Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Геномное исследование гетерохроматина политенных хромосом Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Геномное исследование гетерохроматина политенных хромосом Drosophila melanogaster"

На правах рукописи

Белякин Степан Николаевич

ГЕНОМНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕТЕРОХРОМАТИНА ПОЛИТЕННЫХ ХРОМОСОМ ОЯОЗОРШЬА \iELANOGASTER.

Генетика- 03.00.15

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2005

Работа выполнена в лаборатории молекулярной цитогенетики Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Научные руководители: доктор биологических наук

Жимулев Игорь Федорович Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Высоцкая Людмила Васильевна Новосибирский государственный университет, г. Новосибирск

доктор биологических наук Дымшиц Григорий Моисеевич Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Институт биологии гена

РАН, г. Москва.

Защита диссертации состоится 2 & Юн Я-_200 г.

на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д - 003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу:

630090, г. Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 10; т/ф: (3832) 33-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН

Автореферат разослан_200 5"г.

Ученый секретарь , у

диссертационного совета, *__Urrj^z^----

доктор биологических наук гУ^ А.Д. Груздев

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В последнее время широко обсуждается вопрос о корреляции между временем репликации ДНК в S-фазе клеточного цикла и экспрессией генов: например, геномное исследование временного паттерна репликации в культуре клеток показало, что в Кс клетках дрозофилы ранняя репликация в S фазе ассоциируется с активным состоянием генов (Schuebeler et al., 2002). Амплификация хорионовых генов в фолликулярных клетках дрозофилы и тканеспецифичная регуляция кластера Р-глобиновых генов у млекопитающих также представляют интерес в рамках корегуляции репликации и экспрессии генов.

В норме, в политенных хромосомах слюнных желез D. melanogaster поздняя репликация во многих случаях приводит к недорепликации поздно реплицирующихся районов (Zhimulev, 1998). При этом помимо прицентромерных районов, состоящих преимущественно из разнообразных повторов, около 60 сайтов в эухроматиновых плечах политенных хромосом, демонстрируют недорепликацию (Zhimulev et al., 2003а). Такие районы имеют ряд характеристик, свойственных прицентромерному гетерохроматину (111 X), поэтому получили название интеркалярного гетерохроматина (ИГХ). Один из районов ИГХ, 89DE был ранее охарактеризован с помощью Саузерн-блот гибридизации, и было показано, что зона недорепликации имеет протяженность 300-400 т.п.н., а ДНК может быть представлена менее чем на 5% по сравнению с рано реплицирующейся контрольной ДНК гена rosy (Moshkin et al., 2001). Если эухроматиновая часть генома дрозофилы содержит 120 м.п.н., а среднюю длину зоны недорепликации принять за 300 т.п.н., то около 15% ДНК, не считая прицентромерного гетерохроматина, значительно недореплицируется в слюнных железах D. melanogaster.

Районы ИГХ могут быть прекрасной моделью для изучения связи между репликацией и экспрессией генов. Однако генетически эти районы фактически не охарактеризованы. Необходимо выяснить, какие гены находятся в этих районах, как они экспрессируются и т.д. Для решения этой задачи мы использовали уникальные свойства гена Su(UR) (Suppressor of Underreplication).

Мутация гена Su(UR) приводит к исчезновению разломов в политенных хромосомах и к частичной политенизации ПГХ. Саузерн-блот анализ показал восстановление представленности ДНК до 100% во всех исследованных районах недорепликации (Belyaeva et al., 1998). Дополнительные, трансгенные копии гена Su(UR), вызывают усиление недорепликации в районах, образующих разломы, а также появление ее в поздно реплицирующихся районах, лишенных недорепликации в норме. Таким образом, продукт гена Su(UR) может рассматриваться как транс-фактор, специфически контролирующий позднюю репликацию в геноме дрозофилы, по меньшей мере, в политенных тканях.

1

РОС, HAUK!;H\jifeHA«

£,И€нЗ'-*0ГГкА

ямСРК

Поскольку ген имеет такое уникальное проявление, он может

быть использован как инструмент для изучения явления поздней репликации в политенных хромосомах и организации районов интеркалярного и прицентромерного гетерохроматияа. Сравнение уровня политенизации в линиях с разными дозами гена 5и(11Я) поможет выявить в геноме дрозофилы зоны недорепликации и определить их генетическое содержание.

Цель работы. Целью данной работы является изучение молекулярных свойств и генетического состава прицентромерного и интеркалярного гетерохроматина в слюнных железах Д те1апо%авХег.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Приготовить библиотеки микроклонов и охарактеризовать молекулярный состав прицентромерных районов политенных хромосом линии 8и(иЯ)' Д. melanogaster.

2. Определить границы недореплицированных областей в районах интеркалярного гетерохроматина политенных хромосом Д melanogaster и построить геномную молекулярную карту недорепликации.

3. Проанализировать генетическое содержание недореплицированных районов.

Научная новизна. Впервые описаны последовательности из прицентромерных районов, политенизирующихся у мутантов 5м(1/ДГ. Впервые построена точная молекулярная карта политенизации, на которой нанесены 52 протяженных района недорепликации на всех длинных плечах хромосом дрозофилы. Проведено обобщение нескольких наборов данных, полученных разными авторами, касающихся репликации и экспрессии генома дрозофилы, что позволило сделать вывод об обогащении районов недорепликации генами, специфически коактивируемыми в клетках зародышевого пути самцов дрозофилы. Предложен новый принцип организации генома Д melanogaster - кластеризация генов в поздно реплицирующихся областях, облегчающая их совместную регуляцию. Практическая ценность. Определено генетическое содержание части прицентромерного гетерохроматина. Построена геномная карта политенизации ДНК в слюнной железе Д. те1апо^а$1ег, на основании которой определены границы и генетический состав 52 районов интеркалярного гетерохроматина, что позволяет исследовать свойства содержащихся в них генов и особенности репликации ДНК.

Апробация работы. Основные результаты этой работы были представлены: на Международных Студенческих Конференциях 2000 и 2001 годов на V и VI международных конференциях по гетерохроматину 2001 и 2003 годов в Италии, на XIII Всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра», Санкт-Петербург, 2000, на Съезде ВОГиС, Москва, 2004 г Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Вырезание и предварительные обработки прицентромерных районов были проведены Н.Б. Рубцовым. Работа по секвенированию микроклонов из

прицентромерного гетерохроматина была проведена Ю.М. Мошкиным в университете г. Женева.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, а также выводов и списка цитируемой литературы, в который входит 101 ссылка. Работа изложена на 79 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и 11 рисунков.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи и 1 тезисы; одна статья находится в печати.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Линии мух. Для микродиссекции районов политенных хромосом 40A-41D, 80C-81F и 81F была использована линия w"/w"; Su(UR)'/Su(UR)~. Район 20A-F был вырезан с препарата политенных хромосом линии ln(J)wm4l,/In(l)wm4h\ Su(UR)/Su(UR)~. Для изучения интеркалярного гетерохроматина использовалась линия, несущая дополнительную трансгенную копию гена Su(UR) (4xSu(UR)'). В качестве контролей в экспериментах использовали линию дикого типа Oregon-R

Микроклонирование. Микроманипуляции производили на инвертированном микроскопе Axivert 10 (40х, 10х) микроманипулятором MR mot (Zeiss) силиконизированной стеклянной иглой, управляемой микроманипулятором. Цитологические препараты хромосом были изготовлены на покровных стеклах 60x24 мм в 45% уксусной кислоте. 10-30 фрагментов хромосом переносили в 1-2 нл каплю стерильного Tritone XI00, находящуюся в вытянутом кончике пипетки Пастера диаметром 60-80 мкм. После этого конец пипетки обламывали в 0.5 мл пробирку и добавляли 3 мкл смеси, содержащей 0.25х буфер для секвеназы (Amersham), 0.2% Tritone XlOO (Sigma). Смесь нагревали до 90°С (1 мин.) и охлаждали до 30°С (1 мин.). Нагревание и охлаждение повторяли 5 раз, после чего добавляли 0.1 мкл протеиназы К (14 мг/мл; Boehringer Mannheim) и инкубировали 18 часов при 60°С. Следующим шагом добавляли 2 мкл раствора, содержащего 1х буфер для секвеназы, 0.5 мМ dATP, dCTP, dGTP, dTTP (Boehringer Mannheim) и 5 пмоль праймера MW6 (5'-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3 ') (Telenius et al., 1992). Протеиназу К инактивировали в течение 6 мин при 96°С, после чего проводили ПЦР как описано у Rubtsov et al. (1996). Наработанная ДНК была гидролизована ферментом рестрикции Sfr2751 (Сибэнзим, Новосибирск), изошизомером Xhol в течение 3 часов при 50°С и очищена с помощью колонок QULAquick Spin Column (QUIAGEN, Germany). 300 нг ПЦР продукта и 300 нг вектора (pBluescript П KS+ или pGEM-TEasy, Promega) лигировали в 15 мкл в течение 12 часов при 16°С. Лигазная смесь была трансформирована в компетентные клетки Е. coli XLBluel.

