Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генотоксический эффект формальдегида у млекопитающих и человека

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генотоксический эффект формальдегида у млекопитающих и человека"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

КИТАЕМ

ЛЮДМИЛА ВИКТОРСШНА

ГЕКОТОКСИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ ФОРМАЛЬДЕГИДА У МЛЕКОПИТАЮЩИХ И ЧЕЛОВЕКА

03.00.15 "Генетика"

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Д I ^х. У-

Санкт-Петербург 1996

Работа выполнена в СашуПете. зургской государственной ме-дащтокой академии им. й.И.МеЧйикоаа.

Н&учше руководители: доктор медицинских наук, профессор ПузыревА.А.

доктор биологических наук, профессор Шварцман П.Я.

0|йги»алъные оппоненты: доктор йбабйёвветх наук, чл.-корр.

ЙЕН" Худолей В .В. кандидат биологических наук, ст.в.с. Сяоэина Н.М.

Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательский институт генетика и разведения сельскохозяйственных животных.

Задта состоятся " ш-о-НЛ* 1ЭЭ6г в * ^^ часов й& а&седшш диссертационного совета Д. 063.57.21. по защите досвдащй кь соисканий ученой степени доктора биологических мук % Санкт-Йетербургскш, тудормвенном университете по адресу »169 034, г.Санкт-Пе^рбДО, Университетская наб., д.7/9, ШГУ»

С »тртяюй ысшо ознакомиться в научной баблиотеге Сш^т-Петер^ургсхого государственного университета.

Автореферат разослан *Л§п Рмрцд.ээег

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАШРИСШКЛ РАБОТЫ

Актуальность исследования. Формальдегид /ФА/, будучи естественным метаболитом в организме млекопитающих и человека, в то же время является одним из самих распространенных генотоксикантов воздушной и водно;: с.реды. В крупных промышленных городах, в том числе" в Санкт-Петербурге, концентрация ФЛ в окрухающег человека среде постоянно повышается /Экологическая обстановка в С.-Петербурге,1993, 1994/ и, например, в I9S2 году в 8-4 раза превышала ПДК в атмосферном воздухе, хотя принят»?' уровень ПДК в нашей стране ниже, чем в других странах Дилов,Тиунов,1994/.

ФА как мутаген известен давно /Рапопорт,1946/ и достаточно хорошо изучен на модельных объектах -дрозофиле, микроорганизмах, а также непосредственно на ДНК in vitro /ка,Harri3 1988/. Однако, до настоящего времени генотоксическое действие ФА на млекопитающих и человека недостаточно изучено. К моменту начала нашей работы такие данные практически отсутствовали. В накопившихся к настоящему времени сведениях с мутагенном и канцерогенном эффектах ФА /ка, Harris ,1988; ХудолеЙ,1993; Lucas,1994/ лишь ничтожная часть исследований связана с практически наиболее важным воздействием ФА в газовой пазе. Практически отсутствуют сравнительные данные о гено- щ токсичности с строго и хронического воздействия ФА, которые тослу-гт1лк бы выявлению роли адаптивных механизмов становления его эффекта.

На дрозофиле показана зависимость генетического эффекта ФА от рациона литания / Auerbach, uoser,I953; Шварцман и др. ,1981/. Эта практически ванная зависимость, косвенно свидетельствующая о механизмах деГ.ствия ФА, не изучена у млекопитающих.

Актуальным такке является сравнение мутагенного действия ФА на клетки млекопитающих la vitro и in vivoи в последнем случае его эффективности на разных системах клеток.

Практически не изученным является вопрос о дифференциальной чувствительности клеток к Ф*. на разных стадиях штотического цикла.

При исследовании генетической активности ФА у млекопитаицих и человека в разных работах использованы различные критерии оценки -аберрации хромосом, сестринские хроматмдные обмены /СХО/, микроядра/ Нам практически не встретилось ни одно? работы, где би выше указанные критерии использовались одновременно. В то же время их сравнительный анализ т'ог бы дать более детальное представление о,

генетическом действии ФА.

Цель исследования. Цель настоящее работы - получить достаточно полную картину об особенностях генотоксического действия ФА при ингаляционном его воздействии в концентрациях, приближенных к ПДК в воздухе рабочей зоны, и сопоставить частоту различных событий в клетках, возникающих la vivo и in vitro в зависимости от стадии клеточного цикла.

Задача' исследования.

I.Изучить цитостатическое и генотоксическое /хромосомные аберрации, СХО/ действие ФА на клег..и in vitro при его введении в различные сроки культивирования лимфоцитов периферической крови человека.

2.Оценить клгзтогенную активность ФА /структурные повреждения хромосом и микроядра/ ь соматических клетках человека /лимфоциты периферической крови и клетки буккального эпителия/ и сравнить с результатами, полученными в экспериментахia vitro .

3.Изучить временную кинетику мутагенного действия Ф£ в клетках костного мозга экспериментальных животных после однократного воздействия в у ловиях контрастного по содержанию белка в пшце-

, вом рационе.

