Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль ядерно-цитоплазматических взаимодействий в регуляции доимплантационного развития мыши

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Роль ядерно-цитоплазматических взаимодействий в регуляции доимплантационного развития мыши"

РОССИЙСКАЯ академия н А 7 к СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ СО РАН

РОЛЬ ЭДЕРНО-ЦИТОГШАЗМАТЖЕСКИХ ЮШОДВЙСТВИЙ В РЕГУЛЯЦИИ ДОИШАНТАЦИОННОГО РАЗВИТИЯ ШЛИ

Генетика - 03.00.15

Автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи УДК 575.16:591.16

ЕВСИКОВ Сергей Вадимович

Новосибирск - 1992

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии я генетики АН Украины, г.Киев

Научный руководитель - кандидат биологических наук

А.П.Соломко

Институт молекулярной биологии и генетики АН Украины, г.Киев

Официальные оппоненты - доктор биологических наук

О.Л.Серов

Институт цитологии я генетики СО РАН, г.Новосибирск

доктор медицинских наук профессор В.С.Баранов Институт акушерства и гинекологии РАМН, г.Санкт-Петербург

Ведущее учреждение: Институт биологии развития им.Н.К.Кольце

РАН, г.Москва

Защита диссертации состоится etf/tiS^ " 1992 г.

на £ f "¿-¿у // заседании специализированного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук Д-002.11.01 в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г.Новосибирск - 90, проспект академика Лаврентьева, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитология я генетики СО РАН.

Автореферат разослан

¿с/) £'уУ/ " 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

А.Л.Груздев

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Вопрос о том, через какие механизмы программа, записанная в геноме зиготы, реализует себя во взрослый организм, является центральным не только для биологии развития, его решение будет иметь принципиальное значение для всей биологии в целом. Поскольку цитоплазма яйцеклетки играет исключительно важную роль в раннем развитии всех животных (уже сам объем яйцеклетки указывает на это), то прояснение вопроса об уровнях взаимодействий ядро-цитоплазма, происходящих на первых этапах цитодиф-ференцировки и морфогенеза, представляется одним иа воз модных подходов к решению данной проблемы.

Дискуссия между преформистами и эпигенетиками разрешилась принятием идеи о том, что первичным толчком к дифференцировка клеточных линий является унаследование, в результате ооплазмаги-ческой сегрегации, определенного участка цитоплазмы зиготы. Во исследования, проводимые на млекопитающих, не подтверждают эту гипотезу. Если это действительно так, то раннее развитие млекопитающих, в филогенетическом ряду позвоночных, является в своем роде уникальным.

Первый вопрос, обсуждаемый нами, - зто вопрос о том, почему же эволюция онтогекезов, идя в направлении замены мозаичного типа развития регуляторным, лишь у млекопитающих прошла весь путь до конца. "Но для того, чтобы понять эмбриональное развитие, нас должно интересовать не только то, что происходит, но и то, когда это происходит"(БаЬоЬ, 1982). Вопрос о механизме биологических часов развития успешно решается на земноводных, но данные, полученные для млекопитающее немногочисленны и в большинстве своем противоречивы. Суть проблемы заключается в том, что ни ядерно-цитоп-лазматическое соотношение (ЯЦС), ни количество циклов репликации ДНК, ни какой-либо другой фактор клеточного цикла не является ключевым в запуске первых морфогенетических процессов у млекопитающих.

Дель и задачи исследования. Целью данной работы было изучение систем регуляции, используемых ранними зародышами млекопитающих, их сравнение с нижестоящими видами, рассмотрение закономерностей эволюционных преобразований, происходивших в филзмбриоге-незе позвоночных. В задачи исследования входило: изучение расположения бластомеров друг относительно друга, относительно оси

анизотропии ооцита, с целью выявления возможных закономерностей в дроблении зародышей; разработка метода нарушения пространственной организации морфогенетических детерминант (если таковые имеются) в цитоплазме зиготы, наблюдение га развитием аигот с перемешанной цитоплазмой. Основной задачей данной работы было изучение роли ЯЦС в запуске процесса кавитации. Для этого изучалось влияние неблагоприятных условий на развитие доимплантационных зародышей. Одним из путей прояснения роли ЯЦС в раннем развитии было наблюдение за параметрами развития гаплоидных, триплоидных зигот, зародышей с измененным объемом цитоплазмы. Изначальной целью работы по изучение влияния субоптимальных условий на процессы морфогенеза было выявление критерия жизнеспособности морул и бластоцист, развившихся in vitro. Нэ оказалось, что полученные результаты можно использовать для прояснения роли ЯЦС в регуляции раннего развития, поэтому основная часть экспериментов была спланирована для решения именно этой задачи.