Гибридизация in sita. Мечение ДНК проводили в дополнительных 15 циклах ПЦР с 2 мкл наработанного продукта. Клонированные индивидуальные фрагменты ДНК были помечены в 30 циклах ПЦР и со стандартными ТЗ и Т7

праймерами. Препараты политенных хромосом инкубировали в 2xSSC в течение одного часа при 65°С, денатурировали в 2xSSC, 0.07N NaOH (1.5 мин) и обезвоживали последовательно в 70%, 80% и 96% этиловом спирте по 5 мин в каждом, после чего высушивали на воздухе. Меченый денатурированный зонд смешивали с 1.5х буфером (75% формамид, 15% декстран сульфат, 3xSSC) из расчета 30 мкл гибридизационной смеси на препарат. Гибридизацию проводили при 37°С 12 часов. Несвязавшийся зонд смывали тремя сменами 0.2xSSC (42°С, 3 раза по 15 мин), после чего препараты помещали в раствор, содержащий 2% Blocking reagent (Boehringer Mannheim), 4xSSC, 0.1% Triton-XlOO (37°C, 30 мин). Окраску avidin-FITC проводили в том же растворе (концентрация avidin-FITC 0,025 мг/мл) при 37°С 30 мин. После этого препараты промывали 3 раза по 5 мин в 4xSSC, 0.1% Triton-XlOO при 42°С. В случае индивидуальных микроклонов сигнал усиливали с помощью биотинилированных антител к авидину и повторной окраски avidin-FITC. Хромосомы подкрашивали йодистым пропидием (Sigma) (2 мкг/мл в 0.2xSSC), высушивали и анализировали сигнал на микроскопе Olympus (Japan). Саузерн-блот гибридизация. Геномная ДНК линии Орегон и линии, гомозиготной по мутации Su(UR)ES, были гидролизованы ферментами рестрикции ЕсоШ или Hindlll, разделяли в 0.7% агарозном геле и переносили на нейлоновую мембрану (Hybond N, Amersham). Клоны, для которых не было найдено гомологии в базе данных, были помечены DIG-ll-dUTP (Boehringer Mannheim) с помощью ПЦР. Саузерн-блот гибридизация и детекция с помощью системы CDP-Star производились согласно протоколу DIG DNA Labelling and Detection Kit (Boehringer-Mannheim). Для обсчетов при построении профиля недорепликации в районе 19Е использовали геномную ДНК из 50 слюнных желез и 25 имагинальных дисков линий Su(UR)'/Su(UR)~, 4xSu(UR)+ и Oregon-R. Фрагменты ДНК, использованные в качестве зондов, метили [32P]-dATP в реакции с фрагментом Кленова. Плотность сигнала измеряли с помощью HP Scan Jet 4С/Т сканера и программы Band Leader 3.0. Относительная представленность последовательностей вычислялась как отношение сигналов в слюнных железах и имагинальных дисках после нормировки по контрольному клону гена rosy, который полностью политенизируется в полигенных тканях.

Гибридизация и анализ микрочипов. Мечение геномной ДНК проводили по стандартному протоколу (http://cmgm.stanford.edu/pbrown/protocols/ 4 genomic.html) с небольшими модификациями. 3-5 мкг ДНК обрабатывали ферментом рестрикции НаеШ в течение 4 часов. Меченые образцы очищали на колонках QIAGEN PCR purification columns. Гибридизации проводили при 42°С 12 - 14 часов в гибридизационном буфере, содержащем 50% формамид, 6х SSC, 0.5% SDS и 5х Денхард. Несвязавшийся зонд проводили при комнатной температуре (2 раза по 15 мин O.lxSSC, 0,1% SDS и 2 раза по 15 мин 0,lxSSC). Для сканирования микрочипов и анализа изображений использовали сканер и пакет программ GenePix Pro 3.0. Кластеризацию и

визуализацию данных проводили с помощью программ Cluster и Tree View (http://rana.lbl.gov/EisenSoftware.htm).

Выявление транскрипционных территорий. Данные об экспрессии генов (Arbeitman et al., 2002) на 75 стадиях развития были разбиты на семь групп: эмбрионы 0-3 часа развития, эмбрионы 3-10 часов развития, эмбрионы 10 -24 часов развития, личинки, куколки, взрослые самцы и взрослые самки. Относительные данные об экспрессии каждого гена (по сравнению со стандартом, представляющим собой смесь образцов со всех 75 исследуемых стадий развития) были усреднены, при этом, положительные значения больше +1 по логарифмической шкале (усиление сигнала больше чем в два раза по сравнению со стандартом) рассматривались как активация гена, а отрицательные меньше -1 (ослабление сигнала больше, чем в два раза по сравнению со стандартом) - как репрессия гена. Значения в промежутке (1 ...+1), соответствующие регуляции гена меньше, чем в два раза по сравнению со стандартом, рассматривались как отсутствие регуляции. Полученные данные были отсортированы согласно их расположению в геноме и обработаны с помощью скользящего окна размером 9 генов с шагом в один ген. Это позволило выявить районы, обогащенные корегулируемыми генами.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ районов прицентромерного гетерохроматина

Мутация Супрессор недореплжации (Su(UR)~) обладает уникальным фенотипом: прицентромерные районы всех плеч хромосом, кроме хромосомы 4, приобретают воспроизводимую дисковую структуру и, как кажется, имеют более высокий уровень политенизации, чем в хромосомах линии дикого типа. Несомненно, они представляют собой только часть ПГХ дрозофилы, поскольку, в общем, доля гетерохроматина в политенных хромосомах мутантов Su(UR)' по сравнению с другими линиями увеличивается незначительно и остается намного меньше, чем в митотических хромосомах, где прицентромерные гетерохроматиновые районы занимают в среднем около 30% длины хромосом. Чтобы охарактеризовать эти специфические участки, мы решили получить ДНК из этих районов и изучить составляющие их последовательности.

Для того чтобы получить материал из прицентромерных районов, появляющихся у мутантов Su(UR)~ и охарактеризовать их генетическое содержание, был выбран метод микроклонирования, опробованный ранее для изучения 19 района X хромосомы (Miklos et al., 1988). Этот метод позволяет получить короткие (100 - 1000 п.н.) фрагменты ДНК из интересующих участков хромосом при помощи микродиссекции этих участков с цитологических препаратов и амплификации содержащейся в них ДНК. Фрагменты хромосом (10 - 30 копий) вырезали с сухих препаратов политенных хромосом линии, гомозиготной по мутации Su(UR)~ и собирали с помощью микроманипулятора. Таким образом, были собраны образцы из 20А-

F района X хромосомы, 40A-41F хромосомы 2, 80C-81F, включающий Plato Atlantis, а также район 81F хромосомы 3 отдельно. У мутантов Su(UR)~ район 81F приобретает совершенно иную морфологию, чем в хромосомах дикого типа и становится значительно больше, поэтому он был выделен в отдельный образец. Дистальная часть гетерохроматина X хромосомы была вырезана из политенных хромосом линии, несущей инверсию In(l)wm41', которая переносит часть гетерохроматина до ядрышкового организатора к району ЗС. Перемещенная часть соответствует району 20A-F политенных хромосом.

Для того чтобы получить большее количество продукта для дальнейшей работы, после обработок, подробно описанных в разделе Материалы и методы, ДНК амплифицировали в реакции ПЦР с частично вырожденными праймерами, содержащими адаптер с сайтом узнавания фермента рестрикции Xhol. В результате из каждого образца был получен набор фрагментов размером -100-1000 п.н.

А

*- .V V

А.*

* I/ ' / V

« Jit?

