Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка критериев безопасности вакцины против клещевого энцефалита в тестах in vitro

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Разработка критериев безопасности вакцины против клещевого энцефалита в тестах in vitro"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ТОМСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВАКЦИН И СЫВОРОТОК НПО "ВИРИОН"

На правах рукописи

ЛАВРЕНТЬЕВА ЛАРИСА ВИКТОРОВНА

. РАЗРАБОТКА КРИТЕРИЕВ БЕЗОПАСНОСТИ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА В ТЕСТАХ IN VITRO

03.00.Об - вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ТОМСК 1994

РГ6 од 3

Работа выполнена в Томском научно-исследовательском институте вакцин и сывороток НПО "Вирион"

Научные руководители: доктор медицинских наук Л. Е. Подоплекина

кандидат биологических наук Т. Л. Мирютова

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Н. Н. Ильинских

кандидат медицинских наук Е. Г. Осипова

Ведущее учреждение - Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича

Защита состоится ''¿Э" 394 года в_часов

на заседании Специализированного Ученого Совета К.098.11.01 по присуждению ученой степени кандидата наук при Томском ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте вакцин и сывороток НПО "Вирион" (634050, Томск, пр. Ленина, 32).

С диссертационной работой можно ознакомиться в библиотеке Томского научно-исследовательского института вакцин и сывороток.

Автореферат разослан — 1084г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

V

Л. Н. Полещук

- 3 -ВВЕДЕНИЕ

Вопросы дальнейшего совершенствования профилактических вирусных вакцин остаются актуальными до настоящего времени. Не -смотря на то,что коммерческие вакцины проходят контроль на безвредность на лабораторных животных, периодически выявляются еду-чай повышенной реактогенности и побочного действия отдельных серий препаратов на организм привитого человека (Пгагс* Ь., 1990). Почти все, применяющиеся в настоящее время медицинские иммунобиологические препараты не свободны от содержания в них химических веществ, токсическое, мутагенное и канцерогенное действие которых в большинстве случаев невозможно установить при введении их лабораторным животным' (Дзагуров С.Г. с соавт., 1981; АсПаи С.,1975).

Прямой перенос экспериментальных данных, полученных на лабораторных животных, на организм человека приводит к существенным ошибкам, так как покаэано, что повреждающее действие на клетки может быть причиной повышенной реактогенности вакцин, но благодаря большим компенсаторно-приспособительным возможностям организма, патологическое состояние определенных клеток может проявиться спустя довольно продолжительное время (Червонская с соавт., 1986; Непс1г1кзеп С.Р. ,1988).

В настоящее время установлено, что клеточные культуры имеют целый ряд преимуществ перед лабораторными животными и являются адекватной и более чувствительной моделью для разработки критериев безопасности и оценки качества медицинских иммунобиологических препаратов (Кравченко с соавт. ,1982).

Для решения проблемы безопасности вирусных вакцин необходим строгий контроль субстрата, биологических и химических компонен-.тов, используемых в процессе приготовления препарата, так как большая часть используемых в качестве субстрата клеточных линий контаминирована вирусами и микоплазмами, а химические вещества, входящие в состав вакцин, оказывают токсическое, канцерогенное и мутагенное действие (Червонская с соавт., 1986). Поэтому очевидна необходимость разработки системы научно- обоснованных критериев оценки безопасности вакцинных препаратов на высокочувствительной модели клеточных культур.

Представленная работа выполнялась в рамках научней тематики лаборатории культуры тканей НИИ вакцин а сыьср:.;-.к НПО "Бирион"

"Разработка критериев безопасности вакилны против клещевого энцефалита в тестах in vitro" по заказу концерна "Йммуноген".

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ. Целью данной работы является разработка новых критериев оценки безопасности и качества вакцины против клещевого энцефалита (КЭ) и обоснование возможности использования чувствительных клеточных культур для предварительного контроля безвредности препарата.

