Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярные механизмы действия метаболитов кинуренинового пути обмена триптофана на глютаматергическую и холинергическую системы нейротрансмиссии у мутантов дрозофилы

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные механизмы действия метаболитов кинуренинового пути обмена триптофана на глютаматергическую и холинергическую системы нейротрансмиссии у мутантов дрозофилы"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ ИМ. И. П. ПАВЛОВА

На правах рукописи

005009497 журавлев

Александр Владимирович

молекулярные механизмы действия метаболитов кннуренинового пути обмена триптофана на глютаматергическую и холинергическую системы нейротрансмиссии у мутантов дрозофилы

03.03.01 — физиология 03.02.07-генетика

2 6 Я Н В Ш2

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург

2012

005009497

Работа выполнена в лаборатории нейрогенетики Института физиологии им. И. П. Павлова РАН

доктор биологических наук Савватеева-Поиова Елена Владимировна

доктор биологических наук Семенов Дмитрий Германович

Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН

доктор биологических наук, профессор Падкина Марина Владимировна

Санкт-Петербургский государственный университет

Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И М. Сеченова РАН

Защита диссертации состоится 20 февраля 2012 г. в 13 часов на заседании Диссертационного совета по защите докторских и кандидатских диссертаций (Д 002.020.01) при Институте физиологии им. И.П. Павлова РАН (199034, Санкт-Петербург, набережная Макарова, 6).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии им. И.П. Павлова РАН (199034, Санкт-Петербург, набережная Макарова, 6).

Автореферат разослан января 2012 г.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Работа посвящена решению важной физиологической задачи - изучению механизмов действия метаболитов кинуренинового пути обмена триптофана (КПОТ) на процессы в ЦНС млекопитающих и человека. Кинурениновые метаболиты связаны с развитием ряда нейропатологий, таких как болезнь Паркинсона, Альцгеймера, Хантингтона и др. (Widner et al., 1999; Beal et al., 1999; Savvateeva-Popova et al., 2003). По КПОТ в организме млекопитающих и беспозвоночных метаболизируется около 90% триптофана (Лопатина и др., 2004). В литературе продукты КПОТ получили наименование «кинуренинов». С конца 80-х - начала 90-х годов большинство исследований кинуренинов было посвящено их нейродегенеративному эффекту. Нейрофизиологоческая активность кинуренинов установлена у многих животных: лягушек, мышей, крыс, кроликов, кошек, собак и др. (Лапин, 2004).

Особый интерес представляет изучение молекулярных механизмов активности кинуренинов у мутантов с генетически блокированными стадиями КПОТ. К их числу у насекомых относится дрозофила (О. melanogaster), пчела (A. mellifera) и др. У мутантов дрозофилы накопление тех или иных промежуточных метаболитов КПОТ оказывает модулирующее действие на уровень активности ЦНС, а также на процессы обучения и памяти (Sawateeva. 1991; Sawateeva et al.. 2000; Savvateeva-Popova et al., 2003). Для мутантов vermilion (v) с блокированной первой ключевой стадией пути показано полное отсутствие продуктов КПОТ. У мутантов cinnabar (cri) с повышенным уровнем кинуреновой кислоты (KYNA) наблюдается улучшение ряда физиологических и поведенческих параметров (Sawateeva-Popova et al., 2003). Мутантам cardinal (cd) с повышенным уровнем 3-гидроксикинуренина (ЗНОК), напротив, свойственны функциональные нарушения в нервной системе, в том числе - прогрессивная потеря среднесрочной памяти при обучении методом условно-рефлекторного подавления ухаживания (УРПУ) (Sawateeva et al., 2000).

Механизмы нейрофизиологической активности кинуренинов весьма разнообразны и на настоящий момент исследованы в основном у млекопитающих. ЗНОК в клеточных культурах нейронов индуцирует процессы свободнорадикального окисления, вызывающие гибель клеток путем апоптоза (Okuda et al., 1998). KYNA является конкурентным антагонистом ионотропных рецепторов глутамата (iGluR), преимущественно стрихнин-нечувствительного глицинового сайта NRl-субьединицы NMDA-рецептора (Kessler et al.,

1989), и, возможно, а7 никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (nAChR) (Hilmas et al., 2001). KYN проявляет свойства агониста NRl-субъединицы NMDA-рецептора (Stone, 1991). NMDA-рецепторы опосредованно через систему малых GTP-аз и ключевой фермент ремоделирования актина LlM-киназу 1 (LIMK1) активируют транскрипционный фактор CREB (Yang et al, 2004). CREB регулирует множество клеточных процессов и обеспечивает формирование договременной памяти у млекопитающих и дрозофилы (Yin et al., 1995). LIMK1 также опосредованно через кофилин-зависимую регуляцию полимеризации актина модулирует процессы синаптической пластичности, лежащие в основе процессов обучения (Sawateeva-Popova et al., 2002). Дисбаланс кинуренинов у мутантов дрозофилы коррелирует с уровнем L1MK1 в мозге имаго (Лопатина и др., 2007).

Влияние кинуренинов на нейрофизиологические и когнитивные процессы у пчелы и дрозофилы носит весьма сложный характер (Savvateeva et al., 1991, Лопатина и др., 2004). Неизученными остаются механизмы сходных нарушений долговременной памяти у 13-суточных имаго v, сп и cd (Никитина и др., неолубл. данные). Моделирование кинуренин-зависимых нейродегенеративных заболеваний на дрозофиле должно опираться на точные знания механизмов физиологической активности КПОТ. Это обусловливает необходимость исследования молекулярных процессов, опосредующих действие кинуренинов на ЦНС дрозофилы, с выяснением их сходств и отличий от аналогичных процессов у млекопитающих.

Цель работы. Целью диссертационной работы являлось изучение механизмов воздействия кинурениновых продуктов на процессы в ЦНС дрозофилы на уровне регуляции активности генов рецепторов, лиганд-рецепторных взаимодействий и активности компонентов внутриклеточных сигнальных каскадов.

Конкретные задачи исследования:

1. Оценить различия транскрипционной активности генов рецепторных субъединиц dnrl iGluR, da.7 и dai nAChR, а также гена dlimkl у взрослых самцов кинурениновых мутантов (v, сп, cd) в возрасте 5 суток и 13 суток методом ПЦР в реальном времени.

2. Изучить влияние химической структуры лиганда и рецепторных аминокислотных остатков на специфичность формирования стэкинг-связи кинуреновой кислоты (KYNA) с субьединицами iGluR крысы и дрозофилы методами квантовохимических расчетов.

3. Исследовать возможность взаимодействия ксантуреновой (XAN) и антраниловой (АА)

кислот, кинурешша (КУЫ) и 3-гидроксикинуренина (ЗНОК) с субъединицами ¡ОЬИ, а также взаимодействия КУМА с а7 пАСЬЯ млекопитающих и дрозофилы методом компьютерного докинга.

4. Изучить распределение рСЯЕВ в мозге 5 суточных имаго дикого типа и кинурениновых мутантов (сп, сс!) методом лазерной конфокальной микроскопии до и после 5 часового обучения при условно-рефлекторном подавлении ухаживания.

5. Изучить распределение 1ЛМК1 и р-кофилина в мозге 5 суточных самцов дрозофилы методом лазерной конфокальной микроскопии.

Положения, выносимые на защиту:

1. КЛЫА и ХАМ способны взаимодействовать с )С1иК дрозофилы в качестве антагонистов. Специфичность воздействия КУМА на рецепторные подтипы определяется, в том числе, свойствами ее стэкинг-связи с ароматическим остатком рецептора. Хроническое воздействие КУМА на ЦНС взрослых самцов дрозофилы вызывает компенсаторное увеличение транскрипционной активности йпг1. КУМА у дрозофилы является более специфичным антагонистом МЯ1 ¡бЫЯ, чем а7 пАСИЯ.

2. Сродство ЗНОК к N1^1 в качестве агониста существенно ниже, чем у КУМ. Хроническое воздействие ЗНОК на ЦНС взрослых самцов дрозофилы вызывает увеличение транскрипционной активности йпг1 и с!а7.

3. Локализация компонентов ¡СЬЯ-зависимых внутриклеточных сигнальных каскадов рСЯЕВ, 1ЛМК1 и р-кофилина в мозге взрослых дрозофил - как дикого типа СаЫоп-Б, так и мутантов КПОТ сп и сс1 - носит избирательный характер и связана с различными структурно-функциональными подсистемами мозга.

