Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспериментальные основы создания низкотемпературного банка эмбрионов лабораторных мышей

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Экспериментальные основы создания низкотемпературного банка эмбрионов лабораторных мышей"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н.К.КОЛЬЦОВА

На правах рукописи

МЕЖЕВИКИНА Людмила Михайловна

УДК 57.043:591.31

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ОСНОВЫ СОЗДАНИЯ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОГО БАНКА ЭМБРИОНОВ ЛАБОРАТОРНЫХ МЫШЕЙ

(03.00.11 - эмбриология, гистология)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1990 г,'

Работа выполнена в Институте биологической физики АН СССР

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Б.Н.Вепринцев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Н.Н.Ротт

кандидат биологических наук А.М.Малашенкс

Ведущая организация: Институт проблем криобиологии и криомедицины АН УССР

Защита диссертации состоится "/&/" С ¿У--- 1990 г.

в ^"*часов на заседагин специализированного совета

Д00285.01 при Институте биологии развития им. Н.К.Кольцова АН СССР по адресу: г.Москва, ул. Вавилова, д. 26.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии развития им. Н.к,Кольцова АН СССР.

Автореферат разослан " ¿^¿/У?^ / 1950

года

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук Е.М.Протопопова

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В вивариях медицинских и научно-исследова-ельских институтов, а также в специализированных питомниках со-гржится огромное разнообразие лабораторных мкшей. Многие из них ■лают наследственную предрасположенность к различным заболеваниям, сть линии с хромосомными нарушениями. На этих животных изучает элезни человека и способы их лечения. Однако' жизнеспособность ли-ейных мышей обычно снижена. Кроме того, всегда существует опас-эсть потери ценных признаков в результате неконтролируемых скре-иааний, мутаций, генетического дрейфа или случайных инфекций. Потому разведение, а тем более постоянное поддержание генетического тандарта линий, представляет собой экономически и технически слабую задачу. В связи с этим существующая система поддержания лабо-аторных мышей должна быть дополнена системой низкотемпературных анков, где эмбриона могут сохраняться в глубокозамороженном виде

течение нескольких лет (Whittingham, 1974; Veprintsev, Rott, 979? Ротт, Вепринцев, 1981),

ГГзвестные в настоящее время способы криоконсервации эмбрионов азработаны на основе чисто эмпирического подбора криопротекторов

их концентраций в среде, скоростей замораживания и оттаивания. В зученных случаях для каждой конкретно взятой линии или даже ста-ии развития выявлены оптимальные условия и режимы криоконсервации Whittinghara, 1979,1981; Mazur, 19S4; Белоус и др., 1986), В то же рекя создание крнобанхов предполагает тиражирование универсальных

достаточно простых способов криоконсервации, применимых к различим объектам. Эмбрионы мышей являются наиболее удобной моделью для зучения механизмов криоповрезкдений и разработки на их основе опти-альных для создания криобанка способов криоконсервации.

Криобанки расширят возможности питомников в деле создания обшир-ых коллекций генетически чистых линий лабораторных животных, обес-ечат высокую однородность эмбриологического материала для проведе-ия современных работ по биохимии, биологии развития, генной и кле-очной инженерии, упростят задачу транспортировки животных на отда-енны-з расстояния, что несомненно окажет положительное влияние на ешениа проблем, принципиально важных для медицины, сельского хо-яяства а фундаментальной науки.

Цель настоящего исследования: подобрать для генетически раэлича-■дихся линий лабораторных мышей оптимальные условия проведения всех тапов криоконсервации, выявить наличкэ или отсутствие мекхлипейных азличий в чувствительности эмбрионов к действию повреждающих фак-оров в процесса замораживания-оттаивания и определить возможность

использования единого для всех линий способа криоконсервации.

Работа выполнена в соответствии с плановой тематикой Института биологической физики АН СССР "Длительное сохранение генетической информации. Физико-химические основы замораживания клеточных систем". •- •

Задачи исследованияг <

1. Для различных ланий лабораторных мышей подобрать условия проведения гормональной суперовуляции, обеспечивающие получение максимального количества жизнеспособных эмбрионов.

2. Определить! оптимальные условия и режима замораживания-оттаивания для эмбрионов различных стадий доимплантационного развития

3. Провести трансплантацию криоконсервированных эмбрионов и подобрать оптимальное сочетание пар "донор-реципиент",

4;. Провести количественный анализ возможных повреждения и гибели эмбрионов на всех этапах криоконсервации.