Для достижения цели последовательно решались следующие задачи:

1. Подбор наиболее чувствительных клеточных моделей для регистрации цитотоксического действия вакцины и ее компонентов;

2. Экспериментальное обоснование возможности использования чувствительных клеточных линий в качестве тест-культур для изучения токсичности вакцины против клещевого энцефалита, ее полуфабриката и компонентов;

3. Разработка методики контроля вакцины против клещевого энцефалита на реактогенность на клеточных культурах;

4.Изучение мутагенного действия вакцины против КЭ и ее полуфабриката на хромосомы клеток человека in vitro (в культурах диплоидных клеток и лимфоцитов человека) и in vivo (в лимфоцитах периферической крови привитых людей);

5. Разработка методики контроля субстрата вакцины - клеток куриного эмбриона на контаминацию микоплазмами;

6. Исследование субстрата вакцины против клещевого энцефалита на контаминацию вирусами.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Разработаны новые критерии оценки безопасности и качества вакцины против клещевого энцефалита с использованием чувствительных клеточных культур.

Впервые проведено комплексное изучение цитотоксического действия вёкцины против клещевого энцефалита ,ее компонентов и полуфабриката иа диплоидные и гетероплоидные культуры клеток человеческого происхождения.

Экспериментально доказана возможность использования клеточных тест-культур для выявления реактогенных (наиболее токсичных) серий вакцины против клещевого энцефалита.

Впервые изучено мутагенное действие минимальных , доз'-вакцины и ее полуфабриката на генетический аппарат клеток человека двух модельных клеточных систем - лимфоцитов периферической крови и диплоидных клеток человека.

Показано наличие мутагенных свойств у вакцины против клещевого энцефалита и ее полуфабриката в экспериментах in vitro, а также вакцины против клещевого энцефалита в опытах in vivo.

На основании этих исследований экспериментально обоснована возможность тестирования полуфабриката и готового препарата вакцины на мутагенность в культурах лимфоцитов периферической крови и диплоидных клеток человека.

Проведено изучение микоплазменной и вирусной контаминации субстрата для производства вакцины против клещевого энцефалита и рекомендованы определенные чувствительные методы контроля клеток куриного эмбриона на контаминирующие агенты.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Разработаны "Методические рекомендации по контролю субстрата вакцины против клещевого энцефалита (клеток куриного эмбриона) на присутствие микоплазм".Методические рекомендации утверждены в ГИСКе им. Л.А.Тарасевича (протокол N14 от 19.10.93).

Разработаны "Методические рекомендации по постановке тестов для выявления реактогенных серий вакцины против клещевого энцефалита'^ представлены на утверждение в ГИСК им.Л.А.Тарасевича.

Разработаны "Методические рекомендации по контролю мутагенности вакцины против клещевого энцефалита в клеточных тест-системах человеческого происхождения", представлены на утверждение в ГИСК им.Л.А.Тарасевича.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

Новые критерии оценки безопасности и качества клеточного субстрата, полуфабриката и готового препарата вакцины против клещевого энцефалита с использованием чувствительных клеточных культур.

Экспериментальное обоснование возможности использования клеточных тест-систем для выявления реактогенных серий вакцины против клещевого энцефалита. Наиболее чувствительными клеточными тест-системами признаны диплоидные штаммы клеток М-19, М-22,<1-04 и гетероплоидная Л-41,позволяющие с помощью теста цитотоксичнос-ти выявить реактогенные серии препарата.

Показано мутагенное действие готового препарата вакцины против клещевого энцефалита и ее полуфабриката на генетический аппарат клеток человека двух модельных клеточных систем (диплоидных клеточных линий и лимфоцитов периферической кроыО и лимфоцитов периферической крови привитых людей. Установлено досто-

верное увеличение числа клеток со структурными нарушениями хромосом в диплоидных клетках в 3,3 раза,в культуре лимфоцитов в 3,9 раза,в лимфоцитах периферической крови привитых людей в 3,5 раза по сравнению с контролем.

Выявлена высокая степень контаминации клеток куриного эмбриона онковирусами птиц и в Z07. случаев микоплазмами. Полученные данные явились обоснованием необходимости проведения контроля субстрата для производства вакцины - клеток куриного эмбриона на контаминирующие агенты.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на конференции "Биология клетки в культуре" в 1992 г. в Санкт-Петербурге, на совещании "Культивирование клеток животных и человека" в 1994 г. в Пущино.

Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликованы 3 научные статьи.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 140 стр. машинописного текста, иллюстрирована 8 рисунками й фотографиями, 21 таблицей. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы, описывающей материалы и методы исследований, трех глав собственных исследований, заключения и выводов. Список литературы включает 283 работ, в том числе 135 работ иностранных авторов.

Материалы и методы. В работе использовали следующие клеточные модели: Первичные клетки: клетки куриного, эмбриона - ККЭ, ЛЭК, ПЭК (кожно-мышечная ткань, клетки легких и почек куриного эмбриона соответственно), культура лимфоцитов периферической крови человека.

Перевиваемые линии клеток: а).диплоидные клеточные линии: М-19, М-22 (кожно-мышечная ткань эмбриона человека, клетки получены из лаборатории культуры тканей ИПВЭ РАМП г. Москва, руководитель лаборатории - доктор медицинских наук, профессор Л.Л. Миронова, линии лицензированы авторами в качестве национальных вакцинных линий), Л-68 (легкие эмбриона человека, получены ив НПО "Вектор" г. Кольцово), ЛЭЧ (клетки легких эмбриона человека, получены из НИИ гриппа г. Санкт-Петербург), ФЭЧ (фибробласти эмбриона человека, получены из НИИ ВИ г.Екатеринбург): б>„ гете-роплоидные линии клеток: Vero (клетки почки африканской зеленой мартышки), СПЭВ (клетки почки эмбриона свиньи), RK-13 (почечная ткань кролика), Л-41 (клон клеток лимфоидной опухоли человека),

НЕр-2 (клетки эпидермоидной карциномы гортани человека).'

Для ивучения степени цитотоксичности вакцины против КЭ, ее полуфабриката и компонентов культуральную среду после формирова-" ния монослоя клеток заменяли поддерживающей средой, содержащей 2-х кратные разведения вагащны, ее полуфабриката и компонентов. Цитотоксическое воздействие внесенных веществ оценивали по классической 4-х крестовой системе по степени дегенерации клеток опытных культур при сравнении их с контрольными.

Мутагенные свойства вакцины против-КЭ изучали с помощью онтогенетического анализа лимфоцитов периферической крови привитых людей, клеток диплоидных культур и культуры лимфоцитов периферической крови, подвергшихся воздействию нетоксичных доз вакцины и ее полуфабриката. Препараты хромосом окрашивали рутинно, учитывали число хромосом, количество и типы хромосомных аберраций. Этот раздел работы выполнен в сотрудничестве с канд. биол. наук, с.н.с. Н.А.Поповой.

Исследование субстрата вакцины против КЭ - ККЭ на контаминацию микоплазмами проводили микробиологическим, цитологическим методами и с помощью электронной микроскопии.

Обнаружение вирусной контаминации осуществляли с использованием чувствительных клеточных культур и электронной микроскопии. Этот фрагмент работы выполнялся совместно с канд. физ.-мат. наук, с.н.с. A.A. Миллером.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Проблемы профилактики клещевого энцефалита в нашей стране находятся в центре внимания многих специалистов. В условиях массового и многократного применения культуральной инактивированной вакцины против клещевого энцефалита становятся актуальными вопросы изучения токсического и мутагенного действия вакцины на клетки человека..

Совершенно очевидно,что существующая система методов доклинической оценки безопасности МИБП не отвечает современным требованиям, предъявляемым к препаратам, вводимым человеку и не позволяет оценить всего многообразия изменений, происходящих в поствакцинальном периоде, как с точки зрения непосредственных реакций, так и в плане прогноза на отдаленные последствия (Rossen R.D. с соавт.,1971).

По мнению многих исследователей включение в систему методов контроля безвредности МИБП тестов на клеточных культурах челове-

ка максимально приближает эксперимент к условиям организма и позволяет проследить за процессами, происходящими в клетках, подвергшихся прямому или опосредованному воздействию препарата.

Установлено, что фибробласты человека in vitro в течение определенного количества пассажей сохраняют генотипические особенности организма и воспроизводят их в ряду клеточных поколений. В связи с этим культура фибробластов человека является адекватной системой, которая позволяет моделировать процессы, происходящие в месте парентерального введения МИБП любого соста-. ва (Червонская с соавт., 1986).