'. ■' . a > -

Рис. 1 Пример гибридизации in situ тотального продукта ПЦР из района 81F с политенными хромосомами мутантов Su(UR)~. А - фазово-контрастная фотография, Б - сигнал гибридизации. Стрелками отмечены границы распространения сигнала из

гетерохроматина в дисковую часть хромосом. ЯО - ядрышковый организатор._

Чтобы проверить качество полученных продуктов и их принадлежность прицентромерным районам политенных хромосом дрозофилы, мы провели гибридизацию полученной ДНК с политенными хромосомами мутантной линии Su(UR)' (Рис. 1). На рисунке показана гибридизация продукта из района 81F, однако, в остальных четырех случаях сигнал гибридизации также присутствует во всем хромоцентре. Это свидетельствует о том, что, как и ожидалось, полученные библиотеки обогащены повторенными последовательностями. Кроме этого, мы наблюдали сигналы гибридизации во многих сайтах в эухроматине, что может говорить о наличии в полученном материале фрагментов мобильных элементов или других повсеместно распространенных повторов.

Интересно, что во всех случаях мы наблюдали сигнал гибридизации не только во вновь образующихся районах, но и в прилежащих к ним участках хромосом, которые имеют дисковую структуру и полностью политенизируются в линиях дикого типа. Этот результат хорошо

воспроизводится во всех четырех случаях. На Рис. 1 обозначены границы сигналов: 20А в X хромосоме, 40А и 42А во второй хромосоме и 80А и 81F в хромосоме 3. Таким образом, эти районы, по-видимому, определяют зоны перехода между эу- и гетерохроматином в политенных хромосомах.

Для дальнейшего изучения материала прицентромерных районов, продукт ПЦР клонировали в плазмидный вектор и получили набор индивидуальных клонов из каждой библиотеки. Нами было получено более 100 клонов из каждого района. Секвенирование, поиск гомологии по базам данных геномного проекта и Саузерн-блот анализ 304 фрагментов показал, что только 36 из них (12%) не имеют высокой гомологии в геноме дрозофилы и не дают сигнала при гибридизации с геномной ДНК линии Su(UR)~; эти последовательности были исключены из дальнейшего анализа. Поиск в базах данных с помощью протраммы BLAST показал, что 252 из 268 клонов, принадлежащих геному D. melanogaster (94%), содержат известные последовательности ДНК - фрагменты мобильных элементов, известных генов, а также повторов неизвестной природы.

Особым классом последовательностей в ПГХ является su(f)-повтор. Изначально он был обнаружен в двух копиях с обеих сторон гена suppressor of forked (su(f)), расположенного в X хромосоме. Характерной особенностью этого повтора является его локализация на эу- гетерохроматиновой границе в митотических хромосомах (Tudor et al., 1996). Было предположено, что этот повтор может играть роль пограничного элемента, предотвращающего взаимные влияния эу- и гетерохроматина. В наших библиотеках он оказался наиболее представлен в материале из X хромосомы (около 10% отсеквенированных клонов); в остальных хромосомах его доля составила около 5%.

Клоны, для которых не было обнаружено гомологии в базах данных, были подвергнуты Саузерн-блот анализу и на основании их паттерна гибридизации были разделены на группы, названные "новыми уникальными" и "новыми повторенными" последовательностями.

Уникальные последовательности, обнаруженные в этом исследовании были использованы для получения молекулярных маркеров в гетерохроматиновых районах. Некоторые последовательности были прокартированы in situ на политенных хромосомах линии Su(UR)~ с помощью карт прицентромерных районов, составленных на основе электронно-микроскопических исследований (Semeshin et al., 2001). Полученные данные дали набор клонов, использованных для изучения недорепликации в ПГХ дрозофилы в другом исследовании (Д.А. Ткач и др., неопубликованные данные).

Анализ районов интеркалярного гетерохиоматина

Кроме прицентромерного гетерохроматина, эффект гена Su(UR) распространяется на поздно реплицирующиеся (ПР) районы, рассеянные в эухроматиновой части генома, также называемые «интеркалярным гетерохроматином» (Belyaeva et al., 1998). Эти районы, часто недореплицированные в норме, полностью политенизируются у мутантов Su(UR)', в то время как в линии, несущей дополнительные трансгенные копии функционального аллеля (4xSu(UR)+) недорепликация ДНК появляется даже в тех ПР районах, которые представлены на 100% в хромосомах мух дикого типа (Zhimulev et al., 2000). На микроскопическом уровне недореплицированные районы выглядят как разломы, чаще всего в крупных компактизированных дисках политенных хромосом.

Мы использовали это наблюдение для геномного исследования недорепликации в политенных хромосомах слюнных желез с помощью технологии микроматриц (микрочипов).

В тотальную геномную ДНК, выделенную из слюнных желез личинок третьего возраста, мутантных по гену Su(UR) и несущих две дополнительные копии нормального аллеля Su(UR)+ (4xSu(UR)*), включали нуклеотиды, меченные двумя разными флюорохромами (Су-5 и Су-3 соответственно) с помощью полимеразной реакции с фрагментом Кленова (см Материалы и методы). Полученные зонды одновременно гибридизовали со стеклянными микроматрицами, после чего проводили анализ интенсивностей свечения флюорохромов для каждой последовательности на микрочипе. Основная часть последовательностей, представленных на микрочипе имела соотношение сигналов, близкое к 1, что означает, что они одинаково представлены в обеих линиях и находятся за пределами HP районов. Последовательности, располагающиеся в недореплицированных районах, имели разную представленность в двух образцах и соотношение [Су-3]/[Су-5] было больше 1 (пятна красного цвета).

В экспериментах использовались микрочипы, построенные на двух платформах: первая содержит около 5000 клонов EST из коллекции DGC1 (Drosophila Gene Collection 1), а вторая - все протяженные открытые рамки считывания в геноме Drosophila melanogaster (Hild et al., 2003). Первая платформа использовалась для оптимизации условий эксперимента. Для проверки чувствительности метода мы гибридизовали с микрочипами меченые геномные ДНК из взрослых самцов и самок дрозофилы. При этом мы ожидали увидеть разницу в представленности генов, расположенных на X хромосоме. Действительно, после нормировки результатов мы могли достоверно отличать большинство генов, лежащих на X хромосоме, для которых полученное соотношение сигналов было близко к ХА, от аутосомных генов, для которых соотношение равнялось 1. В реальном эксперименте ожидались более значительная разница, поэтому мы сочли чувствительность метода приемлемой.

После оптимизации мы продолжили эксперименты с микрочипами второго типа. Для окончательных опытов мы использовали геномную ДНК из слюнных желез самок мутантной линии 5и(иЯ)~ и 4х8и(иЯ)+. В этом случае мы рассчитывали получить информацию о недореплицированных участках по всему геному. Всего были проведены три независимых гибридизации. Расположив полученные данные в соответствии с геномной позицией исследуемых последовательностей, мы построили молекулярную карту политенизации генома дрозофилы в политенных хромосомах слюнных желез.

3

3"

>*

а О

Рве. 2 Профиль политенизации в районе 19ВЕ, полученный с помощью микрочипов (А, ) и количественного Саузерн-блот анализа (Б): - профиль в линии дикого типа, • - в линии, несущей

дополнительные копии гена 8и(1/И)*. Границы зоны недорепликации одинаковы в обеих линиях. По оси абсцисс -дистанция в т.п.н. По оси ординат - относительная представленность ДНК. Профили, полученные обоими методами очень близки между собой, что показывает высокую точность карты,

полученной с

использованием микроматриц

На основании этой карты мы обнаружили 52 района, проявляющих значительную по степени и протяженности недорепликацию (Р<0,05). Полученные нами данные хорошо соответствуют профилям недорепликации, построенным ранее для трех районов на основании количественного Саузерн-блот анализа. На рисунке представлены профили недорепликации в районе 19БЕ, полученные двумя методами. На Рис. 2А представлен профиль политенизации, полученный с помощью микрочипов, а на Рис. 2Б - с помощью Саузерн-блот анализа для линии дикого типа О^оп-Я и линии 4х5и(1Ж)'. Видно, что как очертания, так и границы зон недорепликации совпадают в обеих линиях и хорошо согласуются с данными, полученными в

помощью микрочипов, хотя степень представленности оказалась несколько завышенной в экспериментах с использованием микрочипов._

58А

ПР 44

НР

ПР

НР-/ПР

SвBf

•л.

