Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние различных повреждающих факторов на раннее развитие эмбрионов млекопитающих

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Серобян, Гаянэ Азатовна

Введение

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Устойчивость доимплантационных эмбрионов млекопитающих к механическим воздействиям

1.2. Устойчивость доимплантационных эмбрионов млекопитающих к условиям культивирования

1.2.1. Изменение физиологии эмбриона в процессе развития.

1.2.2. Энергетический метаболизм в раннем эмбриогенезе. Роль глюкозы

1.2.3. Роль аминокислот в раннем эмбриогенезе.

1.2.4. Осмолиты

1.2.5. рН Буферы

1.2.6. Пластичность эмбриона

1.3 Устойчивость доимплантационных эмбрионов млекопитающих при положительных околонулевых температурах

1.3.1. Процессы, развивающиеся в клетках млекопитающих при около нулевых температурах (гипотермия)----------------—

1.3.2. Влияние околонулевых температур (гипотермия) на ранние эмбрионы

1.3.3. Зависимость чувствительнеости к гиперемии от стадии доимплантационного развития

1.3.4. Видовые особенности чувствительности зародышей к холоду

1.3.5. Пути совершенствования метода гипотермического хранения эмбрионов млекопитающих

1.3.6. Технологические принципы гипотермического хранения доимплантационных эмбрионов

1.3.7. Практическое применение метода гипотермического хранения доимплантационных эмбрионов млекопитающих

1.4 Устойчивость доимплантационных эмбрионов млекопитающих к разным способам криоконсервации

1.4.1. Факторы криоповреждения клеток эмбрионов

1.4.2. Использование криопротекторов

1.4.3. Низкотемпературное охлаждение эмбрионов в присутствии криопротектора глицерина

1.4.4. Выведение криопротектора из клеток эмбриона

1.4.5. Условия оттаивания и возможные повреждения эмбрионов

1.4.6. Криоконсервация доимплантационных эмбрионов млекопитающих прямым погружением в жидкий азот: сверхбыстрое замораживание и витрификация — —

1.4.7. Зависимость криорезистентности эмбрионов от их генотипа

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Работа с эмбрионами мышей

2.1.1. Получение доимплантационных эмбрионов мышей

2.1.2. Оценка качества эмбрионов мышей

2.1.3. Приготовление гистологических суховоздушных препаратов эмбрионов мышей

2.1.4. Гипотермическое хранение и культивирование in vitro эмбрионов мышей

2.1.5. Замораживание эмбрионов мышей на программном замораживателе

2.1.6. Свербыстрое замораживание эмбрионов мышей---------—

2.1.7. Оттаивание замороженных эмбрионов мышей

2.1.8. Трансплантация эмбрионов мышей

2.2 Работа с эмбрионами крыс

2.2.1. Получение доимплантационных эмбрионов крыс---------—

2.2.2. Оценка качества эмбрионов крыс

2.2.3. Гипотермическое хранение и культивирование in vitro эмбрионов крыс

2.2.4. Трансплантация эмбрионов крыс.

2.3. Работаэмбрионами к.р

2.3.1. Нехирургичое извлечение и тралантация эмбрионов к.р

2.3.2. Определениеадии развития и оценка качва эмбрионов к.р

2.3.3. Разделение эмбрионов к.р

2.3.4. Хранение эмбрионов к.р при положительных околонулевых температурах

2.3.5. Культивирование in vitro эмбрионов к.р

2.3.6. Траортировка эмбрионов к.р при околонулевых температурах

2.3.7. Замораживание эмбрионов КРС на программном замораживателе

2.4. Статистическая обработка

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Развитие доимплантационных эмбрионов мышей и крыс—

3.1.1 .Уточнение ранних стадий развития эмбрионов крыс

3.1.2. Сравнительный анализ количества клеток на стадиях морулы и бластоцисты у разных линий мышей

3.2. Изучение способности к развитию доимплантационных эмбрионов коров после механического разделения

3.3. Влияние различных культуральных сред на доимплантационных эмбрионов млекопитающих. разных стадий развития

3.3.1. Влияние различных сред на развитие 8-клеточных эмбрионов мышей и крыс

3.3.2. Влияние разных сред на развитие эмбрионов мышей и крыс in vitro со стадии морулы

3.3.3. Культивирование бластоцист мышей и крыс в различных культуральных средах.

3.4.Влияние гипотермии на эмбрионы 3-х видов млекопитающих

3.4.1.Влияние скорости снижения температуры до +4°С и последующего гипотермического хранения на развитие компактных морул мышей и крыс

3.4.2. Гипотермическое хранение эмбрионов мышей в различных культуральных средах.

3.4.3. Хранение при положительных околонулевых температурах эмбрионов мышей разных стадий доимплантационного развития

3.4.4. Хранение 8-клеточных эмбрионов мышей различных линий при положительных околонулевых температурах

3.4.5. Развитие компактных морул крыс 2-х линий (SD и SHR) после охлаждения со скоростью

0,1°С/мин и последующего хранения

3.4.6. Сравнительное изучение устойчивости к гипотермии эмбрионов 3-х видов млекопитающих.

3.4.7. Влияние транспортировки на дальние расстояния в условиях гипотермии на прижив ляемость эмбрионов КРС после трансплантации.

3.5. Влияние двух способов криоконсервации на жизнеспособность эмбрионов различных стадий развития, полученных от мышей и КРС разных линий и пород.

3.5.1. Развитие 8-клеточных эмбрионов мышей после

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние различных повреждающих факторов на раннее развитие эмбрионов млекопитающих"