А.Т.Кравченко с соавт. (1082) предложено определять дозы исследуемых в клеточных тестах веществ по.степени повреждения клеток в монослое следующим образом: токсическая доза - гибель клеток составляет 100% •, субтоксическая доза - гибель клеток составляет 50% (титр ЦТД); минимальная доза - следующее разведение за субтоксическим, не вызывающее видимых морфологических изменений клеток в монослое.

МИВП и их компоненты по степени повреждающего действия на клетки в Kv.'-. Tvpe подразделяются на высокотоксичные (титр ПТД от 1:?5б до 1:4096), средней токсичности (тип ЦТД от 1:32 до 1:128 включительно).слаботоксичные (титр ЦТД от до 1:16 включительно) и нетоксичные.

Для определения степени цитотоксического действия вакцины на клеточные культуры были проведены исследования в отношении вклада в общую токсичность каждого компонента препарата, изучение ЦТД полуфабриката.

При изучении токсичности компонентов вакцины против КЗ нами установлено, что готовый препарат содержит в своем составе: 1.нетоксичные компоненты - среда 199 с 0,1% гидролизата лакталь-бумина аминопептид; 2.слаботоксичный компонент - человеческий сывороточный альбумин; 3.компоненты средней токсичности - формальдегид и гель гидроокиси аллюминия.

На основании полученных результатов о степени ЦТД (иэучено 15 серий) на различные клеточные тест-культуры полуфабрикат вакцины намч отнесен к веществам средней токсичности (титр ЦТД от 1:8 до 1:64).

До настоящего времени в доступной нам литературе отсутствовали сведения о цитотоксичности полуфабриката вакцины против КЗ для диплоидных и первичных культур клеток человека.

Для определения возможной причинной зависимости токсичности полуфабриката вакцины от присутствия в нем формальдегида и изучения закономерностей цитотоксичности различных серий нами был' проведен корреляционный анализ.

Результаты корреляционного анализа свидетельствуют о том, что цитотоксичность 6-ти серий несорбированной вакцины КЭ определяется присутствием в них формальдегида, о чем говорят высокие коэффициенты ранговой корреляции (рис. 1.).

85

| .87

ФОРМАЛЬДЕГИД--~

90—-—| ~~ —---93

91

Рис.1. Корреляционные взаимосвязи ЦТД формальдегида и некоторых серий полуфабриката вакцины, (к от 0,9 ДО 1,0; Р<0,05)

Анализируя полученные данные по расчету коэффициентов ранговой корреляции, мы пришли к выводу о существовании определенных закономерностей в развитии цитотоксических изменений, так как с высокой степенью достоверности можно утверждать существование взаимосвязи между токсичностью различных серий полуфабриката.

Так, например, ЦТД 74 серии полуфабриката с высокой степенью достоверности коррелирует с цитотоксическим эффектом И других серий полуфабриката (рис. 2), ЦТД 77 серии с ЦТД 10 других серий и т.д.

Результаты корреляционного анализа свидетельствуют о том, что ЦТД несорбированной вакцины КЭ в определенной степени объясняется присутствием в ней формальдегида, однако, полностью не определяется этим компонентом и связано, по-видимому с токсичностью белковых компонентов полуфабриката, а возможно и нуклеиновой кислотой вируса (Вепйа 1?. .1960).

В результате использования 5-ти клеточных тест-систем для изучения токсичности 12 коммерческих серий вакцины против КЭ установлено,- что готовый препарат оказывает выраженное токсическое действие на клетки, вызывая полную дегенерацию монослоя уже в течение первых суток после начала контакта с клетками.

Титры ЦТД 6-ти серий вакцины из 12-ти исследованных состаь-

83

84

77

<

-Г ПОЛУФАБРИКАТ ВАКЦИНЫ (74 СЕРИЯ)

87

88

93

00

Рис.2. Корреляционные взаимосвязи ЦТД различных серий полуфабриката вакцины против КЭ. (к от 0,9 до 1,0; Р<0,05)

ляют 1:128, на этом основании вакцину КЭ производства НПО "Вири-он" следует отнести к препаратам средней токсичности.