Научная новизна работы. Впервые показано, что хроническое воздействие КУКА и ЗНОК вызывает у взрослых самцов сп и ей увеличение транскрипционной активности генов рецепторных субъединиц <1пг1 ¡СкЯ и <1а7 пАСЬЯ на временном интервале 5-13 суток.

Впервые осуществлена сравнительная оценка энергии и геометрических параметров стэкинг-связи в ароматических димерах, моделирующих взаимодействие КУЫА с различными подтипами ¡бкЯ, с изучением механизмов специфичности связывания.

Впервые построены компьютерные модели лиганд-связывающих сайтов N111, N112 и ОиЯ! ¡бЬЯ, а также а7 пАСЬЯ дрозофилы. Впервые построены компьютерные модели

комплексов KYNA с субъедшшцами NR1, NR2, GluR iGluR и ci7 nAChR крысы и дрозофилы.

Впервые исследовано распределение p(Ser3l)CREB в мозге имаго дрозофилы и выявлены pCREB-обогащешше нейрональные структуры. Впервые выявлена локализация LIMK1 в глиальных клетках мозга у взрослых самцов дрозофилы.

Теоретическая и практическая значимость. Изучение молекулярных механизмов действия кинуренинов на процессы в ЦНС мутантов дрозофилы - модельных объектов нейропатологических синдромов человека - важно для выяснения роли продуктов КПОТ в развитии ряда заболеваний, таких как болезнь Паркинсона, Альцгеймера, Хантингтона. Также оно может способствовать раскрытию механизмов регуляции продуктами КПОТ процессов памяти и обучения, общих для всех высокоразвитых организмов. Изучение биофизических особенностей стэкинг-связи ароматических лигандов с рецепторами имеет как теоретическое, так и практическое значение для разработки лекарственных средств, воздействующих на определенные подтипы рецепторов.

Апробация работы. Полученные в ходе работы данные были представлены на: 9th International Danube Symposium & 1st International Congress on ADHD (Wuerzburg, 2007); Международной школе-конференции, поев. 100 летию со дня рождения М.Е. Лобашева «Системный контроль генетических и цитогенетических процессов» (Санкт-Петербург, 2007); XVII WFN Word Congress on Parkinson diseases and related disorders (Amsterdam, 2007); Конференции с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (Санкт-Петербург, 2008); IX East European Conference "Simpler Nervous Systems". Saint-Petersburg, 2009; Международной конференции "Topical problems of biophotonics - 2009" (Нижний Новгород, 2009); Международной конференции "Topical problems of biophotonics - 2011" (Нижний Новгород, 2011); Всероссийской молодежной конференции-школе «Нейробиология интегративных функций мозга» (Санкт-Петербург, 2011).

Вклад автора. Лично автором выполнена основная часть квантовохимических расчетов, построены компьютерные модели рецепторных субъединиц в комплексе с лигандами, осуществлена оценка экспрессии рецепторных субьединиц у кинурениновых мутантов методом ПЦР в реальном времени, осуществлен анализ распределения pCREB, LIMK1 и р-кофилина в мозге кинурениновых мутантов методом конфокальной микроскопии. Материалы, вошедшие в данную работу, обсуждались и публиковались

совместно с соавторами и научным руководителем.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов), выводов и списка литературы. Работа изложена на 212 страницах печатного текста, содержит 10 таблиц и иллюстрирована 32 рисунками. В списке литературы приведено 235 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Линии D. melanogaster. Мух линии Canton-S (CS), cinnabar (сп) и cardinal (cd) выращивали на стандартной среде для дрозофил (агар, изюм, дрожжи, сахар) в условиях постоянного цикла день/ночь (12 ч./12 ч.) при 25±0.5 °С. В опыт брали взрослых 5-суточных. и 13-суточных самцов.

Выделение РНК, проведение реакции обратной транскрипции и потшеразной цепной реакции с детекцией в режиме реального времени (real-time PCR). РНК из голов дрозофил выделяли с использованием реагента TRI REAGENT™ (Sigma®) в соответствии с указаниями фирмы-производителя. Концентрацию нуклеиновых кислот в пробе измеряли спектрофотометрированием при X 260 нм. После обработки ДНКазой I проводили реакцию обратной транскрипции с использованием набора случайных нонамеров и фермента M-MLV Reverse Transcriptase в соответствии с указаниями фирмы-производителя. Реакцию real-time PCR вели с использованием смеси TaqMan* Gene Expression Assays специфических флюоресцентных ДНК-зондов и праймеров к генам D. melanogater dnrl, rp49, da7, daí и dlimkl, с использованием системы регистрации ПЦР «StepOnePlus» фирмы «Applied Biosystems». Содержание кДНК в пробах нормировали относительно содержания кДНК рибосомного белка гр49, уровни экспрессии генов у мутантов нормировали по отношению к таковым у CS. Оценку достоверности различий осуществляли с использованием статистического теста рандомизации (Sokal, Rohlf, 1995).

Выработка долговременной памяти у самцов дрозофил путем условно-рефлекторного подавления ухаживания (УРПУ). Долговременную память у самцов вырабатывали в соответствии с протоколом УРПУ (Sakai et al., 2004) с некоторыми модификациями. Девственного 5-суточного самца исследуемой линии выдерживали с оплодотворенной самкой CS в течение 5 ч. при 25° С в стаканах с питательной средой. Необученных самцов той же линии использовали в качестве контроля при последующем анализе распределение pCREB в мозге методом конфокальной микроскопии.

Анализ распределения белков в мозге дрозофилы методом лазерной конфокальной микроскопии. Мозговые ганглии 5-суточных самцов после холодовой наркотизации извлекали из головной капсулы и фиксировали в 10% параформальдегиде на буфере PBS с 0.3% Triton Х-100 (РВТ). После блокировки в 10% нормальной сыворотке инкубировали ганглии с первичными антителами к белкам человека (rabbit-anti-homo LIMK1, rabbit-antihomo p(Ser133)CREB; rabbit-anti-homo р(5ег)-кофшшп) в разведении 1:100 и антителами к синаптическому белку CSP дрозофилы в разведении 1:20 5 суток при 4 °С. После промывок инкубировали ганглии со вторичными антителами (mouse-anti-rabbit IgG-FITC, donkey-anti- rabbit IgG-Rhodamine) в разведении 1:100 в течение 1 суток при 4 °С. После промывок окрашивали ганглии DAPI (1,2 мг/л PBS) в течение 40 мин. при комнатной температуре, заключали в среду Vectashield (Vector®) и сканировали с использованием лазерного конфокального микроскопа «Leica TSC SP5» (иммерсионные объективы 20х и 63х). Анализ конфокальных изображений осуществляли с помощью программы FIJI.

Квантовохимические расчеты стэкинг-связи в модельных димерах Полная градиентная оптимизация геометрии димеров и квантовохимические расчеты их энергии связи были выполнены с использованием версии PC GAMESS 7.0 (Granovsky A.A. http://classic.chein.msu.su/gran/gainessA программного комплекса GAMESS (Schmidt et al., 1993). Расчеты вели методом Хартри - Фока - Рутана с использованием базисного набора 6-31G** (Gordon, 1980), с учетом электронных корреляций в рамках теории возмущений Меллера - Плессета второго порядка (МР2) (Möller, Plesset, 1934). Вычисления полной энергии с учетом вклада МР4 проводили для систем с предварительно оптимизированной геометрией. Энергию связи (Емрглшч) вычисляли соответственно с учетом корреляций на уровне МР2 и МР4. Коррекция энергии BSSE была выполнена для оптимизированных димеров с использованием программы GAUSSIAN 03 (Frisch et al., 2003).

