Морфофункциональная и биохимическая альтерация клеток крови квантовыми точками

Михеева, Эльза Равилевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Морфофункциональная и биохимическая альтерация клеток крови квантовыми точками
ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Морфофункциональная и биохимическая альтерация клеток крови квантовыми точками"

На правах рукописи

л/ *____г>

Михеева Эльза Равнлевна

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ И БИОХИМИЧЕСКАЯ АЛЬТЕРАЦИЯ КЛЕТОК КРОВИ КВАНТОВЫМИ ТОЧКАМИ

03.03.01 - физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 3 НОЯ 2011

Нижний Новгород 2011

4858531

Работа выполнена в Нижегородском государственном техническом университете им. P.E. Алексеева

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Плескова Светлана Николаевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Корягин Александр Сергеевич

доктор биологических наук, профессор

Малиновская Светлана Львовна

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО

«Ульяновский государственный университет»

Защита состоится «-10» нслбру 2011 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 212.166.15 Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского по адресу: 603950, Нижний Новгород, пр. Гагарина, д. 23, корп. 1, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского

Автореферат разослан «jM» pkitn^S^ji. 2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук, доцент C.B. Копылова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Развитие методов морфологического, биохимического и иммунологического анализа, основанных на использовании флюоресцентных меток, сделало флюорофоры одним из важнейших инструментов многих научных направлений. В настоящее время спектр флюоресцентных меток достаточно широк. Условно их можно классифицировать на три основных вида: 1) флюоресцирующие белки; 2) неорганические флюорофоры; 3) квантовые точки (KT). Наиболее перспективными являются флюоресцентные полупроводниковые наночастицы (НЧ) - квантовые точки, поскольку: 1) они имеют широкий спектр экстинкции и узкий - эмиссии; 2) для них характерна высокая фотостабильность; 3) возможна одновременная регистрация сигнала в мультиплексных системах. Однако одной из основных проблем использования KT является недостаточная информация о механизмах их взаимодействия с клетками организма человека. Было показано, что KT в отличие от микрочастиц, способны проникать через клеточные барьеры в неизмененном виде, попадать в центральную нервную систему (Oberdorster и соавт., 2005), циркулировать и накапливаться в органах и тканях (Yang и соавт., 2007; Zhang и соавт., 2008), вызывая различные морфологические альтерации в клетках и внутренних органах (Fischer и соавт., 2006). Установлено, что KT повреждают ДНК, приводят к эпигенетическим и генетическим альтерациям (Hoshino и соавт., 2004; Choi и соавт., 2008), изменениям в митохондриях (Lovric и соавт., 2005) и вызывают разрушение мембран клеток. Альтерирующее воздействие KT на клеточном уровне было продемонстрировано на: гепатоцитах (Derfus и соавт., 2004); клетках NRK (нормальные почечные клетки крысы) (Kirchner и соавт., 2005); клетках феохромоцитомы крыс PI2 и микроглиальных клетках N9 (Lovric' и соавт 2005); клетках WTK1 (клеточная линия человеческих лимфобластов) и клетках Vero (клеточная линия почечных эпителиальных клеток африканских зеленых обезьян) (Hoshino и соавт., 2004); клетках HepG2 (клеточная линия карциномы печени человека) (Guo и соавт., 2007); альвеолярных эпителиальных клетках (Geys и соавт., 2009); яйцеклетках (Chan и соавт., 2008); эпидермальных «базальных» клетках человека (НЕК) (Ryman-Rasmussen и соавт., 2007); макрофагах (Clift и соавт., 2010) и других клеточных линиях. Исследования на мышах и крысах in vivo показали, что кумуляция KT происходит преимущественно в печени, селезенке и почках (Fischer и соавт., 2006; Yang и соавт., 2007; Robe и соавт., 2008). Так же следует учесть, что выявление альтерирующего действия KT на клетки является не тривиальной задачей, поскольку не все KT одинаковы и эффекты их взаимодействия с клетками зависят от многих факторов: индивидуальных физико-химических свойств, условий окружающей среды, концентрации, окислительной и механической стабильности и способа проникновения в организм. Однако, при любом механизме проникновения KT в организм и после преодоления ими первого защитного барьера, они неизбежно оказываются в крови, поэтому становиться

актуальным вопрос о степени альтерирующего воздействия НЧ Fia клетки крови. В литературе этот вопрос не освещен.

Цель работы: исследовать функциональные, морфологические и биохимические изменения клеток крови человека в системе с квантовыми точками различного состава.

Задачи исследования:

1. определить распределение и накопление квантовых точек в лейкоцитарной фракции крови;

2. провести сравнительный анализ влияния квантовых точек различного состава на жизнеспособность нейтрофильных гранулоцитов. Определить ОЬ50 для квантовых точек разного состава;

3. исследовать динамику взаимодействия нейтрофилов с квантовыми точками методами высокоразрешающей сканирующей лазерной и атомно-силовой микроскопии;

4. сравнить морфологические параметры клеток и ригидность мембран нейтрофильных гранулоцитов до и после воздействия квантовых точек;

5. оценить изменения кислородзависимого и кислороднезависимого метаболизма, биохимического и рецепторного статуса нейтрофилов периферической крови человека в системе с квантовыми точками;

6. изучить влияние квантовых точек на скорость оседания эритроцитов человека.

Научная новизна работы. Впервые исследовано распределение квантовых точек среди клеток лейкоцитарной фракции крови и показано, что максимальная кумуляция наблюдается в фагоцитах. Впервые проанализирована динамика взаимодействия нейтрофилов с квантовыми точками и выявлена экстрануклеарная кумуляция квантовых точек, агрегация квантовых точек нейтрофилами, передача агрегатов квантовых точек, феномен избегания взаимодействия с квантовыми точками. Впервые проведен сравнительный анализ воздействия квантовых точек различного состава на жизнеспособность нейтрофильных гранулоцитов. Впервые получены данные об изменении морфофункционального состояния и биохимического статуса нейтрофилов периферической крови при воздействии на них квантовых точек. Впервые выявлено снижение ригидности мембран нейтрофильных гранулоцитов в системе с квантовыми точками. Впервые показано комплексное влияние квантовых точек на кровь человека, отражаемое в изменении скорости оседания эритроцитов.

Теоретическая и практическая значимость работы. Исследование эндоцитоза КТ нейтрофилами дополняют теоретические знания о механизмах поглощения ксенобиотиков фагоцитами. Результаты, демонстрирующие, что не только фагоциты способны связывать КТ, представляют новые теоретические данные о сорбции наноматериалов клетками крови, а выявление агрегации КТ

нейтрофилами расширяет теоретические представления о клининговой функции крови. Данные, полученные в результате оценки функциональных и морфологических изменений клеток крови человека, могут быть использованы в разработке систем диагностики цитотоксического действия НЧ. Разработанная модель визуализации позволяет отслеживать как процессы поглощения, так и внутриклеточного трейсинга наноматериалов. Полученные в ходе работы данные позволяют дополнить курс «Физиология человека» и «Медикобиологические основы обеспечения безопасности

жизнедеятельности».

Положения, выносимые на защиту:

1. Фагоциты разной степени морфологической и функциональной зрелости одинаково активно поглощают квантовые точки.

2. Альтерирующее воздействие квантовых точек в отношении нейтрофильных гранулоцитов зависит от размера и химического состава наночастиц.

3. Среди вариантов клеточной гибели под воздействием наночастиц основная роль принадлежит некротической гибели.

4. Нейтрофильные гранулоциты поглощают квантовые точки и накапливают их в своем объеме преимущественно внеядерно, в фаголизосомах.

5. Наблюдается снижение кислородзависимого и кислороднезависимого метаболизма нейтрофилов после воздействия любых типов квантовых точек.

Апробация работы. Основные положения работы были доложены и обсуждены: на II международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (г. Казань, 2008), на Международной конференции «Нанотехнологии в онкологии» (г. Москва, 2008), на XII, XV международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (г. Пущино, 2008, 2011), на XIII, XIV, XV, XVI сессии молодых ученых (г. Нижний Новгород, 2008, 2009, 2010, 2011), на международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова (Москва-Пущино, 2009), на 1-ой международной научной школе «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах» (г. Москва, 2009), на XVII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «JIomohocob-20 10» (г. Москва, 2010), на III и IV международной конференции «AFM BioMed» (Red Island, Хорватия, 2010 и Париж, Франция, 2011), на международной конференции «Neuroplasticity: nervous substrate for health and disorder» (г. Тбилиси, Грузия, 2010), на XVII Российском симпозиуме по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел «РЭМ-2011» (г. Черноголовка, 2011), на III Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010» (г. Нижний Новгород, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 39 научных работ, из них 3 - в изданиях, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 111 страницах и состоит из введения, 2 глав обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа содержит 38 рисунков и 7 таблиц. Список литературы включает 183 источника, из которых 153 на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводились на клетках, выделенных из венозной гепаринизированной крови здоровых доноров студентов-добровольцев (40 человек), забор крови осуществлялся на базе профилактория НГТУ в утреннее время (м.с. Плесковой С.Н.).

В работе использовано 6 типов квантовых точек: (1) CdSe/ZnS, покрытые меркаптоуксусной кислотой (МУК), максимум эмиссии 607 нм, размером 4-6 нм, полученные в лаборатории В.А. Олейникова (Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, г. Москва); (2) CdSe/CdS, покрытые МУК, максимум эмиссии 596 нм, размером 4-6 нм, синтезированные в лаборатории В.Р. Зломанова (Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, г. Москва); (3) CdSe/ZnS, покрытые полиэтиленгликолем (ПЭГ), максимум эмиссии 565 нм, размером 6-12 нм производства Invitrogen, США; (4) CdSe/ZnS, покрытые меркаптопропионовой кислотой (МПК), максимум эмиссии 620 нм, размером 12 нм, производства ООО НТИЦ «Нанотех-Дубна», г. Дмитров, Россия; (5) (CdSe/CdZnS)ZnS, покрытые полимерной цепочкой, состоящей из остатков полиакриловой кислоты, модифицированной дигидролипоевой кислотой и полиэтиленгликолем (polyT), максимум эмиссии 580 нм, размером 20 нм, производства ООО НШЦ «Нанотех-Дубна», г. Дмитров, Россия; (6) CdSeCdSZnS/polyT, покрытые -(Si(NH2)-0)„, максимум эмиссии 605 нм, размером 15-20 нм производства ООО НТИЦ «Нанотех-Дубна», г. Дмитров, Россия.

Выделение нейтрофипов проводили по методу И.С. Подосинникова и соавт. (1981) из венозной крови здоровых доноров. Нейтрофилы взвешивали в физиологическом растворе или растворе Хенкса (ГУП ИПВЭ, Москва) в начальной концентрации 106 клеток/мл для экспериментов на сканирующем лазерном и зондовом микроскопе, либо в концентрации 2-106 клеток/мл для проведения цитохимических тестов. Жизнеспособность клеток по тесту с трипановым синим составляла 99-100%.

