Морфофункциональные особенности эмбрионов мыши на двуклеточной стадии развития, анализ двуклеточного блока in vitro

Боголюбова, Наталья Алексеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Морфофункциональные особенности эмбрионов мыши на двуклеточной стадии развития, анализ двуклеточного блока in vitro
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Морфофункциональные особенности эмбрионов мыши на двуклеточной стадии развития, анализ двуклеточного блока in vitro"

На правах рукописи

РГБ ОД

БОГОЛЮБОВА Наталья Алексеевна

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ЭМБРИОНОВ МЫШИ НА ДВУКЛЕТОЧНОЙ СТАДИИ РАЗВИТИЯ. АНАЛИЗ ДВУКЛЕТОЧНОГО БЛОКА IN VITRO.

03.00.25

клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2000

Работа выполнена в Институте цитологии РАН,

Санкт-Петербург

Научные руководители: кандидат медицинских наук

Г. Г. Секирина

доктор биологических наук В.Н. Парфенов

Официальные оппоненты: Заслуженный деятель науки,

доктор биологических наук, профессор А.П. Дыбан НИИ экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург.

доктор биологических наук, профессор Б.Н. Кудрявцев Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург.

Ведущее учреждение: Биолого-почвенный факультет

Санкт-Петербургского государственного университета

Защита состоится « 7 » июля 2000 года в 13 час на заседании Диссертационного совета Д. 002.73.01 Института цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАИ

Автореферат разослан «.Об » июня 2000 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета

Д.6.Н. е ¡Ь^Т^ Л-И-П,,сарева

Е 633.$ о

££ М. 3,0.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Доимплантационный период эмбриогенеза млекопитающих характеризуется наличием нескольких критических этапов развития, в течение которых происходят принципиальные изменения морфофункционалыгого состояния зародышей. В частности, к ним относят активацию эмбрионального генома, а также начальные формообразовательные процессы (компакти-зацию и кавитацию) [1,2].

Известно, что у различных видов млекопитающих активация эмбрионального генома осуществляется на разных стадиях доимплан-тационного развития [3]. В эмбриогенезе мыши основные события активации эмбрионального генома происходят на протяжении второго клеточного цикла, что дает основание рассматривать двукле-точную стадию развития как одну из критических.

Последовательность молекулярно-генетических преобразований, связанных с активацией эмбрионального генома, и принципы действия контролирующих ее механизмов, подробно изучены [4,5,6], в то время как структурная организация и физиологическое состояние эмбрионов на двуклеточпой стадии охарактеризованы неполно. Вместе с тем, анализ морфофункционального состояния двуклеточ-ных зародышей позволил бы изучить начальные этапы становления ядерно-цитоплазматических взаимоотношений и дефинитивных морфологических черт организации ряда клеточных структур. В частности, такой подход дает возможность выявить связь между последовательным изменением организации цитоплазмы эмбрионов и их способностью успешно развиваться in vitro. Подобные исследования могут проводится как на интактных зародышах, так и на модельных системах - соматических гибридах бластомсров двуклеточных зародышей. Метод соматической гибридизации позволяет комбинировать в составе гибридной клетки цитоплазму и ядра партнеров, находящихся в различном морфофункциональном состоянии. Подобный подход дает возможность проводить цитологический анализ процесса интеграции этих клеточных компонентов и становления ядерно-цитоплазматических отношений при формировании и развитии соматических гибридов.

Известно, что качественные изменения транскрипционной и синтетической активности, связанные с активацией эмбрионального генома, приводят к повышению чувствительности двуклеточных зародышей к действию внешних факторов [7]. Анализ развития заро-

дышей в культуре показал, что эмбрионы мышей определенных генотипов не способны проводить полное доимплантационное развитие вне материнского организма. Культивируемые в стандартных синтетических средах эмбрионы, полученные путем внутрили-нейного скрещивания, в отличие от зародышей гибридных генотипов, о|гганавливаются в развитии на границе фаз G2/M второго клеточного цикла. Этот феномен, получивший название «двуклеточ-ного блока in vitro» [8], проявляется при культивировании эмбрионов, извлеченных из материнского организма до завершения активации эмбрионального генома [9]. Показано, что предрасположенность к двуклеточному блоку in vitro определяется генотипом яйцеклетки и отражает действие на ранние этапы развития материнских цитоплазматических контролирующих механизмов [10,11]. В связи с этим даже успешно дробящиеся в культуре эмбрионы мышей разных генотипов в конце двуклеточной стадии обладают неодинаковыми потенциями к дальнейшему развитию: они оказываются либо компетентными к нему, либо предрасположенными к «двуклеточному блоку in vitro». Подобная ситуация позволяет провести сравнительный анализ морфофункционального состояния эмбрионов, обладающих различными потенциями к развитию in vitro.

Особый интерес здесь представляет изучение событий, происходящих в цитоплазме и оказывающих пря мое влияние на способность зародышей развиваться in vitro. Реорганизация цитоплазмы в этом случае создает необходимые условия для нарастания синтетической активности эмбрионов, и, в конечном счете, отражает процесс переключения контроля развития с материнской программы на эмбриональную. С этой точки зрения, актуальным представляется изучение функциональной роли митохондрий на начальных этапах эмбриогенеза.

Анализ поведения митохондрий на широком круге объектов [12,13,14] с одной стороны, и накапливающиеся данные об ассоциации митохондрий с компонентами цитоскелета [15,16] и закономерностях их перемещения в ходе клеточного деления и цитодифферен-цировки [17,18] с другой, позволили допустить существование механизмов активного регулирования внутриклеточной локализации митохондрий при изменении морфофункционального состояния клеток [19]. Однако, в рамках изучения раннего эмбриогенеза млекопитающих, все эти вопросы исследованы недостаточно подробно. Работы, выполненные еще в семидесятых годах сформировали пред-4

ставление о двуклеточной стадии развития млекопитающих как о стадии, для которой характерны отсутствие митохондрий обладающих ортодоксальной структурой и низкая метаболическая активность этих органелл [20], в то время как все энергетические потребности эмбриона покрываются за счет расходования запаса АТФ, накопленного в процессе оогенеза [21]. Вместе с тем, данные, полученные в течение последних лет свидетельствуют о функциональной активности таких, еще не имеющих дефинитивной организации, митохондрий и наличии их специфического перераспределения на одно-четы-рехклеточной стадиях развития [22,23]. Сведения такого рода представляют несомненный интерес, поскольку становится все более очевидным [9,22], что существует связь между способностью зародышей осуществлять организованное и специфическое изменение внутриклеточной локализации митохондрий и способностью успешно проходить первые деления дробления [22,23).

Цель н задачи исследования. Исходя из вышеизложенного, основная цель работы состояла в прижизненном изучении структурно-функциональной организации эмбрионов мыши различных генотипов на двуклеточной стадии развития, соответствующей периоду активации эмбрионального генома. Конкретные задачи исследования сводились к следующему:

1. Провести анализ влияния эксплантации эмбрионов разных генотипов, находящихся на различных этапах активации эмбрионального генома, на потенции к их дальнейшему развитию in vitro.

2. Исследовать динамику локализации митохондрий на протяжении двуклеточной стадии развития у эмбрионов мышей разных геногипов, обладающих неодинаковыми потенциями к развитию in vitro.

3. Изучить перераспределение митохондрий в бластомерах зародышей, разное время находящихся в состоянии «двуклеточного блока in vitro».

4. Сопоставить динамику внутриклеточной локализации митохондрий, наблюдаемую у эмбрионов в состоянии генетически предопределенного «двуклеточного блока in vitro» и в ходе остановки их развития на стадиях G, и G2 второго клеточного цикла, вызванной действием ингибиторов клеточной пролиферации.

5. Исследовать взаимосвязь между процессом интеграции цитоплазмы и ядер при соматической гибридизации бластомеров двукле-точных эмбрионов разных генотипов и способностью таких реконструированных зародышей к дальнейшему развитию in vitro.

Основные положения, выносимые на защиту:

- характерной особенностью локализации митохондрий двукле-точных зародышей мышей, компетентных к полному доимпланта-ционному развитию, является их повышенная концентрация вокруг ядер (в виде тонкого кольца) и в зоне прилегания бластомеров. Вне указанных зон митохондрий распределены диффузно.

- локализация митохондрий в перинуклеарной зоне обусловлена особым морфофункциональным состоянием ядра, связанным с активацией эмбрионального генома и начальными этапами формирования ядрышек, а также спецификой ядерно-цитоплазматическо-го транспорта у двуклеточных зародышей, у которых транспорт веществ в цитоплазму осуществляется не только через поровые комплексы, но и путем блеббинга ядерной мембраны.

- эмбрионы, предрасположенные к блоку и прекратившие при культивировании развитие в конце G2 фазы второго клеточного цикла, обладают иной, чем эмбрионы, компетентные к развитию, топографией митохондрий в клетках: у них отсутствует перинуклеар-ная локализация митохондрий и наблюдаются многочисленные ми-тохондриальные кластеры, распределенные по всему объему бластомеров.

развитие состояния «двуклеточного блока in vitro» сопровождается перераспределением митохондрий в бластомерах, пространственные и временные параметры которого специфичны для эмбрионов разных генотипов.

- формирование продукта слияния бластомеров не сопровождается интенсивным перемешиванием цитоплазмы и слиянием ядер. В отличие от процесса миграции пронуклеусов во время формирования зиготы, перемещение ядер к центру дикариона не вызывает увеличения концентрации митохондрий в перинуклеарных зонах. Полное объединение партнеров слияния и образование соматического гибрида осуществляется на стадии метафазы первого деления дробления.

Научная новизна и практическое значение работы. Методами прижизненной люминесцентной и фазово-контрастной микроскопии, соматической гибридизации бластомеров двуклеточных эмбрионов и цитогенетаческого анализа, проведено сравнительное исследование локализации митохондрий в бластомерах у зародышей мышей разных генотипов, различающихся по способности к развитию in vitro.

Впервые показано, что локализация и функциональное состоя-

ние митохондрий в бластомерах двуклеточных эмбрионов отражают процесс морфофункциональной реорганизации ядра, сопровождающей активацию эмбрионального генома. Установлено, что характер распределения митохондрий на средней и поздней двуклеточ-ной стадии развития эмбрионов позволяет прогнозировать успешность прохождения ими второго деления дробления. Найдено, что митоз способны осуществить эмбрионы с диффузным распределением в цитоплазме функционально активных митохондрий и небольшой их концентрацией в перинуклеарой и кортикальной зонах бла-стомеров. В то же время формирование в цитоплазме эмбрионов многочисленных митохондриальных кластеров сопровождает остановку их развития на двуклеточной стадии. Обнаружено, что при блокировании дробления с помощью генистеина и мимозина, зародыши сохраняют перинуклеарную концентрацию митохондрий, отсутствующую у эмбрионов в состоянии «двуклеточного блока in vitro». Последние характеризуются наличием в цитоплазме бластомеров периферически расположенных, разнообразных по размеру митохондриальных кластеров.

Методами прижизненной люминесцентной микроскопии, поэтапно прослежены события, происходящие при формировании продукта слияния бластомеров и последующем делении тетраплоидно-го соматического гибрида.

Впервые показано, что формирование продукта слияния двуклеточных бластомеров мыши не сопровождается интенсивным перемешиванием цитоплазмы и слиянием интерфазных ядер. Полная интеграция партнеров слияния осуществляется на стадии мстафазы, во время которой хромосомы обоих партнеров располагаются на общем веретене деления. Цитогенетический анализ подтвердил возможность асинхронного прохождения первого деления дробления блас-томерами гетраплоидных соматических гибридов - аналогично тому, что наблюдается у интактных диплоидных зародышей. Показано, что способность бластомеров к слиянию зависит от стадии клеточного цикла, на которой они находятся, и синхронности его прохождения обоими партнерами.

На основе комбинации методов фазово-контрастной и люминесцентной микроскопии предложена тест-система, обеспечивающая быстрый прижизненный анализ морфофункционального состояния ранних зародышей млекопитающих.