4.Изучить и сравнить влияние ФА при длительном воздействии на соматические и половые клетки самок крыс.

Научная коризна. Выявлен значительный цитостатический эффект ФА в экспериментах на лимфоцитах периферической крови человека in vitro > подтвержденный на этой se системе клеток la vi-то. Выявлено также повышение частоты хромосомных аберраций. Показана идентичность по частоте и спектру хромосомных повреждений при сравнении цитогенетической активности ФА in vitro и in vivo . В силу выраженного, цитостатического действия ФА, препятствующего выявлению аберраций хромосом у ладей, контактирующих с ним в производственных условиях, более'адекватным критерием оценки ге-нотоксзческого действия ФА оказалась оценка частоты клеток с микроядрами в буккадьном эпителии.

Не выявлено- различий в частоте эпителиоцитов с микроядрами между студентами после однократного контакта с влажными ФА-соде-ржащими анатомическими препаратами и преподавателями кафедры нормальной анатомии, длительно /хронически/ контактирующих с данным агентом.

У млекопитающих при остром воздействии выявлено значение белкового рациона в регуляции мутагенной активности ФА.

Впервые для млекопитающих показано, что ингаляционное воздействие ФА на самок после скрещивания их с интактными самцами приводит к цитопатическому эффекту на ранних этапах дробления эмбрионов. ______

Практическая значимость. Показано, что при ингаляционном воз- -действии ФА на уровне ПДК индуцирует в соматических клетках млекопитающих и человека длительно сохраняющиеся нарушения хромосом /структурные повреждения хромосом, анеуплоидные клетки, микроядра/. В связи с этим в ШИ Медицины Труда АМН РФ были направлены материалы /совместно с Куйбышевским филиалом НПО "Гигиена и профпатоло-гия"/ для корректировки ПДК ФА в воздухе рабочей зоны производственных помещения.

Полуденные нами результата позволяют рекомендовать микроядер: ый тест в клетках буккального эпителия для более широкого использования при обследовании людей, контактирующих в производственных условиях с ФА л другими химическими веществами.

Апробация работы. Материалы работы были представлены на 17 и У съездах Всесоюзного общества генетиков и селекционеров шл.Н.И.Вавилова /Кишинев, 1982, Москва, 1987/, на Всесоюзном съезде медицинских генетиков /Киев,1964/, на заседании секции генетических аспектов проблем "Человек и биосфера" /Орджоникидзе,1986/, на Все-россиГском обществе гигиенистов и санитарных врачей /Ленинград} 19Г1/. на заседании Проблемной комиссии СПб ГМА /Санкт-Петербург 1989,1996/, на Герценовских чтениях '1995/', на 25-ой ежегодной конференции Европейского общества по мутагенам окружающей среды /Нидерланды,199 5/.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов ис-ледования и их обсуждения, общего заключения, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 5 рисунками-и 22 таблицами. Спи-рок литературы включает 124 отечественных и-158 зарубежных источников.

СОДЕРЕАНИЕ РАБ01Ы

Материал и методы.

Изучение цитогенетической активности ФА в лимфоцитах пешФеп-ческой крови человека. Культивирование лимфоцитов проводили по общепринятой методике /доогЬеаа вt и.. ,1960/. В экспериментах . при введений ФА в культуру клеток использовали венозную кровь здо-

ровых доноров в возрасте 20-30 лет, не контактировавших с вредными агентами. Свежеприготовленные растворы ФА /исходная плотность 1,09 кг/м3/ вводили в различные сроки культивирования. В первой серии экспериментов ФА в концентрации 10,0; 5,0 и 2,5 от/л вводили до стимуляции лимфоцитов, а также на 24, 48 и 51 часах культивирования. Экспозиция с ФА составляла 4 часа. Лимроциты фиксировали через 54, 72, 76 и 92 часа от начала культивирования. Во второй серии i гспериментов ФА в концентрации 0,025 и 0,0125 мг/л вводили на 50, 56 и 68 часах культивирования, что соответствует Gp 3 Ио2 периодам второго клеточного цикла /Sasaki , Norman ,1966/. Для учета КО за SO часов до фиксации в культуру лимфоцитов доба- „ вляли 5-бровдезоксиуридин /БУДР фирмы jerax / в концентрации 10,0 мг/мл. Экспозиция ФА в данной серии экспериментов составляла 2 часа, Лимфоцита фиксировали на 72 часу культивирования. После соответствующего экспонирования клетки 2-3 раза отмывали раствором Хонкоа и помещали в свежую культуральную среду. Эксперименты прово* дили в 2-3 повторностях.

