Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Влияние квантовых наноструктур состава CdSe/ZnS-DHLA в процессе антенатального развития на морфологию эмбрионов в период позднего органогенеза

ВАК РФ 06.02.03, Звероводство и охотоведение

Автореферат диссертации по теме "Влияние квантовых наноструктур состава CdSe/ZnS-DHLA в процессе антенатального развития на морфологию эмбрионов в период позднего органогенеза"

На правах рукописи

РЯБЦЕВА МАРИЯ СЕРГЕЕВНА

Влияние квантовых наноструктур состава Сс18сЖп8-ОНЬА в процессе антенатального развития на морфологию эмбрионов в период позднего

органогенеза

06.02.03 — ветеринарная фармакология с токсикологией

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

■¿2НШ 2013

Москва 2013

005540206

005540206

Работа выполнена на кафедре ветеринарной медицины Института ветеринарной экспертизы, санитарии и экологии ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств».

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор, академик

РАСХН Уша Борис Вениаминович

Официальные оппоненты: Советкин Станислав Васильевич, доктор

биологических наук (06.02.03), профессор, ФГБУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»), главный научный сотрудник отдела качества и стандартизации фармакологических лекарственных средств

Данилевская Наталья Владимировна, доктор ветеринарных наук (06.02.03), профессор, ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина» (ФГБОУ ВПО МГАВМиБ), заведующая кафедрой фармакологии и токсикологии имени И.Е. Мозгова

Ведущая организация: ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Российской академии сельскохозяйственных наук» (ГНУ ВНИИВСГЭ Россельхозакадемии)

Защита состоится « 19 » декабря 2013 года в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 220.011.01 на базе ФГБУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ») по адресу: 123002, Москва, Звенигородское шоссе д.5, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ВГНКИ». Автореферат разослан «/С » /-г (\С _2013 г.

Ученый секретарь диссертационного гпчртя , „¿у * /

доктор биологических наук, профессор=г^;::^— Букова Н.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. За прошедшее десятилетие активное развитие получили нанотехнологии, которые позволяют создавать материалы размером от 1 до 100 нм, с заданной атомной структурой и совокупностью желаемых свойств (Третьяков Ю.Д., 2012). Особенности физико-химических свойств веществ в виде наночастиц (НЧ) находят широкое применение ветеринарии, в том числе в качестве диагностических тест-систем (Терещенко В.П., 2010; Мешалкин Ю.П., 2008; Iga A.M. et al., 2007; Chermont Q. et al., 2007; Jaiswal J.K. et al., 2003, 2004; Chan W.C.W. etal, 1998).

Несоблюдение схем лечения многих заболеваний и появление побочных реакций и осложнений после применения лекарственных препаратов, как у продуктивных, так и домашних животных, становится актуальное проблема современной диагностики и профилактики, возникающих у них патологических состояний. Одним из наиболее привлекательных типов наночастиц (НЧ) с точки зрения перспективности применения в области флуоресцентной диагностики различных болезней, являются т.н. «квантовые точки» (КТ), полупроводниковые нанокристаллы, характеризующиеся очень маленьким размером 2-10 нанометров. Особенности их фотооптических свойств, позволяют рассматривать данные частицы в качестве более эффективного и универсального флуорофора (Сперанская Е.С. и др., 2011; Берлина А.Н. и др., 2012). Среди таких наноструктур неоспоримое первенство принадлежит КТ состава CdSe/ZnS, покрытым различными органическими лигандами. На основе этого класса наночастиц разрабатываются прижизненные диагностикумы и системы направленного транспорта лекарственных препаратов (Jaiswal J.K. et al., 2004; Medintz I.L. et al., 2005; Michalet X. et al., 2005; Mulder W.J. et al., 2010). Поскольку КТ превосходят стандартные флуорофоры по яркости и стабильности, они постепенно вытесняют последние в области лабораторной диагностики, генной инженерии и биотехнологии.

Глобальное распространение нанотехнологий привело к более тесному взаимодействию живых организмов с разными классами таких частиц. Закономерно возникла необходимость оценки отдаленных последствий влияния данного класса нано ксенобиотиков -на жизненно важные системы животного организма. Практически важным является изучение этого класса ксенобиотиков

на репродуктивную систему животных, особенно в состоянии беременности, а так же на развитие эмбриона и плода.

В последние годы появились научные сообщения об отрицательном действии целого ряда наночастиц на развитие эмбриона и плода (Sun J, et al., 2013). Что касается цитотоксических свойств, а так же влияния КТ на эмбриональное развитие (на ранних стадиях) in vitro, такие данные противоречивы (Lin Wang et al., 2008; Hsieh C.L. et al., 2009). Однако все исследователи сходятся во мнении, что основная роль в цитотоксических свойствах принадлежит CdSe-ядру. Взаимодействие КТ с развивающимися эмбрионами теплокровных животных in vivo изучено недостаточно. Вместе с тем имеются сообщения (Chu M. et al., 2010) о выраженном эмбриолетальном действии КТ, при внутривенном введении последних беременным самкам на поздних сроках беременности. Вопрос о проницаемости плацентарного барьера для таких частиц, а так же о стабильности КТ в организме животных, на сегодняшний день не решен.

Изучение морфологии плодов является основным критерием оценки влияния ксенобиотиков (в частности КТ состава CdSe/ZnS-DHLA) на эмбриональный морфогенез, и состояние системы репродукции в целом. Что, несомненно, позволит в сочетании с оценкой проницаемости плацентарного барьера данного типа НЧ выявить эмбриотоксические эффекты и механизм эмбриотоксического действия КТ. Решение данных вопросов необходимо для понимания потенциальных рисков от применения КТ состава CdSe/ZnS-DHLA в ветеринарии в качестве прижизненных диагностикумов и уточнения безопасности данного типа НЧ. Своевременно предупредить развитие нежелательных эффектов, после применения таких диагностических систем. Этой проблеме и посвящена настоящая работа.

Цель работы. Изучить влияние КТ состава CdSe/ZnS-DHLA на эмбриональное развитие животных и оценить безопасность их применения в качестве прижизненных диагностикумов.

Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить общую токсичность квантовых точек состава CdSe/ZnS-DHLA;

2. Изучить морфологию органов и тканей плодов при воздействии КТ состава CdSe/ZnS — DHLA в процессе антенатального развития на модели эмбрионов лабораторных мышей и куриных эмбрионов;

3. Выявить чувствительность различных этапов эмбрионального развития к воздействию КТ;

4. Выявить тропизм КТ к органам репродуктивной системы самок;

5. Оценить барьерную роль плаценты в проникновении КТ к развивающемуся плоду;

6. На основании полученных результатов определить безопасность применения КТ в составе прижизненных флуоресцентных диагностикумов.

Научная новизна. Представленная работа является первым детальным исследованием влияния квантовых точек состава CdSe/ZnS-DHLA на антенатальное развитие млекопитающих и птиц. Впервые проведена оценка эмбриотоксичности и тератогенности квантовых точек состава CdSe/ZnS-DHLA на модели антенатального развития эмбрионов млекопитающих in vivo. Составлен каталог, отражающий с разным уровнем детализации от организменного до клеточного, морфологию эмбрионов, после воздействия КТ в различные периоды эмбриогенеза.

