Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Цитогенетическая оценка воздействия факторов окружающей среды (экологических мутагенов) на половые и соматические клетки человека)

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Цитогенетическая оценка воздействия факторов окружающей среды (экологических мутагенов) на половые и соматические клетки человека)"

2 5 Ш' №

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

СЛОЗИНА Наталия Михайловна

ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ВОЗДЕЙСТВИЯ ФАКТОРОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ (ЭКОЛОГИЧЕСКИХ МУТАГЕНОВ) НА ПОЛОВЫЕ И СОМАТИЧЕСКИЕ КЛЕТКИ ЧЕЛОВЕКА

03.00.15 "Генетика"

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург- 1995

Работа выполнена во Всероссийском Центре Экологической медицины

(Санкт-Петербург).

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор П.Я.Шварцман доктор медицинских наук, профессор С.К.Клюева доктор биологических наук, профессор В.Е.Комар.

Ведущая организация - Всероссийски» научно- исследовательский

институт генетики п разведения сельскохозяйственных животных.

Зашита диссертации состоится " " — 1995 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 063.57.21 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, г. Санкт-Петербург, Университетская наб. д. 7/9, СПбГУ, бнолого-поч-венный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан " ^" 1995 г.

Учены« секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

Л.А.Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Значительное ухудшение экологической обстановки за последние десятилетия вызывает серьезные опасения относительно генетических последствии действия мутагенов окружающей среды на человека. Модельные эксперименты в системе in vitro показали, что широкий спектр внешнесредовых факторов приводит к мутационным изменениям в клетках человека (Бочков, Чеботарев, 1989). Имеются также сведения об увеличении частоты спонтанных абортов, пороков развития, мертво рождений л некоторых других показателей в результате контакта с вредными факторами в быту или на производстве, что принято трактовать как косвенное подтверждение генотоксичности (Гигиенические критерии состояния окружающей среды, вып. 46, 1989).

Однако, к настоящему времени не получено убедительных доказательств роста частоты каких - либо наследственных заболеваний в результате ухудшения экологической обстановки. Наоборот, имеются сведения о том, что действие мутагенов, в том числе и таких сильных, как радиация, не приводит к генетической патологии у детей (Петрушкина, Мусаткова, 1993; Czeizel et al., 1991: Forni, Bertazzi, 1987; Rudiger, 1991; Shelby, 1994; Vogel, 1992). Отсутствие мутагенных эффектов в потомстве человека противоречит как представлениям об уровне мутабильности человеческих клеток, так и экспериментальным исследованиям на животных, гае убедительно продемонстрированы наследственные изменения в результате действия экзогенных мутагенов (Воробцова, 1988).

Можно предположить, что необнаружение генетических эффектов экологических мутагенов у человека не отражает реальную ситуацию, но вызвано недостатком адекватных методов оценки.

Чтобы получить представление о ходе мутационного процесса у человека, важно иметь информацию о состоянии генома половых клеток. Развитие медицинских технологий сделало принципиально возможным исследование оонитов, сперматозоидов и преимплантационных эмбрионов человека (Pellestor, 1991). Эти технологии создавались для целей медицинской практики - борьбы с бесплодием. В последние годы в связи в активизацией работ по оплодотворению in vitro, - расширением сети центров экстракорпорального оплодотворения, увеличением потока больных и совершенствованием медицинской техники - открылись возможности проведения исследовательских программ в области генетики в периоде раннего эмбриогенеза человека. Так, проводится преимплантационное определение пола плода, разрабатываются и внедряются методы преимплантапионной диагностики

наследственных болезней (Dyban et al., 1993; Griffin et al., 1993). Несомненный интерес представляло бы использование гамет и эмбрионов человека для оценки действия внешнесредовых факторов на геном, однако практические возможности реализации такого подхода еще не исследованы.

Оценка мутагенной опасности для половых клеток различных веществ и соединений, с которыми контактирует современный человек, требует применения модельных экспериментов. В условиях эксперимента можно установить степень генотоксичности изучаемых воздействий и подойти к пониманию механизмов, лежащих в их основе. Если в отношении мужских половых клеток человека существует принципиальная возможность экспериментирования с изолированными сперматозоидами, то женские половые клетки представляют собой уникальный материал, не допускающий проведения экспериментальных исследований. Здесь существенную помощь в оценке действия мутагенов окружающей среды на женские половые клетки могут оказать опыты на ооцитах лабораторных животных. Для этого необходимо создание экспериментальных систем, позволяющих наиболее точно моделировать изменения, происходящие в женских половых клетках под действием внешнесредовых мутагенов. Особый интерес представило бы изучение мутагенного действия таких веществ и воздействий, с которыми человек контактирует в повседневной жизни.

Мутагенные факторы окружающей среды повреждают геном как половых, так и соматических клеток. Если эффект повреждения половых клеток может проявиться в последующих поколениях, то мутации в соматических клетках затрагивают генетический материал тканей организма человека. Анализ генных мутаций в соматических клетках человека (пликофориновый тест, мутации гена HPRT) представляет собой перспективное направление в изучении мутагенеза, однако в настоящее время эти методики находятся в стадии разработки и возможности их практического применения весьма ограничены. Основной объем информации о мутагенном действии факторов среды в популяциях человека получают с помощью цитогенетических тестов, среди которых ведущее положение занимает учет частоты хромосомных аберраций. Предлагаются также иные методические подходы (такие, как анапиз микроядер, индукция преждевременной конденсации хромосом), в числе которых перспективным в эксперименте показал себя метод сестринских хроматидных обменов. Однако, прежде, чем использовать СХО для выявления действия средовых мутагенных факторов, необходимо оценить его информативность в популяционных исследованиях.

Применение адекватных цитогенетических методов дает возможность выявлять действие мутагенных факторов на производстве, в быту и при возникновении чрезвычайных ситуаций. Важность такого рода исследований обусловлена не только их социальной значимостью (компенсаторные выплаты за вредные условия и т.д.), но и потенциальной опасностью мутагенных воздействий для здоровья человека. Вопрос о судьбе генетических повреждений, индуцированных экзогенными мутагенами, об их роли в развитии заболеваний у человека далек от своего разрешения. Необходимы дальнейшие исследования, включающие мониторное наблюдение за пострадавшими в течение длительного периода после воздействия. Анализ цитогенетических изменений в отдаленном периоде после действия мутагенных факторов позволит подойти к решению еще одной важной проблемы - проблемы ретроспективной биодозиметрии и биоиндикапии мутагенных воздействий на организм человека.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлся поиск наиболее адекватных цитогенетических методов оценки действия экологических мутагенов на половые и соматические клетки человека, сопоставление разрешающей способности и практической значимости различных способов хромосомного анализа при решении конкретных проблем экологической генетики.

Дня достижения цели исследования перед работой поставлены следующие задачи:

1. Оценить возможность использования ооцитов и сперматозоидов человека для изучения мутационного процесса в человеческой популяции.

2. Разработать модельные системы на лабораторных животных для изучения действия средовых факторов на женские гаметы и с их помощью определить степень мутагенной опасности ряда внешнесредовых факторов (алкоголь, гербицид, стресс).

3. Изучить применимость теста СХО для выявления мутагенных факторов в популяции человека.

4. Проанализировать с помощью цитогенетических тестов степень мутагенной опасности ряда химических производств.

5. Изучить отдаленные эффекты действия радиационного фактора на геном соматических клеток человека (на примере ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС.), определить характер элиминации хромосомных повреждений во времени и оценить возможности цитогенетических методов ретроспективной биодозиметрии и биоиндикации радиационных воздействий.

Научная новизна исследования.

1. Впервые в рамках одной работы проведено изучение действия мутагенов окружающей среды как на половые, так и на соматические клетки; продемонстрированы ограничения в использовании ооцитов и ранних эмбрионов, полученных при выполнении программы экстракорпорапьного оплодотворения у человека, а также "хомячкового теста" (визуализации хромосом спер-миев) для популяционных исследований.

2. Впервые всесторонне апробированы в качестве модельной тест-системы для оценки мутагенных воздействий средовых факторов ооциты лабораторных грызунов. Продемонстрирована особая чувствительность преовуляторной стадии диакинез - метафаза I и эффективность экспериментальных воздействий в этом периоде для детекции генетических последствий таких экологических мутагенов, как гербицид 2,4-Д, алкоголь и стресс.

3. Сформулирована концепция, получившая название периконцептолот-ческой (от слова conception - оплодотворение, зачатие), согласно которой кратковременное воздействие на самых ранних этапах эмбриогенеза способно индуцировать хромосомные аномалии у человека.

4. Впервые обращено внимание на необходимость унификации измерений частоты сестринских хроматидных обменов (СХО) при популяционных исследованиях с учетом показанных в работе высокой степени вариабельности частоты СХО у одних и тех же индивидуумов и достоверной изменчивости этого показателя в зависимости от времени суток. Предложено использовать более адекватную статистическую обработку для установления мутагенных эффектов в условиях вредных производств.