Настоящее исследование посвящается комплексному анализу устойчивости эмбрионов к различным стрессовым воздействиям: механическим, химическим, термическим, для выявления потенциальных возможностей эмбрионального развития млекопитающих, важных для решения как фундаментальных, так и прикладных задач биологии развития. Эти исследования проводились в сравнительном плане на эмбрионах трех видов млекопитающих: мышей, крыс, крупного рогатого скота (КРС). На современном уровне биологии развития в практику экспериментальных исследований для решения тех или иных задач включены методы и приемы воздействия на эмбрионы млекопитающих, в результате которых зародыши переживают состояние на границе жизни и смерти. Это - механические воздействия - связанные, как правило, с микрохирургией, биопсией или удалением отдельных участков эмбриона, разрезанием зародышей и т.д. Важным биотехнологическим приемом, приводящим к экстремальным механическим повреждениям, является разделение эмбрионов на две половинки в работах по получению монозиготных близнецов. В настоящей работе исследовались потенциальные возможности таких половинок на эмбрионах крупного рогатого скота (КРС). Это - химические воздействия - применение культуральных сред с разным химическим составом, влияние различных ингредиентов этих сред на развитие эмбриона на разных стадиях, а также различные токсические воздействия при использовании криопротекторов. В качестве оценки экстремального химического фактора в настоящей работе проводили сравнительное исследование влияния разных сред и разных криопротекторов на эмбрионах трех видов упомянутых животных. Это -термические воздействия, связанные с влиянием разных скоростей охлаждения, а также с разными конечными температурами. Таких, например, как гипотермия, т.е. выдерживание зародышей при около нулевых температурах, или применение криоконсервации, при которой, охлаждение осуществляется до температур жидкого азота (-196 С), с последующим разогревом. В настоящее время имеется значительное количество работ по анализу влияния глубокого охлаждения с последующим отогревом на развитие эмбрионов млекопитающих. Однако при обсуждении этих вопросов между разными авторами по эффективности того или иного метода криоконсервации имеются серьезные разногласия, что возможно связано с неодинаковыми экспериментальными условиями и методами криоконсервации, применяемыми этими авторами. В связи со сказанным, в настоящей работе проводился анализ эффективности различных приемов указанных воздействий на развитие эмбрионов млекопитающих в строго одинаковых экспериментальных условиях. Кроме того, в данной работе на трех отмеченных выше видах млекопитающих проводилось сравнительное исследование чувствительности предимплантационных эмбрионов к снижению температуры до околонулевых величин.

В связи со сказанным основная цель настоящей диссертационной работы заключалась в сравнительном исследовании устойчивости предимплатационных эмбрионов трех видов млекопитающих (мышь, крыса, к.р.с.) к отмеченным выше экстремальным факторам: механическим, химическим, термическим. Видовые отличия могут оказаться существенными в способности исследуемых видов млекопитающих адаптироваться к тем или иным экстремальным воздействиям на разных стадиях раннего эмбрионального развития.

В работе решались следующие задачи:

- уточнение хронологии доимплантационного развития в норме эмбрионов крыс и мышей и сопоставление фаз развития с числом клеток.

- исследование способности к развитию in vivo эмбрионов к.р.с., после механического воздействия путем микрохирургического разделения доимплантационных зародышей (возможности клонирования).

- сравнительное исследование влияния различных культуральных сред на развитие эмбрионов мышей и крыс.

- сравнительное исследование влияния на жизнеспособность положительных околонулевых температур и возможности гипотермического хранения эмбрионов мышей, крыс и к.р.с.

- изучение влияния скорости охлаждения на жизнеспособность эмбрионов при гипотермии.

- сравнительное изучение влияния разных способов глубокой (жидкий азот) криоконсервации (программного и сверхбыстрого) на жизнеспособность эмбрионов мышей после размораживания.

- определение эффективности криоконсервации сверхбыстрым методом для зародышей мышей различных аутбредных и инбредных линий и изучение роли генома в криорезистентности эмбрионов.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Серобян, Гаянэ Азатовна

Выводы

1. На эмбрионах крыс линии Wistar при использовании большого экспериментального материала выполнены уточнения в таблице нормального предимплантационного развития. Показано, что эмбрионы крыс более длительное время находятся на 2-х клеточной стадии перед вторым делением дробления, чем по литературным данным, хотя вылупление бластоцист, по нашим данным начинается несколько раньше.

2. Показано, что механическое повреждение и потеря больше половины клеточной массы эмбрионов к.р.с. после их микрохирургического разрезания, не влияет на приживляемость этих половинок.

3. Показано, что эмбрионы крыс и мышей всех изученных стадий заметно различаются по своей способности к развитию in vitro в одних и тех же культуральных средах. Полученные результаты указывают на существенные различия в метаболизме доимплантационных эмбрионов крыс и мышей.

4. Выявлены значительные различия между эмбрионами мышей, коров и крыс в устойчивости к охлаждению до околонулевых температур в течение 24 часа. У эмбрионов мышей и коров при этом не снижается способность к развитию по сравнению с контролем, а у зародышей крыс в результате гипотермического хранения жизнеспособность снижается в несколько раз.

5. Эффективность гипотермического хранения доимплантационных эмбрионов крыс зависит от скорости охлаждения до положительных околонулевых температур.

6. Криоконсервация, с использованием программного замораживания, до температур жидкого азота приводит к гибели значительной части (около 20%) 8-клеточных эмбрионов мышей аутбредных линий NMRI и CR, а криоконсервация сверхбыстрым методом не отражается на жизнеспособности 8-клеточных эмбрионов мышей инбредных линий C57BI, DBA и 8-клеточных эмбрионов мышей аутбредной линии NMRI, и не снижает у эмбрионов способности к дальнейшему развитию in vivo.

7. Количество клеток у мышиных эмбрионов жестко не коррелирует со стадией развития: в некоторых зародышах на стадии компактной морулы клеток может быть больше, чем у зародышей на стадии бластоцисты. Впервые показан интервал среднего количества клеток, когда происходит переход от компактной морулы к бластоцисте, при этом не выявлено по этому показателю достоверных различий между аутбредной линией NMRI и инбредными линиями BALB/1, СВА, СЗН.

8 . Не выявлено различий в выживаемости эмбрионов мышей изученных линий, после гипотермического хранения или сверхбыстрого замораживания.

Заключение

В настоящей работе представлены, проведенные в сравнительном плане исследования по устойчивости доимплантационных эмбрионов млекопитающих разных видов к повреждающим воздействиям физической и химической природы. Полученные нами результаты выявили ряд существенных моментов, касающихся заметных различий в чувствительности, связанных как с видовыми особенностями исследованных эмбрионов, так и со стадиями их предимплантационного развития. Коротко подведем итоги этих исследований и отметим главные результаты.

В работе показано, что предимплантационные эмбрионы коров, являясь сложной, многоклеточной, развивающейся системой оказались весьма устойчивы к жестким механическим повреждениям. Не смотря на уменьшение числа клеток в этих системах более чем вдвое, за счет разделения и гибели части клеток, оставшиеся половинки полностью сохраняют жизнеспособность и из них получаются нормальные телята.