Выявлен наиболее критический период воздействия КТ на эмбриональное развитие. Проанализирована роль кадмия в нарушении антенатального развития млекопитающих и птиц при воздействии КТ состава CdSe/ZnS-DHLA.

Практическая значимость. На основании полученных данных произведена оценка потенциального риска для развивающихся эмбрионов от воздействия КТ состава CdSe/ZnS-DHLA в период антенатального развития.

Даны рекомендации по дальнейшей разработке диагностикумов на основе

КТ.

Проведена оптимизация методики выявления нарушений морфологии внешних и внутренних структур эмбриона в рамках оценки репродуктивной токсичности. Метод включен в проект методических рекомендаций по оценке влияния наноструктур на аппарат наследственности, разработанных в рамках Государственного контракта № 01.648.12.3004 «Разработка методологии и создание средств контроля для оценки безопасности действия наноматериалов на аппарат наследственности» ФЦП «Развитие инфраструктуры наноиндустрии в

Российской Федерации на 2008-2011 годы», с целью обеспечения единого, научно-обоснованного подхода к оценке биобезопасности наноматериалов, в соответствии с приказом Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека №280 от 12.10.2007 об утверждении и внедрении методических рекомендаций «Оценка безопасности наноматериалов».

Результаты диссертации о классе токсичности и характере влияния КТ состава Сс!Бе/2п8-ВНЬА на антенатальное развитие эмбрионов предоставлены для включения в «Паспорт безопасности» (МБОБ) данного типа КТ, в процессе создания информационной базы по оценке рисков, связанных с процессами производства и оборота наноматериалов.

Апробация. Основные положения диссертации докладывались на:

Всероссийской студенческой научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы морфологии и репаративных гистогенезов», Оренбург, 2012;

Интернет-конференции с международным участием «Современные проблемы анатомии, гистологии и эмбриологии животных»., Казань, 2013;

Расширенном заседании кафедры ветеринарной медицины Института ветеринарной экспертизы, санитарии и экологии ФГБОУ ВПО МГУПП, Москва, 2013.

Публикации. По теме диссертационной работы опубликованы 5 печатных работ, из них 2 в издании по перечню ВАК России.

Благодарности. Автор благодарит научного руководителя Б.В.Ушу за поддержку, и требовательность. Автор выражает искреннюю благодарность коллективу лаборатории токсикологии ОАО «ВНЦМДЛ» за теплоту и дружественную рабочую атмосферу. А так же глубокую признательность и благодарность А.Ю. Бычкову и Я.В. Бычковой за неоценимую помощь при проведении аналитической части работы. Автор выражает свою признательность Л.В. Симутенко и О.В. Макаровой за дискуссии, ценные комментарии и замечания, полученные во время обсуждения различных материалов исследования.

Объем и структура работы. Материалы диссертации изложены на 241 странице компьютерного текста и сгруппированы в следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных

исследований, обсуждение, выводы, список литературы, приложения. Список литературы содержит 224 источника, в т.ч. 121 зарубежных авторов. Работа содержит 177 иллюстраций (микрофотографии, графики, рисунки), 17 таблиц, 10 приложений.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работу проводили на кафедре ветеринарной медицины ИВЭСиЭ ФГБОУ ВПО МГУПП при поддержке лаборатории токсикологии с виварием ОАО «Всероссийского научного центра молекулярной диагностики и лечения» (ВНЦМДЛ) в 2009-2012г. в рамках реализации государственного контракта - № 01.648.12.3004 «Разработка методологии и создание средств контроля для оценки безопасности действия наноматериалов на аппарат наследственности». Химико-аналитическую часть работы проводили в 2012-2013 г. на базе кафедры геохимии геологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова (МГУ), при консультативной поддержке Института геохимии и аналитической химии им. В.И. Вернадского РАН (ГЕОХИ РАН).

Тест-системы. Исследования проводили на лабораторных мышах линии СВА (питомник лабораторных животных ГУ НЦБМТ РАМН, филиал «Столбовая»), массой 19-21 г при определении острой токсичности, и 20-22г при изучении влияния на эмбриогенез. В серии опытов на модели эмбрионального развития куриных эмбрионов использовали оплодотворенные яйцах белого кросса Шейвер Уайт (ППЗ «Птичное», МО, Нарофоминский р-н) массой 58-68 г.

Объект исследования. В работе исследовали водную суспензию квантовых точек состава CdSe/ZnS - (DHLА) (ООО НТИЦ «Нанотех-Дубна», Россия). Ядро -кристаллы селенида кадмия CdSe (№ по CAS 1306-24-7). Внутренняя оболочка -кристаллы сульфида цинка ZnS (№ по CAS 1314-98-3). Внешняя оболочка -молекулы дигидролипоевой кислоты DHLA (№ по CAS 462-20-4) (Sigma, США). Размер частиц 9,5 нм, максимум эмиссии - 610 нм. Концентрация КТ в исходном растворе 33, 0 г/л, что соответствует 0,1мМ раствору. Концентрация кадмия в исходном растворе 10,26 г/л, селена - 7,21 г/л, цинка - 0,038 г/л. В качестве препарата сравнения была использована растворимая соль CdS04 (источник йонов Cd2+) (Sigma, США). В качестве растворителя использовался раствор натрия хлорида 0,9% для инфузий («Биосинтез», Россия).

Исследование общей токсичности. Определение острой токсичности проводили в соответствии МУ по «Токсико-гигиенической оценке безопасности наноматериалов». На протяжении 14 дней после однократного в/в введения исследуемых КТ наблюдали за состоянием животных и учитывали гибель. На основании полученных данных с помощью программы CombiStats 4.0 по методу Личфилда-Уилкоксона рассчитывали МПД (ЛД10), ЛД50, ЛД84. Подбирали дозы для дальнейших исследований. Класс токсичности вещества определяли по Hodge и Sterner.

Исследование влияния КТ на эмбриогенез на модели эмбрионального развития мышей in vivo. Исследование проводили в соответствии со стандартной методикой оценки репродуктивной токсичности (Голиченков В.А., 2005). Для получения животных с датированным сроком беременности виргинных самок мышей помещали на ночь в клетку с интактным самцами той же линии в соотношении 3 к 1 (на 6 самок 2 самца). Утром (до 12 часов) у самок определяли наличие влагалищной пробки. День обнаружения влагалищной пробки считали первым днем беременности. Ксенобиотики вводили беременным самкам внутривенно в латеральную вену хвоста в объеме 0,3 мл один раз в день на протяжении исследуемого периода развития (таблица 1). Для анализа нарушений эмбрионального развития на 17,5 день гестации (25 этап развития по Тайлеру), самок подвергали эвтаназии и вскрывали. Учитывали оплодотворяемость, количество овулироваших фолликулов, живых плодов, резорбированных плодов, мест имплантации путем прямого подсчета. Рассчитывали индекс оплодотворяемости (как отношение числа беременных самок в группе, к общему числу самок в группе), индекс имплантируемости (отношение количества мест имплантации, к числу желтых тел). Оценку жизнеспособности эмбрионов проводили по количеству живых плодов. Плоды оценивали по морфометрическим критериям, морфологии костной системы и внутренних органов.