5. Накоплен уникальный материал о хромосомной нестабильности у ликвидаторов аварии на ЧАЭС, свидетельствующий о смещении спектра хромосомных аберраций в сторону аберраций хромосомного типа, а также наличии у части ликвидаторов цитогенетических маркеров радиационного воздействия даже по прошествии длительного временного интервала (6 и более лет) после аварии.

дования состоит в обосновании концепции периовуляторной охраны плода, предусматривающей максимальную защиту заключительных этапов оогенеза и раннего преимплантационного развития эмбриона от действия неблагоприятных средовых факторов. Мероприятия, направленные на осуществление периовуляторной охраны плода, позволят снизить частоту ранней эм-брионапьной смертности, рождения детей с хромосомными аномалиями и генетически детерминированными пороками развития.

Практическая значимость после-

Предложен новый методический подход к ретроспективной оценке действия радиационного фактора. Бмоиндикация радиационного воздействия, производимая с помощью предлагаемой схемы цитогенетического обследования, способствует снятию социального напряжения у пострадавших, выбору адекватной тактики лечения больных, а также разрешению экспертных вопросов.

Апробация работы. Основные результаты работы и обобщения были доложены и обсуждены на съездах Всесоюзного общества генетиков и селекционеров им. Н.И.Вавилова (Кишинев, 1982; Москва, 1987), на Всесоюзных и Российском съездах медицинских генетиков (Киев, 1983; Алма-Ата, 1990; Москва, 1994), XIV Ежегодной конференции Европейского общества по мутагенам внешней среды (Москва, 1984), Советско- Польском симпозиуме по проблемам раннего развития человека (Варшава, 1988), научных сессиях ИАГ (Ленинград, 1988,1990,1992), заседаниях Всесоюзного общества научного общества генетиков и селекционеров им. Н.И.Вавилова (Ленинград, 1980,1984,1988,1989), заседаниях Общества медицинских генетиков (Ленинград, 1990,1991,1992), III Всесоюзной конференции по генетике и цитологи и мейоза (Новосибирск, 1990), VI конференции Европейской ассоциации акушеров и гинекологов (Москва, 1991), VI Всесоюзной конференции "Эндокринная система организма и вредные факторы окружающей среды" (Ленинград, 1991), научно-практической конференции "Стратегия экологической безопасности России (Санкт-Петербург, 1992), симпозиуме "Механизмы действия сверхмалых доз "(Москва, 1992,1994), научной конференции "Актуальные вопросы ретроспективной, текущей и прогнозной дозиметрии облучения в результате Чернобыльской аварии" (Киев, 1992), VI Ежегодной конференции немецкого общества генетиков человека (Дюссельдорф, 1994), II Международной конференции "Радиобиологические последствия ядерных аварий" (Москва, 1994), рабочем совещании по проблемам биодозиметрии (Париж, 1994).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 54 печатные работы, с то;.; числе дез авторских свидетельства на изобретения.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 264 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы. Имеется приложение. В диссертации 30 таблиц и 20 рисунков. Список литературы содержит 506 названий.

МАТЕРИАЛ И ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материал и методы, используемые при изучении онтогенетических процессов, происходящих в половых клетках.

Половые клетки человека. Гаметы, зиготы и эмбрионы человека были получены в ходе проведения программ оплодотворения in vitro в Институте акушерства и гинекологии АМН и в Центре детского здоровья, Варшава (Польша).

Половые клетки лабораторных животных.

Крысы. Исследования проводили на половозрелых самках крыс линии Вистар из питомника Рапполово массой 180-200 г.

Мыши. Исследования проводили на самках мышей линии СВА и мышах - гибридах CBA/C57BL массой 18-20 г, а также на самках, гетерозиготных по робертсоновской транслокации JCR/Rb(3;5)Icg. Гомозиготные животные были любезно предоставлены проф. B.C. Барановым. Экспериментальные воздействия. Эффект однократного кратковременного действия экологических мутагенов на женские половые клетки изучали на специально разработанной нами модели, зарегистрированной в качестве изобретения (№1498464). Основные отличительные признаки модели заключались в том, что эксперименты проводили в условиях естественного ова-риапьного цикла животных (крыс) без применения гормональной индукции овуляции. Воздействие производили на строго фиксированном этапе мей-отических преобразований (стадия диакинез - метафаза 1), время наступления которого определяли путем предварительных исследований. Внутриже-лудочное введение изучаемого вещества производили металлическим зондом без применения анестезии.

Проводили следующие экспериментальные воздействия: 1. Острая и хроническая интоксикация животных алкоголем. При острой затравке алкоголь вводили крысам в дозе 1.8-2.0 мл 40%-ного раствора этанола из расчета 3.6 г на 1 кг массы 100%-ного раствора. Хроническую алкогольную интоксикацию самок крыс осуществляли согласно принятой схеме (Бураков и др., 1980) 20%-ным раствором этанола в течение 2 -2.5 месяцев непосредственно перед беременностью в виде свободного доступа ad libidum и при отсутствии других источников жидкости.

Действие алкоголя на сегрегацию хромосом в мейозе изучали на неполовозрелых самках мышей, гетерозиготных по робертсоновской транслокации. Опытным животным внутрижелудочно вводили 0.6 мл 20% раствора этилового спирта на разных этапах преовуляторного периода.

2. Острая и хроническая затравка гербицидом 2,4-Д. 2,4-Д вводили per os с помощью желудочного зонда в 2% растворе крахмала. При острой затравке препарат вводили однократно в дозах 10 мг/кг и 50 мг/кг. При хронической затравке препарат вводили в дозах 1 мг/кг и 12 мг/кг в течение 2-2.5 месяцев. Животным контрольной группы вводили 2% раствор крахмала.

3. Стрессовое воздействие. Стрессирование осуществляли путем иммобилизации. В основу построения схемы стрессового воздействия положены отработанные варианты иммобилизационного стресса, эффективность которых проверена на гормональном уровне (Анишенко и др., 1991; Ковалев и др., 1988; Чеботарь, 1967). Самок крыс, ооциты которых находились на стадии диакинез-метафаза I мейотического созревания обездвиживали, закрепляя спинкой к доске, и держали в таком положении 1 час.

Изучение хромосомного комплекса гамет, зигот и эмбрионов. Все процедуры, связанные с приготовлением препаратов, производили под контролем стереомикроскопа. Препараты ооцитов, зигот и эмбрионов человека и животных готовили по лабораторным модификациям метода Тарковского (Таг-kowski, 1966). Для изучения хромосомного комплекса мужских половых клеток человека проводилась постановка так называемого "хомячкового теста". В основу методики были положены известные разработки (Martin, 1983; Brandriff et al., 1984).

Проводили стропи! отбор хромосомных пластинок, пригодных для анализа; учитывапи степень компактизации хромосом, их взаиморасположение, наличие цитоплазмы.

Изучение хромосомного комплекса зародышей на стадии 1 деления дробления. Зиготы культивировали на одной из культуральных сред: F 10; F 12 или Whitten в инкубационной камере (Секирина, 1985). Фиксацию зародышей проводили по лабораторной модификации метода Тарковского (Tarkowski, 1966). Для идентификации женского и мужского наборов хромосом использовали при спаривании самцов мышей - гомозигот по робертсонов-ской транслокации Rb(3:5)Icg.

Определение эмбриотоксических эффектов. Частоту внутриутробной гибели и эмбриональное развитие определяли на 19 или 20 день беременности. Под доминантными летапями понимали общий уровень эмбриональной смертности, который определяли как сумму до - и постимплантационной гибели. Состояние внутренних органов эмбрионов оценивали по методу Вильсона (Wilson, 1965).

Изучение микроядер в клепках кумулюса. Работа выполнялась на самках крыс линии Вистар. Экспериментальные воздействия (острая алкогольная интоксикация, внутригастральное введение гербицида 2,4-Д, стрессирование животных) производили на стадии диакинез-метафаза I мейотического созревания ооцитов. Метод зарегистрирован в качестве изобретения (№ 1630792).

Материал и методы, используемые при изучении онтогенетических процессов, происходящих в соматических клетках человека.

Контингент обследованных лиц.

1. Лица, обследованные с целью изучения характеристик СХО в популяции.

В эту группу входили здоровые индивиды в возрасте от 17 до 50 лет, не контактировавшие с профессиональными вредностями и проживавшие в г. Ленинграде. Исследование проводилось в 1979-1984 годах.

2. Работники химических предприятий.

Влияние условий химического производства изучали у работниц объединения "Красный Треугольник" (в возрасте от 18 до 33 лет) и у работниц объединения "Пластполимер" (в возрасте от 21 до 66 лет). Основной вредностью у работниц "Красного Треугольника" считался бензин, использовавшийся в качестве растворителя. Химические вещества, действию которых подвергались женщины на объединении "Пластполимер", - бензол, будоин, тальк и нефтепродукты. В качестве контроля обследовали здоровых женщин, не контактировавших с производственными вредностями, в возрасте от 17 до 44 лет.