Изучение мутагенного эффекта у лиц, подвергающихся воздействию ФА, прово-чли у р Зочих /5 женщин, 10 муалн/ в цехе по синтезу ФА на НПО "Азот" г.Новгорода /средний возраст 38,0 лет, стаж работы 9,7 лет/ и у преподавателей кафедры нормально? анатомии /6 женщин, 2 мужчины; средний возраст -41,6, стач работы 17,2 лет/ Санкт-Петербургской государственной медицинской академии.,Концентрация ФА в цехе на момент взятия материала составляла 1,2-2,2мг/м9 /ЦИК в воздухе рабочей зоны -0,5 мг/м3, Германова,1982; Зарембо и др.,1986/. Контрольную группу составили 6 человек, не контактировавших с производственными вредностями, средний возраст -28,5 лет.

Для анализа хромосомных аберрация препараты окрашивали Азур-эозином по Романовскому. Исследовала по 100 ыетафаз от каждого индивидуума. Учитывали все типы аберраций. Пробели в качестве повреждений не регистрировали. Для дифференциального окрашивания хро-матид /анализ СХО в культуре лимфоцитов/ использовали методику Perry, Wolff /1974/. Анализировали по 40 метефаз г каздой пов-торности. При учете хромосомных повреждений определяли местоположение разрыва или обмена согласно методике Levaa , Nichol /1964/. При анализе препаратов проводили учет анеуплоидных клеток. Проли-феративную активность лимфоцитов определяли, подсчитывая число митозов на 1000 клеток.

Изучение генотоксического эффекта ФА в впителиоцитах слизистой оболочки лолости рта. Проведено популяционное исследование спон-

таннсяч уровня частоте микроядер в клетках буш ли:ого эпителия у 91 подростка /39 юношей к 52 девушки/ в г.С.-Петербурге.

Влияние '>Л на частоту микроядер изучали у преподавателе'' кафедры нормально? анатомии СПб ГГДА. /5 ..¡ужчин, 8 женщин; сродни" возраст 51,2 года, ста- работы 24,6 года/. Контрольную группу составили 7 человек, ке контактирующих с-производственными вредностям, средни? возраст -45,7 лет. Втору?) трупу обсл.дуемнх лпдсу составили студента I курса /б мужчин и 6 женщин; средни/, возраст 10,0 лет/. Соскобн из полоста рта брали до первичного контакта о влах-нш/и ФА-содернащи.'ли анагог чески»! препарата:.™ к спустя г 4 л 48 часов после воздействия. Контакт с ФА составлял 40 минут.

Мазки висудовалп на воздухе, гТиксировали в этанол-уксусном фиксаторе /3:1/ и окрашивали по Фельгену. Анализировали по 2-3 тыс. клеток от кагдого индивидуума.

Изучение мутагенного действия ОА з клетка/ костного мезга г.гг.г.. Эксперимент проводили на половозрелых дамках крнс линии Вистар /масса 180-200г/ из питомника Рапполово. Всего было использовано 110 яивотн«х. Животных в специальных затравочных камерах подвергали однократному или длительному воздействию ФА4 концентрацию которого контролировали весовым методом, однократное воздействие ФА /экспозиция 4 часа/ проводили как при нормальном рационе .'концентрация ФА -а! мг/м3/, так и в контрастных условиях питания крыс /концентрация ФА -20 • т/гл3/ - при белковое дефиците к при добавлении в корм пекарск":-: дрогшей из р«.счети х5г ка крысу ежедневно. До воздействия ФА крисн находились ка районах з точение 7 суток и после до взятия материала 24, 48, 72 и 9С час .в.

При д л тельном ингаляционном воздействии ФА в концентрациях 0,5 и 1,5 1.5г/м3 кивотные находились в камер .х ежедневно по -£ часа /кроме выходных дне"/ в течение 4 месяцев. Материал брали через 48-72 часа попе воздействия ОА. Препараты готовили к окрашивали стандартным методом Д"акграгор,Варли,198б/.

Исследование пктопатп .ескнх изменеш-.Г половнх клетках пш длителтчом ингаляционном воздействии ФА. Использовали тех ме самок крыс лилии Вистар, у которых брали косный мозг для исследования повреждений хромосом. Состояние половых клеток оценивали по способности их к оплодотворению непосредственно после окончания воздействия Ф.'., по количеству эмбрионов, элиминпрулднх в течение 72 часов беременности с учетом морфологических особенностей к:-: дегенерации. Для этого самок на стадии эструс одаривали с кнтакт-ннш5 самцами и через 48-72 часа /до фиксации меток косткодо :.:оз-

га/ эмбрионы извлекали из яйцеводов.

Статистическую обработку получен-чх данных проводили с к -пользованием классических методов - "хи" квадрат и критерия Стькщента. Для сравнения частот клеток с микроядрами между контрольными и опытными группами использовали критерий Стьвдента с предварительным преобразованием Фримана-Тьгоки /Глотов и др., 1983/

РЕЗУЛЬТАТЫ' ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУШКЕ

Патогенетическая активность ФА в культуре лимфоцитов периферической крови человека in yttro .