Исследование—методом проточной иитофлуориметрии Эксперименты проводили на проточном цитофлуориметре BD FACS Calibur™ Flow Cytometer (Becton Dickinson, USA). Для оценки процента лейкоцитов, сорбировавших и/или накопивших KT, гепаринизированную кровь инкубировали с KT, взятыми в конечной концентрации 0,1 мг/мл (37 °С, 5-30 мин). Далее вносили 2 мкл 7-AAD (eBioscience, USA) и выдерживали в темноте (4°С, 5 мин). Эритроциты

разрушали лизирующим буфером BD Pharm Lyse™ (Becton Dickinson, USA). Флуоресценцию KT фиксировали в канале FL 2 (585/42 нм). 7-AAD сигнал фиксировали в канале FL 4 (661/16 нм). Для исследования апоптотической гибели клеток использовали Annexin V-FITC (BD Pharmingcn™, США). Нейтрофилы (106 клеток/мл) инкубировали с KT (конечная концентрация 0,02 мг/мл) (37 °С, 60 мин), затем окрашивали Annexin V-FITC. Флуоресценцию Annexin V-FITC фиксировали в канале FL1 (530/30 нм), KT- FL2 (585/42 нм). Исследование некротической гибели нейтрофилов Исследование проводили на флуоресцентном микроскопе Olympus 1X71 (Япония) в НОЦ ФТНС ННГУ им. Н.И. Лобачевского. Нейтрофильные гранулоциты (2-106 клеток/мл) инкубировали с KT (0,1 мг/мл) в течение 30 мин при 37 °С. Клетки фиксировали 96% этанолом и окрашивали рабочим раствором пропидиума йодида (5-Ю'5 мг/мл, 30 сек). Подсчитывали 100 клеток: из них учитывали клетки, флуоресцирующие за счет комплекса ДНК-Р1.

Исследование морфологических изменений нейтрофилов в системе с KT методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии Исследования проводились в ИПФ РАН (г. Нижний Новгород) на установке, состоящей из инвертированного микроскопа Axiovert 200М, лазерного сканирующего модуля Carl Zeiss LSM 510 и спектрального модуля Carl Zeiss 510 МЕТА (Carl Zeiss, Германия). Нейтрофильные гранулоциты в растворе Хенкса вносились в жидкостную термостатируемую ячейку (37° С). Контрольное сканирование образцов в течение 8 ч не влияло на жизнеспособность клеток (жизнеспособность нейтрофилов по окраске трипановым синим составляла 9899 %). Добавляли квантовые точки и визуализировали взаимодействие KT с клетками. Для подтверждения локализации квантовых точек внутри лизосом использовали краситель LysoTracker.

Исследования нейтрофилов в системе с KT методом атомно-силовой микроскопии Исследования проводились на установке SOLVER BIO™ (NT-MDT, Зеленоград) в НОЦ ФТНС ННГУ им. Н.И. Лобачевского. Для исследования морфологических изменений НГ в системе с KT в режиме реального времени, а также клеток, фиксированных метанолом, проводили сканирование топографии НГ в полуконтактном режиме с использованием зондов DNP (Veeco, USA) (Плескова и соавт., 2005). Для визуализации сканируемых объектов применялась программа Nova NT-MDT SPM Software (NT-MDT, Зеленоград). Дальнейшая обработка изображений проводилась с использованием программного обеспечения SPMLab Analysis Only (Topometrix,

Исследование методом FS-спектроскопии ригидности мембран клеток Для оценки ригидности мембран использовали метод силовых кривых, получаемых в режиме спектроскопии (Плескова и соавт., 2006). Измерения проводились в контактном режиме с использованием зондов MSCT-Au (Veeco, США). Ригидность мембран НГ оценивалась по модулю Юнга, который рассчитывали согласно теории Герца (Hassan и соавт., 1998; Henderson, Oberleithner, 2000) до и после инкубации с KT. Все расчеты модуля Юнга проводили в пакете Microsoft Office Excel.

Исследование воздействия квантовых точек на кислородзависимую систему нейтрофилов Кислородзависимую активность нейтрофилов определяли по реакции восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-спонтанный, НСТ-стимулированный зимозаном тесты) (Виксман и Маянский, 1977). Кроме того, подсчитывали индекс стимуляции нейтрофилов и функциональный резерв нейтрофилов (Щербаков, 1989).

Исследование воздействия квантовых точек на кислороднезависимую систему нейтрофилов Активность катионных белков нейтрофилов оценивали по методу В.Е. Пигаревского (1988).

Исследование биохимических изменений нейтрофилов в системе с квантовыми точками Активность кислой фосфатазы оценивали цитохимическим методом, предложенным Burstone и Li с соавт. (1970). Для цитохимического определения активности щелочной фосфатазы использовали метод азосочетания по Rutenburg с соавт. (1965). В каждом мазке подсчитывали 100 клеток, среди которых определяли процент нейтрофилов, содержащих отложения соответствующего красителя и подсчитывали средний цитохимический коэффициент (СЦК) (Рудик и Тихомирова, 2006).

Исследование способности нейтрофилов к СЗЪ-зависимой адгезии Определение рецепторзависимой (СЗЬ/ iC3b-, IgG-) и неспецифической адгезии нейтрофилов на гранулах сефадекса проводилось по методу А.Н. Маянского и соавт. (1991). Исследование спектральных характеристик квантовых точек после инкубации с нейтрофилами Исследование проводилось на специализированном зондовом микроскопическом/спектроскопическом комплексе Ntegra Spectra (NT-MDT, Россия). Накачка КТ осуществлялась твердотельным лазером (0,14 мВт, 473 нм) в течение 0,1 с. До и после инкубации КТ с НГ измеряли спектр эмиссии наночастиц.

Определение скорости оседания эритроиитов (СОЭ) Скорость оседания эритроцитов оценивали по методу Т.П. Панченкова. Венозную кровь инкубировали с КТ (30 мин, 37°С) и переносили в капилляры Панченкова. Через 1 час определяли СОЭ по высоте столба прозрачной плазмы. Статистическая обработка результатов Статистический анализ проводили при помощи программного обеспечения Origin 7.0 SRO (OriginLab Corparation, США) по общепринятой методике (Гланц, 1998). Рассчитывали выборочное среднее и стандартное отклонение. Для сравнения двух групп использовали критерий Стьюдента. Статистически значимыми различия между группами признавались при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ Оценка распределения квантовых точек в лейкоцитарной фракции крови

Методом проточной цитофлуориметрии было проанализировано распределение КТ в лейкоцитарной фракции крови (инкубация в течение 25 -75 мин). Определяли процент клеток, которые поглотили и/или сорбировали на

себе НЧ (рис. 1). Максимальное поглощение КТ отмечено для фагоцитов крови. Представленные данные позволяют дать оценку времени сорбции и/или поглощения наночастиц С<38е/Т;п8-МПК клетками: для фагоцитов 50% барьер был преодолен менее чем за 25 минут, тогда как для лимфоцитов понадобилось значительно больше времени - 75 минут. Традиционно считалось, что максимальную фагоцитарную активность нейтрофилы проявляют после адгезии, а моноциты - после выхода в ткани и перехода в форму тканевого макрофага. Представленные же результаты демонстрируют высокий поглощающий потенциал клеток, несмотря на то, что они находились в суспензионной форме.

[и нейтрофиы □ моноциты а лимфоциты |

01 5 3- С О 5

100

-ь

г{

время,

Рис. 1. Диаграмма сорбции и/или поглощения квантовых точек Ссйе/гпЗ-МПК (конечная концентрация 0,1 мг/мл) клетками крови.

Необычным результатом инкубации клеток крови с КТ (Сё8е/С<Кп8)2п8-ро1уТ стал тот факт, что связывание и/или поглощение моноцитами данного типа НЧ было практически в два раза больше, чем у нейтрофилов (рис. 2). Однако максимальный процент сорбции и/или поглощения наночастиц моноцитами и нейтрофилами был достигнут уже на 35 минуте инкубации, тогда как для С<18е/2п8-МПК - через 55 минут. Объяснением этого феномена может служить различие в размерах наночастиц: (Сс18е/С<12;п8)2п8-ро1уТ - 20 нм, а Сс18е/2п8-МПК - 12 нм. С другой стороны, причиной различия в поглощении может быть и химия покрытия КТ. Поскольку покрытие ро1уТ представляет собой полимер, состоящий из множества длинноцепочечных фрагментов модифицированных кислот, то в жидкой среде они могут связываться с водой, изменяя свою конформацию и тем самым увеличивая гидрофильность КТ, что впоследствии затрудняет их фагоцитоз.

| а нейтрофилы а моноциты д лимфоциты

25 35 45 55 65 75

время, мин

Рис. 2. Диаграмма сорбции и/или поглощения квантовых точек (Сс18е/Сс32п8)2п8-ро1уТ (конечная концентрация 0,] мг/мл) клетками крови.

Таким образом, КТ предположительно активно сорбировались и/или поглощались фагоцитами крови и гораздо менее активно связывались с лимфоцитами. Поскольку НГ в крови доминируют среди остальных фракций лейкоцитов и выполняют полифункциональную роль в осуществлении неспецифической резистентности организма, впоследствии именно они использовались нами в качестве основной модели для тестирования альтерирующего воздействия КТ.

Оценка жизнеспособности нейтрофильных гранулоцитов в системе с квантовыми точками

В результате окраски клеток пропидиумом йодидом (5-10 5 мг/мл) был зафиксирован дозозависимый эффект снижения жизнеспособности НГ после инкубации с КТ (рис. 3-5). Методом экстраполяции кривой жизнеспособности НГ было найдено значение ОЬ50: для СсйеЖпЗ-МПК оно составило 0,025 мг/мл, для (Сс18е/Сс12п8)гп8-ро1уТ - 0,04 мг/мл и для Сс18еСс187п8/ро1уТ-8102-N42 - 16,5 мг/мл. Таким образом, наиболее токсичными в отношении НГ являются КТ СаБе/гпБ-МПК.

Рис. 3. Дозозависимое снижение жизнеспособности НГ в системе с КТ СсЙеЛ^пБ-МПК после 30 мин инкубации

100 -90

5 70-

50 -40 -30 -20 10 ■ о

0.2

0.4

0.Б

0,8

1.2

01*50=0,04 мг/мл

концентрация квантовых точек, иг ил

Рис. 4. Дозозависимое снижение жизнеспособности НГ в системе с КТ (Сс18е/Сс12п8)7п8-ро1уТ после 30 мин инкубации

90 о ВО

• 70 * 60 ~ г-- ----

-—

= 40

с 0

5 10 15 N. 20

концентрация квантовых точек, иг ни ОЬ0=16,5 мг/мл

Рис. 5. Дозозависимое снижение жизнеспособности НГ в системе с КТ Сс18еСс182п8/ро1уТ/8Ю2-МН2 после 30 мин инкубации

Исследование некроз/апоптотических соотношений для НГ в системе с КТ (0,1 мг/мл) показало, что гибель клеток по механизму апоптоза маловероятна (рис. 6), поскольку процент нейтрофилов, у которых выявлены витронектиновые метки колеблется от 5 до 40%, в то время как некротическое

разрушение клеток при аналогичной концентрации КТ (0,1 мг/мл) и времени экспозиции НГ с НЧ, достигает 66-77%. Аналогично J. Lovric и соавт. (2005) показали увеличение числа клеток рака молочной железы MCF7, окрашенных PI, после их инкубации с КТ CdTe-МПК, что позволило авторам сделать вывод о некротической гибели клеток в системе с КТ. J. Lovric и соавт. (2005) определили, что причиной гибели клеток были собственные АФК, вырабатываемые клетками MCF7, которые впоследствии повреждали клеточную мембрану.

