Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Мутагенные эффекты в лимфоцитах эмбрионов человека при воздействии микрофоллина на организм беременной

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Мутагенные эффекты в лимфоцитах эмбрионов человека при воздействии микрофоллина на организм беременной"

во г* 4 г

научный медико-генетический центр рамн

На правах рукописи

яворовская оксана михайловна УДК:615:575:611

мутагенные эффекты в лимфоцитах эмбрионов человека при воздействии микрофоллина на организм беременной

03.00.15 - Генетика

14.00.33 - Акушерство и гинекология

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1992

Работа выполнена во Львовском научно-исследовательском институте педиатрии, акушерства и наследственной

патологии

Научные руководители - кандидат медицинских наук,

старший научный сотрудник О.А.Созанский - доктор медицинских наук, профессор Л.Я.Давыдов

Официальные оппоненты -доктор медицинских наук, профессор

Н.П.Кулешов -доктор медицинских наук В.А.Бахарев

Ведущая организация: НИИ медицинской генетики Томского

научного центра РАМН

Защита состоится « Я/ » ф^ССри^Л/ 1992г.

в_¿на заседании специализированного совета

Научный медико-генетический центр РАМН_

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан «

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук,

профессор _ Л.Ф.Курило

биьл4ч0ВДая характеристика проблемы

Актуальность.

Изучение процессов внутриутробного развития плода человека в условиях изменяющейся экологии и появления всё большего количества потенциально мутагенных и тератогенных веществ в среде обитания является крайне актуальным (Бочков Н.П.,1989).

Решение этих вопросов особенно важно в медицинской генетике и акушерско-гинекологической практике, поскольку именно эти направления медицины обеспечивают нормальную репродукцию популяции путем профилактики врожденной и наследственной патологии, лечения бесплодия и невынашивания беременности. Для этих целей в акушерстве-гинекологии используется большое количество медикаментозных средств, применение которых может приводить к нежелательным последствиям с точки зрения организма плода (Jacobson В. 1962, Driscoll S.1980, Ivett J. 1981).

В литературе имеется достаточно указаний на то, что половые стероидные гормоны, применяемые в акушерско-гинекологической практике, могут оказывать мутагенное и тератогенное действие на развивающийся организм (Brasken M. 1978, Berger M. 1980, Симпсон Дж. 1985).

Для определения мутагенных эффектов предложен целый ряд тест-систем на микроорганизмах, растениях, насекомых и клетках млекопитающих (Бочков Н.П. 1989). Наиболее приемлемыми для анализа мутагенных эффектов в популяции человека являются динамический учет врождённых пороков развития (ВПР) среди новорожденных и цитогенетический анализ лимфоцитов периферической крови (Бочков Н.П. 1975).

Однако, даже учет частоты и спектра хромосомных аберраций имеет ряд недостатков.

Во-первых, он дает возможность изучать лишь хромосомные аберрации в лимфоцитах, стимулированных к делению митогенами в условиях их культивирования in vitro. Во-вторых, получаемые данные отображают чувствительность постнатальных клеток к повреждающему воздействию, а клетки развивающегося эмбриона могут отличаться от них в этом отношении. В-третьих, этот метод не дает возможности оценить суммарное воздействие фактора и их метаболитов на развивающийся эмбрион человека при действии на организм матери.

Следует подчеркнуть, что именно на 6-12 неделях внутриутробного развития происходит формирование пула митотических клеток, из которых в последствии образуются гаметы (Карлсон Б. 1983).

В последнее время большое внимание, помимо исследования хромосомных аберраций, как критерия мутационных событий, уделяется изучению частоты полиплоидных клеток и метафаз с преждевременным расхождением хроматид (ПРХ) (Atkin N. 1967, Mehes К.1978, Fitzgerald P.l975,1985, MadanK.1987).

Широкое применение женских половых стероидных гормонов в гинекологической практике с одной стороны, и недостатки имеющихся способов оценки мутагенных эффектов у эмбрионов с другой стороны, сформировали необходимость проведения настоящего исследования.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлось : изучить мутагенные эффекты у эмбрионов человека при воздействии микрофоллина на организм беременной. Для достижения поставленной цели решали ряд задач:

1 .Изучить частоту приема половых стероидных гормонов женщинами во время беременности.

2.Разработать метод получения препаратов метафазных хромосом лимфоцитов эмбрионо» человека.

3.Изучить частоту и спектр хромосомных аберраций в лимфоцитах эмбрионов человека в норме и при приеме беременными больших доз микрофоллина.

4.Изучить частоту полиплоидов и клеток с ПРХ в лимфоцитах эмбрионов человека в норме и при приеме беременными больших доз микрофоллина.

Научная новизна .

Впервые установлена частота и спектр хромосомных аберраций в лимфоцитах эмбрионов человека 6 — 12 недели внутриутробного развития без их культивирования in vitro в норме и при воздействии на организм беременной микрофоллина в больших дозах. Показано, что у эмбрионов, перенесших воздействие больших доз микрофоллина частота клеток с хромосомными аберрациями достоверно больше.