Предварительное эксперименты были посвящены подбору концентрации ФА и оптимальных сроков фиксации для данно? клеточной культуры. При концентрации 10,0 мг/л ФА оказывал цитостатическое действие на лимфоциты человека в культуре -митотическиГ. индекс равен О. В концентрации 5,0 мг/л при введении г различные часы культивирования ФА также вызывал цитостатический эффект. Незначительное количество метафаз удалось проанализировать лишь при введении ФА в данной концентрации на 51 часу и фиксации клеток на 76 часу, культивирования. Количество ме*-афаз с аберрациями составило 28,6/5 /Р< 0,05/. Структурные повреждения хромосом были, представлены хрома-тидными Делениями и обменами. Половина проанализированных клеток содержала хромосомы, в которых наблвдалась деспирализация в области центромеры.

При использовании концентрации 2,5 мг/л и введении ФА в разные сроки культивирования также наблюдался цитостатический эффект. Лишь при введении ФА перед началом культивирования /стада-1 с / и фиксации клеток на 92 часу удалось проанализировать небольшое количество метафаз, 12,которых содержали хромосомные аберрации, представленные хроматидными делениями, разрывами в области центромеры. Такае пр/введении ФА в данной концентпации на 48 часу и фиксации на 76 часу наблюдалось достоверное повышение числа клеток со;, структурными повреждениями хрор'^сом - % /?< 0,001/. Выявлены как аберрации хроматидного /65£/, так и хромосомного /изохро-матидные де."еция/ типов. Обнаружено появление большого количества полиплоидных клеток - 11,9$ ъ значимоз увеличение числа анеупло-вдных клеток /?*■ 0,001/.

Во второй серии экспериментов на одних и тех же культурах проведено изучение геиотоксического действия ФА /хромосомные аберрации и СХО/ при введении на 50, 56 и 68 часах Культивирования с использованием концентраций 0,0125 и 0,025 мг/л. Показано, что ФА

увеличив^ число клеток с повреждениями хромосом при введении р Gj hS фазах клеточного цикла /рис.Г/, существенно не влияя на частоту хромосомных аберраций при введении на G стадии. Вдавлено, что ФА во 'всех вариантах данного эксперимента увеличивал как повреждения хроматидного, так и хромосомного типов. Их соотношение колебалось в зависимости от времени введения ФЛ в культуру клеток. Показано также, что внутрихромосомнне разрывы преобладали над межхромосомными. Анализ распределения разрывов по хромосомам и группам хромосом в зависимости от относительной дли;.; выявил, что разрывы распределяется неслучайно - избыток попрр-эде-ни1*' обнаружен в хромосомах 3 и 16, В хромосоме 3 разрывы в основном /6СЙ/ был;: локализованы в середине плеч, а в хромосоме 16 -в теломерном рагоне длинного плеча /90%/. Эти дешше свидетельствуют о наличии в'геноме человека своеобразных "горячих точек" ФА-индуцированного мутагенеза.

Увеличение геномных мутаций отмечено только при введении ФА на 56 часу культивирования /Р<0,05/.

Исследования при введении в культуру л\".мфоцитов ЕУДР'а выявила, что ФА достоверно снижал количество СХО при введении на 50 и 56 часах от качала культивирования по сравнению с контролем /Р л 0,05/. Ан лиз распределения СХО мезду хромосомами в контрольных культурах и при введении ФА выявил различия в числе обменов. Распределение СХО по хромосомам б контроле соответствовало литературным данным /Чеботарев,1935; Crossen et а1-Д977/ - избыток JX0 наблюдался в хромосоме 2 и хромосомах групп В и С. При воо-це^ствии ке ФА отмечено перераспределение в геномо точек, вовле-¡енных в СХО. При том же уровне, как в контроле, или дате при снижении частоты СХО их появление преимущественно связано вновь 3 хромосомами 3 и 16. В хромосоме 3 преимущественная локализация СХО в середине плеч, а в хромосоме 16 - в при^ентромерном районе длинного плеча.

; При одновременном учете частоты СХО и частоты.хромосомных аберраций в клетках, меченных БУДР'ом, выявлен сенсибилизирующий к ФА эффект БУДР'а. Анализ структурных повреждений хромосом ■ при введении ФА на 50 часу культивирования /с^ -стадия/ обнаружил увеличение в 2 раза числа метафаз с аберрациями по сравнению с клетками без БУДР'а /Р<0,05/. По спектру повреждений хромосом 90fc структурных аберраций составили повреждения хроматидного типа /делеции и обмены/ с вовлечением хроматид, содержащих БУДР в

двух нитях ДНК.

Таким образом, изучение цитогенетическо/'. активности ФА выявило, что данный агент оказывает презде всего цитостатическиГ; эффект и увеличивает частоту повреждений, регистрируемых как структурные Меррация хромосом. В то не время ФА не способен индуцировать поврездоикя,. регистрируемые как СХО.