Полученные в работе данные могут быть включены в курсы лекций для студентов высших учебных заведений, специализирующих-

ся в области клеточной биологии и биологии развития.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Международных симпозиумах «Биология клетки в культуре» (С-Петербург 1993,1994 г.). Международном симпозиуме «Механизмы развития:

онтогенетические и эволюционные аспекты», (Москва 1994 г.). Всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра», (С.-Петербург, 1997 г.), Европейских симпозиумах по клеточной биологии Ренне,Франция,1993 г., Прага,Чехия 1994 г., Брайтон, Великобритания 1997 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ.

Объем н структура диссертации. Работа изложена на т страницах и состоит из введения, Ц глав и выводов.

Диссертация иллюстрирована -49 рисунками и включает -/ таблиц. Список цитируемой литературы насчитывает источников, в том числе - на русском языке.

Автор посвящает работу памяти своего первого научного руководителя Галины Григорьевны Секириной, безвременно ушедшей из жизни.

Автор выражает искреннюю признательность за плодотворное сотрудничество И.О.Боголюбовой, И.Э. Негановой, Н.В. Антоновой.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные. Опыты проводили на зародышах, полученных от линейных мышей ВАЬВ/с, МП и Вк(Ш)8<=>17), а также мышей-гибридов (СВА/С57В1) (Р2).

Гормональная стимуляция. Для получения датированной беременности, индукции суперовуляции и синхронизации развития эмбрионов использовали гормональную стимуляцию самок. С этой целью самкам вводили 5-10 ИЕ сывороточного, а затем хорионического гонадотропинов с интервалом 44-48ч [24].

Возраст зародышей отсчитывали от момента введения мышам хорионического гонадотропного гормона (ХГГ). Показано, что одноклеточная стадия развития занимает период от 12 до 32 ч после инъекции гормона (в среднем около 20 ч). Длительность двуклеточ-ной стадии развития составляет 20-22 ч. [25]. Одноклеточные зародыши в возрасте 16-24 ч после введения самкам ХГГ и 24-30 ч после инъекции гормона считали находящимися на стадии средней и по-8

здней зиготы, а зародыши в возрасте 30-34 ч, 34-44 ч и 44-50 ч после введения ХГГ - соответственно на ранней, средней и поздней двукле-точной стадии развития.

Культивирование эмбрионов. Эмбрионы вымывали из яйцеводов или матки, контролируя процесс с помощью стереомикроскопа МБС-9, при использовании манипуляционных сред НТ6 [26] или F10 с HEPES-буфером («Sigma»), сохраняющих стабильное значение рН 7.2 на воздухе. Извлеченные зародыши помещали в чашки Петри диаметром 40 мм в микрокапли среды под слой легкого парафинового масла (В DH). Непродолжительно (не более 1 ч) зародыши культивировали в манипуляционной среде в термостате при 37°С во влажной камере. Культивирование эмбрионов в течение более длительного срока (1 сут и более) осуществляли в средах М16 [27] или F10 без IIEPES-буфера. Обе среды содержали бычий сывороточный альбумин (5 мг/мл) и ЭДТА (10.8 мкмоль/мл). Зародыши культивировали в С02-ипкубаторе (Flow) при 37° С. Концентрация С02 составляла 5%.

Светоооптический анализ морфо-функционального состояния зародышей.

Предварительную оценку морфологии и стадии развития зародышей, а также их прижизненное фотографирование производили в фазовом контрасте, используя инвертированный микроскоп Биолам П1 с автоматической фотонасадкой МФНЭ1.

Концентрация маточных растворов люминесцентных красителей родамина 123 и Хехста 33258 составила 0.5 мг/мл. Конечная концентрация рабочих растворов красителей составила для родамина 123-25 мкг/мл и для Хехста 33258 -10 мкг/мл. Зародыши на 10-30 мин при 37°С помещали в капли раствора красителя, приготовленного на среде НТ6, после чего промывали средой и вновь помещали в термостат в каплях чистой среды. Окрашенные зародыши по-одному переносили в каплю среды НТ6 на предметном стекле и закрывали покровным стеклом с ножками, приготовленными из смеси парафина и вазелинового масла.

При наблюдении и фотографировании зародышей, окрашенных люминесцентными красителями, использовали микроскоп ЛЮМАМ-Р8 (ЛОМО, Санкт-Петербург). На микроскопе устанавливали «голубую» светоделительную пластину с фильтром возбуждения УФС6-3 и запирающим фильтром ЖЗС+БС8. Фотосъемку производили на пленку РФ-3.

Для более детального изучения морфологии ядер приготавли-

вали временные тотальные препараты. С этой целью зародыши сразу после изучения методом люминесцентной микроскопии фиксировали и окрашивали непосредственно на предметных стеклах. В качестве фиксатора использовали смесь равных объемов 10%-ного нейтрального формалина, воды и метанола (рН 7.0-7.2). Приготовленные таким образом препараты окрашивали 0.25%-ным раствором лакмоида в 45%-ной уксусной кислоте. Окрашенные зародыши просматривали и фотографировали в фазовом контрасте на микроскопе «Оптон», используя пленку Фото-64 или Фото-100. В ряде случаев при исследовании зародышей и продуктов слияния бластомеров использовали постоянные фиксированные препараты, приготовленные по методу Тарковского в модификации Дыбана [26]. Блокирование развития эмбрионов с помощью ингибиторов клеточной пролиферации. Зародыши извлекали из материнского организма на стадии поздней зиготы в возрасте 26-28 ч и на средней двухкле-точной стадии в возрасте 36-40 ч после введения ХГГ. Извлеченные эмбрионы культивировали в С02-инкубаторе в течение 22-24 ч при 37°С в среде МЗ. Мимозин (20 мкг/мл) и генистеин (92 мкМ/мл) добавляли в среду в момент эксплантации эмбрионов. По истечении необходимого срока культивирования зародыши промывали в свежих каплях манипуляционной среды и окрашивали люминесцентным красителем родамином 123. Последующую фиксацию эмбрионов и их микроскопирование осуществляли по методике, описанной выше.

Электронномикросколическое исследование. Для электронномикрос-копического исследования материал фиксировали 1%-ным глутараль-дегидом, приготовленным на на 0,05 М какодилатном буфере, в течение не менее 12ч при температуре 4°С. Последующую фиксацию материала 1%-ным 0s04 на том же буфере производили в течение 1 ч при комнатной температуре. После обезвоживания препаратов в спиртах возрастающей концентрации их заключали в спиртораство-римую среду Spurr, время полимеризации при температуре 70"С составляло 8 ч. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца, а затем анализировали с помощью микроскопа JEM-100C при ускоряющем напряжении 80 кВ. Соматическая гибридизация бластомеров. Слияние бластомеров осуществляли при помощи ПЭГ (мол. вес 1000, «Sigma») или серии электрических импульсов. В случае использования ПЭГ, эмбрионы обрабатывали по описанной ранее методике [28]. При проведении слияния с помощью электрических импульсов использовали модифици-10

рованную методику Коно и Цуноды [29]. Источником импульсов в этом случае служил пульсовый генератор постоянного тока (Черноголовка, Россия). При электростимуляции слияния использовали два режима: 2 серии по 2 импульса длительностью 30 мкс и силой 400 В/ мм с интервалом между импульсами 0.1 мс и между сериями 0.2 с, а также 4 серии с теми же параметрами.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Развитие зародышей мышей различных генотипов в материнском организме и в культуре.

Данные о влиянии процедуры извлечения зародышей из материнского организма до и в период активации эмбрионального генома (ЭГА) на их дальнейшее развитие в культуре весьма немногочисленны. Впервые развернутый анализ потенций двуклеточных зародышей мышей к нормальному развитию in vitro или его блокированию при их эксплантации в различные сроки и фазы клеточного цикла был проведен в нашей лаборатории на зародышах BALB/c [30]. Развивая это направление исследований, нами проведен сравнительный анализ предрасположенности к возникновению блока эмбрионов мышей двух блокирующихся линий MF1 и Sic(Rb8<=>17) при их эксплантации до ЭГА и на разных этапах этого процесса. Эмбрионы эк-сплантировали на двух сроках до начала ЭГА (18 и 24 ч после введения ХГГ) и на трех сроках в период ЭГА (30, 36 и 48 ч после введения ХГГ).

Таблица!.

Способность эмбрионов к развитию in vitro при их эксплантации из

материнского организма на разных сроках до и в период ЭГА

Генотип Срок эксплантации ( время после введения ХГГ, ч)

эмбрионов 18 24 30 36 48

СВА/С57В1

(F0 ++ ++ ++ ++ ++

MF1 +- -к +- ++

SicRb8<=>17 +- ++

+ + зародыши успешно проходят полное дошишантационное развитие (норма)

+ - зародыши успешно проходят полное доимплантационное развитие, однако темпы дробления намного ниже нормы

- - развитие подавляющего большинства зародышей останавливается на двуклеточной стадии

Исследование динамики развития зародышей в культуре показало, что срок эксплантации оказывает значительное влияние на потенции к развитию in vitro зародышей обеих предрасположенных к «двуклеточному блоку» линий мышей. Эмбрионы мышей линии SicRb(8ol7) при эксплантации до завершения ЭГА демонстрируют типичный «двуклеточный блок in vitro». Развитие, по эффективности сравнимое с развитием in vivo, можно получить лишь в том случае, когда эмбрионы проходят весь второй клеточный цикл в организме матери, поскольку даже достижение ими двуклеточной стадии in vivo не предотвращает возникновения блока.

Большинство эмбрионов мышей линии MF1 способны пройти второе деление дробления, будучи помещенными в культуру до начала ЭГА, через 24 ч после введения ХГГ, но лишь немногие из них развиваются до стадии бластоцисты. Однако уже при эксплантации через 36 ч после введения ХГГ, т.е. в период ЭГА, но ранее начала большого пика транскрипционной активности, развитие MF1 проходит вполне успешно. В этом случае лишь 9% зародышей останавливаются в развитии на двуклеточной стадии. Таким образом, достаточным условием успешного развития эмбрионов MF1 в культуре является их эксплантация после достижения двуклеточной стадии в организме матери. С точки зрения способностей к развитию in vitro, блокирущаяся линия MF1 занимает промежуточное положение между компетентными к полному доимплантационному развитию в культуре гибридными эмбрионами и блокирующейся линией Sic(Rb8<=>17), для развития зародышей которой in vitro необходимо, чтобы весь период ЭГА они проходили in vivo.

Известно, что причиной возникновения «двуклеточного блока in vitro» является субоптимальность условий культивирования, в которые эмбрионы неизбежно попадают при развитии в синтетических средах [8,31]. В этой связи особое внимание привлекают данные о действии на зародыши окислительного стресса. Показано, что образующиеся в клетках под действием ряда факторов химически активные, содержащие кислород радикалы постепенно нарушают де-фософорилирование белков, вовлеченных в процесс регуляции митоза [32]. Усиление воздействия на зародыши окислительного стресса показано в конце двуклеточной стадии при развитии in vitro зародышей мышей как блокирующихся, так и неблокирующихся генотипов [33], однако дробление в таких условиях способны продолжать лишь эмбрионы неблокирующихся генотипов. Исходя из этого, было высказано предположение о том, что зародыши предрасположенные 12

к блоку частично или полностью утратили механизмы, необходимые для детоксикации образующихся в них активных радикалов [33]. Данная гипотеза хорошо объясняет различия в длительности периодов пребывания зародышей в материнском организме (табл.1), минимально необходимой для успешного развития in vitro. Можно предположить, что варьирование длительности этих периодов отражает различия в эффективности функционирования дегоксикационных механизмов у зародышей разных генотипов.

Анализ морфофункциоиально! о состояния зародышей мыши различных генотипов на протяжении двуклеточной стадии развития и при «двуклеточной блоке in vitro».

Динамика локализации митохондрий в эмбрионах, проходящих второй клеточный цикл в материнском организме.

Зародыши, компетентные к полному доимплантационному развитию in vitro и предрасположенные к возникновению «двуклеточ-ного блока», демонстрируют идентичные изменения локализации митохондрий по ходу двуклеточной стадии развития. Интенсивное свечение цитоплазмы эмбрионов за счет люминесценции функционально активных митохондрий является подтвереждением жизнеспособности клеток.

