Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль генотипов и их взаимодействия в процессе индивидуального развития мыши (MuS MUSCULUS)

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Роль генотипов и их взаимодействия в процессе индивидуального развития мыши (MuS MUSCULUS)"

Национальная Академия наук Украины Институт молекулярной биологии и генетики

г о ОД

г 1\ нов mi

Вагина Ирина Николаевна

УДК 575.16 575.22 591.3

Роль ГЕНОТИПОВ И ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В ПРОЦЕССЕ ИНДИВИДУАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ МЫШИ (Mt7S MUSCULUS)

03.00.26 — молекулярная генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Киев - 1997

Диссертацией является рукопись

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии и генетики HAH Украины, г.Киев

Научный руководитель: доктор биологических наук

С'оломко Александр Петрович Институт молекулярной биологии и генетики HAH Украины, г.Киев зав. отд. биохимической генетики Официальные оппоненты: доктор биологических наук

профессор Иалюта Станислав Станиславович Институт молекулярной биологии и генетики HAH Украины, г.Киев зав. отд. молекулярной генетики

кандидат биологических наук Лакиза Ольга Викторовна Украинский научный гигиенический центр МОЗ Украины, г.Киев ст.н.с.

Ведущее учреждение: Институт разведения и генетики

животных, Украинская Академия Аграрных Наук, г. Б.Александровка

Защита диссертации состоится 1997 г. в /г часов на

заседании специализированного ученого сонета Д.01.86.01 Института молекулярной биологии и генетики HAH Украины по адресу: 252143, г.Киев-143, ул. академика Заболотного, 150.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии и генетики HAH Украины, 252143, г.Киев-143, ул. академика Заболотного, 150.

Автореферат разослан 1997 г.

Ученый секретарь

специализированного ученого совета кандидат биологических наук \ "J Лукаш J1.JI.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Ахтуалыгость проблемы. Процесс становления организмов в индивидуальном развитии уже не первое столетие находится в центре внимания Сиологов, однако большинство проблем, касающихся, в первую очередь, механизмов реализации программы пренатального онтогенеза, все еще далеки от своего решения. Раннее развитие млекопитающих характеризуется двойным генетическим'обеспечением, а именно: генопро-дуктами, накопившимися в оогенезе, а также генопродуктами, образовавшимися в результате транскрипции и трансляции генов зародышей. Контролирующие механизмы доимплантационного развития млекопитающих включают в себя сложные взаимодействия между материнской генетической информацией, реализованной в оогенезе, и реализующейся в ходе дробления генетической информацией "ранних генов" зародышей, а также эпигеномными механизмами, в том числе расположением, количеством и свойствами бластомеров, многие из которых предопределяются до и в ходе первых делений дробления [Дыбан, 1987]. Уже на доимплантационной стадии развития существенное значение имеют генетически предопределенные взаимоотношения матери со своим будущим потомством. Малейшее несоответствие во взаимных реакциях эмбриона и матери может привести либо к потере зародышей, либо к возникновению серьезных морфо-физиологических аномалий. Современный уровень познания механизмов пренатального развития млекопитающих не позволяет воспроизвести in vitro те сложные регуляторные механизмы, которые участвуют в развитии зародышей млекопитающих in vivo. Вместе с тем микроманипуляции с доимплантационными зародышами, в том числе и с введением чужеродной ДНК, используются для изучения раннего эмбриогенеза. Следствием указанных процедур является, .как, ¿правило, понижение жизнеспособности эмбрионов, что выражается в уменьшении количества клеток у части бластоцист к моменту имплантации. В свою очередь удлинение доимплантационного периода позволяет таким зародышам увеличить количество клеток перед имплантацией и в дальнейшем успешно имплантировать. В связи с вышеизложенным представляется важным оценить способность к имплантации и выживаемость зародышей мышей с различной клеточной массой, развивавшихся в экспериментально созданных условиях задержки имплантации; выяснить, какова роль взаимодействия генотипов ^матери и эмбрионов на ранних стадиях эмбриогенеза; изучить 'B&sAÁS'éjtfbiHflé чужеродного генома и генома хозяина.

Связь работа с .научными программами, планами, темами. Исследования проводились в рамках тематических планов ИМБиГ НАНУ № 2.34.1.3 "Исследования структуры и стабильности трансгеномов в системе in vivo"

(1987-1990); № 2.34.1.3 "Вивчення регуляцх! eiccnpecil геному на paHHix стад1ях ембр1огенезу mhdjí" (1991-1995) и № 2.28.7.2 "Достижения ядерно-цитоплазматичних взаемод1й в ло!мгшантац1йному розвитку Miinii" (1996-2000), а также поддержаны грантами Государственного Фонда Фундаментальных Исследований Украины № Ь.2/3, № 5.4/172 и грантом МНФ № U47000.

Цель, и задачи исследования. Целью работы- явилось выяснение зависимости пренатального развития мышей от генотипических и морфологических различий зародышей, а также определение поведения экзогенной ДНК и фенотипических эффектов, обусловленных ее взаимодействием с геномом хозяина. Исходя из цели исследований были поставлены следущие задачи:

1. Изучить влияние взаимоотношений мать-потомок на развитие и выживаемость зародышей мышей различных генотипов при внутри- и межлинейных трансплантациях.

2. Оценить особенности развития эмбрионов мышей различных инбредных линий в оптимизированных условиях культивирования in vitro.

3. Проанализировать последствия взаимодействия чужеродной ДНК, микроинъецированной в пронуклеусы зигот мышей, с геномом хозяина.

4. Оценить влияние задержки имплантации на развитие бластоцист мышей развивавшихся in vivo и in vitro.