Впервые установлено наличие и изучена частота клеток с ПРХ в лимфоцитах эмбрионов человека 6 — 12 недель внутриутробного развития. Показано, что частота клеток с ПРХ зависитот пола эмбриона. У эмбрионов женского пола она достоверно выше, чем у эмбрионов мужского пола. Показано,что наличие клеток с ПРХ не связано с присутствием колхицина в питательной среде.

Впервые установлено достоверное повышение частоты клеток с ПРХ в лимфоцитах эмбрионов человека при приеме беременными больших доз микрофоллина.

Впервые изучена частота полиплоидных клеток в лимфоцитах эмбрионов человека без их культивирования in vitro. Установлено достоверное увеличение количества полиплоидных клеток у эмбрионов, перенесших внутриутробно воздействие больших доз микрофоллина.

Предложен способ получения препаратов метафазных хромосом лимфоцитов эмбрионов человека 6-12 недели внутриутробного развития без их культивирования in vitro (отраслевое рационализаторское предложение N881).

Практическая ценность.

Предложен метод получения препаратов метафазных хромосом лимфоцитов эмбрионов человека без их культивирования in vitro Его можно использовать для кариотипирования абортированных эмбрионов человека, для изучения частоты и спектра хромосомных аберраций, исследования состояния отдельных участков хромосом (С-; Ag-полиморфизма) в состоянии in vivo. Предложенный метод обладает рядом преимуществ в сравнении с существующими. Во-первых, отсутствует культивирование клеток in vitro. Во-вторых, нет необходимости в соблюдении стерильности.

Предложенный метод, можно использовать для оценки повреждающего воздействия факторов окружающей среды на различных вредных производствах; в относительно малых коллективах; при возникновении экологического неблагополучия для быстрой оценки возможных его последствий.

Предложен способ оценки мутагенных эффектов в тканях эмбрионов человека при воздействии факторов внешней среды на организм беременной, путем исследования метафазных хромосом в лимфоцитах эмбрионов человека.

Данные о влиянии микрофоллина на генетический аппарат эмбриона человека являются важными для акушерско-гинекологической практики с точки зрения выбора оптимальной терапии на ранних сроках беременности, а также при консультировании женщин, принимавших большие дозы гормональных препаратов.

Внедрение результатов исследования в практику.

Основные результаты диссертации внедрены в практику медико-генетической консультации Львовского МГЦ, Всесоюзного центра радиационной медицины АМН СССР, НИИ наследственной патологии МЗ БССР, а

также Медико-генетической консультации Житомирской области. Получено отраслевое рационализаторское предложение «Способ получения препаратов метафазных хромосом лимфоцитов эмбриона человека без их культивирования in vitro» (N 881). Изданы методические рекомендации: «Хромосомный анализ абортивного материала для оценки возможного мутагенного влияния факторов окружающей среды», Львов, 1990; «Генетический мониторинг населения в связи с загрязнением внешней среды», Львов, 1991.

Апробация работы.

Основные положения диссертации доложены на 5 -ом съезде Всесоюзного общества генетиков и селекционеров им.Вавилова, ноябрь, 1987 г., г.Москва; 5-ом съезде генетиков и селекционеров Украины, июнь, 1986 г., г.Умань; 1-ом съезде медицинских генетиков УССР, март, 1988, г.Львов; конференции молодых ученых Института медицинской генетики АМН СССР, апрель, 1987 г., г.Москва; 22 -ом симпозиуме генетиков с международным участием 28-30 августа, 1989 г., Г.Братислава, Чехословакия. По теме диссертации опубликовано 19 научных работ. Основные положения, выносимые на защиту.

1. Прием беременными микрофоллина в больших дозах увеличивает частоту клеток с хромосомными аберрациями в лимфоцитах эмбрионов человека.

2. Наличие клеток с ПРХ в лимфоцитах эмбрионов человека является онтогенетической нормой.

3. Прием беременными микрофоллина увеличивет количество клеток с ПРХ в лимфоцитах эмбрионов человека.

4. Частота клеток с ПРХ связана с полом эмбриона.

5. Прием беременными микрофоллина увеличивает частоту полиплоидных клеток у эмбрионов мужского пола.

6. Предложенный метод получения препаратов метафазных хромосом из лимфоцитов печени эмбрионов человека без их культивирования in vitro можно использовать для проведения генетического мониторинга популяции в связи с загрязнением внешней среды.

Структура и объем диссертации. ,

Диссертация изложена на 136 страницах. Включает введение, обзор литературы, материал и методы, результаты исследования и их обсуждение, выводы. В работе 7 рисунков, 19 таблиц; список литературы включает 245 работ, из них 14 отечественных и 231 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучение частоты регистрации приема беременными половых стероидных гормонов проводили путем ретроспективного анализа исходов 36511 родов. Методом интервью изучен анамнез у 300 женщин, родивших недоношенных детей с 2-й и 3-й степенью гипотрофии.

Цитогенетическое исследование проведено на 146 препаратах мета-фазных хромосом лимфоцитов эмбрионов человека, полученных при выполнении артифициальных абортов в сроке 6-12 недель беременности и у 10 здоровых женщин.

Эмбрионы получали от женщин, возрастом от 19 до 30 лет без экстра-генитальной патологии, с нормальной репродуктивной и менструальной функцией. У всех женщин и их супругов отсутствовали профессиональные вредности.