Исследование влияння КТ на эмбриогенез на модели развития куриного эмбриона. Введение исследуемых ксенобиотиков осуществляли в желточный мешок согласно стандартной методике, до закладки яиц в инкубатор. Яйца инкубировали при температуре +37,8°С и влажности 60% без переворачивания. Группы представлены в таблице 1. Для анализа нарушений

эмбриогенеза на 12 день (38 этап развития по Hamburger & Hamilton) останавливали развития эмбриона, охлаждением яиц до +2°С. Яйца вскрывали. Учитывали жизнеспособность плодов. Плоды оценивали по морфометрическим критериям, морфологии костной системы и внутренних органов.

Таблица 1. Общая схема экспериментов

Серия экспериментов Исследуемые ксенобиотики Контроль Интактный контроль

KT CdSe/ZnS-DHLA CdS04 Физиологический раствор

Модель эмбрионального развития мышей in vivo

Доза Период""""-^-^. беременности Доза KT 1,46 нМ/мышь, 15мкг Cd/мышь 0,3 мл без воздействия

1-6 день гестации N=15 N=15 N=15 N=15

7-11 день гестации N=15 N=15 N=15

12-16 день гестации N=15 N=15 N=15

Модель развития куриного эмбриона

Исследуемая доза, мг/кг (по кадмию) Однократное введение в желточный мешок до закладки яиц в инкубатор.

0,1 N=30 N=30 N=30 N=30

1,0 N=30 N=30

5,0 N=30 N=30

Анализ эмбриоматернала. Каждый плод освобождали от плодных оболочек, подвергали внешнему осмотру, взвешивали, измеряли кранио-каудальный размер. Анатомическое строение костной системы эмбрионов исследовали по методу Доусона в модификации отдела эмбриологии НИИЭМ АМН СССР (Голиченков В.А., 2005; Хабриев Р.У. , 2005) на тотальных препаратах, подготовленных по стандартной методике (ЫеиЬеЛ е1 а1., 1977). Степень окостенения скелета оценивали путем подсчета количества центров оссификации (ц.о.). Анатомическое строение внутренних органов эмбрионов исследовали на временных препаратах, подготовленных по методу Вильсона в модификации отдела эмбриологии НИИЭМ АМН СССР (Голиченков М.А., 2005; Хабриев Р.У., 2005), А так же постоянных гистологических препаратах.

Исследование биораспоеделения КТ в структурах системы репродукции. Оценку тропизма КТ к органам системы репродукции, проницаемости плацентарного барьера, а так же стабильности КТ в организме проводили по результатам изучения накопления кадмия, селена и цинка в яичниках, матке, плаценте, околоплодной жидкости и плодах. Для этого

биологические образцы, полученные от самок мышей, разлагали методом мокрого озоления смесью HN03 (04, Химмед, Россия) и 33% Н202 (04, Химмед, Россия) (в объемном соотношении 3:1). Концентрацию кадмия и цинка определяли методом ICP - MS, на приборе ELEMENT XR (Thermo Scientific™, США). Концентрацию Se - атомно-абсорбционным методом на спектрометре ContAA700 (Analytik Jena, Германия) с использованием гидридной системы HS60 на кафедре геохимии геологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова. Приношу искреннюю благодарность за оказанную помощь инженеру кафедры Макаровой М.А. Относительная погрешность измерения составила 5%.

Оценка безопасности применения KT в качестве in vivo диагностнкумов. Критерием безопасности KT для развивающегося организма животных и птиц считали отсутствие нежелательных явлений, возникающих при воздействии ксенобиотика на организм матери в процессе антенатального развития. К нежелательным явлениям относили: повышение эмбриональной смертности, изменение морфометрических характеристик плодов, снижение гестационного возраста плодов, нарушение морфологии мягких тканей и скелета, замедление процессов оссификации скелета, изменение гистологической картины тканей.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета прикладных программ Statistika 8.О., с использованием критерия t-критерия Стъюдента, критерий Манна-Уитни и точный критерий Фишера. Критический уровень значимости для всех статистических критериев р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Общая токсичность KT состава CdSe/ZnS-DHLA. KT состава CdSe/ZnS-DHLA ранее не были охарактеризованы с точки зрения общей токсичности, что затрудняло подбор доз для исследований при курсовом введении и потребовало отдельного изучения. По результатам токсикометрии были рассчитаны значения МПД и средне-смертельной дозы, которые представлены в таблице 2. Результаты позволяют отнести исследуемые KT к 2 классу токсичности «высокотоксичные вещества».

Таблица 2 Расчетные значения токсических доз КТ

нМ/мышь мг/кг (по КТ) мкг/мышь (по кадмию)

LD10= 1,95 LD,0 = 3,22 LD,0 = 20,03

LDi6 - 2,12 LD,6 = 3,50 LD16 = 21,78

LDso = 2,73 LDso = 4,51 LDso = 28,04

LD84 = 3,05 LD84 = 5,03 LD84 = 34,31

На основании анализа фактически полученных и литературных данных была выбрана доза для дальнейшего исследования влияния КТ на эмбриональное развитие, которая составила 1,46 нМ КТ/мышь или 15мкг/мышь (по кадмию). Выбранная доза близка к максимально-переносимой дозе (ЛДШ) для мышей, потенциально способна вызвать выраженное эмбриотоксическое действие, а так же соответствует минимальной расчетной дозе растворимой соли CdS04, вызывающей эмбриотоксическое действие (Залавина C.B., 2009; Саломеина Н.В., 2005).

Исследование влияния КТ на эмбриогенез на модели эмбрионального развития мышей in vivo. Проведены исследования влияния КТ состава CdSe/ZnS-DHLA на эмбриогенез на модели эмбрионального развития мышей in vivo в различные периоды антенатального развития: предимплантационный период с 1 по 6 дни беременности, период органогенеза с 7 по 11 дни беременности, период фетогенеза с 12 по 16 дни беременности. Такой подход позволил смоделировать условия воздействия КТ на эмбриональное развитие теплокровных животных с учетом барьерной функции плаценты, выявить период наиболее сенситивный к действию КТ, а так же приблизиться к пониманию механизмов токсического действия.

Высокий класс токсичности КТ, закономерно отразился на состоянии беременных самок мышей. Курсовое введение исследуемых КТ вызывает гибель беременных самок вне зависимости от периода воздействия. С повышением массы тела самок, за счет увеличения массовой доли плодов, проявление токсических эффектов снижается. Препарат сравнения (CdS04) не вызывает гибель самок на протяжении всего исследования.

Стрессовое воздействие и общая интоксикация организма беременных самок, при воздействии сравниваемых ксенобиотиков, выразились в тенденции к

снижению имплантируемое™ эмбрионов и количества плодов у беременных самок по сравнению с контрольной группой, вне зависимости от периода воздействия ксенобиотиков. Достоверные различия отмечены только при введении КТ в период с 7 по 11 дни гестации. Данный период, впрочем, оказался наиболее чувствительным и характеризовался достоверным снижением индекса оплодотворяемости во всех исследуемых группах по сравнению с интактным контролем.