При сравнении титров ЦТД вакцины и ее полуфабриката, установлено, что вакцина до сорбции менее токсична для клеточных линий, нежели конечный продукт - готовая вакцина.

Результаты корреляционного анализа ЦТД вакцины и геля гидроокиси аллюминия свидетельствуют о том, что цитотоксичность 4 серий готового препарата определяется присутствием в нем геля гидроокиси аллюминия, о чем говорят высокие коэффициенты ранговой корреляции (к от 0,8 до 1,0, Р<0,05).

Однако, общие для различных серий полуфабриката закономерности цитотоксического воздействия на клеточные культуры проявляются и при изучении корреляционных взаимосвязей между цитоток-сичностью различных серий препарата. Так, например, цитотоксичность 83 серии.вакцины с высокой степенью достоверности (Р<0,05) коррелирует с цитотоксичностью других 11 серий готового препарата и т.д.

На основании полученных результатов следует заключить, что все исследованные нами 12 серий вакцины против КЭ оказывают летально-необратимое действие на тест-культуры. Наличие ЦТД при оценке результатов регистрируется еще при последующих многократных разведениях каждой серии препарата. Титр ЦТД различных серий вакцины на клетки колеблется от 1:16 до 1:188.

Однако, титр ЦТД ни одной из 12 серий препарата не достигал значения 1:256, следовательно изученные серии вакцины относятся

- 11 -

к препаратам средней токсичности.

Для установления возможной связи цитотоксичности вакцины против КЭ в тестах In vitro с реактогенностью препарата нами были протестированы 6 серий вакцины на которые в период с 1992-1993 гг. поступили рекламации с мест применения. Все реак-тогенные серии препарата успешно прошли контроль на безвредность на морских свинках при выпуске и были предоставлены нам отделом биологического контроля НПО "Вирион". Нами установлено, что титр ЦТД исследуемых реактогенных серий, как правило выше, чем у аре-актогенных вакцин. Цитотоксическая доза, то есть доза, вызывающая гибель 50£ клеток в монослое, реактогенных серий препаратов содержалась в разведениях от 1:256 до 1:1024 (показано на линиях М-22 и Л-41). Следует отметить, что ни одна иэ изученных ранее серий вакцины не имела таких высоких титров ЦТД. На этом основании реактогенные серии вакцины отнесены к высокотоксичным сериям препарата.

Причины, определяющие закономерности в развитии цитотокси-ческих изменений клеток под влиянием определенных разведений реактогенных серий вакцины связаны, по-видимому с сверхтоксичностью биологических компонентов препарата.

Таким образом, тестирование вакцины против КЭ в клеточных культурах для определения степени их ЦТД на клетки позволяет выявлять высокотоксичные серии препарата (титр ЦТД от 1:256 и выше), которые впоследствии могут вызывать поствакцинальные реакции у привитых.

В настоящих исследованиях показано,что клеточные культуры обладают высокой чувствительностью к токсическому действию вакцины против КЭ, ее полуфабриката и компонентов. Наиболее чувствительными тест-системами пригнаны диплоидные линии клеток М-22,М-19,ФЭЧ и гетероплоидная Л-41, позволяющие установить различную степень цитотоксичности серий препарата, не выявляемую при контроле безвредности препаратов на лабораторных животных.

Полученные данные свидетельствуют о высокой чувствительности изученных клеточных моделей и позволяют рекомендовать использовать тест цитотоксичности в культурах клеток как дополнительный экспресс-тест при контроле вакцины против КЭ на реактоген-ность. С помощью этого теста можно осуществлять предварительный контроль на токсичность компонентов препарата, выбраковывая вы-сокотоксичныё серии компонентов, тем самым способствуя снижению

- 12 -

токсичности и реактогенности готовой вакцины.

Вопросы безопасности вакцинопрофилактики КЗ тесно связаны с проблемой возможного мутагенного действия вакцины против КЗ и ее полуфабриката на генетический аппарат клеток человека.

С целью изучения способности полуфабриката вакцины и готового препарата вызывать мутации в соматических клетках человека нами, проведено исследование влияния вакцины против КЗ и ее полуфабриката на генетический аппарат клеток человека двух модельных клеточных систем и лимфоцитов периферической крови привитых людей.