Эмбрионы на ранней двуклеточной стадии развития (32-34 ч после введения ХГГ). Выявлено три варианта локализации митохондрий. В первом варианте свечение цитоплазмы бластомеров дисперсное. В центре каждого бластомера отмечается небольшая концентрация митохондрий, образующих кольцевидную структуру, в составе которой видны хорошо различимые группы митохондрий (митохонд-риальные кластеры). Во втором варианте митохондрии диффузно распределены в околоядерных зонах бластомеров, однако вместе они образуют похожую на восьмерку фигуру, в кольцах которой расположены ядра бластомеров (рис.1, а). В третьем варианте сконцентрировавшиеся митохондрий формируют в центре бластомеров широкие рыхлые кольца. Функционально активные митохондрий в этом случае распределены на периферии клеток дисперсно и их количество меньше, чем в центральной части (рис. 1, б) Анализ морфологии ядер бластомеров прижизненно и на фиксированном материале показал, что в обоих вариантах митохондрии концентрируются вокруг ядер, находящихся на стадии интерфазы.

Эмбрионы на средней двуклеточной стадии развития (40-42 ч после

введения ХГГ) Окрашивание родамином 123 вызывает мелкодисперсное свечение цитоплазмы за счет диффузного распределения функционально активных митохондрий. Повышенная концентрация орга-нелл наблюдается в зоне прилегания бластомеров друг к другу и в центре каждого из них, где митохондрии формируют тонко очерченную однородную кольцевидную структуру (рис. I, в). В дальнейшем эти кольцевидные структуры будут называться «перинуклеарными митохондриальными кольцами». Слабосветящаяся зона внутри пе-ринуклеарного кольца соответствует, как это обнаруживает окраска фиксированных эмбрионов лакмоидом, расположению интерфазного ядра бластомера.

Эмбрионы на поздней двуклеточной стадии (46-48 ч после введения ХГГ). На поздней двуклеточной стадии наблюдается несколько ва-

Рис. I. Локализация митохондрий в бластомерах эмбрионов MF1, BALB/c, Sic(Rb8ol7) и СВА/С57В1 в течение двуклеточной стадии развития in vivo и при развитии гибридных эмбрионов СВА/С57В1 in vitro.

ранняя средняя поздняя

риантов распределения митохондрий. В одном из них картина соответствует описанной выше для зародышей на средней двуклеточной стадии. В другом, один из сестринских бластомеров имеет в цитоплазме обширную зону сконцентрированных митохондрий, локализованную в центре бластомера и совпадающую с местом расположения метафазной хромосомной пластинки, в то время как у второго бластомера на фоне диффузного распределения митохондрий наблюдается характерное околоядерное расположение митохондрий в виде кольца (рис. 1, г). Столь различная картина распределения митохондрий в сестринских бластомерах свидетельствует об асинхронности их дробления. Наконец, в третьем варианте - в обоих бластомерах выявляется яркое свечение большого скопления митохондрий в центре каждого бластомера, указывая на то, что оба бластомера находятся на стадии метафазы (рис. 1, д). 14

Зародыши мышей блокирующихся и («блокирующихся генотипов, завершившие второй клеточный цикл in vivo, компетентны к дальнейшему доимплантационному развитию in vitro. Помещенные в культуру, они развиваются до стадии выселяющейся бластоцисты.

Динамика локализации митохондрий у зародышей, проходящих второй клеточный цикл в условиях in vitro.

При эксплантации эмбрионов и их дальнейшем культивировании выявлены различия б динамике топографии митохондрий между эмбрионами дигибридного неблокирующегося генотипа СВА/ С57В1 (F2) и линейных блокирующихся генотипов MF1, BALB/c, Sic(Rb8ol7).

Эмбрионы (СВА/С57В1 (FJ. Локализация митохондрий в течение дву-клеточной стадии меняется аналогично тому, что наблюдается при развитии дигибридных эмбрионов in vivo (см. рис. 1). Эмбрионы линий, предрасположенных к возникновению «двуклеточно-го блока in vitro». На ранней двуклеточной стадии зародыши всех генотипов демонстрируют два варианта локализации митохондрий. У небольшой части зародышей в цитоплазме видны рыхлые кольца вокруг ядер, аналогичные наблюдавшимся на этой стадии in vivo или при развитии in vitro гибридных эмбрионов (рис. 2, а). Большинство линейных эмбрионов демонстрирует дисперсное распределение митохондрий, причем околоядерная концентрация митохондрий у них отсутствует (рис. 2, б).

На средней двуклеточной стадии распределение митохондрий может оставаться либо мелкодисперсным (рис. 2, в), либо приобретать более грубый вид. Однако, перинуклеарные митохондриальиые кольца у зародышей в обоих случаях отсутствуют. Места расположения ядер визуализируются лишь у части зародышей. В этом случае они проявляются в виде очень слабо томинесцирующих зон, в

Рис. 2. Локализация митохондрий у эмбрионов, предрасположенных к «двуклеточному блоку in vitro», находящихся на ранней, средней и поздней двуклеточной стадии при их развитии в культуре.

в Ч

lise

ранняя

средняя

поздняя

которых отсутствует характерное для остальной цитоплазмы диффузное распределение митохондрий.

На поздней двуклеточной стадии, характер распределения митохондрий не изменяется (рис. 2, г). У подавляющего большинства таких зародышей деления дробления не происходит и на сроке, по времени соответствующем четырехклеточной стадии развития, они продолжают оставаться на поздней двуклеточной стадии, демонстрируя феномен «двуклеточного блока in vitro». Картины, сответству-ющие мегафазе митоза в этом случае наблюдаются лишь у единичных эмбрионов.

Локализация митохондрий в зародышах, длительное время находящихся в состоянии «двуклеточного блока in vitro». Зародыши через 20 ч после остановки дробления. Все зародыши линии MF1 сохраняют высокую жизнеспособность, в то время как у части зародышей BALB/c и Sic(Rb8<=>l7) появляются признаки потери жизнеспособности. Визуально это выражается в снижении яркости свечения цитоплазмы. В бластомерах зародышей MF1 никаких изменений топографии митохондрий не выявлено. Картина распределения митохондрий полностью соответствует той, которая наблюдалась на поздней двуклеточной стадии при развитии in vitro (рис. 3, а).

Жизнеспособные зародыши двух других линий, в целом, сохраняют мелкодисперсное распределение митохондрий, но часто на его фоне наблюдаются зоны не столь тонко структурированные, в которых можно различить многочисленные мелкие кластеры митохондрий. У эмбрионов Sic(Rb8«17) такого рода кластеризация наблюдается в зоне прилегания сестринских бластомеров и на периферии клеток (рис. 3, в), а у эмбрионов BALB/c кластеры митохондрий распределены по всему объему бластомеров хаотично (рис 3, б). Через 20 ч с момента остановки дробления скопление митохондрий в пери-нуклеарных зонах отсутствует. В тех случаях, когда места локализации ядер можно определить, их расположение выявляется в виде слабо светящихся областей с размытыми границами. Зародыши через 52 часа после остановки дробления. Жизнеспособность эмбрионов всех трех линий заметно снижается. В цитоплазме гибнущих эмбрионов видны лишь единичные мелкие кластеры функционально активных митохондрий, а при полной потере жизнеспособности люминесценция цитоплазмы отсутствует. Однако, у единичных эмбрионов, разрушение структуры цитоплазмы сопровождается появлением ярко гаоминесцирующих аморфных зон . 16

Жизнеспособные зародыши линии MF1 характеризуются появлением многочисленных мелких кластеров митохондрий, равномерно распределенных по всему объему клеток. Места локализации ядер выглядят как слабо светящиеся зоны цитоплазмы (рис 3, г).

Зародыши линий Sic(Rb8ol7) и BALB/c демонстрируют несколько вариантов распределения митохондрий. В цитоплазме большинства эмбрионов выявляются многочисленные крупные митохон-дриальные кластеры, которые чаще всего располагаются вблизи плазматических мембран, включая зону прилегания сестринских бласто-меров. В ряде случаев происходит формирование немногочисленных гигантских кластеров в этих же зонах, которое наблюдается преимущественно у зародышей Sic(Rb8<=>17) (рис 3, е). У некоторых зародышей мелкодисперсное распределение митохондрий сохраняется, но при этом топография митохондрий сходна с наблюдавшейся у зародышей Sic(Rb8ol7) и BALB/c через 20 ч после остановки дробления.

Рис. 3. Локализация митохондрий у зародышей, находящихся в течение разного времени в состоянии «двуклеточного блока in vitro».

20 ч в блоке 50 ч в блоке

MF1

л ** f. » «\

BALB/c /*. А-У.'.'*» Г

Анализ остановки развития зародышей на двуклеточной стадии" вызванной действием ингибиторов клеточной пролиферации: моделирование «двуклеточного блока in vitro».

Структурно-функциональная организация бластомеров при остановке развития эмбрионов на границе фаз Gt/S второго клеточного цикла. вызванной действием мимозина.

После 22-24 ч инкубации с мимозином зародыши интенсивно окрашиваются родамином 123, что свидетельствует о сохранении ими жизнеспособности. Околоядерная концентрация митохондрий выра-

жена отчетливо, несмотря на то, что их диффузное распределение в цитоплазме отсутствует. В центральных областях обоих бластоме-ров локализованы многочисленные кластеры митохондрий. Вместе с тем, в периферической зоне цитоплазмы количество митохондрий снижается. Перинуклеарные «кольца», образованные митохондриями утолщены и сформированы из кластеров. В отдельных случаях целостность «колец» может нарушаться. В зоне прилегания плазматических мембран сестринских бластомеров также заметна небольшая концентрация митохондрий (рис. 4,а).

Элекгронномикроскопический анализ свидетельствует о том, что после инкубации эмбрионов с мимозином адгезивный контакт между бластомерами ослабевает и в зоне прилегания мембран бластомеров формируется несколько полостей. Морфология митохондрий в это время совпадает с той, которая наблюдается на поздней двукле-точной стадии развития. Количество митохондрий в околоядерной зоне заметно больше, чем на периферии бластомеров или в зоне их прилегания. Нередко видна ассоциация митохондрий с липидными включениями.

Особенности организации эмбрионов, прекративших развитие на границе фаз О УМ второго клеточного цикла после воздействия ге-нистеина.

Зародыши, инкубированные с генистеином в течение 22-24 ч, сохраняют способность интенсивно аккумулировать родамин 123. Характерной морфологической чертой большинства эмбрионов является заметное уменьшение зоны прилегания сестринских бластомеров при незначительном снижении в этой области концентрации митохондрий. Вместе с тем, встречаются зародыши, у которых зона контакта мембран бластомеров остается обширной. Характер свечения цитоплазмы близок к мелкодисперсному за счет большого количества очень мелких митохондриальных кластеров, равномерно распределенных по всей цитоплазме. Несмотря на то, что в центральной зоне бластомеров не наблюдается значительной концентрации митохондрий, местоположение ядер маркируется митохонд-риальными «кольцами», также состоящими из мелких кластеров (рис.4, б).

Ультраструктурный анализ подтверждает значительное ослабление адгезивного контакта между бластомерами, которое выражено в данном случае значительно сильнее, чем у зародышей, инкубированных с мимозином. Нередко пространство между бластомерами расширяется, образуя значительные по размеру полости. Отчст-18

ливо видна концентрация митохондрий в перинуклеарной зоне. Количество митохондрий в периферической зоне цитоплазмы и зоне контакта между бластомерами сходно с наблюдаемым на поздней двуклеточной стадии.

Рис. 4. Локализация митохондрий у эмбрионов, блокированных на двуклеточной стадии в результате действия ингибиторов клеточной пролиферации.