Научная новизна. Обоснована возможность использования модифицированной среды Виттена с органическим буфером Нереэ на всех этг пах криоконсервации эмбрионов лабораторных мышей, включая их заме раживание. Подобраны оптимальные условия проведения замораживания -оттаивания и выявлены различия в эффективности криозащиты и токсическом действии трех протекторов - ДИСО, глицерина и этиленгли-коля. Показано,, что существующие между инбредными линиями генетик ческие различия не влияют на выживаемость эмбрионов после криокон сервации. Все морфо-функциональные повреждения, вызванные замораживанием-оттаиванием, проявляются в доимплантационном периоде. Обнаружено, что.остановка развития происходит в результате нарушена регуляции делений дробления к ранних морфогенетических процессов. Посла криоконсервации поздних морул и бластоцист повреждаются пре-. имущественно клетки трофобласта, ответственные за имплантацию в , матку, Постимплантационное развитие проходит без отклонений от нормы. Мыши, восстановленные из криоконсервированных эмбрионов,не обраружизают фенотипических отклонений в трех поколениях. Установлено, что при синхронизации и строго определенном сочетании пар . "донор-реципиент" эффективность трансплантации криоконсервированных эмбрионов повышается.

Практическое значение. Подобран универсальный способ криоконсервации для эмбрионов разных линий и стадий доимпалнтацконного , развития мышей и дана рекомендации по его использованию при созда-; вин .генетического криоСанка.

Полученные результаты могут найти применение в экспериментальной эмбриологии при решении вопросов поддержания и разведения ге-

етически чистых линий мышей, при использовании криоконсервирован-ых эмбрионов для тестирования биологически активных препаратов, ри изучении процессов регуляции в раннем эмбриогенезе, в опытах о генной и клеточной инженерии.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на П Всесоюз-ой конференции "Механизмы криоповреждений и криозащиты Оиологи-еских объектов" (Харьков, 1984), П Всесоюзном совещании по куль-ивированию клеток животных и человека (Пувдно, 19 35), Рабочих со-еианиях по криоконсервации генетических ресурсов (Пуиино, 1986, 988), Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы стандартизации абораторньас животных для медико-биологических исследований" (Мос-ва, 1987) , международной конференции "Достижения и перспективы азвития криобиологии и криомедицины (Харьков, 1988), Международом совещании "Создание генетических коллекций лабораторных живот-их" (Пуцино, 1989).-

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных абот в виде статей и тезисов докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 127 границах машинописного текста и состоит из введения, обзора лите-зтуры, описания методов исследования, экспериментальной части, 5суждения результатов и выводов. Работа иллюстрирована 15 рисун-ами, содержит 19 таблиц. Список цитируемой литературы включает 35 отечественных и зарубежных названий.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. Использовали ивбреднах ВАЬВ/с, С57ВЬ/6, ЗА/1ас, А/бп, гибридных Г^ССВА X С57В1/6) и тетрагибрндкых (СВТ'А) лаеЧ. Для синхронизации спаривания и увеличения количества спло-зтворенных яйцеклеток применяли гормональную стимуляцию с помоиьга злликулостимулирующего (СЖК) и хориогонического (ГТХ) гонадотро-1Нов. Гормоны вводили самкам подкожно и внутрибрюшинно в дозах > 5-20 ед с интервалом 48 часов. Беременность устанавливали по 1Личшо копулятивных пробок на следующий день после введения ГТХ.. ;нь обнаружения пробок считали первым днем беременности.

Эмбрионы на стадиях двух и восьми бластомеров вымывали из яйце->дов соответственно на второй и третий день беременности, поздние >рулы и бластоцисты - из маток утром четвертого дня беременвости.

Среды. Для выделения эмбрионов и работы с ними на открытом воз-'хе, а также для замораживания использовали среду с фосфатным бугром Дальбекко (КЫЬЬХпдЬат, 1974) или среду с Оикарбонатным бу-•ром Витгена (ИМЪЬеп, 1971) , в которую для стабилизации рН добав-

•ляли 21 мМ органического буфера Hepes. Среды готовили на бидистил-лированной воде из реактивов фирмы "Serva" и "Merck", антибиотики использовали отечественного производства. Стерилизацию проводили путем фильтрации (диаметр пор 0.22 мкм type НА, Bedford, USA), Отобранных для криоконсервации эмбрионов помещали в пластиковые трубочки (1 X 70 мм), предварительно заполненные 0.05 мл сред* с криопротектором.

Криопротекторы. Использовали 1.5 M ДМСО (димегилсульфоксид, "Serva"), 1.5 M этилснгликоль ("Serva") и 1.0 M глицерин (ultrapure, "BRXj" , USA) . Эквилибрацию эмбрионов с криопротекторами проводили в течение 10-60 мин при 0°, 20-22° и 37°, затем их переносили в предварительно охлажденную до -64 спиртовую баню и через 2-3 мин индуцировали льдообразование в среде.

Замораживание эмбрионов проводили на установке с программным управлением, позволяющей регулировать скорость охлаждения в пределах 0.1 - 10.0вС/мин (Крастс, Хохлов, 1985). По достижении температуры -40-45" образцы переносили в жидкий азот, где они находились от 3 час до 3-4 месяцев.

Размораживание образцов проводили при комнатной температуре со скоростью 25сС/мин или на водяной бане 20-50° со скоростью порядка 500°С/мин. Концентрацию криопротектора в среде снижали от 1.0 -- 1.5 И до 0.25 M путем постепенного разбавления в течение 30 мин при комнатной температуре.