Компьютерное моделирование трехмерной структуры белка и докинг лигандов в связывающие сайты рецепторов. Атомные координаты кристаллических структур рецепторных субъединиц были взяты из электронного банка RCSB Protein Data Bank (www.rcsb.org/pdb/home/liome.do). Аминокислотные последовательности белков крысы и дрозофилы были взяты из электронного банка данных NCBI (www.ncbi.nlm.pov). Автоматическое гомологическое моделирование структуры субъединиц iGluR дрозофилы было выполнено с помощью компьютерного сервера Swiss-Model (Arnold et al., 2006; Guex and Peitsch, 1997; Schwede et al., 2003), с использованием кристаллических структур

рецепторных субъединиц крысы в качестве матрицы. Конструирование модельных димеров. ручной докинг лигандов в связывающие сайты рецепторов, оценка геометрических параметров водородных связей и модификация рецепторных субъединиц были выполнены с использованием программных пакетов VegaZZ 2.0.8 (Pedretti et al„ 2004) и Swiss-PdbViewer 3.7 (Guex et al, 1997). Программы компьютерного докинга Autodock 4.2 (Goodsell, Olson, 1990; Morris et al., 1996; Morris et al., 1998) и Quantum 3.3.0 были использованы для автоматического докинга KYNA в связывающие сайты рецепторов. Оптимизация структуры лиганд-рецепторных комплексов путем минимизации энергии в водной ячейке была выполнена с использованием программ Quantum 3.3.0 и GROMACS 4.07 (Berendsen et al., 1995; Lindahl et al., 2001; van der Spoel etal., 2005; Hess, 2008). Графические изображения молекулярных структур подготовлены с использованием программы VMD (Humphrey et al., 1996).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Анализ экспрессии генов thirl, rp49, da7, dai и dlimkl в тканях голов мутантов КПОТ D. melanogaster. Анализ уровня экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени проводили для 5 сут. и 13 сут. взрослых самцов (рис. 1).

Рис. 1. Относительный уровень экспрессии РНК в гомогенатах голов

кинурениновых мутантов. Уровни экспрессии X нормированы относительно CS (1.000). [х] - средние значения по выборке. Уровень экспрессии у CS принят за 1.* - dnrl v 5 сут. от dnrl сп 5 сут., $ - dnrl сп 5 сут. от dnrl сп 13 сут., # -dnrl cd 5 сут. от dnrl cd 13 сут., л - da7 cd 5 сут. от da7 cd 13 сут., р<0.05: & - da7 сп 5 сут. от da7 сп 13 сут, р<0.1 (двусторонний тест

рандомизации).

У v с отсутствием продуктов КПОТ в возрасте 5 сут. наблюдается более высокий уровень экспрессии dnrl сравнительно с сп с избыточным содержанием KYNA (р<0.05). Следовательно, антагонистическое воздействие KYNA на ранней стадии имагинального периода не приводит к компенсаторному увеличению активности гена ее рецептора. Показано увеличение уровня нормированной экспрессии dnrl у сп (р<0.05) в период с 5 по

1/5с v 13с сп 5с сп13с cd 5с cd 13с

13 сут., что может быть обусловлено продолжительным хроническим воздействием эндогенного ингибитора КУЫА на транскрипционную активность гена ее рецептора. Увеличение уровня экспрессии (1а7у сп в период с 5 по 13 сут. менее значимо (р<0.1).

У сс1 с избыточным содержанием ЗНОК возрастает нормированный уровень экспрессии с1пг1 и йа7 (р<0.05) в период с 5 по 13 сут. Возможно, это связано с компенсаторными пластическими изменениями в каликсах грибовидных тел, объем которых у 13-сут. сс/ снижен сравнительно с 5-суточными (8аууа1ееуа е! а1., 2000). Там же, по-видимому, экспрессируется и <1а7 (ви, О'Оолус!, 2003). Активация экспрессии генов также может быть обусловлена воздействием продукта окисления ЗНОК пероксида водорода на процессы транскрипции посредством активации стресс-зависимых сигнальных каскадов (1поие е1 а1, 2001). Вышеуказанные изменения активности генов могут обуславливать нарушение процессов формирования среднесрочной памяти у 13-суточных сс1 и извлечения долговременной памяти у 13-сут. сп и сс1 (Захаров и др., 2011). Уровни экспрессии прочих генов у 5 и 13 сут. V, сп и сс1 достоверно не отличаются. 2. Стэкинг-связь Ю^А с ароматическими фрагментами аминокислот в составе ¡СЫЯ.

Рис. 2. Оптимизированная структура димеров KYNA с фрагментами ароматических аминокислот.

а. KYNA -бензол;

б. KYNA - фенол;

в. KYNA - имидазол-3;

г. KYNA-индол;

д. суперпозиция димеров: KYNA -бензол (серый), KYNA- фенол (синий), KYNA - индол (голубой);

е. суперпозиция димеров:

1. KYNA енол - имидазол 1,

2. KYNA оксо - имидазол 2;

3.KYNA оксо - имидазол 3; 4.KYNA оксо - имидазол 4,

Взаимодействуя с лиганд-связывающим сайтом 5,7-дихлор-

КУЫА фСКА) формирует стэкинг-связь с ароматическим кольцом РЬем (Ригикаша, Ооиаих, 2003). По нашим данным, во всех субъединицах Ю1иЯ в данном положении присутствует ароматический остаток: РЬе (бензол) - в <¡N1^1 дрозофилы, Туг (фенол) - в

GluR крысы и dGluR дрозофилы, His (имидазол) - в NR2 крысы, Тгр (индол) - в dNR2 дрозофилы (Zhuravlev et al., 2011).

Таблица 1: энергия и оптимальная геометрия димеров KYNA.

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.

Бензол- ИСКА* Phe92 NR1 OD 0.89 -0.57 3.53 9.6

Бензол Phe92 NR1/Phe76 dNRl OD -8.81 -4.19 -16.42 -8.64 1.24 0.18 3.17 1.5

Бензол Phe92 NR1 MD -6.91 -4.19 0.68 -0.60 3.70 9.5

Бензол Phe76 dNRl MD -6.66 -3.64 0.09 0.55 3.53 4.5

Фенол Tyr61 GluR2/Tyr'8 dGluRl OD -11.01 -5.98 -19.0 -10.05 0.74 -0.64 3.35 6.0

Фенол Ту/'1 GluR2 MD -8.77 -5.33 0.61 -0.40 3.49 4.1

Фенол Tyr'8 dGluRl MD -9.16 -5.90 0.89 -0.63 3.52 1.7

Имидазол 1* His88 NR2AOD -10.22 -6.19 1.46 0.29 2.96 10.7

Имидазол 2 His88 NR2AOD -10.69 -6.56 1.28 -0.36 3.10 7.7

Имидазол 3 His88NR2AOD -12.10 -7.59 -17.46 -10.78 1.29 0.60 2.93 6.5

Имидазол 4 His88 NR2AOD -11.04 -7.20 0.77 -0.50 3.22 7.1

Имидазол His92NRl*MD -7.63 -5.44

Имидазол Н1 His92NRl*MD -6.74 -4.55

Индол Trp*9 dNR2 OD -16.34 -8.31 -26.88 -15.39 0.83 0.18 3.09 6.3

Индол Trp89 dNR2 MD -9.97 -6.39 0.46 0.31 3.63 11.0

1. ароматический партнер KYNA, 2. АК остаток рецепторной субъединицы, 3. ЕМР:, 4. ЕМр4, 5. Вир: в электронном базисе aug-cc-pVDZ, 6.ЕМр: в электронном базисе aug-cc-pVDZ с BSSE-коррекцией, 7. dX, 8. dY, 9. dZ, 10. межплоскостной угол (град.). Значения энергии указаны в ккал/моль. dX, dY, dZ - параллельные смещения центроидов ароматических колец (A). OD - димер с оптимизированной геометрией; MD - димер KYNA с ароматической группой после динамической минимизации энергии лиганд-рецепторного комплекса. л Данные рентгенострукгурного анализа (Furukawa and Gouaux, 2003). # KYNA в енольной форме, во всех иных случаях KYNA в оксо форме. NR1* - NR1 с заменой Phe92/His. Здесь и далее: буквой «d» указаны рецепторные субъединицы дрозофилы. Имидазол 1-4: различные варианты ориентации имидазола в OD относительно KYNA.

Энергия и оптимальная геометрия стэкинг-связи зависят от типа взаимодействующего с KYNA ароматического остатка и от характера протонирования полярных атомов ароматических колец (рис. 2, табл. 1). Энергия связи KYNA с ароматическими фрагментами повышается в ряду: бензол < фенол i имидазол < индол. Таким образом, максимальное сродство KYNA к NR1 не может объясняться более высокой энергией связи с ароматическим остатком. Различия в оптимальной геометрии стэкинг-связи могут определять специфичность взаимодействия лиганда с различными субъединицами рецептора.