Научная новизна. Разработан метод перемешивания цитоплазмы зигот млекопитающих; микроманипуляционные методы, используемые для пересадок ядер, впервые применены для получения триплоидов, зародышей с измененным объемом цитоплазмы. Впервые неопровержимо доказано, что механизм ооплазматической сегрегации не участвует в процессе дифференцировки на первых этапах развития млекопитающих. Пэказано, что ЯЦС не играет решающей роли в механизме биологических часов раннего развития млекопитающих. Обсулщены закономерности перехода от мозаичного типа развития к регуляторному, возможные причины, позволившие лишь млекопитающим пройти весь этот путь до конца.

Практическая ценность. Преодоление технических трудностей, стоящих на пути клонирования . млекопитающих, является одной из центральных практических задач экспериментальной эмбриологии. Но результаты работ, проведенных за последние 10 лет, указывают на то, что модифицировать систему такой сложности, как ядро дифференцированной клетки, просто путем его пересадки в энуклеирован-ный ооцит или зиготу, весьма маловероятно. Проведенные нами исследования взаимоотношений ядра и цитоплазмы в раннем развитии указывают на то, что, в отличие от земноводных, цитоплазма зигот млекопитающих .не обладает регуляторными свойствами и, соответственно, не способна "перепрограммировать" дифференцированный геном. Наш вывод заключается в том, что для решения проблемы клони-

рования млекопитающих необходимо привлечение других методов перепрограммирования генома, помимо пересадки ядра в энуклеиро-ванный оощгг или зиготу.

Нами показано, что подсчет числа клеток у ыорул и бластоцист, развившихся in vitro, лучше характеризует жизнеспособность зародышей, чем процент развития до морфологически нормальных бластоцист. Этот метод уже был использован нами в лаборатории IVF Illinois для проверки качества срод, используемых при in -vitro оплодотворении и культивировании человеческих преэмбрионов.

Апробация работы. Результаты, изложенные в диссертации, были представлены на Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии" (Пущино, 1988), 11-м Международном эмбриологическом конгрессе. (Нидерланды, 1989).

Публикации. Содержание работы изложено. в 9 публикациях в отечественных и зарубежных изданиях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, двух глав, заключения и выводов. Диссертация изложена на 111 стр. содержит 11 рисунков и 5 таблиц. Список литературы содержит 212 работ отечественных и аарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использованы зародыш мышей C57B1/6J, BALB/o и B6D2F1. Для трансплантации зародышей использовали псевдоберемэн-ных самок BALВ/с и ICR. Зародыши культивировали до стадии ыорул и бластоцист при 37° С на пластиковых чашках Петри в каплях среды . Виттена с добавлением 100 мкМ Na^-ЭДТА под вазелиновым или легким парафиновым маслом, при повышенном содержании C0¿(7.5Z) в воздухе. Число клеток у морфологически нормальных морул и бластоцист определяли по методу Тарковского (Tarkowski, 1966) или по методу Дыбана (Dyban, 1983). Достоверность различий между зародышами по скорости клеточных делений и стадии начала кавитации вычисляли с использованием критерия Стыодента (t-тест). Микро манипуляции. Часть цитоплазмы зигот удаляли при помощи микроманипуляторов Ш-2 под микроскопом "Airplival". При работе с зародышами B6D2F1 использовали инвертированный микроскоп Nikon Diaphot с оптикой дифференциального интерференционного контраста, микроманипуляторы Narishige МЭ202 и Leitz. Цитоплазму удаляли по методу, предложенному МакГратом и Солтером для энуклеации зародышей (MsGrath & Solter, 1983). После операции зародыши фотографи-

ровали и объем цитоплазмы оценивали по фотографиям; удалялось в среднем 35Z цитоплазмы. Отдельные бдастомеры 2- клеточных зародышей получали, разрушая второй бластомер прокалыванием его плазматической мембраны. Для получения бластомеров с удвоенным объемом цитоплазмы один из бластомеров энуклеировали методом МакГра-та-Солтера, после чего бластомеры сливали либо с помощью инактивированного вируса Сендай, либо электрослияния. При работе с зародышами B6D2F1 использовали метод микрохирургии, предложенный Тсунодой (Tsunoda et al, 1986). Для слияния пронуклеопласта с зиготой использовали метод электрослияния. Для перемешивания цитоплазмы зиготы на стадии двух пронуклеусов культивировали 40 мин -1 ч в присутствии ингибиторов цитоскедета: цитбхалазина В (7.5 мкг/ мл) и колцемида (0.1 мкг/мл) при 37°С. Для перемешивания цитоплазмы использовалась обычная микроинъекционная игла, к которой сбоку прижимался пьезоэлемент. Когда на пьезозлемент подается переменное напряжение (80-90 кГц, 5-15 Б), игла начинает вибрировать, при зтом ее кончик совершает круговые движения. Зигота закреплялась на присоске, иглу вводили в зиготу (плазматическая мембрана зиготы при этом не прокалывадась1), после чего на пьезоэлемент подавалось напряжение. За 10-15 сек цитоплазма зиготы перемешивалась.