Далее в работе показано, что 8-клеточные эмбрионы крыс существенно отличаются от 8-клеточных эмбрионов мышей по своей способности к развитию in vitro в одних и тех же культуральных средах. Сходная картина имела место и при культивировании эмбрионов со стадии компактной морулы. При культивировании бластоцист процент вылупления у крыс был ниже по сравнению с мышиными эмбрионами.

Таким образом не смотря на кажущуюся близость этих видов, полученные нами результаты указывают на существенные различия в метаболизме их эмбрионов различных стадий доимплантационного развития.

В разделе посвященном гипотермии основной результат достаточно неожиданный. Если эмбрионы мышей и коров оказались устойчивы к гипотермии и их жизнеспособность после хранения практически не снижалась, то эмбрионы крыс оказались к гипотермии чрезвычайно чувствительными - у них после гипотермии способность к развитию по сравнению с контролем падает, в 3,5 раза. Вместе с тем, нами впервые на зародышах крыс показано, что эффективность гипотермического хранения может зависеть от скорости охлаждения до положительных околонулевых температур.

Главный результат раздела, посвященного криоконсервации состоит в том, что при криоконсервации мышиных эмбрионов на 8-клеточной стадии метод сверхбыстрого замораживания оказался существенно более эффективным, чем метод программного замораживания. При первом методе полностью отсутствует гибель эмбрионов, а при втором она достигает 20 %. Однако при криоконсервации мышиных эмбрионов на стадии компактной морулы сверхбыстрое замораживание не столь эффективно, оно приводит к остановке развития части эмбрионов. Результаты криоконсервации бластоцист оказались совершенно неудовлетворительны, жизнеспособность сохранили лишь около 5 % зародышей. Причины такого явления пока остаются неясны. В то же время, традиционный метод криоконсервации, с использованием программного замораживателя, оказался весьма эффективным для эмбрионов новой для России, практически значимой мясной породы 8а1ег$. В результате нашей работы был также создан банк эмбрионов аборигенной Красной-Горбатовской породы.

Полученные результаты могут найти применение в экспериментальной эмбриологии при решении вопросов поддержания и разведения генетически чистых линий лабораторных животных, при использовании криоконсервированных эмбрионов для тестирования биологически активных препаратов, при изучении процессов регуляции в раннем эмбриогенезе, в опытах по генной и клеточной инженерии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Серобян, Гаянэ Азатовна, Пущино

1.Амстиславский С.Я., Кривохарченко A.C., Ротт H.H. (1997) Создание генетических криобанков и использование методов биологии развития как способ сохранения редких видов животных. Онтогенез 28(6): 412-420.

2. Белоус А.М., Бондаренко В.А., Бондаренко Т.П., (1978) Молекулярные механизмы криоповреждений мембран. Итоги науки и техники. ВИНИТИ АН СССР. Серия биофизика. 9: 80-113.

3. Белоус A.M., Грищенко В.И., (1994) Криобиология. Киев Наукава думка.

4. Белевич Б.П., Рябых В.П., Черных В.П., Прокофьев М.И. и др. (1982) Извлечение и пересадка эмбрионов у к.р.с. нехирургическими методами. Эндокринология и трансплантация эмбрионов. М.

5. Беркинблит М.Б., Божкова В.П., Бойцова Л.Ю., Мительман Л.А, Потапова Т.В., Чайлахян Л.М., Шаровская Ю.Ю. ( 1981). Высокопроницаемые контактные мембраны. Изд-во « Наука», Москва.

6. Бондаренко В.А., Бондаренко Т.П., Руденко C.B., (1992) Эффекты дегидратации в контроле холодовой и осмотической чувствительности клеток. Проблемы криобиологии 4:14-26.

7. Вуд М., Уиттингхэм Д, Ролл У., (1990) Низкотемпературная консервация яиц и эмбрионов мышей // Биология развития млекопитающих. Методы. М. : Мир : 323356.

8. Грищенко В.И., Осташко Ф.И., Исаченко В.В., Исаченко Е.Ф., Кривохарченко A.C.,, Сушко А.Б., Федотова И.А., (1992) Витрификация, сверхбыстрое замораживание мышиных, крысиных и коровьих эмбрионов. Проблемы криобиологиии. 1: 3 5-40.

9. Грищенко В.Н., Калугин Ю.В., Лучко H.A., (1993) Сверхбыстрые скорости охлаждения и витрифицирующие растворы в криобиологии. Проблемы криобиологии 3: 3-13.

10. Исаченко В.В., Грищенко В Н., Осташко Ф.Н., Исаченко Е.Ф., Сушко А.Б., (1994) Сверхбыстрое замораживание эмбрионов крыс и коров без «классической» эквилибрации. Проблемы криобиологии 3: 3-7.

11. Кривохарченко A.C., Вильянович Л.И, Татаринова Л.В.,1993) Развитие мышиных эмбрионов в среде без белка в зависимости от количества зародышей в микрообъеме среды. Онтогенез 24(6): 53-60.

12. Кривохарченко A.C., Вильянович Л.И, (1995) Хранение яйцеклеток и эмбрионов млекопитающих при положительных околонулевых температурах. Онтогенез 26(1):38-47 и 26(2):99-107.

13. Межевикина Л.М., Березовская О.П., Вепринцев Б.П., (1988) Низкотемпературная консервация 2-кл эмбрионов мышей в среде Виттена с добавлением органического буфера Hepes. Криобиология 3: 42-45.

14. Пучков ВФ. (1975) Лабораторные млекопитающие: крыса."Объекты биологии развития" под ред Детлаф Т. А., Наука:505-566.

15. Руткис З.А., Протасов В.И., (1982) Выживание бластоцист кроликов при субнормальных температурах с добавлением в среду хранения пролактинаю. С-х. Биология. 4:536-540.

16. Abas Mazni О., Valdes CA., Takahashi Y., Hishinuma M., Kanagawa H. (1990) Quick freezing of mouse embyos using ethylene glycol with lactose or sucrose Anim. Reprod. Sei. 22(2): 161-169

17. Ali J, Shelton JN. (1993) Vitrification of preimplantation of mouse embryos. J. Reprod. Fert. 98(2): 459-465.

18. Arave CW, Bunch TD, Mickelsen CH, Warnick K. (1987) Factores affecting survivability of transferred whole and demi-embryos in commercial dairy herd. Theriogenology. 28(3): 373-382.