Оценка жизнеспособности. Состояние эмбрионов после размораживания оценивали по результатам микроскопирования. При этом учитывали целостность блестящей оболочки, размеры и форму отдельных бласго-меров, их взаимное расположение, прозрачность перивителлинового пространства. Эмбрионы с нарушенной морфологией отбрасывали как нежизнеспособные.

При отсутствии видимых структурных изменений о жизнеспособности криоковсервированных эмбрионов судили по результатам 1) культивирования iln vitro, 2) тестирования с помощью флуоресцентного красителя этиди.... бромида, 3) трансплантации в матку псевдобеременным самкам-реципиентам.

Культивирование эмбрионов проводили в малом объеме модифицированной среды Виттена (0.2 мл) при 37° и повышенной влажности в атмосфере 5% С02. Длительность культивирования до стадии бластоцис-ты и выхода из блестящей оболочки для 2-х и 8-ми клеточных эмбрионов составляла 72 и 48 час, соответственно. Поздние морулы и бла-стоцисты культивировали не более 12 час.

Флуоресцентно-микроскопический метод определения жизнеспособности проводили с помощью этидиум бромида (Мельникова и др., 1985). Для возбуждения флуоресценции использовали монохроматическое освещение в области -130 нм. Поврежденные эмбрионы в растворах красителя (10~5-10 6 М) через 1-2 мин давали ярко-красное свечение, что свидетельствовало о его проникновении в клетки и связывании с ДНК. При отсутствии свечения эмбрионы оценивались как жизнеспособные.

.'Трансплантация. Эмбрионы на стадиях поздней морулы и бластоцис-ты трансплантировали хирургическим способом в матку лсевдоберемен-иым самкам-реципиентам. Животных оперировали под общим эфирным или нембуталовим наркозом на третий день после- спаривания с вазек-томированными самцами. В среднем каждой самке пересаживали по 5-7 эмбрионов. Результаты оценивали через 18 дней по количеству живорожденных детенышей. В тех случаях, когда беременность не наступала, самок вскрывали и подсчитывали места имплантаций. Разница между числом имплантировавшихся эмбрионов и развившихся до рождения свидетельствовала о постимплантационной гибели. Доимплантационнук гибель оценивали по эффективности развития оплодотворенных яйцеклеток в бластоцисты. Статистическую обработку результатов проводили по методу Стьюдента.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Гормональная стимуляция эструса и суперовуляции у лабораторных мышей

Гонадотропные гормоны СЖК и ГТХ стимулируют эструс и суперовуляцию, но после оплодотворения значительная часть овулирующих яйцеклеток погибает на ренних стадиях развития и после имплантации в матку (Fowler, Edwards, 1957? Beaumont, Smith, 1975; Maudlin, Fraser, 1977). В связи с этим встает вопрос, можно ли использовать эмбрионы, полученные после гормональной стимуляции, как основной генетический материал при формировании криобанка.

Проведенные исследования выявили зависимость количества овулирующих яйцеклеток ст дозы вводимых гормонов и возраста мышей. Гормональная стимуляция была эффективной при введении 10 ед СЖК и ГТХ молодым самкам, возраст которых не превышал 6 недель (табл. 1). Взрослые мыши (12-15 недель) слабо реагировали на введение гормонов. Синхронизация спаривания у них была невысокой 1(60%), количество овулирующих яйцеклеток мало отличалось от результатов спонтанного спаривания. Кроме того, после оплодотворения яйцеклетки плохо развивались, часто проявляли склонность к фрагментации. Более высокие концентрации СЖК и ГТХ (20 ед) усиливали образование неполно-

ценных яйцеклеток, низкие (5 ед) - практически не влияли на овуляцию. Согласно этим данным, для мышей с установившимся эстральным циклом лучше применять спонтанное спаривание.

Таблица 1. Эффективность гормональной стимуляции и доимплантаци-онная гибель эмбрионов in vivo в зависимости от возраста мышей , (СБА х C57BL/6) .

Возраст (неделя) Число самок Синхронизация спаривания,% Число овулиро-вавших яйцеклеток на самку Доимплантацион-ная гибель.

4-6 17 85.0 + 2.4 17,8 + 1.1 23.5 + 2.3

12-15 19 60.0 ± 3.9 8.4 + 0.4 18.4 + 7.5

12-15 . 20 Спонтанное спаривание .7.6 + 0.7 10.6 + 6.2

Синхронизацию спаривания оценивали по числу самок с копулятивными пробками от общего числа подсаженных к самцам.

ккДсимплантациош1узо гибель определяли как разницу между числом ову-лировавших яйцеклеток и развившихся после оплодотворения до стадии бластоцисты (4-ый день беременности).