Женщины, от которых получали эмбрионы для исследования мутагенных эффектов, принимали микрофоллин по схеме: по 0,00005 г четыре раза в день на протяжении 5 дней с целью прерывания беременности.

Метод получения метафазных хромосом лимфоцитов эмбриона человека.

Лимфоциты эмбрионов человека получали из суспензии клеток ткани печени, после выполнения артифициального аборта.

Идентификацию полученного образца печени проводили путем мик-роскопирования под лупой МБС-1 при общем увеличении в 4 раза.

Последовательность манипуляций приготовления препаратов метафазных хромосом лимфоцитов эмбрионов человека без их культивирования in vitro изображена на рисунке N 1.

Окраску и анализ препаратов проводили общепринятыми методами.

Рисунок N1

ЗАБОР ЭМБРИОНА. ВЫДЕЛЕНИЕ ПЕЧЕНИ, ЕЕ ПРОМЫВАНИЕ. ПРИГОТОВЛЕНИЕ СУСПЕНЗИИ КЛЕТОК НА СРЕДЕ 199.

I

ВЫДЕЛЕНИЕ ЛИМФОИДНОГО КОЛЬЦА В ФИКОЛ - ВЕРОГРАФИНЕ. ОТМЫВ КЛЕТОЧНОЙ СУСПЕНЗИИ ОТ ФИКОЛА.

!

ИНКУБАЦИЯ СУСПЕНЗИИ ЛИМФОЦИТОВ В ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ С КОЛХИ ЦИНОМ 1 ЧАС. ИНКУБАЦИЯ В ГИПОТОНИЧЕСКОМ РАСТВОРЕ.

I

СТАНДАРТНАЯ ФИКСАЦИЯ В МЕТАНОЛ/УКСУСНАЯ КИСЛОТА ФИКСАТОРЕ. РАСКАПЫВАНИЕ КЛЕТОЧНОЙ СУСПЕНЗИИ НА ПРЕДМЕТНЫЕ СТЕКЛА

Для каждого эмбриона анализировали 200 метафазных пластин.

Для оценки и квалификации нарушений структуры хромосом использовали общепринятую классификацию (Бочков Н.П. 1989).

Пробелы в качестве хроматидных аберраций не учитывали.

Количество анеуплоидных метафаз не подсчитывали.

Под метафазными пластинками с ПРХ понимали такие, в которых больше 50 % хромосом были представлены раздельно лежащими хромати-дами.

Примеры метафазных пластин с преждевременным расхождением хроматид представлены на рис. N 2.

РИСУНОК 2

Стрелками указаны хромосомы с ПРХ

Статистическая обработка полученных результатов.

Статистическая обработка полученных результатов состояла в проверке гипотезы однородности статистического материала. Проверяли гипотезу

Но: Р100-?2 (х), 1де Их)-неизвестная функция распределения для контрольной группы, а Р2(х)-неизвестная функция распределения для опытной гру и пы. Эта гипотеза проверялась для выборок по частоте хромосомных аберраций, клеток с ПРХ и полиплоидией в контрольной и опытной группах, а также по признаку пола. В качестве критерия проверки гипотезы ИСПОДЬЗОЕЛ ли критерий однородности X (Урбах 1964). Согласно которому гипотеза об однородности с урознем достоверности р < 0,05 отбрасывается тогда, когда вычисленное по фактическим данным значение I удовлетворяет неравенству: 1 X 1-р, (Б-!), где Б в рассматриваемых случаях равно 2, т.к. возможны лишь 2 исхода: клетки с нормальным кариотипом, либо имеютя отклонения.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение частоты приема половых стероидных гормонов женщинами во время беременности.

При безвыборочном изучении 500 историй физиологических родов ни в одной не было данных о приеме гормональных препаратов во время беременности.

Дуальному изучению подвергали медицинскую документацию о рождении детей с ВПР. Суммарное количество всех ВПР, среди изученных 36511 исходов родов составило 699 случаев - 1,91 %. В 3,86 % случаев отмечен лишь факт приема гормонов без указания названия препарата, аозы, продолжительности и срока беременности.

Имеющиеся результаты свидетельствуют о недостаточном уровне регистрации данных.

При изучении историй родов мертворожденных и неонатально умерших детей обнаружили, что лишь в 10 % случаев имелись записи о приеме гормональных препаратов.

Частота приема различных стероидных гормонов непосредственн перед беременностью и во время беременности проанализирована путем проведения интервью у матерей, находившихся с детьми на 2 - ом этапе выхаживания новорожденных.

Лишь 53% могли точно указать название препарата, продолжительность приема, а также срок беременности, во время которого он применялся. Ни в одном случае получить информацию о дозе препарата не представилось возможным (таблица N 1).

Таблица •*"-» !