Сравнительное исследование локализации митохондрий у дву-клеточных эмбрионов при их успешном развитии, при генетически обусловленной остановке развития, а также при его блокировании в результате действия ингибиторов, позволило выявить корреляцию между изменением локализации митохондрий и изменением морфо-функционального состояния эмбрионов. Как и ожидалось, наиболее заметное перераспределение митохондрий на двуклеточной стадии связано с осуществлением клеточного деления, аналогично тому, что происходит в процессе митоза в соматических клетках и в ходе мей-оза [17]. Помимо этого, топография митохондрий отражает различия в потенциях зародышей к развитию in vitro. Полученные данные свидетельствуют о том, что для зародышей, способных успешно завершить двуклеточную стадию развития и осуществить митоз характерно наличие перинуклеарных митохондриальных колец. Перинук-леарная концентрация митохондрий у двуклеточных эмбрионов, по-видимому, связана с необходимостью энергетического обеспечения ядерно-цитоплазматического транспорта. Показано, что у двуклеточных зародышей, в связи с недостаточным количеством поровых комплексов, транспорт веществ на периферию бластомеров может осуществляется путем блеббинга ядерной мембраны [34]. При этом низкая метаболическая активность митохондрий [35] компенсируется увеличением их концентрации в зонах повышенной затраты энергии. Следует отметить отсутствие перинуклеарных колец в конце двуклеточной стадии при развитии в культуре эмбрионов, предрасположенных к «двуклсточному блоку in vitro». Изменения локализации митохондрий в этом случае отличаются от нормы и типичны

Индуцированная мимозином остановка на границе G,/S второго клепочного цикла

Индуцированная генисгеином остановка в конце G2 второго клеточного цикла

для тех эмбрионов, которые неспособны пройти второе деление дробления. Подобный факт может указывать на наличие нарушений ядер-но-цитоплазматических взаимоотношений, возникающих в процессе культивирования.

Характерным изменением локализации митохондрий у эмбрионов, длительное время находящихся в состоянии «двуклеточного блока» является формирование крупных кластеров митохондрий, расположенных около плазматической мембраны и в зоне прилегания блаетомеров. Такая картина распределения митохондрий подтверждает данные о том, что осуществление блокированными зародышами отдельных процессов связано с реализацией программы индивидуального развития [8]. Показано, что у части блокированных зародышей форма блаетомеров меняется подобно тому, как это происходит при компактизации. Блокированные зародыши осуществляют синтез полинептидов, характерных для стадии морулы и блас-тоцисты [8]. В свою очередь, в нашей работе показано, что локализация митохондрий в блокированных эмбрионах сходна с наблюдаемой на 8-клеточной стадии (концентрация около плазматических мембран блаетомеров) и на стадии морулы (концентрация в зонах межбластомерных контактов).

Блокирование развития эмбрионов на двуклеточной стадии в результате действия ингибиторов сопровождается изменением характера распределения митохондрий с гомогенного на кластеризованный, однако внутриклеточная локализация кластеров при индуцированном блоке принципиально иная, чем при генетически обусловленном «двухклеточном блоке in vitro». После воздействия ингибиторов в клетках сохраняется околоядерная конценграция митохондрий. Обращает на себя внимание то, что по сравнению с нормально развивающимися зародышами, у эмбрионов блокированных действием ингибиторов в составе перинуклеарных колец выявляются мито-хондриальные кластеры, что может свидетельствовать об изменении их функционального состояния. Сопоставляя картины распределения митохондрий при генетически обусловленной остановке развития на границе фаз G,/M второго клеточного цикла и при блокировании развития в той же точке, вызванном действием генистеина, можно отметить, что воздействие ингибитора не приводит к исчезновению перинуклеарной концентрации митохондрий и формированию крупных митохондриальных кластеров. Вместе с тем, следует напомнить, что именно эти изменения топографии митохондрий сопровождают развитие «двуклеточного блока in vitro». 20

При остановке на границе фаз G/S второго клеточного цикла, индуцированной действием мимозина, в бластомерах видны широкие, рыхлые, содержащие кластеры кольца, образованные митохондриями. В ходе нормального развития подобную картину можно видеть на ранней двуклеточной стадии, когда миграция митохондрий от ядер на периферию клеток еще не завершилась.

Таким образом, сравнительный анализ остановки развития на двуклеточной стадии, обусловленной генетической программой ооцита или индуцированной действием ингибиторов, позволяет утверждать, что изменение локализации митохондрий, сопровождающее развитие «двуклеточного блока in vitro», является характерной чертой только этого состояния.

Интеграция и сегрегация цитоплазматического и ядерного материала в составе соматического гибрида при слиянии бластомеров двуклеточ-ных эмбрионов.

Зависимость способности зародышей к индуцированному слиянию от стадии второго клеточного цикла.

В экспериментах по слиянию сестринских бластомеров двухкле-точных зародышей было показано, что на ранней двуклеточной стадии получение продуктов слияния (ПС) затруднено. Обнаружено, что через 30 мин после завершения первого митоза гибридизацию проходит успешно только 24% зародышей. Однако, к середине цикла уже 98,5% зародышей способны сформировать ПС. Эффективность слияния остается на высоком уровне в течение еще примерно 3-4 ч (92%), но на поздней двуклеточной стадии она резко падает (до 31 %). Бластомеры двуклеточных эмбрионов в возрасте 52 ч способна сливаться лишь в 8% случаев, причем неслившиеся бластомеры вскоре приступают ко второму делению дробления. Слияние сестринских бластомеров.

Динамика морфофункиионалъных изменений при гибридизации бластомеров неблокирующегося генотипа. В экспериментах по слиянию использовали дигибридные зародыши СВА/С57В1 (F2). В качестве фузогенов применяли ПЭГ или импульсы постоянного тока. Сразу после обработки любым из этих фузогенов внешний вид зародышей не изменялся, однако прилегание бластомеров друг к другу становилось более плотным. Прижизненный анализ обработанных фузоге-нами эмбрионов с использованием родамина 123 и Хехста 33258 свидетельствует о том, что локализация митохондрий в таких зародышах сходна с той, которая наблюдалась при нормальном дроблении

на средней двуклегочной стадии, а именно: митохондрии диффузно распределены в цитоплазме и образуют «кольца» вокруг ядер. Однако, вследствие концентрации митохондрий в зоне плотного прилегания бластомеров, граница между ними выглядит как полоса с более яркой люминесценцией (рис. 5, а).

В течение 10-30 мин после индукции слияния с помощью электростимуляции или 10-90 мин после обработки эмбрионов ПЭГ наблюдается формирование общей плазматической мембраны. ПС принимает овальную форму, при этом граница цитоплазмы партнеров слияния в фазовом контрасте лишь угадывается. Использование люминесцентного анализа ПС позволило показать, что сегрегация цитоплазмы бластомеров на этом этапе слияния еще сохраняется, причем граница между партнерами отчетливо проявляется в виде зоны, почти лишенной митохондрии (рис. 5, б).

ПС в течение получаса приобретает правильную округлую форму. В последующие несколько часов митохондриальные «кольца» и ядра смещаются к центру ПС, где эти клеточные компоненты располагаются попарно (рис.5, в). Слияния ядер и формирования единого митохондриального кольца не происходит. На стадии метафазы в центре ПС отмечена высокая концентрация митохондрии, которая выглядит как ярко светящееся пятно, расположенное вокруг единой метафазной пластинки (рис. 5, г). На стадии телофазы форма ПС вновь становится овальной. Ярко светящееся пятно митохондрии над хромосомами приобретает форму восьмерки, маркируя расположение двух групп телофазных хромосом и выявляя бочкообразную форму единого биполярного веретена деления (рис. 5, д).

В только что образовавшемся двуклеточном соматическом гибриде на завершающих стадиях цитокинеза некоторое время сохра-

Рис. 5. Локализация митохондрий относительно ядер в процессе формирования и первого митоза продукта слияния бластомеров двуклсточного зародыша.

няется напоминающая восьмерку концентрация митохондрии, в «кольцах» которой расположены вновь образованные ядра, а на пересечении - остатки веретена деления и не прерванный еще цитоп-лазматический мост (рис. 5, е). Цитогенетический анализ показал, что бластомеры соматических гибридов являются тстраплоидными.

ПС, завершившие первое деление, продолжали успешно дробиться и развивались до стадии бластоцисты. На той же стадии развития число клеток в таких бластоцистах значительно меньше (19±7.0), чем в нормальном зародыше (83±9.2) [28].

Гибридизация блаетомеров блокирующегося генотипа. В экспериментах данной серии использовались двуклеточные эмбрионы блокирующегося генотипа BALB/c - линии, демонстрирующей типичный «двуклеточный блок in vitro». Эмбрионы находились в культуре, начиная со срока 24 ч после введения ХГГ, т.е. со средней одноклеточной стадии. При эксплантации на этом сроке большинство зародышей неспособны развиваться далее, чем до поздней двуклеточной стадии. Цитологический анализ эмбрионов на средней двуклеточной стадии показал, что ядра их блаетомеров находятся в интерфазе, а митохондрии могут либо формировать мелкие кластеры, равномерно распределенные в цитоплазме, либо быть распределены диффузно. Псринуклеарные митохондриальные кольца на средней двуклеточной стадии отсутствуют, поэтому места локализации ядер можно идентифицировать как слабо люминесцирующие зоны цитоплазмы, почти свободные от митохондрии.

После воздействия импульсов постоянного тока на пары блаетомеров, полученных от эмбрионов BALB/c, формирование ПС происходит в течение I ч. Дальнейшая последовательность событий сходна с той, которая наблюдалась при слиянии сестринских блаетомеров гибридных эмбрионов. Отличие состояло лишь в том, что ПС блаетомеров BALB/c были неспособны осуществить второе деление дробления и оставались на одноклеточной стадии развития в течение следующих двух суток. К окончанию срока наблюдения в цитоплазме жизнеспособных ПС были видны митохондриальные кластеры, более выраженные, чем у Г1С через 10ч с момента их формирования. Распределение таких кластеров было неравномерным, а псринуклеарные зоны не выявлялись.

Слияние пары блаетомеров с разными потенциями к развитию in vitro: анализ эффекта снятия «двуклеточного блока in vitro» при формировании продукта слияния.

В качестве партнеров слияния использовали изолированные бла-

стомеры блокирующегося (BALB/c) и неблокирующсгося (СБА/ C57BI) генотипов.

Эмбрионы предварительно культивировали in vitro, начиная со средней одноклеточной вплоть до средней двуклеточной стадии. Цитоплазма таких зародышей интенсивно окрашивалась родамином 123. Митохондрии гибридных бластомеров были равномерно распределены по всему объему каждого бластомера, за исключением центральной зоны цитоплазмы, в которой они концентрировались в виде тонко очерченного, однородного кольца (рис.6, а). В бластоме-рах BALB/c наблюдалось два варианта распределения митохондрий: у части зародышей митохондрий распределялись в цитоплазме дисперсно, в то время как у других цитоплазма была равномерно заполнена мелкими митохондриальными кластерами (рис. 6,6). Однако, в обоих случаях перинуклеарные митохондриальные кольца отсутствовали, а места расположения ядер визуализировались в виде зон ци-

Рис. 6. Изменение локализации митохондрий в предрасположенном к «блоку» бластомере как следствие его шгтеграции в состав соматического гибрида.

топлазмы с очень слабым свечением и нечеткими границами.

Далее для проведения соматической гибридизации, зародыши дезагрегировали на бластомеры и составляли пары из клеток разных генотипов.

Устойчивый адгезивный контакт между партнерами слияния формировался в этом случае не ранее, чем через 60 мин, при условии их инкубации в среде, содержащей фитогемагглютинин. В результате успешного слияния формировалась крупная овальная клетка, которая спустя час округлялась. Спустя 2 ч после формирования ПС, митохондрии во всех гибридных клетках распределялись равномерно и диффузно. В ряде случаев на фоне такого равномерного распределения митохондрий были видны отдельные кластеры. Два тонких митохондриальных кольца в сформированных ПС располагались на 24

значительном расстоянии друг от друга (рис.6, в). Фиксация и окрашивание лакмоидом ПС показала, что локализация колец совпадает с местами расположения интерфазных ядер дикариона.

Дальнейшее развитие соматических гибридов проходило стандартным образом: ядра и окружающие их митохондриальные кольца мигрировали в центр клетки, где располагались рядом. Однако, слияния ядер и объединения митохондриальных колец не происходило. ПС успешно завершали митоз и переходили на двуклеточную, а затем и четырехкяеточную стадии развития (рис. 6, г-д).