1

НР

у / ^

В ПР

Рис. 3 Профили некоторых районов недорепликации, демонстрирующие характерные случаи недорепликации в слюнной железе ( ) и поздней репликации в культуре клеток Кс ( , ) (8сЬиЬе1ег е1 а1., 2002). А - район 58А: полное совпадение НР и ПР. Б - район 56ЕР поздно реплицируется в культуре клеток, но не проявляет недорепликации в слюнных железах (НР-/ПР). В - частичное перекрывание зон НР и ПР в районе 23А. фНР/ПР - зона, которая поздно реплицируется в клетках Кс, но полностью политенизируется в слюнной железе. Вертикальные пунктирные линии

указывают границы НР и ПР участков ___

Протяженность 52 районов недорепликации варьирует от 114 до 618 т.п.н. (в среднем 323 т.п.н.) и в сумме они содержат 1036 генов (7,5% генов О. melanogaster).

Р<0001 Р<0 001 Р0 001

Рис. 4 Усредненные профили экспрессии генов в различных плечах хромосом дрозофилы в зависимости от времени репликации. Данные основаны на результатах анализа представленности транскриптов генов в разных библиотеках кДНК (А; Вотйапаеу « а1., 2002). и геномного исследования экспрессии генов дрозофилы в развитии (Б; АгЬейтап е1 а1., 2002). НР - недореплицированные районы; фНР/ПР -поздно реплицирующиеся районы, фланкирующие НР районы; НР-/ПР - районы, поздно реплицирующиеся в культуре клеток, но полностью представленные в слюнной железе; РР - рано реплицирующиеся районы. Разными цветами обозначены библиотеки кДНК, использованные в анализе, расшифровка на рисунке (А). Б: красный - повышенный уровень экспрессии, зеленый - пониженный уровень

I экспрессии. Усредненный уровень экспрессии всех генов, присутствующих в

исследовании приведен на каждой диаграмме (черный цвет) Э - эмбриональные стадии до вылупления; Л - личинки, 1 - 3 возраст; К - стадии предкуколки и

\ куколки, С? - взрослые самцы; ? - взрослые самки. На осях ординат: А - процент

специфически экспрессирующихся генов в каждой категории. Б - относительная экспрессия генов (от отрицательных значений к положительным - усиление экспрессии); На основании обоих наборов данных видно явное обогащение НР

* районов генами, специфически экспрессирующимися в развитии самца и обеднение

генами, экспрессирующимися в эмбрионах и яичниках самок (остальные комментарии в тексте). Линиями под диаграммами обозначены стадии и категории, статистически достоверно (Р<0,001) от среднего по всему геному

Было обнаружено, что некоторые недореплицированные области содержат гены, возникшие в результате тандемных дупликаций. Например,

район 83DE содержит кластер из 20 близкородственных генов, кодирующих трансмембранные белки (локус Osiris или Tpl) (Dorer et al., 2003). Аналогично, кластер гомейозисных генов (Bithorax Complex) и гистоновых генов находятся в зонах недорепликации в районах 89Е и 39DE.

Ранее с помощью иммуноокрашивания было показано, что все найденные недореплицированные районы содержат, по меньшей мере, один из двух типов белков сайленсинга (личное сообщение JI.B. Болдыревой). За исключением районов 35D и 35Е, остальные районы (96% районов) связывают антитела на белок НР1. В то же время, 32 района связывают антитела к Polycomb (Pc) (Zhimulev et al., 2003b). Эти белки играют важную роль в инактивации генов: НР1 связан с ПГХ и поддерживает его инактивацию (Cheutin et al., 2003; van Steensel et al., 2001), a Pc участвует в подавлении экспрессии гомейозисных генов (Ross and Zarkower, 2003). Было предположено, что репрессирующие белковые комплексы способны образовывать конденсированное состояние хроматина, которое пассивно затрудняет и замедляет прохождение репликации (Zhimulev and Belyaeva, 2003).

Как оказалось, недорепликация в политенных хромосомах хорошо коррелирует с временным паттерном репликации в культуре неполитенных клеток Кс (Schubeler et al., 2002): из 32 охарактеризованных нами районов 50 (96%) поздно реплицируются в Кс клетках (Рис. ЗА). Однако некоторые районы поздней репликации в Кс клетках не проявляют недорепликации в слюнных железах, а во многих случаях границы недорепликации и поздней репликации не совпадают (Рис. ЗБ, В). Эти данные означают, что, в общем, существует значительное сходство в программах репликации двух типов клеток, но также могут иметь место определенные тканеспецифичные различия.

Для удобства описания недорепликации и поздней репликации мы ввели следующие обозначения: НР-/ПР районы, которые поздно реплицируются в культуре клеток, но не проявляют недорепликации в слюнных железах; фНР/ПР - поздно реплицирующиеся участки, фланкирующие недореплицированные области в слюнных железах (см. также Рис. ЗБ,В).

Исследование на Кс клетках (Schubeler et al., 2002) также показало связь между ранней репликацией и повышенным содержанием в рано реплицирующихся районах активных генов. Чтобы проверить наличие корреляции между недорепликацией и координированной экспрессией генов, мы сопоставили наши результаты с двумя наборами данных: геномным анализом экспрессии генов дрозофилы в развитии (Arbeitman et al., 2002) и исследованием представленности транскриптов в проекте EST (Boutanaev et al., 2002). Анализ данных из обоих исследований показал значительное обогащение ряда районов генами, специфически экспрессирующимися в семенниках.

58А

590

К) . ;

1

■И13ЯИЯС1Е305

ь | ( I (I I I

I I I 4 »

Рис. 5 Диаграмма, демонстрирующая корреляцию транскрипционных территорий и доменов репликации на примере 5,8 м.п.н. участка плеча 211. А: расположение специфически экспрессирующих-ся генов по данным ВоШапаеу ег а1., 2002. Б: анализ транскрипционных территорий (по данным АгЬейтап е1 а1„ 2002). На каждой панели снизу указаны районы, реплицирующиеся в разное время: РР ранняя репликация, белый цвет, ПР - поздняя репликация, серый

„ I I I

цвет, НР - недорепликация, черный цвет. Э1 - эмбрионы 0-3 часа развития, Э2 эмбрионы 3 - 10 часов развития, ЭЗ - эмбрионы 10-24 часов развития, Л - личинки,

К - куколки, С? - взрослые самцы, ? - взрослые самки. Данные получены на основании результатов (АтЪеШпап е! а1., 2002) с помощью плавающего окна размером в 9 генов (см Материалы и методы). Наиболее очевидные

транскрипционные территории обведены рамками._

Чтобы проверить эту закономерность, мы провели независимый анализ этих двух наборов данных. Для этого мы разбили гены на группы в соответствии с их принадлежностью НР, фНР/ПР, НР-/ПР и РР (рано реплицирующимся) районам. После этого для каждого хромосомного плеча в отдельности были построены усредненные паттерны экспрессии для выявления преобладающих специфических программ экспрессии в каждой группе.

Анализ представленности транскриптов в библиотеках к ДНК показал кластеризацию в геноме генов, специфично экспрессирующихся в семенниках самцов дрозофилы (ВоЩапаеу е1 а1., 2002). Мы решили проанализировать, не коррелирует ли этот факт со временем репликации ДНК. На Рис. 4А

представлены диаграммы, отражающие процент генов, специфически экспрессирующихся в семенниках, яичниках, эмбрионах, личинках/куколках и головах мух от общего числа генов в четырех выделенных нами типах районов (НР, фНР/ПР, НР-ЛТР и РР). На диаграммах видно, что недореплицированные районы 2Ь, ЗЯ и X хромосом, а также все НР районы в сумме обогащены генами, специфическими для семенников и обеднены генами, специфическими для яичников. Это наблюдение было подтверждено с помощью таблицы сопряженности признаков, основанной на тесте х2 (Р<0,001).