Частота приема половых стероидны к гормонов матерыми, дети которых страдали гипотрофией 2-Л . ¡-опер

Сведения о приеме КоЛИЧ'УЛЖ Прсцентнс.е

гормонов случзеи 1 4ырзл'{ ние

Общее количество 84 ; 00.00 ;

А. Указание на прием гормонов

1. Информация о препаратах чо '03.53

Препараты:

- прогестерон 22 26,19

- туринал 10 11,92

- 17-оксипрогетерон капронат 5 5,95

- микрофоллин 6 7,14

- фолликулин 2 2,38

¡2. Не смогли назвать препарат 39 46/12

Б. Срок беременности

- 1 триместр 62 73,82

- 2 триместр 18 21,42

- 3 триместр 4 4,76

В. Продолжительность приема

- до 7 дней 0 0 j

- до 14 дней 21 25,00 :

- до 30 дней 40 47,63 I

- больше 30 дней 12 14,28 :

Нет информации 11 13,09

Полученные нами результаты по использованию методов ретроспективного анализа медицинской документации исходов родов и проведения интервью у женщин совпадают с мнением многих авторов о значительных затруднениях в выявлении причинно-следственной взаимосвязи между приемом женских половых гормонов и мутагенными эффектами у новорожденных (Schenkel В. 1974), даже при исследовании больших выборок.

Сложность использования этих подходов обусловлена плохим уровнем учета анамнестических данных, недостаточной информированностью женщин, клиническим полиморфизмом фенотипических проявлений последствий воздействия повреждающих факторов и наличием таких патологических состояний со стороны матери и плода, которые требуют назначения гормональных препаратов. Вся эта совокупность ограничений заставляет разрабатывать другие методические подходы.

Одним из наиболее объективных и совершенных подходов по исследованию мутагенных эффектов у человека является анализ частоты и спектра хромосомных аберраций в культивируемых in vitro клетках (Бочков Н.П., Чеботарев Н. 1989).

Однако, даже и этот метод имеет ограничения: необходимость культивирования клеток in vitro; возможность исследования лишь части клеток, подлежащей стимуляции пролиферации митогенами; необходимость экстраполяции данных на систему in vivo; трудоемкость (Speit G. 1980).

Поэтому, в настоящее время разрабатываются новые и совершенствуются имеющиеся методы определения мутагенных эффектов в тканях человека (Александров С. 1982).

Методические аспекты изучения метафазных хромосом лимфоцитов эмбрионов человека без культивирования in vitro.

В этой части исследования мы пытались определить оптимальные условия получения препаратов метафазных хромосом.

Данные представлены в табл. N 2 свидетельствуют о значительном снижении количества митотических клеток в препаратах метафазных хромосом лимфоцитов эмбрионов человека по мере увеличения времени содержания печени в среде 199 до момента ее обработки.

Таблица N 2.

Количество митозов в зависимости от продолжительности сохранения печени.

I NÍ исследования К-во исследованных ядер Количество митозов при разном ¡ времени до обработки печени I

0ч 2ч 4ч 6ч |

1 1000 354 323 82 30 j

2 1000 240 242 54 . 12 |

3 1000 227 180 17 0 I

Мы пришли к заключению, что печень желательно подвергать обработке в течении 1-2-х часов после забора материала.

Культивировать выделенные лимфоциты нам не удалось.

При предложенном нами способе получения препаратов метафазных хромосом лимфоцитов эмбрионов в значительной мере нивелируются ограничения цитогенетического подхода.

Поскольку фиксация клеток производилась через час после забора материала, то были все основания предполагать, что мы изучали те повреждения хромосом, которые произошли в организме эмбриона.

Исходя из этого влияние среды, порядок клеточного деления и другие факторы, сопровождяющие культивирование клеток in vitro, не могли повлиять на характеристику аберраций хромосом (Sinha К. 1984). Таким образом, предложенный метод максимально соответствует условиям объективного учета хромосомных аберраций.

Вторым положительным моментом при использовании предложенного способа являлось изучение хромосомных аберраций непосредственно в тканях эмбрионов человека.

Эмбрион обладает специфической чувствительностью к повреждающим факторам, которая совершенно не сравнима с таковой у взрослых (Александров С.1982, Gregg N.1941, Lenz W. 1961).

Использование лимфоцитов эмбрионов в качестве объекта исследования позволит также проводить сравнительное изучение частоты и спектра хромосомных аберраций у беременных и плодов от них полученных, то есть в системе мать-плод.

Предложенный метод прост в исполнении, нетрудоемкий и экономически выгодный.

Он имеет один недостаток невозможность культивирования лимфоцитов печени эмбрионов человека in vitro. Однако, это не снижает положительных и качественно новых возможностей предложенного метода для определения мутагенных эффектов в соматических тканях эмбриона человека.

Феномен преждевременного расхождения хроматид.

При анализе препаратов метафазных хромосом лимфоцитов эмбрионов человека без их культивирования in vitro обратили внимание на большую частоту метафаз, в которых хроматиды хромосом были в разошедшемся состоянии (см.рис. N 2).

Эти клетки могут восприниматься как эндоредупликанты. Однако, наличие большого количества метафаз, в которых ПРХ наблюдали лишь в части хромосом, а остальная часть была представлена "обычными" мета-фазными хромосомами, соединенными в области центромер, убеждало в том, что это не эндоредупликанты (см. рис. N 2).