Выражав глубокую благодарность Л М. Морозовой за помощь и поддержку при проведении данной работы, А. Д. Груздеву за идею оптической схемы и советы по изготовлению стереомикроскопа, С. Л. Рыбалко за помощь при работе с вирусом Сендай. Фотографии со сканирующего электронного микроскопа были получены А. В. Евсиковым. Работа в Ив-те медицинской генетики (Чикаго, Иллинойс)проводилась при финансовой и моральной поддержке д-ра Берлинского.

РОЛЬ (»ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ СЕГРЕГАЦИИ В РАЗВИТИИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

Несмотря на существование косвенных данных, указывающих на то* что ооплазматическая сегрегация не играет роли в развитии млекопитающих, каких-либо экспериментов, окончательно отвергающих или подтверждающих идею о существовании в цитоплазме зиготы мор-фогенетических градиентов, к настоящему времени нет (Davidson, 1990). Проблема видится не в том, какой тип развития (мозаичный или регуляторный) характерен для инфракдасса плацентарных. То, что зародыш млекопитающих обладают исключительно мощными регуля-торными свойствами, не требует дополнительных доказательств; хи-

мерные животные, эмбрионы с нарушенным числом клеток наглядно демонстрируют это. Вопрос лишь в том, задействованы ли наряду с регуляторной хоть какие-нибудь системы, характерные для автономной клеточной спецификации.

Если у аиготы мыши, как и у филогенетически нижестоящих видов, имеется плоскость билатеральной симметрии, или, по крайней мере, анимальный и вегетативный полюса, то плоскость первого деления дробления должна ориентироваться относительно уме предсу-ществующей оси анизотропии каким-то вполне определенным образом. При этом, поскольку второе полярное тело остается связанным с зиготой посредством серединного тела, онг, монет служить в качестве маркера оси анизотропии ооцита. По положению полярного тела относительно бластомеров 2-клеточного зародыша можно, следовательно, судить о роли анизотропии цитоплазмы аиготы в определении плоскости первого деления дробления. Оказалось, что в отсутствие внешних воздействий (со стороны zona pellucida) второе полярное тело располагается на поверхности одного из бластомеров где угодно, вне всякой зависимости от взаиморасположения бластомеров. Таким образом, связи мелзду прохождением плоскости первого деления дробления зиготы и (гипотетическим) полюсом симметрии аиготы нами не обнаружено.

После перемешивания цитоплазмы 85% зигот (77 из 91) развиваются в культуре до морул и бластоцист, по скорости дробления, морфогенеза и стадии начала кавитации не отличаются от контрольных зародышей (Таблица). В нескольких экспериментах, через 24 ч. после перемешивания цитоплазмы, 2-клеточные зародыши пересаживали в яйцевод самок первого дня псевдобеременности. Из 12 зародышей, пересаженных забеременевшей самке, три развились до нормальных мышат. Таким образом, можно сделать вывод, что перемешивание ци- I гоплазмы зиготы никак не сказывается на развитии зародыша. Ш нашему мнению, полученный результат является наиболее показательным подтверждением того факта, что в цитоплазме зигот мыши нет прело-кализации информационных детерминант, ответственных за различные направления дифференцировки клеточных линий.

При некоторых типах развития эмбриональная ось формируется- в зависимости от прохождения плоскости первого деления дробления

