Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Закономерности хромосомной изменчивости в соматических клетках у детей

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рыжкина, Ирина Владимировна, Рязань

>' '. /

МИНИСТЕРСТВО/ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ РЯЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИМЕНИ И.П. ПАВЛОВА

На правах рукописи

Рыжкина Ирина Владимировна ЗАКОНОМЕРНОСТИ ХРОМОСОМНОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ В СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТКАХ У ДЕТЕЙ

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологичесих наук

03.00.04 - БИОХИМИЯ

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ академик РАН, профессор Е.А.СТРОЕВ

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ академик РАМН, профессор Н.П. БОЧКОВ

Рязань - 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ ..................................................................4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .......................................8

1.1. Изменчивость и наследственность человека Спонтанный и индуцированный мутагенез ..........8

1.2. Хромосомные аберрации и злокачественные новообразования .........11

1.3. Возрастные изменения уровня хромосомных аберраций ......... 13

1.4. Хромосомные аберрации и соматические заболевания ......... 15

1.5. Хромосомные аберрации и наследственная патология .........18

1.6. Закономерности спонтанного уровня хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови человека .........22

1.7. Уровень хромосомных аберраций в лимфоцитах крови детей, проживающих в экологически неблагоприятных районах .........26

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.................................45

2.1. Характеристика обследуемых регионов .........46

2.2. Описание обследуемых групп .........51

2.3. Методика проведения цитогенетических исследований .........53

Стр.

2.4. Методы статистического анализа ........60

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.......................61

3.1. Частота хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови у детей района с льготным социально-экономическим статусом .........61

3.2. Частота хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови у детей

из района условного контроля ......■ 69

3.3. Частота хромосомных аберраций у детей сельскохозяйственных районов Рязанской

области .........76

3.4. Частота хромосомных аберраций у детей -пациентов медико-генетической консультации ......82

3.5. Зависимость уровня хромосомных аберраций

от величины выборки индивидов и клеток ..........89

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ........................................92

ВЫВОДЫ....................................................................100

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.................................................101

ПРИЛОЖЕНИЕ.............................................................115

Актуальность темы Научно-технический прогресс привёл в XX веке к резким изменениям экологических условий в масштабах всей планеты, размах и характеристики которых не встречались в длительной эволюции человека. Загрязнение окружающей среды химическими, физическими и другими вредными факторами, к которым человек как биологический вид не приспособлен, может отрицательно влиять на здоровье как настоящего, так и последующих поколений.

Защиту наследственности человека от экологических последствий загрязнения внешней среды возможно обеспечить только при условии знания групп риска среди населения и постоянном контроле за наследственной изменчивостью в популяциях человека, т.е. генетическом мониторинге. Повсеместное внедрение мониторинга мутаций с использованием эпидемиологического, молекулярно-генетического, цито-генетического, биохимического и клинико-генетического методов позволили выявить реальную опасность проживания человека в современной среде обитания и проведение гигиенических мероприятий, направленных на исключение вредных внешних факторов.

В последние десятилетия во всём мире идёт совершенствование критериев популяционной индикации мутагенных воздействий в малых дозах. Цитогенетический метод исследования - один из существующих методов, который позволяет идентифицировать изменения в ДНК, видимые при микроскопировании на хромосомном уровне. Многочисленные исследования показали, что повышенный уровень повреждения хромосом в популяционных исследованиях указывает на увеличение риска раковых и генетических заболеваний.

Наиболее широко используемым цитогенетическим методом для оценки генетических эффектов внешнесредовых воздействий является

метод учёта хромосомных аберраций, при котором регистрируются частота и типы структурных перестроек хромосом, индуцируемых в соматических клетках организма. Популяционная индикация слабых мутагенных воздействий может осуществляться в динамике или путём сравнения частот цитогенетических событий в группах, подвергавшихся воздействию изучаемых факторов. Особое значение в нашей стране подобные исследования приобрели после аварии на Чернобыльской АЭС.

Несомненно приоритетной группой в подобных исследованиях являются дети, обладающие наибольшей чувствительностью хромосомного аппарата к различным внешним воздействиям (в т.ч. и радиационному) по сравнению с другой возрастной категорией, а также наличием особой иммунологической памяти [4]. Таким образом, дети представляют собой группу потенциального риска в отношении отдалённых и недостаточно изученных последствий действия различных мутагенных факторов. Поэтому представляется целесообразным изучение количественных характеристик уровня хромосомных нарушений в лимфоцитах периферической крови различных групп детского контингента.

Изучение хромосомной изменчивости у детей является биологичес-кои индикациеи воздействия среды обитания. Такие данные необходимы как для прогнозирования отдалённых последствий таких как канцерогенез, тератогенез, мутагенез, так и для проведения соответствующих терапевтических и гигиенических мероприятий уже сегодня.