Научная новизна. Впервые установлено, что в условиях искусственно создаМбй диапаузы бластоцисты, развивающиеся in vitro и имеющие уменьшенное количество клеток к моменту кавитации, как правило, догоняли по этому показателю бластоцисты, развивающиеся in vivo. Данные по развитию зародышей, полученных в результате микроманипуляций (1/2 эмбрионов, тетраплоиды, эмбрионы с половинным ЯЦС), позволяют с большой определенностью указать на факторы, определяющие готовность бластоцист к имплантации. Существенное увеличение веса развивающихся совместно аллогенных и сингенных эмбрионов подтверждает представление о важности генетических различий в системе мать-плод для благоприятной реализации генотипических потенций развивающихся эмбрионов. Показано, что успех развития зигот in vitro зависит от их генотипических особенностей и биологического возраста (времени, прошедшего с момента оплодотворения). Отмечена полная элиминация вирусспецифических последовательностей векторной молекулы в результате взаимодействия генома мыши с интегрированной геномной ДНК вируса саркомы Рауса птиц.

Ирахчтчвсхая ценность. Для повышения успеха трансплантаций зародышей различных видов животных необходим подбор оптимальных сочетаний мать-плод, в том числе по генотипической принадлежности.

Разработанная модель задержки имплантации перспективна б качестве системы для повышения жизнеспособности эмбрионов, подвергшихся различным экспериментальным манипуляциям, приводящим к уменьшению числа клеток у бластоцист. При культивировании in vitro необходимо учитывать, что успешнее развиваются зиготы, полученные через 26-28 ч. после оплодотворения, имеющие два четко видимых пронуклеуса, расположенных близко от центра зиготы.

Личная вклад соискателя. Основные результаты, изложенные в диссертации, получены автором самостоятельно.

Апробация работа. Материалы диссертации докладывались на: 5 Украинском биохимическом съезде (Ивано-Франковск, сентябрь 1987), Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии" (Пущино, октябрь 1988), Международном генетическом конгрессе (Торонто, Канада, август 1988), школе-конференции "Структура и функции биополимеров" (Львов, февраль 1989), 27 Конгрессе Общества по изучению репродукции (Мичиган, США, июль 1994), рабочем совещании "Консервация генетических ресурсов" (Путцино, Россия, май 1996), на межотдельском семинаре ИМБиГ(май 1997).

Публикации. Содержание работы изложено в 12 печатных работах.

Структура и объем работа. Работа состоит из вступления, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Диссертация изложена на стра-

ницах текста. Иллюстративный материал представлен 12 таблицами и 10 рисунками. Список литературы включает 283 работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали 1.5 — 3 месячных мышей инбредных линий BALB/c, CBA/Lac, C57Bl/6j, ICR, а также гибридных мышей B6D2F1 (BALB/c х C57Bl/6j) .

Получение зародышей и типы пересадок, используемые при изучении развития и выживаемости зародышей мышей при внутри- и межлинейных трансплантациях. Для получения зародышей определенного срока развития виргинных самок подсаживали к самцам той же линии на ночь. Факт покрытия устанавливали по наличию вагинальных пробок и день их обнаружения считали нулевым днем беременности. Трехдневных зародышей вымывали из матки средой 199 и пересаживали в левый рог матки псевдобеременным самкам. Пересадки зародышей проводили по методикам, описанным ранее [McLaren, Michie, 1956; Дыбан, 1974; Евсиков, Морозова, 1977], с нашими модификациями. Были проведены следующие типы пересадок: межлинейные ; внутрилинейные; совместные- в один рог матки самок-реципиентов пересаживали равное количество зародышей одной стадии раз-

вития двух фенотипически различимых линий; синхронные ("3-+3") - 3-дневных зародышей пересаживали самкам-реципиентам третьего дня псевдобеременности и асинхронные ("3->2")- 3-дневных зародышей переносили самкам второго дня псевдобеременности. В качестве контроля использовали зародыши той же линейной принадлежности, полученные при чистолинейном разведении. На 16-й день беременности учитывали число резорбировавших, имплантировавших и 'живых плодов, взвешивали их, а линейную принадлежность определяли по пигментации глаз.

Гормональная стимуляция, выделение и культивирование зародышей. Гормональную стимуляцию самок проводили как описано [Hogan et al., 1986]. Были испытаны различные дозы ГСЖК (гонадотропин сыворотки жеребых кобыл) и чХГ(хорионический гонадотропин человека). Зиготы на стадии двух пронуклеусов вымывали из яйцеводов раствором культуральной среды через различные интервалы времени после введения чХГ. Зародышей культивировали до стадии бластоцист при 37°С в пластиковых чашках Петри в микрокаплях среды Виттена [Whitten, 1971] с добавлением Ыа2-ЭДТА.

Получение и анализ трансгенных животных. Для проведения микроинъекций в качестве донорной использовали ДНК плазмид pATV8 и pBR322. Микроинъекции проводили в мужской пронуклеус зигот с помощью микроманипулятора КМ-2, вводя по 200-400 копий плазмиды на зиготу, пересаживая их затем в яйцеводы псевдобеременных самок. Дот-блот-анализ проводили по методам [Palmiter, 1983; Southern, 1975].

Получение зародышей различных типов в результате ыикроманипуля-ций, их трансплантация и подсчет количества клеток. В качестве доноров зародышей использовали самок гибридных мышей B6D2F1. Были получены четыре типа эмбрионов: контрольные, развивавшиеся in vivo или in vitro с одноклеточной стадии; диплоидные половинки (1/2 эмбриона), полученные прокалыванием плазматической мембраны одного бластомера двуклеточного зародыша; тетраплоидные половинки,, полученные при культивировании зигот in vitro в присутствии цитохалазина D (0,5 мг/мл) в течение 20 ч.; диплоидные половинки с удвоенным содержанием цитоплазмы (уменьшенное наполовину ЯЦС), полученные путем микрохирургического удаления одного из ядер у тетраплоидных половинок эмбрионов. До 10 бластоцист переносили в оба рога матки или в ампулы яйцеводов [Pease et al.,1989; Монк,1990] псевдобеременных самок линии ICR. Беременным самкам-реципиентам — по 3-5 бластоцист в один рог матки или в один яйцевод. При учете динамики числа клеток трехдневные бластоцисты были разделены на две группы: часть использовалась для подсчета количества клеток, остальные переносились в яйцевод самок нулевого дня псевдобеременности. Через три дня их вымывали из матки и подсчитывали количество клеток по