19. Aslanidi K.B., Aslanidi G.V., Vachadze D.M., Zinchenko V.P., Labas Yu.A., Potapova T.V. (1997) A possible role of cold-induced ionic stress in cold-induced cell death. Member Cell Biol, 11(1) :57-76.

20. Averill RLW, Rowson LEA. (1959) Attempts at storage of sheep ova at low temperatures. J Agric Sci 52(3): 392-395.

21. Baguisi A, Arav A, Crosby TF, Roche JF, Boland MP. (1997) Hypotermic storage of sheep embryos with antifreeze proteins development in vitro and in vivo. Theriogenology 48: 1017-1024.

22. Barbehenn EK, Wales RG, Lowry OH. (1978) Measurement of metabolites in single preimplantation embryos : a new means to study metabolic control in early embryos. J Embryol Exp Morph 43:29-46.

23. Barq PE, Barad DH, Feichtinger W. (1990) Ultrarapid freezing (URF) of mouse and human preembryos: a modified approach. J. In Vitro Fert. Embryo Transfer. 7:6:355-357.

24. Bavister BD. (1995) Culture of preimplantation embryos: facts and artifacts. Hum Reprod Update 1:91-148.

25. Bernard A, Fuller B, Djahanbakhch O, Imoedemhe D, Stevens P, Shaw RW. (1984) The osmotic response of human oocytes to glycerol and 1,2 propandiol (Abtsr). Cryobiology 21:712,

26. Bielanksi A, Manns JG, Schneider U, Mapletoft RJ. (1986) Survival of mouse embryos after refrigeration and deep freezing. Theriogenology 25(1): 139.

27. Biery KA, Seidel GE, Jr, Eldsen RP. (1986) Cryopreservation of mouse embryos by direct plunging into liquid nitrogen. Theriogenology 25(1): 140.

28. BiltonRJ, MoorNW. (1976) Storage of cattle embryos. J.Reprod. Fert. 46:537-538.

29. Bilton RG, Moore NW. (1979) Factors affecting the viability of frozen stored cattle embryos. Aust J Biol Sci.

30. BonDurant RH, Anderson GH, Boland M, Cupps PT, Hughes MH. (1981) Pregnansy rates and embryos survival following transfer of bovine embryos stored at 4 C. Theriogenology 15(1): 112.

31. BonDurant RH, Anderson GH, Boland M, Cupps PT, Hughes MH. (1982) Preliminary studies on bovine embryo survival following short term storage at 4 C. Theriogenology 17(2):223-230.

32. Boone WR, Brown CA, Vasquez JM, Shapiro SS. (1988) Freezing of mammalian embryos without the aid of a programmable freezer. Fertil. Steril 50(2):348-354.

33. Borland RM, Hazra S, Biggers JD, Lechene CP. (1997) The elemental composition of the environments of the gametes and preimplantation embryo during the initiation of pregnancy. BiolReprod 16: 147-157.

34. Carnevale EM, Squires EL, Kinnon AO. (1987) Comparison of Hams F-10 With C02 or Hepes buffer for storage of equine embryos at 5 C for 24 H. I Anim Sci 65: 1775-1781.

35. Clark KE, Squires EL, McKinnon AO, Seidel GE, Jr. (1987) Viability of stored equine embryos. J. Anim. Sci 65(2): 534-542.

36. Copp AJ. (1978) Interaction between inner cell mass and trophectoderm of the mouse blastocyst. JEmbryol Exp Morph 48: 109-125.

37. Dandekar PV, Glass RH. (1987) Development of mouse embryos in vitro is affected by strain and culture medium. Gamete Res 17(2): 279-285.

38. Dinnyes A, Wallace GA, Rail WF. (1995) Effect of genatype on the efficiency of mouse embryo cryapreservation by vitrification or slow freezing methods. Mol Reprod Devel 40:429-435.

39. Dinnyes A, Carolan C, Loneragan P, Solti L, Massip A, Mermillod P. (1995) Invitro survival of in vitro produced (IVP) bovine embryos frozen or vitrified by techniques suitable for direct transfer. Theriogenology 38:197.

40. Dobrinsky JR, Graves CN. (1988) Effect of 4 C storage prior to vitrification on development invitro of mouse embryos. J. Anim. Sci. 66(Suppl 1): 403-404.

41. Du ZF, Wales RG. (1993) Some effects of genotype and composition of the culture medium on the development of mouse zygotes in vitro. Reprod Fertil Dev 5: 405-415.

42. Evans MJ, Kaufman MH. (1981) Establishment in culture of pluripotent cells from mouse embryos. Nature 292 (5819) : 154-156.

43. Fahy GM, McFarlane DR, Angell CA, Meryman HT. (1984) Vitrification as an approach to cryopreservation. Cryobiology 21:407.

44. Fiser PS, Fuku E, Marcus GJ, Bielanski A. (1991) The effect of partial dehydration on the development capacity of mouse embryos stored in the supercooled state. Cryobiology 28(6): 535.

45. Gardner DK, Lane M. (1996) Alleviation of the "2-cell block" and development to the blastocyst of CF1 mouse embryos: role of amino acids, EDTA and physical factors. Biol Reprod 11: 2703-2712.

46. Gordts S, Roziers P, Campo R, Noto V. (1990) Survival and pregnancy outcome after ultrarapid freezing of human embryos.Fertil. Steril 53(3): 469-472.

47. Hafez ESE. (1965) Storage media for rabbit ova. J.Appl. Physiol 20:731-736.

48. Harper MJK, Rowson LEA. (1963) Attempted storage of sheep ova at 7 centigrade. J reprod Fertil 6: 183-191.

49. Herr CM, Wright RJR. (1988) Cold storage of mouse embryos of different stage of development. Theriogenology 29(3): 765-770.

50. Herr CM, Wright RJR. (1988) Cold storage of different stage mouse embryos in biocarbonated and biocarbonate-free media. Theriogenology 30(1):159-168.

51. Heyman Y, Xuan NB, Renard JP. (1988) Preservation in the supercooled state of one-cell rabbit eggs with reduced cell water content. Cryobiology 25(6): 564.

52. Ho Y, Wigglesworth K, Epigg JJ, Schultz RM. (1995) Preimplantation development of mouse embryos in KSOM: augmentation by amino acids and analysis of gene expression. Mol Reprod Devel 41:232-238.