[а апоптоз о некроз

CdSe/ZhS-МПК (CdSe/Cd2nS>2hS-pO)yT

Рис. 6. Оценка некроз/апоптотических соотношений после пребывания НГ в системе с КТ (КТ взяты в концентрации 0,1 мг/мл, время инкубации 30 мин).

В тоже время отмечено, что при инкубации с наноматериалами возможны и другие варианты клеточной гибели, в частности, инкубация с КТ CdSe/ZnS-МПК вызывает образование NET (neutrophil extracellular traps) - вариант гибели НГ, впервые описанный V. Brinkmann и соавт. (2004) для клеток, принимающих активное участие в реализации воспаления. Кроме того отмечается блеббинг мембраны нейтрофилов, описанный в работе С.Н. Плесковой (2009) для НГ и вакуолизация мембран, приписываемая к аутофагии S.T. Stem и соавт. (2008).

Визуализация динамики взаимодействия и морфологических изменений нейтрофилов в системе с квантовыми точками

Методом конфокальной микроскопии было зафиксировано, что при внесении к НГ квантовых точек CdSe/ZnS-МУК в концентрации 2 мг/мл, наблюдалось быстрое осаждение КТ на поверхности стекла и нейтрофилов, активное проникновение агрегатов НЧ в клетки. НГ интенсивно перемещались, стремясь объединиться, образовывали псевдоподии. Методом атомно-силовой микроскопии так же было выявлено, что после инкубации НГ с КТ CdSe/ZnS-МУК (0,1 мг/мл), клетки формировали множественные сетевые контакты друг с другом, при этом размеры этих сетевых структур превышали размеры псевдоподий, формируемых интактными нейтрофилами. На некоторых участках отмечается особая морфология псевдоподий: они выглядели

«раздавленными», в отличие от всегда четко структурированных псевдоподий, формируемых НГ при фагоцитозе микроорганизмов. Часть НГ интенсивно поглощало КТ, другие агрегировали НЧ и обменивались ими с соседними нейтрофилами. Некоторые НГ пытались избежать контакта с агрегатами точек, создавая «карманы». Через 20 минут НГ начинали гибнуть, наблюдался процесс блеббинга цитоплазмы с образованием волдырчатых структур в клетке и концентрирование КТ в объёме нейтрофилов. Через 40 мин после начала инкубации с КТ все НГ погибли, на видеозахвате визуализировались только тени клеточных мембран.

При уменьшении концентрации КТ нейтрофилы по-прежнему поглощали НЧ и накапливали их в своем объеме. Агрегаты КТ визуализировались по периметру клетки, формируя «ореол», который также наблюдали J.D. Martin и соавт. (2008) и Т.Н. Беляева и соавт. (2009). Часть КТ аккумулировалась над клеткой в виде «шапки» (рис. 7). Через 30-35 минут объем клеток уменьшался, а через 55-60 минут происходил блеббинг цитоплазмы и гибель клеток. Через 1 час визуализировались только тени клеток.

Рис. 7. Накопление нейтрофилами квантовых точек CdSe/ZnS-МУК (0,06 мг/мл) на поверхности, ЗО-изображение (конфокальная флуоресцентная микроскопия, объектив XI00)

В отличие от КТ CdSe/ZnS-МУК, результатом инкубации НГ с CdSe/ZnS-ПЭГ стало сохранение жизнеспособности клеток в течение 4 ч экспозиции. НГ также поглощали CdSe/ZnS-ПЭГ и накапливали их в своем объеме. Для данного типа КТ не наблюдалось «вскипание» цитоплазмы, клетки претерпевали минимальные морфологические изменения, через 5 ч инкубации жизнеспособность клеток составляла 63 %.

Для подтверждения факта поглощения и накопления КТ в клетках был проведен тест с красителем LysoTracker. В результате исследования было доказано фаголизосомальное накопление КТ в НГ. В условиях низких значений рН внутри фаголизосом КТ способны к агрегации, которая наблюдалась в нашей работе, а также была описана I. Nabiev и соавт. (2007) и Y. Xiao и соавт. (2010). С другой стороны, в лизосомах присутствует большое количество протонов, которые легко соединяются с покрытием КТ МГЖ или МУК, что приводит к постепенному отделению этого покрытия и к деградации КТ в клетках. В результате этого может обнажиться кадмий-содержащий кор, токсичный для клетки (Deríus и соавт., 2004).

Для проверки гипотезы о внутриклеточной деградации КТ было проведено исследование спектра флюоресценции КТ до и после пребывания в системе с НГ. В результате получили, что для КТ CdSe/ZnS-МПК максимум флюоресценции уменьшается, следовательно, покрытие КТ в клетках постепенно разрушается. Для CdSeCdSZnS/polyT/Si02-NH2 спектр

флюоресценции практически не меняется после инкубации их с НГ в течение 30 мин, тогда как для КТ (Сс18е/С<К1\8)гп8-ро1уТ наблюдается увеличение значения пика флюоресценции, что может свидетельствовать об увеличении размеров КТ вследствие их коагрегации.

Помимо морфологических изменений было выявлено дозозависимое снижение упругости мембран НГ после воздействия на них КТ Сс18е/С<18 -МПК (табл. 1).

Таблица 1

Изменение упругости мембраны НГ при инкубации с CdSe/CdS - МПК

контроль Концентрация КТ, мг/мл

0,06 0,1

модуль упругости, кПа 26,46 ± 2,49 10,18±1,56* 4,83 ± 1,05*

* - статистически значимые различия по сравнению с контролем (р<0,05)

Таким образом, тип КТ влияет на характер взаимодействия их с клеткой, что в последующем может быть определяющим фактором варианта гибели клеток. Поскольку апоптоз нейтрофилов может быть вызван действием свободных ионов Cd2+, образующихся при деградации КТ, а для разрушения КТ необходимо достаточно длительное время, то некротическая гибель клеток становиться наиболее вероятным механизмом, что также подтверждается результатами, полученными нами методом проточной цитометрии.

Оценка функционального состояния нейтрофилов в системе с квантовыми точками

Интенсивность одного из ведущих звеньев фагоцитоза - продукции АФК можно оценить по способности клеток восстанавливать нитросиний тетразолий (НСТ) in vitro (НСТ-тест) (Маянский, Маянский, 1989; Маянский и соавт., 1999). Как в спонтанном, так и в стимулированном НСТ-тестах наблюдается уменьшение числа клеток с диформазаном (табл. 2) после инкубации НГ с КТ. В спонтанном НСТ-тесте наибольшее снижение числа НСТ-позитивных клеток было выявлено для НГ, проинкубированных с CdSe/ZnS-МПК, тогда как в стимулированном НСТ-тесте - для НГ с (CdSe/CdZnS)ZnS-polyT. Также следует заметить, что в стимулированном НСТ-тесте активность клеток снижается больше, чем в спонтанном по сравнению с контролем. Причиной этого может служить срыв защитных механизмов НГ и невозможность ими нейтрализовать новые порции АФК, выделяемые клеткой при контакте с КТ.

Был рассчитан индекс стимуляции (ИС) и функциональный резерв нейтрофилов (ФРН). Для НГ в системе с КТ CdSe/ZnS-МПК и CdSeCdSZnS/polyT/Si02-NH2 была характерна тенденция к увеличению ИС, тогда как для (CdSe/CdZnS)ZnS-polyT ИС снижался. ФРН для клеток, проинкубированных с КТ, уменьшался, причем в наибольшей степени для НГ в системе с (CdSe/CdZnS)ZnS-polyT, что свидетельствует об истощении функциональной активности НГ.

Выявлено дозозависимое снижение респираторной активности НГ после инкубации (60 мин) с КТ СсШеДЖ - МУК, как в спонтанном (рис. 8), так и в стимулированном зимозаном НСТ-тесте (рис. 9).

Таблица 2

Показатели функциональной активности НГ периферической крови до и после _ инкубации с КТ (концентрация КТ 0,1 мг/мл)._

группа показатель ч контроль НГ после инкубации с СаБе/гпБ-МПК НГ после инкубации с (СаБе/СёгпБ) гп8-ро1уТ НГ после инкубации с С<18еСс182п8/ро1у Т/БЮг-Шг

Число НСТ-положительных клеток в спонтанном тесте 12,80±0,90 6,80±2,60* 8,80±0,8С * 7,70±1,80*

Число НСТ-положительных клеток в стимулирован ном тесте 40,50± 12,40 24,50±3,90* 20,30±4,30* 23,20±3,70*

ИСНГ 3,17±0,97 3,96± 1,41 2,31 ±0,41 3,21±1,11

ФРН 29,80± 10,20 17,70±3,80* 11,50±3,90* 15,50±4,40*

* - статистически значимые различия по сравнению с контролем (р<0,05)

1а 16 0 | 14 1 " I 10 о 8 т Б 6 X § « X ' 2 О * * * * * *

котроль 0,003 0.02 0.03 0.04 0,05 0,06

концентрация квантовых точек, мг/мл

Рис. 8. Снижение спонтанной респираторной активности нейтрофилов под действием квантовых точек Сс18е/С(18 - МУК (* - статистически значимые различия по сравнению с контролем (р<0,05))

| 30

г 25

о 20 О 15

0,003

0,02 0,03 0,04 0.05

концентрация квантовых точек, мг/'лп

Рис. 9. Снижение стимулированной респираторной активности нейтрофилов под действием квантовых точек Ссйе/СёЗ - МУК (* - статистически значимые различия по сравнению с контролем (р<0,05))

Было обнаружено увеличение количества диформазана вне клеток наряду с наличием разрушенных нейтрофилов при увеличении концентрации КТ. Это может свидетельствовать о подавлении резистентности нейтрофилов к АФК и о некротической гибели клеток.

Уровень катионных белков (КБ) характеризует кислороднезависимую бактерицидную систему НГ, их способность к внутриклеточному и внеклеточному киллингу (Нагоев и соавт., 1982). По результатам наших исследований уровень КБ НГ в системе с КТ статистически значимо ниже, чем в контроле (табл. 3).

Таблица 3

Средний цитохимический коэффициент (СЦК) КБ НГ в системе с КТ

контроль НГ после инкубации с Сё8е/2п8-МПК НГ после инкубации с (СсШСсКпЗ) 2п8-ро1уТ НГ после инкубации с Сс18еС<182п8/ро1уТ/ 8Ю2-Ш2

1,37+0,10 0,89+0,16* 0,88+0,04* 0,97+0,06*

* - статистически значимые различия по сравнению с контролем (р<0,05)

Подобная динамика может быть связана с экскрецией КБ из гранул НГ во внеклеточную среду после воздействия КТ. Снижение СЦК КБ для каждого типа КТ - различно. Подсчет изменений количества высокоактивных, среднеактивных и малоактивных клеток, различающихся по степени интенсивности окрашивания показал, что количество высокоактивных клеток становится меньше после инкубации с НЧ СсйеСс^пЗ/ро^Т/БЮг-МНг по сравнению с двумя другими типами КТ. Однако, после инкубации с С(18е/7п8-МПК и (Сё8е/Сс12п8^п8-ро1уТ количество малоактивных клеток увеличивается в большей степени, чем с С<38еСс182п8/ро1уТ/8Ю2-МН2 (рис. 10).