Отметим, что ФА являемся обязательным продуктом метаболизма. Образуют Лея ia vi-vo ФА в исключительно короткие сроки инакти-вируется ферментами биотрансформ'ацшг ксенобиотиков, в частности, форм&яьдегкддегидрогеназой /Парл,1973; Голиков,IS86; A.^,tfepr,I989 и др./ Бее описание выше события in -vitro происходят при кон- ■ центрадаях ФА, близких к тем, которые достигаются в крови человека /2,6 мкг/ш..' в результате Обменных.процессов /неск » Casanova ,1904/. '

Генотоксическое действие ФА в лимонитах лтаей из группы рис-

Щ..

Проведен анализ частоты меток с аберрациями хромосо" у рабочих и преподавателей, профессионально /длительно/ контактирующих с ФА. Показано, ïto при фиксации меток на 48-50 часу культивирования наблюдалось отсутствие митозов у всех индивидуумов. Наличие стимуляции г. трансформации лимфоцитов при деГствии ФГА отмечено по присутствии бластных клеток, среднее число которых у лвде£ группы риска составило 2,1%, в контрольной группе - 46$. Аналогичные результаты обнаружены у 5 рабочих при фиксации лимфоцитов на 72 часу культивирования, среднее количество бластов у них состарило 2,7$. Незначительное число метафаз удалось проанализировать толы о у 8 рабочих. Средняя частота клеток с аберрация:.® составила 5,4$. Обнаруженные "повреждения хромосом были как хроматидного^ так и хромосомного типов с преобладанием последнего /62$/. Выявлено достоверное увеличение числа анеуплоид-ных клеток у рабочих по сравнению с контголем /Р<0,05/". Оценка пролиферативной активности ФГА-стигулированных лимфоцитов показала существенное сникеьие /в 10 раз/ митотическогэ индекса по сравнению с контролем /Р <0,001/. Таким образом, в связи с цито-статическкм эффектом, который является эффектом "первого плана" в экспериментах in vitro . не удалось в достаточной гзре оценить мутагенное действие ФА при длительном ингаляционном воздействии у ладей из групп риска.

Опенка частоты микроядер в клетках буквального эпителия у

¿гаде ft t

Проведен рчалиэ спонтгчной частоты микроядер /Ш/ в эпителиоци^ах слизистой оболочки полости рта у жителей С.-Петербурга. Не выявлена связь частоты Ш с полом /мужчины -0,69/5«, женщины -0,675?«/ и возрастом /в контрольно?" группе яеытн -45,7 лет-.частота !АЯ - 0,64/2®/.

Результаты анализа МЯ после однократного контакта с ФЛ-содержащи-I.— влачнытли анатомические препаратами у студентов представлены в табл.1.

Таблица I.

Частота клеток с !'Я в бухкалъном эпителии студентов в разные сроки после однократного контакта с ФА-содержащими анатомическими про-тами.

Пол Количество человек Контроль Через 24 ч. Черея 48 ч.

исследовано кле ток клеток с т.%. исследовано кле ток клеток V- исследовано кле ток клеток с^ЛЯ,

МУЖ жен 6 6 13000 12000 0,77 0,58 17000 17200 2,02 * 2,59" 14г00 14000 1,86 ,2,64**

Примечание: * -Р <0,05; ** -Р <0,01.

Показано, что у студенток частота онтогенетических нарушений через 48 часов после контакта с ФА сохраняется на более высоком уровне, чем у студентов-мужчин. Выявлены также ..оловне различия по количественному содержанию Ш. 7 мужчин через 24 часа после контакта с ФА эпителиоциты с 2 и более МЯ обнаруживались в 23% от общего числа клеток с Ш, в то время как через 48 часов они отсутствовали. У студенток ке клетки с множественными Ш составляли 12 и 24$ через 24 и 48 часов соог-зтственно.

Дальнейшие исследования'подтвердили обнаруженные закономерности. У преподавателей кафедры нормальной анатомии, длительно контактирующих с ФА, средняя частота эпителиоцитов с МЯ составила: у мужчин -„ 1,18$?., у женщин -2,94$. /Р < 0,01/. /Табл.2/.

Таблица 2.

Частота клеток с МЯ в буккальном эпителии преподавателей кафедры

нормальной анатомии.

Пол Количество человек Стаж работы /контакт с ФА/ Возраст исследовано клеток Частота клеток с Шф.

контр. кен. муас. 7 8 .5 0 23,6+3,1 25,6+5,1 45,7+4,4 52,1Й .,5 50,4+5,0 14000 18000 11000 0,6ч 2,94 ** ■ 1,18

Примечание: достоверные различия /Р <0,01/.

Таким образом, как при однократном, так и при длительном воздействии ФА вызывал повышение числа клеток с !.П и числа МЯ на клетку. Выявлены половые различия - более чувствительными к воздействий ФА как среда преподавателей, так и среди студентов, оказались женщины. Наиболее интересным фактором является то, что доли клеток с МЯ у студентов после разового контакта с ФА и у преподавателе!! после длительного с ним контакта оказались сопоставимы.