В диплоидных культурах клеток и на культуре лимфоцитов периферической крови нами показана мутагенность полуфабриката и готового препарата вакцины против КЗ.Установлено, что даже нетоксичные для клеток дозы полуфабриката и вакцины воздействуют на генетический аппарат клеток, вызывая достоверное увеличение числа клеток с нарушениями хромосом (таблица 1, 2).

Мутагенность минимальных доз различных серий полуфабриката и готового препарата различна. Цитогенетический анализ влияния минимальных доз полуфабриката и вакцины против КЗ в тестах in vitro позволяет установить большую или меньшую мутагенность отдельных серий вакцины и ее полуфабриката.

Для получения наиболее полного представления о мутагенных свойствах вакцины клещевого энцефалита нами проведен цитогенетический анализ лимфоцитов периферической крови людей, привитых против клещевого энцефалита.

Проанализировано состояние хромосомного аппарата клеток лимфоцитов периферической крови участвующих в эксперименте людей в довакцинальный период для определения уровня индивидуальных цитогенетических нарушений и в поствакцинальный период для определения мутагенности вакцины. Полученные результаты представлены в таблице 3.

Как следует из приведенных данных, частота возникновения аберрантных метафаз в лимфоцитах периферической крови в довакцинальный период в среднем составляет 2,4%.

При проведении цитогенетического анализа лимфоцитов периферической крови привитых на 3-е сутки после вакцинации установлено достоверное увеличение процента клеток с нарушениями хромосом. В среднем 8,4% клеток имели различные нарушения в хромосомном аппарате. К 14-м суткам после вакцинации появляется тенден-

Таблица 1

Действие вакцины КЭ и ее полуфабриката на хромосомы клеток диплоидных культур человеческого происхождения *.

Исе- линия X клеток с хромосомными аберрациями Р1 Р2

рии клет. ------------------------------------

контроль вакцина полуфабрикат

82 М-22 13,0±6,6 нет деля- 44,0+9,7 - <0,001

шихся кл.

83 ЛЭЧ 7,0±5,0 25,0+8,5 35,0+9,3 <0,001 <0,001 86 ЛЭЧ 4,0+3,8 21,0+8,0 нет делящихся1 <0,001

клеток

89 ЛЭЧ 4,0+3,8 23,0+8,2 12,0+6,4 <0,001 <0,05 Средние

данные 7,0+2,5 23,0±4,1 30,0+4,5 <0,001 <0,001

Примечания: * - в каждой точке опыта подсчеты проведены на 100 метафазных платинках;

Р1 - уровень значимости для достоверных различий по числу клеток с хромосомными аберрациями между контрольными и опытными кул! !'¿i,d!tñ ¡.с готовой вакциной);

Р2 - уровень значимости для достоверных различий по числу клеток с хромосомными аберрациями между контрольными и опытными культурами, (с полуфабрикатом);

ция к снижению уровня хромосомных аберраций. В этот период частота возникновения аберрантных метафаз составляет 4,47..

Анализ распределения хромосомных нарушений по типам выявил достоверное увеличение таких аберраций хромосом как одиночные и парные фрагмены (таблица 3).

Из полученных данных следует, что вакцинация культуральной инактивированной вакциной против клещевого энцефалита оказывает мутагенное действие на хромосомный аппарат соматических клеток привитых, ■ вызывая достоверное увеличение процента клеток с хромосомными аберрациями.

При сравнении чувствительности использованных клеточных моделей и лимфоцитов периферической крови привитых к мутагенному действию вакцины против клещевого энцефалита оказалось, что в

Таблица 2

Действие минимальных доз вакцины клещевого энцефалита и ее полуфабриката на хромосомы лимфоцитов периферической крови человека.

(Феерии X клеток с хромосомными аберрациями

вакцины --------------1------------------------------------

контроль вакцина полуфабрикат

82 7,00±5,0 21,0018,0* 17,00+7,4 *

83 2,00+2,7 17,00+7,4* 17,00+7,4 *

84 4,00+3,8 5,00+4,3 4,00±3,8 91 2,00+2,7 15,00+7,0* 4,00+3,8

Средние данные 3,70+1,8 14,50±3,5* 10,50±3,0 *

Примечания:

В каждой точке опыта подсчеты проведены на 100 метафавных пластинках;

л достоверность различий между контролем и опытом.