Клетки с ПРХ нельзя также расценивать как анафазные по двум причинам. Во-первых: они по морфологии и степени конденсации соответствуют метафазным хромосомам. Во-вторых, наличие в одной метафазной

пластинке обычных хромосом и хро мосом с разошедшимися хроматидами при анафазном состоянии клетки является невозможным, что дополнительно убеждало нас в том, что наблюдаемое явление не является анафазой (см. рис. N 2). Количество таких метафаз в лимфоцитах эмбрионов было значительным.

В препаратах лимфоцитов крови, стимулированных к делению ФГА, явление ПРХ наблюдали крайне редко. При анализе 1000 клеток от 10 индивидов, оно было отмечено лишь в 7-и метафазных пластинках, что составило 0,7%. В лимфоцитах эмбрионов такие клетки наблюдали как минимум в 10 раз чаще, хотя методы фиксации клеточной суспензии ничем не отличались. Это позволило исключить возможность влияния методических факторов приготовления препаратов метафазных хромосом на возникновение ПРХ, что согласуется с результатами других исследователей (Маёап К. 1987).

Изучали возможную взаимосвязь ПРХ с наличием колхицина в питательной среде.

Приведённые в таблице N 3 данные свидетельствуют о том, что явление ПРХ во всех 3-х случаях наблюдали и без добавления колхицина в питательную среду.

Таблица N 3.

Количество метафаз с ПРХ в зависимости от наличия колхицина в питательной среде

Количество Количество

№ препарата Инкубация в среде исследуемых клеток

клеток с ПРХ

без колхицина 100 24

322 с колхицином 1 ч 100 21

без колхицина 100 1

326 с колхицином 1ч 100 2

без колхицина 100 12

329 с колхицином 1ч 100 13

с колхицином 3 ч 100 13

Особенно интересным был в этом отношении эмбрион N 326. Он выбран для исследования чисто случайно и факт низкого количества клеток с ПРХ можно считать удачным совпадением. Исследование этого эмбриона показало что ПРХ не является следствием воздействия колхицина на лимфоциты эмбрионов.

Следовательно, результаты проведенного исследования позволяют предположить, что наличие колхицина в питательной среде (в течении 3 часов) не изменяет частоты клеток с ПРХ.

Суммируя результаты этой части исследования можно констатировать, что явление ПРХ в лимфоцитах эмбрионов встречается значительно чаще, чем в культивируемых лимфоцитах взрослых. Эти клетки не являются ни эндоредупликантами, ни полиплоидами, ни анафазами. Особенно важно, что на частоту таких клеток не влияет наличие колхицина в питательной среде. Их возникновение не является следствием технических факторов приготовления препаратов метафазных хромосом.

Частота и спектр хромосомных аберраций в лимфоцитах эмбрионов человека в норме и при воздействии на организм беременной микрофоллина.

Для анализа 30 случаев контрольной группы препараты метафазных хромосом приготавливали из 34 эмбрионов. В трех случаях митозов на препаратах не обнаружили, а в одном в 100 проанализированных метафазах наблюдали ПРХ во всех хромосомах, что практически не позволило провести анализа частоты и спектра хромосомных аберраций.

Для того, чтобы проанализировать препараты метафазных хромосом эмбрионов от женщин, принимавших микрофоллин в больших дозах, пришлось получить препараты от 41 эмбриона. Причем, в 2-х случаях анализ был затруднен из-за большого количества метафаз с ПРХ, а в остальных 9-и случаях митозов либо вообще не было (7 эмбрионов), либо встречались лишь единичные (2 эмбриона).

Это наблюдение представляет интерес с точки зрения возможной высокой индивидуальной чувствительности эмбрионов человека к экзогенным гормонам, вплоть до полного угнетения пролиферации лимфоцитов печени (Sawada М. 1978).

Данные по исследованию частоты и спектра хромосомных аберраций в лимфоцитах эмбрионов человека в норме и при воздействии микрофоллина представлены в табл. N 4.

Установлено достоверное увеличение частоты клеток с хромосомными аберрациями в лимфоцитах эмбрионов, подвергшихся воздействию микрофоллина. В соответствии с этим обнаружено достоверное увеличение количества аберрантных хромосом в группе эмбрионов, подвергшихся воздействию микрофоллина.

Это наблюдение совпадает с данными других исследователей (Hafez М. 1985), хотя в литературе имеются сообщения об отсутствии мутагенных

эффектов в соматических клетках при воздействии аналогичных гормональных веществ (\VilpartM. 1987).

Таблица N 4.

Частота и спектр хромосомных аберраций в лимфоцитах эмбрионов человека.

1 Характеристика аберраций Контроль При воздействии микрофоллина

Количество клеток с аберрациями 119 (3,96+0,35)" 278 (8,96+0,52)"

Количество хромосом с аберрациями 132(0,044%)" 305(0,101%)"

Одиночние фрагменты 101 (76,5%) 240(78,7%)

Парние фрагменты 27(20,5%) 62 (20,3%)

Хромосомиие обмены 3 2

Хроматидние обмены 1 1

Количество исследованных клеток 3000 3000

Примечание: " -обнаружены достоверные статистические от личия. ( р < 0,05).

Однако, для нашего исследования были выбраны эмбрионы, которые подвергались воздействию больших, по сравнению с терапевтическими, доз микрофоллина. Возможно именно это явилось причиной столь выраженного увеличения частоты клеток с хромосомными аберрациями.