Динамика локализации митохондрий позволила поэтапно описать события, происходящие при формировании ПС сестринских бластомеров и при последующем делении тетраплоидного соматического гибрида. В результате, удалось выявить несколько ранее не описанных особенностей формирования и развития таких направленно реконструированных зародышей.

На начальных этапах соматической гибридизации слияние плазматических мембран бластомеров и формирование одноклеточного дикариона не сопровождается интенсивным перемешиванием цитоплазмы партнеров слияния. Сходные данные были получены при изучении динамики формирования ПС ооцитов или бластомеров морских безпозвоночных [36, 37]. Ход гибридизации бластомеров мыши отличался также и от слияния культивируемых соматических клеток, при котором реорганизация цитоплазмы начиналась с быстрого включения микротрубочек и митохондрий в многочисленные цитоплазма-тические мостики соединяющие партнеров слияния [38]. В процессе формирования соматических гибридов бластомеров околоядерные митохондриальные кольца перемещались к центру ПС, допуская существование ассоциации митохондрий с микротрубочками, обеспечивающими такое перемещение, подобно тому что наблюдается при формировании зиготы [39].

На двуклеточной стадии развития тетраплоидного соматического гибрида сестринские бластомеры могут асинхронно вступать в М-фазу клеточного цикла. Аналогичное явление ранее было описано у интактных [40], изолированных и предрасположенных к «дву-клеточному блоку», но успешно развивающихся в составе arpera ци-онных химер [41] сестринских бластомеров двуклеточных зародышей мышей. Полагают, что именно асинхронное прохождение митоза сестринскими бластомерами является первопричиной композиционной гетерогенности эмбриона, возникающей на более поздних стадиях развития [42].

В заключение следует отметить, что динамика локализации митохондрий является надежным прижизненным маркером функционального состояния эмбрионов. Использование прижизненных методов изучения поведения митохондрий, в сочетании с другими методами анализа, даст возможность исследовать взаимосвязь между динамикой их локализации, основными событиями клеточного цикла и изменениями метаболических требований эмбрионов.

Выводы

1. Характер внутриклеточной локализации митохондрий у зародышей, находящихся на двуклеточной стадии развития, обусловлен особым морфофункциональным состоянием ядра, связанным с активацией эмбрионального генома и начальными этапами формирования ядрышек, а также особенностями ядерно-цитоплазматичес-кого транспорта на этой стадии развития.

2. Темпы формирования, размер и местоположение митохонд-риальных кластеров, образующихся при развитии «двуклеточного блока in vitro», специфичны для эмбрионов каждого из блокирующихся генотипов.

3. Изменения локализации функционально активных митохондрий в ходе возникновения и развития «двуклеточного блока in vitro» и при остановке дробления на двуклеточной стадии в результате действия ингибиторов клеточной пролиферации различны.

4. Успешность развития эмбрионов мышей in vitro зависит от того, на каком этапе периода активации эмбрионального генома производится эксплантация. Длительность периода пребывания в материнском организме у эмбрионов, предрасположенных к «дву-клеточному блоку in vitro», необходимая для обеспечения их полного доимплантационного развития в культуре, для линий мышей MF1 и Sic(Rb8ol7) различна.

5. Способность бластомеров к индуцированному слиянию изменяется в течение двуклеточной стадии развития. Различия в эффективности соматической гибридизации бластомеров эмбрионов, находящихся на ранней, средней и поздней двуклеточной стадии, связаны с особенностями их структурной организации на разных фазах клеточного цикла, причем наиболее сильно эти различия проявляются тогда, когда один из партнеров слияния готовится к осуществлению митоза.

6. Формирование теграгшоидных соматических гибридов из бластомеров двуклеточных эмбрионов разных генотипов сопровожда-26

ется вначале слиянием цитоплазматических мембран и образованием единого дикариона без интенсивного перемешивания митохондрий партнеров слияния, а затем интеграцией их цитоплазматическо-го и ядерного материала, которая завершается в момент объединения хромосом на веретене деления на стадии метафазы. При дальнейшем развитии тетраплоидных зародышей, сестринские бластоме-ры способны асинхронно проходить митоз.

7. Объединение в составе продукта слияния пары бластомеров, состоящей из предрасположенного к «двуклеточному блоку» и компетентного к развитию in vitro бластомера влечет за собой быстрое перераспределение митохондрий в цитоплазме блокирующегося партнера и приводит к появлению картины распределения митохондрий, сходной с наблюдаемой у эмбрионов, компетентных к развитию в культуре.

Список основных публикаций по теме диссертации. Секирина Г.Г., Боголюбова Н.А. 1993. Динамика формирования тетраплоидных ядер и топографии митохондрий в соматических гибридах бластомеров зародышей мыши. Цитология 35 (10): 61

Sekirina G.G., Neganova I.E., Bogoliubova N.A. 1993. Cyto-embriological examination of the competence for the development in vitro in preimplantation mouse embryos with different genotypes. Over-coming of «2-cell block» in aggregation chimeras. The 40-th meeting of the European tissue culture society. Abstract book. Abstr.3

Sekirina G.G., Neganova I.E., Bogoliubova N.A. 1994. Some characteristic features of G2-phase mitosis arrest of mouse embryos in vitro. Cell Biology International. 18(5). 579

Sekirina G.G., Neganova I.E., Bogoliubova N.A. 1994. In vivo and in vitro comparative examintion of the nucleus and cytoplasm on the second cell cyclc of mouse cleavage and during formation of the somatic blastomeres hybrids. Ontogenez 25(4): 29

Боголюбова И.А., Секирина Г.Г. 1995. Экспресс-оценка морфо-функционального состояния доимплантационных зародышей мышей в момент эксплантации, при культивировании и конструировании in vitro. Цитология 37(3); 202-207.

Секирина Г.Г., Боголюбова И.А., Неганова И.Э., Архангельская И.Б. 1996. Анализ и коррекция развития зародышей млекопитающих in vitro при эксплантации из материнского организма на стадии активации эмбрионального генома. В сб. «Консервация генетических ресурсов», Пущино.ОНТИ ПНЦ; 69-70.

Sekirina G.G., Bogoliubova N.A., Antonova N. V., Dyban A.P. 1997. The behavior of mitochondria and cell integration during somatic hybridization of sister blastomeres of the two cell mouse embryo. Zygote 5; 97-103.

Секирина Г.Г., Неганова И.Е., Боголюбова H.A., Почукалина Г.Н., Парфенов В.И. 1997. Ядро и ядсрно-цитоплазматические взаимоотношения на стадии активации эмбрионального генома у мышей. Цитология 39(1); 101

Bogoliubova N.A., Sekirina G.G. 1997. Combination of simple cytological approaches to follow the changes of morpho-functional state of early mammalian embryos in vitro. Abstracts of European Congress for Molecular Cell Biology. Abstr. 4002

Bogoliubova N.A., Sekirina G.G. 1997 Changes in morpho-functional state of early mouse embryos under in vitro conditions. The XXXIII International Congress of Physiological Sciences. Abstr. 01701. 28

Боголюбова H.A., Секирииа Г.Г. 1998. Сегрегация и интеграция цитоплазматического и ядерного материала при дроблении и индуцированном слиянии бластомеров ранних зародышей мышей. Онтогенез 29(6);437-443

Боголюбова И.А., Боголюбова И.О., Парфенов В.И., Секирииа Г.Г. 1999. Особенности структурно-функциональной организации двух-клеточных зародышей мыши при воздействии некоторых ингибиторов клеточной пролиферации. Цитология 41(8): 698-706.

Список цитируемой литературы.

1. Kidder J.M. 1992. Devel. Genet. 13; 319-325. 2. Leese H.D. 1995. Hum. Rehrod. Update 1(1). 63-72. 3. Telfold N.A., Watson A.J, Schultz G.A. 1990. Mol. Reprod. Devcl. 26; 90-100. 4. Schultz G.A. 1993. Bioessays. 15(8); 531-538. 5. WangQ., Latham K.E. 1997. Mol. Reprod. Devel. 47(3); 265-270.6. Beller S. et al. 1997. EMBO Journal. 16(20); 62506262. 7. Whittingham D.G. 1974. The early development of mammals. Acad. Press., P 1-24. 8. Goddart M.J., Pratt H. 1983. J. Embryol. Exptl. Morph. 73; 111-133.9. Muggleton-Ilarris A.L., Brown J.J.D. 1988. Human Reprod. 3; 1020-1028.10. Muggleton-Harris A. L. etal. 1982. Nature.299; 460-462. 11. Suzuki et al. 1988.Cell Differ.24; 133-138. 12. Yaffe M.P. 1996. PNAS. 93:11664-11674.13. McCarthy D.M., Jenq W; Savage D.S. 1987. Appl. Environ. Microbiol. 53: 345-351. 14. Couchman J.R., Rees D.A. 1982. Eur. J. Cell. Biol. 27; 47-49.15. Rapaport L. Olivero P., Samuel J.L. 1998. Mol. Cell. Biochem. 184(1-2); 101-105. 16. Summerhayes J., Wong L„ Chen L.B. 1983. J. cell. Sei. 61: 81-105. 17. Van Blerkom J., Runner M.N. 1984. Am. J. Anat. 171:335-355.18. McKenacherL.J., Heath LB. 1987. Exp. Mycol. 11; 79-100. 19. YaffeM.P. 1999. Science 283(5). 1493-1497. 20. Ginsberg L., Hillman,1973. J. Embryol. Exp.Morphol. 30(1); 267-282. 21. Biggers J.D, Borland H.1976. Ann. Rev.Physiol. 95110. 22. Barnett D.K, Bavister B.D. 1996. Mol. Reprod. Devel. 43(1); 105-133.23. Tokura et al., 1993. J. Assist. Reprod. Genet. 10:417-426. 24. Дыбан А.П. 1974. Опыты на зародышах млекопитающих. В кн.; Методы биологии развития М., Наука 217-245. 25. Пратт X. 1990. Эксперименты с предимплаитационными зародышами млекопитающих. В кн.: Биология развития млекопитающих. Методы. Мир. 27-64. 26. QuinnP., etal. 1982. J. Reprod. Fert. 66: 161-168. 27. Dyban A.P. 1983. Stain Tech. 58; 69-72. 28. Секирииа Г.Г. 1985. Онтогенез. 16(6); 583587. 29. Kono Т., Tsunoda Y. 1988. Gamete Res. 19: 349-357. 30. Нега-нова Н.Э., Секирииа Г.Г. 1996. Онтогенез. 27(5); 371-378. 31. Brown J.J. 1991. Clevage arrest during mouse preimplantation development in

vitro. PhD Degree Thesis., University of London. 32. Nöda et al.. 1991. Mol. Reprod. Develop. 28; 356-360. 33. Nasr-Esfahani M.H., Atkien J., Johnson M. 1990. Development. 109; 501-507. 34. Секирина Г.Г. и др., 1997. Цитология 39(1); 101.35. BiggersJ.D., SternJ. 1973. Adv. Reprod. Physiol. 6; 1-59. 36.BennetJ., Masia D. 1981. Exptl. Cell. Res. 131:197207. 37. Sekirina G.G. et al. 1983. Cell Differ. 12; 67-71. 38. Zheng Q., Chang D.C. 1991. J. Cell. Sei. 100; 431-442. 39. Shatten G., Simerly C„ ShattenH. 1985. PNAS. 82:4152-4156.40. LehtonenE. 1980. J. Embryol. Exptl. Morphol. 58. 231-249. 41. Секирина Г.Г., Неганова И.Э. 1996. Онтогенез. 27(5): 361 -370.42. Дыбан А.П. 1988. Раннее развитие млекопитающих. Наука.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского Фонда фундаментальных исследований, гранты 95-04-11442, 99-04-49517.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Боголюбова, Наталья Алексеевна

ВВЕДЕНИЕ. 4

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11

1. Морфофункциональная характеристика двуклеточной стадии развития в эмбриогенезе мыши. 11

1.1. Молекулярно-генетическая характеристика.