Таким образом, изучение кластогенного эффекта ПрИ дозах, получаемых людьми на соответствующих производствах и при профессиональном контакте с ФА-содержащими влажными анатомическими препаратами медицински^ работнш ов и студентов, показало отчетливое превышение частоты нарушений генома, проявляющееся в снижении пролифера-тивной активности, в повышении частот хромосомных и геномных мутаций в лимфоцитах периферической крови, а также в повышении частоты эпителиоцитов с МЯ. В сравнительном плане при использовании разных тест-систем можно заключить, что метод учета МЯ в клетках слизистой оболочки полости рта i мониторинге генетических последствий контакта с некоторыми агентами может оказаться более рентабельным и перспективным.

Питогенетическое действие ФА после однократного ингаляционного воздействия на йоне различного содержания белка в рационе.

6 период с 1987 по 1993 годы проведено исследование частоты спонтаннгх хромосомных нарушений в клетках костного мозга животных /текущий контроль/ при изучении мутагенной активности ряда химических соединений. Использовано 139 нелинейных кгыс /105 самцов и 34 самки/ и 22 крысы линии Вистар /пf II самцов и самок/. Не выявлено различий по частоте метафаз со структурными повреждениями хромосом и по количеству анеуплоидных клеток между нелинейными и линейными кивотн'ши, а также между самцами и самками. /?>0,05/. На этом материале проведен анализ частоты хромосомных нарушений в зависимости от времени года. У самцов не выявлено сезонных изменений ни по частоте метафаз с аберрациями хромосом, ни по количеству анеуплоидных клеток. В то же время у самок отмечено достоверное увеличение числа аберрантных метафаз /Р < 0,05/ и снижение числа анеуплоидных клеток /Р<0,05/ при сравнении весна-зима, что, вероятно, связано с гормональной регуляцией репродуктивного цикла у самок и с сезонными особенностями ее изменений.

В условиях нормального по содержанию белка в пище при концентрации ФА 31 мг/м3 через 24 часа после воздействия наблюдали цито-статический эффект - митотический индекс был равен 0. Через 48

часов обнаруживалось значимое его снижение /Р < 0,05/, а через 72 . часа наблюдалось его увеличение /Р < 0,05/ "о сравнению с контрольной группоР животных. Через 48 и 72 часа после воздействия обнаружено значимое /в 3 раза - 4,2 и 6,0% соответственно/ повышение числа метафаз со структурными повреждениями хромосом по сравнению с контролем /Р<0,05/. Аберрации хромосом были представлены хрома-тидными делениями и парными фрагментами. На препаратах было выявлено значительное количество клеток со "слипаниями" хроматид. Указанные клетки были отнесены к числу аберрантных. Основную долю /96%/ составляли внутрихрэмосомные "слипания", из них 81,3?» -продольные.

В экспериментах с избытком и недостатком белка в пищевсм рационе концентрация ФА составляла 20 мг/м3. В первом случае кластоген-ное действие ФА было выявлено через 24 часа /метафазн с аберрациями хромосом штос метафазн со "слипаниями" и декомпенсацией хроматина/ и сохранялось до 96 часов после воздействия /метафазн со "слипаниям" и с деконденсадаей хроматина/. Соотношение поьревде-ний по типам было следующим: через 48 и 24 часа наблюдалось повышение числа аберраций как хроматидного, так и хромосомного типа, тогда как через 72 и 96 часов основную долю составляли хроматидные делешга. Среди"слипаний" существенную долю /65,8#/ составляли вну-трихромосомнне, а из них 68% -теломерные.

Пролиферативная активность клеток костного мозга была достоверно ниже /Р < 0,05/ на всех сроках взятия материала за исключением 72 часов, когда митотический индекс соответствовал уровню контроля*

В условиях недостатка белка в пище у опытных животных геноток-сический эффект ФА был выявлен лишь через 72 часа после воздействия /метафазы с аберрациями хромосом плкз клетки со "слипаниями" и с деконденсацией хроматина/ /рис.2/. Через 96 часов повышение мутагенного действия ФА наблвдалось за счет увеличения числа мета-фаз со "слипаниями" и с деконденсацией хроматина. "Слипания" в данной серии эксперимента были в основном внутрихромосомнче /70$/, из них по 50% теломерные и продольные.

Митоть веская активность клеток костного мозга при дефиците белка в рационе была снижена лишь на 96 час после воздействие ФА.

При анализе распределения числа идентифицированных разрывов по хромосомам и группам хромосом показано, что оно достоверно отклоняется от случайного /Р< 0,05/. Во всех экспериментах при различных рационах питания обнаружен избыток повреждений в хромосоме I с преимущественной локализацией в теломерном сегменте.

*

Время культивирования (часы)

□ КОНТРОЛЬ min бш.лаТЗкОНТРОЛЬ та* бета ИФА+min белка /а/ ШЗФА-Hnin белка /б/ ОФА+тах белка /я/ РфА+тах белка Д;/

Рис.2. Изменение частоты генетических повреждений в клет-кат костного мозга крыс после однократного ингаляционного воздействия ОА в концентрации 20 мг/м3 на фоне контрастного по белку рациона, /а/ -клетки с аберрациями хромосом; /б/ -клетки с аберрациями хромосом + клетки со "слипаниями" и нарушепяем конденсации хроматина.

