Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генотоксические и антимутагенные эффекты рибонуклеазы Bacillus intermedius

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Генотоксические и антимутагенные эффекты рибонуклеазы Bacillus intermedius"

КАЗАНСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО эАСКОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ МЕНИ В. И. УЛЬЯНОВА-ЛЕНИНА

211

, I

На правах рукописи

ИВАНЧЕНКО Ольга Борисовна

ГЕНОТОКСИЧЕСКИЕ И АНТИМУТАГЕННЫЕ ЭФФЕКТЫ РИБОНУКЛЕАЗЫ ВАСИЛЛДБ ШТЕКМЕЩиБ

03.00.07 - микробиология

• Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

КАЗАНЬ - 1993

Работа выполнена в лаборатории биосинтеза и биоинхензР! Ферментов Казанского ордена Ленина и ордена Трудового Красноп Знамени государственного университета им. В. И. Ульянова-Лею

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор, академик АН РТ И. Б. Ленинская

кандидат биологических наук с. н. с. О. Н. Ильинская

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Б. А. Тарасов

кандидат биологических наук, доц. н. Н. Амирханова

Ведушая организация : институт экологии и генетики

микроорганизмов уро ран

Л^/А^ЬЗ 1993 г. в {V

Зашита состоится 1993 г. в час о;

на заседании специализированного Совета К 053. 29. 19 в Казанском ордена Ленина и ордена Трудового Красного знамени государственном университете ин. В. И. Ульянова-Ленина по адресу: 420003, Казань, ул. Ленина, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотек им. н. и.Лобачевского казанского государственного университет, им. В. и. Ульянова-Ленина по адресу; чгооов.Казань, ул. Ленина,35 Автореферат разослан 1993г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук А. Н. Аскара

Актуальность дроблены. Биологически активные вещества природного происхождения в настоящее'вреня успешно конкурируют в практике с соединениями, синтезированными химически.

Разрабатываемая для использования в медицине в качестве противовирусного (Жданов. 1984) и противоопухолевого средства (Березов. 1972). рибонуклеазa Bacillus lntermedlus, предлагаемая также к использованию в качестве ростостииулятора в биотехнологии и сельском хозяйстве (Захарова и др.. 1939.1991; Егоров и др.. 1989.1991).достаточно полно изучена с точки зрения структуры, биосинтеза, биохимических, каталитических свойств (Яковлев и др. ,1979; Balaban et al.. 1980). Токсические свойства Фермента на культуре клеток и на уровне целостного организма представлены в работе Сергеевой (1991).

Теи не менее закономерности взаимодействия экзогенных нуклеаз с живой клеткой и вопросы мутагенного действия чистых белков исследованы недостаточно. Известно, что окончательный ответ клетки на действие чужеродного соединения будет обусловлен всем многообразием ответных реакций. Происходит ли проникновение экзогенного чужеродного фернента в клетку; как осуществляется контакт Фермента с мембраной; как функционирует в данной случае система вторичных мессенджеров; прямо или опосредованно происходит возникновение повреждений в ДНК - все эти вопросы относятся к проблеме создания полной картины последовательных этапов мутагенеза, вызываемого экзогенными бедками. Бактериальные системы оценки генотоксичности в этон плане кажутся более заслуживающими внимания, чем мы привыкли считать. Конечный определяемый параметр - генотоксичность может служить значимым показателей всей цепи реакций клеточного ответа. Кроме того, классические исследования дозо-зависимых эффектов редко проводятся в области малых концентраций, где зачастую наблюдаются труднообъяснимые эффекты, изучение которых в свою очередь может внести свой вклад в цельное представление о механизме взаимодействия фермента с клеткой.

В настоящее время известно немало случаев, когда мутагены в малык дозах проявляют аятимутагенные эффекты. Следовательно. особый интерес представляют исследования низких концентраций белковых препаратов, предлагаемых к использованию в каче>-Т5с лекарственных.

На сегодняшний день практически не установлены точные механизмы действия на клетку многих биологически активных веществ, предлагаемых для широкого практического использования. Бактериальная рибонуклеаза, как препарат, имеющий широкий спектр полезного в практическом понимании действия, нуждается в установлении детально определенного механизма взаимодействия с хивой клеткой, начиная от первичных контактов с кэмбралэй, кончая воздействием на геном. Потенциальные возможности данного препарата изучены далеко не полностью: возможность применения РНКазк как антивирусного препарата имеет определенные перспективы в борьбе с таким серьезным заболеванием, как СПИД.