3. Лица, подвергшиеся действию радиационного фактора.

Обследовали мужчин, принимавших участие в ликвидации последствий аварии на Чернобыльской АЭС, главным образом в 1986-87 годах, и находившихся на обследовании и/или лечении во Всероссийском центре экологической медицины. Возраст обследуемых в момент производства работ -от 20 до 40 лет. Большинство ликвидаторов не имеет сведений о полученной ими дозе радиационного воздействия. В тех случаях, когда доза облучения была документально зарегистрирована, она, как правило, не превышала принятую на ЧАЭС в качестве допустимой дозу в 25 Бэр.

Группа сравнения состояла из лиц мужского пола, без профвредностей, того же возрастного интервала и не имевших лучевой нагрузки. Методы обследования.

1. Изучение СХО. Анализ СХО проводился с использованием культуры лимфоцитов периферической крови по стандартным методикам (Чеботарев и др., 1978).

2. Изучение хромосомных аберраций. Анализировали частоту и типы хромосомных аберраций в первом митотическом делении лимфоцитов в культуре. Верификация атипичных хромосом производилась с помощью анализатора изображений Leitz MIAMED MF. Эта система осуществляла также автоматизированный поиск метафазных пластинок, пригодных для анализа.

3. Формы и методы анкетирования обследуемых; ведение базы данных.

При обследовании ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС осуществлялось анкетирование больных и лиц из контрольной группы. Анкета включала в себя более 60 вопросов, направленных, главным образом, на выявление возможных дополнительных мутагенных воздействий. Компьютерная форма базы для цитогенетической лаборатории была создана в математической лаборатории Всероссийского центра экологической медицины.

Методы статистической обработки данных.

Использовали классические методы статистической обработки материала, такие, как методы tst, %2, дисперсионный анализ, регрессионный анализ и другие. Для определения частоты СХО, характеризующей группу обследуемых, использовали не значение среднего арифметического (формируемого на основании входящих в него индивидуальных средних), но значение среднего оптимального, поскольку этот критерий учитывает погрешности индивидуальных измерений (Джелепов, 1974).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучение половых клеток Цитогенетическое исследование гамет и эмбрионов человека.

Проведена оценка применимости метода цитогенетического анализа гамет и эмбрионов, полученных при проведении процедур оплодотворения in vitro, для выявления мутагенного действия экологических факторов на половые клетки человека.

Проанализированы ооциты и эмбрионы, ставшие доступными в результате осуществления 311 процедур оплодотворения in vitro. Хромосомы овулпрующих ооцитов в норме находятся на стадии МП мейоза. Они сильно спирализованы, что затрудняет внутригрупповую идентификацию хромосом. Набор хромосом эмбрионов человека по своей морфологии не отличается от дипяондного набора соматических клеток. При изучении препаратов ооцитов, зигот и эмбрионов, наряду с типичной для этих стадий цитологической картиной, выявлены различного рода нарушения нормального хода

раннего эмбриогенеза: дегенеративные изменения хроматина, выражающиеся в виде слипаний (глыба хроматина) или, наоборот, в воде аномальной де-конденсации (визуальное отсутствие хроматина); нарушения плоидности гамет (диплоидные ооииты); полиспермия; несоответствие видимого состояния хроматина этапу развития (например, один хромосомный набор на стадии первого деления дробления); неравный размер ядер эмбрионов и другие.

Из 210 зафиксированных ооцитов человека 103 имели различные формы хромосомной дегенерации. Как показали эксперименты с ооцитами лабораторных грызунов, дегенеративные изменения хроматина свидетельствуют о нарушении физиологического состояния клетки (Слозина и др., 1990). Помимо дегенеративных изменений, проведению цитогенетического анализа ооцитов препятствовали множественные наложения хромосом, наблюдавшиеся у четверти зафиксированных клеток. Из 16 кариотипирован-ных ооцитов четыре несли числовые хромосомные аномалии 12 имели нормальный хромосомный набор из 23 хромосом и 4 имели числовые хромосомные аберрации: 2 гипоплоидии (22,-F; 21) и 2 пшерплоидии (25,+D,+G; 24-25).

Среди 97 проанализированных зигот (оплодотворенных ооцитов) 48.4% остановили свое развитие на стадии двух пронуклеусов или двух гаплоидных наборов хромосом. Уровень полиспермии -22.7%. У 16.5% зигот наблюдалась преждевременная конденсация хромосом спермия. Два ооцита были партеногенетнчески активированы и в одной зиготе наблюдалась структурная аберрация - разрыв хромосомы с образованием фрагмента.

Зафиксировано 95 эмбрионов человека на стадии 2-16 бластомеров (42 эмбриона имели нормальную морфологию и 53 имели морфологические аномалии). Анализ хромосомного комплекса на уровне кариотипирования по меньшей мере одного бластомера оказался возможным у 24 эмбрионов. Среди морфологически аномальных эмбрионов в 60% случаев выявлены хромосомные аномалии, среди эмбрионов с нормальной морфологией хромосомные аномалии выявлены у 25% эмбрионов. Основные типы хромосомных аномалий - мозаицизм и нарушения плоидности.

Число гамет и зигот, доступных для анализа в результате проведения одного цикла оплодотворения in vitro, варьировало от 1 до 14. При этом не наблюдалось какого-либо постоянства в типах нарушений, выявляемых при цитологическом анализе как в одном цикле, так и в повторных циклах, проанализированных нами у 44 женщин.

Анализ хромосомного комплекса сперматозоидов мужчин (мужей тех женщин, которые проходили лечение от бесплодия в ИАГ путем экстракор-

порального оплодотворения) был начат нами в 1990 году. В 1991 году методика была поставлена, получены препараты хромосом спермиев. К сожалению, дачьнейшие исследования в области цитогенетического анализа сперматозоидов человека были прекращены из-за резкого сокращения финансирования этой программы. Полученный нами методический опыт, а также анализ литературных данных о выявляемых хромосомных нарушениях сперматозоидов - преобладание структурных аберраций в спектре хромосомной патологии (Estop et al., 1991, 1992), возрастание частоты структурных аберраций с возрастом (Rosenbusch et al., 1993), избирательная чувствительность ответа на мутагенные воздействия (Estop, 1991; Jendery et al., 1992 и другие работы) - приводят к выводу о том, что этот метод может быть с успехом применен для изучения действия экологических и иных повреждающих факторов на гаметы человека. Вместе с тем, относительная дороговизна и техническая сложность "хомячкового теста" не позволяют использовать его в широких популяционных исследованиях.

Цитогенетический анапиз ооцитов и эмбрионов человека представляет большой интерес при решении таких вопросов как установление спонтанного уровня хромосомных аномалий, неслучайность вовлечения в аберрации рапнчных хромосом, впияние возрастного гормонапьного дисбаланса на возникновение хромосомной патологии потомства и т.д. Однако, изучение прямых эффектов неблагоприятных внешних воздействий на женские гаметы в системе оплодотворения in vitro представляется неэффективным.

Существенную помошь в оценке действия мутагенов окружающей среды на женские половые клетки могут оказать опыты на лабораторных животных.

Модельные эксперименты на лабораторных животных.

С помощью разработанной нами модели проведен анализ мутагенного действия ряда факторов окружающей среды, с которыми человек контактирует в повседневной жизни, на женские половые клетки. Действие алкогольной интоксикации.

Изучение мутагенных эффектов алкоголя проводили в условиях острой и хронической интоксикации самок крыс. Изучат также влияние острой алкогольной интоксикации на расхождение хромосом в мейозе у мышей, гетерозиготных по робертсоновской транслокации Rb(3:5)Icg. Цитогенетический анализ овулщювавших ооцитов и эмбриотоксические эффекты при острой и хронической алкогольной интоксикации.

В таблице 1 представлены данные, обобщающие результаты экспериментов по однократному введению алкоголя на стадии диакинез- метафаза I мейотического созревания ооцитов и хронической алкогольной интоксикации животных до беременности.

Как показывают данные, представленные в таблице 1, однократное воздействие алкоголя в период прохождения женской половой клеткой пре-овоуляторной стадии диакинез - метафаза I приводит к значительному увеличению эмбриональной гибели, и на цитогенетическом уровне - к возрастанию частоты анеуплоидии. Хроническая алкоголизация самок крыс вызывает эффект, сходный по своей направленности, и не превосходящий острое воздействие ни по частоте анеуплоидных гамет, ни по уровню эмбриональной смертности.

Таблица 1.