53. Itskovitz-Eldor DW, Fletcher GL, Rubinski B. (1993) Hypotermic preservation of human oocytes with antifreeze proteins from sub-polar body. Cryo-Lett 14(4):235-242.

54. Kasai M, Niwa K, Iritani A. (1981) Effects of various cryoprotective agents on the survival of unfrozen and frozen mouse embryos J. Reprod. Fertil 63(1): 175-180.

55. Kasai M, Niwa K, Iritani A. (1986) Protective effect of sucrose on the survival of mouse and rat embryos stored at 0 C. J. Reprod. Fert 68(2):377-380.

56. Kasai M. (1986) Nonfreezing technique for short-term storage of mouse embryos. J. Vitro Fert. Embr. Trans 3(1): 10-14.

57. Kasai M, Niwa K, Iritani A. (1980) Survival of mouse embryos frozen and thawed rapidly. J Reprod Fertil 59 :51.

58. KasaiM. (1996) Simple and efficient methods for vitrification of mammalian embryos. Anim Reprod Sci 42: 67-75.

59. Kasai M, Zhu SE, Pedro PB, Nakamura K, Sakurai T, Edashige K. (1996) Fracture damage of embryos and its prevention during vitrifaication and warming. Cryobiology 33: 459-464

60. Kasai M, Nishimori M, Zhu SE, Sakurai T, Machida T. (1992) Survival of mouse morulae vitrifed in an ethylene glcol-based solution after exposure to the solution at various temperatures. Biol Reprod 47: 1134-1139.

61. KasaiM. (1997) Cryopreservation of mammalian embryos. Cryobiology 7(2): 173179.

62. Kelly SJ. (1977) Studies of the developmental potential of 4- and 8-cell stage of mouse blastomeres. J Exp Zool 200(3): 365-376.

63. King WA, Picard L, Bosquet D, Goff AK. (1992) Sex- dependent loss of bisected bovine morulae after culture and freezing. J. Reprod Fert 96(2): 453-459.

64. Kishi J, Noda Y, Noriraato K, Umaoka Y, Mori T. (1991) Block to development in cultured rat 1-cell embryos is overcome using medium HECM-1. Hum Reprod6(10): 1445-1448.

65. Krag KT, Koehler IM, Wright RW, Jr. (1985) A method for freezing early murine embryos by plunging directly into liquid nitrogen. Cryobiology 22(6): 635-636.

66. Krivokharchenko A, Galat V., GantenD., Bader M. In vitro formation of tetraploid rat blastocysts after fusion of two-cell embryos Mol Reprod Dev 2002 ; 61(4):460-465

67. Lawitts JA, Biggers JD. (1992) Joint effects of sodium chloride, glutamine and glucose in mouse preimplantation embryo culture media. Mol Reprod Devel 31:189194.

68. Lehn-Jensen H, Willadsen SM. (1983) Deep-freezing of cow "half' and "quarte" embryos. Theriogenology 19(2): 49-54.

69. Leibo SP, Mazur P, Jackowski SC. (1979) Factors affecting survival of mouse embryos during freezing and thawing. Exp Cell Res 89: 79.

70. Leibo SP, Winninger D. (1986) Production of bovine pregnancies from embryos transported at 0 C by air. Theriogenology 25(1): 165.

71. Leibo SP, Roll WF. (1987) Increase in production of pregnancies by bisection of bovine embryos. Theriogenology 27(1): 245.

72. Leibo SP, Pollard JW, Martino A. (1995) Chilling and freezing sensitivity of "reassembled" in virto-derived bovine embryos. Theriogenology 43:265.

73. Lindner GM, Wright RW. (1983) Bovine embryo morphology and evaluation. Theriogenology 20(4): 407-416.

74. Lindner GM, Anderson GB, BonDurant RH, Cuups PT. (1983) Survival of bovine embryos stored at 4 C. Theriogenology 20(3): 311-319.

75. Lindner GM, Ellis DE. Refrigeration of bovine embryos. (1985) Theriogenology 23(1): 202.

76. Liu J, Vandenabbeel E, Vansteirteghem A. (1993) The in vitro and in vivo development potential of frozen and non frozen biopsied 8-cell mouse embryos. Hum. Reprod 8(9): 1481-1486.

77. Looney CR, Westhusin ME, Bondioli KR. (1989) Effect of cooling temperatures on pre-compacted bovine embryos. Theriogenology 31(1): 218.

78. Lopes RFF, Rodriques JL, Christmann L. (1989) In vivo survival of mouse embryos frozen by direct plunging into liquid nitrogen and vitrification. Theriogenology 31(1): 219.

79. Loskutoff NM, Johnson WH, Betteridge KJ. (1993) The development competence of bovine embryos with reduced cell number. Theriogenology 39(1): 95-107.

80. LowBG, Takahashi Y, Kanagawa. (1986) Variability of frozen-thawed mouse blastocyst with different number of dead cells. Theriogenology 25(5): 675-680.

81. Liu J, Van den Abbeel Van Steirteghem AC. (1993) Assessment of ultrarapid and slow freezing procedures for 1-cell and 4-cell mouse embryos. Hum Reprod 8(7): 11151119.

82. Mahadevan M. M., Fleetham J., Church R. B., Taylor P. J. Growth of mouse embryos in bicarbonate media buffered by varbon dioxide, Hepes of phosphate//J. Vitro Fertil. and Embryo Transfer. 1986. V. 3. P. 304-307.

83. Maneiro E, Ron-Corzo A, Julve J, Goyanes VJ. (1991) Surface area/volume ratio and growth equation of the human early embryo. Int J Dev Biol 35:139-145.

84. Mapletofl RJ, Moker J, Palasz A. (1989) Effect of thawing temperature and time of sucrose dilution on survival of mouse embryos in culture. Theriogenology 31(1): 223.

85. Martes PC, Bondioli KP. (1985) Effect of splitting technique on pregnancy rate from half embryos. Theriogenology 23(1): 209.

86. Masayasu M, Nishikimi A. (1999) Inhibitory effect of phosphate on in vitro development of 2-cell rat embryos is overcome by a factor(s) in oviductal extracts. FEBS Lett 462:71-74.

87. Massip A, Van der ZwalmenP. (1982) In vitro survival of mouse embryos frozen in glycerol or glycerol-sucrose (Abstr). Cryo- Letters 3:326.