В с'язи с этан особенно актуальны исследования генетической активности рибоиуклеазы Bacillus intermedials.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось изучение генотоксических свойств внеклеточной рибонуклеазы Bacillus Intermedins 7F на бактериальных тест-системах, на клеточном уровне в условиях in vitro и на уровне целостного 'организма (in vivo), а также изучение ее возможной антимутагенной активности. В соответствии с поставленной целью в задачу исследования входило:

1. Исследовать мутагенные свойства РНКазы В. intermedials в серии бактериальных тестов с метаболической активацией (in vitro) и без нее.

2. Охарактеризовать качественные к количественные показатели исследуемых коммерческих микросомных фракпий,используемых для метаболизма соединений in vitro в микробных тестах.

3. Оценить генотоксическое действие РНКазы по интегральным и специфическим тестам на некоторые этапы мутагенеза и попытаться изучить на этой основе возможный механизм генотокси-ческого действия Фермента на микроорганизмы.

'-i. проверить возможность мутагенного действия препарата in vivo, а также на культуре клеток человека in vitro.

5. Провести сравнение генотоксических свойств рибонуклеазы В. Intermedlus с близким аналогом - РНКазой реконбинантного штамма Е. coli HB 101 РТИ 416 в бактериальных тест-системах.

6. Исследовать аятимутагенные свойства РНКазы m vitro.

Научная новизна. В результате проведенных исследований

впервые установлено наличие слабого мутагенного эффекта экзо-

генной бактериальной рибонуклеазы в серии бактериальных тестов. Метаболическая активация микросомальными фракциями растения и млекопитающих In vitro снижает этот нутагенный эффект.

Изученные генотоксические эффекты рибонуклеазы являются гес-А зависимьми и обусловлены ее способностью вызывать SOS-ответ клетки. Предложена гипотетическая схема возможного механизма генотоксического действия Ферментного препарата. В ходе исследований показано, что генотоксические свойства исследуемого препарата главный образом связаны с Еативной структурой белка.

Впервые изучены антиигтагенные свойства Фермента в ряде модифицированных микробных тестов, показано наличие протекционных свойств рибонуклеазы в низких концентрациях.

Практическая значимость. Полученные результаты по мутагенности и антимутагенности рибонуклеазы микробного происхождения вносят определенный вклад в создание конкретной схемы биохимических реакций и процессов, происходящих в результате взаимодействия экзогенного белка с живой клеткой.

Данные об антимутагенном действии малых доз РНКазы могут быть использованы в разработке схем применения ферментов в комбинированной терапии опухолей, а также в перспективной профилактике лиц, подвергавшихся контакту с мутагенными соединениями.

Представлены полные биохимические характеристики коммерческих лиоФилизированных Фракций растений и млекопитающих, используемых. в бактериальных тест-системах. Найдены оптимальные условия экспериментов с метаболической активацией in vitro, ЯЕЛЯШиеся индивйдуалькыки для каждой исследованной Фракции.

апробация работы: Диссертация доложена на совместном заседании кафедры микробиологии, НИЛ биохимии и биоинженерии Ферментов казанского государственного университета (1993). Основные результата диссертационной работы доложены и обсуждены на итоговых научных конференциях КГУ (1990.1991.1992), Всесоюзных конференциях "Нуклеазы и их практическое использование" (Рига.1955: 1969). Конференции молодых ученых "Синтез и иссле- • дование биологически активных соединений" (Рига. 1969). Секции генетических аспектов конференции "Человек и биосфера" (Самарканд, 1990).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ.

структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 177 страницах машинописного текста; состоит кз обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа содержит 19 таблиц. 15 рисунков, список литературы содержит 191 отечественных и 170 иностранных авторов.

В работе использовали Ферментные препараты : бактериальную рибонуклеазу Bacillus lntermedlus.' коммерческое название "би-наза", РНКазу реконбкнантного штамма Е. coll НЗ 101 рТН 416. коммерческое название "барназа". ЛиоФилизированные микросонные фракции (S9) животных и растительных клеток предоставлены институтом Зкодогии и генетики микроорганизнов VpO РАН г. Перми. Изучение генотоксических свойств проводили на штаммах микроорганизмов, генотипы которых представлены в таблице 1.

НАТЕРНАЛЫ И НЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ,

Натериалы.

таблица 1

Генотипы тестерных штаммов

Втаимы микроорганизмов

Генотип

Е. coll: PQ 37

sfl A::mud (AP Lac) cts.lac A U 169. mal , uvr A. eal E. eal 7. Pho C, rfa.