(Davidson, 1990). Поскольку собственный геном зародыша начинает работать на 2-клеточной (мышь) или 8-16-клеточной (кролик, овца, корова, человек) стадиях, регуляция развития от момента оплодотворения до включения генома осуществляется целиком и полностью факторами цитоплазмы зиготы. Итак, кажется уместным рассмотреть, как цитоплазма зиготы осуществляет функцию, наличие которой не вызывает сомнений, а именно - временную и пространственную регуляцию первых делений дробления. Бластомеры 4-клеточного зародыша расположены крест-накрест. Это позволило предположить, что у млекопитающих реализуется "ротационный" тип дробления, при котором плоскость деления одного из бластомеров перпендикулярна плоскости предыдущего деления (Gulyas, 1975; Graham & Deussen, 1978). С таким выводом трудно согласиться, поскольку в наших экспериментах по удалению прозрачной оболочки (zona pellacida) дробление зародышей происходит совершенно неупорядочено: вплоть до начала компакт из ации бластомеры формируют все возможные структуры, начиная от цепочки клеток, расположенных одна за другой, до вполне компактных 8-клеточных зародышей, неотличимых от контрольных, развивающихся в zona pellucida. Взаиморасположение бластомеров до начала компактизации никак не сказывается на дальнейшем развитии зародыша. Из этих наблюдений следует, что помимо участия в формировании блока полиспермии и защите зародыша при его прохождении яйцевода, у zona pellucida есть еще одна функция: некоторое упорядочение массы бластомеров на 4- и 8- клеточных стадиях. Наш вывод заключается в том, что в раннем эмбриогенезе млекопитающих нет какого-либо заданного типа дробления. Цитоплазма обеспечивает последовательное прохождение бластомерами клеточных циклов, задает их продолжительность, но не более того.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ЧАСЫ РАННЕГО РАЗВИТИЯ МЛЕКОПИТАЮЩИХ РОЛЬ ЯДЕРНО-ЦИТОПЛАЭМАТИЧЕСКОГО СООТНОШЕНИЯ Нас будет интересовать вопрос о том, каким образом определяется момент образования полости бластоцели. На роль факторов, ответственных за запуск кавитации, были предложены межклеточные вааимодействия, число клеток в зародыше (объем клеточной массы), число клеточных делений (цитокинез и/или кариокинез), количество циклов репликации ДНК, ядерно-цитоплазматическое соотношение, абсолютное время развития зародыша В той или иной форме все эти I гипотезы уже были подвергнуты экспериментальной проверке. И ре-

аультаты оказывались однозначно негативными: ни один из вышеперечисленных факторов не является ключевым в запуске кавитации. Двусмысленность такого результата состоит в том, что данный список факторов перекрывает все мыслимые системы регуляции морфоге-нетических процессов. То, что ни абсолютное число клеток, ни межклеточные взаимодействия, ни количество циклов карио- или цитокинеза не входят в механизм биологических часов развития, не вызывает к настоящему времени ни малейшее сомнений. Гипотеза о том, что необходимым условием запуска кавитации является достижение определенного ядерно-цитоплазмдтического соотношения (ЯЦС), представляет для нашего обсуждения особый интерес, ибо предполагает налйчие у цитоплазмы функций, утерянных, по нашему мнению, в ходе эволюции плацентарных млекопитающих. Состоит гипотеза в следующем. Поскольку объем доимплантационного зародыша не изменяется, при каждом делении дробления количество цитоплазмы, приходящейся на диплоидный геном, уменьшается вдвое. То есть, с каждым делением ЯЦС удваивается. Если механизм биологических часов включает в себя какие-либо системы взаимодействия ядра и цитоплазмы (например, на уровне титрования какого -либо регуляторного фактора), то ЯЦС вполне момэт оказаться фактором, влияющим на программу развития зародыша.

Имеющиеся в литературе данные по обработке зародышей ингибиторами синтеза ДНК одноаначно указывают на отсутствие непосредственной причинно-следственной связи между репликацией ДНК, ЯЦС и морфогенетическими превравдэниями раннего зародыш мыши. На, как и в случае ооплазматической сегрегации, рассмотренной выше, такой вывод требует интенсивной перепроверки другими методами перед его окончательным принятием. На необходимость иных подходов указывает и гот факт, что ингибирование репликации ДНК не является абсолютно корректным подходом для изучения развертывания программы развития: ведь воздействуя непосредственно на ДНК, мы молем изменить эту программу. При изучении роли ЯЦС в запуске компагеги-зации и кавитации можно испольаовать результаты развития полиплоидных и гаплоидных зародышей, зародышей, развивающихся в субоптимальных условиях, а также зародышей с экспериментально измененным объемом цитоплазмы.

Несмотря на то, что зародыши некоторых линий мышей могут успешно проходить все стадии доимплантационного развития in vitro,

Таблица. Зародыши различных линий мышей на третьи сутки развил (В скобках приведены количества зародышей)

Линия Типы зародышей, стадия

зародышей начала культивирования

Возраст зародышей, в ч после овуляции

МОРУЛЫ И бЛс (скорость Д1

C57B1/6J

in vivo

80

32.0 + 0. Е

C57B1/6J

BALB/c B6D2F1

1М VI тш

2-клеточные 90

Зиготы 90

Зиготы с перемешанной цитоплазмой 90

Зиготы с уменьшенным объемом цитоплазмы 90

1/2-бластомеры 90

1/2-бластомеры с

удвоенным объемом

цитоплазмы 100

гаплоиды 90

гаплоиды с уменьшенным объемом цитоплазмы 90

2-кдеточяые 90

2-клеточные 80

Зиготы 85

1/2-бластомеры с

удвоенным объемом

цитоплазмы 95

гаплоиды 85

триплоиды 85

29. 8 + О. 7 26.1 + О. 4

26 + 1

21.1 + о.е

14.8 + 0.4

21 + 1 8 + 1

13 + 1 27. 2 + О. 7

42 + 2 33. 5 + 0.5

27 + 1 12 + 2 22 + 1

числю клеток

ранние бластоцисты Процент бластоцист

(стадия начала кавитации) (скорость морфогенеза)