Анализ морфометрических показателей плодов на 17,5 день развития, выявил достоверное снижение массы и кранио-каудалыюго размера плодов 0,52±0,08 г, 15,85±0,98 мм (р < 0,05), полученных от самок после воздействия КТ с 7 по 11 дни беременности по сравнению с контролем 0,68±0,03 г, 17,81±0,49 мм. Морфометрические характеристики и результаты внешнего осмотра позволяют отнести полученные эмбрионы к более раннему сроку развития, поскольку соответствуют верхней границе физиологической нормы эмбрионов 24 этапа развития или нижней границе эмбрионов 25 этапа развития по Тайлеру (Kaufman, 1992). Снижение гестационного возраста плодов было сопряжено с замедлением процессов оссификации в грудном, поясничном отделах позвоночника, грудной кости (5,7±3,8 ц.о., 3,0±2,0 ц.о., 2,7±1,8 ц.о.) по сравнению с контролем (10,3±0,4 ц.о., 5,0±0,0 ц.о., 5,0±0,0 ц.о.), и низкой плодностью беременности (3,0±1,1 плодов, против 6,5±1,0 плодов в контроле), что позволило отнести данный эффект, к проявлению общей задержки развития, на фоне интоксикации.

Влияние ионов кадмия на эмбрион в период эмбриогенеза (1-6 дни гестации) также характеризуется снижением плодности беременности, которая составила 3,0±1,3 плодов, против 6,5±1,0 плодов в контроле. Морфометрические характеристики плодов, и гистологический возраст костной системы остаются в пределах физиологической нормы и не отличаются от контрольной группы. По-видимому, элиминация доимплантационных зародышей обеспечивает более комфортные условия выживания эмбрионов, которые получают возможность нормально развиваться. А действие ионов кадмия в исследуемой дозировке, в отличие от КТ, вызывает меньший метаболический сдвиг, который не отражается на динамике фетогенеза.

Воздействие исследуемых ксенобиотиков с 1 по бис 12 по 16 дни беременности самок характеризуется отсутствием общих токсических эффектов.

Зарегистрированные показатели репродуктивной функции опытных и контрольных групп находятся в пределах вариации величин, свойственных лабораторным мышам. Морфометрические характеристики плодов и гистологическая зрелость костной системы находятся в прямой зависимости от плодности беременности. Исключение составляет группа плодов, полученных от самок, после введения препарат сравнения с 1 по 6 дни беременности. В данной группе отмечается тенденция к снижению численности центров окостенения в некоторых отделах скелета (грудная кость 3±2,0 ц.о., кости таза 4±2,0 ц.о.), по сравнению с контрольной группой (4,7±0,5 ц.о., 5,5±0,9 ц.о.). По-видимому, длительное воздействие ионов кадмия на материнский организм нарушает кальциевый метаболизм, что проявляется в снижении темпов оссификации скелетов плодов.

Аномалий развития внутренних органов и скелетов плодов во всех исследуемых группах обнаружено не было.

Гистологическое исследование тканей. В морфогистологической структуре печени плодов, полученных от самок, после введения исследуемых КТ и препарата сравнения с 1 по 6 и с 7 по И дни беременности, отмечалось увеличение доли клеточных элементов гемопоэза на фоне сохранения клеточности печеночных балок, по сравнению с контролем (рисунок 1), что свидетельствует о более активном процессе гемопоэза, по сравнению с физиологической нормой. В морфогистологической структуре гепатоцитов эмбрионов, полученных от самок, после введения исследуемых КТ с 7 по 11 дни беременности визуализировались крупные вакуоли (рисунок 2).

Морфогистологические исследования печени эмбрионов полученных от самок, после введения исследуемых ксенобиотиков с 12 по 16 дни беременности показали увеличение клеточных элементов гемопоэза, которое сопровождалось снижением клеточности печеночных балок, по равнению с контролем (рисунок 1).

В структуре легочной ткани эмбрионов, полученных от самок после введения исследуемых КТ в период с 12 по 16 дни беременности, наблюдается снижение просвета альвеол и увеличение доли стромы органа (рисунок 2).

Результаты изучения гистологической структуры подтверждают отсутствие нарушений формирования внутренних органов плодов при воздействии КТ и препаратом сравнения в процессе антенатального развития.

100

контроль КТ1-6 КТ7-11 КТ12-16 Сс15041-6 СсВ047- Сс150412-

11 16

■ клеточные элементы гемопоэза шт/в п.зр. гелатоциты шт/е п. эр.

Рисунок 1. Влияние КТ и препарата сравнения на клеточность системы эритропоэза и гепато-биллиарной системы печени. (* р<0,05).

Рисунок 2. Микрофотография гистологических срезов тканей печени (1,2) и легких (3) эмбриона контрольной группы (А) и группы эмбрионов полученных от самок после воздействия КТ в период с 7 по 11 дни гестации. Окраска гематоксилин-эозин. (1- объектив х40, 2-объектив х100, 3-объектив х20). Вместе с тем, следует отметить, что введение изучаемых ксенобиотиков беременным самкам вне зависимости от периода воздействия приводит к активации гемопоэза у плода в возрасте 17,5 дней. КТ оказывают более выраженное отрицательное влияние на гистологическую структуру тканей эмбрионов по сравнению с сульфатом кадмия, что проявляется развитием дистрофических процессов в гепатоцитах при воздействии КТ в период органогенеза, и замедлением формирования легочной ткани при воздействии в период фетогенеза.

Исследование биораспределения КТ в структурах системы репродукции. При введении исследуемых КТ вне зависимости от периода воздействия наибольшая концентрация кадмия отмечается в тканях яичников. В тканях плода кадмий накапливается в следовых количествах, его концентрация не превышает 10 ррЬ. При воздействии сульфатом кадмия на организм самки распределение этого элемента зависит от периода беременности. Накопление кадмия в плодах отмечается при введении препарата сравнения с 7 по 11 и с 12 по 16 дни беременности (рисунок 3).

Воздействие с 1 по б дни развития

| »

Воздействие с 1 по б дни развития

Воздействие с 7 по 11 дии развития

Воздействие с 7 по 11 дни развития

Воздействие с 12 по 16 дни

.........II

! 1........*'

■1Г:К. | 1 5Д: "

Воздействие с 12 по 16 дни

развития

*

«

Рисунок 3. Влияние введения КТ и препарата сравнения на распределение ионов кадмия в органах системы репродукции самки и плодах. (* р<0,05).

Введение КТ не влияет на накопление цинка в органах системы репродукции и плодах. Концентрация этого элемента во всех исследуемых группах остается на физиологическом уровне и не отличается от контроля. Увеличение концентрации селена отмечается в тканях яичников, но преимущественно во втором и третьем триместре беременности, а так же в тканях плода во втором триместре беременности (рисунок 4).

Концентрация селена в плаценте

Концентрация селена 8 яичниках

1 1...........1

II Е 1

Рисунок 4 Влияние введения КТ и препарата сравнения на распределение ионов селена в плодах, тканях плаценты и яичников самок. (* р<0,05).