[□контроль □ [ФАН),0125 а[ФА]=0.025]

Рис.1. Изменение частоты метафаз со структурными повреждениями хромосом в культуре лимфоцитов периферической крови человека при введении ФА в различнее сроки культивирования и ------------ --------------------

Не обнаружено влияния характера питания на изменение частоты ане-уплоидных клеток.

Таким образом, результаты исследования влияния рациона на геноток-сичность ФА после однократного воздействия свидетельствуют о модифи-ЗФ^ищем действии алиментарных факторов. При высокой концентрации ФА имеет место цитостатическое действие, в сравнимых концентрациях наблюдается задержанный эффект ФА в условиях недостатка белка в пище.

Цитотоксические нарушения в соматических и нитопатичпские изменения в половых клетках млекопитающих после длительного ингаляционного воздействия ФА.

Костный мозг брали у беременных самок через 2-3 суток после окончания хронического воздействия ФА /на 2 и 3 дни беременности/. Не было выявлено значимых различий по аберрантным клеткам внутри указанных групп; в связи с чем результаты цитогенетического анализа были сумми-рог-гны /та^л.З/,

Таблица 3.

Частота хромосомных повреждений и анеуплоидии в клетках костного мозга беременных крыс, подвергавшихся воздействию формальдегида.

Кон-ция Ц 3 mt/Mj Кол-во проанализированных метафаз Число клеток с аберрациями; % Число аберраций на 100 метафаз Число анеупло-идныт клеток, Xi Зх Митотичес-кий индекс

хрома-тидных хромосомных

0 600 0,3 0,3 7,2+0,73 5,0+0,3

0,5 785 2,4* 2,3* 0,2 11,7+1,60* 4,2+0,2

1.5 625 4,0*" 2,7 * 1.6 - 13,6+1,40* 6,7+0,3

Примечание: -достоверные отличия от контроля /*Р <0,05;»»Р <0,01/.

Обнаружено достоверное повышение числа метафаз со структурными повреждениями хромосом как при концентрации ФА 0,5 мг/мЕ /ПДК в воздухе рабочей зоны/, так и 1,5 мг/м3 /концентрация, которой подвергались рабочие на НПО "Азот"/. В отличие от лимфоцитов периферической крови человека - условиях воздействия ФА как In vitro *, так я in vivo . в клетках костного мозга крыс, подвергавшихся длительному ингаляционному воздействию ФА в концентрациях, близких к ПДК, не отмечено снижения митотическои активности. В то же время уровень хромосомных аберраций у них был сопоставим с таковым у рабочих, длительно контактирующих с ФА.

В концентрации 0,5 мг/м3 ФА не вызывал нарушения репродуктивной

функции у самок, т.е. не бы..о отмечено изменения характера астрального цикла, не было выявлено изменений скорости развития эмбрионов ни на 2-е, ни на 3-й сутки беременности, что проявлялось в одинаковом соотношении в указанные сроки зародышей, находящихся на различных стадиях развития. В то же время при концентрации 1,5 мг/м3 на 3-й сутки после оплодотворения наблвдалось достоверное повышенна числа дегенерирующих зародышей по сравнению с контролем, Наиболее характерными формами нарушения морфологии зародышей было уменьшение их размеров, а также появление признаков нарушения структуры /зернистость цитоплазмы, сморщивание ее, пикноз ядер/ в одном или нескольких бластомерах.

Таким образом, изучение последствий ингаляционного воздействия ФА на млекопитающих и человека показало, что он оказывает цитоге-нетическое и цитопатическое действие на различите клеточные системы. На уровне высоких концентраций преобладает его цитостати-ческий эффект. На уровне концентраций в несколько раз превышающих или сравнимых о ЦЦК Наряду с цитостатическим проявляется и гено-токсическое его влияние, длительно сохраняющееся после однократного и длительного, воздействия.

ВЫВОДЫ.

1..В культуре лгчфоцитов периферической крови человека ФА в концентрации 10,0,'5,0 и 2,5 мг/л при введении его в различные сроки культивирования вызывает цитостатический эффект. При введении ФА в культуру клеток в концентрациях 5,0 и 2,5 мг/л наблвдалось так же выраженное геногоксическое его действие, проявлявшееся в увеличении частоты метафаз со структурный»! повреждениями хромосом, числа анеуплоидных и полиплоидных клеток.

В концентрации 0,0125 и 0,025 мг/л онтогенетическая активное* ФА выявлена при введении его на 50 и 56 часах от начала, культиви роваиия. ФА индуцирует повреждения как хроматидного, так и хромосомного типа.

Анализ распределения повреждений по хромосомам выявил "горячие" точки разрывов -избыток их в хромосомах 3 /срединная часть плеч/ » 16 /теломерный район/.