Проведенный нами анализ показал, что в недореплицирующихся районах слюнных желез действительно концентрируются гены с характерными паттернами экспрессии в развитии (Рис. 4Б). При этом паттерны различается на разных хромосомных плечах. В частности, недореплицированные районы на 2Ь, 2К, X и ЗЯ обогащены генами, экспрессирующимися в семенниках, но обеднены генами, транскрибирующимися в яичниках и эмбрионах (/-тест, Р<0,001). У самцов мутантов /иг/ог, у которых не развиваются ткани зародышевого пути, эти гены перестают экспрессироваться (АтЬекшап й а1., 2002). Недореплицированные районы ЗЬ плеча обеднены генами, экспрессирующимися в яичниках и эмбрионах; в то же время, в них не наблюдается очевидного обогащения генами, экспрессирующимися в семенниках. Небольшое преобладание генов, транскрибирующихся в личинках, проявляется за счет лишь нескольких генов.

Аналогичный анализ ПР (Рис. 4Б) районов в клетках Кс показал, что НР-/ПР районы хромосомы 2 содержат гены, имеющий сходный, но не настолько выраженный паттерн экспрессии, как недореплицированные районы: они обогащены генами, специфичными для семенников, но обеднены генами, экспрессирующимися в яичниках и эмбрионах (Р<0,05). Гены, экспрессирующиеся в семенниках, концентрируются в наиболее поздно реплицирующихся участках НР-/ПР районов, в то время как ближе к границам появляются гены, транскрибирующиеся в яичниках и эмбрионах. В то же время, фНР/ПР районы, независимо от из положения в геноме, содержат меньше генов, активных в семенниках и больше генов, экспрессирующихся в яичниках и эмбрионах по сравнению НР и НР-/ПР районами. Поскольку большинство (96%) недореплицированных районов перекрываются с ПР районами в клетках Кс, можно предположить, что фНР/ГГР районы также поздно реплицируются и в слюнной железе, однако недостаточно для того, чтобы бьггь недореплицированными.

Кроме этого, мы провели независимое исследование транскрипционных территорий в геноме дрозофилы на фоне временной программы репликации (Рис. 5). Для этого развитие дрозофилы было разбито на 7 стадий: эмбрионы 03 часов развития (Э1), эмбрионы 3-10 часов развития (Э2), эмбрионы 10-24 часов развития (ЭЗ), личинки (Л), куколки (К), взрослые самцы (С?) и

взрослые самки (9). Данные для каждого гена на каждой стадии были усреднены, после чего расположенные в соответствии с геномной позицией были обработаны с помощью плавающего окна размером в 9 генов (см.

Материалы и методы). Таким способом были обнаружены районы, содержащие гены, имеющие сходные программы экспрессии. На Рис. 5Б наиболее крупные транскрипционные территории обведены рамками. При наложении на временной паттерн репликации, схематически изображенный разными цветами, видно, что во многих случаях обнаруженные транскрипционные территории совпадают с поздно и недореплицированными районами.

В целом, эти данные позволяют нам предложить модель функциональной организации генома дрозофилы, в которой время репликации и включение/выключение транскрипции генов тесно связаны между собой, образуя в результате эволюции высокоорганизованную структуру генома. Согласно этой модели, гены, имеющие определенные программы экспрессии, могут кластеризоваться в геноме в виде транскрипционных территорий, что дает возможность их согласованной регуляции в развитии. При этом гены, работающие в развитии семенников, остаются инактивированными большую часть времени и в большинстве тканей, подобно Р-глобиновым генам млекопитающих. Это может быть также связано с тем, что у дрозофилы презумптивные клетки зародышевого пути целлюляризируются раньше соматических и, по-видимому, могут сильно отличаться по своим свойствам. Эмбриональные гены и гены, экспрессирующиеся в яичниках, проявляют противоположную тенденцию, располагаясь в основном в рано реплицирующихся областях генома.

Связь между транскрипционной корегуляцией генов и времени репликации в S фазе клеточного цикла позволила нам провести подробный геномный анализ групп корегулируемых генов или транскрипционных территорий, используя данные об экспрессии генов в развитии (Рис. 5Б) (Arbeitman et al., 2002). В результате была обнаружена значительная корреляция между границами выявленных транскрипционных территорий и HP или ПР районами, предполагая, что одни и те же белковые комплексы (например, содержащие SU(UR), НР1) могут служить регуляторами как транскрипции, так и времени репликации. Как и ожидалось, большинство транскрипционных территорий связаны с генами, специфичными для семенников, яичников или эмбрионов. Кроме того, 30 (58%) обнаруженных HP районов перекрываются с обнаруженными ранее в геноме дрозофилы транскрипционными территориями (Spellman and Rubin, 2002).

Геномный подход позволяет создавать новые гипотезы, когда массивы данных из различных исследований накладываются, как на матрицу, на последовательность генома. В этом исследовании мы использовали уникальную способность белка SU(UR) регулировать недорепликацию в политенных хромосомах дрозофилы и охарактеризовали значительную долю генов (1036, 7,5%), находящихся в 52 HP районах. Эти районы располагаются в ПР сайтах хромосом и связываются с репрессирующими факторами, такими как НР1 (96% районов) и/или Pc-G (61% районов). Более того, 96% обнаруженных районов также поздно реплицируются в неполитенных клетках

культуры Кс, демонстрируя удивительное соответствие программы репликации в двух физиологически очень различающихся типах клеток. Используя результаты других геномных исследований, мы показали, что гены, находящиеся в HP районах политенных хромосом и в ПР районах клеток Кс, образуют группы корегулирую щихся генов, имеющих характерную экспрессию в семенниках, но не в яичниках и эмбрионах. К тому же, эти транскрипционные территории кластеризуются на более высоком уровне в разных плечах хромосом.

Геномная кластеризация и дифференциальная репликация могут служить механизмами одновременного выключения генов, экспрессирующихся только в очень специализированных тканях. Эти процессы могут регламентироваться локус-контролирующими районами, и другими регуляторными элементами, подобными описанному для р-глобинового кластера у млекопитающих (Fraser et al., 1998). Инактивация HP районов может распространяться из особых центров, как это происходит в ПГХ (Zhimulev, 1998).

Выводы

В результате проведенного исследования поздно реплицирующихся гетерохроматиновых районов в геноме дрозофилы и анализа последовательностей ДНК из районов прицентромерного гетерохроматина были получены новые сведения о молекулярно-генетической организации этих районов:

1. в результате анализа библиотек микроклонов, полученных из прицентромерных районов политенных хромосом D. melanogaster, обнаружены ранее неизвестные повторенные и уникальные последовательности.

2. районы прицентромерного гетерохроматина имеют сходную молекулярную организацию с полностью политенизирующимися основаниями плеч хромосом, которые, по-видимому, могут рассматриваться как зона перехода между эу- и гетерохроматином.

3. с помощью микрочипов определены границы и степень представленности ДНК в 52 районах недорепликации и построена геномная карта политенизации ДНК в политенных хромосомах слюнных желез D. melanogaster.

4. клетки в культуре Кс и клетки слюнных желез имеют похожую картину репликации.

5. гены, экспрессирующиеся в процессе дифференцировки тканей зародышевого пути самцов, организованы в кластеры, располагающиеся в недореплицированных и поздно реплицирующихся районах генома D. melanogaster.

6. предложена и обсуждена модель организации генома D. melanogaster, связывающая временную программу репликации и регуляцию генов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Белякин С.Н., Мошкин Ю.М., Рубцов Н.Б., Кокоза Е.Б., Спирер П., Жимулев И.Ф. Анализ последовательностей ДНК из районов прицентромерного гетерохроматина в линии Su(UR)ES у Drosophila melanogaster. (Тезисы на XIII Всероссийском симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Санкт-Петербург, октябрь, 2000) Цитология 42,264-265 (Тезисы)).

2. Moshkin Yu. М., Belyakin S.N., Rubtsov N.B., Kokoza E.B , Alekseyenko A.A., Volkova E.I., Belyaeva E.S., Makunin I.V., Spierer P., Zhimulev I.F. (2002). Microdissection and sequence analysis of pericentric heterochromatin from the Drosophila melanogaster Suppressor of underreplication mutant. Chromosoma 111:114-125.

3. Koryakov D.E. Domanitskaya E.V., Belyakin S.N., Zhimulev I.F. (2003) Abnormal tissue-dependent polytenization of a block of third chromosome pericentric heterochromatin in Drosophila melanogaster. J Cell Sci 2003, 116, 1035-1044

4. Zhimulev I.F., Belyaeva E.S., Makunin I.V., Pirrotta I. V., Semeshin V.F., Alekseyenko A.A., Belyakin S.N., Volkova E.I., Koryakov D.E., Andreyeva E.N., Demakova O.V., Kotlikova I.V., Kolesnikova T.D., Boldyreva L.V., Nanayev R.A. (2003) Intercalary heterochromatin in Drosophila melanogaster polytene chromosomes and the problem of genetic silencing. Genetica, 117,259-270.