1.2. Структурно-функциональная организация зародышей.

2. Двуклеточный блок in vitro. 17

2.1. Потенции зародышей к развитию in vitro.

2.2. Морфологические и биохимические особенности эмбрионов, находящихся в состоянии двуклеточного блока in vitro.

2.3. Причины возникновения двуклеточного блока in vitro.

2.4. Методы предупреждения и преодоления блока.

3. Структура, функциональная активность и внутриклеточная локализация митохондрий на ранних этапах эмбриогенеза млекопитающих. 28

3.1. Морфология и показатели метаболизма митохондрий.

3.2. Динамика локализации и механизмы подвижности митохондрий.

3.3. Изучение локализации и морфо-функционального состояния митохондрий при помощи родамина 123.

4. Соматическая гибридизация как инструмент экспериментального изучения контролирующих механизмов начальных стадий эмбриогенеза.35

4.1. Методы соматической гибридизации.

4.2. Основные результаты, полученные в ходе изучения направленно реконструированных зародышей.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 42

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 50

1. Развитие зародышей нескольких генотипов в материнском организме и культуре.50

1.1. Динамика развития зародышей СВА/С57В1 (F2), MF1, Sic(Rb8o 17) in vivo - контроль жизнеспособности эмбрионального материала.

1.2. Развитие эмбрионов in vitro при разных сроках эксплантации из материнского организма.

1.2.1 Эксплантация до начала активации эмбрионального генома.

1.2.2 Эксплантация в период активации эмбрионального генома.

2. Анализ морфо-функционального состояния зародышей мышей нескольких генотипов на протяжении двуклеточной стадии развития и в состоянии двуклеточного блока in vitro. 56

2.1. Топография ядер и митохондрий у зародышей, проходящих второй клеточный цикл в материнском организме.

2.2. Топография ядер и митохондрий у зародышей, проходящих второй клеточный цикл в культуре.

2.3. Локализация митохондрий в зародышах, находящихся в состоянии двуклеточного блока in vitro.

3. Моделирование состояния , сходного с двуклеточным блоком in vitro с помощью ингибиторов клеточной пролиферации . . 71

3.1. Структурная организация гибридных эмбрионов СВА/С57В1 (F2) на поздней двуклеточной стадии после их развития в культуре со стадии зиготы.

3.2. Влияние ингибиторов клеточного цикла мимозина и генистеина на развитие зародышей.

3.3. Структурно-функциональная организация эмбрионов при остановке развития на границе фаз Gi/S второго клеточного цикла, вызванной действием мимозина.

3.4. Особенности организации эмбрионов, остановившихся в развитии на границе фаз G2/M второго клеточного цикла в результате воздействия генистеина.

4. Интеграция и сегрегация цитоплазматического и ядерного материала в составе соматического гибрида при слиянии бластомеров двуклеточных эмбрионов. 82

4.1. Влияние возраста двуклеточных зародышей на их способность к успешной гибридизации.

4.2. Изучение динамики интеграции партнеров при слиянии сестринских бластомеров двуклеточных зародышей.

4.2.1 Слияние сестринских бластомеров неблокирующегося генотипа. 4.2.2. Динамика формирования продукта слияния сестринских бластомеров блокирующегося генотипа.

4.3. Формирование продуктов слияния из пар несестринских бластомеров.

4.3.1.Соматическая гибридизация бластомеров одного генотипа.

4.3.2.Динамика интеграции пары бластомеров с разными потенциями к развитию in vitro: анализ эффекта снятия "двуклеточного блока in vitro" при формировании продукта слияния.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Морфофункциональные особенности эмбрионов мыши на двуклеточной стадии развития, анализ двуклеточного блока in vitro"

Система контроля развития млекопитающих в доимплантационном периоде представляет собой уникальное сочетание генетических и Эпигенетических механизмов. С одной стороны, осуществление генетической программы развития определяется действием генопродуктов, накопленных еще в оогенезе (McLaren, 1981; Schultz, 1986). С другой, уже на ранних стадиях дробления начинает проявляться транскрипционная активность хромосом эмбриона, в результате чего генопродукты эмбрионального генома достаточно рано начинают оказывать влияние на ход развития ( Kidder, McLachlin, 1985; Braude et al., 1988). Помимо этого, на проэмбриональном этапе развития в процессе оогенеза закладывается система биологических ритмов ("зиготические часы"), являющаяся базовым механизмом эпигеномного контроля развития эмбриона и определяющим его биологический возраст (Conover et al., 1991).

При изучении закономерностей раннего эмбриогенеза млекопитающих особое внимание привлекают критические периоды развития (Светлов, 1978), которые сопровождающиеся резкими изменениями морфофункционального состояния зародышей. К ним, в частности, относят активацию эмбрионального генома, а также начальные процессы формообразования (компактизацию и кавитацию) (Kidder, 1992; Leese, 1995).

Известно, что у различных видов млекопитающих активация эмбрионального генома осуществляется на разных стадиях доимплантационного развития - от дйуклеточной (мышь, крыса или китайский хомячок) до 8-16 -клеточной (крупный рогатый скот) (Telfold et al; 1990). То, что в эмбриогенезе мыши основные события активации эмбрионального генома происходят на протяжении второго клеточного цикла, дает основание рассматривать двуклеточную стадию развития у этого вида в качестве критической. Уникальность двуклеточной стадии состоит в том, что в этот период на фоне действия цитоплазматических контролирующих факторов материнского происхождения в зародыше происходит трансляция мРНК как материнского, так и эмбрионального происхождения. К концу второго клеточного цикла большинство мРНК материнского происхождения деградирует, а транскрипционная активность зиготических генов резко возрастает (Bolton et al., 1984; Caput et al., 1986).

Последовательность молекулярно-генетических событий, связанных с активацией эмбрионального генома, и принципы действия контролирующих ее механизмов, подробно изучены ( Schultz, 1993; Beller et al., 1997; Wang et al., 1997; В то же время структурная организация и физиологическое состояние эмбрионов на двуклеточной стадии охарактеризованы далеко не полно. Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что репрограммирование генома у мыши проходит на фоне отсутствия дефинитивной структуры важнейших органелл и несформированности жизненно важных клеточных систем (Hillman, Tasca, 1969; Stern et al., 1971; Maro et al.,1985; Секирина и др., 1997).

Исходя из уникальности двуклеточной стадии, изучение морфо-функционального состояния зародышей на этом этапе развития представляет интерес по нескольким причинам. Во-первых, в настоящее время не существует подробного описания структурно-функциональных изменений состояния цитоплазмы эмбрионов на протяжении двуклеточной стадии развития. Во-вторых, практически не изучены проходящие в течение этой стадии начальные этапы становления дефинитивной организации ряда ядерных структур и формирования ядерно-цитоплазматических отношений. В-третьих, существует необходимость изучения на начальных этапах развития зависимости между способностью зародышей успешно развиваться in vitro и изменениями их морфофункциональной организации.

Изучение становления ядерно-цитоплазматических отношений в раннем эмбриогенезе проводят в частности с использованием анализа формирования и развития реконструированные зародышей, полученных с помощью соматической Ц гибридизации бластомеров (Tarkovski, Balakier, 1980; Bennett, Mazia, 1981; Дыбан и др., 1981). Эти модельные системы сочетают в себе черты сходства и различия с основополагающим процессом эмбриогенеза - формированием зиготы. При оплодотворении, как и при соматической гибридизации происходит слияние двух партнеров и объединение двух хромосомных наборов, дающие начало развитию эмбриона. Однако, если при образовании зиготы объединение ядерного материала мужской и женской гамет происходит в цитоплазме, представленной, главным образом, материалом яйцеклетки, то при слиянии бластомеров цитоплазма каждого из них в равной степени участвует в формировании гибрида. Образование продукта слияния приводит, в результате, к принципиальному изменению ядерно-цитоплазматического отношения. Весьма важно подчеркнуть, что оплодотворение представляет собой естественный процесс, на всех этапах контролируемый сложной системой генетических и негенетических механизмов (Howlett, Bolton, 1985; Heikinheimo, Gibbons, 1998), в то время как соматическая гибридизация является модельным процессом, у которого генетически запрограммированный контроль отсутствует. Несмотря на это, гибридизация происходит настолько организованно, что обеспечивает успешное развитие соматического гибрида, включая реализацию таких начальных этапов цитодифференцировки, как компактизация и кавитация. Проведение поэтапного анализа реорганизации цитоплазмы при слиянии бластомеров двуклеточных эмбрионов мыши и дроблении соматического гибрида позволит расширить представление о процессах структурной и функциональной интеграции ядра и цитоплазмы в ходе формирования ядерно-цитоплазматических взаимоотношений на этой стадии развития.

Уникальной особенностью, характеризующей период активации эмбрионального генома у млекопитающих является то, что при развитии зародышей in vitro с одноклеточной стадии наблюдается остановка дробления, совпадающая по времени С активацией эмбрионального генома (Cammus et al., 1984; Davis, 1985; Sakkas et al., 1985; Bavister 1988). Анализ развития зародышей мыши в культуре показал, что эмбрионы определенных генотипов не способны проходить полное доимплантационное развитие вне материнского организма. При культивировании в стандартных синтетических средах эмбрионы, полученные путем внутрилинейного скрещивания, в отличие от эмбрионов гибридных генотипов, останавливаются в развитии на границе G2/M - фаз второго клеточного цикла. Такое нарушение развития, получившее название "двуклеточного блока in vitro" (Whittingham, 1974), проявляется при культивировании эмбрионов, извлеченных из материнского организма до завершения активации эмбрионального генома (Muggleton-Harris, Brown, 1988). Полагают, что повышение чувствительности двуклеточных зародышей к действию внешних факторов, и, прежде всего, условий in vitro, связано с качественными изменениями транскрипционной и синтетической активности, обусловленными активацией эмбрионального генома (Whittingham 1974, Goddard, Pratt 1983). Показано, что предрасположенность к "двуклеточному блоку in уйго"определяется генотипом яйцеклетки и отражает действие на ранние этапы развития материнских цитоплазматических контролирующих механизмов (Muggleton-Harris et al., 1982; Suziki et al., 1988). В связи с этим, даже успешно дробящиеся в культуре эмбрионы мышей разных генотипов в конце двуклеточной стадии обладают неодинаковыми потенциями к дальнейшему развитию. Одни из них оказываются компетентными к развитию, в то время как другие - предрасположеными к "двуклеточному блоку in vitro". Наличие такого генетически предопределенного различия в потенциях к развитию in vitro позволяет провести сравнительный анализ морфофункционального состояния эмбрионов разных генотипов, находящихся на стадии активации эмбрионального генома.

Логично предположить, что различия между компетентными к развитию и предрасположенными к "блоку" эмбрионами могут выражаться в изменении структурной организации и функциональной активности компонентов ядра и цитоплазмы. Показано, что "двуклеточный блок in vitro" проявляется прежде всего в неспособности эмбрионов начать второе деление дробления (Goddard, Pratt 1983; Muggleton-Harris, Brown 1988). В связи с этим, особый интерес представляет одновременный анализ морфологии ядра и цитоплазмы, в целях поиска морфофункциональных критериев, позволяющих идентифицировать предмитотическую фазу G2 и момент перехода зародышей в состояние "блока". Помимо этого, анализ морфофункционального состояния эмбрионов, остановившихся в развитии в конце стадии G2 второго клеточного цикла и при дальнейшем длительном пребывании в "блоке" представляет интерес с точки зрения изучения регуляции клеточного цикла.

В то время как организация ядерных структур на двуклеточной стадии развития мыши изучена методами трансмиссионной электронной микроскопии гисторадиографического и цитогенетического анализа (HUlman, Tasca, 1969; Дыбан и др., 1979; Паткин, 1980; Хожай 1981; Северова, 1990), комплексное изучение реорганизации цитоплазмы на этой стадии развития не проводилось. Имеющиеся сведения получены при исследовании всего доимплантационного периода эмбриогенеза мыши и весьма фрагментарны. Исключение составляет лишь подробно описанное поведение микротрубочек, связанное с осуществлением митотического цикла (Shatten et al., 1985).