Таблица 3

Хромосомные аберрации в лимфоцитах периферической крови людей, привитых против КЗ

срок Число клеток с хромосомными аберрациями в X

после -------------------------------------------------------

кгаун. - всего кл. кл.с разрывами кл.с разрывами гэпы с аберр. и фрагментами и фрагментами хромосом. хроматид

контроль 2,4+1,3 0,0+0,009 1,4+1,0 0,6+0,7

3-е сутки 8,4+2,4* 1,6+1,1* 6,0+2,1* 0,6+0,7

14-е сутки 4,4+1,8 1,010,9* 3,4+1,6* 1,2+1,0

Примечание: * - достоверность различий между опытом и контролем.

В каждой точке опыта подсчеты проведены на 600 метафазных пластинках.

среднем количество хромосомных аберраций увеличилось в диплоидных клетках в 3,3 раза, в культуре лимфоцитов в 3,9 раза , в лимфоцитах периферической крови привитых в 3,5 раза при сравнении с контролем. На этом основании можно предположить, что данные клеточные модели (диплоидные клетки человека и культура лимфоцитов периферической крови человека) являются адекватными системами для изучения мутагенности вакцины против клещевого энцефалита.

В результате проведенных исследований установлено, что диплоидные клетки человека, сохраняющие в определенном количестве пассажей генотипические особенности организма, обладают высокой чувствительностью к мутагенному действию вакцины против КЗ, отражают мутационные процессы, идущие в организме привитых в поствакцинальный период и могут быть использованы для тестирования вакцин на мутагенность наряду с общепризнанной моделью- лимфоцитами периферической крови человека.

Для решения проблемы безопасности вирусных вакцин большое значение имеет тщательный контроль субстрата, используемого для приготовления препарата, так как большая часть используемых в качестве субстратов клеточных линий контаминирована вирусами и микоплазмами (Mahy В.М.с соавт.,1990).

В связи с этим нами было проведено исследование клеток куриного эмбриона на' контаминацию, а также сравнительное изучение чувствительности некоторых методов контроля субстрата вакцины против КЭ на контаминацию микоплазмами.

Для контроля вирусной контаминации клетск куриного эмбриона были использованы методы электронной микроскопии и индикации вирусов с помощью чувствительных клеточнж культур. В результате электронно-микроскопического исследования 10 ".«-рий вакцинного субстрата обнаружено большое количество онковирусов птиц.

В литературе также имеются многочисленные сообщения о присутствии вирусов лейкоза птиц в куриных эмбрионах, используемых для приготовления вакцин (Pospisil L. с соавт.,1991; Oldstone М.В.. 1984).

В силу недоступности метода электронной микроскопии для использования в производственных условиях нами проведены исследования по подбору чувствительных к вирусам птиц клеточных культур. .

Наиболее эффективными культурально-клеточными системами для

обнаружения вирусной контаминации клеток куриного эмбриона по нашим данным являются линии СПЭВ и Л-41.

Таким образом, нами показана возможность использования метода электронной микроскопии и чувствительных клеточных культур для контроля вирусной контаминации вакцинного субстрата.

Нами установлено, что результат выявления ыикоплазменной контаминации клеточных культур зависит от использованного метода (таб. 4).

Таблица 4

Сводные данные по индикации микоплазм в клеточных культурах различными методами

Название I Метод индикации микоплазм

линии I г-------------------------------------------------

I микробиологич. цитологический негативное контр.

ккэ 10/0 8/0 10/2

Л-41 1/1 1/1 2/2

НЕр-2 1/1 1/1 2/2

СПЭВ 1/0 1/1 2/2

Уего 1/0 1/1 1/1

Примечание: В числителе дроби проставлено общеч> число исследованных проб данной линии, в знаменателе - число обнаружения микоплазм.