методике Дыбана [ОуЬап, 1983] с последующей окраской Гимза. Статистическую обработку проводили с использованием критерия Стьюдента и анализа х2-

РЕЗУЛЬТАТЕ! И ОБСУЖДЕНИЕ

Развитие и вышваемзсть зародкпей мышей при внутри- и мехлинейных трансплантациях

Система воспроизводства млекопитающих тесно связана с

обеспечением жизнеспособности потомства, начиная с самых ранних стадий беременности. Существенную, хотя все еще недостаточно изученную роль в становлении жизнеспособности особей следующего поколения играют взаимоотношения мать-потомок. Одним из наиболее адекватных подходов для выяснения роли генетической компоненты в предетерминации таких взаимоотношений является метод трансплантации бластоцист. Во многих случаях у трансплантированных зародышей наблюдался эффект, аналогичный гетерозису: вес эмбрионов одного и того же генотипа в условиях аллогенного и сингенного развития существенно различался.

Таблица 1

Вес 16-дневных плодов мышей, полученных при асинхронных пересадках

Линейная принадлежность Количество Вес плодов, мг

плодов самок-реципиентов самок плодов (film)

СБА BALB BALB с зародышами BALB СБА СБА с зародышами BALB 6 10 13 8 12 12 24 9 568,3±22,6**t 588,1±35,l**t 509,8±12,9 558,0±39,7

С5-,В1 BALB с зародышами BALB С51В1 BALB 12 1-1 7 15 18 13 607,2±27,5***t 511,0±24,9 609,2±20,9***tt

BALB BALB с зародышами СБА BALB BALB с зародышами CS1B1 СБА с зародышами СБА 7 7 9 10 10 10 12 3 696,6+33,5*** 521,9±25,7 664,4±34,8***t 574,6

Контроль СБА C57BI BALB 6 10 9 17 23 28 476,4±20,5 493,7+9,5 498,2±19,2

Примечание. Различия в весе достоверны а)»- по отношению к контролю при "?>С,99 и при ""?>0,995; б) т- по отношению к внутрилинейной пересадке при + Р>0, 95 и ПР>0,99.

Анализ веса 16-дневных плодов, развившихся из синхронно и асинхронно пересаженных зародышей, свидетельствует об отсутствии достоверных отличий в весе плодов BALB, СБА и С57В1, полученных при синхронных и асинхронных пересадках. Кроме того, их вес при асинхронных внутрилинейных пересадках достоверно не отличался от веса плодов той же линейной принадлежности из аналогичных пометов контроля. Выяснилось, что плоды СБА, развивавшиеся у матерей BALB самостоятельно или совместно с плодами BALB, были достоверно тяжелее плодов аналогичного генотипа, развивавшихся в матерях СБА (табл.1). Та же закономерность наблюда-

лась при самостоятельном и совместном с BALB развитии плодов С51В1 в самках BALB.Они значительно превосходили в весе плоды генотипа С51В1, полученные в результате внутрилинейных пересадок и в контроле. Выявлено также повышение веса сингенных плодов BALB, развивавшихся с аллогенными плодами СБА и С51В1 после их совместной пересадки самкам BALB. Такая же тенденция сохранялась и для плодов СБА, которые вынашивались самками СВА совместно с эмбрионами BALB.• По-видимому, увеличение веса аллогенных плодов не является следствием отбора на выживаемость или следствием асинхронности пересадок. В противном случае внутрилинейные пересадки сопровождались бы повышением веса выживших плодов, чего на самом деле не наблюдалось. Увеличение веса аллогенных плодов, по всей вероятности, обусловлено материнско-плодными генетическими различиями. Таким образом, при межлинейных и совместных пересадках зародышей мышей используемых линий обнаружено существенное увеличение веса аллогенных и развивавшися совместно с ними сингенных эмбрионов. Это может свидетельствовать о том, что при определенном уровне генетических различий матери и плода складываются более благоприятные условия в организме матери для реализации генотипических потенций развивающихся эмбрионов.

Оптимизация системы для проведения генегико — эмбриологических исследований на

инбредньос линиях мышей

Особенности проведения экспериментов по изучению ряда проблем биологии

развития связаны с необходимостью создания оптимальных условий для гормональной стимуляции самок, а также для культивирования in vitro зародышей на доимплантационной стадии развития. Для того, чтобы проанализировать развитие зародышей мышей разных генотипов in vitro, а также подобрать оптимальные условия для введения гетерологичной ДНК в пронуклеус оплодотворенных яйцеклеток, была проведена оптимизация системы для генетико-эмбриологических исследований. Введение экзогенных рн67гоьтДНК в пронуклеус оплодотворенных яйцеклеток мыши позволяет создать модель, с помощью которой можно исследовать перенесенные гены в процессе развития организма и, что особенно важно, проследить их судьбу, влияние на метаболизм, продуктивность и другие жизненно важные функции.

Создание и изучение условий успешного поддержания развития зародышей нишей в системе in vitro

Были подобраны оптимальные дозы гормонов для суперовуляции самок мышей инбредных линий ICR, CBA/Lac, C57Bl/6j и гибридных самок B6D2F1. Результаты исследований по подбору оптимальных доз гонадотропинов подтвердили положение о том, что одним из важнейших факторов, контролирующих .суперовуляцию, является генотип мышей [Schmidt et al, 1987; Межевикина

-ioa

z

9

5 90

-A

w

\\ \ »

22 23 24 25 26 27 28 Время sour »мдеш» чХГ <чаеы) ^

К § 60

E 70s

I 60

я

40 -30

// t!

i

/

r V

/ f /

'J

4

11

12 13 Время нес

14

15

16

17 18 иод» (иеы) g

Рис 1. Сезонная динамика развития пронуклеусов в зиготах мышей линии ICR после суперовуляции (А) и после естественной овуляции (Б).