[в контроль в СсКе/глв - МПК а (СаБв/айпв^З-рЫуТ а Сс13еС<132п8/ро|уТ/5Ю2]

Малоактивные клетки Среднеактианые клетки Высокоактивные клетки

Рис. 10. Изменения количества высокоактивных, среднеактивных и малоактивных клеток в системе с КТ (* - статистически значимые различия по сравнению с контролем (р<0,05))

Таким образом, было выявлено альтерирующее воздействие КТ на кислородзависимую и кислороднезависимую активность НГ.

Оценка биохимических изменений нейтрофилов в системе с квантовыми точками

Интенсивность процессов клеточного катаболизма и переваривающей способности лейкоцитов многие авторы связывают с активностью одного из важнейших лизосомальных ферментов - кислой фосфатазы (КФ) (Соколов и соавт., 1975). Уровень КФ в НГ после воздействия КТ статистически значимо снижался по сравнению с контролем (рис. 11).

[ыконфапь догеВ(СйЗе/СагпЗДиЭ-рауТ я

•

I 1

15 30 60

время инкубации с квантовыми точками, мин

Рис. 11 Изменение активности кислой фосфатазы нейтрофилов после 30 мин инкубации с квантовыми точками, взятыми в концентрации 0,1 мг/мл. (* -статистически значимые различия по сравнению с контролем (р<0,05))

Причем активность фермента уменьшалась при увеличении времени инкубации НЧ с клетками

Уровень активности щелочной фосфатазы (ЩФ) следует рассматривать как индикатор напряжения функции клеток, поскольку он оказывает влияние на ход окислительно-восстановительных процессов в клетках и играет важную роль в осуществлении фагоцитарной функции лейкоцитами (Шубич, 1966). По нашим данным СЦК ЩФ также уменьшался со временем, причем наибольшее снижение наблюдалось для С<38е/2п8-МПК, как и в случае уменьшения активности КФ (рис. 12).

|о Контроль о 015е/гп5 - МК в (Саве/Сагг^гпв-ро^Т и 035еСе18гп$/ра|уТ/&02-№£

0.9

1 § °'8

| 5 0-7

I * 0.6

I | 0.5

х з

1 » 0.4

в о

а * 0.2 0.1 0

Рис. 12 Изменение активности щелочной фосфатазы нейтрофилов после 30 мин инкубации с квантовыми точками, взятыми в концентрации 0,1 мг/мл. (* - статистически значимые различия по сравнению с контролем (р<0,05))

С целью определения влияния наночастиц на рецепторное звено клеток был проведен тест, основанный на оценке адгезивной способности нейтрофилов в реакции СЗЬ-зависимой адгезии на гранулах сефадекса. КТ Сс18е/гп8-МПК и (Сё8е/СсКп8)2п8-ро1уТ вызывали увеличение СЗЬ-зависимой адгезии нейтрофилов на гранулах сефадекса, тогда как для третьего типа Сс[8еСс182п8/ро1уТ/8Ю2-МН2 выявлено снижение этой способности (табл. 4).

Таблица 4

Количество опсонированного сефадекса, связанного с нейтрофилами

контроль Cd.Se/ZnS -МПК (Ссйе/ЧЖп8)гп8-ро1уТ СсйеСс^пЗ/рсЛуТ/ЗЮг-Ш2

29,6±13,3 31,8± 11,2 37,8±7,4 21,7±6,2

* - статистически значимые различия по сравнению с контролем (р<0,05)

время инкубации с квантовыми точками, мин

Однако полученные результаты не были статистически значимыми, что не позволяет сделать вывод об изменении уровня рецепторов на мембране под влиянием НЧ.

Оценка комплексного воздействия квантовых точек на кровь

Оценку комплексного воздействия КТ на кровь проводили по изменению скорости оседания эритроцитов (СОЭ). Результаты исследований показали снижение СОЭ после инкубации КТ (0,1 мг/мл) с кровью в течение 30 мин, причем наибольшее снижение СОЭ наблюдалось при воздействии квантовых точек СёЗе/гпБ - МПК (табл. 5).

Таблица 5

Значение СОЭ после инкубации с квантовыми точками (0,1 мг/мл)

Показатель контроль СёБе/гпЗ -МПК (Сс^еЛЖпЗ^пБ -ро1уТ С(1БеСс182п8/ро1уТ/ ; 8Ю2-Ш2

СОЭ, мм 7,1*1,9 4,9±1,9* 3,8±1,8* 3,4±1,6*

* - статистически значимые различия по сравнению с контролем (р<0,05)

Наиболее частой причиной значительного уменьшения СОЭ является увеличение вязкости крови. В нормальной среде отрицательно заряженные эритроциты взаимно отталкиваются. Слабо заряженные крупнодисперсные белки, адсорбируясь на эритроцитах, уменьшают их поверхностный заряд, эритроциты начинают сближаться и быстрее оседают. Поскольку квантовые точки СсЗБе^пБ - МПК на поверхности имеют отрицательный заряд, то можно предположить, что данный тип квантовых точек и эритроциты будут взаимно отталкиваться, следовательно, снижение СОЭ для них минимально. Также на СОЭ может влиять изменение рН крови. Проведенные эксперименты показали, что после инкубации с квантовыми точками, рН крови уменьшилась (табл. 6), следовательно, уменьшение СОЭ можно связать с изменением рН крови.

Таблица 6

Значения рН цитратной крови до и после инкубации с квантовыми точками (0,1 _мг/мл, 30 мин инкубации, 25 °С)_

контроль 7,43±0,07

СёЗе/гпЗ-МПК 7,34±0,04

(Сс18еЛ1Жп8)гп8-ро1уТ 7,34±0,03*

Са8еСа82п8/ро1уТ/8102-Ш2 7,35±0,06

* - статистически значимые различия по сравнению с контролем (р<0,05)

Таким образом, было показано альтерирующее действие полупроводниковых наночастиц на клетки крови, которое отразилось в снижении функционального резерва нейтрофилов, изменении морфологических и биохимических параметров нейтрофилов, снижении СОЭ.

выводы

1. Квантовые точки кумулируются преимущественно в фагоцитарной фракции лейкоцитов крови. Наибольшее поглощение и/или сорбция отмечена для моноцитов.

2. Выявлено дозозависимое снижение жизнеспособности нейтрофильных гранулоцитов в системе с квантовыми точками. DL50 отличается в зависимости от состава квантовых точек: для CdSe/ZnS-МПК она составила 0,025 мг/мл; для (CdSe/CdZnS)ZnS-polyT - 0,04 мг/мл; для CdSeCdSZnS/polyT/Si02-NH2- 16,5 мг/мл.

3. Альтерация квантовыми точками проявляется гибелью клеток по разным механизмам: некроз (до 77%), апоптоз (до 40%). Среди вариантов гибели клеток отмечается также блеббинг, аутофагия и neutrophil extracellular traps.

4. Ригидность мембран является чувствительным критерием альтерации клеток квантовыми точками. Модуль упругости (модуль Юнга) мембран клеток значительно снижается после воздействия наночастиц.

5. Альтерация нейтрофилов периферической крови квантовыми точками проявляется в подавлении кислородзависимого и кислороднезависимого метаболизма клеток: снижается уровень АФК-генерирующей способности, активности кислой и щелочной фосфатаз и количество катионных белков.

6. Снижение скорости оседания эритроцитов характеризует комплексное токсическое воздействие квантовых точек на кровь.

Список опубликованных работ по теме диссертации Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Плескова С.Н. Нарушения ферментативной активности нейтрофильных гранулоцитов под воздействием наноразмерных флуорофоров / Плескова С.Н., Михеева Э.Р., Горшкова Е.Н., Хомутов А.Е. // Вестник Нижегородского Университета им. Н.И. Лобачевского. - 2010. - № 5 (1). - с. 106-109.

2. Плескова С.Н. Исследование биосовместимости нанопорошка с флюоресцирующим центром Er/Yb в системе с нейтрофильными гранулоцитами / Плескова С.Н., Горшкова Е.Н., Михеева Э.Р., Шушунов А.Н. // Цитология. - 2011. - Т.53 (№5). - с. 444-449.

3. Плескова С.Н. Модуляция кислородзависимого и кислороднезависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов квантовыми точками / Плескова С.Н., Михеева Э.Р. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2011.-Т. 151.-№ 4.-с. 452-454.

Статьи в журналах:

4. Гиматдинова Э.Р. Цитотоксический эффект квантовых точек на нейтрофильные гранулоциты / Гиматдинова Э.Р., Плескова С.Н., Балапаева И.В. // Структура и динамика молекулярных систем. - 2008 - Т. 2. - с. 394-398.

5. Михеева Э.Р. Цитохимический анализ нейтрофильных гранулоцитов в системе с квантовыми точками / Михеева Э.Р., Плескова С.Н., Горшкова Е.Н.,

Пудовкина Е.Е. // Актуальные проблемы гуманитарных и естественных наук. -2010.-№ 10.-с. 17-19.

6. Горшкова E.H. Влияние флуоресцентных наночастиц Er/Yb на биохимические реакции нейтрофильных гранулоцитов / Горшкова E.H., Плескова С.Н., Михеева Э.Р., Пудовкина Е.Е. // Актуальные проблемы гуманитарных и естественных наук.-2010.-№ Ю.-с. 15-17.

Статьи в сборниках научных трудов:

7. Михеева Э.Р. Фотоиндуцированные (лазерной энергией) и темновые токсические эффекты квантовых точек в системе in vitro / Мнхеева Э.Р., Плескова С.Н., Балалаева И.В., Горшкова E.H. // Труды 2-ой Всероссийской научной школы для молодежи «Концентрированные потоки энергии в индустрии наносистем, материалов и живых систем». Москва. - 2009. - с. 268273.

8. Горшкова E.H. Влияние флюоресцирующих частиц Er/Yb на нейтрофильные гранулоциты / Горшкова E.H., Плескова С.Н., Михеева Э.Р. // Труды 2-ой Всероссийской научной школы для молодежи «Концентрированные потоки энергии в индустрии наносистем, материалов и живых систем». Москва - 2009. -с. 135-139.

9. Михеева Э.Р. Исследование методом проточной цитометрии взаимодействия квантовых точек с клетками крови человека / Мнхеева Э.Р., Плескова С.Н., Горшкова E.H., Пудовкина Е.Е. // Сборник трудов I всероссийская интернет-конференция «Современные проблемы биохимии и бионанотехнологии». Казань. - 2010. - с. 106-108.

10. Михеева Э.Р. Влияние квантовых точек на клетки крови человека / Михеева Э.Р. // Материалы форума «Перспективы и риски использования наноматериалов в технических и природных системах». Москва. - 2009. - с. 124-130.