Характер изменения энергии связи при параллельных и вертикальных смещениях

ароматических колец определяет форму потенциальной поверхности стэкинг-связи. Из

рис. 3 следует, что для димеров неполярных колец (бензол - бензол, бензол - КУКА)

параллельные смещения сопровождаются меньшими изменениями энергии связи, чем для

димеров полярных колец, (имидазол-имидазол, имидазол-КУКА). Потенциальная

поверхность водородной связи имеет наиболее выраженный минимум. Это позволяет

предположить следующую модель образования лиганд-рецепторного комплекса: 1. -

формирование стэкинг-связи с относительно подвижным лигандом в связывающем сайте,

2. - формирование паттерна лиганд-рецепторных водородных связей. С ростом

диэлектрической проницаемости £ понижается абсолютная величина энергии стэкинг-

связи. Наибольшее влияние увеличение е оказывает на энергию связи полярных

ароматических остатков.

Рис. 3. Потенциальные поверхности Емр4 стэкинг-связи и водородной связи КУЫА-Рго124.

а. бензол — бензол, (IX;

б. КУЛА-бензол, (IX;

в. КУКА - имидазол 3, (IX;

г. КУКА - имидазол 3, с!У;

д. КУНА - бензол,

е. КУЫА-Рго134,аХ;

ж. КУЫА - Рго1"4, ей.

Смещения вдоль осей X, У относительно координат димеров, оптимизированных методом МР2, вдоль оси I - относительно координат с минимальной ЕМр4-

а

4)

I 5 (Ч

-1,5

■0,5 0 0.5 1

Смещения (А)

т->-1,5

3. Компьютерный докииг KYNA в рецепторные сайты iGluR крысы и дрозофилы.

Оптимизированные димеры KYNA с ароматическими фрагментами были подставлены в лиганд-связывающие сайты субъединиц iGluR в открытой, инактивированной конформации (рис. 4). Паттерн лиганд-рецепторных взаимодействий KYNA в комплексах достаточно консервативен: это стэкинг-связь с Plic92 (Туг, His, Тгр), водородная связь группы NH (окео форма KYNA) с С=0 Pro124 (Ser), водородная связь СОО с NH Thr126 (Met) и ионная связь СОО с гуанидиновой группой Arg'3'.(HoMepa остатков указаны для NR1.) В NR2 и dNR2 возможны различные ориентации KYNA в зависимости от характера протонирования ароматических колец, что может обусловливать меньшую специфичность связывания KYNA с этими субъединицами.

Значения свободной энергии связи (ЕР) и 1С50 (ОиапШт 3,3.0) были рассчитаны до и после динамической оптимизации комплексов (МО) (табл. 2). Для комплексов до МО расчетные значения 1С50 (2.6 - 3.7*10"5 М) близки экспериментальному для ЫЯЦ !.5*10"5 М; НШпав е! а1., 2001). Сродство КУМА к субъединицам 101иЯ крысы убывает в ряду: Ш1>Ш2>С1иЯ2, к субъединицам дрозофилы: <1ЫК.1>сЮ1и111>с)НК2 (до МО). Комплекс ёМШ-КУЫА по своим свойствам (структуре связывающего сайта, значениям Ер и 1С50) наиболее близок к ЫЯ1-КУЫА млекопитающих.

а. б.

Pro 89

enol 1

Рис. 4. KYNA в связывающих сайтах iGluR до и после MD. a. NR1; б. GluR2; в. NR2: г. dNR2. KYNA и аминокислотные остатки до MD изображены синим цветом, после MD -голубым. В NR2 ароматическое кольцо His1"1 показано в катионной форме. Оптимизированный комплекс с KYNA в енольной форме (KYNA-имидазол 1) изображен красным цветом, в оксо форме (KYNA — имидазол 2) — синим.

Таблица 2: энергии связывания KYNA с субъединицами iGluR (Quantum 3.3.0)

Рецепторная Ег IC50 Еэяектростатическая ЕВАНдар

субьединица (кка л/моль) С10"?М) (ккал/моль) ваальсд

(ккал/моль)

1 2 1 2 1 2 1 2

NR1 -6.38 -5.45 2.57 10.1 -3.80 -7.75 -7.10 -5.13

NR1 (Phe'2/Ala) -4.14 -4.18 106 98.5 -1.21 -8.70 -5.31 -3.40

NR1 - DCKA* -7.28 -4.91 0.58 29.4 -4.07 -7.29 -8.25 -4.77

NR1 (Arg"'/Ala) -5.43 -4.43 12.4 65.5 -1.73 1.18 -6.88 -6.03

dNRl -6.23 -5.60 3.32 9.36 -3.21 -5.63 -7.21 -5.88

NR1* -6.35 -5.30 2.69 15.5 -4.57 -5.90 -6.64 -5.34

NRl*(HisH+) -6.60 -5.64 1.80 8.80 -4.56 -7.39 -6.99 -5.45

NR1** (HisH+) -6.23 -5.14 3.30 20.3 -4.50 -11.34 -6.51 -4.60

GluR2 -6.17 -5.02 3.67 24.6 -2.98 -4.38 -7.25 -5.32

GluR2 (Tyr6'/Ala) -5.27 -3.88 16.3 162 -2.87 -5.08 -6.01 -3.64

dGluRl -6.07 -6.43 4.33 2.37 -2.95 -7.20 -7.13 -6.39

dNR2 -5.55 -5.91 10.2 5.62 -3.79 -7.19 -5.94 -6.40

1 - до динамический минимизации энергии комплекса (MD), 2 - после MD. $ NR1 в комплексе с DCKA (Furukawa and Gouaux, 2003). EF- свободная энергия связывания. NR1 * (Phe92/His) и NR1 ** (Phe93/His, Pro124/Ser, Trp":i/Tyr, Phe~5°/Tyr) — модели NR2 в открытой конформации.

4. Компьютерный докинг ксантуреновой кислоты (XAN), антраниловой кислоты (АА), кинуренина (KYN) и З-гидроксикинуренина (ЗНОК) в лигапд-связывающий сайт iGluR. Оптимизированные димеры XAN - бензол и АА-бензол была подставлена в лиганд-связывающнй сайт dNRl в открытой конформации (Autodock 4.2). XAN может связываться с dNRI в качестве конкурентного антагониста, подобного KYNA, с несколько меньшим сродством (ЕР = -7.21 и -7.43 ккал/моль для KYNA-dNRl и XAN-dNRl соответственно). АА обладает меньшим сродством к рецептору (EF = -5.19 ккал/моль). По-видимому, АА из-за ее малых размеров не может стабилизировать открытую конформацию NR1. KYN способен взаимодействовать с NR1 в качестве агониста, стабилизируя ее закрытую, активированную конформацию. Ориентация аминокислотного фрагмента K.YN в рецепторе с максимальной Ef (-7.58 ккал/моль) близка таковой для глицина. Сродство ЗНОК к NR1 в данной ориентации существенно ниже (ЕР = -5.89 ккал/моль): ЗНОК. по-видимому, не обладает свойствами специфического агониста NR1.

5. Компьютерный докинг KYNA в галантамин-связывающий сайт а7 tiAChR крысы и дрозофилы. KYNA является конкуретным антагонистом связывания галантамина с а7*

nACliR (Lopes et al., 2007). Компьютерная подстановка KYNA в открытый галантамин-связывающий сайт димера а7 nACliR млекопитающих (PDB ID: 3SQ9, без агониста) была выполнена путем автоматического докинга (Autodock 4.2). Наиболее энергетически выгодной является структура 1 (рис. 5 а.). Группа NH KYNA формирует Т-связь с Тгр'45 (1; здесь и далее в скобках - номер субъединицы), группа СОО - водородные связи с NH Leu106 (2) и Leu"6 (2). Группа С=0 KYNA может формировать водородную связь с NH2 Gin"4 (2), что, возможно, отчасти определяет специфичность взаимодействия KYNA с а7 nACliR. Динамическая минимизация I в водной ячейке (G ROM ACS 4.07) приводит к оптимизации водородных связей с увеличением Ef комплекса. Антагонистические свойства KYNA, по-видимому, обусловлены тем, что она не формирует сильных связей с мобильными остатками (1): Туг", Туг184, Cys186'187, Туг191 - и не способна фиксировать закрытую, активированную конформацию рецептора, но препятствует взаимодействию с ним аллостерических активаторов.

а. б.

Рис. 5. КТЫА в галантаминовом сайте а7 пАСИИ млекопитающих (а.) и дрозофилы (б.) после динамической минимизации энергии комплекса (СЯОМАСЗ 4.07). Линиями указаны водородные связи лиганда с рецептором.