Использование лимфоцитов периферической крови в качестве объекта исследования обусловлено их высокой чувствительностью к различным мутагенным факторам, низким и относительно стабильным уровнем спонтанных аберраций в этих клетках, естественной синхронизацией клеток перед началом культивирования, способностью лимфоидных клеток к аккумуляции хромосомных повреждений в течение определённого периода времени.

Цель исследования Оценить частоту хромосомных аберраций у детей двух различных сельских районов и пациентов цитогенетической лаборатории медико-генетической консультации через 8 лет после аварии на Чернобыльской АЭС.

Задачи исследования:

1. Определить уровень частоты хромосомных аберраций в культуре лимфоцитов периферической крови детей Рязанской области через 8 лет после аварии на Чернобыльской АЭС.

2. Определить особенности типов аберрантных клеток и провести их сравнительный анализ у детей двух сельских районов, один из которых относится к зоне проживания с льготным социально-экономическим статусом.

3. Осуществить сравнительный анализ хромосомных аберраций у детей -пациентов цитогенетической лаборатории медико-генетической консультации с нормальным и аномальным кариотипом.

4. Сопоставить частоту хромосомных аберраций в культуре лимфоцитов крови детей, представляющих население Рязанской области, и пациентов медико-генетической консультации с нормальным кариотипом.

5. Определить зависимость уровня хромосомных аберраций от величины выборки индивидов и клеток.

Научная новизна

В работе впервые проведена оценка спонтанного уровня хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови у детей Рязанской области (средняя полоса России). Разницы в частоте хромосомных повреждений у детей двух сельских районов, один из которых после аварии на Чернобыльской АЭС относится к зоне проживания с льготным социально-экономическим статусом, не обнаружено.

ласти, где плотность загрязнения по Сб в 1986 году вследствие аварии на Чернобыльской АЭС составляла от 1,01 до 1,72 Ки/км , удельная реконструированная активность I131 от 3,14 до 5,61 Ки/км2 - через 8 лет после аварии частота хромосомных аберраций не отличалась от таковой у детей контрольной популяции.

Установленный спонтанный уровень частоты хромосомных аберраций в лимфоцитах крови детского населения может явиться исходным для дальнейшего слежения за действием факторов окружающей среды на популяцию средней полосы России.

Организм как целое существует благодаря тому, что его наследственным детерминантам присуще противоречивое единство устойчивости и изменчивости. Для того чтобы существовать, организм должен обладать такой организацией наследственного материала, которая, с одной стороны, обеспечила бы устойчивость, постоянство наследственных свойств, а с другой - достаточную лабильность, гибкость, возможность их изменения. Изменчивость организмов, включая человека, является, как и наследственность, их универсальным свойством [11,13,89].

В зависимости от причин различают ненаследственную и наследственную изменчивость. Причина ненаследственной модификационной изменчивости — действие факторов среды, включая питание, образ жизни и др., хотя и в этом случае реакция на действие факторов среды, как правило, в известной мере обусловлена генетически. Наследственная изменчивость подразделяется на два основных вида - комбинативную и мутационную. Под комбинативной изменчивостью понимают возникновение новых сочетаний неизменных генов за счет их перегруппировки в мейозе и случайности встречи гамет при оплодотворении. Мутационная изменчивость - возникновение мутаций, (генных, хромосомных, геномных) т.е. количественных или качественных изменений генотипа организма, передаваемых в процессе репликации генома от клетки к клетке и от поколения к поколению. Хромосомные и геномные мутации - объект цитогене-тических методов исследования [11,13,17,50,52].

Цитогенетические изменения, также как и все виды мутаций, являются облигатными свойствами организмов. По сравнению со многими функциями организма цитогенетические повреждения характеризуются высокой степенью постоянства, т.е. гомеостатические механизмы, обес-

печивающие это свойство, ограничивают должным для жизни образом цитогенетическую изменчивость [21,104]. Причем, изменения в хромосомном аппарате соматических и половых клеток нельзя рассматривать как процесс, независимый от других событий, происходящих в организме. Накоплен значительный материал, свидетельствующий о взаимосвязи функционирования генетического аппарата клеток и темпа мутирования от физиологического состояния организма [44]. Степень мутагенности любого фактора определяется, с одной стороны, свойствами объекта (физиологическое состояние организма, особенности метаболизма, активность ферментных систем, эффективность защитных механизмов на клеточном и организменном уровнях), а с другой, особенностями мутагена.

Разделение мутагенного процесса на спонтанный и индуцированный в определенной степени условно [13]. Когда говорят о спонтанном мутационном процессе, подразумевают возникновение мутаций при обычных физиологических состояниях организма без дополнительного воздействия какими-либо внешними для организма факторами. Безусловно, спонтанный мутагенез детерминирован в организме какими-то факторами: химическими веществами, возникающими в ходе метаболизма, естественным фоном радиации, ошибками репликации и т.п. Характерной особенностью спонтанного мутагенеза является отсутствие специфичности: мутации возникают в любых генах, во всех возможных направлениях; в результате такого мутагенеза возникают все возможные типы хромосомных и геномных мутаций. Мутационный процесс у человека протекает непрерывно, постоянно приводя к появлению новых мутаций.

Противоположными мутагенезу по значению являются процессы репарации - исправления мутационных повреждений генетического материала. В настоящее время известно несколько видов репарации. Лучше других изучена эксцизионная репарация, при которой происходит ферментативное выщепление поврежденных участков и ферментативная застройка брешей нормальными нуклеотидными последовательностями.

Спонтанный мутационный процесс является одной из биологических характеристик вида, в том числе и для человека. Пополнение новых мутаций уравновешено их элиминацией, при этом популяция сохраняет стабильное состояние. Если же интенсивность мутационного процесса будет повышена, то приспособленность популяции снизится, в связи с чем для человеческих популяций особенно опасен индуцированный мутагенез, который является одним из самых отдаленных последствий действия неблагоприятных факторов среды, ведущий к накоплению мутационного груза в популяциях. Следствием его будет увеличение перинатальной смертности, врождённых пороков развития, наследственных болезней, рост заболеваемости раком, уменьшение продолжительности жизни [17]. Груз наследственных болезней и без того большой за счет накопления его на протяжении эволюции. Однажды возникнув, патологические мутации длительное время сохраняются и передаются из поколения в поколение. Защиту наследственности человека от экологических последствий загрязнения внешней среды возможно обеспечить только при условии знания групп риска среди населения и постоянном контроле за наследственной изменчивостью в популяциях человека, т.е. генетическом мониторинге [11,13,17,28]. Было бы ошибкой устанавливать для генетических изменений какой-либо допустимый уровень, тем более, что еще неясен вопрос о последствиях популяционных изменений в результате повышения мутационного процесса. Принимая во внимание это обстоятельство, а также тот факт, что для большинства мутагенов (если не для всех) отсутствует порог действия, можно полагать, что предельно допустимой «гене-тически-повреждающей» концентрации для химических мутагенов, как и дозы физических факторов, существовать не должно.

В процессе эволюции физиологические системы человека выработали механизмы приспособления к изменениям внешней среды. Однако, на фоне промышленного и химического прессинга происходит напряжение и срыв адаптационных процессов.

Составить перечень всех мутагенных факторов практически невозможно: во-первых, он все время пополняется, во-вторых, по некоторым имеются противоречивые заключения. Однако, установлено, что для человеческой популяции в целом контакты больших групп населения со слабыми мутагенами опаснее, чем малых с сильными [60].

Процесс репарации генетического материала снижает частоту возникновения мутаций, но некоторая доля новых мутаций всегда остается нерепарированной [18]. При этом мутационный процесс протекает с определенной интенсивностью во всех клетках, как соматических, так и половых, и на всех стадиях жизни организма. И если мутации в половых клетках увеличивают число мутаций, передаваемых следующим поколениям, то мутации в соматических клетках могут проявляться непосредственно у своих носителей. Достаточно хорошо показано, что соматические мутации играют весьма важную роль в процессах старения организма, малигнизации, возникновении иммунодефицитных состояний. Весьма вероятно, что соматические мутации вносят определенный вклад и в переход острых патологических процессов в хронические [12].

1.2. Хромосомные аберрации и злокачественные новообразования

Исследования последних лет свидетельствуют о том, что опухоли человека относятся к мультифакториальной патологии, на подверженность к которой с разной степенью влияют как внешнесредовые, так и генетические факторы. Поэтому задачей современной онкологии является поиск генетических маркеров онкологических заболеваний, позволяющих не только распознавать опухолевый процесс на ранних стадиях его развития, но и выявлять пациентов, предрасположенных к возникновению злокачественных новообразований [65].

Прогностическая роль цитогенетических повреждений в развитии злокачественных новообразований очевидна [74,79,106,109,127]. Проведенные работы показали, что у лиц с повышенной частотой хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови в дальнейшем развивались раковые заболевания - латентный период составлял примерно 4,9 года [128]. Чувствительность к возникновению рака в результате воздействия низких доз ионизирующей радиации или мутагенов химической природы варьирует с возрастом. Относительный риск для облученных в детстве более высокий, чем для взрослых. Поразительной находкой является обнаружение того, что при однократном кратковременном воздействии радиационного или химического фактора биологический эффект может проявляться через десятки лет, а в ряде случаев для его выявления требуется вся жизнь или жизнь нескольких поколений, т.е. канцерогенные эффекты могут обнаруживаться у потомков облученных лиц [53]. Канцерогенные и генетические эффекты являются стохастическими, беспороговыми реакциями, частота которых (но не тяжесть!) повышается с увеличением дозы. Нестохастические эффекты возникают в результате одновременного поражения большого числа клеток в облученном органе или ткани, стохастические - в результате поражения одной или нескольких клеток.

Специальная проверка показала