11 Михеева Э.Р. Влияние наноматериалов на активность миелопероксидазы нейтрофильных гранулоцитов / Михеева Э.Р., Плескова С.Н., Горшкова E.H., Пудовкина Е.Е. // Сборник трудов первой международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине». Санкт-Петербург. -2010.-е. 284285.

Статьи, опубликованные в материалах международных конференций и конгрессов:

12 Гиматдинова Э.Р. Цитотоксический эффект квантовых точек на нейтрофильные гранулоциты / Гиматдинова Э.Р., Плескова С.Н. // Материалы II Международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии». Казань. - 2008. - с. 155-156.

13. Гиматдинова Э.Р. Морфологическая неоднородность нейтрофильных гранулоцитов в системе с квантовыми точками / Гиматдинова Э.Р., Плескова С.Н. // Сборник тезисов 12 Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущине. - 2008. - с. 172-173.

14. Гиматдинова Э.Р. Цитотоксические свойства квантовых точек / Гиматдинова Э.Р., Плескова С.Н, Балалаева И.В. // VIII Международная молодежная научно-техническая конференция «Будущее технической науки». Н.Новгород. - 2009. - с. 306.

15. Михеева Э.Р. Поглощение квантовых точек нейтрофильными гранулоцитами и эффекты их взаимодействия с клетками / Михеева Э.Р., Плескова С.Н., Балалаева И.В. // Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова. Сборник тезисов. Москва-Пущино. - 2009. - Т. 2. - с. 153-156.

16. Гиматдинова Э.Р. Влияние квантовых точек на функциональную активность нейтрофилов / Гиматдинова Э.Р. // Сборник тезисов 13 Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино. - 2009. - с. 98-99.

17. Плескова С.Н. Биоцидные свойства наноматериалов / Плескова С.Н., Балалаева И.В., Гиматдинова Э.Р., Горшкова Е.Н., Голубева И.С., Першин Е.А., Весновских Е.Ю. // Материалы 1-ой Международной научной школы «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах». Москва. - 2009. - с. 312 -314.

18. Горшкова Е.Н. Лизосомально-катионный тест для исследования воздействия наиопорошка Er/Yb на нейтрофильные гранулоциты / Горшкова Е.Н., Плескова С.Н., Михеева Э.Р., Пудовкина Е.Е. // Сборник тезисов 14 Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино. - 2010. - с. 119.

19. Ekaterina N. Gorshkova AFM application in research of integration Neutrophils with Er/Yb nanoparticles / Ekaterina N. Gorshkova, Svetlana N. Pleskova, Elza R. Mikheeva // Third international meeting on AFM in life sciences and medicine. Red Island, Croatia. - 2010. - p. 104.

20. Elza R. Mikheeva Research of the semiconductor nanoparticles influence on the neutrophil granulocytes by AFM / Elza R. Mikheeva, Svetlana N. Pleskova, Ekaterina N. Gorshkova // Third international meeting on AFM in life sciences and medicine. Red Island, Croatia. - 2010. - p. 113.

21. Svetlana N. Pleskova Using of AFM for morphological and visco-elastic characteristics of living cells under hydrogen peroxide conditions / Svetlana N. Pleskova, Elza R. Mikheeva, Ekaterina N. Gorshkova // Third international meeting on AFM in life sciences and medicine. Red Island, Croatia. - 2010. - p. 119.

22. Плескова С.Н. Проявление токсичности квантовых точек в реакциях с нейтрофилами / Плескова С.Н., Балалаева И.В., Гущина Ю.Ю., Гиматдинова Э.Р., Сергеева Е.А. // Тезисы докладов I Международного конгресас по нанотехнологиям, конференции «Нанотехнологии в онкологии». Москва. -2008.-с. 160.

23 Михеева Э.Р. Ослабление кислород-независимых реакций нейтрофилов под воздействием квантовых точек / Михеева Э.Р. // Тезисы докладов XVII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010», секция «Биология». Москва. -2010.-е. 32.

24. Pleskova Svetlana Nanomechanical properties of living cells under different conditions estimated by AFM / Pleskova Svetlana, Gorshkova Ekaterina, Mikheeva Elza II Neuroplasticity: nervous substrate for health and disorder/ ISTC international scientific workshop abstract book. Tbilisi, Georgia. - 2010. - p. ,56-57.

25. Михеева Э.Р. Модуляция ферментативной активности нейтрофильных гранулоцитов квантовыми точками / Михеева Э.Р. // Материалы Международного молодежного научного форума «Ломоносов-2011», секция «Биология». Москва. - 2011. - с. 26,

26. Михеева Э.Р. Влияние квантовых точек на выживаемость нейтрофилов / Михеева Э.Р., Плескова С.Н., Горшкова Е.Н., Пудовкина Е.Е. // Сборник тезисов 15 Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино. - 2011. - с. 194.

27. Elza Mikheeva Difference kind morphology of pseudopodia neutrophil in phagocytosis of bacteria and xenobiotics investigated by atomic force microscopy / Elza Mikheeva, Svetlana Pleskova, Ekaterina Gorshkova // Fourth international meeting on AFM in Life sciences and Medicine Paris, France. - 2011. - p.85.

28. Плескова C.H. Взаимодействие нативных клеток крови с наноразмерными флюорофорами / Плескова С.Н., Михеева Э.Р., Горшкова Е.Н. // Сборник тезисов 5 международной конференции «Современные достижения бионаноскопии». Москва. - 2011. - с. 39,

Статьи в региональных изданиях и материалах конференций:

29. Гиматдинова Э.Р. Цитологический эффект квантовых точек на нейтрофильные гранулоциты / Гиматдинова Э.Р., Князев Д.И., Плескова С.Н., Бапалаева И.В., Гущина Ю.Ю. // XIII Нижегородская сессия молодых ученых. Естественно-научные дисциплины. Нижний Новгород. - 2008. - с. 11.

30 Куценко О.В. Применение полупроводниковых квантовых точек для анализа функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов / Куценко О.В., Гиматдинова Э.Р. Н XIV Нижегородская сессия молодых ученых. Естественно-научные дисциплины. Нижний Новгород. - 2009. - с. 134-135.

31 Михеева Э.Р. Ингибирование защитных реакций нейтрофильных гранулоцитов в системе с квантовыми точками и нанопорошком Er/Yb / Михеева Э.Р., Горшкова Е.Н. // Материалы III Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010». Нижний Новгород. - 2010. - с. 179.

32 Пудовкина Е.Е. Исследование влияния квантовых точек на лизосомально-катионные белки нейтрофильных гранулоцитов / Пудовкина Е.Е., Михеева Э.Р., Горшкова Е.Н. // «Биосистемы: организация, поведение и управление». Материалы 62-й и 63-й студенческих научных конференций биологического факультета. Нижний Новгород. - 2010. - с. 70-71.

33 Михеева Э.Р. Применение цитохимических тестов для оценки воздействия полупроводниковых нанокристаллов на нейтрофильные гранулоциты / Михеева Э.Р., Горшкова Е.Н., Плескова С.Н., Пудовкина Е.Е. // XV Нижегородская сессия молодых ученых. Труды молодых ученых по естественнонаучным дисциплинам, Нижний Новгород. - 2010. - с. 18-19.

f \

34 Горшкова E.H. Цитотоксический эффект наноразмерных флюорофоров с ионами Er/Yb оцененный по их влиянию на цитохимические реакции нейтрофильных гранулоцитов / Горшкова E.H., Плескоза С.Н., Михеева Э.Р. // Сборник материалов четвертой всероссийской конференции по наноматериалам «НАНО-2011». Москва. - 2011. - с. 50.

35 Канунов А.Е. Разработка люминесцентных материалов на основе ортофосфатов структурного типа NaZr2(P04)3 для исследования живых систем / Канунов А.Е., Горшкова E.H., Михеева Э.Р. //. Тезисы докладов V Всероссийской конференции студентов и аспирантов «Химия в современном мире». Санкт-Петербург. - 2011.-с. 181 -182.

36. Михеева Э.Р. Накопление квантовых точек лейкоцитарной фракцией крови / Михеева Э.Р., Плескова С.Н., Горшкова E.H., Пудовкина Е.Е. // Материалы IV Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2011». Воронеж. - 2011. - Т. 2. - с. 38-40.

37. Горшкова E.H. Атомно-силовая микроскопия для исследования изменений в морфологии нейтрофилов под воздействием вносимых наноразмерных флуорофоров / Горшкова E.H., Плескова С.Н., Михеева Э.Р. // Сборник материалов XVII Российского симпозиума по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел «РЭМ-2011». Черноголовка. - 2011. - с. 236.

38. Михеева Э.Р. Применение атомно-силовой микроскопии для оценки изменения упругости мембран нейтрофильных гранулоцитов под воздействием квантовых точек / Михеева Э.Р., Плескова С.Н., Горшкова E.H. // Сборник материалов XVII Российского симпозиума по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел «РЭМ-2011». Черноголовка. - 2011. - с. 253.

39. Михеева Э.Р. ингибирование защитных реакций нейтрофильных гранулоцитов в системе с квантовыми точками и нанопорошком Er/Yb / Михеева Э.Р., Горшкова E.H. // Сборник тезисов III Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010». Нижний Новгород. -2010.-е. 179-180.

Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю д.б.н., профессору Плесковой С.Н., за возможность проведения экспериментов директору НОЦ ФТНС ННГУ, к.ф.-м.н. Горшкову О.Н:, а также за совместные исследования м.н.с. Горшковой E.H., научному сотруднику IRCIMA Нежданову A.B., коллективу лаборатории биофотоники ИПФ РАН, в особенности к.б.н., н.с. Балалаевой И.В., коллективу лаборатории клеточных технологий и биофотоники ННГУ, в особенности к.б.н. Брилкиной A.A.

Подписано в печать 05.10.2011. Формат 60 х 84 '/,6.

Бумага офсетная. Печать офсетная. Уч.-изд. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 692.

Нижегородский государственный технический университет им. P.E. Алексеева.

Типография НГТУ.

Адрес университета и полиграфического предприятия: 603950, г. Нижний Новгород, ул. Минина, 24.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Михеева, Эльза Равилевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КЛЕТОК С КВАНТОВЫМИ

ТОЧКАМИ.

1.1. Физико-химическая характеристика квантовых точек.

1.2. Механизмы проникновения квантовых точек в клетки.

ГЛАВА 2. АЛЬТЕРАЦИЯ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ КЛЕТОК КВАНТОВЫМИ

ТОЧКАМИ.

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Материалы исследования.

3.2. Методы исследования.

3.2.1. Выделение нейтрофилов из крови.

3.2.2. Исследование жизнеспособности клеток крови в системе с квантовыми-точками.

I 3.2.3. Исследование морфологических изменений нейтрофилов в системе с квантовыми точками методом конфокальной лазерношсканирующей микроскопии.

3.2.4. Исследование нейтрофилов в системе с квантовыми точками методом атомно-силовой микроскопии.

3.2.5. Исследование воздействия квантовых точек на кислородзависимую систему нейтрофилов.

3.2.6. Исследование воздействия-квантовых точек на кислороднезависимую систему нейтрофилов.

3.2.7. Исследование биохимических изменений нейтрофилов в системе с квантовыми точками.