Результаты цитогенетического анализа овулировавших ооцитов и изучения эмбриональной летальности при острой (1) и хронической (2) алкогольной интоксикации самок крыс

Показатель Воздействие Контроль

1 2

Цитогенетический анализ ооцитов

Количество животных 131 95 169

Количество проанализированных ооцитов 119 105 150

Из них: с нормальным набором хромосом 83(69.8) 77(73.3) 141(94.6)

<21 13(10.9) 15(14.3) 5(3.3)

>21 23(19.3) 13(12.4) 4(2.7)

Общее количество анеуплоидных ооцитов 36(19.3)* 28(26.7)* 9(6.0)

Анализ эмбриональной летальности

Количество животных 57 53 62

Количество желтых тел 679 626 664

Из них:

живых эмбрионов 506 453 573

погибших эмбрионов 173(25.5)* 173(27.5)* 91(13.6)

В том числе:

до имплантации 104(15.3) 119(19.0) 64(9.6)

после имплантации 69(12.0) 54(10.8) 27(4.3)

Примечание. В скобках - доля от общего числа, 7с. * Значимое отличие от контрольной группы, р<0.01.

Действие алкоголя на сегрегацию .хромосом в мейозе у мышей, гетерозиготных по робертсоновской транслокации КЬ(3;5)1с$.

Проведены эксперименты по однократному внутригастральному введению алкоголя на различных стадиях мейотического созревания ооиитов: первой группе животных алкоголь вводили два раза в течение преовулятор-ного периода - когда ооциты находились на стадии метафаза I и на стадии анафаза I. Вторая группа мышей получала алкоголь только на стадии метафаза I, третья - только на стадии анафаза I. Результаты работы представлены на рисунке 1.

Контроль Метафаза I + Метафаза 1 Анафаза I анафаза I

Стадия введения алкоголя

Рис.1. Соотношение ИЬ/не ИЬ гамет у гетерозиготных по робертсоновской транслокации самок при введении алкоголя на различных стадиях мейотического созревания ооцитов.

Как следует из представленных данных, соотношение Шэ/не ЯЬ гамет у контрольных животных не отличается от 1:1. Высокозначимое повышение частоты не КЬ гамет возникает при воздействии алкоголя на стадии метафаза I и отсутствует при воздействии на стадии анафаза I мейотического созревания. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что в ходе 1 мейотического деления ооцитов мышей, гетерозиготных по транслокации НЬ(3,5)1с§ под действием экзогенного фактора (алкоголя) происходит изменение сегрегации хромосом. Учитывая, что эффект проявляется только при воздействии алкоголя на стадию диакинез-метафаза I и отсутствует в период анафазы I, можно предположить, что этанол влияет на ориентацию веретена

деления. Расшифровка механизмов направленной сегрегации гамет, помимо теоретического интереса, может иметь большое значение в медицинской генетике для получения потомства от больных - носителей трансло каций.

Действие гербицида 2,4-Д.

Изучение мутагенного действия гербицида 2,4-Д проводили в условиях острого (на стадии диакинез-метафаза 1 мейотического созревания) и хронического воздействия.

Хромосомные аномалии в ооцитах и эмбриотоксические эффекты при острой и хронической затравке самок крыс гербицидом 2,4-Д.

Результаты цитогенетического анализа ооцитов представлены в таблице 2. В таблице 3 приведены данные изучения эмбриотоксических эффектов.

Таблица 2.

Цитогенетпческий анализ ооцитов при острой и хронической интоксикации самок крыс 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой

Характер Число Число Ооциты Анеупло-

воздействия и живот- проана- идные

доза ных лизиро- п= 21 п= 20 п= 22 ооциты

ванных коли доля коли доля коли доля коли доля

ооцитов чес-тво чес-тво чес-тво чес-тво

Контроль 60 113 102 90.2 9 8.0 2 1.8 11 9.7

Острое

воздействие:

10 мг/кг 59 114 102 89.4 9 7.9 2 1.7 11 9.6

50 мг/кг 49 109 87 79.8 12 11.0 10 9 2** 22 20.2*

Хроническое

воздействие:

1 мг/кг 40 83 70 84.3 8 9.6 5 6.1 13 15.7

12 мг/кг 46 109 93 85.3 11 10.1 5 4.6 16 14.7

*р<0.05; **р<0.01 по сравнению с контролем; п - число хромосом.

Как следует из таблицы 2, гербицид 2,4-Д при однократном введении в дозе 50 мг/кг вызывает нарушения хромосомного комплекса, выражающиеся в возникновении числовых хромосомных аберраций. Воздействие гербицидом до беременности приводит также к росту эмбриональной гибели (таблица 3). Как следует из данных, представленных в таблице 3, одно-

кратное введение 2,4-Д до беременности в дозах 10 и 50 мг/кг увеличивает частоту эмбриональной гибели плодов по сравнению с таковой в контроле. При хронической затравке 2,4-Д частота эмбриональной гибели значимо возрастает при использовании гербицида в дозе 12 мг/кг. При введении 2,4-Д в период реинициацин мейоза при обеих концентрациях гербицида наблюдается рост частоты пороков развития плодов -4.1-4.3% по сравнению с 1.4% в контроле. Различия, определенные методами у}, критерием Р Фишера, достоверны при р<0.01. Рост частоты пороков развития до 7.5% наблюдали и при воздействии 2,4-Д (в концентрации 50 мг/кг) сразу после спаривания (р<0.001).

Таблица 3.

Частота эмбриональной гибели при острой и хронической затравке самок

2,4-Д до зачатия

Характер воздействия Число живот- Число жел- Число живых Погибшие эмбрион ы (%)

и доза ных тых эмбрио- до после всего

тел нов имплантации имплантации

Острое: 10 мг/кг 42 478 391 12.1+1.5** 6.9+1.2 18.2±1.8**

50 мг/кг 39 485 366 15.1±1.6** 11.2+1.4** 24.5+1.9**

Контроль 42 456 410 5.7±J J 4.6+1.0 J0.1±1.4

Хроническое: 1 мг/кг 27 304 260 7.2±1.5 7.8+1.5 14.5±2.0

12 мг/кг 21 230 183 11.7+2.1 9.8+2.0* 20.4±2.7*

Контроль 28 320 280 8.4±1.5 4.4+1.1 12.5+1.8

*р<0.05; **р<0.01 по сравнению с контролем.

Хромосомный комплекс зародышей мышей на стадии 1 деления дробления после воздействия 2,4-Д на самок в преовуляторном периоде.

Изучение цитогенетических эффектов 2,4-Д на стадии первого деления дробления проведено на 385 зародышах мышей. При использовании трех доз гербицида 10 мг/мл, 40 мг/мл и 100 мг/мл получены значимые различия в частоте гамет с хромосомными аномалиями: если в контроле из 147 зигот выявлена одна хромосомная аномалия (0.7%), при воздействии 2,4-Д в концентрации 10 мг/кг из 92 зигот 2 несли хромосомные аберрации (2.2%), при действии гербицида в дозе 40 мг/кг среди 90 зигот выявлено 4 аберрации

(4.4%), при дозе гербицида 100 мг/мл среди 56 проанализированных зародышей выявлено 7 аберрантных (12.4%).

Действие стресса.

Проведены цитогенетический анализ ооцитов и оценка эмбриотокси-ческих эффектов при действии стресса в преовуляторном периоде. Результаты исследования представлены в таблицах 4 и 5.

Таблица 4.

Цитогенетический анализ ооцитов крыс после стрессового воздействия в преовуляторном периоде

Вариант Кол-во проанализирован ных ооцитов Хромосомный комплекс абс. (9с) Общее число анеуплоидных ооцитов

п=21 п<21 п>21

Опыт 115 86(74.8) 9(7.8) 20(17.4)* 29(25.2)*

Контроль 105 100(95.2) 3(2.9) 2(1.9)* 5(4.8)

*р<0.001

Таблица 5.

Эмбриональная гибель у крыс после стрессового воздействия в преовуляторном периоде.

Вариант Количество Погибающие эмбрионы абс(%)

животных желтых живых до имплан- после им- всего

тел эмбрионов тации плантации

Опыт 37 416 322 44(10.6) 50(13.4) 94(22.6)*

Контроль 34 352 317 21(6.0) 14(4.3) 35(9.9)

* р<0.01

Полученные данные свидетельствуют о том, что стрессовое воздействие в преовуляторном периоде приводит к индукции анеуплоидий и росту частоты эмбриональной гибели.

Микроядра в клетках кумулюса при действии алкоголя, гербицида 2,4-Д и стресса в преовуляторном периоде.

С помощью разработанной модели показано, что экспериментальные воздействия, мутагенный эффект которых для созревающих ооцитов был выявлен ранее, вызывают увеличение числа микроядер в клетках кумулюса с

2°/(Ю до Ю-17%0 (р<.01). Следовательно, независимо от природы мутагенного агента (является ли он химическим мутагеном или же действует стрессовый фактор) цитогенетические нарушения наблюдаются уже на уровне клеток, окружающих ооцит.