Полученные нами результаты свидетельствуют об увеличении частоты клеток с хромосомными аберрациями в лимфоцитах эмбрионов человека в норме в сравнении с культивируемыми in vitro лимфоцитами крови . Это может быть связано с более активным пролиферативным состоянием лимфоцитов эмбрионов.

Результаты по исследованию частоты хромосомных аберраций в лимфоцитах эмбрионов человека подтверждают также возмож- ность и целесообразность использования этого подхода для определения мутагенных эффектов в тканях эмбрионов при воздействии на организм матери потенциально мутагенных веществ.

При исследовании количества клеток с хромосомными аберрациями у эмбрионов женского и мужского пола, подвергшихся внутриутробно влиянию больших доз микрофоллина мы не обнаружили достоверных различий.

Это может свидетельствовать о том, что чувствительность хромосом соматических клеток эмбрионов человека одинакова у особей разных полов.

Количество аберрантных хромосом в клетках с аберрациями оказалось одинаковым в обоих исследованных группах и составило 1,109 в эксперименте и 1,097 в контрольной группе.

Спектр хромосомных аберраций оказался одинаковым как в эксперименте, так и в контрольной группе. Основной тип хромосомных аберраций в обоих изученных группах составили одиночные фрагменты (76,5% в контрольной и 78,7% в опытной группе). Парные фрагменты составили 20,5% всех хромосомных аберраций в норме и 20,3% при воздействии микрофоллина. В общей сложности, эти два типа хромосомных аберраций составили 97% в норме и 99% при влиянии микрофоллина.

Лишь в четырех метафазах контрольной группы наблюдали хромосомные обмены (два дицентрика и одно центрическое кольцо) и в одном случае хроматидные обмены (квадрирадиал), что составило 3% клеток. При воздействии микрофоллина частота хромосомных обменов (два дицентрика) и хроматидных обменов (один квадрирадиал) составила 1 %. Следовательно, воздействие микрофоллина на внутриутробно развивающийся эмбрион человека не вызывает увеличения частоты клеток с хромосомными и хрома-тидными обменами.

Суммируя результаты этой части исследования можно заключить, что при воздействии микрофоллина увеличивается частота клеток с хромосомными аберрациями. В то же время не обнаружено различий по спектру аберраций в норме и при воздействии микрофоллина.

Частота полиплоидов и клеток с ПРХ в лимфоцитах эмбрионов в норме и при воздействии микрофоллина.

Помимо хромосомных аберраций важным и информативным признаком состояния метафазных хромосом в норме и при различных патологических процессах является частота клеток с преждевременным расхождением хроматид (Nakagome Y. 1984, Fitzgerald P. 1986, Gabarron J. 1986, MadanK. 1987).

Как в норме, так и при воздействии на эмбрион микрофоллина отметили выраженные различия между ембрионамн по частоте метафаз с ПРХ. Этот показатель колебался от 0 до 36% в норме и от 2 до 76% при приеме женщинами больших доз микрофоллина.

Частота клеток с ПРХ достоверно ниже в культивируемых лимфоцитах взрослых индивидов (0,7%) в сравнении с лимфоцитами нормальных

эмбрионов и подвергшихся внутриутробному воздействию микрофоллина (см.табл. N 5).

Табл. N 5.

Частота клеток с ПРХ в лимфоцитах эмбрионов в норме и при воздействии микрофоллина.

Исследуемая Пол К-во К-во Количество ПРХ

группа эмбриона случаев клеток абсол. процент

Контроль XX 14 1400 197 14,07+0,92

Гормон XX 12 1200 249 20,75±1,17

р < 0,05

Контроль XY 16 1600 125 7,81+0,67

Гормон XY 18 1800 274 14,94±0,84

р < 0,05 j

Контроль XX+XY 30 3000 322 10,73±0,56

Гормон XX+XY 30 3000 523 17,26±0,69

р < 0,051

Обнаружено достоверное увеличение частоты клеток с ПРХ в лимфоцитах эмбрионов, подвергавшихся внутриутробному воздействию больших доз микрофоллина.

В лимфоцитах эмбрионов мужского пола в норме количество клеток с ПРХ достоверно ниже, чем у эмбрионов женского пола (7,8% и 14,07% соответственно).

При воздействии микрофоллина наблюдали достоверное увеличение частоты клеток с ПРХ у эмбрионов обеих полов (см. табл. N 5).

Особый интерес представляло исследование пары близнецов, полученных при артифициальном аборте. При цитогенетическом исследовании один из них оказался с кариотипом 46.ХХ, а другой - 46,ХУ. У эмбриона мужского пола количество клеток с ПРХ составило 4 %, а у эмбриона женского пола -19%. Обнаруженые половые различия по частоте клеток с ПРХ, в этом случае не связаны с условими внутриутробного развития и методическими факторами приготовления препаратов метафазных хромосом.

Полученные нами результаты свидетельствуют о наличии достоверных различий по частоте клеток с ПРХ у эмбрионов разного пола. Мы не встретили в литературе работ, посвященных половым различиям этого признака, хотя о возможности такой взаимосвязи свидетельствует целый ряд исследований (Fitzgerald Р. 1983, Baynocky К. 1986).