33. 6 + 0.5 С116] 65 + 3

30.0 + 0.5 С 78] 28.2 + 0.2 С198]

27 + 2 [14]

23.0 + 0.6 [72] 15.7 + 0.4 [95]

71+4 72 + 2

79 + 5

59 + 4 69 + 4

26 + 2 [30]

52 + 5

31.2 + 0.7 [76]

39 + 2 [20] 33.9 + О. 5 [175]

54 + 4

83 + 4 79 + 2

27.5 +0.8 [50]

74 + 4

26 + 1 [12]

32 + 8 9

их развитие при атом замедляется (Bowman & Mo Laren, 1970). Это неудивительно: воссоздать условия развития, существующие in vivo, мы пока что не в состоянии. Но тот факт, что зародыши все-таки способны развиваться в неблагоприятных условиях, предоставляет уникальную возможность изучать зависимость морфогенетических процессов от клеточных делений: если запуск кавитации зависит от количества циклов репликации ДНК, ЯЦС, то при замедлении скорости дробления зародыша будет задерживаться и образование бластоцели. Бластоцель начнет образовываться на той же 32-клеточной стадии, что и in vivo; по абсолютному времени, прошедшему с начала развития, это будет происходить ровно на столько же позже, насколько зародышу потребуется больше времени на прохождение 5 делений дробления. С другой стороны, если окажется, что факторы, ответственные за образование бластоцели и клеточный цикл, между собой не связаны, то изменение условий развития будет разрушать згу псевдовзаимосвязь между 32-клеточной стадией и запуском кавитации.

Соответствующий эксперимент мы провели на зародышах мышей B8D2F1, C57B1/6J и BALB/c. Изучали скорость дробления, скорость морфогенеза и стадии начала кавитации у зародышей, развивавшихся либо in vivo, либо культивируемых с двуклеточной стадии или стадии зиготы. Результаты представлены в Таблице. Неблагоприятные условия развития in vitro достоверно (Р<0.001) замедляют как скорость морфогенеза, так и скорость клеточных делений. Результаты, приведенные в Таблице, с большой степенью достоверности указывают на то, что достижение 32-клеточной стадии не является необходимым условием запуска кавитации: уменьшение числа клеток у зародышей в целом сопровождается уменьшением числа клеток и у ранних бласто-цист. Предположение о том, что уменьшение числа клеток у зародышей, развивающихся в культуре, связано с повышенной клеточной смертностью, наши результаты не подтверждают: ни в одном случае число пикнотических ядер не превышало 0. 2 на зародыш.

Тот факт, что стадия развития зародыша, на которой происходит запуск образования бластоцели, зависит от условий развития, линии мышей, указывает на то, что прямой зависимости данного мор-фогенетического процесса от факторов клеточного цикла нет. Ухудшение условий развития приводит к некоторому запаздыванию образования бластоцели, но кавитация начинается в соответствии с какими-то своими биологическими часами, при том количестве клеток,

которое имелось у зародыша на момент запуска этой морфогенети-ческой программы.

Гаплоидные морулы, подученные нами после микрохирургического удаления одного из пронуклеусов, по числу клеток значительно отставали от нормы, образования бластодели не наблюдалось никогда (Таблица). Можно принять гипотезу, что образования бластоцист не произошло по той причине, что гаплоиды погибают раньше, чем успевают пройти 6 делений дробления и достигнуть ЯЦС, соответствующего запуску кавитации. Относительно же регуляцкя процесса компак-тизации можно сделать более определенный вывод. То, что гаплоиды начали компактизацию при меньшем (а не в два раза большем) числе клеток, чем диплоиды, свидетельствует о независимости запуска компактиаации от ЩС.