• зима ■ лето

—весна ■ осень

и др./ 1991]. С целью создания условий для успешного поддержания раз«-вития зародышей мышей в системе in vitro были испытаны различные культуральные среди. Лучшей по результатам испытаний была признана среда Виттена [Khitten et al., 1971]. Определение временных параметров четкого проявления пронуклеусов является одним из важнейших критериев оплодотворяемости яйцеклеток. Мы отбирали и анализировали зиготы с двумя четко видимыми пронуклеусами, .расположенными близко от центра зиготы. Так, при индуцированной овуляции у самок ICR к 23-му ч. после введения чХГ свыше 80% зигот были с четко еидимыми пронуклеусами, в течение последующих 2-3 часов количество их достигало максимума, а затем резко снижалось к 26 часу (рис.1,А). При этом оба пронуклеуса объединяясь, вступали в метафазную стадию развития. После суперовуляции у самок наблюдалась синхронизация во времени развития пронуклеусов, а динамика оплодотворяемости яйцеклеток была однонаправленной независимо от времени года. В то же время у самок с естественной овуляцией обнаружен большой разброс по времени развития пронуклеусов (рис.1,Б), что свидетельствует о неравномерности созревания и овуляции яйцеклеток у половозрелых самок при естественном течении этого процесса. Такие же закономерности были обнаружены у самок всех используемых линий. Однако у самок C57Bl/6j максимальное количество зигот с двумя четко видимыми пронуклеусами наблюдалось на 1,5-2 часа раньше, чем у самок ICR и CBA/Lac. При культивировании зигот мышей трех линий выявлены линейные различия в способности эффективно развиваться до бластоцист в условиях in vitro. При этом успешнее всего

«о

развивались зиготы мышей линии Cs?Bl/6jr затем СБA/Laс, а зиготы линии ICR в преобладающем количестве останавливались на двуклеточной стадии. Весьма вероятно, что отмеченные различия развития зигот в системе in vitro обусловлены их генотипическиыи особенностями. Наиболее успешно развивались зиготы, полученные от самок через 26-28 ч. после введения чХГ.. При этом число зигот линий ICR и С51В1/6j, развившихся до стадии бластоцисты было значительно больше, чем бластоцист, развившихся из зигот полученных, через 23-25 ч. после введения чХГ (различия достоверны при Р>0,999). Результаты культивирования зигот линии ICR свидетельствуют о том, что их развитие блокируется на двуклеточной стадии (только 5% зигот, вымытых через 23-25 ч. после введения чХГ, развивались до бластоцист). В то же время, успех развития зигот этой линии, вымытых на несколько часов позже,'повышался до 22%. Аналогичная зависимость сына отмечена при культивировании зигот, полученных после естественной овуляции. При культивировании зародышей других видов млекопитакщи:-: обнаружен сходный "блок" [Whittingham, Bavister, 1974; Wright, Bonciioli, 1981] на различных стадиях дробления, соответствующих переключению контроля эмбриогенеза с материнского (на посттраис-крипционном уровне) на эмбриональный геном [Telford et al., 1990]. Результаты наших экспериментов по культивированию зигот мышей свидетельствуют о том, что успех развития in vitro зависит от их генотипичес-ких особенностей и биологического возраста. Блокирование развития зародышей линии ICR с определенной вероятностью удается преодолеть при культивировании зигот, полученных через 26-28 часов после введения чХГ.

Трансгенные мызт полученные микроикъецированхеы длазмид рАТУ8 и pBR322 В качестве донорной ДНК для проведения микроинъекций была взята

плазмида pATV8, созданная на основе плазмиды pBR322 и провирусной ДНК вируса саркомы Рауса кур [Katz et al., 1992]. Главной задачей нашего исследования явилось выяснение влияния эффекта микроинъецирования чужеродной ДНК на выживаемость и жизнеспособность зародышей мышей, а также мы хотели проследить наследование встроеннй последовательности и ее воздействие на жизнеспособность и плодовитость последующих поколений. Было установлено (табл.2), что успех вынашивания самками зародышей, инъецированных плазмидой pATV8, ниже по отношению к контрольной группе, где проводились пересадки зародышей, прошедших все манипуляции, кроме инъекций. Аналогичная закономерность наблюдалась и для самок при трансплантации им зародышей, микроинъецированных плазмидой pBR322. Выяснилось, что выживаемость зародышей в случае инъекции плазмиды pATV8 была ниже, чем при введении плазмиды pBR-322 (различия достоверны при Р>0,999). Можно предположить, что особенности

структуры плазмиды рАТУ8 и ее достаточно большой размер (14 тыс.п.н.) являются основными причинами повышенной частоты летальных повреждений зародышей по сравнению с плазмидой рВй322. По данным дот-блот гибридизации меченной 32Р ДНК плазмид рАТ\78 и рВК322 с тотальной высокополимерной ДНК мышей, количество трансгенных животных в серии с введением

Таблица 2

Результата! пересадок.зародышей, шосроинъецироваюшх плазмидныки ДНК

Иньецированная ДНК Количество

реципиентов инъецированных зародышей родивших самок (%) родившихся мышат (%)

pATVS 80 821 31 (38,8+5,5) 84 (10,2±1,0)

PBR322 25 294 14 (56,0+9,9) 60 (20, 4±2, 3)"*"

Контроль 39 496 27 (69,2±7, 4) *** 83 (16, 7±1,7) *"

Примечание. Различия достоверны при "*'Р>0,999.

плазмиды рАТУЗ было достоверно большим (24 из 52 исследованных мышат,

что составляет 46,2+6,9%), чем в серии с введением плазмиды рВ1*322 (8 из

40 исследованных, что составляет 20,0±6,3%).