88. Massip A, van der Zwalmen P, Ectors F. (1985) Recent progress in cryopreservation of cattle embryos. Theriogenology 27(1): 69-70.

89. Massip A, Van der Zwalmen P, Scheffen B, Ectors F. (1986) Pregnancies following transfer of cattle embryos preserved by vitrification. Cryo-Letters 7:270-273.

90. Massip A, Van der Zwalmen P, Leroy F. (1984) Effect of stage of development on survival of mouse embryos frozen-thawed rapidly. Cryobiology 21: 574-577.

91. Maurer RR, Haseman JK. (1976) Freezing morula stage rabbit embryos. Biol. Reprod 14: 256-263.

92. Mazur P, Leibo SP, Chu EHY. (1972) A two-factor hypothesis of freezing injury. Exp Cell Res 71(2) 342-355.

93. Mazur P. (1984) Freezing of living cells: mechanisms and implications. Am. J Phisiol 247 ( Cell Physiol 16:C125-C142).

94. MazurP. (1990) Equilibrium, quasti-equilibrium, and nonequilibrium freezing of mammalian embryos. Cell Biophysics 17(1): 53-92.

95. Mazur P, Schneider U. (1986) Osmotic responses of preimplanation mouse and bovine embryos and their cryobilogical implicatioans. Cell Biophys 8:259.

96. McKierman SH, Clayton MK, Bavister BD. (1995) Analysis of stimulatory and inhibitory amino acids for development of hamster one-cell embryos in vitro. Mol Reprod Devel 42: 188-199.

97. Meryman HT. (1970) The exceeding of medium tolerable cell volume in hypertonic suspension as a couse of freezing injury. The Frozen Cell. London 51-63.

98. Minhas BS, Randall GM, Dodson MG, Robertson JL. (1989) A limited exposure of murine oocytes and zygotes to phosphate buffered saline retards development in vitro. Theriogenology 31(1): 229.

99. Miyake T, Kasai M, Zhu SE, Sakurai T, Machida T. (1993 ) Vitrification of mouse oocytes and embryos at various stages in an ethylene glycol-based solution by a simple method. Theriogenology 40:121-134.

100. Miyamoto H, Ishibashi T. (1983) Survival of mouse embryos frozen-thawed slowly or rapidly in the presence of various cryoprotectants. J Exp Zool 226:123.

101. Miyamoto H. (1986) Factors affecting the survival of mouse embryos during freezing and thawing. J In Vitro Fer Embry Transfer 3:15.

102. Miyamoto H, Ishibishi T. (1977) Survival of frozen-thawed mouse and rat embryos in the presence of ethyilen glycol. J Reprod Fertil 50:373.

103. Mioyashi I, Ishikawa K, Kasai M, Kasai N. (1992) Useful short-range transport of mouse embryos by means of a nonfreezing technique . Lab. Anim. Sci. 42(2): 198-201.

104. Miyoshi K, Funahashi H, Okuda K, Niwa K. (1994) Development of rat 1-cell embryos in a chemically defined medium: effects of glucose, phosphate and osmolarity. J Reprod Fertil 100:21-26.

105. Miyoshi K, Abeyderra LR, Okuda K, Niwa K. (1995) Effects of osmolarity and amino acids in a chemically defined medium on development of rat 1 -cell embryos. J Reprod Fertil 103:27-32.

106. Miyoshi K, Kono T, Niwa K. 1997. Stage-dependent development of rat 1 -cell embryos in a chemically defined medium after fertilization in vivo and in vitro. Biol Reprod 56:180-185.

107. Miyoshi K, Niwa K. (1997) Stage specific requirement of phosphate for development of rat 1-cell embryos in a chemically defined medium. Zygite5(February): 67-73.

108. Monis H., Bavister B. D. Development of 4-cell hamster embryos to the blastocyst stage in vitro and its regulation by components of the culture milieu//Reprod. Fertil. Dev. 1990. V. 2. P. 1-9.

109. Monis H., Bavister B. D. Analysis of the inhibitory effect of inorganic phosphate on development of four-cell hamster embryos in vitro//J. Exp. Zool. 1990. V. 256. N 1. P. 75-83.

110. Nagashima H, Kato Y, yamakawa H, Ogawa S. (1988) Survival of pig hached blastocysts exposed below 15 C. Theriogenology 29(1): 280.

111. Nakamichi R, Ohboshi S, Fujihara N. (1993) Vitrification of rat blastocysts developed in vitro. Zygote l(November): 281-285.

112. Niemann H, Wust A, Gardon JC. (1989) Successful intercontinental transport of porcine embryos from Europe to south America. Theriogenology 31(3): 525.

113. Nowshari MA, Nayudu PL, Hodges JK. (1995) Effect of cryopretectants and their concentration on post-thwed pronuclear stage mouse embryos. Hum Reprod 10:32373242.135.0hboshi S, Fujihara N, Yoshida T, Tomogane H (1997)

114. Usefulness of polyethylene glycol for cryopreservation by vitrification of in vitroderived bovine blastocysts.

115. Palasz A, Del Campo MR, Mapletoft RJ. (1990) The effect of methods of thawing and glycerol removal on survival of frozen mouse and bovine embryos. Theriogenology 33(1): 294.

116. Pedro PB, Zhu SE, Makino N, Sakurai T, Edashige, Kasai M. (1997) Effects of hypotonic stress on the survival of mouse oocytes and embryos at various stages. Cryobiology 35:150-158.

117. Petters R. M., Johnson B. H., Reed M. L., Archibong A. E. Glucose, glutamine and inorganic phosphate in early development of pig embryo in vitro//J. Reprod. Fert. 1990. V. 89. P. 269-275.

118. Polge c, Wilmut I, Rowson LEA. (1974) The low temperature preservation of cow, sheep and pig embryos. Cryobiology 11(6): 560.

119. Polge C, Willadsen SM . (1978) Freezing eggs and embryos of farm animals. Cryobiology 15:370.

120. Pollard JW, Leibo SP. (1994) Chilling sensitivity of mammalian embryos Theriogenology 41:101-106.

121. Pomp D, Eisen EJ. (1990) Genetic control of survival of frozen mouse embryos . Biol. Reprod. 42(5-6): 775-786.

122. Pool SH, Blakewood EG, Rorie RW, McFarland CW, Godke RA. (1986) Use of household refrigerator for short-term storage of bovine embryos. Theriogenology 25(1): 184.

