозофилы проникновение спермия в яйцо индуцирует цепь цитологических событий, быстро сменяющих друг друга. Материнское ядро, блокированное в метафазе I мейоза, после проникновения спермия заканчивает мейоз и сближается с мужским пронуклеусом, который формируется в результате деконденсации головки спермия. До наступления метафазы первого деления дробления материнские и отцовские хромосомы пространственно разделены на веретене. Этот фен