Таким образом, использование экспериментальных моделей ооцитов лабораторных животных позволило показать, что факторы окружающей среды при однократном воздействии в наиболее чувствительном - периову-ляторном периоде могут приводить к мутационным событиям.

Оценка значимости критерия сестринских хроматидных обменов (СХО) в изучении мутагенных эффектов в популяции человека.

Проведен анализ частоты СХО у 99 жителей г. Ленинграда. Показано нормальное распределение средних. Не выявлена связь частоты СХО с полом (7.2±0.5 у мужчин и 7.3±0.5 у женщин), возрастом (в пределах возрастного интервала от 17 до 50 лет), временем года. Характер распределения СХО по клеткам (2219 метафаз из 80 культур крови) не укладывается ни в один из известных типов распределения. Причины необычного распределения СХО до настоящего времени не ясны.

Изучена вариабельность частоты СХО при многократных измерениях. У 20 индивидуумов произведено многократное взятие крови (от 2 до 21 раза). Повторные исследования проводили через различные промежутки времени (от 1 дня до 2 лет). Показаны статистически значимые различия частот СХО при неоднократных измерениях. Степень различий не зависит от временного интервала между повторностями: статистически значимые изменения наблюдались со сходной частотой во временных интервалах 1-7 дней, 8 дней - 1 месяц, 1 -6 месяцев, и более 6 месяцев.

В группе, составленной из индивидуумов, обследованных не менее 5 раз, осуществлено сопоставление дисперсий оптимальных значений. Выявлены индивиуальные различия в величине дисперсии, т.е. в степени варьирования значения частот СХО в повторных измерениях.

Проведено сравнение частоты СХО, измеренной у одних и тех же лиц в различное время суток. При исследовании СХО у одних и тех же лиц в 9 и в 21 час в б парах измерений из 11 показано достоверное превышение вечернего значения над утренним и в 5 парах различия между измерениями недостоверны. Средняя частота обменов в 9 часов достоверно ниже, чем в 21

час. Таким образом, полученные данные позволяют говорить о влиянии времени измерения на частоту СХО.

Широкая вариабельность частоты СХО в популяции человека, варьирование этого показателя в повторных измерениях, выполненных не только через длительный (более 1 месяца), но и через короткий (от нескольких часов до нескольких суток) временной интервал и, наконец, зависимость частоты обменов от времени измерения позволяют выдвинуть предположение, что в определенных пределах частота обменов между сестринскими хрома-тидами опосредована нормальными физиологическими процессами организма, многие из которых весьма ла лабильны. Отсюда следует, что метод учета СХО, хорошо зарекомендовавший себя в экспериментах in vitro и проявивший высокую чувствительность к отдельным химическим мутагенам (Чеботарев, 1985), значительно менее эффективен в выявлении мутагенных факторов в популяции человека. При оценке мутагенных факторов среды метод учета СХО может быть использован в качестве дополнительного теста, проводимого параллельно с изучением хромосомных аберраций.

Результаты цитогенетического обследования работниц, занятых в химическом производстве.

Изучали частоту сестринских хроматидных обменов (СХО) и хромосомных аберраций (ХА) у работниц двух химических предприятий "Красный Треугольник" (20 работниц и 20 человек- контрольная группа) и "Пластполимер" (41 работница и 41 человек- контрольная группа). В группе работниц "Красного Треугольника средняя частота СХО 7.3±0.4% при 6.8± 0.3 в контроле, частота ХА 0.8% при 0.7% в контроле. В группе работниц объединения " Пластполимер" средняя частота СХО 7.7+0.2 при 8.3±0.3 в контроле, частота ХА 0.5% при 0.8% в контроле. Ни в одной из групп не выявлено статистически значимых отличий от контроля как по критерию СХО , так и по критерию ХА. Применение двух цитогенетических методов позволяет с большой долей определенности говорить о том, что условия производства на обследованных предприятиях не приводят к мутационным событиям, выявляемым на цитогенетическом уровне.

Результаты обследования лиц, подвергшихся действию радиационного фактора

При изучении хромосомного комплекса лимфоцитов периферической крови ликвидаторов аварии на ЧАЭС, проведенном в 1992-1994 годах, получены следующие данные относительно частот и типов хромосомных абер-

раций: средняя частота хромосомных аберраций 2.63Ю.21%, что практичеси равно средней частоте аберрантных метафаз, так как клетки с двумя и более нарушениями встречались чрезвычайно редко. Минимальная частота хромосомных аберраций в обследованной группе 07с, максимальная - 12%. Характер распределения обследуемых по частоте хромосомных аберраций согласуется с распределением Пуассона (р<0.01).

Среди типов хромосомных аберраций преобладают одиночные и парные фрагменты. Соотношение аберраций хроматидного и хромосомного типов составляет 1.2:1. Выявлены также днцентрики, кольца, атипичные хромосомы, межхромосомные хроматидо - хроматидные обмены. В таблице 7 предстаалены данные, позволяющие сопоставить частоты и типы хромосомных аберраций, выявляемые у ликвидаторов и в группе сравнения, состоявшей из лиц сходной возрастной группы, обследованных в тот же период времени, что и ликвидаторы аварии, и не имевших установленной мутагенной нагрузки.

Таблица 7.

Частота и типы хромосомных аберраций у ликвидаторов аварии на ЧАЭС и

в группе сравнения

Группа Число проанализированных метафаз Частота аберрантных метафаз Тип хромосомных аберраций

Хроматидные Хромосомные

одиночные фрагменты обменные всего парные фрагменты цицент- рики, кольца атипичные хромосомы всего

контроль (30 чел.) 3300 2.22+ 0.13 1.93+ 0.37 0+0.03 1.93+ 0.37 0.30+ 0.06 0+0.03 0±0.03 0.30+ 0.06

ликвидато ры (136 чел.) 14100 2.74+ 0.21 1.46± 0.14 0.15± 0.04* 1.61± 0.14 0.82+ 0.10* 0.19+ 0.04* 0.12+ 0.04** 1.13+ 0.12*

* различия достоверны при р<0.01,** различия достоверны при р<0.02

Данные, представленные в таблице 7, показывают, что обе группы не различаются по обшей частоте хромосомных аберраций. При этом частота хромосомных аберраций в группе сравнения 2.227с. Обобщение обширных литературных данных зарубежных авторов, проведенное А.Форни (Рогги, 1992), указывает на то, что в среднем контрольный уровень нестабильных

хромосомных аберрации составляет 0.4-0.6%. Частота хромосомных аберраций, не превышавшая 1%, была показана нами в группе сравнения при проведении исследований в Ленинграде в 80-е годы (см. раздел, посвященный обследованию работниц химической промышленности). Повышение частоты хромосомных аберраций в группе сравнения до 2.22% может быть вызвано как случайными факторами, так и являться опосредованным ответом на ухудшение экологической ситуации и других условий жизни населения в последние годы. Преобладающий тип хромосомных аберраций в группе сравнения - одиночные фрагменты, доля которых в общей частоте аберрантных клеток составляет 86.9%. На рисунке 2 представлено соотношение различных типов хромосомных аберраций у ликвидаторов и в группе сравнения.

Ликвидаторы

0 Одиночные фрагменты ЕЗ Парные

фрагменты В Днцснтрики,

кольца □ Транслоииро ваннье хромосомы Ш Обменные хромат идные аберрации

Рис.2. Соотношение различных типов хромосомных аберраций у ликвидаторов и в контрольной группе.

Как показывает рисунок 2, у ликвидаторов аварии на ЧАЭС соотношение аберраций хроматидного и хромосомного типа значимо смещено, по сравнению с контрольной группой, в сторону роста частоты аберраций хромосомного типа. Только в группе ликвидаторов выявлены аберрации, характерные для радиационного воздействия - дицентрики и кольцевые хромо-

сомы. Заслуживает внимания тот факт, что обшая частота хромосомных аберраций у лиц, имевших кольца и дицентрические хромосомы (4.4± 0.77%), достоверно (р<0.02) превышала обшую частоту аберраций у лиц без этого типа нарушений (2.45±0.20%).

При проведении цитогенетического анализа в группе ликвидаторов выявлены атипичные хромосомы, возникшие в результате транслокаций. Обнаружение транслоцированных хромосом при тотальном окрашивании возможно только в случае видимых отклонений в их морфологии. Применение анализатора изображений .\1iamed позволило проводить верификацию транслоцированных хромосом.

Не вполне понятным с точки зрения классической теории воздействия радиации на организм является обнаружение у ликвидаторов межхромосомных хроматидо - хроматидных обменов. Частота такого рода нарушений в обследованной выборке 0.15±0.04%. Наличие хроматидных обменов принято связывать с действием химических мутагенов. Тщательное анкетирование обследуемых позволило исключить воздействие каких-либо химических мутагенных факторов. Вопрос о причинах и механизмах появления хроматидных аберраций обменного типа у лиц, контактировавших с радиационным фактором, нуждается в дальнейшем изучении.