123. Rail WF, Fahy GM. (1985) Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196 C by virtification. Nature 313(6003): 573-575.

124. Rall WF, Wood MJ. (1994) High in vitro and in vivo survival of day 3 mouse embryos vitrified or frozen in a nontoxic solution of glycerol and albumin. J. Reprod. Fert. 101(3): 681-688.

125. Rail WF, Wood MJ, Kirby C. (1985) In vivo development of mouse embryos cryopreserved by vitrification (Abstr). Cryobiology 22: 603.

126. Renard JP, Bui-Zuan-Nguyen, Gamier Y. (1984) Two-step freezing of two-cell rabbit embryos after partial dehydration at room temperature. J. Reprod. Fert. 71(2): 573-580.

127. Schmidt PM, Wildt DE. (1986) Influence of sucrose concetration and dilution sequence on culture viability of thawed embryos from four mouse genotypes. Theriogenology 25(1): 195.

128. Schmidt PM, Hansen CT, Wildt DE. (1985) Viability of frozen-thawed mouse embryos is affected by genotype. Biol. Reprod. 32(3): 507-514.

129. Schmidt PM, Schiewe MC, Wildt DE. (1987) The genotypic response of mouse embryos to multiple freezing variables. Biol. Reprod. 37(5): 1121-1128.

130. Schneider U, Mazur P. (1984) Osmotic consequences of cryoprotectant permeability and its relation to the survival of frozen thawed embryos. Theriogenology 21:68.

131. Sertich PL, Love LB, Hodgson MR, Kenny RM. (1988) 24-hour cooled storage of equine embryos. Theriogenology 30(5): 947-952.

132. Seshagiri P. B., Bavister B. D. Glucose inhibits development of hamster 8-cell embryos in vitro//Biol. Reprod. 1989a. V.40. P.599-606.

133. Seshagiri P. B., Bavister B. D. Phosphate is required for inhibition by glucose of development of hamster 8-cell embryos in vitro// Biol. Reprod. 1989b. V.40. P. 607614.

134. Seshagiri PB, Bavister BD. (1991) Glucose and phosphate inhibit respiration and oxidative metabolism in cultured hamster eight-cell embryos: evidence for the "Crabtree effect". Mol Reprod Devel 30:105-111.

135. Shaw JM, Kola I, MacFarlane DR, Trounson AO. (1991) An association between chromosomal abnormalities in rapidly frozen 2-cell mouse embryos and the ice-forming properties of the cryoprotective solution. J Reprod Fertil 91:9-18.

136. Shaw JM, Trounson AO. (1989) Effect of dimethyl sulfoxide and protein concentration on the viability of two-cell mouse embryos frozen with a rapid freezing technique. Cryobiology 26: 413-421.

137. Shaw JM, Diotallevi L, MacFarlane D, Trounson A. (1989) Rapid freezing of pronuclear, two-cell, eight-cell, morulae and blastocyst stage mouse embryos. Cryobiology 26(6): 540-541.

138. Shelton K. (1982) The successful cryopreservation of in vitro fertilized mouse embryos. Cryo-Letters 2:305.

139. Sherman JK, Lin TP. (1959) Temperature shock and cold-storage of unfertilized mouse eggs. Fértil. Steril. 10(4): 384-396.

140. Singh EL. (1987) The decease control potential of embryos. Theriogenology 27(1): 9-20

141. Smith DM, Tenny DY. (1978) The effect of cold shock on mouse oocyte maturation in vitro. J. Reprod. Fert. 54(2): 401-403.

142. Smith R, McLaren A. (1977) Factors affecting the time of formation of the mouse blastocoel. J Embryol Exp Morph 41: 79-92.

143. Sreenan J, Scanlon P, Gordon I. (1970) Storage of fertilized cattle ova in vitro. J. Agrie.Sci. 74(3): 593-594.

144. Takahashi Y,Kanagawa H. (1985) Quick freezing of mouse embryos by direct plunge into liquid nitrogen vapour: effects of sugars. Jpn. J. Vet.Res. 33(3-4): 141-144.

145. Takahashi Y,Kanagawa H. (1990) Effect of equilibration period on the viability of frozen-thawed mouse morulae after rapid freezing. Molec.Reprod. Devel. 26: 105110.

146. Takeda T, Elsen R, Seidel GE. (1984) Cryopreservation of mouse embryos by direct plunging into liquid nitrogen. Theriogenology 21(1): 266.

147. Takeda T, Hallowell SV, McCauley AD, Hasler IF. (1986) Pregnancy rates with intact and split bovine embryos transferred surgically and nonsurgically. Theriogenology 25(1): 204.

148. Tao T, Jang S, Han Y, Gao C, Meng W, An T, Zhu Y. (1991) The survival of zona-free bovine demi- and quarte embryos. Theriogenology 36: 1: 281.

149. Tarkowski AK. (1966) An air drying method for chromosome preparations from mouse eggs. Cytogenetics 5: 394-400.

150. Tarkowski AK., Wroblewska J. (1967) Development of blastomeres of mouse eggs isolated at the 4- and 8-cell stage. J. Embryol. Exp. Morph 16: 155-180.

151. Thomas WK, Biery KA, Kraemer DC. (1989) Effect of cryoprotectant concentration on mouse embryo development following rapid freezing. Theriogenology 31(1): 266.

152. Trounson AO, Willadsen SM, Rowson LEA, Newcomb R. (1976) The storage of eggs at room temperature at low temperatures. J. Reprod. Fertil. 46(1): 173-178.

153. Trounson AO, Willadsen SM, Rowson LEA. (1976) The influence of in vitro culture and cooling on the survival and development of cow embryos. J. Reprod. Fertil. 47(2):367-370.

154. Trounson AO, Peura A, Kirby C. (1987) Ultrarapid freezing: a new low-cost and effective method of embryo cryopreservation. Fertil. Steril. 48(5): 843-850.

155. Trounson AO, Peura A, Freemann L, Kirby C. (1988) Ultrarapid freezing of early cleavage stage human embryos and eight cell mouse embryos. Fertil.Steril. 9(5): 822826.

156. Valdez CA, Mazni OA, Kanagawa H. (1987) Effect of phitosin on mouse embryo survival after short-term storage. Jpn J Yet Res 35:221-224.