Анализ концентраций ионов кадмия, цинка и селена в биологических тканях показал, что введение КТ не вызывает сочетанного распределение химических элементов пропорциональное химическому составу КТ (Сс1:8е:2п 270:190:1), ни в одном из исследуемых элементов системы репродукции. Это позволяет сделать вывод о постепенном разрушении структуры КТ: растворении оболочки органических лигандов и протективной оболочки 2п8, и, в дальнейшем, постепенном разрушении структуры СёБе-ядра, с высвобождением свободных ионов кадмия. Совместное накопление кадмия и селена отмечается в тканях яичников, во втором и третьем триместре беременности, а так же в тканях плода во втором триместре беременности. Массовое соотношение которых, составляет соответственно 2,4, 2,1, 0,05, против 1,42 в составе КТ. Что косвенно свидетельствуют о накоплении Сс1 и Бе в яичниках структуре Ссйе - ядра, а так же преимущественно раздельной миграции этих элементов через плаценту. Тропизм КТ к яичникам, в случае введения в составе КТ, может рассматриваться как предпосылка к выраженному токсическому влиянию на гаметогенез.

Анализ концентрации химических элементов в тканях плода показал, что КТ в недеградированной форме не способны преодолевать плацентарный барьер, при гемохориальном типе плаценты. Ионизированный кадмий, может частично преодолевать плацентарный барьер, особенно в процессе плацентации, пока функция плаценты еще полностью не сформирована.

Исследование влияния КТ на эмбриогенез на модели развития куриного эмбриона. Исследование на модели развития куриного эмбриона провели для трех уровней доз, рассчитанных с учетом данных, полученных на предыдущих этапах работы. Наименьшая соответствовала концентрации КТ в тканях плода, при воздействии на организм матери в период с 7 по 11 дни

беременности. Наибольшая доза соответствовала концентрации КТ в яичниках самки. В основу расчета было положено предположение, что весь накопившийся кадмий, проник в ткани эмбриона в структуре КТ.

Оценка выживаемости показала значительную чувствительность развивающихся куриных эмбрионов к введению раствора исследуемых КТ и раствора сульфата кадмия. При близких значениях эмбриолетальности исследуемых препаратов, динамика гибели значительно отличалась (таблица 3).

Таблица 3. Динамика гибели куриных эмбрионов под воздействием КТ

состава С(18е/2п8-ОНЬА и препарата сравнения.

Дни развития КТ 0,1 мг/кг КТ 1,0 мг/кг КТ 5,0 мг/кг сазо4 0,1 мг/кг Сй804 1,0 мг/кг Сё504 5,0 мг/кг Контроль Интактные

Эмбриолетальность, %

1-3 26 26 0 7 83 63 20 33

4-7 44 54 77 63 17 13 0 0

Эмбриолетальнос ть к 12 дню развития 70 80 77 70 100 83 20 33

Важно отметить, что при введении высокой дозы сульфата кадмия, превышающей ЛД100 (1,0 мг/кг по кадмию), отмечается увеличение выживаемости куриных эмбрионов. Данный эффект, по-видимому, связан с коагуляцией белков под действием ионов кадмия в месте введения раствора с образованием белковой капсулы, которая, в свою очередь, снижает биодоступность препарата.

На фоне проявления эмбриотоксических эффектов, морфометрический анализ эмбрионов, выживших к 12 дню развития, выявил лишь тенденцию к снижению массы плодов после введения КТ в дозах 0,1 мг/кг и 1,0 мг/кг (по кадмию), а так же после введения и препарата сравнения в дозе 0,1 мг/кг (по кадмию), которое составило 2,66±0,38 г, 2,38±1,24 г и 2,53±0,24 г соответственно, против 3,09±0,35 г и 3,15±0,34 г для группы физиологического раствора и интактной группы соответственно. Кранио-каудального размер плодов составилял 36,0±3,3мм, 31,0±10,0мм и 36,5±5,5мм соответственно, против 40,8±2,43мм в контрольной группе. Введение препарата сравнения также вызывало снижение кранио-каудального размера (31,5±5,75мм), но только в группе, получавшей низшую дозу.

В отличие от сульфата кадмия, действие КТ не затрагивает минерализацию костей (таблица 4).

Таблица 4. Влияние КТ состава CdSe/ZnS-DHLA и препарата сравнения на

формирование центров окостенения куриных эмбрионов.

N. Группа (доза по кадмию) Отдел скелета ч^ КТ 0,1 мг/кг КТ 1,0 мг/кг КТ 5,0 мг/кг CdS04 0,1 мг/кг CdS04 5,0 мг/кг Контрол ь Интактные

N=9 N=6 N=7 N=9 N=5 N=24 N=20

Количество центров окостенения, шт

пальцы кисти (право) 3,0±1,0 3,0±0,7 3,2±0,8 2,3±0,4* 3,0±0,5 4,0±0,7 3,3±0,7

пальцы кисти (лево) 3,0±1,0 3,0±0,7 3,2±0,8 2,0±0,7* 3,0±0,5 4,0±0,7 3,3±0,7

пальцы стопы (право) 5,5±0,5 4,7±1,1 5,2±1,4 1,3±1,0* 3,0±0,5 3,5±1,0 3,0±2,0

пальцы стопы (лево) 4,1±0,3 3,7±0,4 4,3±0,9 1,3±1,0* 3,0±0,5 3,5±1,0 3,3±2,2

шейный отдел позвоночника 4,5±0,5 5,7±1,5 6,8±2,3 4,3±3,1* 6,0±2,7 4,5±3,0 7,0±4,7

тазовая кость 1,5±0,5 1,0±0,6 1,0±0,5 0* 0* 0,5±0,4 1,0±0,5

(* р<0,05)

Детальное изучение морфологии внутренних органов куриных эмбрионов, выживших к 12 дню развития, не выявило различий экспериментальных и контрольных групп.

Результаты исследования позволили сделать вывод, что выявленное неспецифическое проявление эмбриотоксичности связано с непосредственным влиянием КТ на эмбрион и не зависит от высвобождения кадмия или других ионов.

Оценка безопасности применения КТ в качестве in vivo днагностикумов. Поведенные нами исследования показали, что КТ состава CdSe/ZnS-DHLA относятся к высокотоксичным соединениям, что закономерно отражается на состоянии беременных самок, при внутривенном введении таких частиц. Полученные результаты однозначно позволяют сделать вывод об отрицательном влиянии воздействия исследуемых КТ на антенатальное развитие в дозе 1,46 нМ/мышь в период с 1 по 7 дни беременности. А так же об отрицательном влиянии исследуемых КТ на развивающийся куриный эмбрион в дозах 0,1 мг/кг и более (по кадмию). Однако КТ не вызывают тератогенного действия и не нарушают процессы дифференциации тканей и закладки органов, что проявляется сохранением морфологического строения плодов, анатомии и топографии внутренних органов и костей скелета.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В организме млекопитающих действие ксенобиотиков на антенатальное развитие складывается из влияния на гомеостаз материнского организма и, в случае проницаемости плацентарного барьера, непосредственного влияния на эмбрион. В своей работе нами использован подход, позволяющий в определенной степени смоделировать наиболее реальные условия воздействия КТ на эмбриогенез.

Комплексные исследования, присутствующие в нашей работе, позволили приблизиться к пониманию механизма токсического действия КТ, и роли данного класса ксенобиотиков в возникновении патологий антенатального развития и предупредить их использование в диагностике отдельных заболеваний животных.