3.2.8. Исследование способности нейтрофилов к СЗЬ-зависимой адгезии.

3.2.9. Исследование спектральных характеристик квантовых точек после инкубации с нейтрофилами.

3.2.10. Определение скорости оседания эритроцитов (СОЭ).

3.2.11. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ.

4.1. Распределение квантовых точек в лейкоцитарной фракции крови.

4.2. Исследование жизнеспособности нейтрофильных гранулоцитов в системе с квантовыми точками.

4.3. Визуализация динамики взаимодействия и морфологических изменений нейтрофилов в системе с квантовыми точками.

4.4. Функциональное состояние нейтрофилов в системе с квантовыми точками.

4.5. Биохимические изменения нейтрофилов в системе с квантовыми точками.

4.6. Исследование комплексного воздействия квантовых точек на кровь.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Морфофункциональная и биохимическая альтерация клеток крови квантовыми точками"

Geys и соавт., 2009); яйцеклетках (Chan и соавт., 2008); эпидермальных «базальных» клетках человека (НЕК) (Ryman-Rasmussen и соавт., 2007); макрофагах (Clift и соавт., 2010) и других клеточных линиях. Исследования на мышах и крысах in vivo показали, что кумуляция KT происходит преимущественно в печени, селезенке и почках (Fischer и соавт., 2006; Yang и соавт., 2007; Robe и соавт., 2008). Так же следует учесть, что выявление альтерирующего действия KT на клетки является не тривиальной задачей, поскольку не все KT одинаковы и эффекты их взаимодействия с клетками зависят от многих факторов: индивидуальных физико-химических свойств, условий окружающей среды, концентрации, окислительной и механической стабильности и способа проникновения в организм. Однако, при любом, механизме проникновения KT в организм и после преодоления ими первого защитного барьера, они неизбежно оказываются в крови, поэтому становиться актуальным вопрос о степени альтерирующего воздействия НЧ на клетки крови: В литературе этот вопрос не освещен.

Цель работы: исследовать функциональные, морфологические и биохимические* изменения, клеток крови- человека в системе с квантовыми-точками различного состава.

Задачи исследования:

1. определить распределение и накопление квантовых точек в лейкоцитарной фракции крови;

2. провести сравнительный анализ влияния квантовых точек различного состава на жизнеспособность нейтрофильных гранулоцитов. Определить DL50 для квантовых точек разного состава;

6. изучить влияние квантовых точек на скорость оседания эритроцитов человека.

Научная новизна работы. Впервые исследовано распределение квантовых точек среди клеток лейкоцитарной фракции крови и показано, что максимальная кумуляция наблюдается в фагоцитах. Впервые проанализирована динамика взаимодействия, нейтрофилов с квантовыми точками и выявлена экстрануклеарная кумуляция квантовых точек, агрегация- квантовых точек нейтрофилами, передача агрегатов^ квантовых точек, феномен избегания взаимодействия с квантовыми точками: Впервые проведен сравнительный анализ воздействия квантовых точек различного состава на жизнеспособность нейтрофильных гранулоцитов; Впервые получены данные об' изменении морфофункционального состояния, и биохимического статуса нейтрофилов периферической крови при воздействии на них квантовых точек. Впервые выявлено снижение ригидности мембран нейтрофильных гранулоцитов в системе с квантовыми точками. Впервые показано комплексное влияние квантовых точек на кровь человека, отражаемое в изменении скорости оседания эритроцитов.

Теоретическая и практическая значимость работы: Исследование эндоцитоза КТ нейтрофилами дополняют теоретические знания о механизмах поглощения ксенобиотиков фагоцитами. Результаты, демонстрирующие, что не только фагоциты способны связывать КТ, представляют новые теоретические данные о сорбции наноматериалов клетками крови, а выявление агрегации КТ нейтрофилами расширяет теоретические представления о клининговой функции крови. Данные, полученные в результате оценки: функциональных и морфологических изменений клеток крови человека, могут быть использованы в разработке систем диагностики цитотоксического действия; НЧ. Разработанная модель визуализации позволяет отслеживать как: процессы поглощения;.таки внутриклеточного трейсинга наноматериалов. Полученные в ходе работы данные позволяют дополнить курс «Физиология человека» и «Медикобио логические основы обеспечения безопасности жизнедеятельности».

Положения, выносимые на защиту:

1. Фагоциты разной степени; морфологической и функциональной зрелости одинаково активно поглощают квантовые точки:.

3. Среди вариантов клеточной гибели под воздействием наночастиц основная: роль принадлежит некротической гибели.

4. Нейтрофильные гранулоциты поглощают квантовые точки; и накапливают их в своемюбъеме преимущественно внеядерно, в фаголизосомах.

Апробация работы. Основные положения работы были доложены и обсуждены: на II международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (г. Казань, 2008), на Международной конференции «Нанотехнологии в онкологии» (г. Москва, 2008), на XII, XV международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (г. Пущино, 2008, 2011), на XIII, XIV, XV, XVI сессии молодых ученых (г. Нижний Новгород, 2008, 2009, 2010, 2011), на международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова (Москва-Пущино, 2009), на 1-ой международной научной школе «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах» (г. Москва, 2009), на XVII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010» (г. Москва, 2010), на III и IV международной конференции «AFM BioMed» (Red Island, Хорватия, 2010 и Париж, Франция, 2011), на международной конференции «Neuroplasticity: nervous substrate for health and disorder» (г. Тбилиси, Грузия, 2010), на XVII Российском симпозиуме по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел «РЭМ-2011» (г. Черноголовка, 2011), на III Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010» (г. Нижний Новгород, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 39 научных работ, из них 3 — в изданиях, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 111 i страницах и состоит из введения, 2 глав обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа содержит 38 рисунков и 7 таблиц. Список

I 1 литературы включает 183 источника, из которых 153 на иностранных языках. белков, нуклеиновых кислот и др.), позволяющих использовать нанокристаллы для создания систем направленной доставки, систем биоимиджинга, диагностики и терапии (Bailey и соавт., 2004; Hardman, 2006; Pisón и соавт., 2006; Azzazy и соавт., 2007; Choi и соавт., 2008). Уже первое исследование, посвященное возможности использования, квантовых точек для- молекулярной диагностики, показало, что конъюгация пептидов с квантовыми точками приводит к их селективному накоплению в сосудах опухолей и других тканей ex vivo (Akerman и соавт., 2002). Позднее были выполнены исследования, показавшие возможность использования конъюгатов «КТ-пептид» для визуализации специфических тканей in vivo. Так, в работе W. Cai и соавт. (2006) применялись квантовые точки, конъюгированные с трипептидом arg-gly-asp. Последний является антагонистом интегрина ау(3з, который, в свою очередь, селективно экспрессируется на поверхности опухолевых клеток и сосудов. В» результате внутривенного введения конъюгатов квантовых точек с указанным трипептидом авторам удалось добиться идеальной флуоресцентной картины подкожной глиобластомы у мышей in vivo. Квантовые точки также конъюгировались с • моноклональными антителами против мембранного простатоспецифического антигена для детекции рака предстательной железы у мышей in vivo (Gao и соавт., 2004). В' другом исследовании применялись конъюгаты квантовых точек и антител против альфафетопротеина для визуализации гепатомы in vivo (Yu и соавт., 2007). Н. Tada и соавт. (2007), используя метод высокоскоростной конфокальной микроскопии кожной складки, изучили движение единичной квантовой точки, конъюгированной с антителом против херсептина-2, у мышей с раком молочной железы. При этом авторы наблюдали циркуляцию квантовой точки в просвете кровеносных сосудов, экстравазацию квантовой точки, ее связывание с мембранным антигеном и движение от мембраны опухолевой клетки к перинуклеарной зоне. Итак, применение квантовых точек может существенно расширить возможности диагностики многих заболеваний. В настоящее время квантовые точки активно используются для детекции опухолевых клеток (Wu и соавт,

2002), маркирования внутриклеточных органелл (Напакл и соавт., 2003), визуализации микрососудов (1лт и соавт., 2003) и многих других биомедицинских исследованиях.

К сожалению, прижизненная флюоресцентная диагностика тканей с помощью квантовых точек, успешно продемонстрированная в нескольких работах на мелких лабораторных животных, в силу ограниченной глубины проникновения оптического сигнала не может быть напрямую экстраполирована на клиническую практику. В * медицине эта методика может применяться для выявления поверхностных тканевых образований (опухоли кожи и подкожной клетчатки), интраоперационной диагностики и визуализации зон, доступных при эндоскопии (Шляхто, 2009). Другим недостатком квантовых точек можно назвать явление их мерцания, которое обусловлено случайными изменениями между излучающим и- неизлучающим состояниями КТ (Ка^ и соавт., 2007). В результате мерцания происходит разрыв флюоресценции КТ, что особенно важно в области обнаружения одной молекулы одной КТ. В некоторых же случаях, например в иммуноцитологических исследованиях, разрыв во флюоресценции помогает отличить сигнал, идущий от КТ, от сигнала, получаемого как артефакт. В последнее время 8. НоЬг^ и соавт. (2004) предположили, что мерцание КТ может быть подавлено в результате пассивации поверхности КТ тиоловыми группами.

Итак, квантовые точки — флюоресцентные полупроводниковые нанокристаллы, состоящие из атомов элементов П-1У или Ш-У групп периодической таблицы Менделеева и имеющие размер меньше радиуса экситона Бора для данного материала (Яшин и соавт., 2007; вио и соавт., 2009). В биомедицинских приложениях наиболее зарекомендовали себя КТ, состоящие из основного материала (кора), обычно это либо теллурид кадмия (СсГГе) или селенид кадмия (СёБе), покрытые оболочкой, например сульфидом цинка или сульфидом кадмия (Сёв), а также КТ сложного состава короболочка-оболочка, напрмер, Сс1Те/Сс18/£п8, которые обладают высоким выходом флуоресценции. Чаще всего при синтезе КТ используются триоктилфосфиновая окись (ТОФО), придающая им гидрофобный характер. Поэтому прежде чем применять КТ в биологических системах, необходимо придать им свойство гидрофильности. Для этого с помощью различных обменных реакций поверхность КТ покрывают гидрофильным покрытием, например меркаптокислотами, полиэтиленгликолем (ПЭГ), бычьим сывороточным альбумином и другими (Олейников и соавт., 2007). В литературе введена особая номенклатура в обозначениях КТ. Например, «КТ655» -цифрами обозначают максимум пика флюоресценции КТ.

Относительно большая суммарная площадь поверхности в сочетании с универсальной управляемой химией поверхности делает КТ наилучшим решением в. области создания избирательно действующих нанопрепаратов. Физические и химические свойства КТ, включая размер, форму, поверхностный заряд и тип покрытия, играют важную роль в определении И'прогнозировании вариантов клеточной интернализации, фармакокинетики и биораспределения определенных типов КТ в клетках. Знание основных механизмов поглощения, трейсинга и эндоцитоза НЧ позволят дать оценку биологической совместимости и безопасности КТ по- отношению к биологической^ системе (Rejman и соавт., 2004; Champion и соавт., 2006).