Интеграция ДНК плазмиды рАТУ-8 и модификация ее структуры у трансгенных ■ мышей

12 3 4

Рис. 2. Анализ тотальной ДНК трансген- Рис.3. Блот-анализ геномной ДНК транс-ных мышей поколения F0, зонд 32Р pATV8. генных мышей сублинии В9, рестрикция Мыши: 1-В1, 2-В6, 3-В9, 4-В14. EcoRI, зонд 32Р pBR322. 1-9 трансгенние

:.&ппи поколений F0-F5.

Анализ тотальной ДНК из хвостов мьппей F0 показал, что при рестрикции эндонуклеазой EcoRI, которая имеет на плазмиде pATV8 четыре сайта рестрикции, в различных сублиниях обнаруживается по одному фрагменту, разного размера (рис.2). Молекулярный вес фрагментов был в пределах от 2,6 до 5,3 тыс.п.н., что существенно меньше, чем у инъецированной плазмиды pATV8 —14тыс.п.н. После внутрилинейного скрещивания исходных трансгенных мышей ICR с нормальными особями были обнаружены количественные различия в наследовании чужеродной ДНК. В сублиниях В9 и В14 ее наследовали около половины потомков, а в сублиниях В1

и В6 - более 80%. Для исследования структуры интегрированной последовательности мы изучали тотальную ДНК мышей, производных от В9. В качестве позитивного контроля использовали ДНК pBR322 (разные разведения в смеси с ДНК нормальных мышей). В первой серии экспериментов после расщепления ДНК нуклеазой EcoRI и гибридизацией с меченой ДНК pBR322 во всех препаратах ДНК трансгенных мышей разных поколений (F0-F5) этой сублинии был обнаружен один фрагмент (рис.3). Гибридизация с провирусной ДНК вируса саркомы Рауса и ее клонированными фрагментами дала отрицательный результат, что свидетельствовало о селективной элиминации провирусных последовательностей из структуры интегрированного трансгенома. Размер обнаруживаемого фрагмента составил 2,6 - 2,7 тыс.п.н. Было также установлено, что экзогенная последовательность интегрирована в геномную ДНК трансгенных мышей сублинии В9-5 в количестве одной неполной копии введенной последовательности (0,5 генома pBR322 или 1/6 - 1/7 генома pATV8). Таким образом, в случае интеграции плазмиды pATVS мы обнаружили элиминацию практически всех провирусных последовательностей и большей части последовательностей бактериальной векторной плазмиды pBR322. Подобная селективная элиминация вирусного Тк гена отмечена в работах [Газарян и др., 1984; Газарян, 1985; Кузнецова и др., 1989). Механизм селективной элиминации специфических вирусных последовательностей пока неизвестен, однако необходимо отметить, что геномные вирусные последовательности в непермиссивной для вируса системе элиминируются с повышенной частотой. Это, вероятно, отражает специфику взаимодействия негомологичных геномов вируса и хозяина еше на раннем этапе эмбрионального развития.

Биологические эффекты трансгеноза

Анализ результатов скрещивания исходных трансгенных мышей с нормальными мышами той же линии свидетельствует о нарушении репродуктивной функции у ряда трансгенных самок, в основном, за счет повышения эмбриональной смертности. Существенное нарушение репродуктивных способностей отмечено также и в поколении FI трансгенных самок. В сублинии В6 среди потомков второго и третьего поколений выявлены мертворожденные мышата с различной степенью недоразвития хвостов. При изучении влияния чужеродной ДНК на частоту возникновения новообразований у трансгенных мыией проводили сравнение с контрольными животными той же линии ICR, характеризующейся повышенным уровнем спонтанных опухолей молочной железы. Внутривозрастной анализ показал, что частота возникновения новообразований у исходных трансгенных самок (F0) составляет 73±12%, в то время как в контрольной группе этот показатель составляет 31±4% (данные достоверны при Р=0,999). В поколении F1 трансгенных самок выявлена аналогичная закономерность. При сравнительном анализе частоты

возникновений новообразований у трансгенных самцов определенной закономерности не выявлено. Трансгенные мыши обоих полов в возрасте от 6 месяцев имели дефекты кожи, выпадение шерсти, изъязвления на теле и ушах, а также нарушения координации движений — нейропатии. В последующих поколениях уровень проявления этих нарушений изменялся, однако они постоянно обнаруживались и, более того, в поколениях F3-F5 появились мыши с феноменом "мокрой шерсти", имеющие дефицит веса. Таким образом, аномалии развития и повышенный уровень новообразований, скорее всего, являются следствием интеграции в геном мыши экзогенной последовательности. Наиболее вероятно, что интеграция произошла вблизи генов, отвечающих за ранние этапы развития зародышей. Это могло повлиять на регуляцию их экспрессии и, как следствие, повлечь за собой выявленные нами негативные последствия онтогенеза.

+юторы, определяющие готовность бластошст мышей к ИМШ1ЛНТЙЦИИ Для выяснения закономерностей регуляции размеров доимплантаци-

онных зародышей была создана экспериментальная модель з'адержки имплантации. Состояние диапаузы моделировали посредством высокоасинхронных переносов бластоцист в яйцеводы самок нулевого дня псевдобеременности. Пониженная жизнеспособность зародышей, культивированных in vitro или подвергшихся микроманипуляции, обусловлена уменьшеныпением количества клеток у бластоцист к моменту имплантации. Удлинение доимплантационного периода позволяет таким зародышам увеличивать число клеток перед вхождением в состояние диапаузы.