Триплоидные зародыши могут быть получены при слиянии зиготы с пронуклеусом (точнее, пронуклеопластом) от другой зиготы. Такой эксперимент был впервые осуществлен нами, из 38 триплоидов все развились до морул и бластоцист. Результаты развития триплоидных зародышей приведены в Таблице. Контрольные диплоидные зародыши начинают образование Оластоцеди на 33.5+0. 5-клеточной стадии. У триплоидных зародышей соответствующее ЯЦС будет достигаться к 34x2/3=23 - клеточной стадии. Полученное число клеток для триплоидных ранних бластоцист, 26+1, не находится в противоречии с гипотезой о решающей роли ЯЦС в запуске кавитации. На в такой же мере нет противоречия и с гипотезой о том, что биологические часы отсчитывают абсолютное время, прошедшее с начала развития: трип-лоиды начинают образовывать бластоцель даже с запаздыванием по сравнению с контролем (см. Таблицу). Скорость дробления триплоидов также замедлена: к 85-му часу после овуляции триплоид имеет порядка 20 клеток, диплоид - 34. Но тогда меньшее число клеток у триплоидных ранних бластоцист (26, а не 34) может объясняться тем, что к моменту запуска кавитации зародыш имеет меньше клеток, чем диплоидный контроль.

Результаты нашей работы по уменьшению объема цитоплазмы у зигот представлены в Таблице. Результаты этого эксперимента допускают интерпретацию с точки зрения регуляторной роли цитоплазмы. В самом деле, ЩС, соответствующее стадии запуска кавитации, при уменьшении объема цитоплазмы будет достигаться после меньшего

числа клеточных делений. Действуя 'по принципу reductio ad absurdum, мы увеличили ЯЦС до максимума, оставив на культивирование кариопласты зигот. Некоторые кариопласты через сутки были двуклеточными, но дальше развитие не пошло. Этот эксперимент, по нашему мнению, особенно наглядно показывает, что основная роль цитоплазмы - это поддержание жизнедеятельности ядра.

Поскольку один бластомер 2-клеточного зародыша мыши (1/2-бластомер) способен развиться до нормального мышонка (Tarkowski, 1959), можно считать его вполне жизнеспособным эмбрионом. По нашим данным, к 90-му ч. после овуляции 70% зародышей, развившихся из 1/2-бластомеров, начинали накапливать бластоцель, при этом среднее число клеток у ранних бластоцист было ровно в два раза меньше, чем у контрольных'зародышей, развивающихся in vitro с 2-клеточной стадии (Таблица). Эти результаты подтверждают данные об отсутствии влияния на развитие бластомера того, что он остался один (O'Brien et al, 1984; Rands, 1985).

Мы сравнили развитие 1/2-бластомеров с развитием 1/2-бласто-меров с удвоенным объемом цитоплазмы. Жизнеспособность таких зародышей была продемонстрирована ранее (Barra & Renard, .1988). Из 239 оперированных нами зародышей C57B1/6J бластомеры слились у 138, из них 113 (82%) развились до морул и бластоцист. К 90-му ч. после овуляции лишь 6Х зародышей начали образовывать бластоцель. Следует подчеркнуть, что число клеток у морул и бластоцист к этому сроку было таким же, как и у контрольных, развившихся из 1/2-бластомеров. Таким образом, скорость клеточных делений после уменьшения ЯЦС не изменяется. Среднее число клеток у ранних бластоцист - 26+2 (Таблица). После удвоения объема цитоплазмы у i/2-бластомеров B6D2F1, 89%. (133 из 149) развились к 90-100 часу после овуляции до морул и бластоцист. Скорость дробления и стадия начала кавитации этих зародышей представлены в Таблице, результаты аналогичны полученным на зародышах линии C57B1/6J.

Контролем к оперированным зародышам служат 1/2-бластомеры, хотя по ЯЦС бластомер с удвоенным объемом цитоплазмы соответствует зиготе. Возраст зародышей, при котором начинается образование полости бластоцели, не дает никаких указаний на то, какой из факторов,- абсолютное время, прощедшее с начала развития, или ЯЦС,-играют решающую роль в запуске кавитации. Если у 1/2-бластомеров линии C57B1/6J 70% бластоцист развились через 50 ч. культивирова-

ния, у зигот - через 75 ч., то оперированные зародыш развивались до этой стадии 60-65 ч. Но по стадии начала кавитации зародыши, развившиеся из бластомеров с удвоенным объемом цитоплазмы, ближе зиготам, чем 1/2-бластомерам (Таблица).

Предположение, наиболее близкое к нашему, высказанное по поводу биологических часов раннего развития млекопитающих, заключается в том, что доимплантационное развитие регулируется на двух уровнях: "программа ооцита" запускается при созревании ооцита и ответственна за бааисные (housekeeping) функции клетки; проникновение же сперматозоида активирует "программу оплодотворения", направляющую эмбриогенез (Howlett & Bolton, 1985). Наша гипотеза сводится к тому, что доимплантационное развитие млекопитающих контролируется двумя часами: "цитоплазматическими часами" регулируется продолжительность клеточных циклов, а "генетические часы" ответственны за процессы цитодифференцировки и запуск морфогене-тических событий.