Проведено сравнение частоты и типов хромосомных аберраций у ликвидаторов в течение первого года и в отдаленные (6 и более лет) сроки после воздействия. Данные по частоте хромосомных аберраций в первый год после обследования получены из базы данных ВЦЭМ. Рисунок 3 позволяет наглядно представить характер изменений, произошедших в спектре хромосомных аберраций через 6 лет после аварии.

Как видно из рисунка 3, по прошествии 6 и более лет происходит снижение общей частоты хромосомных аберраций и изменение их спектра. Снижение общей частоты хромосомных аберраций у ликвидаторов произошло, главным образом, за счет парных фрагментов. Достоверно снизилось также число одиночных фрагментов. Однако, частота дицентрических и кольцевых хромосом как в первый год после аварии, так и через 6 лет превышала контрольный уровень и составляла в первый год 1.7 на 1000 клеток, в отдаленном периоде 1.9 на 1000 клеток.

Одиночные Парные Дицентрики, Транслокации Обменные фрагменты фрагаенты кольца хроматидпые

аберрации

Тип аберраций

Рисунок 3. Частота и типы хромосомных аберраций у ликвидаторов

аварии на ЧАЭС в первый гад и через 6 и более лет после аварии

Проведенный анализ показал, что дицентрические и кольцевые хромосомы встречаются у 14.7% ликвидаторов. Атипичные хромосомы, видимые при рутинном окрашивании, выявлены у 8.1% ликвидаторов. Межхромосомные хроматидо-хроматидные обмены имелись у 11.8% ликвидаторов. В ряде случаев у одного обследуемого имелось сразу несколько типов нарушений. В общей сложности не менее 20% ликвидаторов имели маркеры мутационного воздействия. В контрольной группе из 30 человек, не имевших каких-либо контактов с ионизирующим и другими видами излучения, лица с маркерами выявлены не были.

Таким образом, в отдаленном периоде после воздействия (6 и более лет) у ликвидаторов аварии снижается общий уровень хромосомных аберраций, при этом сохраняется повышенный уровень радиационных маркеров. Снижение общей частоты хромосомных аберраций до уровня нормы показано у ликвидаторов, проживающих в Припяти (Шевченко и др., 1993), в то же время у части обследуемых зарегистрирована увеличенная частота ди-центрических хромосом. В работе А.Погосян и других (Ро§оз!ап е1 а1., 1994) была сделана попытка проследить характер элиминации хромосомных аберраций во времени у ликвидаторов аварии на ЧАЭС. Исследования проводились с 1987 по 1993 год. Авторам не удалось выявить закономерности

Проанализированы данные анкет (опросных листов) ликвидаторов. Проведен поиск связи ряда анкетных данных с результатами цитогенетичес-кого иследования. Дисперсионный анализ не показал значимого вклада таких показателей, как зарегистрированная доза облучения, длительность пребывания в зоне, удаленность от эпицентра, род занятий во время ликвидации аварии в формирование частоты хромосомных аберраций. Отсутствие связи цитогенетических показателей, изученных в отдаленном периоде после воздействия, со всеми перечисленными параметрами, может быть как результатом неточности данных физической дозиметрии, так и следствием значительного временного интервала между воздействием радиации и обследованием, в результате чего характерные для такого параметра, как ХА, дозовые зависимости размываются.

Достоверные различия в частоте хромосомных аберраций (р<0,05) наблюдались между группами лиц, подвергающихся и не подвергающихся в настоящее время действию вредных факторов на производстве: у ликвидаторов, отмечавших наличие вредных факторов различной природы на работе, частота хромосомных аберраций 3.08±0.30%, тогда как у лиц, считавших, что они не подвергаются на работе действию вредных факторов, частота хромосомных аберраций 2.13±0.37%. Широкий спектр воздействий, зарегистрированных в опросных листах (бензин, пыль, красители, растворители, асбест, различные химические вещества), не позволяет выделить группу ведущих производственных факторов, ответственных за повышение частоты хромосомных аберраций.

По роду занятий обследуемые подразделяются на две равные группы -люди рабочих профессий и занятые в непроизводственной сфере (инжнерно-технические работники, ученые и военнослужащие). Достоверные различия в частоте хромосомных аберраций (р<0,05) получены в зависимости от характера труда: у лиц рабочих профессий частота хромосомных аберраций 3.22±0.36%, у лиц, занятых другими видами деятельности, частота хромосомных аберраций 2.27±0.29%. При этом вредные факторы на производстве и в быту в обеих группах встречаются с одинаковой частотой. Причины выявленных различий не ясны.

Таким образом, у ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС, подвергшихся действию малых доз радиации, и в отдаленном периоде после аварии (6 и более лет) наблюдаются хромосомные аберрации, характерные для воздействия радиационного фактора. Причины и механизмы длительного выявления радиационных маркеров в лимфоцитах периферической крови пострадавших, а также биологическое значение и медицинские последствия

нестабильности генома до настоящего времени окончательно не ясны; требуются дальнейшие исследования в этом направлении.

Цитогенетический анализ в решении экспертных вопросов у пострадавших в отдаленном периоде после контакта с радиационным фактором.

Полученные нами данные по цитогенетическому обследованию ликви-аторов аварии на ЧАЭС и некоторых других групп пострадавших показали, что в лимфоцитах периферической крови лиц, подвергшихся действию малых доз радиации, длительное время могут выявляться маркеры радиационного воздействия. При увеличенном временном интервале от момента облучения до исследования цитогенетический анализ выступает не в качестве дозиметра, но в качестве индикатора действия радиационного фактора. При этом большое значение имеет правильный сбор анамнестических данных обследуемых с тем, чтобы исключить артефакты, вызванные влиянием других мутагенных воздействий. Обнаружение кольцевых, дицентрических, транслоцированных хромосом с частотой, превышающей контрольный уровень, через значительный интервал после облучения представляет весьма ценную информацию для решения экспертных вопросов о связи развития заболеваний с предшествовавшим радиационным воздействием.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящее исследование было предпринято с тем, чтобы способствовать решению проблемы реальной оценки генетических последствий действия факторов внешней среды на человека. За основу взяты методы цитогене-тического анализа, которые, обладая высокой информативностью, позволяют вести исследования на популяционном уровне. В процессе работы проведен поиск новых методологических подходов для оценки мутагенного действия средовых факторов на половые и соматические клетки человека.

В последние годы, благодаря развитию медицинских технологий, стало принципиально возможным изучение хромосомного комплекса гамет и пре-имплантационных эмбрионов человека. Несомненно, прямой анализ цитоге-нетических изменений, наблюдаемых в половых клетках человека, представлял бы большой интерес для изучения действия средовых факторов

на хромосомные преобразования. Исходя из этого, нами проведено изучение возможностей использования цитогенетического анализа ооцитов, эмбрионов и сперматозоидов человека, получаемых в процессе оплодотворения в системе in vitro. Исследование хромосомного комплекса женских половых клеток дало новую информацию об уровне хромосомных аномалий на ранних этапах эмбриогенеза человека. Анализ собственных и литературных данных свидетельствует о высокой (до 25%) частоте анеуплоидии в ооцнтах человека. Среди хромосомноаномальных предимплантационных эмбрионов выявлены мозаицнзм и нарушення плоидности. Вместе с тем, наряду с типичными хромосомными аномалиями, при цитогенетическом анализе женских гамет более, чем в половине обследуемых клеток выявляются иного рода нарушения генетического материма: аномалии компактизации хроматина (слипания или деконденсация), преждевременное расхождение хромосом на хроматлды, пульверизация хромосом и некоторые другие типы патологии. Экспериментальные исследования, проведенные нами на лабораторных животных, показали, что эти нарушения могут быть связаны как с гетерогенностью овулировавших ооцитов, так и с многочисленными факторами экзогенной и эндогенной природы, способными нарушать ход мейотического процесса. Высокая частота морфологических аномалий хроматина, затрудняющих анализ хромосомного комплекса, гетерогенность стимулированных к овуляции ооцитов, а также небольшое количество клеток, доступных для исследования в каждом конкретном случае, приводят к заключению, что для целей выявления мутагенной нагрузки в популяции человека анализ гамет, зигот человека вряд ли может быть рекомендован. Здесь существенную помощь способны оказать экспериментальные исследования на ооцитах лабораторных животных (см. далее). Оценка применимости метода анализа хромосомного комплекса сперматозоидов ("хомя-чковый" тест) к изучению действия средовых факторов на половые клетки человека показала обоснованность и принципиальную возможность такого подхода для решения частных вопросов, связанных с изучением действия экологических мутагенов на мужские половые клетки. Вместе с тем, опыт нашей работы свидетельствует о том, что относительная дороговизна и большая трудоемкость метода затрудняют его использование в популяци-онных исследованиях.