Сравнение результатов суперовуляции мышей пяти различных линий (рис.1 (11)) показало, что количество овулируииих яйцеклеток варьирует от 12,2 до 17.8 в зависимости от линейной принадлежности. Наиболее сильное стимулирующее действие гормоны СЖК и ГТХ оказывали на молодых самок СВА/1ас и СБА х С57ВЬ/6. Менее чувствительными к гормональной стимуляции были мыши С57В1./6, Очевидно, высокая чувствительность к гормонам является доминантным признаком линии СВгЦ/1ас, который проявляется у гибридов первого поколения при скрещивании с малореактивной линией С57вь/б.

Несмотря на межлинейные различия в эффективности суперовуляции, у всех мышей (340 самок) количество яйцеклеток после гормональной стимуляции увеличивалось по сравнению со спонтанным спариванием примерно в 2 раза (рис. 1(1-11)).|Наряду с этим, под влиянием гормонов усиливалась доимгша н т аци о н н а я гибель (рис.1, разница между первой и второй колонками в каждой группе сравнения), Исключение составляли мыши линии ВАЬВ/с, у которых гибель эмбрионов после суперовуляции оставалась на том же уровне, что и при спонтанном спаривании. Следует .отметить, что у мышей ВАЬВ/с даже в норме было больше нарушений в доимплантационном развитии (27%), чем у других, использованных нами линий (СБА х С57ВЬ/6 - 10%, СВА/1ас - 20%, А/эп - 20%, С57В1</б - 12%) ,

В тех случаях, когда эмбрионы были выделены из яйцеводов на самых ранних стадиях развития и помещены в культуральные условия,

>аэвитие не нарушалось и к положенному сроку они достигали стадии ластоцисты (табл.2). Достоверные различия в выживаемости in vitro осле гормональной суперовуляции и спонтанного спаривания не обнаруживались. Следовательно, при использовании молодых мышей (4-6 едель) и гонздотропных гормонов СЖК и ГТХ (10 ед) овулирующие яй-еклетки обладают всеми необходимыми потенциями для нормального азвития. Увеличение гибели происходит после оплодотворения и по-ледуюкего развития in vivo. Согласно нашим наблюдениям, у всех ышей, подвергавшихся гормональной стимуляции, к моменту рождения цело детенышей не превышает норму.

Линии:

¡1 И

I й

и

i —

i ч ÍJ Р U

1 ; Й

М я

1 й ш И

1 и и и

г 3 4

1) СВА X C57BL/6

2) СВА/1ас

3) A/sn

4) BALB/c

5) C57BL/6

с.1.Эффективность овуляции и развития доимплантационных эмбрионов in vivo после гормональной стимуляции мышей в возрасте 4-6 недель (I) и после спонтанного спаривания (II).

Г ! - количество овулировавших яйцеклеток;

- количество эмбрионов, развившихся: к 4-ому дню беременности до стадии бластоцисты.

блиаа 2.Развитие в модифицированной среде Виттена 2-х клеточных эмбрионов после спонтанного спаривания и гормональной суперовуляции (10 ед. СЖК и 10 ед. ГТХ).

Число эмбрио- % развившихся до стадии бластоцисты

нов, эксплан- -:-1-

ышей тированных в после суперову- после естественного

культуру ляции спаривания

Viae 173 93.7 + 4, ,1 92.5 + 5.1

7BL/6 234 91.2 + 6, ,1 . 91.4 + 3.2

-В/с . 209 52.8 + 6, ,9х 40,9 + 3.4

222 94.2 + 3. ,7 93.9 + 2.1

204 69.6 + 3, ,6 70.7 + 2.3

1зличия с естественным спариванием статистически достоверны (р=0.98).

Сравнение результатов дотпикшгационной гибели эмбрионов в условиях in vivo и in vitro указывает на то, что повышенный гормональный фон матери вызывает патологические отклонения как в раннем морфогенезе, так и постнмплантациоином развитии. Неблагоприятное влияние гормонов устраняется при выделении оплодотворенных яйцеклеток на ранних стадиях развития (предпочтительнее па стадии 2-х бластомеров) и культивировании в условиях in vitro. В этом случае доимплантационное развитие эмбрионов не нарушается (табл.2).

Таким образом, наши исследования подтвердили правомерность использования метода гормональной стимуляции с целью получения от линейных мышей максимального количества жизнеспособных эмбрионов для криобанха. Однако необходимо учитывать, что при суперовуляция возможны различные аномалии развития в зависимости от индивидуальных и генетических свойств используемых линий мышей. Поэтому отбор эмбриологического материала требуется проводить особенно тщательно с учетом морфо-функциональных особенностей каждой стадии развития и времени с момента оплодотворения.