Воздействие и КТ, и сульфата кадмия вызывает преимущественно однотипные реакции функциональной системы мать-плод. Метаболический ацидоз снижает резистентность клеток (Савченков Ю.И., 1980), их миграционную способность (Bellairs R., 1998) и приводит к запаздыванию темпов развития некоторых внутренних органов, а недостаточность тканевого дыхания приводит к активации компенсаторно-приспособительных механизмов, таких как активизация процессов гемопоэза. Подобные эффекты были неоднократно описаны при изучении воздействия ионов кадмия на развитие плода (Залавина C.B., 2009; Саломеина Н.В., 2005).

Несмотря на однотипность реакций, действие КТ характеризуется значительно большей выраженностью общих эмбриотоксических эффектов, и развитием умеренной гидропической дистрофии печени. Что свидетельствует о более глубоком сдвиге гомеостаза материнского организма и соответственно организма плода.

По всей видимости, механизм реализации токсического действия КТ связан, прежде всего, со способностью и самих КТ CdSe/ZnS-DHLA и отдельно CdSe-структуры ядра вызывать оксидативный стресс в живых системах. И в меньшей степени обусловлен действием кадмия, диффундировавшего из КТ. Малый размер кристаллов приводит к концентрированию атомов на поверхности частицы, и соответственно к концентрированию донорных или акцепторных центров и образованию свободных радикалов. Кроме того, для кристаллов КТ характерно некоторое отклонение кристаллической решетки от стехиометрического состава.

Образующиеся дефекты служат дополнительными центрами образования свободных радикалов. Образуясь внутри клетки, свободные радикалы связываются с функциональными группами белков, нарушая многие ферментативные системы. Что приводит к изменению характерного для беременности гомеостаза самки и смещению «гестационной доминанты».

ВЫВОДЫ

1. Квантовые точки состава CdSe/ZnS-DHLA по параметрам острой токсичности относятся к классу — высокотоксичные вещества (Hodge и Sterner): ЛД50 для мышей линии СВА при внутривенном введении составляет 4,51 мг/кг (или 2,73 нМ/мышь). Курсовое введение исследуемых квантовых точек в сублетальной дозе 2,41 мг/мышь (1,46нМ/мышь) вызывает усиление токсического эффекта, проявляющуюся в гибели животных.

2. Квантовые точки состава CdSe/ZnS-DHLA вызывают выраженное эмбриотоксическое действие на антенатальное развитие мышей линии СВА и куриных эмбрионов, проявляющееся в снижении морфометрических характеристик плодов и увеличении эмбриональной смертности, но не обладают тератогенным действием.

3. Эмбриотоксическое действие КТ и сульфата кадмия характеризуется сходными реакциями, но степень выраженности токсических эффектов при воздействии квантовыми точками значительно выше, и сопровождается развитием более глубокого сдвига гомеостаза материнского организма и организма плода.

4. Наиболее чувствительным периодом эмбрионального развития мышей к воздействию квантовых точек состава CdSe/ZnS-DHLA является период органогенеза с 7 по 11 дни гестации. Курсовое введение исследуемых квантовых точек беременным самкам мышей в данный период в дозе 1,46 нМ/мышь вызывают снижение гестационного возраста плодов на 12-24 часа, замедление процессов минерализации костей плодов, и умеренные дистрофические изменения в печени.

5. Квантовые точки состава CdSe/ZnS-DHLA при курсовом внутривенном введение беременным самкам мышей в дозе 1,46 нМ/мышь обладают наибольшим тропизмом к тканям яичников. Что приводит к увеличению концентрации кадмия, при воздействии в период с 1 по 6 дни гестации в 1000 раз,

а в период с 7 по 11 и 12 по 16 дни гестации - в 2000 раз по сравнению с фоновыми значениями.

6. В процессе циркуляции в организме мышей КТ способны разрушаться до ядерных (CdSe) и оболочечных структур (ZnS, DHLA), с частичным высвобождением свободных ионов металлов. В неизмененном виде КТ не проникают через сформированный плацентарный барьер при гемохориальном типе плаценты, но при воздействии в период формирования плаценты, вызывают увеличение концентрации кадмия в тканях плода в 8 раз по сравнению с фоновыми значениями.

7. Применение КТ состава CdSe/ZnS-DHLA для создания прижизненных диагностикумов не является безопасным, как для антенатального развития эмбрионов, вызывая эмбриональную гибель и замедление развития, так и для организма в целом, поскольку приводит к накоплению в организме ионов кадмия.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Полученные результаты позволяют рекомендовать ограничить применение квантовых точек CdSe/ZnS-DHLA в составе прижизненных диагностикумов, особенно во 2 триместре беременности. Однако не являются основанием для прекращения работ в области использования таких частиц в лабораторной диагностике in vitro;

При дальнейшей разработке прижизненных диагностикумов на основе квантовых точек особое значение должно уделяться стабильности таких структур во внутренней среде организма.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИСЕРТАЦИИ

Рябцева М.С. Влияние CdSe/ZnS-DHLA квантовых точек на развитие куриных эмбрионов/ М.С.Рябцева, Б.В.Уша, Г.Г.Барсегян, Е.А.Журжа //Аграрная наука. - 2013. - №8. С. 25-27.

Рябцева М.С. Оценка влияния фосфолипидной транспортной системы на показатели эмбрионального развития in vivo / М.С.Рябцева, О.В.Климова, Г.Г.Барсегян // Проблемы репродукции. - 2012. - №2/2012. - С. 23-26.

Рябцева М.С. Исследование зависимости эмбриотоксического действия квантовых точек от пути проникновения в организм /М.С. Рябцева М // Материалы IV всероссийской научной Интернет-конференция с международным участием «Современные проблемы анатомии, гистологии и эмбриологии животных». - Казань, 2013. - С.148-151.

Рябцева М.С. Изучение влияния CdSe/ZnS-DHLA квантовых точек на формирование скелета плода мышей в процессе эмбриогенеза /М.С. Рябцева, Е.А. Журжа//Материалы всероссийской студенческой конференции с международным участием «Актуальные вопросы морфологии и репаративных гистогенезов - 2012»,- Оренбург, 2012. - С. 46-49.

Рябцева М.С. Эмбриотоксическое действие фуллеренов С60 в липосомальной среде, проявляющееся в раннем постнатальном периоде развития потомства мышей / М.С. Рябцева, К.А. Алексеенко // Материалы 14-й Пущинской международной школы-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века»,- Пущино, 2010. - Том 1. - С. 173.