Остаток Gin"4 в а7 nACliR дрозофилы замещен на гидрофобный Leu. Моделью димеров dali и da7da6 рецепторного сайта дрозофилы (da7 nAChR) служила структура димера a7 nAChR млекопитающих (3SQ9), в которого путем компьютерного мутагенеза были замещены остатки Leu10fVVal (2), Gln'H/Leu (2) и Leullf7Val (2). Компьютерный докинг KYNA в димер da7 nAChR с последующей минимизацией энергии приводит к

формированию структуры, подобной I, в которой, однако, С=0 КУМА образует водородную связь с ОН Туг191 (1) (рис. 5 б.). ЕР в оптимизированных комплексах КУЫА с а7 пАСЖ млекопитающих и дрозофилы составляет -6.51 и 6.71 ккал/моль соответственно, для N111-КУМА - -7.98 ккал/моль (АиЫоск 4.2). В с!а7 пАСЬЯ КУЫА образует водородные связи с(1) и (2), что может фиксировать его закрытую конформацию. Нами предсказано снижение или полное отсутствие антагонистических свойств КУМА в отношении 0.1 пАСИЯ дрозофилы сравнительно с таковым у млекопитающих. Этим, возможно, объясняется менее достоверный характер увеличения экспрессии с!а7 по сравнению с Лпг1 у сп при хроническом воздействии КУЫА.

6. Распределение рСЙЕВ в мозге мутантов КПОТ О. тсШп^ии-г. Анализ распределения в мозге дрозофилы р^ег231) СЯЕВ методом конфокальной микроскопии выявляет ряд внутримозговых структур, в которых избирательно концентрируется данный

транскрипционный фактор (рис. 6, 7).

Рис. 6. Структуры мозга дрозофилы с повышенным содержанием рСЯЕВ (фронтальная проекция, без оптических ганглиев). 1. - схема мозговых структур, обогащенных рСЯЕВ, 2,-распределение рСЯЕВ в мозге на уровне подглоточного ганглия, а. - Клетки, прилегающие к вЕв, б. - гломерулярная структура 1, в. - гломерулярная структура 2, горизонтальные ветви, г. - проводящие тракты, связывающие горизональные ветви гломерулярной структуры с протоцеребрумом, д. - область взаимосвязи проводящих трактов с У-образной структурой протоцеребрума, е. - медиальный пучок, ж. - У-образная структура, з. - проводящие тракты сверху от СС, и. - кластеры клеток в области антенного тракта, к. -нейрональный тракт, связывающий данные кластеры. АЬ - антенные доли, АЫ - антенный нерв, Е5 - пищевод, МВ1 - медиальный пучок, БЕй - подглоточный ганглий, вРЬ - верхний протоцеребрум. Красным изображен маркер структур нейропиля С5Р, зеленым - рСИЕВ.

В клетках в районе подглоточного ганглия (ЭЕй) в цитоплазме и ядрах содержание рСЯЕВ существенно более высокое сравнительно с фоновым (рис 6 а., 7 а.). В области хромоцентра ядра рСЯЕВ отсутствует (рис. 7 б.): по-видимому, он локализуется в

областях транскрипционно активного хроматина. pCREB также содержится в отростках

вышеуказанных клеток, в гломерулярных структурах в области пищевода (рис 6 б., в.) и в

области верхнего протоцеребрума (рис 6 ж ). Количество кластеров CREB-обогащенных

клеток в SEG достоверно не различается у CS, сп и cd, как до, так и после обучения

методом УРПУ. Это согласуется с данными исследователей (Horiuchi et al.,. 2004),

согласно которым весь пул CREB в головах дрозофил фосфорилирован по остатку Ser.

Рис. 7. pCREB в структурах мозга дрозофилы (увеличение хбЗ). а - клетки в области подглоточного ганглия (SEG) и их аксоны, б. - отдельная клетка с

хромоцентром в области ядра; Ядра с хромоцентрами изображены синим

цветом, pCREB - зеленым. Стрелками указано положение хромоцентра в ядре клетки.

pCREB-обогащенные структуры у дрозофилы морфологически сходны с нейрональными структурами, регулирующими поведение питания и формирование пищевой мотивации. (Melcher, Pankratz, 2005; Kraslies et al., 2009). Не исключено, что данная система участвует также в процессах формирования долговременной памяти у дрозофилы методом УРПУ. Локализация CREB в отростках нейронов, аксонах и дендритах, была ранее показана и у млекопитающих (Crino et al., 1998, Сох et al., 2008). CREB в них может выполнять функцию сигнального посредника между синаптической активностью и индукцией экспрессии генов в ядре клетки.

7. Распределение LIMK1 и р-кофилина в мозге 5-суточных самцов D. melanogaster. В

мозге самцов CS, а также сп и cd L1MK1 локализуется вне обогащенных CSP структур нейропиля, концентрируясь в лежащих по их контуру клетках и в отдельных проводящих трактах (рис. 8 а, б.). Морфологически это соответствует распределен™ в мозге дрозофилы глиальных клеток (Hartenstein et al. 2011). р-Кофилин у самцов CS также локализован в глии, но преимущественно — в ядрах нейронов на поверхности мозга (рис. 8 в.). Небольшое количество р-кофилина наблюдается в отдельных структур нейропиля (FB, AL, SEG и др.), в то время как в грибовидных телах и в эллипсовидном теле он практически отсутствует. Для некоторых нейроглиальных контактов показана

17

возможность межклеточного транспорта в них белковых макромолекул (Рес)огепко, Шс1еп8ку, 2009). Не исключено, что после фосфорилирования 1ЛМК1 р-кофилин из клеток глии аналогичным образом поступает в нервные окончания и далее - в ядра клеток.

а. б. в.

Рис. 8. Распределение L1MK1 и р-кофилина в мозге дрозофилы (фронтальная плоскость), а. LIMK1 в мозге на уровне каликсов грибовидных тел, б. LIMK] в клетках глии центрального комплекса, в. - р-кофилин в мозге на уровне центрального комплекса. Са - калике, СС -центральный комплекс, ЕВ -эллипсовидное тело, Es - пищевод, FB - вееровидное тело, Lo -лобула, Ме-медулла, РВ-протоцеребральный мост. а„ в. -зеленым указаны LIMK1 и р-кофилин, красным - CSP; б. - зеленым указан CSP, красным - LIMK1, синим - ядра.

У млекопитающих ферменты КПОТ преимущественно активны в клетках глии (Schwarcz and Pelliccari, 2002). Важность глии в обеспечении различных форм нейрофизиологической активности у млекопитающих и беспозвоночных находит все больше экспериментальных подтверждений. Взаимодействие нейронов и глиальных клеток в мозге дрозофилы может определять характер активности компонентов сигнальной системы: продукты КПОТ - iGluR/nAChR - LIMK - р-кофилин/pCREB.

ВЫВОДЫ

1. В тканях голов взрослых самцов D. melanogaster в период с 5 до 13 суток наблюдается увеличение нормированного относительно Canton-S уровня экспрессии гена dnrl iGluR у линии сп, а также генов dnrl и da7 nAChR у линии cd. В возрасте 5 суток нормированный уровень экспрессии dnrl у сп выше, чем у v.

2. В димерах кинуреновой кислоты (KYNA) с фрагментами ароматических аминокислот ¡GluR формируется стэкинг-связь, оптимальная геометрия и энергия которой в существенной мере зависят от размера плоских ароматических систем и распределения в них парциальных зарядов. Величина диэлектрической проницаемости среды оказывает значительное влияние на энергию стэкинг-связи гетероароматических колец. Различия в оптимальной геометрии стэкинга для разных субъединиц отчасти определяют специфичность формирования лиганд-рецепторных комплексов.

3. KYNA в качестве антагониста может связываться с NR1, NR2 и GluR субъедшшцами iGluR млекопитающих и дрозофилы. Ксантуреновая кислота может связываться с NR1 дрозофилы как антагонист, подобный KYNA, но с несколько меньшим сродством. Кинуренин может связываться с NR1 в качестве агониста, с существенно более высоким сродством, чем З-гидроксикинуренин. KYNA способна взаимодействовать с галаитаминовым сайтом а7 nAChR млекопитающих, но со сродством, более низким, чем к NR1. Характер связывания KYNA с тем же сайтом а7 nAChR дрозофилы отличен от такового у млекопитающих, что может вызывать снижение антагонистической активности KYNA в отношении данного рецептора.