2. Влияние состава среды, температуры, криопротскторов и режимов э амор ажи з а н я я-о-т аивания на жизнеспособность эмбрионов

Криоконсервация включает последовательное проведение целого ряда манипуляций: выделение эмбрионов, замораживание и хранение в жидком азоте, размораживание, определение жизнеспособности, культi вирование, восстановление из размороженных эмбрионов животных. Практически на всех этапах можно использовать среду с фосфатным 6j фером Дальбекко, поддерживавшую постоянное значение pH 7.2-7,4 при равновесии с воздухом (Whittirigham, 1971), ко для культивироЕ,-: ния ранних эмбрионов мышей она не пригодна. Нормальное развитие si. брионов in jtitro обеспечивается в присутствии буферной система би-карбонат-СО^ (Brlnster, 1970; Whltten, 1971; Qulnn, Kales, 1973). При равновесии с воздухом в культураяьных средах с бикарбонатнкм буфером pH сдвигается в щелочную сторону, что нарушает эмбриональное развитие и в силу этого ограничивает их применение, В целях проверки возможности использования для криоконсервации среды Вит-тена (Whitten, 1971), применяемой при культивировании эмбрионов, j ее состав был допблнительно введен органический буфер Hepes в эмпирически подобранном соотношении с бикарбонатом 1:1. Такая модификация не препятствовала развитии эмбрионов до стадии поздней бластоцисты при 37s в атмосфере.5% СО^ (табл.2). Кроме того, Нере: стабильно поддерживал в среде физиологический уровень pH 7.2 в течение 2-х час при равновесии с воздухом и при замораживании в жид-

ком азоте. Это позволило нам использовать одну модифицированную среду Виттека на всех этапах криоконсервации, что значительно упростило работу и снизило вероятность повреждения эмбрионов при манипуляции с ними на открытом воздухе.

Успешное замораживание ранних эмбрионов мышей возможно только при наличии в среде высоких концентраций крнопрогекторов (Wilmut, 1972! Whittlngham, 1979; Law et al., 1979; Takeda, Elsden, 1982), которые, как известно, кроме криозамитного оказывают еще и цито-гоксическое действие (Шраго и др., 1983; Stanley, Herschler,1986; Fahy, 1986). В гиперосмотической среде для замораживания резко изменяется объем эмбрионов в результате перераспределения воды,электролитов и концентрации криопротектора между вне- и внутриклеточной средой. Было показано, что длительность осмотической реакции 2-х клеточных эмбрионов, включая сжатие и быстрое восстановление объема, составляет при комнатной температуре в среде с 1.5 М ДМСО 5-6 мин, 1.5 М этиленгликоля - 2-3 мин, 1.0 И глицерина - 10 мин. В течение этого времени эмбрионы оставались жизнеспособными и после удаления криопротекторов нормально развивались в культуре. Следовательно, быстрое уравновешивание концентраций в системе "клетка-среда" не влияет на барьерные свойства клеточных мембран, участвующих в процессах регуляции раннего развития. Снижение жизнеспособности в результате цитотоксического действия криопротекторов выявлялось только после 30 мин эквилибрации эмбрионов с ДМСО и глицерином. Этиленгликоль не вызывал заметных нарушений в доим-плантационнои развитии, однако его криозащитные свойства были несколько слабее, чем у ДМСО и глицерина '(табл. 3).

Таблица 3.Эффективность низкотемпературной консервации ранних эмбрионов гибридных мышей. Р^ СБА х C57BL/6 в присутствии различных протекторов (экоилибрация 15 мин при комнатной темцературе)

Стадия развития (к^ц^ацйя в момент замора-з среде) кивания.(кол-во

г Сластомеров)

рожеиных эмбрионов

% развившихся в культуре до стадии бластоцисты

Этиленгликоль г 71 28.5 + 5.5я

(1.5 И) 3 87 54.0 + 2.1

ДМСО 2 163 53.2 + 2.7

(1.5 11) 8 89 60.6 + 3.9

Глицерин 2 55 58.2 + 5.5

(1.0 М) 8 71 63.3 + 6.9

^Различия по сравнению с ДМСО и глицерином (р = 0.99) .

Следует отметить, что, несмотря на хорошую криозааигу, глицерин менее удобен при работе с эмбрионами мышей на этапе размораживания Он плохо удаляется из этих клеток, в результате чего возможно осмо тические повреждения. Поэтому мы использовали в основном ДМСО. Пр« замораживании эмбрионов с этим крнопротехтором было установлено, что эффективность криозаииты зависит от условий проведения эхэияи-брации. Наиболее существенными факторами являются температура и длительность пребывания эмбрионов в среде с ДМСО перед началом замораживания. Для самых ранних стадий (2-х и 8-ми бяастомеров) опгв мальной была комнатная температура, для более поздних (морула-бла-стоннста) - 0" при условии проведения эквилибрации в течение 10-1! мин. Температурные различия в эффективности действия ДМСО на эмбр-оны, по всей видимости, связаны с изменением свойств клеточных ме бран в ходе раннего эмбриогенеза. На основании полученных данных предложены оптимальные режимы замораживания (рис.2), которые для ранних и более поздних стадий развития различаются по температуре эквилибрации и скорости охлаждения до начала кристаллизации в сре де, т.е. сиданга. Все остальные параметры совпадают, что позволяг использовать единую программу замораживания для эмбрионов разных стадий развития.

1 Рис.2.Оптимальные режимы замораживания эмбрионов: I - на стадиях 2-х и 8-ми бластомеров, II - на стадиях поздней морулы и Сластоцисты.