Функциональная роль митохондрий на начальных этапах эмбрионального развития остается малоизученной. Вместе с тем, показано, что эти органоиды представляют важный информативный маркер при наблюдениях за структурной реорганизацией цитоплазмы (Chen, 1988). Это определяется тем, что во-первых, существует возможность прижизненного изучения локализации и функционального состояния митохондрий с использованием специфичных витальных люминесцентных красителей, в частности родамина 123. Во-вторых, анализ поведения митохондрий на широком круге объектов (Couchman, Rees 1982; McCarthy et al., 1987; Yaffe, 1996) с одной стороны, и накапливающиеся данные об ассоциации митохондрий с компонентами цитоскелета (Ball, Singer 1982; Summerhayes 1983; Rappaport et al., 1998) и закономерностях их перемещения в ходе клеточного деления и цитодифференцировки (Van-Blercom et al., 1984; Me Kerracher, Heath 1987) с другой, позволяют допустить существование механизмов активного регулирования внутриклеточной локализации митохондрий при изменении морфофункционального состояния клеток. Кроме того, показано, что митохондриальная система не только соматических, но и эмбриональных клеток чрезвычайно лабильна и может легко менять свою конфигурацию, отражая изменения физиологического и функционального состояния клеток. Имеющиеся в настоящее время данные свидетельствуют о наличии специфического перераспределения митохондрий в ходе оогенеза и на одно-четырехклеточной стадиях эмбрионального развития (Kruip et al., 1983; Barnett et al., 1996). Сведения такого рода представляют несомненный интерес, поскольку становится все более очевидным, что существует определенная связь между способностью зародышей осуществлять организованное и специфическое изменение внутриклеточной локализации митохондрий и способностью успешно проходить первые деления дробления (Muggleton-Harris, Brown 1988; Barnett, Bavister 1996). Однако, подобные наблюдения входят в противоречие с данными о низкой метаболической активности и отсутствии дефинитивной структуры митохондрий вплоть до восьмиклеточной стадии развития (Hillman, Tasca 1969; Biggers, Borland 1976). Полагают, что на начальных этапах развития все энергетические потребности эмбриона покрываются за счет расходования запаса АТФ, накопленного в процессе оогенеза (Grinsberg, Hillman, 1973). Возможно вследствие этого общепринято, что митохондрии не играют или играют лишь незначительную роль в формировании структурной организации зародыша на ранних этапах эмбрионального периода.

Исходя из вышеизложенного, основная цель работы состояла в прижизенном изучении структурно-функциональной организации эмбрионов мышей различных генотипов на двуклеточной стадии развития, соответствующей периоду активации эмбрионального генома. Конкретные задачи исследования сводились к следующему:

2. Исследовать динамику локализации митохондрий на протяжении двуклеточной стадии развития у эмбрионов мышей разных генотипов, обладающих неодинаковыми потенциями к развитию in vitro.

П. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Боголюбова, Наталья Алексеевна

выводы

1. Характер внутриклеточной локализации митохондрий у зародышей, находящихся на двуклеточной стадии развития, обусловлен особым морфофункциональным состоянием ядра, связанным с активацией эмбрионального генома и начальными этапами формирования ядрышек, а также особенностями ядерно-цитоплазматического транспорта на этой стадии развития.

2. Темпы формирования, размер и местоположение митохондриальных кластеров, образующихся при развитии "двуклеточного блока in vitro", специфичны для эмбрионов каждого из блокирующихся генотипов.

3. Изменения локализации функционально активных митохондрий в ходе возникновения и развития "двуклеточного блока in vitro" и при остановке дробления на двуклеточной стадии в результате действия ингибиторов клеточной пролиферации различны.

4. Успешность развития эмбрионов мышей in vitro зависит от того, на каком этапе периода активации эмбрионального генома производится эксплантация. Длительность периода пребывания в материнском организме у эмбрионов, предрасположенных к "двуклеточному блоку in vitro", необходимая для обеспечения их полного доимплантационного развития в культуре, для линий мышей MF1 и Sic(Rb8<=>17) различна.

6. Формирование тетраплоидных соматических гибридов из бластомеров двуклеточных эмбрионов разных генотипов сопровождается вначале слиянием цитоплазматических мембран и образованием единого дикариона без интенсивного перемешивания митохондрий партнеров слияния, а затем интеграцией их цитоплазматического и ядерного материала, которая завершается в момент объединения хромосом на веретене деления на стадии метафазы. При дальнейшем развитии тетраплоидных зародышей, сестринские бластомеры способны асинхронно проходить митоз.

7. Объединение в составе продукта слияния пары бластомеров, состоящей из предрасположенного к "двуклеточному блоку" и компетентного к развитию in vitro бластомера влечет за собой быстрое перераспределение митохондрий в цитоплазме блокирующегося партнера и приводит к появлению картины распределения митохондрий, сходной с наблюдаемой у эмбрионов, компетентных к развитию в культуре.

Автор посвящает свою работу памяти своего первого научного руководителя Галины Григорьевны Секириной, безвременно ушедшей из жизни.

Автор выражает искреннюю признательность за плодотворное сотрудничество И.О. Боголюбовой, И.Э. Негановой, Н.В. Антоновой.

Автор от души благодарит весь коллектив Лаборатории морфологии клетки и ее руководителя Владимира Николаевича Парфенова за внимание, оказанное при подготовке этой работы, товарищескую поддержку и постоянную готовность оказать любую посильную помощь.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Боголюбова, Наталья Алексеевна, Санкт-Петербург

1. Секирина Г.Г., Боголюбова Н.А. 1993. Динамика формирования тетраплоидных ядер и топографии митохондрий в соматических гибридах блакстомеров зародышей мыши. Цитология 35 (10): 61

2. Список цитированной литературы

3. Дыбан А.П. 1974. Опыты на зародышах млекопитающих. В кн. Методы биологии развития. М. Наука. 217-245.

4. Дыбан А.П., Секирина ГГ., Игнатова Т.Н. 1981. Развитие in vitro клеточных гибридов, полученных из яйцеклеток и изолированных бластомеров зародышей мышей. Цитология. 23: 120-126.

5. Крохина Т.Б., Надеждина Е.С. 1991. Роль элементов цитоскелета в процессе возвращения в центр клеток их ядер, смещенных центрифугированием. Цитология. 33: 28-34.

6. Паткин Е.Л. 1980. Исследование структурного гетерохроматина на начальных стадиях развития зародышей мышей. Онтогенез. 11: 49-55.

7. Северова Е.Л. 1990. Ядрышкообразующие районы хромосом и аргентофильные ядерные белки в раннем эмбриогенезе мышевидных грызунов: Автореф. канд. дисс. 22с.

8. Секирина Г.Г., Неганова И.Э.1996. Преодоление "двуклеточного блока"зародышей мышей в агрегационных химерах. Онтогенез. 27: 361-370.

9. Секирина Г. Г., Неганова И. Э., Боголюбова Н. А., Почукалина Г. H., Парфенов В. Н.1997. Ядро и ядерно-цитоплазматические взаимоотношения на стадии активацииэмбрионального генома у мышей. Цитология. 39:101.

10. Скоблина М.Н., Васецкий С Г., Секирина Г Г., Билинкис A.A. 1982. Гибридизацияооцитов морской звезды Aphelasterias Japónica. Журн. общ. биологии. 43: 847-853.

11. Abramczuk J., Solter D., Koprowski H. 1997. The beneficial effect of EDTA on development of mouse one-cell embryos in chemically defined medium. Dev Biol. 61: 378-383.

12. Akiyama Т., Ishida J., Nakagawa S., Ogavara H., Watanabe S., Itoh N., Shibuya M., Fukami Y. 1987. Genistein, a specific inhibitor of tyrosine-specific protein kinases // J Biol. Chem. 262: 5592-5595.

13. Aoki F.T., Choi Т., Mori M., Yamashita M., Nagahama Y., Kohmoto K. 1992. A deficiency in the mechanism for p34cdc2 protein kinase activation in mouse embryos arrested at 2-cell stage. Dev Biol. 154: 66-72.

14. Aoki F., Worrad D.M., Schultz R.M.1997. Regulation of transcriptional activity during the first and second cell cycles in the preimplantation mouse embryo. Dev. Biol. 181: 296307.

15. Anderson E., Condon W., Sharp D. 1971. A study of oogenesis and early embryogenesis in the rabbit, Oryctolagus cuniculus, with special reference to the structural changes of mitochondria. J. Morphol. 130: 67-92.

16. Bachvarova R., De Leon V. 1980. Polyadenilated RNA of mouse ova and loss of maternal RNAin early development. Dev. Biol. 74: 1-8.

17. Ball E. H., Singer S.J. 1982. Mitochondria are associated with microtubules in cultured fibroblasts. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 79: 123-126.

18. Barnett D. K, Kimura J., Bavister B.D. 1996. Translocation of active mitochondria during hamster preimplantation embryo development studied by confocal laser scanning microscopy. Dev. Dyn. 205: 64-72.

19. Barnett D. K., Bavister B.D. 1996. What is the relationship between the metabolism of the preimplantation embryos and their developmental competence? Mol. Reprod. Dev. 43: 105-133.

20. Barnett D.K., Clayton M. K., Kimura J., Bavister B.D. 1997. Glucose and phosphatetoxicity in hamster preimplantation embryos involves disruption of cellular organisation,including distribution of active mitochondria. Mol. Reprod. Devel.48: 227-237.

21. Batten В. E., Albertini D. F., Ducibella T. 1987. Patterns of organelle distribution in mouseembryos during preimplantation development. Am. J. Anat. 178: 204-213.

22. Bavister B.D. 1988. A microchamber devise for maintaining a constant carbon dioxyde inair atmocphere during prolonged culture of cells in the stage of an inverted microscope. Invitro Cell. Dev. Biol. 24: 795-803.

23. Bement W. M., Gallicano G.I., Capeo D.G. 1992. Role of the cytoskeleton during early development. Micr. Res. Tech. 22: 23-48.

24. Bennet J., Mazia D. Interspecific fusion of sea urchin eggs. 1981. Surface events and cytoplasmic mixing. Exp. Cell Res. 131: 197 207.

25. Brown J.J. 1991. Cleavage arrest during mouse preimplantation development in vitro. PhD Thesisis. L. Univ. of London. 230 p.

26. Calarco P.G., Brown E.H. 1969. An ultrastructural and cytological study of preimplantation development of the mouse. J. Exp. Zool. 171. 253-283. Calarco P.G. 1995. Polarisation of mitochondria in the unfertilized mouse oocyte. Dev. Genet. 16: 36-43.

27. Camous S., Heyman Y., Meziou W., Menezo Y. 1984. Cleavage beyond the block stage and survval after transfere of early bovine embryos cultured vith trophoblastic vesicles. J Reprod. Fert. 72:479-85.

28. Chavez D.J. 1984. Embryology of the mouse from ovulation through peri-implantation stages in vitro. Scan. Electron. Microsc. 3: 729-735.

29. Clark M. A., Shay J.W. 1982. Mitochondrial transformation of mammalian cells. Nature. 295: 605-607.

30. Dawson K M., Baltz J.M. 1997. Organic osmolytes and embryos: substrates of the Gly and beta transport systems protect mouse zygotes from effect of raised osmolality. Biol. Reprod. 56: 1550-1558.

31. Ducibella T., Ukena T., Karnovsky M., Anderson E. 1977. Changes in cell surface and cortical cytoplasmic organization during early embryogenesis in the preimplantation mouse embryo. J. Cell Biol. 74: 153 167.

32. Dudani A.K., Austin R.S., Venner T.J. Gupta P.S. 1990. Effect of antimitotic and antimitochondrial agents on the cellular distribution of microtubules and, mitochondria. Cytobios. 63: 95-108

33. Du Z.F., Wales R.G. 1993. Effect of culture from the zygote stage on the metabolism of glucose and glutamine by 2-cell embryos and blastocysts recovered from outbred or F1 hybrid female mice. Reprod Fértil Dev. 5: 555-565.

34. Du Z.F., Wales R.G. 1993. Effect of culture from the zygote stage on the metabolism of glucose and glutamine by 2-cell embryos and blastocysts recovered from outbred Fi hybrid female mouse. Reprod. Fert. Dev. 5: 555-565.