Подписано в печать 12.11.2013. Формат 60x84/16. Тираж 100 экз. Типография «Принта»

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Рябцева, Мария Сергеевна, Москва

российская федерация

Министерство образования и науки федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ПИЩЕВЫХ

ПРОИЗВОДСТВ»

На правах рукописи

04201 450129

РЯБЦЕВА МАРИЯ СЕРГЕЕВНА

Влияние квантовых наноструктур состава С(!8е^п8-ОНЬА в процессе антенатального развития на морфологию эмбрионов в период позднего органогенеза

06.02.03 - ветеринарная фармакология с токсикологией

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель доктор ветеринарных наук, профессор, академик РАСХН Уша Борис Вениаминович

Москва 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ...................................................................................................................................4

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................................7

1.1.Этиология внутриутробных повреждений.......................................................................7

1.2.Наноксенобиотик и..............................................................................................................15

1.3.Квантовые точки.................................................................................................................18

1.4.Методы оценки повреждающего действия ксенобиотиков на развивающийся организм ................................................................................................42

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..................................................................................51

2.1. Материалы...........................................................................................................................52

2.2. Методы.................................................................................................................................54

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ___________________________________61

3.1. Результаты изучения общего токсического действия KT состава CdSe/ZnS-DHLA на мышей - самок линии СВА при однократном внутривенном введении...................61

3.2. Результаты изучения влияния KT состава CdSe/ZnS-DHLA на антенатальное развитие млекопитающих на модели мышей линии СВА................................................63

3.3.Изучение распределения KT в органах репродуктивной системы..........................100

3.4.Результаты изучения влияния KT состава CdSe/ZnS-DHLA на антенатальное развитие птиц на модели развития куриного эмбриона.................................................104

ГЛАВА 3 ОБСУЖДЕНИЕ.....................................................................................................109

ГЛАВА 4 ВЫВОДЫ................................................................................................................117

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ..............................................................................118

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................................................119

ПРИЛОЖЕНИЕ А Лекарственные препараты, представляющие опасность для плода и новорожденного........................................................................................................141

ПРИЛОЖЕНИЕ Б Характеристика куриного эмбриона 38 этапа развития по Hamburger & Hamilton...........................................................................................................144

ПРИЛОЖЕНИЕ В Характеристика эмбрионов мыши по Тайлеру.............................146

ПРИЛОЖЕНИЕ Г Описание образцов квантовых точек.............................................150

ПРИЛОЖЕНИЕ Д Классификация лекарственных препаратов по степени токсичности..............................................................................................................................151

ПРИЛОЖЕНИЕ Е Морфология скелета эмбрионов мышей на 17,5 день развития. 152

ПРИЛОЖЕНИЕ Ж Морфология внутренних органов эмбрионов мыши на 17,5 день развития....................................................................................................................................161

ПРИЛОЖЕНИЕ И Каталог микрофотографий гистологических срезов тканей эмбрионов мышей на 17,5 день развития...._____...______________________________________________________________169

ПРИЛОЖЕНИЕ К Морфология скелетов куриных эмбрионов 12 дня развития......232

ПРИЛОЖЕНИЕ Л Морфология внутренних органов куриных эмбрионов 12 дня развития....................................................................................................................................235

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Современный этап развития науки характеризуется тесным взаимодействием технических и биологических наук, что приводит к активному созданию новых высокотехнологичных подходов к решению актуальных задач биофармацевтической области человеческой деятельности. За прошедшие 5-10 лет активное развитие получили так называемые нанотехнологии - междисциплинарная область знаний фундаментальной и прикладной науки и техники, позволяющая создавать материалы и частицы очень маленьких размеров (от 1 до 100 нм), с заданной атомной структурой и совокупностью свойств [Третьяков Ю.Д., 2012]. Особенности физико-химических свойств веществ в виде наночастиц могут быть широко использованы в ветеринарии, прежде всего, для: диагностики и лечения опухолей различного происхождения и локализации, лечения внутриклеточных инфекций, таких как туберкулез, бруцеллез, малярия, создания более эффективных иммунобиологических препаратов, повышения эффективности лекарственных препаратов посредством адресной доставки к органу мишени, фотодинамической терапии, создания имплантов различного назначения, инструментов генной инженерии и молекулярной биотехнологии [Jaiswal J. К., 2004; Iga А. М., 2000; Chan W.C.W., 1998].

В настоящее время на основе особого класса наночастиц - «квантовых точек» (KT) - активно разрабатываются: различные прижизненные флуоресцентные диагностикумы и системы визуализации, для применения in vivo, наноразмерные системы направленного транспорта лекарственных препаратов [Jaiswal J. К., 2004; Medintz I.L., 2005; Ширманова М. В., 2009; Dubertret В., 2002; Stroh М., 2005]. Поскольку несоблюдение схем лечения многих заболеваний и появление побочных реакций и осложнений после применения лекарственных препаратов, как у продуктивных, так и домашних животных, делает особенно актуальной проблему современной диагностики и профилактики, возникающих у них патологических состояний.

Глобальное распространение нанотехнологий и внедрение наноматериалов в повседневную жизнь, включая их целевое применение, накопление в производственной среде, вовлечение в круговорот веществ, привело к увеличению вероятности взаимодействия живых организмов с разными классами таких частиц. Закономерно возникла необходимость оценки отдаленных последствий влияния данного класса нано-ксенобиотиков на живые системы.

Сельскохозяйственные продуктивные животные находятся преимущественно в состоянии перманентной беременности, поэтому проблема изучения влияния наночастиц

и материалов на эмбриональное развитие, в настоящее время, выдвигается на первый план [Кашин А.С.,2008]. Понимание потенциальных рисков, в том числе для организма в период антенатального развития, и своевременное предупреждение их развития может значительно снизить численность слабого и нежизнеспособного потомства, а так же численность потомства, подвергающегося выбраковке. Это позволит реализовать механизм одной из наиболее важных задач животноводства, как области человеческой деятельности, направленной на получение продукции животного происхождения.

Таким образом, оценка влияния наночастиц на эмбриогенез в процессе антенатального развития является актуальной задачей.

Цель

Изучить влияние квантовых точек состава CdSe/ZnS-DHLA на эмбриональное развитие животных и оценить безопасность их применения в качестве прижизненных диагностикумов.

Задачи исследования

Для достижения поставленной цели предполагается решить следующие задачи:

1. Изучить общую токсичность квантовых точек состава CdSe/ZnS - DHLA;

2. Изучить морфологию органов и тканей плодов при воздействии КТ состава CdSe/ZnS - DHLA в процессе антенатального развития на модели эмбрионов лабораторных мышей и куриных эмбрионов;

3. Выявить чувствительность различных этапов эмбрионального развития к воздействию КТ;

4. Выявить тропизм КТ к органам репродуктивной системы самок;

5. Оценить барьерную роль плаценты в проникновении КТ к развивающемуся эмбриону;

6. На основании полученных результатов определить безопасность применения КТ в составе прижизненных флуоресцентных диагностикумов.

Научная новизна работы

Представленная работа является первым детальным исследованием влияния квантовых точек состава CdSe/ZnS-DHLA на антенатальное развитие млекопитающих и птиц. Впервые проведена оценка эмбриотоксичности и тератогенности квантовых точек состава CdSe/ZnS-DHLA на модели антенатального развития эмбрионов млекопитающих in vivo. Составлен каталог, отражающий с разным уровнем детализации от организменного до клеточного, морфологию эмбрионов, после воздействия КТ в различные периоды эмбриогенеза.

Выявлен наиболее критический период воздействия КТ на эмбриональное развитие. Проанализирована роль кадмия в нарушении антенатального развития млекопитающих и птиц при воздействии КТ состава СёБе^пЗ-ОНЬА.

Практическая значимость работы

На основании полученных данных произведена оценка потенциального риска для развивающихся эмбрионов от воздействия КТ состава Сс18е/2п8-ОНЬА в период антенатального развития.

Даны рекомендации по дальнейшей разработке диагностикумов на основе КТ.