Vp trp E. дикий тип lex А СИ 561Itrp Б. lex A pol A trp "65. sul.mal B. pol A uvr A trp"65, sul.uvr 155 rec A trp "65. гес A

/

Bacillus subtllls: 168 дикий тип

лизогенная культура S. typhlffiurlum: TA 1535 his G 46. rfa. uvr. MoT

TA 1536 his D 3052. rfa, uvr. bio"

TA 100 his G 16. rfa, uvr. Mof pEm 101.

TA 98 his D 3052. rfa, uvr, ЫО." pan 101

BA 13 his G 46, ara D531, uvr. pKm 101

- 7 -

Нетоди исследований.

t. Тест Эймса, Поллсоличественный учет генных мутаций проводили на тестерных штамнах S. typhlmurlum ТА 1535. ТА 1538. ТА 98, ГА 100 с метаболической активацией in vitro и без нее. Опыты проводили в чашечной модификации. Мутагенную активность учитывали по кратности превышения числа индуцированных ревертантов *ад спонтанным Фоной кггировэния (Ames et al.. 1973). i. Ara-тест, Учет пряных нутаций устойчивости к L-арабинозе ipoводили с метаболической активацией in vitro и без нее на атамме S. typhlmurlum ВА 13 (Ruiz-Rubio,Puevo. 1962) 5. Тест на ДНК-повреждающее действие препарата. Культуру тес-?ерных штаммов Е. col 1 инкубировали вместе с тестируенын препаратом в исследуеной концентрации в жидкой среде б час при 37 С. i чувствительности клеток судили по индексу выживаемости куль-•уры. (Порошенко, Абилев. 1986),

. SOS-хроиотест, Способность препарата индуяировать SOS-ответ детки вели по методу, описанному Килардье и ХэФнунг (1982). . Тест по индукции проФага. Метод основан на способности сое-инений вызывать переход лизогенного Фага на литический путь азвития ( Halnemann, 1971),

. Метод регистрации индуцированного репаративного синтеза ДНК. ценку вели в культуре лимфоцитов периферической крови челове-1 методом радиоавтограФии. По степени включения в ДНК меченого по тритию тимидина, " на Фоне подавленного окекночевиной зпликативного синтеза, судили о степени генотоксичности пре-1рата (Белидкий, 1982),

Никроядерный тест, Учет микроядер в эритроцитах периФери-:Ской крови мышей in vivo проводили по методу Шкидта (1975).

Оценку антимутагенности проводили на микроорганизмах в мо-[фикадиях теста Эймса к SOS-хромотеста. Определяли влияние на юнтанный и индуцированный ''он мутирования тест-штамма в тес-1 Эймса. Антииутагенные свойства рибонуклеазы в SOS-хромотесте ;енивали по степени снижения Фактора индукции SOS-ответа, Содержание белка в микросомных Фракциях (S9) определяли по тоду лоури (1951), количество яитохрома р-450 по методу ому-и Сато (Omura, Sato. 1964).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Биохимические характеристики микросомных фракций (59) живо1 них и растительных клеток.

Количество белка и дитохроиа РЧ50 определяли в лиоФилизиро-ванных препаратах микросомных фракций, полученных из тканей хивотных: печени кур, печени крыс и плаценты человека; в растительных Фракциях из плодовой части моркови, листовой части коланхоэ. кукурузы, луковиц тюльпана. Активность микросон определяли по максимальному мутагенному эффекту 2 аминофлуорена,. регистрируемому в тесте Эймса. Как видно из результатов, представленных в таблице 2, содержание белка и цитохрома Р-450 в различных Фракциях неодинаково. В ряде случаев количество цитохрома Р-450 не находится в прямой зависимости от всего количества белка во фракции. В исследованных хивотных фракциях количество цитохрома Р-450 больше,чем в растительных; к тому же более активная метаболическая трансформация 2 аминофлуорена происходила в клетках хивотных. что подтверждалось данными по реверсии мутантов в тесте Эйиса.

таблица 2

Биохимические показатели микросомных фракций

фракция Б9 Содержание белка Количество цитохрома

нг/мл Б9 Р-450, нм/мг белка

•коланхоэ И. 1 1, 98

морковь 12. 3 4. 45

кукуруза 16.2 2. 00

луковицы тюльпана 14.4 .4, е

печень крыс 9.9 5. 54

печень кур 11,9 5, 00

плацента человека 13.4 5. 90

таким образом, исследовав никросомные фракции 89 животных и растительных клеток и установив зависимость их нетаболизи-рушего эффекта как от источника выделенной фракции, так и от количества активного в них цитохрома Р-450. далее в тесте Эйн-са и Ага-тесте использовали микросонные фракции печени кур.