5. S.N. Belyakin, G.K. Christophides, A.A. Alekseyenko, E.V. Kriventseva, E.S. Belyaeva, R.A. Nanayev, I.V. Makunin, Heidelberg Fly Array Consortium, F.C. Kafatos and I.F. Zhimulev (2005). Genomic analysis of DNA underreplication in Drosophila polytene chromosomes reveals a link between replication control and transcriptional territories. Proc Nat Acad Sci, принято к публикации

Подписано к печати 13.04.2005 г.

Формат бумаги 60 х 90 1/16. Печ. л. 1. Уч. изд. л. 0,7

Тираж 100 экз. Заказ 57

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, тпр ак. Лаврентьева, 10.

РНБ Русский фонд

2005-4 45249

f V* i » V 1

Í î - ' Г !

Um /

i

Hi

07 *

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Белякин, Степан Николаевич

1. ВВЕДЕНИЕ.

1.1. Актуальность проблемы.

1.2. Цель работы.

1.3. Научная новизна.

1.3. Практическая ценность.

1.4. Апробация работы.

1.5. Список публикаций по теме диссертации.

2. ГЕТЕРОХРОМАТИН В ПОЛИТЕННЫХ ХРОМОСОМАХ.

4 2.1. Прицентромерный гетерохроматин политенных хромосом слюнных желез.

2.1.1. Молекулярный состав ПГХ.

2.2. Интеркалярный гетерохроматин.

2.3. Репликация и транскрипционная активность гетерохроматина.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Геномное исследование гетерохроматина политенных хромосом Drosophila melanogaster"

1.1. Актуальность проблемы

В последнее время широко обсуждается вопрос о корреляции между временем репликации ДНК в S-фазе клеточного цикла и экспрессией генов: например, геномное исследование временного паттерна репликации в культуре клеток показало, что в культуре клеток Кс дрозофилы ранняя репликация в S фазе ассоциируется с активным состоянием генов (Schuebeler et al., 2002). Амплификация хорионовых генов в фолликулярных клетках дрозофилы и тканеспецифичная регуляция кластера (3-глобиновых генов у млекопитающих также представляют интерес в рамках совместной регуляции репликации и экспрессии генов.

В норме, в политенных хромосомах слюнных желез D. melanogaster поздняя репликация во многих случаях приводит к недорепликации поздно реплицирующихся районов (Zhimulev, 1998). При этом помимо прицентромерных районов, состоящих преимущественно из разнообразных повторов, около 60 сайтов в эухрсматиновых плечах политенных хромосом, демонстрируют недорепликацию (Zhimulev et al., 2003а). Такие районы имеют ряд характеристик, свойственных прицентромерному гетерохроматину (ПГХ), поэтому получили название интеркалярного гетерохроматина (ИГХ). Один из районов ИГХ, 89DE был ранее охарактеризован с помощью Саузерн-блот гибридизации, и было показано, что зона недорепликации имеет протяженность 300-400 т.п.н., а ДНК может иметь представленность менее 5% по сравнению с рано реплицирующимся геном rosy (Moshkin et al., 2001). Если эухроматиновая часть генома дрозофилы содержит 120 м.п.н., а среднюю длину зоны недорепликации принять за 300 т.п.н., то около 15% ДНК, не считая прицентромерного гетерохроматина, значительно недореплицируется в слюнных железах D. melanogaster.

Районы ИГХ могут быть прекрасной моделью для изучения связи между репликацией и экспрессией генов. Однако генетически эти районы фактически не охарактеризованы. Необходимо выяснить, какие гены находятся в этих районах, как они экспрессируются и т.д. Для решения этой задачи мы использовали уникальные свойства гена Su(UR) (Suppressor of Underreplication).

Мутация гена Su(UR) приводит к исчезновению разломов в политенных хромосомах и к частичной политенизации ПГХ. Саузерн-блот анализ показал восстановление представленности ДНК до 100% во всех исследованных районах недорепликации (Belyaeva et al., 1998). Таким образом, продукт гена Su(UR) может рассматриваться как транс-фактор, специфически контролирующий позднюю репликацию в геноме дрозофилы, по меньшей мере, в тканях с политенными хромосомами.

Дополнительные, трансгенные копии гена Su(UR), вызывают усиление недорепликации в районах, образующих разломы, а также появление ее в поздно реплицирующихся районах, лишенных недорепликации в норме.

Поскольку ген Su(UR) имеет такое уникальное проявление, он может быть использован как инструмент для изучения явления поздней репликации в политенных хромосомах и организации районов интеркалярного и прицентромерного гетерохроматина. Сравнение уровня политенизации в линиях с разными дозами гена Su(UR) поможет выявить в геноме дрозофилы зоны недорепликации и определить их генетическое содержание.

1.2. Цель работы

Целью данной работы является изучение молекулярных свойств и генетического состава прицентромерного и интеркалярного гетерохроматина в слюнных железах D. melanogaster.

В связи с этим были поставлены следующие задачи: • Приготовить библиотеку микроклонов и охарактеризовать молекулярный состав прицентромерных районов политенных хромосом линии Su(UR)'.

• Определить границы недореплицированных областей в районах интеркалярного гетерохроматина и построить геномную молекулярную карту недорепликации.

• Проанализировать генетическое содержание недореплицированных районов.

1.3. Научная новизна

Впервые описаны последовательности из прицентромерных районов, политенизирующихся у мутантов 8и(и13)~. В ходе этой работы были прокартированы цитологически несколько протяженных участков ДНК, которые не были прокартированы в рамках проекта по секвенированию генома ОгоэорЬНа melanogaster. Впервые построена точная молекулярная карта политенизации, на которой нанесены 52 протяженных района недорепликации, на всех длинных плечах хромосом дрозофилы. Проведено обобщение нескольких наборов данных, полученных разными авторами, касающихся репликации и экспрессии генома дрозофилы, что позволило сделать вывод об обогащении районов недорепликации генами, специфически коактивируемыми в клетках зародышевого пути самцов дрозофилы. Предложен новый принцип организации генома О. те/аподавГег - кластеризация генов в поздно реплицирующихся областях, облегчающая их совместную регуляцию.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Белякин, Степан Николаевич

4.3. Выводы

1. в результате анализа библиотек микроклонов, полученных из прицентромерных районов политенных хромосом, обнаружены ранее неизвестные повторенные и уникальные последовательности.

2. районы прицентромерного гетерохроматина имеют сходную молекулярную организацию с полностью политенизирующимися основаниями плеч хромосом, которые, по-видимому, могут рассматриваться как зона перехода между эу- и гетерохроматином.

3. с помощью микрочипов определены границы и степень представленности ДНК в 52 районах недорепликации и построена геномная карта недорепликации ДНК в политенных хромосомах слюнных желез О. те/алодавГег.

4. клетки в культуре Кс и клетки слюнных желез имеют похожую картину репликации

5. гены, экспрессирующиеся в процессе дифференцировки тканей зародышевого пути самцов, организованы в кластеры, располагающиеся в недореплицированных и поздно реплицирующихся районах генома О. те1аподаз1ег.

6. предложена и обсуждена модель организации генома melanogaster, связывающая временную программу репликации и регуляцию генов.

5. БЛАГОДАРНОСТИ

Автор благодарит Игоря Федоровича Жимулева проводившего научное руководство представленной работой, Гиоргоса Кристофидеса и Фотиса Кафатоса из Европейской Молекулярно Биологической Лаборатории, с которыми автор сотрудничал во время выполнения части работы, касающейся проведения экспериментов с микрочипами и анализа полученных результатов, Елену Сергеевну Беляеву, Сергея Анатольевича Демакова и Артема Анатольевича Алексеенко за активное и заинтересованное обсуждение работы и помощь в выполнении некоторых экспериментов, Валерия Федоровича Семешина за предоставление электронно-микроскопических фотографий политенных хромосом, Виктора Шлому, Алексея Пиндюрина и многих-многих других людей, с которыми автор контактировал во время выполнения работы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Белякин, Степан Николаевич, Новосибирск

1. Дубинин, Н.П., Хвостова, В.В. and Мансурова, В.В. (1941) хромосомные аберрации,летальные мутации и доза Х-лучей. Докл АН СССР, 31,386-388.