2. Не выявлено возрастания частоты СХО при введении ФА в различные сроки культивирования в концентрации 0,025 мг/л, а при концентрации его 0,0125 мг/л обнаружено достоверное снижение их частоты по сравнению с контролем при одновременном повышении частоты хромосомных аберраций. БУДР оказывает сенсибилизирующее дейс-

твие л ФА на стадии о1 клеточного цикла. При этом спектр структурных повреждений смещаетсг в сторону образования аберраций хро-матидного типа.

3. У людей, контактирующих с ФА в производственных условиях, в -лимфоцитах периферической крови подтвержден цитостатический эффект как эффект "первого плана", который не позволяет в достаточной мере оценить мутагенное действие ФА. Среди клеток, преодолевших блок пролиферации, частота метафаз с аберрациями составила 5,4+1,9$ по сравнению с 1,8+0,6$ в контроле.

4. Проведено популяционное исследование частоты клеток с МЯ р эпи-телиоцитах слизистой оболочки полости рта у жителей С.-Петербурга. Не выявлено связи спонтанно»! частоты клеток с МЯ с полом я возрастом.

5. Обнаружено 3-4 кратное превышение частоты клеток с ТОТ у студентов посль однократного острого контакта с влажными ФА-содержащи-ми анатомическими препаратами. У преподавателей кафедры нормальной анатомии, длительно контактирующих с ФА, частота клеток с МЯ также в 4-5 раз превышает таковую в контроле. Причем, ФА увеличивает не только частоту клеток с МЯ, н^ и количество МЯ в поврежденных клетках. С учетом цитостатической активности ФА можно заключить, что микроядерный тест в данном случае является рентабельным и перспективным.

6. Анализ частоты структурных поврсздений хромосом у контрольных животных выявил половые различия спонтанного мутационного процесса в зависимости от сезона года. Повышение частоты генетических повреждений у самок наблюдается весной, в то время как у самцов частота хромосомных аберрациР существенно не изменялась в течение года.

7. Острое ингаляционное воздействие ФА вызывает существенное повышение частоты хромосомных аберраций в клетках костного мозга крыс. Обнаружено, что содержание белка в рационе способно модифицировать цитогенетические эффекты ФА. У животных, получавших избыток белка, повышение числа клеток со структурными повреждениями хромосом наблюдалось-через 24 часа после воздействия ФА, в то время как в условиях недостатка белка в пище наблюдалась задержка его генотоксических эффектов.

8. При длительном /в течение 4 мес/ ингаляционном воздействии ФА в концентрациях, близких к ЦДК в воздухе рабочей зоны, у экспериментальных животных выявлено повышение как частоты цитогенетичес-

ких повреждений в клетках костного мозга, так и цитопатические изменения в половых клетках, ведущие к нарушению эмбрионального развития.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕЖ ДИССЕРТАЦИИ

1. Изучение хромосомных повреждений в лимфоцитах человека при действии формальдегида.I.Обработка формальдегидом лимфоцитов в культуре.// Цитология, 1982,J£9,с. 1056-1059 /в соавт. с П.Я.Шварцманом/.

2. Хромосомные аберрации и обмены сестринских хроматид при действии формальдегида на лимфоциты человека.// 1У съезд ВОГиС.Тез.докл. Кишинев,1982./в соавт. с Т.В.Гришанкиной.Н.И.Качуриной/.

3. Изучение цитогенетической активности формальдегида в клетках человека и млекопитающих.// I Всесозн.съезд мед.генетиков,Киев,1984, с.226 /в соавт.с Н.М.Качуриной.Н.В.Решетовой,П.Я.Шварцманом/.

4. Цито^енетические эффекты формальдегида в клетках человека и млекопитающих.// Тез.докл.на заседании секции генетических аспектов проблемы "Человек и биосфера",Орджоникидзе, 19%,с.f8 /в соавт. с Шварцманом П.Я./

5. Мутагенное действие формальдегида у млекопитающих и человека

¿д vitro и la vivo и проблема порогово" дозы мутагена.// Тез.докл. У съезда.ВОГиС,Москва,1987,т.I,с.122-123.

6. Токсико-гвнвшческал оценка формальдегида при ингаляционном воздействии.// Гиг.сан., 1988,№5,с.75-76 /в соавт. с П.Я.Шварцманом/.

7. Цитопатические и цитогенетические эффекты хронического ингаляционного воздействия формальдегида на женские половые клетки и клетки костного мезга крыс.// Цитология, 1990,»12,с.I2I2-I2I6 /в соавт. с Китаевым Э.М. ,Пименовой М.Н./

8. Морфофункциональные и Цитогенетические изменения в тканях различных органов при воздействии факторов окружающеГ среды.// Отчет за I99I-I995 гг.инв.М 08950004077,с.15-23.

9« Geno toxic effect of formaldehyde on human cells in vitro end in vivo.// 25th annual meeting of the European environmental mu-.tagen eociety,l995, Hoordwijkerhout, Netherlander.249 /with She-loiwva L.,Mikheeva E»,Shvartsman p./