- 9 -крыс, плаяента челоеека и, для моделирования трансформации препарата я растительных клетках - S9 луковиц тюльпана.

2. Генотоксические свойства рибонуклеазы Оценка токсичности рибонуклеаз по отношению к тест-пгганнам S.typhinmrium показала, что высокие дозы препарата обладают токсическим действием (угнетение роста 50-60 /■), в то время как малые дозы - стинулкруюшин действием. Учитывая эти резуль таты, оценку мутагенности в тесте Эйнса и Ага-тесте проводили в более узком диапазоне концентраций.

Как свидетельствуют данные теста Эйиса (таблица 3),рибонук-леаза В. intermedius в опытах без нетаболической активации в концентрации 1000 ккг/чашку выходит на нижнюю границу слабых мутагенов. Использование кикросонной Фракции печени крыс in vitro снижало прямой мутагенный зФФект препарата.

таблица 3

Нутагенная активность РНКазы В. intermedius в тестах иа S. typhinmriuio: тест Эйнса, Ага-тест

тест-штамм превышение над контролен при концентрации(нкг/чаш) 1 10 ^ 100 1000

ТА 1535 - S9 + S9 ТА 1538 -S9 +S9 ТА 98 -S9 +S9 ТА 100 -S9 +S9 ВА 13 -S9 +S9

О, 9 0,4

1,0 1,9

О, б О, 9

О, 9 1,2

1,04 1,02

1, 3 О, 5

1,5 1,5

О, Г

0, 9

1, 1 1, 1

1, 5 1,08

2, 5«

0, 7**

1, 1*

1.9

0.9

1, 2

1. 1«

0, 9*

2. 2*

1. 1

2, 7*«

О, в**

2. 4**

1.9

2, 4*«

0, 9*

1, 9* 1, 5«

3, 2«» 1,6«

Значимо отличаются от контроля: *-Р<0,05 ««-Р<0,01,

Аналогичные результаты получены при использовании микро-сом печени кур (белок-1,7 пг/чаш). плаценты человека (белок- 1.85 иг/чаш), луковиц тюльпана (белок-З.г мг/чаш).

Рибонуклеаза рекоибинантного штанна Е. coll не проявила мутагенности.

Следующим этапом работы было исследование мутагенной активности на штамме ВА 13 в Ara-тесте, способном регистрировать более широкий круг генетических повреждений.

Как виднс из результатов, представленных в таблице 3, РНКаза В. intermedius в наивысшей из исследуемых концентраций индуцирует число мутантов, превышающее спонтанняй Фон е 3,2 раза в опыта* без метаболической активации. Метаболическая активация jn vitro иикросомами печени крыс (белок-1,5 нг/чашку) и плаценты человека ( белок-1.85 нг/чаш! полностью снимала мутагенный эФФект. Рибонуклеаза рекоибинантного штамма Е,coll (барназа) и в данном тесте проявила мутагенность меньшей силы.

Обнаружив слабую мутагенную активность е тесте Эймса и под' чердив ее в Ara-тесте, мы посчитали необходимым найти подходы к объяснен}® мутагенного действия изучаенэго соединения. Учитывая возможные трудности проникновения Фермента в клетку и предполагавкое действие на него внутриклеточных Ферментов, приникая: во еникакле литературные данные о нембракотропнон действии препарата (Куриненко,1991 ; Сергеева, 1991; Колпаков, 1992) нехло предположить, что мутагенный эффект обусловлен не непосредственным действием на генетические структуры клетки. Склонясь к еозкожному непряному действию экзогенной РНКазы, как индуктора мутация, провели эксперименты по определению степени вовлеченности Еес а белка и работа ошибочной SOS-репарации в процесс возникновения мутаций под действием РНКазы. Как и в случае определения индукции точковых мутаций, использовали два теста (тест по индукции проФага и sos-хромотест), позволяющие судить о воздействии РНКазы на включение индуцибельных функций генетического аппарата.

Полученные экспериментальные данные (рис.1! свидетельствуют об экспрессии Фаговых генов. В тесте по иняукпии проФага на ли-зогенном штамме В. subtil is i6et^l05 WT.выявлено, что РНКаза В. îraerxedius индуцирует выход проФага и приводит к восьмикратному превышению титра Фага над спонтанным Фоном Фагоиндук

ии. Под действиен рибснуклеазы рекоибинантного птанна Е. coll. этой хе концентрации наблюдали превышение над спонтанным Фо-он Фагоиндукции в 3 раза.