2. Прокофьева-Бельговская, А.А. (1986) Гетерохроматические районы хромосом. Москва. Наука, 1-432.

3. Alekseyenko, A.A., Demakova, O.V., Belyaeva, E.S., Makarevich, G.F., Kotlikova, I.V., Nothiger, R. and Zhimulev, I.F. (2002) Dosage compensation and intercalary heterochromatin in X chromosomes of Drosophila melanogaster. Chromosoma, 111, 106-113.

4. Arbeitman, M.N., Furlong, E.E., Imam, F., Johnson, E., Null, B.H., Baker, B.S., Krasnow, M.A., Scott, M.P., Davis, R.W. and White, K.P. (2002) Gene expression during the life cycle of Drosophila melanogaster. Science, 297, 2270-2275.

5. Berghella, L. and Dimitri, P. (1996) The heterochromatic rolled gene of Drosophila melanogaster is extensively polytenized andtranscriptionally active in the salivary gland chromocenter. Genetics, 144, 117-125.

6. Bonaccorsi, S., Gatti, M., Pisano, C. and Lohe, A. (1990) Transcription of a satellite DNA on two Y chromosome loops of Drosophila melanogaster. Chromosoma, 99, 260-266.

7. Bonaccorsi, S., Pisano, C., Puoti, F. and Gatti, M. (1988) Y chromosome loops in Drosophila melanogaster. Genetics, 120, 10151034.

8. Boutanaev, A.M., Kalmykova, A.I., Shevelyov, Y.Y. and Nurminsky, D.I. (2002) Large clusters of co-expressed genes in the Drosophila genome. Nature, 420, 666-669.

9. Brosseau, G. (1960) Genetic analysis of the male fertility factors on the Y chromosome of Drosophila melanogaster. Genetics, 45, 257-274.

10. Caizzi, R., Caggese, C. and Pimpinelli, S. (1993) Bari-1, a new transposon-like family in Drosophila melanogaster with a unique heterochromatic organization. Genetics, 133, 335-345.

11. Carmena, M., Abad, J.P., Villasante, A. and Gonzalez, C. (1993) The Drosophila melanogaster dodecasatellite sequence is closely linked to the centromere and can form connections between sister chromatids during mitosis. J Cell Sci, 105 ( Pt 1), 41-50.

12. Cayirlioglu, P., Ward, W.O., Silver Key, S.C. and Duronio, R.J. (2003) Transcriptional repressor functions of Drosophila E2F1 and E2F2 cooperate to inhibit genomic DNA synthesis in ovarian follicle cells. Mol Cell Biol, 23, 2123-2134.

13. Cenci, G., Belloni, G. and Dimitri, P. (2003) 1(2)41Aa, a heterochromatic gene of Drosophila melanogaster, is required for mitotic and meiotic chromosome condensation. Genet Res, 81,15-24.

14. Cheutin, T., McNairn, A.J., Jenuwein, T., Gilbert, D.M., Singh, P.B. and Misteli, T. (2003) Maintenance of stable heterochromatin domains by dynamic HP1 binding. Science, 299, 721-725.

15. Cordeiro, M., Wheeler, L., Lee, C.S., Kastritsis, C.D. and Richardson, R.H. (1975) Heterochromatic chromosomes and satellite DNAs of Drosophila nasutoides. Chromosoma, 51, 65-73.

16. Devlin, R.H., Bingham, B. and Wakimoto, B.T. (1990) The organization and expression of the light gene, a heterochromatic gene of Drosophila melanogaster. Genetics, 125, 129-140.

17. DiBartolomeis, S.M., Tartof, K.D. and Jackson, F.R. (1992) A superfamily of Drosophila satellite related (SR) DNA repeats restricted to the X chromosome euchromatin. Nucleic Acids Res, 20, 1113-1116.

18. Dickson, E., Boyd, J.B. and Laird, C.D. (1971) Sequence diversity of polytene chromosome DNA from Drosophila hydei. J Mol Biol, 61, 615627.

19. Dimitri, P. (1991) Cytogenetic analysis of the second chromosome heterochromatin of Drosophila melanogaster. Genetics, 127, 553-564.

20. Dimitri, P. (1997) Constitutive heterochromatin and transposable elements in Drosophila melanogaster. Genetica, 100, 85-93.

21. Eberl, D.F., Duyf, B.J. and Hilliker, A.J. (1993) The role of heterochromatin in the expression of a heterochromatic gene, the rolled locus of Drosophila melanogaster. Genetics, 134, 277-292.

22. Endow, S.A. and Gall, J.G. (1975) Differential replication of satellite DNA in polyploid tissues of Drosophila virilis. Chromosoma, 50, 175-179.

23. Endow, S.A., Polan, M.L. and Gall, J.G. (1975) Satellite DNA sequences of Drosophila melanogaster. J Mol Biol, 96, 665-692.

24. Ferguson, B.M. and Fangman, W.L. (1992) A position effect on the time of replication origin activation in yeast. Cell, 68, 333-339.

25. Fraser, P., Gribnau, J. and Trimborn, T. (1998) Mechanisms of developmental regulation in globin loci. CurrOpin Hematol, 5, 139-144.

26. Ganetzky, B. (1977) On the components of segregation distortion in Drosophlla melanogaster. Genetics, 86, 321-355.

27. Gatti, M. and Baker, B.S. (1989) Genes controlling essential cell-cycle functions in Drosophila melanogaster. Genes Dev, 3, 438-453.

28. Gatti, M. and Pimpinelli, S. (1992) Functional elements in Drosophila melanogaster heterochromatin. Annu Rev Genet, 26, 239-275.

29. Gilbert, D.M. (2002) Replication timing and transcriptional control: beyond cause and effect. Curr Opin Cell Biol, 14, 377-383.

30. Goldstein, L.S., Hardy, R.W. and Lindsley, D.L. (1982) Structural genes on the Y chromosome of Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci USA, 79, 7405-7409.

31. Hecht, A., Strahl-Bolsinger, S. and Grunstein, M. (1996) Spreading of transcriptional repressor SIR3 from telomeric heterochromatin. Nature, 383, 92-96.

32. Heun, P., Laroche, Т., Raghuraman, M.K. and Gasser, S.M. (2001) The positioning and dynamics of origins of replication in the budding yeast nucleus. J Cell Biol, 152, 385-400.

33. Hilliker, A.J. (1976) Genetic analysis of the centromeric heterochromatin of chromosome 2 of Drosophila melanogaster. deficiency mapping of EMS-induced lethal complementation groups. Genetics, 83, 765-782.

34. Hilliker, A.J., Appels, R. and Schalet, A. (1980) The genetic analysis of D. melanogaster heterochromatin. Cell, 21, 607-619.

35. Holmquist, G.P. (1987) Role of replication time in the control of tissue-specific gene expression. Am J Hum Genet, 40, 151-173.

36. Hsieh, T. and Brutlag, D. (1979) Sequence and sequence variation within the 1.688 g/cm3 satellite DNA of Drosophila melanogaster. J Mol Biol, 135, 465-481.

37. Jenuwein, T. and Allis, C.D. (2001) Translating the histone code. Science, 293, 1074-1080.

38. Kaufmann, B.P. (1946) Organization of the chromosome I. Break distribution and chromosome recombination in Drosophila melanogaster. J Exptl Zool, 102, 293-320.

39. Kaufmann, B.P. and Gay, H. (1958) The nuclear membrane as an intermediary in gene-controlled reactions. The Nucleus, 1, 57-74.

40. Kay, M.A., Zhang, J.Y. and Jacobs-Lorena, M. (1988) Identification and germline transformation of the ribosomal protein rp21 gene of Drosophila: complementation analysis with the Minute QUI locus reveals nonidentity. Mol Gen Genet, 213, 354-358.

41. Koryakov, D.E., Alekseyenko, A.A. and Zhimulev, I.F. (1999) Dynamic organization of the beta-heterochromatin in the Drosophila melanogaster polytene X chromosome. Mol Gen Genet, 260, 503-509.

42. Koryakov, D.E., Belyaeva, E.S., Alekseyenko, A.A. and Zhimulev, I.F. (1996) Alpha and beta heterochromatin in polytene chromosome 2 of Drosophila melanogaster. Chromosoma, 105, 310-319.