35. Dyban A.P. 1983. An improved method for chromosome preparation from preimplantation mammalian embryos, oocytes or isolated blastomeres. Stain Technol. 58. 69 72.

36. Dyban A.P., Severova E.L., Zatsepina O.V., Chentsov Y.S. 1990. The silver-stained NOR and argentophilic nuclear proteins in early mouse embryogenesis: a cytological study. Cell Differ. Devel. 29: 165 179.

37. Elsheikh A S., Takahashi Y., Tanaka H., Hishinima M., Kanagawa H. 1995. Electrofusion of zona-free mouse embrome cells in electrolytes and their development in vitro. J. Vet. Res. 43: 125-134.

38. Gardner D.K., Lane M. 1996. Alleviation of the "2-cell block" and development to the blastocyst of CF1 mouse embryos: role of amino acids, EDTA and physical parameters. Hum Reprod. 11: 2703-12.

39. Graham C.F. 1971. Virus-assisted fusion of embryonic cells. Acta endocrinol. Suppl. 153: 154-165.

40. Graham C.F. 1972. Genetic manipulation of mouse embryos. Adv. Biosci. 8: 263-273. Graham C.F., Lehtonen F. 1979. Formation and conseqenses of cell patterns in preimplantation mouse development. J Exp. Embr. Morph. 49: 277-294.

41. Gallicano G.L., Capeo D.G., McDaudhey R.W. 1990. Cytoskeletal sheets comprised of intermediate filaments: novel cytoskeletal elements characteristics of mammalian embryos. J Cell Biol. Ill: 481-491.

42. Grinsberg L., Hillman N. 1973. ATP metabolism in cleavage- stage mouse embryos. J Exp. Embr. Morph. 30: 267-282.

43. Hahnel A. C. Gifford D.G., Heikkila J.J., Schultz G.A. 1986. Expression of a major heat shock protein (hsp 70) family during early mouse embryo development. Teratog., Carcinog., Mutag. 6: 493-510.

44. Hirokawa N. 1982. Cross-linked system between microfilaments, microtubules and membranous organells in frog axons revealed by the quick-freese, deep-etching method. J. Cell. Biol. 94: 129-142.

45. Howlett S., Bolton V. 1985. Seqúense and regulation of morphological and molecular events durind the first cell cycle of mouse embryogenesis. J Exp. Embr. Morph. 87: 175206.

46. Hughes T. A., Cook P.R. 1996, Mimosine arrests the cell cycle after cells enter S-phase. Exp. Cell. Res. 222: 275-280.

47. Johnson M.H., McConnell G., Van Blercom J. 1984. Programmed development in the mouse embryo. J Exp. Embr. Morph. Suppl: 197-231.

48. Kappus H. 1986. A survey of chemicals inducing lipid peroxydation in biological systems. Chem. Phys. Lipids. 45: 105-115.

49. Kalejta R.F., Hamlin J.L. 1977. The dual effect of mimosine on DNA replication Exp.Cell.Res. 231: 173-183.

50. Karasiewicz J., Modlinski J. 1985. Dislocation of gold particles in the cytoplasm of mouse zygotes during cleavage. Roux's Arch. Dev. Biol. 194: 495-497.

51. Kidder G.M. Mc Lachlin J.R. 1985. Timing of transcription and proteine syntesis in preimplantation mouse embryos. J Exp. Embr. Morph. 89: 223-234. Kidder G.M. 1992. The genetic programm for preimplantation development. Devel. Genet. 13: 319-325.

52. Kidder G.M. 1993. Genes, involved in cleavage, compaction and blastocyst formation. In: Genes in mammalian reproduction Wiley-Liss Inc : 45-71.

53. Kruip T. A. M., Cran D.G., van Benden T. H., Dieleman S. J. 1983. Structural changes inbovine oocytes during final maturation in vivo. Gamete Res. 8: 29-47.

54. Maneijvala F.M., Logan C.Y., Schultz R.M. 1991. Regulation of hsp 70 m RNA levels during oocyte maturation and zygotic gene activation in the mouse. Dev. Biol. 144: 301308.

55. Marinos E. 1986. Observation of the mitochondrial distribution in normal, rotated, fnd cold- treated 2-cell stage embryos of Xenopus laevis.

56. Maro B, Johnson M.H., Pickering S.J., Louvard D. 1985. Changes in the distribution of membranous organelles during mouse early development. J. Embryol. Exp. Morphol. 90: 287-309.

57. Maro B., Johnson M.H., Webb M. 1986. Mechanisms of polar body formation in the mouse oocyte: an interaction between the chromosome, the cytoskeleton and the plasma membrane. J. Embryol. Exp. Morphol. 92: 11-32.

58. Modica-Napolitano J., Aprille J. 1987. Basysis of selective cytotoxity of rhodamine 123. Cancer Res. 47: 4361-4365.

59. Nangaki M., Sato-Yoshitake R., Okada Y., Noda Y. Takemura R., Yamazaki H., Hirokava N. 1994. KDF1B, a novel microtubule plus end directed monomeric motor protein for transport of mitochondria. Cell. 79: 1209-1220.

60. Nasr-Esfahani M.H., Aitken JR., Johnson M.H. 1990 a. Hydrogen peroxide levels in mouse oocytes and early cleavage stage embryos developed in vitro and in vivo.Development. 1990. 109: 501-507.

61. Nasr-Esfahani M.H., Johnson M.H., Aitken J.R.1990 b. The effect of iron end iron chelators on the in vitro block to the development of the mouse preimlantation embryos: BAT6 a new medium for improved culture of mouse in vitro. Hum. Reprod. 5: 9971003.

62. Nasr-Esfahani M.H., Johnson M.H. 1991. The origin of reactive oxygene species in mouse embryos, cultured in vitro. Development. 113: 551-560.

63. Natsuyama S., Noda Y., Yamashita M., Nagahama Y., Mori T. Superoxide dismutase and thioredoxin restore defective p35cdc2 kinase activation in mouse two-cell block // BiochimBiophys Acta. 1993. V.1176. P.90-94.

64. Nogues C., Ponsa M., Egozcue J., Vidal F. 1995. Cytogenetic studies of oocyte fusion products. Zygote. 3: 27 29.

65. O' Fallon J. V., Wright R.W. 1986. Quantitative determination of the pentose phosphate pathway in preimplantation embryos. Biol. Reprod. 34: 58-64.

66. Pereira A.J., Dalby B., Stevart R. J., Doxsey S.J., Goldstein G.S. 1997. Mitochondrial association of a plus end -directed microtubule motor expressed during mitosis in Drosophila melanigaster. J. Cell Biol. 136. 1081-1090.

67. Petzoldt U. 1984. Regulation of stage-specific gene expression during early mouse development: effect of cytochalasin B and aphidicolin on stage-specific protein synthesis in mouse eggs. Cell Differ. 15: 163-167.

68. Petzoldt U., Muggleton-Harris A. 1987. The effect of the nucleoplasmic ratio on protein synthesis and expression of a stage-specific antigene in early cleaving mouse embryos. Development. 99: 481-491.

69. Piko L., Clegg K B. Quantitative changes in total RNA, total poly (A) and ribosomes in early mouse embryos // Develop. Biol. 1982. Vol.89. P. 362-378.

70. Richter HP., Scheurich P., Zimmerman U. 1981. Electric field-indused fusion of sea urchin eggs. Dev. Growth Differ. 23: 479-486.

71. Renaurd J.P., Babinet C. 1986. Identification of the parental developmental effect on thecytoplasm of one-cell stage mouse embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83. 6883-6886.

72. Sathananthan A.H. 1997. Ultrastructure of the human egg. Hum. Cell. 10: 21-38.

73. Sakkas D., Batt P A., Cameron A.W. 1989, Development of preimplantation goat (Caprahircus) embryos in vivo and in vitro. J. Reprod. Fert. 87: 359-365.

74. Salmeen I., Zahmanidis P., Jesion G., Feldkamp L. 1985. Motion of mitochondria incultured cells quantitified by analysis digitized images. Biophys J 48: 681-686.

75. Soupart P. 1980. Initiation of mouse embryonic development by oocyte fusion. Arsh.1. Androl. 5: 55-57.

76. Schultz G.A. 1986. Utilisation of genetic information in the preimplantation mouse embryo. In: Experimental approaches to mammalian embryonic development. NY. Cambrige Univ.Press. pp 239-265.

77. Schultz R.M. 1993. Regulation of zygotic gene activation in mouse. Bioessays. 1993. 15 . 531-538.

78. Schwartz D.A., Schultz R.M. 1992. Zygotic gene activation in mouse embryo: involvement of cyclic adenosine monophosphate-dependent protein kinase and appearance of an AP-l-like activity. Mol Reprod Dev. 32: 209-216.

79. Soupart P. 1980. Initiation of mouse embryonic development by oocyte fusion. Arch. Androl. 5: 55 57.

80. Stern S., Biggers J.D., Anderson E. 1971. Mitochondria and early development of the mouse. J Exp Zool. 176: 179-192.

81. Sturmer K., Baumann O., Waltz B. 1995. Actin- dependent light-induced translocation of mitochondria and ER cisternae in the photoreceptor cells of the locust Shistocerca gregaria. J Cell. Sci. 108: 2273-2283.

82. Summers M.C., Bhatnagar PR, Lawitts J.A., Biggers J.D. 1995. Fertilization in vitro of mouse ova from inbred ans outbred strains: complete preimplantation embryo development in glucose-supplemented KSOM. BiolReprod. 53: 431-437.

83. Summerhayes J., Wong D., Chen L.B. 1983. Effect of microtubules and intermediate filaments on mitochondrial distribution. J Cell. Sci. 61: 87-105.

84. Surani A., Barton S., Burling A. 1980. Differentiation of 2-cell and 8-cell mouse embryosarrested by cytosceletal inhibitors. Exptl. Cell Res. 125: 275-286.

85. Suzuki S., Kitai H., Endo Y., Kurasawa S., Komatsu S., Onba M., Iisuka R. 1987.

86. Cytoplasmic factors in oocyte maturation, fertilization and early development.

87. AnnN. Y. Acad. Sci. 541: 349-365.

88. Taylor K.D., Piko L. 1987. Patterns of mRNA prevalence and expression of B1 and B2 transcripts in early mouse embryos. Development. 101: 877-892.

89. Telford N.A., Watson A.J., Schultz G.A. 1990. Transition from maternal to embryonic control in early mammalian development: a comparison of several species. Mol Reprod Dev. 26: 90-100.

90. Vale R.D., 1987. Intracellular transport using microtubule-based motors. Ann. Rev. Cell Biol. 3: 347-378.

91. Vale R.D., Fleterrick R.J. The design plane of kinesine motors. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 13: 745-777.

92. Van Blerkom J., Runner H., Meredith N. Mitochondrial reorganization during resumption of arrested meiosis in the mouse oocyte // Am. J. Anat. 1984. Vol. 171:3. P. 335-355.

93. Wiekowski M., Miranda M., Da Pamphilis M.L. 1991. Regulatioon of gene expression in preimplantation mouse embryos: effects of zygotic gene expression at the first mitosis on promoter and enhanser activities, Dev Biol. 147: 403-414.

94. Wang Q, Latham K.E. 1997. Requirement for proteine synthesis during embryonic genome activation in mice. Mol. Repr. Dev. 47: 265-270.

95. Whittingham D.G. 1966. A critical phase in the cultivation of mouse ova in vitro. J Cell Biol. 31: 123a.

96. Whittingham D.G., Biggers J.D. 1967. Fallopian tube and early cleavage in the mouse. Nature. 213: 942-943.

97. Zheng Q., Chang D. C. Reorganization of cytoplasmic structures during cell fusion // J. Cell Sci. 1991. Vol. 100. P. 431-442.

Информация о работе

Боголюбова, Наталья Алексеевна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2000
ВАК 03.00.25

Диссертация

Морфофункциональные особенности эмбрионов мыши на двуклеточной стадии развития, анализ двуклеточного блока in vitro - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы