Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антикластогенный эффект интерферона в культурах лимфоцитов здоровых доноров и больных бронхиальной астмой

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Антикластогенный эффект интерферона в культурах лимфоцитов здоровых доноров и больных бронхиальной астмой"

ъ 9 1Д 9 О

ЕРЕВАНСКИЙ ОРДЕНА. ТРУДОВОГО ЙРАСНЗГО ЗНМЯЗШ ГОСТДАРСТЕЕНЕаЙ УШЕЕРСЙТЕТ .

Ш правах рукописи

НОЕСЕСЯН Элизабет Сергеевна

Щ. 575:591

АНТИШАСТОГЕЙНЬЙ ЭФФЕКТ ИНТЕРФЕРОНА В КУЛЬТУРАХ ЛИМФОЦИТОВ ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ И БОЛЬНЫХ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ

03.00.15 - Генетика

Автореферат ,

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ереван- 1990

Работа вшолнона на кафедре генетика и цитологии биологического факультета Ереванского государственного университета.

Шучные руководители - доктор биологически наук

-- Р.М.АРГГОШН - кандидат биологических наук Т.Ф.САРКИСЯН

Официальные оппоненты - доктор медицинских наук

. А.Г.ЗЩЕВДНЕ кандидат биологических наук С.Б.ЕАГРАМЯН

Ведущее учреждение - Онкологический Научный Центр ик.В. А.Фанардвдиа ИЗ Республики Армения.

Защита состоится " /О " декабря 1990 г. в час.

на заседании специализированного ученого совета К 055.01.04 по генетике при Ереванском государственном университете по адресу: г.Вревад, ул.Чаренца, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ЕрГУ.

Автореферат разослан п /О " ноября 1990 года.

дел

зтац"".й

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОШ

Актуальность проблемы. Ввиду нввогмолноста устранения значительной доля химических мутагенов из среды обитания, в конца 60-ых годов для защиты от них была предложена концепция антиглу-тагенеза у человека ( ,1958). Эта концепция была'разви-

та как в отношении модификации цитогоготических нарушений, так и для защиты от гошшх мутаций.

В 80-не годы возникла идэя сходства мэханиЕмов действия ан-тпкарцяногенов и ангамутагеноз на {.молекулярном уроЕпе. Рядом авторов создана система классификации антимутагенов по механизмам дзйствия. Применение антпмутагенов стало рассматриваться в качестве реального фактора защиты от-действия загрязнителей окружающей среды.

Для правильной интерпретации результатов анализа снижения цитогенетических повреждений (антикластогеяного эффекта) необходима адекватная тест-система, для которой разработаны временные и количественные закономерности действия мутагенов (кластогенов) и протекторов (антикластогенов). К числу таких тест-систэм относится используемая в данной работе культура лимфоцитов человека, применимость которой при оценке модификации'химического мутагенеза достаточно обоснована (йе.£>кал£, 1968;. Р.М.Арутюнян,1985).

Общепринятым параметром для изучения эффективности индуцированного мутагенеза является частота хромосомных аберраций (ХА) Многими авторами в качестве более чувствительного индикатора патогенетического эффекта для ряда мутагенов используется параштр сестринских хроматидных обменов' (СХО). Согласно существующим теориям возникновения СХО ( РсиШйу ', ¡be.cc.he.tty, 1977; ¿"А-й-

,1977;Рси.п£е/г. ,1980), их индукция тесно связана с репли-кативным синтезом ДНК и может отражать интенсивность репаратив-ных процессов. Кроме того, с помощью дифференциальной окраски сестринских хроматид стало возмоетым изучение отдельных субпопуляций в культуре клеток.

Рост количества природных мутагенов привел к поиску физиологичных для организма веществ, способных снижать или предотвращать образование хромосомных повреждений. К числу подобных протекторов относится и интерферон (ИФ), имеющий следующие преимущества: "интерферон - продукт самой клетки, поэтому введение его в организм безвредно; ... защитное свойство интерферона про-

является как дроткв фааяческн?., так и против химических мутагенов, характеразуюдихся рааличныьи механизмами взаимодействия с ДНК; антпцутатензая активность пктерферонов проявляется не только при индукции ^роыосошшзс аберраций, но и при формировании СХО (в отличие от рдда шогчвских протекторов)"(Г.Д.Е'асухика и соавт., 1966).

Известно, что защитные свойства ИФ оироко варьируют при разной интенсивности процессов клеточного метаболизма. В связи с достаточно актуальным является более подробное изучение его протекторного эффекта в группах "генетического рнска", в том числе, у (Зольных с ослабленной иммунной системой. К одной из таких групп цоано относта группу бхчьных бронхиальной астмой аллергической этиологии ( ЗЬгсиигдгъ л/.,1970;А^лгй,1977; Леев , 1978 ;А.Г. Опарин, 1986).

Предпосылками для проведения подобного исследования явились работы Ю.Я.Керкиса и соавт. (1574,1977); С.В.Скоровой и соавт. (1976); Т.Ф.Сарклсян (1384), в которых показано четкое повншзггае количества хромосомных аберраций в клетках при аллергических заболеваниях.

Цель и Бадачи исследования. Цель настоящей работы заключается в исследовании защитных свойств ИФ в зависимости: от времени введения ИФ, от вида используемого лейкоцитарного ИФ (натиь-ного ж рекомбинантного); от стадии клеточного цикла, на которой вводились мутагены (алкшшруодие .соединэния-тиоТЭФ и фотрин),от их "центровости" и концентрации, а также от, исследуемой группы - здоровых доноров и больных бронхиальной астмой (БА).

При этом решали следующие задачи:

1. Сравнительный анализ индивидуальной чувствительности хромосом в клетках бальных БА и здоровых доноров при воздействии исследуемых веществ.

2. Изучение защитных свойств лейкоцитарного природного (ос) и рекомбинантного ( - ИФ в культурах лимфоцитов доноров, прошедших предобработку мутагенами тиоТЗФ и фотрином на стадии Сг клеточного цикла.

3. Выявление концентрационных зависимостей защитного эффекта, рекомбйнантного ИФ прл обработке культур лимфоцитов больных БА и здоровых доноров мутагена!ли на разных стадиях клеточного

■ цикла.

Научная, новизна я практик ска я значимость« В результата проведенных экспорт,ангов показаны определенные различия в дг.то-гонатическом эффекте обоих видов лейкоцитарного ИФ. Дрп ввэд-зтшг: ira разных сроках культивирования клеток (до, после п од-

новременно с мутагенами) аэцитннй эффект по критерию CZD валилон только лрл его одновремонном воздействия с мутагенами.

Более четкий протекторный эффект ИФ просле.чиваатся при анализе ХА. При вводении обоих видов ИФ в клетки на 48-ом част культивирования показано "четкое спигеняе частоты ХА, шгдуцзрозгнких хиоТЭФ и фотрипом ка стадии v> клеточного цикла.

Показано, что антикластогешшэ свойства-Кф sэ зависят от "цзнтровостп" мутагенов, пдцуцирущих цитогвпетические поврэлдз-нзя.

Нэ выявлено достоверных раатачпй з чувствительности хромосом при сравнительном исследовании индукции и модификации ХА и СХО между больными бронхиальной астмой и здоровыми донорами. Тагам образом, в клетках больных бронхиальной астмой нэ отмэчэно повышенной ломкости хромосом и хромосомной нестабильности.

При изучении концентрационпнх зависимостей о^-ЙФ по тесту ХА быявлон оптимальный эффект антикластогена при концептрацяях мутагенов, индуцирующих в среднем до 25-303 аберраций хромосом.

Полученные результаты исследований свидетельствую? ей отсутствии значительной индивидуальной вариабельности защитного эффэк-та ИФ в исследованных группах лиц, а такза о целесообразности использования конкретяшс тест-систем з культурах лимфоцитов человека для оценки эффективности различных классов модификаторов, в частности, перспективности дальнейшего исследования защитного эффекта ИФ.

Положения, выносите на| защиту:

Анализ антикластогенных свойств лейкоцитарного ИФ в культуре лимфоцитов человека при индукции цитогенетичэских повреждений химическими мутагенами тиоТЭФ и фотрином.

Изучение раатичий между видами используемого - природного и рекомбинантного - ИФ, при введении его на разных стадиях клеточного цикла , при использовании разных концентраций обоих мутагенов.

Способ опенки индивидуальной клеточной чувствительности патогенетических показателей к действию химических мутагенов и

протектора в.культурах лимфоцитов на примере группы больных бронхиальной астмой в сравнении с группой здоровых доноров.

Апообатшя работы. Основные материалы диссертации долсжеяы на всесоюзном симпозиуме "Актуальные вопросы профилактики наследственных б слезней" в г.Вильнюсе (1986); на заседаниях секции "Человек и биосфера" ШПСГКНГ в г. Орджоникидзе (1986) ив г.Ереване (1987); ш всесоюзном симпозиуме "Объем и методы гено-токсической оценки побочных эффектов биологически активных веществ" в г.Ленинграде (1989).

Д£Й22£31Ш- Полученные результаты исследований, представленные в диссертационной работе, изложены в 6 печатных работах.

Объем д структура .тг^ог-^рт^таи, Диссертация состоит из введения, обзора литературы,'.описания материала и методов, трех глав, посвященных описанию полученных результатов, обсуждения, общего заключения, выводов и библиографического указателя. Работа изложена на 124 страницах, содержит 35 рисунков и 25 таблиц. Список литературы включает 132 наименования (из них 59 на иностранных языках).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом во всех экспериментах служила цельная периферическая кровь вдоровых доноров и больных атонической форйой бронхиальной астш (ЕА). Донорами служили больные и здоровые лица в возрасте от 20 до 40 лет.

Культивирование лгайогштов. Лимфоциты культивировали по общепринятой методике {.Ишгдея-^огх^ 1965). Культивирование проводили в течение 76-ти часов при температуре 37°С. Перед взятием крови в пробирки вводили разведенный гепарин из расчета 0,6 мл на 10 мл крови.

Стимуляцию культур проводили с добавлением фитогеммагглю-тинина (ФГА) фирмы "Р" из расчета 0,02 мл на 10 мл куль-туральной сыэся.

Окрашивание препаратов. Для анализа количества хромосомных аберраций препарата окрашивали адур-эозином.

. Для дифференциальной окраски сестринских хроматид в клетки на 28-ом часу культивиро":лия вводили 5-броадезоксиуридин (ВДУ) в конечной концентрации 10 мкг/мя.

Препараты окрашивали двумя способами: по методу А.Н.Чебо-,

тарева и соазт. (1978) с применением акридинового ораусгевсго, а такте по методу ФПГ, предложенному P&vuf (1974).

"агоя плтогвн^тического агалкза. Препарата анализировали с помощью светового микроскола L&itz. Tass Pius прп увеличении 10x100 яри масляной гммэрсид. . . .

Полученные данные фиксировали в специальных протоколах.

Учитывала следующие цитогзнзтическлз показатели: частота аберрантных клеток (з %), общее число разрывов, число одиночных и парных разрывов хромосом, чиело хрояатщцшг обмзпов - зсэ показатели приведены sa 100 клеток.

Подсчитивачи число СХО на клетку при акалиЕэ 25-40 изтафаз на каддый вариант.

Всего в данной работе проакалаггровано 23.000 !,этафаз/_"

Б работе исследованы клэточнно культуры от 12пар больных ЕА и здоровых доноров, что прп соответствующем колтпзстео просмотренных клеток от каддого епдтэидл удовлетворяет задачам исследования.

Автор благодарит к.м.н. М.З.Шрагатсгл га предоставление для патогенетических исследований крона дкагпостзроЕапяаг банных БД. Пульмонологического Центра.

Описание .использованных веществ. Для изучо:яя актпкласто-генного эффекта интерферона в качество кутагохгов кспсяьгох-'ллл алкилирувдие вещества - тиоТЭФ л фотран. .

В качестве протектора использовали лейкоцитарной И-?, являющийся специфическим белком, сингэзаруекш в клотксг организма в результате воздействия вирусов.

По своему происхокдению лейкоцитарный ИФ подразделяют ка натпвккй или природный ( cL -КЗ) и рекомбинантннй ( аЦ-ИФ).

Б экспериментах исследовала антикластогенную активность ИФ в зависимости от времени его введения - до , после и одновременно с мутагенами. Конечная активность ИФ в клеточных культурах составляла 37 и 50 МЕ/мл.

Охета введения.веществ. I. При исследовании антикластоген-ного эффекта ИФ культуры обрабатывали мутагенами на стадии & • клеточного цикла, эксперименты проводили по следующей схег.э. За 0-ом часу (до стимуляции культур ФГА) в культуры вводили мутагены: тиоТЭФ - в концентрациях О.гБЛО""^; О.бЯО-4?.!; 0,75*Ю~4а и 1,0«Ю-41.5 и фотрин - в концентрациях О.гб^О-4!,? ц

0,75 Через час мутагены отмывали. ИФ добавляли в культу-

ры на 48-ом часу (ряс.1а).

2. Защитный г-ффехт ИФ изучен также при введении мутагенов па стадиях О} - £ клеточного цикла. При этом об-ИФ и г^утагены вводили в культуры па 48-ом часу культивирования без дальнейшего става (рис.16). Мутагены брали в следующих концентрациях: гиоТЭФ. - 1,0 -10"5И; 2,0 • 3,0»10~^М и фотрин - 0,25Л0-5?>!; 0,5-Ю-5Н и 1,0»10_5и.

3. При увеличении на временной шкала разброса точек введения протектора и мутагенов (с добавлением последних на стадиях

- глоточного цикла) была приманена схема опытов с предму-тагзнной обработкой культур о^-ИФ (рисЛв).

+ЕДУ..

+мутаген

отшв

мутагена

+ФЕА

-1ч. Оч. +ЕГА

28ч. +Ш

48ч. +ИФ

+мутаген

76ч.

Рис.1а

Рес.16

Оч.

+ФГА н-ИФ

28ч, +БДУ

48ч.

+ыутаген

76ч.

Рис.1з

Оч.

28ч.

48ч.

76ч.

Рис.1. Используемые в работе схемы введения веществ.

Статистический аначиа. При статистической обработке полученных результатов использовали двухфакторный дисперсионный

анализ и критерий £ на микроЭВМ НР-41С.

Вся статистическая обработка выполнена

СОДЕРЖАШЕ РАБОТЫ

I. Сравнительное изучение антикластогенных свойств природного и рекоыбинантного интерферонов

Защитные свойства ИФ изучали в культуре лимфоцитов здоровых доноров, обработанной мутагенами на стадии О клеточного

цикла (до введения 2ГЛ), когда культура представлена в влдэ однородной популяции клеток. Полученные при подобной обработка результаты давт более объективную информацию о иэханашах куга-генного эффекта исследуемых алкалируюшдх бощэстз.

ИЗ активностью 50 ¡АЕ/глл вводили в чувстплтольпый к дойст--протектора дерпод на 48-см часу культивирования (за' 28 часов до фиксации).

На урозпэ индуцяровазных фотрином а тноТЗФ аберрантных тафаз наблюдался сходный антикяастогэнный эффект как природного, так и рекомбинантного ИЗ (рис.2,3).

Нз ВЫЯ313Н0 различий в модификации обс:з:2 типаст ИЗ уровней аберрантных мэтафаз, индуцированных как тпоТЗФ, так а фотрином.

Однако, с увеличение« числа аберрантных г,:зтафаз, индуцгро-ванпых мутагенами,' защитный эффект обоях вядоз 115 усиливается (р<0,01).

При введэнгл з культуры ы. -КЭ ггэ окгэчялосъ «злапая частота схо.

При добавления в культуры <^¿410 во есэх вариантах, крюлэ фотрина в концентрации 0,75.10"%, наблюдалось повггтзвпэ уровней СХО (рис.4-5).

По всей видимости, введение оС^КЭ на 48-стл часу, прцзсдят к нарушению процесса рекомбинации ДНК с вояшсгсеэнпзм ясеих повреждений, реализующихся в СХО, которые возникает дзаяды: на 0-ом часу - под воздействием мутагенов, и на 48-ом часу культивирования - с введением

оС-И5 не Еызынал значительного аз-танэндл количества С,10, что, вероятно, свидетельствует о более вырагэншх аптиклзстоген-ннх свойствах об -ИФ в сравнении с оС^-ИФ.

Исходя пз отмеченного вышэ, моеяо сделать вывод о недостаточности защитных свойстз о(.,-ИФ для модификация СХО, индуцированных мутагенам на стадии О клеточного цикла.

2. Изучение антикластогенных свойств оС-'ЛЗ в зависимости от концентрации используемого мутагена

Защитные свойства о^-ИФ изучены при индукции ХА и СХО мутагенами на стадиях С^-Ъ клеточного цикла. Во' всех экспериментах мутагены и протектор вводили в культуры одновременно,на

- с -

30 25 20 {15 ю Ь 5

аберрантные мета/разы (6%)

к

а ося.

сш-ю-^м

г-н []

[1

N [4

Ж

а ,йх. 0,5-10 М

и

>■■ 1 1\М

Ь'. л! Л

С..;

а оч 0,75-Ю''* $

Г (

Г- ■ {

И

а

1,0-Ю"А|Т" тиоГЭФ

а.кончентрац,

Рис.2. Антикластогенный эффект природного ( оС) и рекомби-нантного IИФ на уровне АМ, индуцированных тиоиз«

30 25

20

15

10

аберрантные мета<разы (6%)

- 1

СИ Вариант, £ез ИФ Ы Вариант, с ИФ

а

0,25-Ю

%

а о£г концентрация контроль (ротрина

Рис.3. Антикластогенный эффект природного ( с*-) и рекомби-

нантного ( оСд) ИФ на уровне АМ, индуцированных фотринсм.

/ли из клетку

I

7 I

СП Вариант,баз ИФ СП вариант, с ИФ

Я£г;пл> (. с;,) П.» ш

сскрсжсго С оС) л рзкс

¿.«и

СХО на кд-зглки

20 ■15 •10 5

I - и

п.

Л

н

!

: -1 V-.!

□ (Ьряшет. о

Г«.-:- -.д

ид Сйр;ЮКП1, С !'(ф

га Ш

а* „ а а а, кони.

0,25-Ю-М 0,75<0^М контроль1, фотрина

Рис.5. Цитогенетичесмй эффект природного ( оС) и секомйи-

вантного (ИФ на уроЕнэ СХО, индуцированных фотринсм.

48-ои часу культЕваровапгл.

Б хеедой серая опытов параллельно всследсеада культуры лимфоцитов здоровых допоров и больны:: БА.

При всех исследуемых концентрациях мутагенов паблпдался достоверный аетпкластогенннй эффект ©й-ИФ на уровне ХА (р<0,01). Однако, с увеличением концентрации обоих мутагенов протекторше свойства КФ становились более четкими (рис.6,7).

Достоверность защитного эффекта о£ь-ИФ на уровне аб^рра^п-еих мзтафаз в группах здоровых доноров и больных ЕА при .ссгх исследуемых концентрациях мутагенов подтверждена на основе дзух-факторпого дисперсионного анализа.

Исходя из полученных результатов можно заключить, что оС£-ИФ (при введении его в культуры на стадиях б р - 5 меточного цикла) обладает модифицирунцим эффектом на уровне СЮ, индуцированных мутагенами. Однако, лееь прд высоки концентрациях мутагенов отмечался достоверный антккластогенный эффс-кт ИФ в клетках больных и здоровых лиц при анализе всех исследуемых дар (рис.8,9). В остальных случаях наблюдалось незначительное снижение уровней СХО. Статистически достоверный защитный эффект ИФ на уровне СХО в клетках больных и здоровых доноров отмечался при яндукщш цитогенетических повреждений тиоТЭФ в концентрации 3,0-10"^, (р 4.0,05), а в группе здоровых доноров - еще к при концентрации фотрина 1,0'Ю~°М (р -¿0,05).

При проведении цитогенегического анализа контрольных вариантов культур от здоровых доноров и бальных БА не выявлено достоверного повышения о^-КФ спонтанного уровня ХА, у больных составляющих 3-4$ А!.!; а у здоровых - 2-ЗаАМ.

Спонтанные уровни СХО у больных составляли 4,9-5,7, у здоровых - 4,2-4,9 СХО на клетку, с введением об^-ИФ эти значения достоверно не изменялись.'

Таким образом, при индукции ХА тиоТЭФ и фотрином на стадиях (т ^ - 5 клеточного цикла антикластогенный эффект сс^-Ш наблщдался при всех исследуемых концентрациях мутагенов. Однако, при концентрациях, индуцирующих до 25-30? аберрантных клеток, протекторный эффект оС^-ИФ становился более выраженным.

Аналогичным образом изменялись защитные свойства сС^ЛФ при анализе СХО. В культурах от здоровых доноров о^ИФ досто-- верно сникал частоту СХО, индуцированных средними концентрация-

20 15 Ю 5

аберрантные метафазы (6%)

1

2 ; у\ у 1

ш

У: ]

А

В

I

1

II

И

I

ПШЗЗонор.без ИФ Е2 больной, Без ИФ

ЕНЗ Варианты с ИФ

I

/1Л

М я

11 Й_■

I

Н

м

Б пары сбслеЭоВанных лиц

6. Ангикластогеняый эффект ^ИФ на уровне АМ, при концентрации тиоТЭ±> 3,0-10 в культурах лимфоцитов больных и адороЕых.

30 25 20 15 Ю 5

аберрантные метафазы (8 %)

т т-

I

А

0

В

2,

Рис.7. Антикластогеншй эффект оС^-ИФ на уровне АН, при концентрации фотрина 1,0 в культурах лимфоцитов" Сольных и здоровых.

аиных лиц

25 20 45 Ю

5

СХО

но клетку

I

I

Я..*

'А ■

Ш

СП донор, без ИФ И больной,-без ИФ ЩГ! варианты с !4Ф

1.-1 i

( :

в- . : ' ■?

Г.;

Ь /

Ъл

т

I!

II

'А I

' / :

/С'- ! >/ ) V

ы

Б С Б ..пасы оъсхчЪ:.

'о « - « г., Ьан1-!ь];с лиц

Рис.8. Антикластогеннып эффект о^.-ГД га уровне ОлО, при концентрации фотркёа 1,<М<Г°Ц-в культусах тф-цитов больных и здоровых.

25 20 <5 .10 5

СХО

на клетку

Р

щ Ы

оонор,оез п-1 .сл больной, без ИФ бариашпы, с

I Й!

ж

к-'!

I 1

► .1

У^Л

А- 1

'У- ■■

УУ' .г

/•

/*' -

И '

Ь

В С И пары сбслеао-

Рио.Э. Ангикластогенный эффект с^-ИФ на даннык. лиц уровне СХО, при концентрации тиоТЭФ 3,0'Ю~П1 . в культуре лимфоцитов больных и здоровых.

:гп мутагенов, но при высоких концентрациях - наблюдался более четкий Еятикластогешшй эффект о^-ИФ в культурах лимфоцитов как здоровых, таге и больных ЕА.

3. Выявление индивидуальных различий в чувствительности клеточных культур бальных бронхиальной астмой л здоровых доноров к мутагенному воздействию и защитному эффекту интерферона-

Исследован защитный эффект о^-ИФ на разных стадиях клеточного цикла. С этой целью о^-ИФ .вводили как на стадии G- (на 0-см часу), так л на стадиях S j- S клеточного цикла вместе с мутагенами (па 48-ом часу культивирования).

Предварительная обработка оС^-ИФ проводилась с целью язуче-тая его антикластогснлЫХ свойств при увеличении разброса точек введения мутагенов и протектора с изменением последовательности их воздействия.

Следует отметить, что швду культураг.ш клеток здоровых доноров и бальных ЕА па обнаружено достоверных различий. В то ке время, яри двух сроках введения otz-41Ф, в обоих группах выявлен четкий актикластогенный эффект сл^-КФ (р<0,01).

Повреждения, реализуемые в СХО, изменялись менее однозначно. ИФ, введенный на 48-ом часу, достоверно снинал частоту СХО, индуцирозанных тиоТЗФ и фотркном. При введении оС^Ш на стадии G-'0 не наблюдалось снижения уровней СЖ).

Результаты исследования антиклаЪтогенного эффекта ос^-ИФ при разных сроках его введения в культуры лимфоцитов здоровых доноров и больных ЕА, обработанные тиоТЭФ и фотркном, представлены в таблицах.I и 2.

Порученные результаты подтверждают приведенные выше данные о том, что с увеличением разброса точек введения мутагенов и защитные свойства последнего на уровне СХО ослабевают (табл.3).

Таблица' I

Индивидуальная чувствительность клеток здоровых доноров к воздействию мутагенов и антшиастогенному эффекту оС^-ИФ (при разных сроках его введения)

Варя- тиоТЗ'5 Фотрин

ант ............. .................—»

сбра- количест- общее чис- СХО на коллчаст- -общее чес- СХО на

ботки во абер—. ло разры- клетку во абер- ло разрк- клетку

оаатных вов на 100 рантных нов на 100

клеток клеток клеток клеток

(••) (%)

введение о^-ИФ на 0-о.м часу культивирования

А 24,0 24,0 19,4 25,0 26,0 21,5

А + КЗ 10,0 10,0 19,8 13,0 13,0 17,8

В 28,0 28,0 18,2 29,0 30,0 25,1

В + тт-и »¿V 12,0 12,0 20,6 10,0 10,0 21,3

С 27,0 27,0 22,1 31,0 32,0 22,3

С -(- 9,0 9,0 20,3 13,0 13,0 16,0

В 29,0 30,0 23,6' 28,0 28,0 22,3

Бн- 13 11,0 11,0 20,8 ■ 10,0 10,0 18,5

Е ведение оС^-КЗ на 48-ом часу культивирования

Е 27,0 27,0 - 9П П , ПО л , и -

Б + 115 •15,0 " 15,0 - 10,0 10,0 -

■п 28,0 28,0 ' 18,5 26,0 25,0 18,0

т> 4 + 12,0 .. 12,0 13,4 . 18,0 - 18,0 1С,7

Сг 18,С 18,0 17 ,9 ' 23,0 28,0 20,5

0 + 13,0 13,0 12,5 14,0 14,0 13,5

п 29,0 29,0 20,1 27,0 23,0 20,6

н + 13,0 13,0 14,2 12,0 12,0 12,5

I 26,0 25,0 24,5 .31,0 35,0 от 1

I + 115 12,0 12,0 13,4 23,0 23,0 12,3

3 29,0 30,0 22,9 30,0 35,0 21,0

.3 т 11,0 11,0 13,8 12,0 12,0 12,4

. Лгпмзчанпэ: Лагинсхимл буквами обозначены исследованные

Таблица 2

Индивидуальная чувствительность клеток больных ЕА к воздействию мутагенами и антикластогеяному эффекту о^- ИФ (при разных сроках его введения)

Бари- тяоТЭФ Фотрин

ант обработки количество аберрантных клеток {%) оощее число разрывов на 100 клеток С'Ю на' клетку -количество аберрантных клеток {%) общее число разры-• вов на 100 клеток "й£о на ■клетку

введение о^-ИФ на 0-ом часу культивирования

А 27,0 27,0 23,1 31,0 • 32,0 24,8

А + I® 12,0 12,0 22,0 12,0 12,0 19,9

В 27,0 27,0 19,8 30,0 31,0 24,4

3 + № 11,0 11,0 22,1 9,0 9,0 19,2

С 30,0 30,0 24,8 24,0 24,0 24,1

С + КФ 10,0 10,0 22,7 9,0 9,0 21,9

I) 27,0 29,0 23,1 32,0 32,0 22,1

В + ИФ 10,0 10,0 12,4 8,0 8.0 18,9

введение оС^-ИФ на 48-ом часу культивирования

Е 29,0 29,0 — 27,0 27,0 -

Е + ИФ 13,0 13,0 - ■ 11,0 11,0 -

Р 25,0 26,0 20,5 24,0 24,0 20,1

Р + ИФ 13,0 13,0' 14,6 20,0 20,0 13,2

• 0 ■ •25;0 25,0 18,5 29,0 29,0 21,6

'6 + ИФ 13,0 13,0 13,4 16,0 16,0 14,2

н 26,0 27,0 22,4 28,0 " 28,0 21,8

Н + ЙФ 14,0. ' 14,0 16,5 13,0 13,0 13,0

I 28,0 28,0 21,8 27,0 ' 27,0 19,5

I + ИФ 10,0 10,0 14,8 12,0 12,0 12,4

3 29,0 . 29,0 23,3 25,0 26,0 21,2

2 + ИФ 11,0 11,0 15,2 12,0 12,0 13,6

Таблица 3

Антикластогенвый эффект oCj-КФ (при разкнх сроках его введения) на урозш онтогенетических параметров, индуцированных мутагенами -- тиоТЭФ и фотриногл на стадии G-i - S клеточного цикла

Группа исследуемых лиц Время введения CL,- ИФ Ангикластогенный эффект действия ося-ИФ

на уровне IA на уровне СХО

Здоровые доноры 0-ой час 48-ой час + -н- +

Больные ЕА 0-ой час 48-ой час т — +

4. Общее загсгочэшэ

Лейкоцитарный ИФ в культурах лимфоцитов здороаах доноров и больных атонической формой ЕЛ оказывал достоверный антакласто-генный эффект на разных стадиях клеточного шпиа при индукции цитогенетических довреждешй хемячэскеш щтагвваип.

При сравнении модифицирующего эффекта природного ( ) и рекомбинанткого ( cCj) иф, сс^-ИФ оказзлся мэкзэ вффэктявяым модификатором уровней СХО. Так, при обработка культур мутагенами на 0-ом часу, <хА-ИФ, в' отличие от сх -ИФ (при введении их на 48-ом часу культивирования), повышал уровни СХО.

Анализ частоты ХА выявил достоверный защитный эффект сс-ИФ и о^-ИФ при действии всех исследуемых концентраций обоих мутагенов.

Согласно данным литературы, природный et -ИФ лучше способствует репарации повраздензй ДНК, индуцированных катрозогуаниди-ном в сравнении с о^-иф (И.М.Васильева и соавт., 1986).

Подобное различие ыеаду свойствами двух видов ИФ подтверждается при индукции разрывов хромосом широким спектром концентраций нитрозогуанидина (1,2,3,5,10 мхг/кя). "Стабилизирующее" дейстаие сХ-ИФ отмечалось при всех исследуемых концентрациях мутагена, в то вреда как в опытах с «%-ИФ такой закономерности не наблюдалось (Т.П.Швецова и соавт., 1987).

Подобные различия в протекторных свойствах oí и о^-ИФ показаны и при их сравнительном анализе на уровне ¿a vivo в культурах больных синдромом Марфана (Е.Л.Якубовская и соавт., 1988).

При изучении патогенетического эффекта ИФ разных типов отмечались защитные свойства лимфобластоидного ИФ на уровне структурных мутаций хромосом, индуцированных 8-метоксиисораленом, посредством образования мзанитевых сшивок ДНК (Г.П.Македонов и соавт., 1989).

Фибробластический ИФ также снизал уровни ХА и СХО, индуцированных как быстрыми нейтронами, так и 4-нитрохинолин -I -оксидом (Г.Д.Засухина и соавт., 1986).

Г.Д.Засухина и соавт. (1987) показали более эффективную защиту клеточной ДНК со стороны рекомбинантного ^ -ИФ по сравнению с лейкоцитарным нативным сС-ИФ.

Антимутагенный эффект % -ИФ наблюдался в культуре крови работников нефтехимической промышленности. Авторы отмечали защиту на уровне геномных мутаций, полиплоидных: клеток, параллельно с понижением митотического индекса (С.Лалчев, М.Цонава,1988).

При изучении эффективности защитных свойств ИФ в зависимости от времени введения в культуры мутагенов и протектора нами показано, что, с увеличением расстояния между точками введения этих веществ антиклаотогенные свойства о^гИФ на уровне СХО ослабевают. Однако, при одновремэнном введении : с^-ИФ и мутагенов, на 48-ом часу культивирования, отмечалось достоверное снижение частоты СХО. По всей видимости, при единовременном введении" мутагенов и оС^-ИФ, поБреЕдения, реализующиеся в СХО, возникают одномоментно.

При введении мутагенов на О-ом часу, а о^^-ИФ на 48-ом, отмечена тенденция к повыпению урознэй СХО, что объясняется возникновением'повреждений, реализующихся в СХО дважды: при введении мутагенов и при введении ИФ.

Аналогичным образом можно объяснить и отсутствие модификации уровней СХО при введении обд-ИФ на 0-ом часу, а мутагенов на 48-ом.

Однако, Ю.С.Лазутка (1987) подобный эффект ИФ объясняет его способностью задергивать митотический цикл клетки. Для определения истинной причины неизменности уровней СХО при предвари-

тельном введении (на О-ом часу) о^-ИФ,необходимо четко оценит его воздействие на клеточную пролиферацию.

Что касается модификации частоты ХА, то при любом резппмэ введения мутагенов и протектора нами отмечался достозэрннд ан-тикластогенный эффект как оС-ИФ, так и о(,-ИФ.

Разница в модификации уровней СХО рекомбинантным ц природным ИФ обусловлена его природой. Так, ос -ПФ-продукт более чем 10 геноз, что обуславливает его более универсальные протекторные сзойства, в то время как рекомбинантный -о^-ИФ - продукт синтеза одного гена.

Изучая зависимость атикластогенного эффекта <*.-ИФ от концентрации используемого мутагена, выявили, что защитный эффект Ж> становится более выраженным с увеличением концентрации мутагенов.

Б работе Т.П.Швецовой (1983) достоверный защитный эффект ИФ отмечался при концентрациях 4-НХО, вызывающих уровень аберраций не выше 6-9$. Автор объясняет такио экспериментальные условия (невысокая концентрация'мутагена - 2,5-10"^! и низкая активность ИФ - 25 МЕ/мл) стремлением избегать изменений в ми-тотяческой активности клеток, так как ИФ стимулирует клеточную, пролиферацию (Г.Д.Засухина и соавт., 1982).

Однако, при увеличении .концентрации мутагена ИФ Т.П.Швецова (1983) наблюдала аналогичное цротекторное действие ИФ активностью 375 МЕ/мл. Таким образом, и в случае возможного угнетения митотической активности клеток наблюдается защитный эффект ИФ. • _

3 наших экспериментах ИФ оказывал защитное действие в культурах ¡теток при индукции мутагенами до 25-30$ аберрантных метафаз. Для дальнейшего исследования антикластогенных свойств ИФ мы рекомендуем брать концентрации мутагенов, индуцирующих достаточно высокую долю аберрантных клеток в культурах здоровых доноров.

Аналогичным образом защитные свойства оС^-ИФ проявлялись и в культурах лимфоцитов больных БА, обработанных разнима концентрациями мутагенов. И здесь прослеживалась закономерность более выраженного антикластогенкого эффекта ИФ. при енсоких концентрациях обоих мутагенов, как на уровне ХА, так п на уровне СХО.

В то не время, в культурах лимфоцитов здоровых доноров и больных БА на выявлено различий в чувствительности хромосом к действию мутагенез и ИФ. На основании полученных цитогенетичес-1СЕХ данных мокно заключить, что при бронхиальной астма аллергической этиологии нз наблюдается позьппенной чувствительности хромосом к действию мутагенов и модификаторов, таюке как и не выявлено различий в спонтанных уровнях ХА и СХО по сравнению со здоровыми донорами.

Приг.1эненная наг,ш тест-система с максимальным разбросом точек введения мутагенов и протектора, позволила оценить эффективность ИФ независимо от возможного взаимодействия с исследуемыми мутагенами - тиоТЭФ и фотрином.

Вэ выявлено различий в антикластогенном эффекте ИФ в кле -точных культурах при действии тиоТЭФ (одноцептровый мутаген) и фотрнка (многоцентровый мутаген). Это свидетельствует об отсутствии зависимости протекторного эффекта ИФ от центровости используемого мутагена.

Следует предположить, что в кагдом тесте, при различных условиях'культивирования для данного комплекса воздействия, наблюдается определенное соотношение разных механизмов действия протекторов.

ВЫВОДЫ

Исследовался актикластогенный эффект природного ( Ы.) и рекомбикантного ( с^) интерферонов ка уровне ХА и СХО, индуцированных" тиоТЭФ и фотрином ка разных стадиях клеточного цикла в культурах лимфоцитов здороЕкх доноров и больных атонической формой бронхиальной астмы.

1. Лейкоцитарный природный и рекомбияактный интерферона достоверно снижали уровни аберраций хромосом, индуцированных мутагенами (тиоТЭФлфотрином) на стадии О клеточного цикла в специальной тест-системе, рассчитанной на оптимальное выявление эффекта модификации.

2. Сравнительное изучение модифицирующих свойств рекомби-нантного ИФ при разных сроках его добавления (до, после и одновременно с мутагенами) показало, что по критерию СХО защитный эффгкт с^ИФ проявляется лишь при его одновременном введении с

кутагенами. В то же время на уровне ХА. антшсластогенный эффект сХ^ИФ проявлялся вне зависимости от времени его введения.

3. Изучение концентрационных зависимостей для аберраций -хромосом и СХО при разных концентрациях алкшшрувдих' веществ выявило оптимальный эффект антикластогенного действия ИФ при концентрациях мутагенов, индуцирующих до 25-30$ аберраций хромосом.

4. Антикластогенный эффект ИФ не проявлял зависимости от "центровости" мутагена, индуцирующего цитогенетические поврек-дешя в культурах клеток как здоровых доноров, так и больных бронхиальной астмой.

5. Сравнительное исследование индукции и модификация ХА и СХО в клетках больных бронхиальной асФмой и здоровых доноров ко выявило достоверной разницы внутри исследуемых групп и шзду ними.

6. Исходя из результатов исследований моепо подтвердить отсутствие большой индивидуальной вариабельности в защитном эффекте ИФ и подтвердить как целесообразность применения специальной тест-системы в культуре лимфоцитов человека для оценки различных классов модификаторов, так и перспективность дальнейшего исследования защитного эффекта интерферона.

Основные положения диссертации опубликованы в работах:

'I. Арутюнян P.M., Саркисян Т.Ф., Мовсесян Э.С., Оганесян Г.Г. Тестирование физиологичных для организма протекторов в • культуре лимфоцитов человека //Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума "Актуальные вопросы профилактики наследетвеиных болезней". Вильнюс. - 1986. - С.7-8.

2. Саркисян Т.Ф., Мовсесян Э.С. Уровни oC-1-актитрипсина и патогенетических показателей в клетках больных аллергией //Тезисы докладов секции генетических аспектов проблемы "Человек и биосфера" Ш1СГКНГ, г.Орджоникидзе, 1986. - C.I26. •

3. Саркисян Т.Ф., Арутюнян P.M., Мовсесян Э.С. Протекторный эффект интерферона-.в культуре лимфоцитов здоровых доноров //Тезисы докладов секции генетических аспектов "Человек я биосфера" шпешп:, Ереван. - 1987. - C.I4.

4. Саркисян Т.Ф., Арутюнян P.M.,- Мовсесян Э.С., Засухи на Г.Д. Протекторный эффект интерферона в культуре лжлфоцитов че-

- -

лозека, обработанных таоТЗФ а фотонном до яг стимуляции //Патология, I98S. - 30. - .'а 12. - G.T49I-I434.

5. Саркисян Т.Ф., Аруткяян Ыозсзсяя S.C., Aûp.v/лц Л.Г. Оценка кодификаторов хигяи*«-:яого мутагенеза с учетом pear, репаратизкых процессов //Тезисы докладов Боесоязксго симпозиума "Объем и методы гепотоксаческой оценка и побочных гфгэкгов отологически активных взпзстз. - Ленинград. - 1Э8Э. - С.63.

6. Мовсесягг Э.С., Саркисян Т.®., Арутакяя Р..М. Илгсгрнзтз-ческий эффект естественных модификаторов М7тзгзкеза з культуре лимфоцитов человека. Сообщение П. Дэйсгзпз Ш úl/-jLZ'ío 3 клзт-ках больных бронхиальной астмой д здоровых доноров //¡литология и генетика, IS90. - 24. - Га 2. - С.21 -24.