43. Le, M.H., Duricka, D. and Karpen, G.H. (1995) Islands of complex DNA are widespread in Drosophila centric heterochromatin. Genetics, 141, 283-303.

44. Levinger, L. and Varshavsky, A. (1982a) Protein D1 preferentially binds A + T-rich DNA in vitro and is a component of Drosophila melanogaster nucleosomes containing A + T-rich satellite DNA. Proc Natl Acad Sci USA, 79, 7152-7156.

45. Levinger, L. and Varshavsky, A. (1982b) Selective arrangement of ubiquitinated and D1 protein-containing nucleosomes within the Drosophila genome. Cell, 28, 375-385.

46. Lohe, A.R. and Brutlag, D.L. (1986) Multiplicity of satellite DNA sequences in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci USA, 83, 696-700.

47. Lohe, A.R. and Hilliker, A.J. (1995) Return of the H-word (heterochromatin). CurrOpin Genet Dev, 5, 746-755.

48. Lohe, A.R., Hilliker, A.J. and Roberts, P.A. (1993) Mapping simple repeated DNA sequences in heterochromatin of Drosophila melanogaster. Genetics, 134, 1149-1174.

49. Makunin, I.V., Volkova, E.I., Belyaeva, E.S., Nabirochkina, E.N., Pirrotta, V. and Zhimulev, I.F. (2002) The Drosophila suppressor of underreplication protein binds to late-replicating regions of polytene chromosomes. Genetics, 160, 1023-1034.

50. Marchant, G.E. and Holm, D.G. (1988) Genetic Analysis of the Heterochromatin of Chromosome 3 in Drosophila melanogaster. II. Vital Loci Identified Through EMS Mutagenesis. Genetics, 120, 519-532.

51. Miklos, G.L. and Cotsell, J.N. (1990) Chromosome structure at interfaces between major chromatin types: alpha- and beta-heterochromatin. Bioessays, 12, 1-6.

52. Murphy, T.D. and Karpen, G.H. (1995) Localization of centromere function in a Drosophila minichromosome. Cell, 82, 599-609.

53. Oda, H., Uemura, T., Shiomi, K., Nagafuchi, A., Tsukita, S. and Takeichi, M. (1993) Identification of a Drosophila homologue of alpha-catenin and its association with the armadillo protein. J Cell Biol, 121, 1133-1140.

54. Oellers, N. and Hafen, E. (1996) Biochemical characterization of rolledSem, an activated form of Drosophila mitogen-activated protein kinase. J Biol Chem, 271, 24939-24944.

55. Parks, S. and Wieschaus, E. (1991) The Drosophila gastrulation gene concertina encodes a G alpha-like protein. Cell, 64, 447-458.

56. Rodriguez Alfageme, C., Rudkin, G.T. and Cohen, L.H. (1980) Isolation, properties and cellular distribution of D1, a chromosomal protein of Drosophila. Chromosoma, 78, 1-31.

57. Rollins, R.A., Morcillo, P. and Dorsett, D. (1999) Nipped-B, a Drosophila homologue of chromosomal adherins, participates in activation by remote enhancers in the cut and Ultrabithorax genes. Genetics, 152, 577-593.

58. Ross, J.M. and Zarkower, D. (2003) Polycomb group regulation of Hox gene expression in C. elegans. Dev Cell, 4, 891-901.

59. Schuebeler, D., Scalzo, D., Kooperberg, C., van Steensel, B., Delrow, J. and Groudine, M. (2002) Genome-wide DNA replication profile for Drosophila melanogaster. a link between transcription and replication timing. Nat Genet, 32, 438-442.

60. Selig, S„ Okumura, K„ Ward, D.C. and Cedar, H. (1992) Delineation of DNA replication time zones by fluorescence in situ hybridization. Embo J, 11, 1217-1225.

61. Simon, I., Tenzen, T., Mostoslavsky, R., Fibach, E., Lande, L., Milot, E., Gribnau, J., Grosveld, F., Fraser, P. and Cedar, H. (2001) Developmental regulation of DNA replication timing at the human beta globin locus. Embo J, 20, 6150-6157.

62. Spellman, P.T. and Rubin, G.M. (2002) Evidence for large domains of similarly expressed genes in the Drosophila genome. J Biol, 1, 5.

63. Spotswood, H.T. and Turner, B.M. (2002) An increasingly complex code. J Clin Invest, 110, 577-582.

64. Stevenson, J.B. and Gottschling, D.E. (1999) Telomeric chromatin modulates replication timing near chromosome ends. Genes Dev, 13,146151.

65. Strahl, B.D. and Allis, C.D. (2000) The language of covalent histone modifications. Nature, 403, 41-45.

66. Tchurikov, N.A., Kretova, O.V., Chernov, B.K., Golova, Y.B., Zhimulev, I.F. and Zykov, I.A. (2004) SuUR protein binds to the boundary regions separating forum domains in Drosophila melanogaster. J Biol Chem, 279,11705-11710.

67. Telenius, H., Carter, N.P., Bebb, C.E., Nordenskjold, M., Ponder, B.A. and Tunnacliffe, A. (1992) Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer. Genomics, 13, 718-725.

68. Torok, T., Harvie, P.D., Buratovich, M. and Bryant, P.J. (1997) The product of proliferation disrupter is concentrated at centromeres and required for mitotic chromosome condensation and cell proliferation in Drosophila. Genes Dev, 11, 213-225.

69. Tudor, M., Mitchelson, A. and O'Hare, K. (1996) A 1.5 kb repeat sequence flanks the suppressor of forked gene at the euchromatin-heterochromatin boundary of the Drosophila melanogaster X chromosome. Genet Res, 68, 191-202.

70. Vaury, C., Bucheton, A. and Pelisson, A. (1989) The beta heterochromatic sequences flanking the I elements are themselves defective transposable elements. Chromosoma, 98, 215-224.

71. Wakimoto, B.T. and Hearn, M.G. (1990) The effects of chromosome rearrangements on the expression of heterochromatic genes in chromosome 2L of Drosophila melanogaster. Genetics, 125, 141-154.

72. Warner, T.S., Sinclair, D.A., Fitzpatrick, K.A., Singh, M., Devlin, R.H. and Honda, B.M. (1998) The light gene of Drosophila melanogaster encodes a homologue of VPS41, a yeast gene involved in cellular-protein trafficking. Genome, 41, 236-243.

73. Williams, S.M. and Robbins, L.G. (1992) Molecular genetic analysis of Drosophila rDNA arrays. Trends Genet, 8, 335-340.

74. Zhang, P. and Spradling, A.C. (1995) The Drosophila salivary gland chromocenter contains highly polytenized subdomains of mitotic heterochromatin. Genetics, 139, 659-670.

75. Zhimulev, I.F. (1998) Polytene chromosomes, heterochromatin, and position effect variegation. Adv Genet, 37, 1-566.

76. Zhimulev, I.F. and Belyaeva, E.S. (2003) Intercalary heterochromatin and genetic silencing. Bioessays, 25, 1040-1051.

77. Zhimulev, I.F., Belyaeva, E.S., Makunin, I.V., Pirrotta, V., Semeshin, V.F., Alekseyenko, A.A., Belyakin, S.N., Volkova, E.I., Koryakov, D.E., Andreyeva, E.N., Demakova, O.V., Kotlikova, I.V.,

78. Kolesnikova, T.D., Boldyreva, L.V. and Nanayev, R.A. (2003a) Intercalary heterochromatin in Drosophila melanogaster polytene chromosomes and the problem of genetic silencing. Genetica, 117, 259-270.

79. Zhimulev, I.F., Belyaeva, E.S. and Semeshin, V.F. (1981) Informational content of polytene chromosome bands and puffs. CRC Crit Rev Biochem, 11, 303-340.

80. Zhimulev, I.F., Makunin, I.V., Volkova, E.I., Pirrotta, V. and Beliaeva, E.S. (2000) Effect of four doses of the Su(UR)ES gene on intercalary heterochromatin in Drosophila melanogaster\. Genetika, 36, 1061-1070.

81. Zhimulev, I.F., Pokholkova, G.V., Bgatov, A.V., Semeshin, V.F., Umbetova, G.H. and Belyaeva, E.S. (1983) Genetic interpretation of polytene chromosomes banding pattern. Mol Biol Rep, 9, 19-23.