4. pCREB в мозге взрослых самцов дрозофилы избирательно концентрируется в телах клеток в области подглоточного ганглия, а также - в нейрональных структурах, образованных отростками этих клеток и отвечающих за регуляцию пищевого поведения. В данных структурах pCREB локализуется преимущественно вне ядра. pCREB также содержится в ядрах клеток в поверхностных слоях мозга. 5-часовое обучение методом условно-рефлекторного подавления ухаживания не влияет на среднее число кластеров pCREB-обогащенных клеток в подглоточном ганглии у Canton-S и мутантов КПОТ сп и cd.

5. LIMK1 у взрослых 5-суточных самцов дрозофилы избирательно концентрируется в глиальных клетках мозга: на его поверхности, на периферии структур нейропиля и в области некоторых проводящих трактов. Пространственное распределение LIMK1 в мозге сходно у Canton-S и мутантов КПОТ сп и cd. р-Кофилин преимущественно локализуется в ядрах мозговых клеток, а также - в глиальных клетках, окружающих структуры нейропиля. В нейропиле содержание р-кофилина заметно более низкое, в грибовидных телах и в эллипсовидном теле центрального комплекса он практически отсутствует.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕТАЦИИ

Статьи:

1. Журавлев A.B., Щеголев Б.Ф., Савватеева-Попова Е.В., Попов A.B. Роль стэкинг-взаимодействий в механизмах связывания кинурениновой кислоты с NR2A- и GluR2-субъединицами ионотропных рецепторов глутамата // Росс, физиол. журн. им. И.М.Сеченова.- 2007,- Т. 93,- №6,- С. 609-624.

2. Zhuravlev A. , Savvateeva-Popova E., Popov A., Shchegolev В., Riederer P. Stacking interactions in the control-gear binding of kynurenic acid with NR2A subunit of glutamate ionotropic receptors // J. Neural Transm.- 2007.- V. 114,- N. 7.- P. CXIV.

3. Zhuravlev A.V., Shchegolev B.F., Savvateeva-Popova E.V., Popov A.V. Molecular mechanisms of imidazole and benzene rings binding in protein // Biochemistry (Moscow).-2009,- V. 74,- N. 8,- P. 1135-1144.

4. Захаров Г.А., Журавлев A.B., Паялина Т.Л., Камышев Н.Г., Савватеева-Попова Е В. Влияние мутаций кинуренинового пути обмена триптофана у D. melanogaster на локомоторное поведение и экспрессию генов глутаматэргической и холинэргической системы // Экологическая генетика,- 2011.- Т. IX.- №2 - С. 65-73.

5. Zhuravlev A.V., Zakharov G.A., Shchegolev B.F., Savvateeva-Popova E.V. Stacking interaction and its role in kynurenic acid binding to glutamate ionotropic receptors // J. Mol. Model.- 2011. DOI: 10.1007/s00894-011 -1206-1.

Основные тезисы:

1. Zhuravlev A., Zakharov G., Shchegolev В., Sharagina L., Popov A., Sawateeva-Popova E. The possibility of kynurenine metabolites binding to ionotropic glutamate receptors and to calmodulin: data on molecular modeling and Drosophila kynurenic mutants // XVII WFN World Congress on Parkinson diseases and related disorders.- Netherlands, Amsterdam, 2007.- P. 71.

2. Журавлев A.B, Щеголев Б.Ф. Савватеева-Попова Е В. Роль стэкинг-взаимодействия в механизмах связывания кинуреновой кислоты с NR2A- и GluR2- субъединицами глутаматных рецепторов // Тезисы конференции «Системный контроль генетических процессов», посвященной 100-летию М.Е.Лобашева,- Санкт-Петербург, 2007,- С. 49.

3. Zhuravlev A.V., Medvedeva A.V., Sawateeva-Popova E.V. Confocal microscopy imaging of the Drosophila brain structures and Lim kinase 1 distribuion // Simpler nervous systems.- St.-Petersburg, 2009 - P. 120-121.

4. Zhuravlev A.V., Petrov A.A., Savvateeva-Popova E.V. The distribution of the phosphorylated cyclic AMP-responsive element binding protein (p-CREB) in the brain structures of Drosophila melanogaster // Topical problems of biophotonics - 2011,- N. Novgorod, 2011,- P. 263-264.

5. Журавлев A.B., Савватеева-Попова ЕВ. Молекулярные механизмы связывания кинурениновых метаболитов с ацетилхолиновыми и глутаматными рецепторами дрозофилы // Медицинский академический журнал: тезисы доклада,- Санкт-Петербург, 2011.- Т. 11.- С.24-25.

Подписано в печать 11.01.2012г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,2. Тираж 100 экз. Заказ № 2386.

Отпечатано в ООО «Издательство "JIEMA"» 199004, Россия, Санкт-Петербург, В.О., Средний пр., д. 24 тел.: 323-30-50, тел./факс: 323-67-74 e-mail: izd_lema@mail.ru http://www.leinaprint.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Журавлев, Александр Владимирович, Санкт-Петербург

61 12-3/435

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ ИМ. И. П. ПАВЛОВА

Молекулярные механизмы действия метаболитов кинуренинового пути обмена триптофана на глютаматергическую и холинергическую системы нейротрансмиссии у мутантов дрозофилы

03.03.01 — физиология 03.02.07 - генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д.б.н. Савватеева-Попова Е.В.

На правах рукописи

Журавлев Александр Владимирович

Санкт-Петербург 2012

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ..............................................................6

ВВЕДЕНИЕ.............................................................................................................9

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................18

1.1. РОЛЬ КИНУРЕНИНОВ В РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ

ЦНС.........................................................................................................................18

1.1.1 .Кинурениновый путь обмена триптофана.................................................18

1.1.2. Кинурениновые мутанты дрозофилы и пчелы, их физиологические и поведенческие особенности.................................................................................21

1.1.3. Влияние продуктов КПОТ на нейрофизиологические процессы в ЦНС насекомых...............................................................................................................24

1.1.4. Молекулярные механизмы действия кинурениновых продуктов.........26

1.2. ГЛУТАМАТЕРГИЧЕСКАЯ СИСТЕМА НЕЙРОТРАНСМИССИИ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ И ДРОЗОФИЛЫ.............................................30

1.2.1. Роль глутаматергической системы нейротрансмиссии в ЦНС............30

1.2.2. Структура и механизмы функционирования Ю1иЯ..................................31

1.2.3. Локализация и функции С1иЯ в мозге дрозофилы...........................35

1.2.4.101иЯ -зависимые каскады внутриклеточной сигнализации...............37

1.2.5. Дисфункция глутаматергической системы как причина развития нейродегенеративных патологий.......................................................41

1.3. АЦЕТИЛХОЛИНЕРГИЧЕСКАЯ СИСТЕМА НЕЙРОТРАНСМИССИИ В

ЦНС МЛЕКОПИТАЮЩИХ И ДРОЗОФИЛЫ.......................................42

1.3.1 Функциональная роль ацетилхолинергической системы в ЦНС.............42

1.3.2. Структура и механизмы функционирования пАСЬЯ........................43

1.3.3. Локализация и функции АСЫ^ в мозге дрозофилы...........................52

1.4. ПАМЯТЬ И ОБУЧЕНИЕ У ДРОЗОФИЛЫ.....................................53

1.4.1. Генетическая основа процессов обучения и памяти у £>. melanogaster.5Ъ

1.4.2. Роль СЯЕВ-зависимых сигнальных каскадов в формировании долговременной памяти...................................................................58

1.4.3. Структуры мозга дрозофилы, ответственные за обучение и память.... 62

1.4.4. Влияние продуктов КПОТ на процессы обучения и памяти у дрозофилы...................................................................................73

1.5. КОМПЬЮТЕРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ КАК ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ОСНОВА ПРЕДСКАЗАНИЯ НЕЙРОАКТИВНЫХ СВОЙСТВ КИНУРЕНИНОВЫХ ПРОДУКТОВ...................................................77

1.5.1. Компьютерное моделирование биомолекулярных структур...............77

1.5.2. Физическая природа стэкинг-связи, методы квантовохимических расчетов ее энергии и геометрии.......................................................79

1.5.3. Моделирование трехмерной структуры рецепторных субъединиц и лиганд-рецепторных комплексов.......................................................82