157. Valdez CA, Mazni OA, Kanagawa H, Fujikawa S. (1990) Confirmation by cryo--electron microscopy of absence of cristallization using a vitrification solution. Cryo-let. 11:351-358.

158. Valdez CA, Mazni OA, Takahashi Y, Hishinuma M, Kanagawa H. (1990) Effects of equilibration time, precooling and development stage on the survival of mouse embryos cryopreserved by vitrification. Theriogenology 33(3): 627-635.

159. Valdez CA, Mazni OA, Takahashi Y, Fujikawa S, Kanagawa H. (1992) Successful cryopreservation of mouse blastocysts using a new vitrification solution. J. Reprod. Fertil. 96(2): 793-802.

160. Van Winkle LJ, Campione AL. (1996) Amino acid transport regulation in preimplantation mouse embryos: effects of amino acid content and pre- and periimplantation development. Theriogenology. 45: 69-80.

161. Van den Abbeel E, Van der Eist J, Van der Linden M, van Steirteghem A. C. (1997) High survival rate of one-cell mouse embryos cooled rapidly to -196 C exposure to a propylene glycol-Dimethylsulfoxide-sucrose solution. Cryobiology 34: 112.

162. Van der Eist J, Van den Abbeel E, Van Steirteghem AC. (1995) The effect of equilibration temperature and outcome of ultrarapid freezing of one-cell mouse embryos. Hum reprod 10: 379-383.

163. Vitale NJ, Myers MW, Denniston RS, Leibo SP, Godke RA. (1997) In-vitro development of refrozen mouse embryos. Hum Reprod 12 (2): 310-6

164. Voelkel SA, Viker SD, Johnson CA, Hill KG, Humes PE, Godke RA. (1985) Multiple embryo-transplant offspring produced from quarteing a bovine embryo at the morula stage. Vet.Res. 117(20): 528-530.

165. Voelkel SA, Rorie RW, MacFarland CW, Godke RA. (1986) An attempt to produce quarter embryos from non-surgically recovered bovine blastocysts. Theriogenology 25(1): P 207.

166. Warfield SJ, Seidel GE, Elsden RP. (1986) Transfer of bovine demi-embryos with and without zonae pellucidae. Theriogenology 25(1): 212.

167. Whittingham DG, Wales RG. (1969) Storage of two-cell mouse embryos in vitro. Aust J Biol Sei 22: 1065-1068.

168. Whittingham DG. (1971) Survival of mouse embryos after freezing and thawing. Nature 233(5315): 125-126.

169. Whittingham DG, Leibo SP, Mazur P. (1972) Survival of mouse embryos frozen to-196 C and -269 C. Science 178: 411-414.

170. Whittingham DG, Witten WK. (1974) Long-term storage and aerial transport of frozen mouse embryos. J. Reprod. Fertil. 36(2): 433-435.

171. Whittingham DG, Lyon MF, GlenisterPH. (1977) Re-establishment of breeding of mutant and inbred strains of mice from embryos stored at -196 C for prolonged periods.

172. Genet. Res 30(3): 287-299.

173. Whittingham DG, Wood M, Farrant J, Lee H, Halsey JA. (1979) Survival of frozen mouse embryos after rapid thawing from -196 C. J Reprod Fertil 56: 11

174. Wildt DE, Schiewe MC, Schmidt PM, Goodrowe KL, Howard JG, Phillips LG, 0"Brien SJ, Bush M. (1986) Developing animal model systems for embryo technologies in rare and endangered wildlife. Theriogenology 25(1): 33-51.

175. Willadsen SM. (1981) The developomental capacity of blastomeres from 4-and 8- sheep embryos. J. Embriol. Exp. Morh. 65: 165-172.

176. Willadsen SM, Polge C. (1981) Attempts to produce monozigotic quadruplets in cattle by blastomere separation. Vet. Rec. 108(10): 211-213.

177. Willadsen SM, Lehn-Jensen H, Fehilly CB, Newcomb R. (1981) The production of monozygotic twins of preselected parentage by micromanipulation of non-surgically collected cow embryos. Theriogenology 15(1 ): 23-29.

178. Williams TJ, Elsden RP, Seidel GE. (1984) Effect of embryo age and stage on pregnancy rates from demi-embryos. Theriogenology 21(1): 276.

179. Williams TJ, Johnson SE. (1985) Quick-freezing of day four mouse embryos. Theriogenology 23(1): 325.

180. Williams TJ, Johnson SE. (1986) A method for one-step freezing of mouse embryos. Theriogenology 26(1): 125-133.

181. Wilmut I, Polge C, Rowson LEA. (1975) The effect on cow embryos of cooling to 20, 0 and -196 C. J. Reprod. Fert. 45(2): 409-411.

182. Wilson L, Quinn P. (1989) Development of mouse embryos cryopreserved by an ultra-rapid method of freezing. Hum. Reprod 4: 1: 86-90.

183. O.Wood MJ, Farrant J: Preservation of mouse embryos by two-step freezing. (1980) Cryobiology 17:178.

184. Xu K, Palasz A, Moker J, Mapletoft RJ. (1988) Fast freezing of mouse morulae. Theriogenology 29(1): 334.

185. Yang NS, Luu KH, Gordon I. (1990) In vitro fertilization (IVF) and culture (IVC) of bovine oocytes from stored ovaries. Theriogenology 33(1): 352.

186. Yang NS, Duff R, Lu KH, Gordon I, Polge C. (1991) Effect of storage temperature and time on the viability of bovine embryos produced in vitro. Theriogenology 35(1): 297.

187. Yoshino J, Kojima T, Shimizu M, Tomizuka T. (1993) Cryopreservation of porcine blastocyts by vitrification. Cryobiology 30: 413-422.

188. Zhang X, Armsrong DT. (1990) Presence of amino acids and insulin in a chemically defined medium impruves development of 8-cell rat embryos in vitro and subsequent implantation in vivo. Biology Reprod 42:662-668.

189. Ziomek CA, Johnson MH, Handyside AH. (1982) The developmental potential of mouse 16-cell blastomeres. J. Exp. Zool. 221(3): 345-355.

190. Zhu SE, Kasai M, Otoge H, Sakurai T, Machida T. (1993) Cryopreservation of expanded mouse blastocysts by vitrivication in ethylene glycol-based solutions. J Reprod Fertil 98: 139-145.