Or момента разрушения зародышевого пузырька и до двуклегоч-ной стадии геном зародыша мыши "молчит"; все процессы, связанные с завершением созревания ооцита, оплодотворением, первым делением дробления, запуском работы генома, регулируются программой цитоплазмы (Van Blerkom, 1985). Как и у земноводных, в энуклеированных ооцитах или зиготах мыки проявляется цитоплазматическая активность, "автономная кортикальная аотивность", по времени совпадающая с первым делением дробления интаотных зигот (Vaksmundzka et al. 1984). Этот факт вполне соответствует представлениям о том, что цитоплазма ооцита - это некая "базисная", эвояюционно консервативная структура (Нага et al. 1980): проявления активности ци-топлазматических часов наблюдаются у всех хордовых, от асцидии до мыши.

Результаты навей работы и данные литературы подтверждают точку зрения о независимости запуска гравитации от факторов клеточного цикла, т.е., указывают на присутствие в раннем развитии мьшш еще одного типа биологических часов. О "генетических" часах мы достоверно знаем лишь то, что они отсчитывают абсолютное время, прошедшее с начапа(?) развития, и не зависят ни от циклов репликации ДНК, ни от ядерно-цитоплазматичесгаэго соотношения. Молекулярный механизм "генетических часов" неясен, непонятно даже, какая роль отводится геному в работе этих часов. Основная же за-

дача нашей работы была в той, чтобы проследить зависимость образования бластоцели от ядерно-цитоплазматического соотношения.

Тот факт, что зародыши, развивающиеся in vitro, начинают образовывать бластоцель при меньшем числе клеток, чем in vivo (Таблица), указывает на независимость запуска кавитации ни от количества циклов репликации ДНК, ни от ядерно-цитоплазматического соотношения. Другими словами,- механизмы морфогенеза и цитокинеза относительно независимы друг от друга. Что касается относительной роли ядра и цитоплазмы в регуляции этих процессов, то здесь выводы могут быть следующие. Любое изменение условий развития зародыша млекопитающего может быть только ухудшением (это достаточно очевидно). Замедление развития в культуре связано, скорее всего, с неспецифическим снижением скоростей метаболизма. В первую очередь будут замедляться процессы, запуск которых в меньшей степени зависит от ядра, поскольку цитоплазма играет роль "буфера" между средой и ядром. Из данных Таблицы мы, видим, что наиболее заметное влияние экспериментальные воздействия оказывают на скорость дробления зародышей. По-видимому, процессы цитокинеза в большей степени зависят от "цитоплазмагических часов", механизм которых основан на каких-то осцилляторах цитоплазмы (Murray & Kirschner, 1989; Murray et al. 1939), а не на геномной активности или ядерно -цитоплазматических взаимодействиях. С другой стороны, транскрипция и трансляция для запуска кавитации заканчиваются лишь за несколько часов до начала образования бластоцёли (Kidder & kfcLachlin, 1985), указывая на значительно большую роль ядра в запуске этого процесса, чем в случае дробления. Скорее всего, именно с этим связана наблюдаемая нами относительная независимость кавитации от условий развития. Данный результат был первой причиной, по которой вместо термина "морфогенетические часы" мы использовали более конкретный термин "генетические часы".

Уменьшение объема цитоплазмы у зигот не влияет на время появления бластоцист, но уменьшает скорость дробления. Зато при уменьшении ЯЦС наблюдается обратная картина: удвоение объема цитоплазмы не сказывается на скорости дробления, но задерживает образование бластоцели (Таблица). Это еще раз указывает на то, что клеточные деления и образование бластоцели - независимые процессы, регулирующиеся на различных уровнях.

На основе имеющихся данных вырисовывается следующий принцип действия молекулярных механизмов "генетических часов". Шсле на-

тала транскрипции первого комплекса генов каждая последующая программа, лежащая за "point of no return" по Дгонсону (Johnson, 1981), может быть запущена лишь после того, как произведено некое мбрфогенетическое действие, например, достигнута определенная концентрация белков-продуктов реализации предшествующей программы. фи уменьшении объема цитоплазмы замедляется спорость пост-транскрипционного биосинтеза, но одновременно уменьшается и количество каждого белка, необходимое для достижения его определенной концентрации в цитоплазме. Это приводит к тому, что на разных стадиях развития отдельные морфогенетические процессы могут как ускоряться, так и замедляться. Например, процесс формирования мужского пронуклеуса ускоряется при уменьшении объема цитоплазмы ооцита (Borsuk & Manka, 1988). Некоторое замедление образования бластоцели (Таблица) указывает на то, что уменьшение объема не компенсирует негативных последствий удаления части систем жизнеобеспечения. При увеличении объема цитоплазмы, приходящейся на диплоидный геном, лимитирующим фактором будет, очевидно, мРНК. В этом случае время для наработки необходимого количества транскриптов увеличится и, соответственно, образование бластоцели будет задерживаться (Таблица). (Следует заметить, что уже в 1964 г. подобный ход рассуждений был использован Т. Детлаф при обсуждении ею регуляции процесса гаструляции у рыб и земноводных (Dettlaff, 1964).