гоос

титр Фага »10

//

320-

100-

40-

ч 200 -

// А

« *

*

_ 1

титр Фага»10

//

<х>

30■ 20-lO-

ii « В

1С 100

10 100 нхг/мл

А-биназа; В-барназа; 1-контроль; 2-УФ облучение * - Р < 0,01 ** - Р < 0,05 Рис. 1 Индукция Фага из лизогенноя культуры в. suit 11 Is

Данными последних лет показано, что индукция проФага явля-•ся огним из проявлений SOS-ответа глетки, находящие я под «тролем индуцибельных Функций гес А, lex А генов (WltKln,1972). :я подтверждения того, что РНКаза в. Intermedlu3играет роль в :тивапии SOS-генов, ее исследовали в SOS-хроиотесте. По экс-есст гена sfi А, входяшэго в SOS-регулон судили о включении с А зависимых функций клетки, в концентрации 1мг/мл препарат дуцировал sos-ответ (Фактор индукции 3,2).

Таким образом, мутагенез, вызванный РНКазой В. lntermedlus. ляется гес-А зависимым и основан на работе "ошибочной" р^па-шш, нгисправляшей полностью первичные изменения в ДНК.

Сравнительный анализ величин выживаемости штаммов Е. сои мутантных по разным путям репарации показал, что наиболе чувствительным к действию препарата оказался итами с нарушен* ем экспизионной репарации (шгг А). На штанмах гее А и lex А в зарегистрировано угнетение роста культуры ( табл.4).

таблица 4

Опенка ДНК-повреждашего действия РНКазы В, intermeülus

Концентрация Индекс выживаемости

нкг/мл Р01 А uvr А гес А . lex А

1 1.01 0,91 1,1 1.1в

100 0.87 0, 9 1,06 1, 12

1000 0.65 0, в 1, 25 1, 14

Полученные данные свидетельствуют о слабой (пограничной ДНК-повреждаюпей активности Фермента. В исправлении поврежде ний, возникающих при действии РНКазы на клетки, необходимы ра бота экспизионной репарации и ДНК-полямеразы 1 Корнберга.

Изучение мутагенности нативного раствора РНКаз В. 1п1егше(11из и раств5>ра после 20 минут.кипячения (100 С), по казало изменение исследованных свойств. Несмотря на сохранен» после "кипячения ее каталитической активности, раствор РНКаз: после тепловой обработки не вызывал индукцию точковых мутаци и дал отрицательные результаты в БОЗ-хромотесте. Вероятно после тепловой обработки происходят изменения в нативно; структуре белка, это подтверждается данными спектрального ана лиза. В частности, в работе' Ступишиной (1992) показано, чт< при РН 7. о с увеличением температуры до 50 С происходят изме нения в структуре Ферментного препарата. При этом теплово! разворачивачие глобулы выше 50 С сопровождается агрегацие] белка с образованием межмолекулярной ^-структуры и полносты необратимо, что не позволяет наблюдать плавление биназы. Ножн< предположить, что РНКаза, изменяя структуру, уменьшает способность сорбироваться на мембране,в результате чего ее геноток-сические свойства утрачиваются.

Полная характеристика генотоксичности препарата предполагает исследования на клетках разных уровней организации, в ев:

и с чем мы провели исследования в культуре клеток in vitro и а уровне целого организма In vivo.

3. Генотоксические эффекты РНКазы В1 на клетках эука-риот in vitro и in vivo.

Генотоксическое действие РНКазы В1 в культуре лимфоцитов онорской кройи человека проводили методой радиоавтографии по ценке внепланового синтеза ДНК. Как свидетельствуют результа-ы экспериментов, под действием препарата в концентрации 1 г/мл репаративный синтез ДНК увеличивается в 2 раза, что ука-ывает на активную работу систем репарации клетки. Повышение ровня внепланового синтеза ДНК в лимфоцитах, обработанных НКазой, хорошо согласуется с данными по ее генотоксической ценке на микроорганизмах в наших исследованиях. Проявление енотоксического эффекта в культуре клеток лимфоцитов такде ожет быть опосредованно индукцией ошибочной репарации. Ряд некяихся Фактов позволяет утверждать возможность сушествова-ия в клетках эукариот индуцибельной ошибочной репарации, ействуюшей подобно SOS-репарадии, описанной в клетках прокапот (Radrnan, 1980; Sarasln, 19Й5; Elespuru,1987).