Поскольку размер КТ сопоставим по размеру с молекулами белков и нуклеиновых кислот, можно предположить, что он является ключевым фактором в процессе интернализации КТ клеткой. Так, I. Nabiev и соавт. (2007) выявили зависимость эндоцитоза и внутриклеточного трейсинга КТ от их размера. КТ CdSe быстро поглощались макрофагами и в зависимости от размера накапливались в различных клеточных компартментах. Наименьшие зеленые КТ локализовались преимущественно в ядрах и ядрышках клеток, причем процесс поступления был многоступенчатым, включающим эндоцитоз, активный цитоплазматический транспорт и внедрение в ядра через ядерные поры. Красные КТ концентрировались в цитоплазме клеток. J. Lovric' и соавт. (2005) во время исследования КТ CdTe при инкубации их с крысиными клетками (микроглиальные N9) вывили зависимость распределения КТ CdTe в клетках от размера. Аналогично результатам работы I. Nabiev и соавт. (2007), они также показали, что квантовые точки малого размера с зеленой флюоресценцией (2,2±0,1 нм в диаметре) концентрировались в ядре и вблизи него после 1 часа инкубации, а большого размера квантовые точки с красной флюоресценцией (5,2±0,1 нм в диаметре) находились в цитозоли и не проникали в ядро. Различие в распределении КТ с зеленой и красной флюоресценцией связано с размером НЧ. КТ малого размера могут с большей легкостью проникнуть в ядро и другие части клетки, чем НЧ большего размера. Для проверки этой гипотезы КТ с зеленой флюоресценцией были покрыты макробиомолекулами, такими как бычий сывороточный альбумин. В результате размер этих КТ увеличился, и они уже были не способны проникать в ядро клетки. В других исследованиях было показано", что размер наночастиц оказывает сильное влияние на связывание и активацию мембранных рецепторов и последующую экспрессию белка (Jiang и соавт., 2008).

B.D. Chithrani и соавт. (2007) также установили, что кинетика поглощения клетками Hela наночастиц золота изменяется в зависимости от их размера. Помимо этого авторами было рассмотрено влияние формы наночастиц на их интернализацию клетками: сферические частицы поглощались в большей степени, чем палочковидные того же размера. Возможно, это было связано с большим временем, необходимым для образования вытянутых инвагинаций в мембране клеток для упаковки удлиненных НЧ. S.E.A. Gratton и соавт. (2008) показали, что клеточная интернализация НЧ сильно зависит й от размера, и от формы, частиц. Так НЧ кубической формы с длинами сторон 3 мкм и 5 мкм практически не поглощались клетками Hela в отличие от кубических частиц с длиной стороны 2 мкм. Цилиндрические частицы, имеющие диаметр 500 нм и 1 мкм, поглощались клетками лучше, чем кубические НЧ. Но и среди НЧ цилиндрической формы наблюдалось различие в скорости поглощения в зависимости от размера: частицы диаметром 150 нм и высотой 450 нм поглощались в 4 раза быстрее, чем более симметричные НЧ диаметром 200 нм и высотой 200 нм. Интернализация же цилиндрических частиц,, имеющих диаметр 100 нм, осуществлялась в меньшей степени, чем цилиндрических частиц с большим диаметром (150 нм); Возможное объяснение тому факту, что кинетика интернализации НЧ зависит от их размера, заключается в том, что мультивалентные катионоактивные взаимодействия КТ с клетками наиболее доступны для частиц с большей поверхностью контакта, чем с меньшей; J.A. Champion и соавт. (2006) на альвеолярных макрофагах показали, что на; фагоцитоз полистироловых частиц влияет форма; а не размер: Однако, известно, что размер частиц в первую очередь, влияет на завершённость фагоцитоза их клетками.

Исследование влияния формы, и размера наноматериалов на клеточное поглощение имеет решающее значение, поскольку может определить токсичность НЧ (Nel и соавт., 2009). A. Shiohara и соавт. (2004) сравнивали' цитотоксические эффекты; квантовых точек, имеющих разные размеры: КТ520 (зеленая флюоресценция), КТ570- (желтая флюоресценция), и КТ640 (красная флюоресценция). КТ520, у которых был наименьший размер, показали самую' высокую токсичность. Объяснением этого эффекта являлась наибольшая подвижность малых КТ в клетках.Таким образом, маленькие НЧ имеют больше -шансов интернализоваться или связаться с клеткам» и потому их токсичность выше. Аналогично J. Lovric' и соавт. (2005) нашли, что квантовые точки с зеленой флюоресценцией (2,2±0,1 нм в диаметре) демонстрировали более высокие цитостатические эффекты, чем квантовые точки CdTe с красной флюоресценцией (5,2±0,1 нм в диаметре). Для увеличения размера КТ они были покрыты БСА. В результате наблюдали уменьшение цитотоксического эффекта КТ в отношении клеток. Подобное исследование проводилось в работе J.P. Ryman-Rasmussen и соавт. (2007). Было обнаружено, что при инкубации квантовых точек, отличающихся размером КТ655 (6 нм) и КТ565 (4,6 нм), с эпидермальными «базальными клетками» человека (НЕК) в течение 24 часов жизнеспособность клеток была уменьшена на 40% в обоих случаях. При инкубации в течение 48 часов жизнеспособность клеток с КТ655 была значительно ниже, чем у клеток с КТ565, что также свидетельствует о роли размера в проявлениях цитотоксичности. L. Wang и соавт. (2008) отмечали, что на токсичность квантовых точек, покрытых полиэтиленгликолем (ПЭГ), влияет размер частиц. Они обнаружили, что при инкубации их с клетками Сасо-2 (модель эпителиальных клеток карциномы тонкого кишечника человека) квантовые точки большего размера были более токсичны, чем меньшего.

Таким образом, среди исследователей нет единого мнения о влиянии размера квантовых точек на их токсичность. Казалось бы, чем меньше размер, тем отношение поверхности квантовых точек к объему выше и тем выше должна быть токсичность. Однако на практике L. Wang и соавт. (2008), а также J.P. Ryman-Rasmussen и соавт. (2007) установили иную зависимость: чем больше размер, тем больше токсичность квантовых точек.

Кроме размера и формы не менее важной характеристикой КТ является^ заряд на их поверхности, поскольку при контакте с отрицательно* заряженной мембраной клеток на начальном этапе взаимодействия возникают электростатические силы, которые могут препятствовать интернализации клетками КТ. Так Y. Shan и соавт. (2011) показали, что при, покрытии^ поверхности КТ карбоксильной группировкой- эндоцитоз не наблюдался. Это» позволило им сделать предположение, что положительно заряженные КТ эндоцитируются за счет электростатических взаимодействий с отрицательно заряженной мембраной клеток Hela. Причем методом АСМ они определили, что для поглощения клеткой одной КТ достаточно 0,4 с (Shan и соавт., 2011). Аналогичные результаты были получены группой S.E.A. Gratton и соавт. (2008) при исследовании зависимости поверхностного заряда цилиндрических наночастиц (диаметр 150 нм, высота 450 нм) на интернализацию клетками Hela. Они выявили, что положительно заряженные НЧ были поглощены в большей степени (84%) после 1 ч инкубации, тогда как имеющие такую же форму, но отрицательно заряженные НЧ не поглощались клетками. Однако, в работе M .J. Clift и соавт. (2008) было показано, что отрицательно заряженные полистироловые шарики поглощались макрофагами. Аналогично A. Hoshino и соавт. (2004) также наблюдали, что карбоксилированные на поверхности КТ поступали в мышиные клетки ЕЬ-4 путем эндоцитоза. Также .Т.К. 1а15ша1 и соавт. (2003) выявили, что отрицательно заряженные СсШе/ЕпБ-дигидролипоевая кислота легко поглощаются клетками млекопитающих. I. №Ыеу и соавт. (2007) показали не только эндоцитоз отрицательно заряженных КТ СсГГе-тиогликолевая кислота клетками, но и продемонстрировали, что после поглощения внутриклеточный транспорт КТ не заканчивается в лизосомах. Данный тип КТ попадает в цитоплазму и накапливается в перинуклеарной области. Катионные частицы могут связываться с отрицательно заряженными группами на поверхности клеток (например, сиаловой кислотой) и перемещаться через плазматическую мембрану, в отличие от низкого уровня взаимодействия и интернализации клетками нейтральных и отрицательно заряженных частиц. О. НагшИ-Ргепке! и соавт. (2007) изучили механизмы -эндоцитоза заряженных частиц. Их результаты показали, что отрицательно заряженные наночастицы менее эффективно поглощаются, клетками, тогда как положительно заряженные — быстро. Кроме того, при ингибировании клатрин-зависимого пути поглощения в клетках, интернализация. положительно-заряженных частиц протекала по компенсационным, путям: с большей скоростью.

Итак, заряд на поверхности КТ регулирует процессы эндоцитоза клетками. С другой стороны существует несколько работ, в которых показано, что заряд на поверхности КТ влият ещё и на их токсичность. Так .Г.Р: Яутап-КазтиББеп и соавт. (2007) получили результаты, свидетельствующие о том, что Сс18е/гп8, покрытые нейтральным полиэтиленгликолем (ПЭГ) или катионактивным ПЭГ-М^, не повлияли на жизнеспособность эпидермальных клеток человека НЕК (МТТ-тест) после 24 часов инкубации в отличие от анионактивных КТ, покрытых карбоксильной кислотой, которые снижали выживаемость на 20 %. При последующей инкубации в течение 48 часов снижение жизнеспособности клеток наблюдалось для всех трёх типов наночастиц: на 20% для нейтральных квантовых точек; на 40% для катионактивных; на 70% для анионактивных. Таким образом, J.P. Ryman-Rasmussen и соавт. (2007) подтвердили влияние заряда на поверхности КТ на их токсичность. G. Guo и соавт. (2007) также обнаружили зависимость цитотоксичности КТ от заряда, поверхностного покрытия. Так положительно заряженные (+59,3 мВ) КТ CdSe, покрытые ацетилтриметиламмониумбромидом (АТАБ), при инкубации с клетками HepG2 проявили цитотоксичность при любой концентрации; Отрицательно; заряженные (-57,6 мВ) квантовые точки с покрытием додецилсульфатом натрия (ДСН) не вызвали повреждение клеток при трех низких концентрациях (10 ррш, 20 ррш, 50 ррш) в течение 12, 24, 48 и 72 часов инкубации, в отличие от нанокристаллов,* взятых при трех высоких концентрациях (100 ррш, 200 рргп, 400 ррш) и тех же периодах инкубации. Неионогенные квантовые точки (-13,4 мВ), покрытые Fluronic® 68 (F-68), были не: токсичны при« любых концентрациях.

Размер, форма и заряд наноматериалов вносят существенный вклад в их взаимодействие с клетками. Однако функциональные группы на поверхности НЧ определяют многие важные: свойства: наноматериалов, такие как растворимость и способность. взаимодействовать с поверхностью клетки. Как правило, инкубация наноматериалов в среде:с. клетками приводит к адсорбции плазмы и/или белков на поверхности НЧ (Khan и соавт., 2007). В результате чего эндоцитоз НЧ может протекать рецептор-опосредованным путем. Однако адсорбция белков на поверхности НЧ может привести к агломерации частиц и выведению через ретикулоэндотелиальную систему. Неспецифические взаимодействия также могут привести к связыванию НЧ с клеточной мембраной, что сделает маркировку и детекцию неэффективной. Чтобы избежать таких проблем, НЧ могут быть покрыты нейтральными лигандами (например, полиэтиленгликолем), которые не вступают во взаимодействие с белками. При сравнении между КТ, покрытыми и не покрытыми ПЭГ, было выявлено, что эндоцитоз вторых выше, чем первых (Xie и соавт., 2007).