Выживаемость пресаженных бластоцист различных типов у самок-реципиентов при асинхронных трансплантациях

Выяснилось, что место переноса бластоцист ("3—>2", матка, или "3->0", яйцевод) псевдобеременным самкам, вымытых из матки мышей на третий день беременности, не влияло на их выживаемость (табл.3). При этом для полностью жизнеспособных бластоцист ни число имплантаций, ни выживаемость на постимплантанционной стадии не повышались с помощью высокоасинхронных переносов. После переноса бластоцист, развивавшихся in vitro, в яйцеводы самкам нулевого дня псевдобеременности доля живых эмбрионов на 16-й день развития была такой же, как и при переносе бластоцист, развивавшихся in vivo (табл.3). Половинки эмбрионов имели такой же процент имплантаций, как контрольные зародыши, перенесенные в противоположный яйцевод — 62% и 74% соответственно. Однако, доля выживших была значительно (Р>0,999) ниже для половинок эмбрионов (15%), чем для контрольных — 52%. Возможно, пониженная жизнеспособность половинок зародышей вызвана несоответствующим ответом восприимчивой матки псевдобеременных самок-реципиентов. Наиболее высокий процент выживаемости

(Р>0,95) был отмечен при переносе бластоцист, развивавшихся in vivo, беременным самкам-реципиентам (табл.3). Повышение уровня выживаемости на постимплантационной стадии происходило также при переносе половинок зародышей (29% выживших плодов у беременных самок и 15% у псевдобеременных самок).

Таблица 3

Выживаемость паре саженных бластоцист у самок-реципиентов

Реципиенты, место пересадки Типы эмбрионов, условия развития Число беременностей/ число реципиентов % Количество эмбрионов (тольк( у беременных самок)

Пересаженных Имплантировавших (%) Живых на 16-е сутк (%)

Псевдобеременные, матка Бластоцисты, in vivo 94 171 132 (77) 91 (53)

Псевдобеременные, ПЯ и ЛЯ Бластоцисты, in vivo 86 120 80 (67) 57 (48)

ПЯ Псевдобеременные ЛЯ Бластоцисты,in vitro Угбластоцист, in vitro 100 102 111 75 (74) 69 (62) 53 (52) 17 (15)

Беременные, ЛЯ бластоцисты, in vivo 68 47 НО 31 (66)

Беременные, ЛЯ Угбластоцист, in vitro 50 35 НО 10 (29)

Примечания: 1. Пересадки в матку осуществляли на 2-день, в правый (ГШ) или левый (ЛЯ) яйцеводы — в 0 день. 2. -Ф— как интактные, так и 1/2 бластоцист пересаживали одним и тем же самкам-реципиентам. 3. НО — невозможно определить.

Развитие различных типов бластоцист мышей в экспериментально созданных условиях задержки имплантации

Для выяснения регуляции размеров бластоцист определяли количество клеток у них в то время, когда бластоцисты могли бы в норме начинать имплантацию, и спустя три дня после высокоасинхронного переноса, когда в действительности наблюдалась доимплантационная стадия. В условиях культивирования in vitro значительно замедлялось развитие и уменьшалось количество клеток в бластоцистах через 96 ч. после введения чХГ (табл.4). При культивировании зигот в среде без ЭДТА количество клеток у бластоцист уменьшалось наполовину (28,2+0,7 по сравнению с 60,5+1,4 клеток в контроле). Однако бластоцисты, развивавшиеся как in vivo, так и культивированные in vitro, через три дня после переноса в яйцевод выравнивались в развитии, достигая одинакового количества клеток - 110. Зародыши, развивавшиеся из единичных бластомеров двуклеточных эмбрионов, имели на каждой стадии развития половинный набор клеток по сравнению с интактными зародышами. С другой стороны, в течение трех дней задержки имплантации количество клеток в половинках бластоцист также увеличивалось и составляло в среднем 49,9+2,0, что уже сопоставимо с количеством клеток в интактных бластоцистах на день имп-

лантации -60,5+1,4. В целях выявления факторов предопределяющих состояние покоя бластоцист, были получены тетраплоидные половинки зародышей и половинки зародышей с уменьшенным наполовину ЯЦС. После переноса бластоцист в яйцеводы самок нулевого дня псевдобеременности и их после-

Таблица 4

Количество клеток у бластоцист до и через 3 дня после пересадки в яйцеводы псевдоберемеюшх самок

Условия культивирования, типы эмбрионов ЯЦС на 2-кл. стадии Бластоцист на 96-й час после введения чХГ, % Количество клеток у бластоцист на 96-й час после введения чХГ Количество клеток у бластоцист на 190-й час после введения чХГ

In vivo [2N/C] х2 90 [151/164] 60.5 ± 1.4 ' 111.0 ± 3.7 л

In vitro [2N/C]х2 75 [223/298] 38.7 ± 0.9 6 109.3 ± 2.5 *

In vitro, без ЭДТА [2N/C]*2 82 [145/177] 28.2 ± 0.7 * 107.2 ± 3.5 д

In vitro, ^эмбрионов [2N/C] 73 [288/395] 17.8 + 0.8 г 49.9 ± 2.0 '

In vitro, тетраплоиды [4N/2C] 85 [67/79] 16.8 + 0.9 г 51.9 ± 3.8 е

In vitro, '/¿эмбрионов с уменьшенным ЯЦС [2N/2C] 27 [64/238] 17.7 ± 1.1 г 70.5 ± 2.4 ж

Примечания: 1.ЯЦС — ядерно-цитоплазматическое соотношение. 2. 2N — диплоидное ядро. 3. С — объем цитоплазмы одного Эластомера двуклеточного зародыша. 4. В каждой колонке группы со статистически достоверным (Р>0,999) различием по числу клеток отмечены разными буквами.