Отличительной особенностью криоконсервации эмбрионов мкшей является применение малых скоростей замораживания {КМ1:1:1пдНап1 et а1., 1972; Магиг,' 1977; Ье1Ьо ег а1. , 1978; ИЫ^пдЬат, 1981). Проведенные нами исследования показали, что для ранних стадий развития оптимальны скорости 0.5 - 0.7°/мин. В этом случае замороженные эмбрионы сохраняют нормальную морфологию, а после оттаивания восстанавливают функциональную активность и развиваются в культуре. С помощью криомикроскопических наблюдений было установлено, 10

что при медленном замораживании эмбрионы сравнительно долго (1-1.5 час) могут находиться в состоянии глубокого переохлаждения (до" -50"). При этом они остаются внешне морфологически не измененными. Однако глубокое переохлаждение, как показали результаты культивирования, приводит к необратимым микроструктурным нарушениям, в результате которых эмбрионы теряют способность к развитию. Эти результаты говорят в пользу включения в технологию замораживания дополнительной процедуры - сидинга. В ваших опытах был определен диапазон температур -5-10°, при которых проведение искусственной кристаллизации среды способствует лучшей выживаемости эмбрионов. Кроме того, была выявлена зависимость выживаемости эмбрионов от скорости оттаивания. Наилучшие результаты получены при использовании высоких скоростей порядка 500°С/мин. Медленное отганвание эмбрионов на воздухе со скоростью 25°С/мин приводило к значительным структурным повреждениям. Они выражались в виде увеличения зернистости и потемнения цитоплазмы, нарушения целостности плазматических мембран и выхода клеточного содержимого в перивителлиновое пространство. Согласно результатам микрофлуоресцентного анализа, эмбрионы с явными признаками повреждения морфологии были нежизнеспособными. При медленном оттаивании их доля составляла 40-50%, при быстром - менее 20%. На основании полученных данных были определены оптимальные параметры криоконсервации: использование модифицированной среды Виттена с 1.5 М ДМСО, проведение'эквилибрации в течение 10-15 мин при комнатной температуре и 0° (в зависимости от стадии развития), применение искусственной кристаллизации при -6°, низких скоростей замораживания 0.5 - 0.7°С/мин до -40-45° и высоких скоростей оттаивания порядка 500°С/мин.

При использовании одинакового режима криоконсервации удалось показать, что выживаемость эмбрионов в большей степени зависит от их состояния в момент замораживания, чем от генотипа (табл.4) . Максимальная гибель эмбрионов вследствие грубых нарушений морфологии была на стадии 2-х бластомероз (21%) . Несколько меньше повреждались при оттаивании 8-ми клеточные эмбрионы, а также поздние мо-рулы и бластоцисты (14% и 17%) . Способность выдерживать низкотемпературное замораживание тесно связана с морфологическими, Физиологическими и метаболическими особенностями каждой стадии развития. При культивировании у ранних эмбрионов "чаще всего выявлялись нарушения темпов дробления, Фрагментация и остановка развития на стации морулы. В то же время эмбрионы, прошедшие в культуре хомлакти-зацию, развивались в бластоцисты, а после трансплантации - до рождения. На основании этого было сделано предположение, что при завораживании повреждаются системы, ответственные за регуляцию ран-

hex морфогенетических процессов. Известно, что блокирование ком-■ пактизации на стадии кору ли препятствует дифференцировке эмбрионов в бластоцясти (Johnson et al., 1979; Ziomek, Johnson, 1980; Handyside, 1980). После замораживания более поздних стадий наруше--ния в развития были связаны преимущественно с повреждением клеток трофоёласта, ответственных за имплантацию в матку.

Таблица 4. Выживаемость эмбриоаов линейных мыгией 'посла замораживания на разных стадиях развития

Количест-Линия во замо-мьшгей роженных эмбрионов

% поврежденных.от общего числа замороженных эмбрионов:

по морфологии

доимплаи- постимплан-тационндя тациоиная гибель11 ' гибель

кк

% живорожденных детенышей от числа замороженных эмбрионов

стадия 2-х бластомеров

BALB/c ■ 120 ' 29 50 12 9

A/sn 83 20 47 19 14

CBA/lac 58 19 38 25 18

CBAxC57BX,/S 163 " 22 40 24 14

CBWA 178 15 48 22 . 15

Среднее: 602 . 21. 0+6.4 44.6+4.5 * 20.4+6 .0 14. 0+3.2

стадия 8-ми бластомеров

BÄLB/C 106 ' 19 47 16 18

CS 7BL/6 66 11 49 20 20

CBA/lac 58 И .50 20 19

CBAXC57BL/S 89 13 38 23 20

C3WA 127 17 40 24 19

Среднее : 446 14. 2+4.5 44.8+8.0 20.6+4 .2 20. ,4+4.4

стадии : поздай морулы к бластоцисты

BALB/c 142 16 31 37 16

C57BL/6 123 17 46 25 12

CBA/lac 196 20 33 . 25 22

CBAXC57BL/6 129 16 35 29 20

CBWA - 55 15 44 26 15

Среднее: 597 16. 8+2.5 37.8+6.0 28.4+6 .0 17.