Выявленная нами взаимосвязь количества клеток с ПРХ и полом эмбриона, а также гормональным статусом организма представляется интересной с точки зрения гипотезы (1983) о возможной роли ПРХ в возникновении анеуплоидий. До сих пор остается непонятным почему анеуплоидные гаметы значительно чаще наблюдаются у женщин старше 35 лет; почему именно вклад первого деления женского мейоза наиболее весомый в возникновении анеуплоидных кариотипов (Навтап I. 1983).

Данные литературы и полученные нами результаты позволяют предположить, что гормональный дисбаланс может приводить к значительному увеличению частоты ПРХ и соответственно анеуплоидии.

Изучали частоту полиплоидов в лимфоцитах эмбрионов в норме и при водействии микрофоллина.

Данные, приведенные в таблице N 6 свидетельствуют о наличии достоверных различий по частоте полиплоидов в лимфоцитах эмбрионов контрольной группы и при воздействии микрофоллина.

Табл. N 6.

Частота полиплоидов в лимфоцитах эмбрионов в норме и при воздействии микрофоллина.

Исследуемая Пол Кол-во Кол-во Количество полиплоидов

группа эмбриона случаев клеток абсол. процент

Контроль XX 14 1400 15 1,07±0,27 I

Гормон XX 12 1200 14 1,16+0,30

I р > 0,05

Контроль XY 16 1600 6 0,37+0,15

Гормон XY 18 1800 23 1,55+0,29

I р < 0,05

Контроль XX+XY 30 3000 21 0,70+0,15 I

Гормон XX+XY 30 3000 37 1,40±0,21

р < 0,05

Эти наблюдения подтверждают данные, полученные ранее (Parry Е. 1983) о существенном возрастании частоты полиплоидов при экзогенном влиянии женских половых гормонов.

Следует подчеркнуть, что в лимфоцитах взрослых индивидов, культивируемых in vitro при их стимуляции к пролиферации ФГА обнаруживали 0,34 % полиплоидных клеток. У эмбрионов в норме этот показатель составлял 0,7%. Однако, в группе эмбрионов женского пола частота полиплоидных клеток составляла 1,07%, а у эмбрионов с кариотипом ХУ - 0,38%.

Следовательно, частота клеток с полиплоидией у эмбрионов женского пола достоверно выше, чем у эмбрионов мужского пола и постнатальных лимфоцитах.

При воздействии микрофоллина обнаружили достоверное увеличение частоты полиплоидных клеток при суммарном учете обоих полов. Однако, у эмбрионов женского пола частота полиплоидов достоверно не увеличивалась. У эмбрионов мужского пола произошло 3-х кратное увеличение частоты полиплоидов.

Суммируя данные по изучению частоты полиплоидных клеток в лимфоцитах эмбрионов человека без их культивирования in vitro можно заключить, что их количество достоверно больше у эмбрионов женского пола, чем в культивируемых лимфоцитах взрослых женщин. У эмбрионов женского пола этот показатель больше, чем у эмбрионов мужского пола. При воздействии больших доз микрофоллина частота полиплоидных клеток достоверно увеличивается у эмбрионов мужского пола и практически не изменяется у эмбрионов женского пола.

ВЫВОДЫ

1. Предложен способ приготовления препаратов метафазных хромосом лимфоцитов эмбрионов человека без культивирования in vitro, путём их фиксации после выделения из эмбриональной печени, получаемой при выполнении артифициального аборта в сроке 6 — 12 недель беременности.

2. Частота клеток с хромосомными аберрациями в лимфоцитах эмбрионов человека 6 — 12 недели беременности без их культивирования in vitro составляет в среднем 3,96 % ± 0,35 при нормальном течении беременности в популяции г. Львова. Не обнаружено половых различий по частоте клеток с хромосомными аберрациями в лимфоцитах эмбрионов человека.

3. Частота клеток с хромосомными аберрациями в лимфоцитах эмбрионов человека,подвергшихся внутриутробно воздействию больших доз микрофоллина достоверно выше, чем в норме и составляет в среднем 8,96 % ± 0,52 и 3,96 % ± 0,35 соответственно.

4. В лимфоцитах эмбрионов человека 6-12 недели беременности имеется достоверно большее количество метафазных пластин с преждевременным расхождением хроматид по сравнению с культивируемыми in vitro лимфоцитами постнатального периода развития (10,73 % ± 0,56 и 0,7 % соответственно).

5. Частота метафазных пластин с преждевременным расхождением хрома-тид зависит от пола эмбриона. У эмбрионов с кариотипом XX количество клеток с преждевременным расхождением хроматид достоверно выше, чем у эмбрибнов с кариотипом ХУ (14,07 % ± 0,92 7,81 % ± 0,67 и соответственно).

6. В лимфоцитах эмбрионов, подвергшихся внутриутробно воздействию больших доз микрофоллина частота метафазных пластин с ПРХ достоверно выше по сравнении с нормой (17,26 % ± 0,69 и 10,73 % ± 0,56 и соответственно).

7.Применение методов ретроспективного анализа исходов родов по медицинской документации и интервьюировании беременных не позволяет делать обоснованных заключений по определению возможных мутагенных и тератогенных последствий применения женских половых гормонов из-за плохого уровня регистрации в медицинской документации и информированности женщин.