1.6. СВЯЗЬ НАСТОЯЩЕГО ИССЛЕДОВАНИЯ С ОБСУЖДАЕМОЙ

ПРОБЛЕМОЙ...............................................................................84

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..............................................90

2.1. МАТЕРИАЛЫ.........................................................................90

2.1.1. Реактивы и расходные материалы...............................................90

2.1.2. Линии дрозофил......................................................................90

2.2.МЕТОД Ы................................................................................91

2.2.1. Выделение РНК, проведение реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с детекцией в режиме реального времени....91

2.2.2. Выработка долговременной памяти у самцов дрозофил путем условно-рефлекторного подавления ухаживания..............................................92

2.2.3. Анализ распределения белков в мозге дрозофилы методом лазерной конфокальной микроскопии.............................................................92

2.2.4. Вестерн-блот анализ белков в тканях голов дрозофил.....................93

2.2.5. Компьютерное моделирование трехмерной структуры белка, квантово-химические расчеты модельных димеров и компьютерный докинг лигандов в

связывающие сайты рецепторов........................................................93

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ...............................................................96

3.1 АНАЛИЗ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ СУБЪЕДИНИЦЫ NR1 NMDA-РЕЦЕПТОРА (DNR1), СУБЪЕДИНИЦ НИКОТИНОВОГО АЦЕТИЛХОЛИНОВОГО РЕЦЕПТОРА (DA7, DA3) И LIM-КИНАЗЫ 1 (DLIMK1) В ТКАНЯХ ГОЛОВ ДРОЗОФИЛ.........................................96

3.2. КВАНТОВОХИМИЧЕСКИЕ РАСЧЕТЫ СТЭКИНГ-СВЯЗИ В АРОМАТИЧЕСКИХ ДИМЕРАХ.......................................................99

3.2.1. Модельные системы для расчета стэкинг-связи.............................99

3.2.2. Оптимальная геометрия и энергия KYNA в комплексе с фрагментами ароматических аминокислот: бензолом, фенолом, имидазолом и индолом.. 106

3.2.3. Поверхность потенциальной энергии KYNA в комплексе с ароматическими остатками.............................................................113

3.3. КОМПЬЮТЕРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ КИНУРЕНОВОЙ КИСЛОТЫ С IGLUR..............................................118

3.4. КОМПЬЮТЕРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ, КСАНТУРЕНОВОЙ КИСЛОТЫ, АНТРАНИЛОВОЙ КИСЛОТЫ, КИНУРЕНИНА И 3-ГИДРОКСИКИНУРЕНИНА С IGLUR..................124

3.5. КОМПЬЮТЕРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ KYNA С НИКОТИНОВЫМИ АЦЕТИЛХОЛИНОВЫМИ РЕЦЕПТОРАМИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ И ДРОЗОФИЛЫ............................................130

3.6 РАСПРЕДЕЛЕНИЕ PCREB В МОЗГЕ КИНУРЕНИНОВЫХ МУТАНТОВ ДО И ПОСЛЕ ФОРМИРОВАНИЯ ДОЛГОВРЕМЕННОЙ ПАМЯТИ ПРИ УСЛОВНО-РЕФЛЕКТОРНОМ ПОДАВЛЕНИИ УХАЖИВАНИЯ............142

3.7 .РАСПРЕДЕЛЕНИЕ LIMK1 И Р-КОФИЛИНА В МОЗГЕ

ДРОЗОФИЛЫ.............................................................................155

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ......................................159

4.1.ВЛИЯНИЕ КИНУРЕНИНОВЫХ МЕТАБОЛИТОВ НА УРОВЕНЬ ЭКСПРЕССИИ РЕЦЕПТОРНЫХ ГЕНОВ И DLIMK1...........................159

4.2.ПРОСТЕЙШИЕ МОДЕЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ ДЛЯ КВАНТОВОХИМИЧЕСКИХ РАСЧЕТОВ ЭНЕРГИИ СТЭКИНГ-СВЯЗИ... 162

4.3.КОМПЬЮТЕРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ СВЯЗЫВАНИЯ

КИНУРЕНИНОВЫХ ПРОДУКТОВ С ЮЬШ......................................163

4.4 .ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КТОА С КАСЖ.......................................169

4.5.РАСПРЕДЕЛЕНИЕ РСЯЕВ В СТРУКТУРАХ МОЗГА КИНУРЕНИНОВЫХ МУТАНТОВ ДРОЗОФИЛЫ И ВОЗМОЖНАЯ РОЛЬ ЭТИХ СТУКТУР В ПРОЦЕССАХ ФОРМИРОВАНИЯ ДОЛГОВРЕМЕННОЙ

ПАМЯТИ...................................................................................173

4.6 .РАСПРЕ ДЕЛЕНИЕ ЫМК1 И Р-КОФИЛИНА В МОЗГЕ

ДРОЗОФИЛЫ.............................................................................177

ВЫВОДЫ............................................................................................................182

БЛАГОДАРНОСТИ...................................................................184

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................185

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АК — аминокислоты БС — безусловный стимул ГАМК - у-аминомасляная кислота ДВП — долговременная потенциация ИО — индекс обучения

КПОТ — кинурениновый путь обмена триптофана

ЦНС - центральная нервная система

УРПУ - условно-рефлекторное подавление ухаживания

УС — условный стимул

АА - антраниловая кислота

AChBP — ацетилхолин-связывающий белок

Akt - протеинкиназа В.

AMPAR - рецептор а-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты

AL (antennal lobes) — антенные доли АР-1 - активаторный белок 1.

ARM (anesthesia-resistent memory) - память, устойчивая к анестизии Са (calyxes) — каликсы СаМ — кальмодулин

СаМК II/IV — кальмодулин-зависимая киназа II/IV сАМР - циклический аденозинмонофосфат СВР - CREB-связывающий белок СС (central complex) — центральный комплекс Cdc42 - гомолог белка контроля деления клеток 2. CI (courtship index) - индекс ухаживания c-Jun, c-Fos - компоненты АР-1.

CREB — белок, связывающийся с сАМР-завимым элементом

dNPF - нейропептид F дрозофилы

ЕВ (ellipsoid body) — эллипсоидное тело

ERK - киназа, регулируемая экстраклеточными сигналами

FB (fan-shaped body) — вееровидное тело.

GABAR - рецептор у-аминомасляной кислоты

GFR - фактор обмена GTP

GRN - програнулин, ростовой фактор

iACT — внутренний антенноцеребральный тракт

iGluR - ионотропные рецепторы глутамата

IMPC (internal medial protocerebtum) - внутренний медиальный протоцеребрум

5-HI - 5-гидроксииндол

HS (heat shock) — тепловой шок

ЗНОК - 3-гидроксикинуренин

JNK - N-концевая киназа c-Jun

KAR — каинатные рецепторы

КС (Kenyon cell) - клетки Кеньона

KYN — кинуренин

KYNA - кинуреновая кислота

LH (lateral horn) — боковой рог

LIMK1 - LIM-киназа 1.

LRN (learning) - обучение

LTM (long-term memory) - долговременная память mAChR - мускариновые ацетилхолиновые рецепторы МАРК - митоген-активируемая протеинкиназа MB (mushroom bodies) - грибовидные тела

MD - динамическая минимизация потенциальной энергии в лиганд-рецепторном комплексе

МЕКК - киназа киназы МАРК

МКК - киназа МАРК

МТМ (medial-term memory) — среднесрочная память nAChR — никотиновые ацетилхолиновые рецепторы NGF - фактор роста нервов NMDAR — ТчГ-метил-Б-аспартатный рецептор NRSE - последовательность связывания NRSF

NRSF - нейрональный фактор сайленсига генов

РАК1 - р21-активируемая киназа 1

РВ (protocerebral bridge) - протоцеребральный мост

PDE 1 - фосфодиэстераза 1

PI3K - фосфатидилинозитол-3-киназа

РКА/В/С - протеинкиназа А/В/С

PKA-R1 - регуляторная субъединица протеинкиназы А

PN — проекционные нейроны

QUIN - хинолиновая кислота

Rae - GTP-аза семейства Rho

Raf - киназа киназы МАРК

Ras - белок семейства малых GTP-аз

RSK - киназа рибосомального белка S6

SAPK - стресс-активируемая протеинкиназа

S6K - киназа р70 рибосомального белка S6

SEG (subesophageal ganglion) - подглоточный ганглий

SM/LPC (superior medial/lateral protocerebrum) - верхний медиальный/ латеральный протоцеребрум

STM (short-term memory) - кратковременная память

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Актуальной проблемой современной нейрофизиологии является изучение механизмов действия метаболитов кинуренинового пути обмена триптофана (КПОТ) на процессы в ЦНС млекопитающих и человека, связанные с развитием ряда нейропатологий, таких как болезнь Паркинсона, Хантингтона, старческое слабоумие и др. (Widner et al., 1999; Beal et al., 1999; Savvateeva-Popova et al., 2003). По КПОТ в организме млекопитающих и беспозвоночных метаболизируется около 90% триптофана (Лопатина и др., 2004). В литературе продукты КПОТ получили наименование кинуренинов, по названию кинуренина (KYN), первого из долгоживущих метаболитов этого пути. Доказана или предполагается их роль в развитии воспалений ЦНС, а также СПИД, диабета, инфаркта миокарда. С конца 80-х - начала 90-х годов большинство исследований кинуренинов было посвящено их нейродегенеративному эффекту. Нейроактивность продуктов КПОТ была показана для многих видов животных: лягушек, мышей, крыс, кроликов, кошек, собак и др. (Лапин, 2004).