Большие трудности, с которыми, как показало настоящее исследование, связано прямое изучение цитогенетических аномалий в гаметах человека, привели к необходимости поиска иных методических подходов, направленных на выявление мутагенного действия экологических факторов на

уровне половых клеток. Нами разработана модельная система ооцитов лабораторных животных, направленная на оценку мутагенного действия факторов окружающей среды применительно к женским половым клеткам. Эта модель показала себя реальной и высокоинформативной. С использованием предложенной модели удалось показать, что не только сильные мутагены, но и такие факторы, с которыми современный человек имеет дело в повседневной жизни (алкоголь, гербициды, стресс), способны приводить к возникновению хромосомных аномалий в ооцитах, росту эмбриональной смертности и частоты пороков развития. Принципиально важным является также тот факт, что в оогенезе имеется относительно небольшая по протяженности стадия диакинез - метафаза I, которая характеризуется повышенной чувствительностью к мутагенным воздействиям. Так, острое однократное воздействие алкоголем в этот период реинициации мейоза по частоте хромосомных аберраций и уровню эмбриональной смертности вызывает генотоксические эффекты, сходные с длительной алкогольной интоксикацией животных. Парадоксальные, на первый взгляд, данные понами получены и в отношении индукции пороков развития при однократном действии гербицида 2,4-Д в периовуляторном периоде. Согласно классическим представлениям, пороки развития формируются только в результате действия повреждающих факторов в период органогенеза. Наши наблюдения предполагают возможность мутационной (хромосомной и генной) природы возникновения пороков развития плода при действии мутагена в период раннего эмбриогенеза. Результаты исследований, опубликованные в последние годы (Vogel, Schpielman, 1992), также приводят к выводу о зн-чительной роли экзогенных мутагенных воздействий на доимплантационных стадиях в индукции пороков развития.

Полученные в настоящем исследовании фактические данные позволяют предложить концепцию, получившую название периконцептолошческой (от слова conception - оплодотворение, зачатие), в основе которой лежит представление о том, что высокий уровень хромосомной патологии в оогенезе и раннем эмбриогенезе человека в значительной степени обусловлен кратковременными мутагенными воздействиями в периовуляторном периоде. Отсюда следует необходимость принятия профилактических мер, направленных на снижение вероятности зачатия детей с хромосомной патологией. Полное устранение мутагенных воздействий для абсолютного большинства населения нереально. Практическим путем решения этой задачи является снижение возможности контактов с потенциальными мутагенными факторами хотя бы в наиболее чувствительный к их действию период - пе-

риовуляторный. Задача исследователей состоит в том, чтобы на экспериментальных моделях выявлять потенциально опасные факторы, тогда как акушеры - гинекологи должны способствовать внедрению в сознание населения необходимости периовуляторной охраны плода.

Действие мутагенов окружающей среды на организм затрагивает как половые, так и соматические клетки. Постоянно предлагаются новые методы оценки мутагенных эффектов в соматических клетках' человека. Проведенный нами анализ применимости методики СХО в популяционных исследованиях показал, что этот критерий отражает не только действие мутаенов окружающей среды, но подвержен сильному влиянию эндогенного фактора, природа которого не ясна. Наличие эндогенной составляющей изменчивости частоты СХО привносит дополнительные сложности в постановку исследований и заставляет с осторожностью относиться к результатам, полученным без учета высокой вариабельности данного параметра.

Ионизирующая радиация является одним из наиболее известных мутагенов. Цитогенетические исследования, проведенные нами у ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС, подвергшихся действию малых доз радиации, показали, что в отдаленном периоде (6 и более лет после аварии) обшая частота хромосомных аберраций не превышает аналогичный показатель группы сравнения. Однако, у 20% ликвидаторов выявлены цитогенетические маркеры радиационного воздействия. Биологические механизмы столь длительного сохранения повышеного уровня радиационных маркеров у ликвидаторов последствий аварии в настоящее время не ясны. Обнаруженные изменения в спектре хромосомных аберраций в отдаленном периоде после контакта с радиацией (смещение в сторону аберраций хромосомного типа, наличие радиационных маркеров) положены в основу рекомендаций для экспертных советов по оценке связи возникновения заболеваний с предшествующим радиационным воздействием.

Таким образом, цитогенетические эффекты мутагенов окружающей среды надежно регистрируются на уровне соматических клеток. Достигая половых клеток, мутагенные факторы, с которыми человек контактирует в повседневной жизни, способны вызывать мутационные изменения не только при длительном контакте с ними, но и в результате однократного кратковременного воздействия в наиболее чувствительном - преовуляторном периоде мейотических преобразований ооцита. Внутриутробный отбор отсевает абсолютное большинство хромосомноаномальных зародышей человека, в результате чего цитогенетические эффекты экологических воздействий у потомства выявить не удается. Для окончательной оценки генетических

последствий действия экологических мутагенов на организм человека необходимо длительное мониторное наблюдение за состоянием здоровья пострадавших, а также анализ генетических сдвигов в ряду поколений.

ВЫВОДЫ

1. Предложена и апробирована экспериментальная модель ооцитов лабораторных грызунов, позволившая сформулировать концепцию особо высокой восприимчивости периовуляторного периода к мутагенным факторам среды.

2. Показано, что однократное воздействие алкоголем в период прохождения ооцитом преовуляторной стадии диакинез - метафаза II приводит к значительному увеличению эмбриональной гибели, и на цитогенетическом уровне - к возрастанию частоты анеупловдии. Хроническая алкоголизация самок крыс вызывает эффект, сходный по своей направленности и не превосходящий острое воздействие ни по частоте анеуплоидных гамет, ни по уровню эмбриональной смертности.

Однократное введение алкоголя в преовуляторном периоде изменяет сегрегацию хромосом в мейозе у мышей, гетерозиготных по робертсоновской транслокацни ИЬ(3:5)^, в сторону преобладания не ЛЬ гамет. Эффект проявляется только при воздействии алкоголем на стадии диакинез-метафаза II и отсутствует при воздействии в период анафазы II.

3. При однократном введении гербицида 2,4-Д на стадии диакинез метафаза II в период реинициации мейоза наблюдается возникновение числовых хромосомных аберраций в ооцитах, рост эмбриональной смертности и частоты пороков развития плодов. Возникновение числовых хромосомных аберраций происходит на фоне сдвига в хронологии мейотического созревания. Хроническая затравка 2,4-Д приводит к росту эмбриональной смертности, но не увеличивает частоту анеуплоидий.

Дозо-зависимая индукция хромосомных аберраций наблюдается у зародышей на стадии первого деления дробления^ после действия гербицида 2,4-Д на преовуляторные ооциты.

4. Стрессовое воздействие в преовуляторном периоде на стадии диакинез - метафаза II приводит к возникновению анеуплоидий в ооцитах и росту эмбриональной смертности.

5. Цитогенетический анализ ооцитов, зигот и эмбрионов, полученных при выполнении программы экстракорпорального оплодотворения, дает ценную информацию в области генетики раннего онтогенеза, однако его использование в качестве критерия оценки вклада экологических мутагенных воздействий в структуру хромосомной патологии у человека в

настоящее время представляется нецелесообразным вследствие небольшого количество клеток, доступных для обследования в каждом конкретном случае, гетерогенности стимулированных к овуляции ооцитов, а также многообразия факторов как экзогенной, так и эндогенной природы, влияющих на ход мейотического процесса.

Анализ возможностей использования "хомячкового" теста (визуализация хромосом сперматозоидов) в изучении мутационного процесса у человека показан, что этот метод может быть применен для решения частных вопросов, связанных с действием мутагенных факторов на мужские половые клетки. Вместе с тем, относительная дороговизна и техническая сложность метода не позволяют рекомендовать его для широких популяционных исследований.

6. Анализ применимости теста СХО для выявления действия мутагенных факторов в популяции человека показал отсутствие стабильности результатов определения частоты СХО при многократных измерениях у одних и тех же индивидуумов. Достоверные различия наблюдали при измерении частоты СХО в различное время суток (в 9.00 часов 7.6±0.7 и в 21 час 9.8+0.7 обмена на клетку). Полученные данные свидетельствуют о том, что имеется фактор эндогенной природы, существенно влияющий на частоту СХО. Это ограничивает возможности использования теста для оценки мутагенных эффектов у человека.

Не выявлено значимых изменений частот СХО и ХА у работниц химических предприятий "Красный треугольник" и "Пластполимер".

7. Частота хромосомных аберраций у ликвидаторов аварии на ЧАЭС в отдаленном периоде после обследования (6 и более лет) 2,74±0,21% близка к общепопуляционной, наблюдаемой в районах со сложной экологической обстановкой таких, как Санкт-Петербург (2.22±0.13%), при этом спектр аберраций смещен в сторону нарушений хромосомного типа.