Рассмотренные нами принципы работы "генетических часов" развития не дают никаких указаний на то, какие конкретные молекулярные механизмы осуществляют отсчет времени. '■ Вполне вероятно, что репликация ДНК входит каким-то образом в механизм регуляции транскрипционной активности генома (Petzoldt, 1984). Поскольку для образования бластоцели необходимо, . чтобы за несколько часов до начала этого процесса прошла и транскрипция, и трансляция не-: которых веществ,'- то репликация ДНК может быть одной из составляющих механизма биологических часов. Выяснение относительной доли и временных параметров геномной активности в работе механизма "генетических часов" представляется нам более перспективным, чем попытки увязать напрямую количество циклов репликации или определенное ядерно-цитоплазматическое соотношение с процессами доимплантационного морфогенеза.

выводы

1. Показано, что в цитоплазме зигот млекопитающих нет прело-кализации морфогенетических детерминант, которые могли бы быть ответственны за первые этапы цитодифференцировки. Зиготы с перемешанной цитоплазмой успешно проходят полное развитие до нормальных и плодовитых мышат.

2. Какой-либо закономерности в дроблении зародышей мыши не наблюдается. Это указывает на то, что ни факторы цитоплазмы, ни цитоскелет зигот не участвует в формировании пространственной организации ранних зародышей.

а Рассмотрение систем регуляции раннего эмбриогенеза в типе Хордовых позволило прийти к заключению, что окончательный переход к регуляторному типу развития становится возможным лишь в тот момент, когда в эволюции онтогенеза по пути максимально возможной автономизации осуществляется переход к внутриутробному развитию, сопровождающемуся формированием плаценты.

4. Ори замедлении скорости дробления зародыша образование бластоцели начинается после меньшего числа клеточных делений, что указывает на отсутствие решающей роли ядерно-цитоплазматичес-кого соотношения в запуске первых морфогенетических процессов.

5. Изучение развития гаплоидных, триплоидных зигот, зародышей с экспериментально измененным объемом цитоплащмы, позволило предположить, что в раннем развитии млекопитающих участвуют два типа биологических часов: "цигоплазматические часы" регулируют продолжительность клеточных циклов, а "генетические часы" ответственны за процессы цитодифференцировки и за запуск морфогенетических процессов.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ

1. Евсиков С. Е , Морозова Л.М., Соломко А.Е Разработка подходов к клонированию млекопитающих. Изучение потенций бластомеров начальных стадий развития зародышей мышей // Тезисы докладов. Всесоюзная конференция "Новые направления биотехнологии". -1988. -Пущино.

2. Evsykov S. V., Morozova L. M., Solomko A. P. Role of the nuoleocytoplasmic ratio in the mouse blastocyst formation // Cell Differentiation Develop. - 1989. - v. 27suppl.

3. Евсиков С. В., Морозова JL Ы., Соломко A. IL Роль ядерно-ци-топлазматического соотношения в регуляции развития млекопитающих. Развитие зигот с уменьшенным объемом цитоплазмы // Биополимеры и Клетка. - 1989.- Т. 5.- N.5.

4. Евсиков С. R , Морозова JL М., Соломко А. Е Роль ядерно-ци-топлазматического соотношения в регуляции развития млекопитающих. Развитие зародышей с удвоенным объемом цитоплазмы // Биополимеры и Клетка - 1990. - Т. 6. - N. 3.

5. Evsikov S. V., Morozova L. M., Solomko A. P. The role of the nuoleocytoplasmic ratio in development regulation of the early mouse embryo // Development. - 1990. - v. 109. - N. 2.

6. Evsikov S. V., Cieslak J., Verlinsky У. Fertilization of human oocytes by sperm microinjection and electrofusion // J. of I VF and Errbryo Transfer. - 1990. - v. 7. - N. 4.

Подписано к печати 26.03.92

Формат бумаги 6x9 I/I6 Печ.л. I. Уч.-изд.л. 0,7

Тираж 110 экз. Заказ 54

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН

630090, Новосибирск, проспект академика М.А.Лаврентьева, 10

"■ч