По мнению многих исследователей (Тихомирова Л.Г. с соавт., 1988; Щегловатова О.Н.с соавт., 1982)и по нашим данным метод негативного контрастирования является наиболее достоверным и информативным. Метод электронной микроскопии с использованием техники негативного контрастирования образцов позволяет безошибочно идентифицировать микоплаамы среди клеточных структур и клеточного дейтрита. |

Во время проведения электронно-микроскопического исследования 10 серий производственного вакцинного субстрата на вирусные контамшшрующие агенты общепринятыми методами валивки клеток в смолы в 2 сериях клеток куриного эмбриона нами обнаружены микоп-лазмы. Следовательно, микоплазменная контаминация имеет место в юеткак куриного эмбриона, являющихся субстратом для производства вакцины против КЭ и свявана с Наличием микоплааменной инфек-

ции у кур-несушек.

Таким образом, показана возможность'использования микробиологического, цитологического методов, электронной микроскопии и чувствительных клеточных культур для выявления микоплазменной и вирусной контаминации субстрата для производства вакцины против КЭ. Полученные данные позволяют рекомендовать использовать данные методы для контроля клеток куриного эмбриона на контаминацию.

Таким образом на основании проведенных исследований разработана система научно-обоснованных критериев оценки безопасности и качества вакцины против КЭ, ее полуфабриката и клеточного субстрата.

- 18 -ВЫВОДЫ

1. Разработаны новые критерии оценки безопасности и качества клеточного субстрата, полуфабриката и готового препарата вакцины против клещевого энцефалита с использованием чувствительных клеточных культур.

2. Обоснована возможность использования клеточных тест-сис-теы для выявления реактогенных серий вакцины против клещевого энцефалита. Наиболее чувствительными клеточными тест-системами признаны диплоидные штаммы клеток М-19, М-22.ФЭЧ и гетероплоид-ная Л-41,позволяющие с помощью теста цитотоксичности выявить ре-актогенные серии препарата.

3. Показано мутагенное действие полуфабриката и готового препарата вакцины на генетический аппарат клеток человека двух модельных клеточных систем (диплоидных клеточных линий и лимфоцитов периферической крови) и лимфоцитов периферической крови привитых людей. Установлено достоверное увеличение числа клеток со структурными нарушениями хромосом в диплоидных клетках в 3,3 раза,в культуре лимфоцитов в 3,9 раза,в лимфоцитах периферической крови привитых людей в 3,5 раза по сравнению с контролем.

4. Выявлена высокая степень контаминации клеток куриного эмбриона онковирусами птиц и в 20% случаев микоплаэмами. Полученные данные явились обоснованием необходимости проведения контроля субстрата для производства вакцины - клеток куриного эмбриона на контаминирующие агенты.

5. Материалы исследований послужили основой для разработки трех методических рекомендаций:

"Методические рекомендации по контролю субстрата вакцины против клещевого энцефалита (клеток куриного эмбриона) на присутствие микоплазм" утвержденц в ГИСК им. Л.А.Тараеевича (протокол N14 от 19.10.93).

"Методические рекомендации по постановке тестов для выявления реактогенных серий вакцины против клещевого энцефалита'. Методические рекомендации представлены на утверждение в ТИСК им.Л.А.Тараеевича.

"Методические рекомендации по контролю мутагенности вакцины против клещевого энцефалита в клеточных тест-системах человеческого происхождения". Методические рекомендации представлены на утверждение в ПКЖ ям.Л. А. Тараеевича.

- 19 -

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Л.В.Лаврентьева, Н.А.Попова, Т.Л.Мирютова. Использование перевиваемых клеточных линий в качестве тест-культур для изучения токсичности компонентов вакцины против клещевого энцефалита // Цитология.-1992, N 9.- С. 57-58.

2. Л.В.Лаврентьева, Т.Л.Мирютова, Н.А.Попова. Использование перевиваемых клеточных линий в качестве тест-культур для выявления токсичных серий вакцины против клещевого энцефалита // Эко-ген.- 1993, N 3.- С. 40-41.

3. Н.А.Попова, Л.В.Лаврентьева. Использование диплоидных клеточных культур человеческого происхождения для изучения действия вакцины против клещевого энцефалита на хромосомы клеток человека // ЭкогеН.- 1993, N 3,- С. 14-15.