дующего вымывания на третий день получали бластоцисты шестидневного возраста, синхронизированные во время задержки имплантации и реактивированные в матке на день вымывания. Во время задержки имплантации развитие бластоцист не останавливается внезапно, перед вступлением в состояние покоя бластоцисты увеличивают количество клеток (табл.4). Высокоасинхронный "3-»0" перенос бластоцист показал, что жизнеспособность изначально отстающих в развитии зародышей мывей частично восстанавливается в течение задержки имплантации, что подтверждает данные [Kaufman et al., 1977; Tsunoda, McLaren, 1983]. Результаты no переносу зародышей беременным и псевдобеременным реципиентам (табл.3) позволяют предположить, что низкая жизнеспособность половинок зародышей вызвана некоторым эндогенным фактором, а не отсутствием адекватного ответа со стороны восприимчивой матки (% имплантировавших половинок зародышей такой же высокий, как и у контрольных эмбрионов). По-видимому, увеличе- ' ние количества клеток в половинках бластоцист с задержанной имплантацией является наиболее возможным объяснением повышения уровня выживания зародышей во время высокоасинхронных переносов. Бластоцисты, у которых

количество клеток было наполовину меньше при культивировании в условиях in vitro, в последующие три дня задержки имплантации догоняли по числу клеток контрольные бластоцисты, развивавшиеся in vivo (табл.4). Однако абсолютное количество клеток не является критическим фактором для вхождения бластоцист в состояние покоя, поскольку бластоцисты, развивавшиеся как из диплоидных, так и тетраплоидных половинок зародышей, имели в состоянии покоя меньше клеток, чем контрольные бластоцисты (49,9+2,0 и 51,9+3,8 по сравнению с-109,3+2,5; табл.4). Сходный результат был получен Smith, McLaren, [1977] при определении параметров, определяющих начало образования бластоцист. Подобные результаты исключают количество цитокинезов как наиболее вероятный фактор, запускающий начало имплантации, однако, в качестве возможных

В

60 100 120 140 160 холичетао клеток Рис.4 Распределение количества клеток у бластоцист в условиях задержки имплантации через 190 часов после введения чХГ. (А) '/2бластоцист; (Б) ^бластоцист с удвоенным объемом цитоплазмы; (Б) контроль.

кандидатов на эту роль остаются' число циклов репликации ДНК, либо достижение определенного ЯЦС. Для выбора между этими двумя возможными вариантами были получены половинки зародышей с удвоенным объемом цитоплазмы (уменьшенное в два раза ЯЦС). В условиях задержки имплантации большая часть бластоцист с уменьшенным ЯЦС имела то же количество клеток, что и контрольные половинки бластоцист (рис.4). По-видимому, первичный механизм состояния покоя бластоцист запускается не только определенным ЯЦС, но и неким другим фактором, характерным для восьмого клеточного цикла. С другой стороны, возросшее число клеток в таких бластоцистах (70,5+2,4; табл.4) и тот факт, что распределение зародышей по количеству клеток не подчиняется нормальному распределению (рис.4,Б), подтверждают, что и начало восьмого цикла, и уменьшенное ЯЦС

ответственны за вхождение в состояние покоя бластоцист. Доимплантацион-ное развитие зародышей плацентарных млекопитающих поддерживается, в основном, энергетическими запасами ооплазмы. Следовательно, общий объем зародышей на доимплантационной стадии не подвергается значительным изменениям и при каждом последующем делении количество цитоплазмы в бластомерах уменьшается вдвое. На стадии 120 клеток ЯЦС достигает уровня соматических'клеток [Smith, Johnson, 1986] и поэтому зародыши не могут больше развиваться за счет внутренних энергетических запасов. В интактных бластоцистах восьмой клеточный цикл совпадает со стадией 120 клеток, т.е. с моментом истощения внутренних источников энергии. Этим объясняется, почему общее количество клеток в бластоцистах, развивавшихся в условиях задержки имплантации, не превышает такового по сравнению с бластоцистами, развивавшимися в нормальных условиях непосредственно перед имплантацией [Сорр, 1982]. Получая зародыши с удвоенным объемом цитоплазмы мы сняли ограничения, вызванные высоким ЯЦС и показали, что возможно получить бластоцисты в условиях задержки имплантации с большим количеством клеток на девятом клеточном цикле.На основании полученных данных можно сделать заключение о том, что состояние покоя бластоцист запускается некоторым фактором, характерным для восьмого клеточного цикла, и в нормальных условиях состояние покоя бластоцист обеспечивается снижением метаболической активности в то время, когда зародыши имеют около 120 клеток и ядерно-цитоплазматичес-ксе соотношение достигает уровня соматических клеток.

выводы

1. При межлинейных и совместных пересадках зародышей мышей линий BALB/c, CBA/Lac и C57Bl/6j обнаружено существенное увеличение веса аллогенных и развивающихся совместно с ними сингенных эмбрионов по сравнению с зародышами той же линейной принадлежности в контроле и при внутрилинейных пересадках. Это может свидетельствовать о том, что при определенных генетических различиях матери и плода складываются более благоприятные условия в организме матери для реализации генотипических потенций развивающихся эмбрионов.

2. Установлено, что успех культивирования зародышей в системе in vitro в существенной мере зависит от их генотипических особенностей, а также от времени, прошедшего с момента введения чХГ до вымывания зигот. Найболее успешно развиваются зиготы, вымытые через 26-28 часов после введения чХГ, имеющие два четко видимых пронуклеуса, расположенных близко от центра зиготы.

3. Особенностью развития зигот мышей линии ICR in vitro является наличие "блока" на 2-бластомерной стадии. Блокирование развития с определенной вероятностью (22% зигот развиваются до бластоцист) удается

преодолеть при культивировании in vitro поздних зигот, полученных через 26-28 часов после введения чХГ.

4. Наличие экзогенной ДНК в клетках трансгенных мышей влияет на функционирование генома хозяина, что характеризуется появлением летальных мутаций, снижением плодовитости, повышением частоты новообразований. В случае интеграции чужеродной ДНК отмечена полная потеря последовательностей провирусной ДНК вируса саркомы Рауса и части структуры бактериальной векторной плазмиды.

5. Показано, что бластоцисты, развивавшиеся in vitro и имеющие к ■ моменту кавитации уменьшенное количество клеток, как правило, в условиях экспериментально созданной диапаузы догоняют по этому показателю зародышей, развивавшихся in vivo.

6. Состояние покоя бластоцист достигается в то время, когда зародыш имеет около 120 клеток, а их ядерно-цитоплазматическое соотношение находится на уровне, характерном для соматических клеток. Готовность бластоцист к имплантации определяется, по-видимому, двумя факторами: количеством завершившихся клеточных циклов и ядерно-цитоплазматическим соотношением.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1-Титок Т.Г., Морозова Л.М., Малючик И.Н., Маренич Т.П., Евсиков В.И. Развитие и выживаемость зародышей мышей при внутри- и межлинейных трансплантациях// Цитология и генетика.- 1984.- 8<3.- С. 433-437.