Незначительное превышение ( в 1,5 раза) образования ник-оядер зафиксировано в эритроцитах крови мышей в опытах на ровне целостного организма при внутрибршиннон введении РНКа-а В. intermedials в концентрации 25 мг/ кг массы животного. В оддержании РНКазной активности организма после введения экзо-енной РНКазы важная роль принадлежит ингибиторам РНКаз, кото-уе как показано в работе Сергеевой (1991), более эффективно ействуют на РНКазы животного происхождения, чей на микробный грмент. Знесте с тен, нашими собственными исследованиями, по-азано, что генотоксические свойства Фермента .главный обрати, обусловлены его нативной структурой, что нельзя исключать ри обсуждении возможных механизмов генотоксического действия репарата in vivo.

Сопоставив полученные нами данные о механизме мутагене-1, вызываемого экзогенной РНКазой. с сумной данных литературы возможных механизмах действия рибонуклеаз и других биологи-?ски активных веществ, мы можем кратко определить узловые но-гнты воздействия Фермента на клетку. Итак, экзогенная РНКаза

В. ИПегтеаШБ. вероятно может выльгяять в клетке ряд с-педующщ изменений:

1. Конформадионные перестройки мембраны под действием адсорбированной (либо связавшейся с рецептором) экзогенной РНКазь (Конев, 1972; Куриненко,1991; Чертишев, 1991).

2. Активация вторичных мессенджеров (Колпаков,1993).

3.накопление внутриклеточного Са (Колпаков, Куприянова 1992). Передача сигнала от вторичных мессенджеров на геном, приво-

дяшая к остановке синтеза ДНЕ (Северин, 1991).

5. Активация Са-зависимых внутриклеточных зндонуклеаз клетки, работа которых приводит к фрагментации дня ШесопКет ег а1, 1966; аопеэ е! а1,1989; 'УапмаК.а.з е! а1 1992).

6. выход свободных нуклеотидов из клетки, с соответствующий изменением баланса предшественников ДНК (Не К1оег е1 а1,1962; Конев, 1972).

7.!?ес А-завискный мутагенез (Иванченко, 1993).

8. возможное растепление эндогенного субстрата (кембраносвя-занной РНК) под действием РНКазы (Ногег, 1980; куриненко,1991)

Кажется вероятный, что РНХаза не взаимодействует непосредственно с ДНК. а изменения скорости репликация или изменения в структуре ДНК являются вторичными й опосредуются действием экзофериента на мембрану. Возможно, что основной вклад в реализацию конечного клеточного ответа вносит какой-либо один из вышеперечисленных эффектов, но не исключено также, что только в результате суммирования всех эффектов возможно проявление генотоксических свойств препарата.

Возможность РНКазы опосредованно влиять на ДНК не противоречит данный литературы о возможных механизмах проявления ге-нотоксическнх свойств вешеств. Возникновение повреждений ДНК можно рассматривать как неспеякФическую реакцию клеток не только на агенты, непосредственно взаимодействующие с ДНК. но и нг другие структуры клетки.наприиер, на цитоплазматическую мембрану (Федоров.1981). вследствие чего повреждения днк можно считать интегральным показателем жизнеспособности клеток.

Таким образом, полученные данные в совокупности с Фактами, имеющимися на сегодняшний день в литературе, позволяют нам предложить гипотетическую схему генотоксического действия экзогенной РНКазы (рис. 2). где отражены все обсужденные ранее

Рис. 2.Схема возможного механизма генотоксического действия экзогенной РНКазы. НКД-нуклеотиды., Р-рецьптор

- IG -

этапы вероятного действия исследуемого Фермента.

Изучив генотоксические свойства РНКазы в. lntermedlus представлялось интересны» провести исследования препарата области малых концентраций, т. к. е последнее время появило немало сведений о том, что малые концентрации мутагенов мог обладать ростостимулиртошии и антинутагеиными свойствами открывает новые возможности практического использования Фе мента в медицине. Кроме того, изучение антимутаг&нности внос неоценимый вклад в цельное представление в механизмы клеточн го ответа под действием препарата.

ч. Антимутагенная активность РНКазы в. lntermedlus. в бактериальных тест-системах.

Для выяснения возможного антинутагенного действия препа та проводили исследования в модифицированном тесте Эймса SOS-хромотесте.

изучение влияния РНКазы В1 на спонтанный уровень возни новения обратных мутадий в клетках S. typhlmurlmn ТА 100 пока зало, что препарат в исследованном диапазоне концентраций (О £; £0 мкг/нл) не оказывает значимого антинутагенного эффект,

Исследования влияния рибонуклеазы на индуцированный нут; генез свидетельствуют об отсутствии антинутагенного действ) при совместной ее воздействии с нитрозогуанидинон или с hhtpi зометилмочевиной на клетки S. typhlmurlum ТА 98 и ТА 100 в koi центрации юо и юоо икг/чашку; Напротив. ■-в этих случаях на( людается усиление мутагенного действия известных мутагенов. Малые концентрации РНКазы (1, 10 мкг/чашху) незначительно сш жают число индуцированных мутаций преимущественно на штамме "i 100.