Список опубликованных по теме работ.

1. Деяк1 аспекта д1агностики затримки розвитку плода за допомогою уль-тразвуково'1 фетометрп//Псд1атр1я, акушерство i гшеколопя.-1986.-N3.-c.61. (в соавторстве с Л.Б.Маркин, О.З.Гнатейко, А.А.Корытко).

2. Роль генетических факторов в этиологии врожденных пороков развития (ВПР) у новорожденных и неонатально умерших детей. //Тезисы. Y съезд УОГИС.-1986.-Т.4.-С.118 (в соавторстве О.Созанский).

3. Опыт использования ультразвукового сканирования в комплексе методик медико-генетического обследования беременных женщин//Тезисы. Y съезд УОГИС.-1986.-Т.4.-С.26 (в соавторстве А.Корытко, О.Гнатейко).

4. Улучшение системы диспансеризации семей с отягощенным генетическим анамнезом//Рекомендации для внедрения в практику результатов научных исследований.-г.Львов.-1987.-С.28-30 (в соавторстве В.Шувар-ская, О.Гнатейко, О.Созанский).

5. Cytogenetics of human abnormalies//Тезисы.-Bunska Bystrica, 6-йконгрес медицинской генетики.-1986.-C. 135 (в соавторстве О.Созанский, О.Гнатейко) .

6. Изучение хромосом "кроветворных клеток эмбриона человека// Тезисы. Y съезд ВОГИС им.Вавилова.-1987.-С.110 (в соавторстве О.Созанский, Э.Савранский, М.Челак)

7. Преждевременное расхождение хроматид у эмбрионов человека мужского и женского пола//Тезисы. 1-й Съезд Медгенетиков УССР. 1988.-С.177.

8. Хромосомные аберрации в лимфоидных клетках эмбрионов человека подход для изучения мутагенных процессов//Тезисы. 1-й Сьезд Медгенетиков УССР.-1988.-С.178 (в соавторстве Ю.Гаврилюк).

9. Соотношение полов в эмбриональный период онтогенеза человека// Тезисы.1-йСьездМедгенетиковУССР.-1988.-СД44 (в соавторстве Т.Коновалова, Э.Савранский, О.Созанский, Г.Акопян).

10. Premature centromere division in maternal fetal cells // Тезисы, 22 Symposion on cytogenetics with international participation, Bratislava, Czechos lovakia. -28 -30.08,1989.-С.43(в соавторстве Созанский О..Лозинская М.).

11.Медико-генетический подход к оценке повреждающего воздействш факторов окружающей среды на ранних этапах беременности// Тезисы Пленум правления научного общества акушеров-гинекологов Украинской ССР.-Тернополь,25-26 мая 1989.- С.118 (в соавторстве О.Созанский,О.Гнатейко, Л.Давыдов, М.Лозинская, А.Евтушенско).

12. Генетический мониторинг,как средство оценки внутриутробного развития плода// Тезисы. Пленум правления научного общества акушер-гинекологов Украинской ССР.-Тернополь,25-26 мая 1989.-С.117 (i соавторстве А.Созанский, Ю.Гаврилюк, Б.Ковалишин, И.Седнева).

13. Структурная стабильность ядрышкообразующих районов хромосом человека// Конференция "Хромосомы человека в норме и патологии".-Москва,ноябрью-1989.-С.26-33 (в соавторстве О.Созанский Т.Коновалова, Н.Гулеюк, М.Лозинская).

14. Расхождение хроматид в лимфоидных клетках эмбрионов человек« //Республиканский межведомственный сборник "Медицинская генети-ка".-Киев.-1990.-]Ч1.-С.97-100 (в соавторстве О.Созанский).

15. Исследование динамики мутационного процесса и тератогенных эффектов в популяции г.Черновцы //Тезисы.- 2-й Всесоюзный сьезд медицинских генетиков .-Алма-Ата.-4-6 декабря 1990.-С.88 (в соавторств( Ю.Гаврилюк, П.Глинка, И.Седнева, Н.Невзгода, О.Иськив).

16. Анеуплоидия,невынашивание беременности и патология гениталий / J Тезисы 2-й Всесоюзный сьезд медицинских генетиков. -Алма-Ата.-4-( декабря 1990.-С.505 (в соавторстве О.Созанский, И.Гуменецкий, Б.Ко-вылишин).

17.Авторское свидетельство N1464062 «Способ определения зон оссифика-ции у абортированного эмбриона человека» от 8.09.1988 г. (в соавторсш О.Созанский, Е.Дзись, И.Седнева).

18. Хромосомный анализ абортного материала для оценки возможного мутагенного влияния факторов окружающей среды// Методические рекомендации.! 9 90,- Львов.- С.3-11.- (в соавторстве Созанский O.A. Лозинская М.Р., Гаврилкж Ю.И., Седнева И.А.).

19.Генетический мониторинг населения в связи с загрязнением внешнее среды//Методические рекомендации.-1991.-Львов.-С.2г10 (в соавторстве Гаврилюк Ю., ГнатейкоО., Сатурская А., Созанскир О., Седнева И. Акопян Г.).