8. У 20% ликвидаторов через 6 и более лет после аварии выявлены ци-тогенетические маркеры радиационного воздействия. Общая частота хромосомных аберраций у ликвидаторов, имевших днцентрические и кольцевые хромосомы (4.40±0.77%), достоверно превышала общую частоту аберраций у лиц без этого типа нарушений (2.45±0.20%).

9. Не показано связи частоты ХА в отдаленном периоде с зарегистрированной физической дозой облучения, годом и длительностью пребывания на ЧАЭС, с удаленностью от эпицентра аварии, с родом занятий во время ликвидации аварии, характером выполняемой работы, клиническим диагнозом на момент обследования.

Достоверные различия в частоте хромосомных аберраций (р<0,05) наблюдались между группами ликвидаторов, подвергавшихся и не подвергавшихся впоследствии действию вредных факторов на производстве: 3.08± 0.30% и 2.13±0.37% соответственно.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Слозина Н.М. Сестринские хроматидные обмены при физиолога ческом и патологическом изменении состояния организма женщин // Тез. докл. IV съезда ВОГнС, ч.1У.-Кишинев. - 1982. - С.12.

2. Слозина Н.М., Боровицкая Е.Э., Головачев Г.Д. Изучение распределения СХО среди жителей города Ленинграда // Цитология и генетика. -1984. - Т. 18, N4. - С.302-307.

3. Golovachev G.D., Slozina N.M., Borovitskaya E.E. Cytogenetic studies in women employed in rubber, polymer processing and shoe industries // Mutat. Res.-1985. -Vol.147, N5. - P.297-298.

4. Слозина H.M., Головачев Г.Д. Частота сестринских хроматидных обменов в лимфоцитах человека в разное время суток II Цитология. - 1986. -Т.28, N1. - С. 127-129.

5. Слозина Н.М., Китаев Э.М. Изменение в гормональном статусе организма и формирование аномальных гамет // Тез. докл. V съезда ВОГиС. - М., 1987. - С.262.

6. Nikitin A.I., Kitaev Е.М., Slozina N.M. Disorders of human female gametes formations and prenatal pathology // First Polish-Soviet symposium. Selected problems of pathology of reproduction and early human development. -Warsaw, 1988. - P.74.

7. Нарзуллаева M.C., Никитин А.И., Слозина Н.М. Способ моделирования алкогольной хромосомопатии в ооцитах. A.c. N1498464 // Офиц . бюл. Гос. ком. по изобр. и открыт, при ГКНТ СССР. - 1989. - N29. - С. 15.

8. Никитин А.И., Китаев Э.М., Слозина Н.М. Факторы, влияющие на расхождение хромосом в мейозе у млекопитающих животных и человека // Изв. сиб. отд. АНСССР серия: "Биол. науки" 2 вып. - 1989. - С.54-55.

9. Никитин А.И., Слозина Н.М., Китаев Э.М. Хромосомная патология у человека и охрана периовуляторного периода // Тез. докл. II Всес. съезда мед. генет. - Алма-Ата. - 1990. - С.320.

10. Во-Динь-Винь., Слозина Н.М., Никитин А.И. Характер астрального цикла, частота ановуляции, хромосомные гаметопатии и эмбриональная смертность у крыс при затравке самок 2,4-D до беременности // Арх. анат. гнет, и эмбр. - 1990. - Т.99, N9. - С.69-73.

11. Слозина Н.М., Ливотова О.Ю., Неронова Е.Г., Во-Дннь-Вннь. Комплексный подход к изучению причин хромосомной патологии женских половых клеток // Тез. докл. XIX науч. сессии ИАГ, поев, памяти проф. Д.О.Отта. - Л., 1990. - С. 122-123.

12. Слозина Н.М., Нарзуллаева М.С., Кустова М.Е., Неронова Е.Г. Действие алкоголя на поведение хромосом в мейозе // Изв. сиб. отд. АНСССР серия: "Биол. науки" 2 вып. - 1990. - С.34.

13. Слозина Н.М., Нарзуллаева М.С., Никитин А.И. Хромосомные аномалии и доминантные летали в ооцитах крыс при острой и хронической алкогольной интоксикации // Генетика. - 1990. - Т.26, N1. - С. 154-156.

14. Слозина Н.М., Неронова Е.Г. Хромосомные нарушения в ооцитах крыс после стрессового воздействия в преовуляторном периоде // Цитология и генетика. - 1990. - Т.24, N3. - С.37-40.

15. Слозина Н.М., Неронова Е.Г., Китаев Э.М. Хромосомные аномалии в гаметах и предимплантационных эмбрионах человека // Тез. докл. II Всес. съезда мед. генет. - Алма-Ата. - 1990. - С.320.

16. Слозина Н.М., Неронова Е.Г., Фаундез Р. и др. Цитогенетическая характеристика гамет человека (анализ литературы и собственные данные) // Изв. сиб. отд. АНСССР серия: "Биол. науки" 2 вып. -1990. - С.37-39.

17. Слозина Н.М., Пономарева H.A., Линская М.Н. и др. Варианты компактизации хромосом и оценка способности ооцитов млекопитающих к дальнейшему развитию // Цитология. - 1990. -Т.32, N12. - С.1187-1192.

18. Слозина Н.М., Рамша Ю.К., Ливотова О.Ю., Неронова Е.Г. Методические подходы к изучению генетической патологии в раннем эмбриогенезе человека // Методические и методологические вопросы генетики. -Томск. - 1990. - С. 19-38.

19. Неронова Е.Г., Слозина Н.М., Китаев Э.М. Влияние стресса на мейотический процесс и раннее эмбриональное развитие у крыс // Тез. докл. IV Всес. конф.: Эндокринная система организма и вредн. факторы окр. среды. - Л., 1991. - С. 166.

20. Слозина Н.М., Ливотова О.Ю. Способ оценки повреждений генома ооцитов лабораторных животных. A.c. № 1630792 // Офиц. бюл. Гос. ком. по нзобр. и открыт, при ГКНТ СССР. - 1991,- N8. - С. 15.

21. Nikitin A.I., Nusratova L.H., Narzullaieva M.S., Slozina N.M. Experimental analysis of the influence of alcohol consumption before conception on the reproductive function of the female rat and its offspring.// European association of Gynecologists and Obstetricians 6th Meeting. - Moscow, 1991. -P.46.

22. Слознна Н.М., Неронова Е.Г. Хромосомные аномалии гамет человека и внутриутробный отбор. Исследование мужских гамет // Цитология и генетика. - 1992. - Т.26, N3. - С.67-72.

23. Слозина Н.М., Неронова Е.Г. Хромосомные аномалии гамет человека и внутриутробный отбор. Исследование женских гамет // Цитология и генетика. - 1992. - Т.26, N6. - С.58-63.

24. Слозина Н.М., Сениченкова И.Н. Новый подход к изучению экологических воздействий на гаметы и зиготы // Актуальные вопросы физиологии и патологии репродуктивной функции женшин: Тез. докл. XX науч. сессии НИИАГ им. Д.О.Отта. - СПб., 1992. - С. 166-168.

25. Fedortseva R.F., Shishmarev Y.N., Slozina N.M., Mavritsina L.P., Nikiforov A.M. Cytogenetic and clinical consequences of exposure to low dose of ionizing radiation by inhabitants of the North- west region // XI] Nordic conference on Social Medicine "Public Health around the Baltic Sea".- Kuopio. 1993.- P.65.

26. Fedortseva R.F, Slozina N.M., Lushnov M.S., Nikiforov A.M. Cytogenetic changes in lymphocytes of peripheral blood of patients exposed to small doses of radiation during the Chernobyl disaster // XHth Meeting of the International Society of Hematology. Book of abstracts. -Vienna. 1993. - P. 176.

27. Fedortseva R.F, Slozina N.M., Mavritsina L.P., Nikiforov A.M. Clinical and cytogenetic consequences of exposure to- low dose ionizing radiation // Med. Genetik.- 1993. -N1. - P.l 10.

28. Слозина H.M., Федорцева Р.Ф., Харченко T.B., Неронова Е.Г. Нестабильность генома у ликвидаторов аварии на ЧАЭС в отдаленные сроки после воздействия // Тез. докл. первого (третьего) Российского съезда медицинских генетиков. - М.,1994. - С.237-238.

29. Fedortseva R.F., Slozina N.M., Nikiforov A.M. A cytogenetik approach to the assessment of mutagenic effect of small radiation doses on liguidators of the Chernobyl disaster // Med. Genetik. - 1994. - N1. - P.148.

30. Slozina N.M., Fedortseva R.F., Kharchenko T.V., Neronova E.G., Nikiforov A.M. Bioindication of low-level radiation in liqudators 6 year after Chernobyl accident. // The 2nd International Conference "Radiobiological Consequences of nuclear accidents". Abstracts part 2. - Moscow, 1994. - P.255.