Как свидетельствуют данные таблицы 5, предварительная о< работка клеток S. typhlimrUm ТА 1535, ТА 1538 и ТА 98 Ферме! том в концентрации го-о, ог нкг/ил приводит к уменьшению чис; ревертаятов, индуцированных нитрозогуанидином (НГ), 2 нитрон луоренои (2 НФ) или нитрозонетилночевиной (НИН), предварител! ная обработка клеток препаратон в этих же концентрациях привс дила также к снижению индуцированных реверсий штаммов ТА 98 ТА 100. под действием иззестного мутагена и канцерогена -те! раметилткурамдисульфида.

Такин образом, изучение антимутагенных свойств рибонукле-I В. пиегтейШз показало, что предварительная обработка кле-с Ферментом делает их менее чувствительными к действию мута-юв и механизм защитного влияния фермента является неспеяи-шьм, что может быть связано с рядом причин.

Возможно. РНКаза. обладая мембранотропныни свойствами, сет оказывать влияние на проницаемость клеточной мембраны и. н*вая в ней конформационнке перестройки (Конев, 1972;Г.уринен-1991), препятствует взаимодействию мутагенов с ней или »ньшает их проникновение в клетку. Кроме этого, возможно. > рибонуклеаза сама, обладая хорошими сорбдиошшни способами может образовывать некую " защитную белковую оболоч-'. которая также будет препятствовать взаимодействию мутаге-5 с клеткой.

таблица 5

Протекторные свойства РНКазы в. ипегтесИиз

шентрааия. мкг/кл ТА 1535 у. та 1538 '/• ТА 98 z

жтанный Фон 16+4« 11+5 65+11

;аза В1***

10 - 572+14 59 405+7 70

¡.О 1464+23 35»* 504+14 64 457+9 65

>.2 1764+17 22 669+12 52 359+.Ю 75

>,02 2326 + 14 551 + 10 61

ШК. 1000 2266*20

[Г. 5.0 1163+43

! НФ, 500 1394+25

число колоний-ревертантов; *«-антимггагенный эФФект (Z); ■•*- предобработка клеток РНКазой с последующим действием му-'ена.

Представленные в работе данные о генотоксических свойс-ix высоких доз препарата говорят о способности РНКазы инду->овать SOS-ответ клетки. В связи с этим представлялись инте-ными исследования по влиянию малых доз РНКазы на процессы ■агенеза. в частности на работу ошибочной SOS-репарации. : свидетельствуют экспериментальные данные (рис.3), сами ис-

следуемые концентрации (1 и О, 1 нкг/нл) не проявляют БОБ-ин-дуцируюшей активности, а при концентрации о,1 нкг/мл заметно небольшое ингибируюшее действие на спонтанную индукцию БОБ-ответа. Предобработка клеток этими дозами Фермента делает их более устойчивыми к последующему воздействию БОБ-индуцируюпшх доз нитрозонуанидина. Наблюдается снижение индудибельного БОЗ-ответа клетки на £4 '/-. Известно, что экспрессия всех генов, входящих в БОЬ-регулон, не однонсмептна и происходит поэтапно. Индуцибелышми репарагивными белками, уровень которых возрастает в первую очередь, являются белки, работавшие и до индукции - это с1\гг а. в, с, ю. выполняющие эксцизконную репарацию. Таким образом, вероятно, иалые дозы Фермента, действуя на клетки, активируют в первую очередь безошибочные пути репарации, и обработанная клетка ухе потенциально "готова" к действию супермутагенов.

Фактор индукции 50Б-ответа

4

з • г -i

-нг

rh

к

i г 'i 4 вариант опы

НГ, 3 мкг/мл

1 - РНКаза В1, 0.1 мкг/мл

2 - РНКаза Bi, i мкг/мл

* - Предобработка клеток РНКлзой с последующим действием нитррзогуанидина

3 - РНКаза Bi (О, i нкг/нл) ► НГ (3 нкг/wi)

4 - РНКаза Bi ( 1 мкг/мл) + НГ (3 мкг/мл).