Особый интерес представляет изучение молекулярных механизмов активности кинуренинов у мутантов с генетически блокированными стадиями КПОТ. К их числу у насекомых относится дрозофила (Drosophila melanogaster) и пчела (Apis mellifera). Мутанты КПОТ дрозофилы могут рассматриваться как модель соответствующих нейродегенеративных патологий у человека, что полностью оправдано в свете данных современной генетики и молекулярной биологии. Секвенирование генома человека и дрозофилы выявило значительный процент гомологии их генов, регулирующих биологические процессы на различных уровнях организации: от взаимодействия отдельных компонентов внутриклеточных сигнальных каскадов до сложных физиологических, поведенческих и когнитивных программ. Более 75% генов человека, связанных с развитием наследственных

заболеваний, имеют гомологи у D. melanogaster (Reiter et al., 2001). Важным направлением исследований после завершения проектов «Геном человека» и «Геном дрозофилы» стал анализ проявлений мутаций генов дрозофилы для установления функции гомологичных генов болезней человека и выявление групп тех генов, дисфункция которых провоцирует развитие полигенных заболеваний (Savvateeva-Popova et al., 2002). Короткий репродуктивный цикл дрозофилы делает возможным постановку генетических экспериментов и исследование физиологических функций отдельно взятых генов на разных стадиях развития. Головной мозг дрозофилы, насчитывающий порядка 100 тыс. нейронов, является достаточно высокоорганизованной структурой, обеспечивающей реализацию всех основных форм когнитивной активности. Все вышеуказанное обуславливает удобство использования дрозофилы в качестве модельного объекта при изучении физиологических механизмов нормальных и патологических процессов, протекающих в ЦНС.

У мутантов дрозофилы накопление тех или иных промежуточных метаболитов КПОТ оказывает разнообразные модулирующие воздействия на уровень активности ЦНС, а также на процессы обучения и памяти (Savvateeva, 1991; Savvateeva et al., 2000; Лопатина и др., 2004). Мутанты vermilion (v) с блокированной первой ключевой стадией пути характеризуются полным отсутствием продуктов КПОТ. Мутанты cardinal (cd) с повышенным уровнем 3-гидроксикинуренина (ЗНОК) характеризуются развитием нейродегенеративных процессов в ЦНС, снижением среднесрочной и долговременной памяти при обучении в парадигме условно-рефлекторного подавления ухаживания (УРПУ), и могут рассматриваться как модель процессов старения. У мутантов cinnabar (сп) с повышенным уровнем кинуреновой кислоты (KYNA) в тканях головы, напротив, наблюдается улучшение ряда физиологических и поведенческих параметров (Savvateeva-Popova et al., 2003). Вместе с тем, нарушения долговременной (8 сут.) памяти у самцов проявляются на стадии 13 сут. имагинального периода как у cd, так

и у сп и V (Никитина, неопубликованные данные).

Молекулярные механизмы нейрофизиологической активности кинуренинов на настоящий момент исследованы преимущественно у млекопитающих. ЗНОК в нейрональных культурах индуцирует процессы свободнорадикального окисления, вызывая гибель клеток путем апоптоза (Okuda et al., 1998). KYNA является конкурентным антагонистом ионотропных рецепторов глутамата (iGluR), с наибольшим сродством к стрихнин-нечувствительному глициновому сайту NR1-субъединицы NMDA-рецептора (NMDAR) (Kessler et al., 1989) KYNA также обладает антагонистической активностью в отношении а7 никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (nAChR) (Hilmas et al., 2001). KYN, по-видимому, может связываться с NR1 NMDAR в качестве агониста (Stone, 1991). NMDAR и АМРА-рецепторы (AMPAR) опосредованно через систему малых GTP-аз и ключевой компонент актин-ремоделирующего внутриклеточого каскада LIM-киназу 1 (LIMK1) активируют транскрипционный фактор CREB (Yang et al, 2004). CREB регулирует множество клеточных процессов и обеспечивает реализацию высших когнитивных функций ЦНС, к примеру, формирование договременной памяти у дрозофилы (Yin et al., 1995). Опосредованно через регуляцию полимеризации актина LIMK1 также модулирует процессы синаптической пластичности, лежащие в основе обучения (Savvateeva-Popova et al., 2002).

Мало изученными остаются механизмы активности кинуренинов в ЦНС дрозофилы. Мутанты с постоянно повышенным уровнем кинуренинов воспроизводят их хроническое действие на ЦНС, способное вызывать глубокие изменения в регуляторных системах организма. Последние могут быть связаны, в частности, с изменением уровня экспрессии генов рецепторов, взаимодействующих с продуктами КПОТ, а также - с пространственным перераспределением рецепторов в структурах мозга (Лопатина и др., 2007). Характер взаимодействия KYNA, KYN и ЗНОК с

1С1иК и пАСЬЯ дрозофилы не исследован. Моделирование нейродегенеративных заболеваний у кинурениновых мутантов с возможностью экстраполяции на человека получаемых данных должно опираться на точные знания молекулярных механизмов активности КПОТ. Это обусловливает необходимость исследования молекулярных процессов, опосредующих действие кинуренинов на ЦНС дрозофилы, с выяснением их сходств и отличий от аналогичных процессов у млекопитающих.

Цель работы. Целью диссертационной работы являлось изучение механизмов воздействия кинурениновых продуктов на процессы в ЦНС дрозофилы на уровне регуляции активности генов рецепторов, лиганд-рецепторных взаимодействий и активности компонентов внутриклеточных сигнальных каскадов.

Конкретные задачи исследования:

1. Оценить различия транскрипционной активности генов рецепторных субъединиц с1пг1 ¿ОГиЯ, с1<х7 и с1оЗ пАСЬЯ, а также гена с1Нтк1 у взрослых самцов кинурениновых мутантов (у, сп, ссГ) в возрасте 5 суток и 13 суток методом ПЦР в реальном времени.

2. Изучить влияние химической структуры лиганда и рецепторных аминокислотных остатков на специфичность формирования стэкинг-связи кинуреновой кислоты (К^ПЧА) с субъединицами 1С1иК крысы и дрозофилы методами квантовохимических расчетов.

3. Исследовать возможность взаимодействия ксантуреновой (ХАЫ) и антраниловой (АА) кислот, кинуренина (КУЫ) и 3-гидроксикинуренина (ЗНОК) с субъединицами ¡С1иЯ, а также взаимодействия КУМА с а7 пАСИИ. млекопитающих и дрозофилы методом компьютерного докинга.

4. Изучить распределение рСКЕВ в мозге 5 суточных имаго дикого типа и кинурениновых мутантов {сп, ее!) методом лазерной конфокальной микроскопии до и после 5 часового обучения при условно-рефлекторном

подавлении ухаживания.

5. Изучить распределение 1ЛМК1 и р-кофилина в мозге 5 суточных самцов дрозофилы методом лазерной конфокальной микроскопии.

Положения, выносимые на защиту:

1. КУЫА и ХАМ способны взаимодействовать с ЮГиЯ дрозофилы в качестве антагонистов. Специфичность воздействия КУМА на рецепторные подтипы определяется, в том числе, свойствами ее стэкинг-связи с ароматическим остатком рецепто