Доимплантационную гибель эмбрионов оценивали по результатам культивирования зародышей гп иг Иго; нж

постимплаитационнуи - по результатам трансплантации в матку ге-иотипически однородным самкам-реципиентам (внутрилинейная транс плантация).

<

3. Трансплантация криоконсервированных эмбрионов

Поскольку не все аномалии развития проявляются в раннем эмбриогенезе (Дыбан, Баранов, 1978), необходима трансплантация эмбрионов для выявления возможных отдаленных последствий замораживания. Это - единственный способ, позволяющий восстанавливать животных из генетического криобанка. Как видно из таблицы 4, после трансплантации у мышей рождается от 9 до 26% детенышей от общего числа замороженных эмбрионов. Значительная часть эмбрионов погибает сразу же при оттаивании и последующем культивировании (55-65%) , меньше - в постимплантационном периоде развития (20-28%).

Сравнение результатов трансплантации после замораживания и без него (табл.5) выявило различия по количеству живорожденных детенышей у мышей инбредных линий BALB/c, C57BL/6 и СБА/lac. У гибридных и тетрагибридных животных пересаженные эмбрионы восстанавливали активность и нормально развивались до рождения. Количество живых детенышей не отличалось от контрольного.

Незначительное снижение рождаемости у инбредных мышей (табл.5) было связано с более низкой активностью криоконсервированных эмбрионов при имплантации в матку. В то же время постимплантационное развитие проходило нормально и гибель эмбрионов не увеличивалась. Эти результаты подтвердили заключение о преимущественном повреждении трофобласта при замораживании эмбрионов на стадиях поздней мо-рулы и бластоцисты. В тех случаях, когда замораживали 2-х и 8-ми клеточные эмбрионы, затем культивировала их до бластоцисты и пересаживали в матку, рождаемость по сравнению с контролем не снижалась. Следовательно, все летальные повреждения, затрагивающие основные структурные и функциональные механизма жизнеобеспечения эмбрионов, проявляются в доимплантационном периоде и на результаты самой трансплантации не влияют. Мыши, развившиеся из замороженных эмбрионов, по внешнему виду и массе,тела не отличались от контрольных. У них не было выявлено явных фенотипических изменений. По достижении половой зрелости как самцы, так и самки обладали нормальной репродуктивной способностью.

Сравнительно низкая рождаемость в опытной и контрольной группах мышей (не более 50% от числа пересаженных эмбрионов) свидетельствует о снижении жизнеспособности эмбрионов при манипуляциях с ними на открытом воздухе, а также о нарушении синхронизации гормональной активности эндометрия реципиента по отношению к эмбрионам донора. Характер взаимодействия пересаженных эмбрионов с реципиентом и их последующее развитие зависят от генетических и индивидуальных особенностей мышей. Известно, что антиген-несовместимые с матерью эмбрионы развиваются лучше, чем гекотнпически однородные (McLaren,

Таблица 5.

Выживаемость поздних морул и бластоцист после трансплантации в матку генотипически однородным самкам-реципиентам (внутрилинейная трансплештация)

Линии мышей

Число трансплантированных эмбрионов \(число самок-реци-

% имплантировавшихся в матку от общего числа пересаженных

Количество

живых детенышей

% рождаемости от общего числа трансплавтирован-

пиентов) эмбрионов

контроль -196" контроль -196е контроль -196' контроль -196*

ВАЬВ/с 29 (5) .46 (8) 75;8+6.6 65.2+6.8" 14 17 48.3+9.9 36.9+7.6х

С57ВЬ/6 33 (4) 30 (6) 68.5+6.7 60.0+8.6Я 14 10 45.2+5.7 33.4+5.2х

СВА/1ас 37 (6) 80 (12) 76.4+7.2 68.8+6,7* 18 37 48,6+5.3 40.2+4.5К

СВА X С57В1У6 60 (7) 37 15) 81.8+5.3 78.4+9,4 25 15 41.6+3.8 40.5+8.9

СВИА 102 (16) 19 (4) 68.8+6.7 69.2+4.9 38 7 37.2+7.6 36.8+6.3

кРазличия по сравнению с контролем (р = 0.95).

1965; Beer, Billingham, 1975; Колесников, Морозова, 1985). В этой связи были проведены опыты по трансплантации замороженных эмбрионов самкам других линий. Следует отметить, что эффективность пост-имплантационного развития повышалась только при строго определенном сочетании лар "донор-реципиент". Во всех остальных случаях количество живорожденных детенышей было таким же, как при внутрили-нейной трансплантации или даже меньше. По нашим данным лучшими реципиентами являются инбредные мыши СВА/lac и тетрагибриды CBWÄ. Этих животных можно рекомендовать при восстановлении из криобанка тех линий, живые самки которых за время хранения будут утеряны.