Проведена оптимизация методики выявления нарушений морфологии внешних и внутренних структур эмбриона в рамках оценки репродуктивной токсичности. Метод включен в проект методических рекомендаций по оценке влияния наноструктур на аппарат наследственности, разработанных в рамках Государственного контракта № 01.648.12.3004 «Разработка методологии и создание средств контроля для оценки безопасности действия наноматериалов на аппарат наследственности» ФЦП «Развитие инфраструктуры наноиндустрии в Российской Федерации на 2008-2011 годы», с целью обеспечения единого, научно-обоснованного подхода к оценке биобезопасности наноматериалов, в соответствии с приказом Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека №280 от 12.10.2007 об утверждении и внедрении методических рекомендаций «Оценка безопасности наноматериалов».

Результаты диссертации о классе токсичности и характере влияния КТ состава СсКе^пБ-ОНЬА на антенатальное развитие эмбрионов предоставлены для включения в «Паспорт безопасности» (МБОБ) данного типа КТ, в процессе создания информационной базы по оценке рисков, связанных с процессами производства и оборота наноматериалов.

Основные положения, выносимые на защиту:

- токсико-фармакологическая характеристика квантовых точек состава СсШе^пБ -

БНЬА;

- результаты исследований морфологии эмбрионов мышей и куриных эмбрионов при воздействии квантовыми точками состава СёЭе/гпБ -ОНЬА в процессе антенатального развития;

- тропизм квантовых точек состава Сс18е/7п8 -ИНЬА к органам системы репродукции самки и барьерная роль плаценты в проникновении квантовых точек к тканям плода;

- обоснование безопасности применения квантовых точек Сё8е/2п8 -ОНЬА в составе прижизненных диагностикумов.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Этиология внутриутробных повреждений

Эмбриональное развитие организма, как значимая часть онтогенеза, представляет собой совокупность закономерных, взаимосвязанных, характеризующихся определенной временной последовательностью морфологических, физиологических и метаболических преобразований от момента оплодотворения до рождения, в процессе которых новый организм проходит стадии от одноклеточной зиготы до сформировавшегося плода. Характер морфо-физиологии новорожденного определяется в значительной степени течением антенатального развития. Беременность сопровождается формированием в организме матери «гестационной доминанты» [4, 48], которая обеспечивает взаимодействие друг с другом материнского организма и организма плода с общей целью - обеспечить нормальное развитие эмбриона и рождение жизнеспособного потомства [3]. Отсутствие комплекса оптимальных условий является основной и наиболее важной причиной задержки, остановки развития, формирования аномалий организма и других видов патологии внутриутробного развития [64].

Возникновение патологий может быть результатом, как неполноценности генетического аппарата зиготы [14, 15], так и действия на плод факторов внешней среды и различных ксенобиотиков, за счет непосредственного повреждения клеток и их нормального функционирования, или нарушения маточно-плацентарного кровообращения и функции плаценты [48, 64, 63, 18, 182]. Возникшие не компенсированные патологии эмбрионального развития сказываются не только на численности новорожденного потомства, но и на его здоровье (рождение слабого потомства, потомства со скрытыми патологиями, нарушениями генетического аппарата и др.).

1.1.1. Приспособительные реакции эмбриона и плода

По своим анатомо-физиологическим особенностям незрелый организм существенно отличается от взрослого [47]. Его реактивность на всех стадиях развития несовершенна. На начальных стадиях - она определяется преимущественно на клеточном уровне, т.е. за счет цитофизиологических систем. В дальнейшем, с последовательным появлением систем органов - определяется «созреванием» отдельных морфологических структур. Незрелость многих систем (нервной, эндокринной, рецепторной, эффекторной, ферментной и др.) в эмбриональном периоде развития определяет их пониженную резистентность и ограниченность приспособительных реакций плода [103,41].

Патогенному воздействию в период эмбрионального развития зародыш может подвергаться на всех этапах от зиготы до плода, а особенности приспособительных и

компенсаторных реакций накладывают свой отпечаток на характер возникающих патологий [68,70,84]. На самых ранних стадиях развития эмбрион реагирует на вредное воздействие только гибелью. Бластопатии - нарушения развития в зародыше на стадии до завершения формирования бластоцисты - могут вызывать гибель зародыша, пороки с нарушением формирования его оси (симметричные, ассиметричные, не полностью разделившиеся близнецы, циклопия, аплазия почек, сирингомиэлия) [53]. Из 50% бластоцист, погибающих в первую неделю 1/3 гибнет от накопления летальных генов [14, 62], а 2/3 от отсутствия условий, необходимых для их развития [41].

Уже сформировавшийся плод отвечает на раздражение по-разному, в зависимости от силы патогенного фактора. Чрезмерное воздействие приводит к гибели или развитию грубой патологии, раздражители средней силы вызывают перезревание систем, компенсирующих нагрузку и недоразвитие других, при слабых воздействиях тренируются приспособительные возможности плода ("физиологический стресс") [48, 41].

Эмбриопатии обуславливают пороки развития отдельных органов и систем, тератомы, эмбриоцитомы, прерывание беременности. Аномалии, развивающиеся после закладки и формирования систем органов (с 12 дня для мышей), вызывают задержку внутриутробного развития, врожденные пороки (кишечный свищ, открытый артериальный проток, незаращение овального отверстия, расщелины губы, позвоночника, уретры, крипторхизм, гидроцефалию, катаракту, глиоз мозга) (рисунок 1), врожденные болезни (гемолитическую болезнь новорожденного, гепатиты, циррозы, миокардиты, васкулиты), обуславливают преждевременные роды, асфиксию, неонатальные болезни, смертность [44, 39].

Рисунок 1. Аномалии формирования лицевой части черепа при повреждении генетического аппарата эмбриона крысы [44].

1.1.2. Критические периоды эмбрионального развития

Характер патологических изменений эмбриона определяется, в значительной степени, временем воздействия повреждающих факторов. С конца XIX века известны определенные периоды внутриутробного развития, когда зародыш особенно чувствителен к повреждающим агентам - критические или сенситивные периоды. Они характеризуются высоким темпом размножения клеток и синтеза белков; в эти периоды зародыш вступает в новый этап морфогенеза, они наиболее опасны для жизни эмбриона [67,69, 80].

Основоположником учений о «критических» периодах эмбрионального развития можно по праву считать П. Г Светлова, который в середине XX столетия внес большой вклад в изучение данного вопроса. Он полагал, что критические периоды совпадают с моментом детерминации, который определяет конец одной и начало другой, новой цепи процессов дифференциации, т.е. с моментом переключения направления развития. Ученый установил в развитии плацентарных млекопитающих два «критических» периода. Первый сопряжен с процессом имплантации, а второй - с процессами плацентации, нейруляции и начальными этапами органогенеза. Повреждения в первый критический период приводят к нарушению имплантации, к ранней смертности эмбрионов, аборта рованию плодов. Действие повреждающих факторов во время второго критического периода может привести к врожденным уродствам. При этом, чем раньше возникает повреждение, тем грубее бывают пороки развития.

Дальнейшее накопление данных позволило расширить учение о критических периодах.

Согласно сегодняшнему представлению, помимо перечисленных выше, «критическим» периодом считается также момент окончания формирование плаценты, когда ее функция характеризуется высокой степенью активности. В этот период у плода появляются новые рефлексы, образуются зачатки коры головн