2.Соломко А.П., Рындич A.B., Титок Т.Г., Морозова Л.М., Вагина H.H., Чащина Л.И., Евсиков C.B., Кириченко И.В., Сарапина H.A. Трансгенные мыши полученные на основе плазмид pATV-8 и pBR-322// Биополимеры и клетка,- 1988.- Т.4, №5,- С.267-269.

3.Evsikov S.V., Vagina I.N., Solomko А.P. Mechanisms of cell number regulation in the peri-implantation mouse blastocyst// J. Exp. Zool.-

1996.- V.276, №3,- P.201-208.

4.Вагина И.H., Евсиков C.B., Соломко А.П. Факторы, определяющие готовность бластоцист мышей к имплантации// Биополимеры и клетка.-

1997.- Т.13, №2,- С.161-167.

5.Вагина И.Н., Титок Т.Г., Сарапина H.A., Кириченко И.В., Евсиков C.B., Соломко А.П. Оптимизация системы для проведения генетико-эмбриологических исследований на инбредных линиях мышей.3.Условия гормональной стимуляции самок и культивирования in vitro зародышей на доимплантационной стадии развития у мышей инбредных линий ICR, CBA/Lac и C51Bl/6j// Биополимеры и клетка.-1997.-Т. 13, »3.- С.232-238.

6.Чащина Л.И., Петренко А.И., Вагина И.Н., Крисан К.В., Соломко А.П. Модификации структуры ДНК плазмиды pATV-8 у трансгенных мышей. 1.Исследование структуры интегрированного трансгенома и биологические эффекты трансгеноза// Биополимеры и клетка.- 1997,- Т.13, »4.- С.323-327.

BariHa I.M. Роль генотип1в i ax взаемодИ у npoueci 1Ндив1дуального розвитку мини,— Рукопис.

Дисертац1я на здобуття наукового ступеня кандидата 61олог1чних наук за спец1альн1стю 03.00.26 — молекулярна генетика.— 1нститут молекулярно! 61ологП i генетики НАН Укра1ни, Киав, 1997.

Дисертац1ю присвячено проблем! генетичного контролю хндивл.дуального розвитку миш1. Показано, що генетичн1 розб1жност1 у систем! мати<-ит1д сприяють реал1заиИ генотипових потенц1й ембр1он1в, як1 розвиваються, це виражаеться у суттевому зб1льшенн1 ваги аллогенних i сингенних ембрхонхв, шо розвивалися разом. В1дм1чено, що ycnix розвитку зигот in vitro залежить в1д 1х генотипових особливостей i бюлог1чного в1ку. Виявлено повну ел1м1нац!ю вхрусоспецифхчних посл1довностей векторно! молекули в результат! взаемодИ геному миш! з 1нтегрованою ДНК Bipycy саркоми Рауса nTaxiB. Встановлено, що в умовах штучно створено! дхапаузи бласгоцисти, яка розвиваються in vitro та мають зменшену к1льк1сть кл1тин наздоганяли за цим показником бластоцисти, що розвивалися in vivo. Анал1з розвитку зародк1в п1сля м1кроман1пуляц1й дозволяв э достатньою BiporiflHicTio Еизначити фактори, що зумовлюють TOTOBHicTb бластоцист до iMimaHTauil.

Ключов1 слова: зигота, бластоцист, ембр1он, трансплантац1я зародк1в, трансгенна миш1, д1апауза, 1мплантац1я.

Вагина И.Н. Роль генотипов и их взаимодействия в индивидуальном развитии мыши.— Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.26 — молекулярная генетика.- Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 1997.■

Диссертация посвящена проблеме генетического контроля индивидуального развития мыши. Показано, что генетические различия в системе мать<->плод способствуют реализации генотипических потенций развивающихся эмбрионов, это выражается в существенном увеличении веса аллогенных и сингенных эмбрионов, развивающихся совместно. Отмечено, что успех развития зигот in vitro зависит от их генотипических особенностей и биологического возраста. Обнаружена полная элиминация вирусспецифичес-ких последовательностей векторной молекулы в результате взаимодействия генома мьпли с интегрированной ДНК вируса саркомы Рауса птиц. Установлено, что в условиях искусственно созданной диапаузы бластоцисты, развивающиеся in vitro и имеющие уменьшенное количество клеток догоняли по этому показателю бластоцисты, развивающиеся in vivo. Анализ развития зародышей после микроманипуляций позволяет с большой определенностью указать на факторы, определяющие готовность бластоцист к имплантации.

Ключевые слова: зигота, бластоциста, эмбрион, трансплантация зародышей, трансгенные мыши, диапауза,имплантация.

Vagyna I.N. Role Of Genotypes And Their Interactions In Mouse Ontogenesis.— Manuscript.

Thesis for a candidate's degree on speciality 03.00.26 - molecular genetics.— Institute of Molecular Biology and Genetics, Ukrainian NAS, Kiev, 1997.

Dissertation is devoted to the problem of genetic control of mouse development. It was shown that genetic differences in mother<->foetus system endure the realisation of genotypical potentialities of developing embryos, since the wheights of concurrently developing allogenic and syngenic embryos significantly increase. It was noted that the rate of succes of in vitro development of zygotes depends on their genotypical peculiarities and biological age. As a result of interactions between mouse genome and integrated Rauss avian sarcoma virus DNA, complete elimination of virus-specific DNA sequences from the vector molecule was detected. It was found out that during experimentally produced implantation delay, blastocysts developing in vitro and having fewer cells than in vivo developing blastocysts, gained the cell number of the controls. Analysis of development of manipulated embryos made us suggest the factors responding for the blastocyst readiness for implantation.

Key Words: Zygote, Blastocyst, Embryo, Embryo Transplantation, Transgenic Mice, Diapause, Implantation.