В заключение необходимо остановиться на практических выводах из проделанной работы. Наши данные показывают, что успех криоконсер-вации в большей степени зависит от состояния эмбрионов в момент замораживания, чем от линейной принадлежности. Для мышей разных линий максимальное количество жизнеспособных детенышей можно получить из замороженных 8-ми клеточных эмбрионов (табл.4). Однако из практических соображений (легкость вымывания нехирургическим путем, более простые культивирование и трансплантация) при создании криобанка удобнее использовать поздние морулы и бластоцисты. Для восстановления мышей необходимо 50-70 замороженных эмбрионов. Однако, чтобы застраховаться от случайностей и иметь возможность повторить эту процедуру несколько раз, представляется целесообразным хранить в криобанке не менее 250-350 эмбрионов каждой линии.

ВЫВОДЫ

1. Осуществлена криоконсервация ранних эмбрионов шести инбредных линий BALB/c, С57В1/6, A/sn, CBA/lac, СВА х С57ВГ,/6 и СВКА. После трансплантации получено потомство без феногипических отклонений в трех поколениях. Межлинейных различий в выживаемости после криоконсервация не обнаружено.

2. Для эмбрионов мышей могут быть рекомендованы следующие условия криоконсервации: искусственная индукция льдообразования при-6", низкие скорости охлаждения 0.5-0.7°/мин до -40-45° и высокие ; скорости оттаивания, порядка 500°/мин, использование модифицированной среды Виттена с органическим буфером Hepes и криопро-тектора ДМСО. ' i

3. При сравнении трех протекторов - ДМСО, глицерина и этиленглико-ля выявлены различия в эффективности криозащиты и токсическом действии на эмбрионы разных стадий доимплантационного развития, в зависимости от температуры и определены оптимальные условия проведения эквилибрации.

4. Обнаружены межстадийные различия в чувствительности эмбрионов к действию повреждающих Факторов при криоконсервации. Гибель 'на стадии 2-х бластомеров выше, чем на стадиях 8-ми бласгоме-

. ров и йластодисты. Основные повреждения проявляются в допстлан-тационном периоде развития. При замораживании поздних морул и бластоцист возможно незначительное снижение активности трс-Ло-бласта. Постимплантационное развитие не отличается от нормального. От общего количества замороженных двуклеточных эмбрионов получено 14.0 + 3.2% нормальных детенышей, восьмиклеточных -20.4 + 4.4%, бластоцист - 17.0 + 4|.7%.

5. Показано, что количество живорожденных мышей возрастает в среднем на 30% при межлинейных трансплантациях в оптимальном сочетании пар "донор-реципиент" по сравнению с трансплантациями ге-нотипически однородным самкам. Для использованных линий лучшими реципиентами являются инбредные мыши СВ?./1ас и тетрагибридыСЕКА.

6. Для сохранения; лабораторных мышей в криобанке необходимо иметь 250-350 замороженных эмбрионов каждой линии. Такое количество можно получить от 30-50 самок после гормональной стимуляции с применением СХК и ГТХ. На практике лучше использовать поздние морулы и бластоцисты. Эмбрионы этих стадий менее требовательны

з

к условиям культивирования и трансплантации, хорошо восстанавливаются после низкотемпературного замораживания.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1 .Межевикина JI.M. , Крастс И.В. , Вепринцев Б.Н. Создание низкотемпературного банка геномов лабораторных мышей // Тезисы П Всесоюзной конференции "Механизма криоповреждений и криозадиты".-Харьков, 1984,- С. 238.

2.Межевикина JI.M., Вепринцев Б.Н. Низкотемпературная консервация эмбрионов лабораторных мышей // Тезисы П Всесоюзного ^совещания по культивированию клеток животных и человека.- Пукино, 1985.-С. 145-146.

3.Мельникова Е.В., Межевикина Л.М. Флуоресцентный метод определения жизнеспособности зародышей млекопитающих // Тезисы П Всесоюзного совещания "Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение".- Рига, 1985,- С. 161-162.

4.Березовская О.П., Межевикина Л.М., Вепринцев Б.Н. Метод культивирования ранних эмбрионоз линейных мышей // Онтогенез.- 1966.-Т.17, 8 5^.- С. 553-555.

5 .Веприк-.ев''Б.Н. , Межевикина JI.M. Криоконсервация ранних эмбрионов, сохранение и возобновление генетического разнообразия лабораторных- мышей //\ Тезисы Международной конференции "Достижения к перспективы развития криобиологии и криомедшишы" .- Харьков, 1988,-С. 60-61.

6.Межевикина Л.М., Игнатьева Т.В., Вепринцев Б.Н. Выживаемость эмбрионов крыс м мышей при низкотемпературной консервации II Онтогенез.- 1988.- Т. 19, № 5.- С. 491-494.

7.Межевикина Л.М,, Березовская О.П., Вепринцев Б.Н. Низкотемпературная консервация 2-клеточных эмбрионов мышей в среде Виттена с добавлением органического буфера HEPES // Криобиология.- 1988,В 3,- С. 42-44.