Рис. j Ашинутагенные эФФе.ктп I'HK.i.mj в. íntermedlus в SOS - хром

- 19 -ВЫВОДЫ

1. Установлено наличке слабого мутагенного эффекта бактериальной рибонуклеазы В. intermedins, в концентрации 1 мг/нл в бактериальных тест-системах: тесте Эймса. Ага-тес.те.

2. С помощью использованных тест-систем и набора мутант-ных штаннов установлено, что мутагенез, вызываеный РНКазой в. intermedius, является Ree А-зависиныи и обусловлен способностью экзофериента индуцировать ошибочную sos-репараиию,

3. выявлено, что модификация эффектов клеточного ответа в бактериальных тест-системах мгасросомныии фракциями растений и млекопитающих in vitro приводит к снижению мутагенной активности РНКазы В. intermedius.

4. Показано,что генотоксические свойства рибонуклеазы В. intermedius. главным образом, связаны с нативной структурой Фермента.

5. Представлены биохимические характеристики коммерческих лиофилизированных микросомннх фракций (S9) печени крыс. кур, плаценты человека, луковиц тюльпана, коланхоэ, кукурузы, меркови. которые необходимо учитывать для выбора оптимальных условий эксперимента с метаболической активацией, in vitro в микробных тест-систенах. Найдена точка оптимума с определенным соотношением количества белка и питохрома Р-450, являющаяся индивидуальной для каждой исследованной Фракции.

6. определен слабый генотоксический эффект рибонуклеазы В. intermedius. выражающийся в двухкратном усилении редаратив-ного синтеза ДНК в культуре лимфоцитов человека in vitro. На уровне целостного организма (учет микроядер в эритроцитах крови мышей) мутагенный эффект выражен незначительно.

7. Установлено, что рибонуклеаза В.intermedius 7Р обладает более сильными генотоксическими свойствани. чем рибонуклеаза рекоибинантного цтаима Е. coli HB 101 pHT 416'.

8. Выявлены протекторные свойства малых доз Фермента в условиях индуцированного мутагенеза, связанные, вероятно, со способностью препарата либо препятствовать взаимодействию мутагена с клеткой, либо повышать активность работы безошибочных систем репарации.

Список работ, опубликованных по тене диссертации

1. Черепнева И. е., Фаттахова А. И., Сысоева о. в. Изучение генетической активности бактериальной рибонуклеаэы. // Всесоюзн. итоговая конФ. "Нуклеазы никроорганизнов и их практическое использование. " Рига, 1985. -с. 38.

2. Иванченко О. Б. , Ильинская О. Н. Исследование генетической активности рибонуклеаэы в бактериальных тест-систенах. // X конференция молодых ученых" Синтез и исследование биологически активных соединений", Рига, -1989. С. 122.

3. Иванченко О. Б., Ильинская О. Н., Черепнева И. Е., Набенджиева Е. В. Генетическая токсичность бактериальной рибонуклеаэы //Нежреспуб. конФ. " Нуклеазы микроорганизмов и их практическое использование", Рига, 1989.-С. 25.

4. Ильинская О. Н., Иванченко О. Б. , Черепнева И. Е., Лешинская И. Б. Нутагеннне и анткнутагенные эффекты препарата "биназа" /Докл. секции генетических аспектов пробл. "Человек и биосфера", Самарканд. -1990. С. 82-83.

5. Иванченко о. Б. , Ильинская О. Н. , Харамова Н. С., Черепнева И. Е. Оценка генетической активности бактериальной рибонуклеаэы. / Всесоюзн. конФ. нежвузовского (межотраслевого) проекта" Ферменты никроорганизнов" (Нуклеазы) .Казань,-1991.-С. 36-33.

6. Иванченко О. Б. , Ильинская О. Н. , Каранова Н. С., Черепнева И. Е. Оценка генотоксичности Ферментного препарата "биназа" // Нолск. генетика, никробиология,вирусология. -1991. -Т. и. -С. 22-25.

7. Иванченко О. Б., Ильинская О. Н., Каранова Н. С. Генотоксич-ность препарата "биназа" в тестах на 5а1пюпе11а:тест Эйнса и Ага-тест // Цитология и генетика. -1992. -нз. -с. 5 2-55.

8. Иванченко О. Б., Ильинская о. Н., Каранова Н. С.. Черепнева И. Е. Неханизны проявления генотоксических эффектов биназы // Биол. науки. - 1992. -Н2. -С. 108-112.

Сдано в набор 10.08.93 г. Подписано в печать 12.08.93 г. Форм.бум. 60 х 84 1/16. Печ.л.1. Тираж 100. Заказ 364.

Лаборатория оперативной полиграфии КГУ 420008 Казань, Ленина, 4/5