Таким образом, поверхностные, химические и физические свойства НЧ играют решающую роль в их взаимодействии с клетками. Однако для создания биосовместимых и безопасных KT в отношении биологических систем будут недостаточны знания лишь о физико-химических свойствах НЧ. Немаловажным моментом во взаимодействии KT с клетками является понимание механизма эндоцитоза, внутриклеточного трейсинга и экзоцитоза НЧ.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Михеева, Эльза Равилевна

ВЫВОДЫ

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Михеева, Эльза Равилевна, Нижний Новгород

1. Адо А.Д., Маянский А.Н. Современное состояние учения о фагоцитозе // Иммунология. 1983. - №1. — с. 20-26.

2. Бакуев М.М., Саидов М.З., Бутаков A.A. Особенности секреции миеломпероксидазы и хемилюминесцентного ответа нейтрофилов человека при контакте со стимуляторами различной природы // Иммунология. — 1991. — №1. — с. 15-16.

3. Беляева Т.Н., Салова A.B., Леонтьева Е.А., Моженок Т.П., Корнилова Е.С., Кроленко С.А. Нецелевые квантовые точки в прижизненных конфокально-микроскопических исследованиях клеток // Цитология. — 2009. — Т. 51.-№ 10.-с. 830-837.

4. Виксман М. Е., Маянский А. Н. Применение реакции восстановления нитросинего тетразолия для оценки функциональногоIсостояния нейтрофилов человека // Казанский» медицинский журнал. 1977. -№5.-с. 99-100.

5. Гланц С. Медико-биологическая статистика. Пер: с англ. М., Практикаю - 1998. - 459 с.

6. Демин* A.A. НБТ-тест при бактериальных и небактериальных заболеваниях. Оценка и перспективы использования // Советская Медицина. -1976. -№12. -с. 16-20.

7. Жекова М:М., Анатолий С.А., Ашмарин И.П. Выброс миелоперокидазы из нейтрофилов при сорбции бактерий // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. — 1976. — №3. — с. 70-73.

8. Зинкин В.Ю., Годков М.А. Способ количественной* оценки кислородзависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов человека // Клиническая лабораторная диагностика. 2004. - №1. - с. 26.

9. Куценко С.А. Основы токсикологии // Санкт-Петербург: Издательство Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова. 2002. - с. 395.

10. Маянский А.Н., Маянский H.A., Заславская М.И., Поздеев Н.М., Плескова С.Н. Апоптоз нейтрофилов // Иммунология. 1999. - №6. - с. 11-20.

11. Маянский А.Н., Чеботарь И.В., Конышкина Т.М. Оценка альтернативного пути активации комплемента через СЗЬ-зависимую адгезию // Лабораторное дело. 1991. - №11. - с. 41-43.

12. Маянский А.Н., Маянский Д.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге // Новосибирск: Наука. 1989. - с. 34-40.

13. Маянский Д.Н. Определение биоцидности лейкоцитов // Новосибирск: Издательство СО РАМН. 1996. - Т. 2. - с. 32.

14. Олейников В.А., Суханова* A.B., Набиев И.Р. Флуоресцентные полупроводниковые нанокристаллы в биологии и медицине // Российские нанотехнологии. 2007. — Т. 2. — № 1-2. — с. 160-173.

15. Пигаревский В.Е. Клиническая морфология нейтрофильных гранулоцитов // Ленинград: Издательство ВНИИЖа. — 1988. — 142 с.

16. Плескова С.Н., Звонкова М.Б., Гущина Ю.Ю. Исследование морфологических параметров нейтрофильных гранулоцитов методом сканирующей зондовой микроскопии' // Морфология. Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. 2005. - Т. 127. — №1. — с. 60-62.

17. Подосинников И.С., Нилова Л.Г., Бабиченко И.В., Турина О.П., Пономарева В.Н. Метод определения хемотаксической активности лейкоцитов // Лабораторное дело. 1981. - № 8. - с. 468-470.

18. Рудик Д.В., Тихомирова Е.И. Методы изучения процесса фагоцитоза и оценки функционально-метаболической активности фагоцитирующих клеток // Саратов: Издательство Саратовского университета. -2006.-112 с.

19. Соколов В.В., Нарциссов Р.П., Иванова JI.A. Цитохимия ферментов в профпатологии. -М.: Медицина. — 1975. — 120 с.

20. Цой- И.Г., Овчинников В.В. Использование теста восстановления нитросинего тетразолия для определения характера гуморального взаимодействия активированных лимфоцитов с гранулоцитами // Лабораторное дело. -1983. -№11. -с. 31-33.

21. Шубич М.Г. Цитохимический анализ активности щелочной фосфатазы лейкоцитов и его клинико-диагностическое значение // Лабораторное дело. 1968. - № 6, - с. 323-327.

22. Шубич М.Г., Нагоев Б.М: Цитохимическое изучение щелочной фосфатазной активности нейтрофилов при инфекционных заболеваниях //Лабораторное дело. 1966. - № 11.-е. 646.

23. Шубич М.Г., Нагоев Б.С. Щелочная фосфатаза лейкоцитов в норме и патологии // М.: Медицина. 1980. — 224 с.

24. Шубич М.Г., Нестеров И.В. О специфичности цитохимического выявления кислой фосфатазы в нейтрофильных лецкоцитах // Лабораторное дело. 1980. - № 3. - с. 150-154.

25. Яшин К.д:з Осипович B.C., Пицук С.Е. Структура нанокристаллов селенида кадмия, полученных методом коллоидной химии для применения в медицинской диагностике // Доклады БГУИР. 2007. — №3. - с. 74-79.

26. Abdulaziz A., Okuda Т., Kawashima N., Nakayama К., Itoh Т., Ishikawa М., Biju V. Clathrin-mediated endocytosis of quantum dot-peptide conjugates in living cells // ACS Nano. 2009. - V. 3. - p. 2419-2429.

27. Akerman M.E., Chan W.C., Laakkonen P., Bhatia S.N., Ruoslahti E. Nanocrystal targeting in vivo И Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2002. — V. 99. p. 12617-12621.

28. Aldana J:, Wang Y.A., Peng X. Photochemical instability of CdSe nanocrystals coated by hydrophilic thiols // J. Am. Chem. Soc. — 2001. — V. 123. p. 8844-8850.

29. Araki N., Johnson M.T., Swanson J.A. A role for phosphoinositide 3-kinase in the completion of macropinocytosis and phagocytosis by macrophages // J. Cell Biol. 1996. - V.135. - p. 1249-1260.

30. Azzazy H.M., Mansour M.M., Kazmierczak S.C. From diagnostics to therapy: prospects of quantum dots // Clin Biochem. — 2007. V. 40. — p. 917-927.

31. Bailey R.E., Smith A.M., Nie S. Quantum dots in biology and.medicine // Physica E. 2004. - V. 25. - p. 1 -12.

32. Bailey R.E., Strausburg J.B., Nie S. A new class of far-red and near-infrared biological labels based on alloyed semiconductor quantum dots // J. Nanosci. Nanotechnol. 2004. - V. 4. - p. 569-574.

33. Balu R., Larimer,P., Strowbridge B.W. Phasic stimuli evoke precisely timed spikes in intermittently discharging mitral cells. // J Neurophysiol. — 2004. V. 92.-p. 743-753.

34. Bao Y.J., Li J.J., Wang Y.T., Lei Lou L.Y., Du W.J., Zhu Z.Q., Peng H., Zhu J.Z. Probing cytotoxicity of CdSe and CdSe/CdS quantum dots // Chinese Chemical Letters. 2011. - V. 22. - p. 843-846.

35. BeruBe K., Balharry D., Sexton K., Koshy L., Jones T. Combustion-derived nanoparticles: mechanisms of pulmonary toxicity // Clin Exp Pharmacol Physiol.-2007.-V. 34.-p. 1044-1050.

36. Brodsky F.M., Chen C.Y., Knuehl C., Towler M.C., Wakeham D.E. Biological basket weaving: formation and function of clathrin-coated vesicles // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2001. -V. 17. - p. 517-568.

37. Brown J.S., Zeman K.L., Bennett W.D. Ultrafine particle deposition and clearance in the healthy and obstructed lung // Am J Respir Crit Care Med. — 2002. — V.166.-p. 1240-1247.

38. Buono G., Anzinger J.J., Amar M., Kruth H.S. Fluorescent pegylated nanoparticles- demonstrate fluid-phase pinocytosis by macrophages in mouse atherosclerotic lesions // J. Clin. Invest. 2009. - V. 119. - p. 1373-1381.

39. Burns A.A., Vider J., Ow H., Herz E., Penate-Medina O., Baumgart M., Larson S.M., Wiesner U., Bradbury M. Fluorescent silica nanoparticles with efficient urinary excretion for nanomedicine // Nano Letter. — 2009. — V. 9. — p. 442-448.

40. Cai W., Shin D.W., Chen K., Gheysens O., Cao Q., Wang S.X., Gambhir S.S., Chen X. Peptide—labeled near—infrared quantum dots for imaging tumor vasculature in living subjects // Nano Letters. 2006. — V. 6. - p. 669-676.

41. Cardelli J. Phagocytosis and' macropinocytosis in Dictyostelium: phosphoinositide-based processes, biochemically distinct // Traffic. 2001. - V. 2. — p. 311-320.

42. Champion J.A., Mitragotri S. Role of target geometry in phagocytosis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. - V 103. - p. 4930-4934.

43. Chan W.C.W. Bio-applications of nanoparticles // Advances in experimental medicine and biology. 2007. - V. 620. — 207 p.

44. Chithrani B.D., Chan W.C.W. Elucidating the mechanism of cellar uptake and removal of protein-coated gold nanoparticles of different sizes and shapes //Nano Lett. -2007. -V. 7. p. 1542-1550.

45. Cho S.J., Maysinger D., Jain M., Roder B., Hackbarth S., Winnik F.M. Long-term exposure to CdTe quantum dots causes functional impairments in live cells. //Langmuir. -2007. V. 23. - p. 1974-1980.

46. Choi A.O., Brown S.E., Styf M., Maysinger D. Quantum dot-induced epigenetic and genotoxic changes in human breast cancer cells // J. Medicine Mol. -2008.-V. 86.-p. 291-302.

47. Choi A.O., Maysinger D. Applications of quantum dots in biomedicine // Semiconductor nanocrystal quantum dots: synthesis, assembly, spectroscopy and applications. Springer Wien: New York. 2008. — p. 349-365.

48. Clarke S.J., Hollmann C.A., Zhang Z., Suffern D., Bradforth S.E., Dimitrijevic N.M., Minarik W.G., Nadeau J.L. Photophysics of dopamine-modified quantum dots and effects on biological systems // Nat. Mater. — 2006. — V. 5. p. 409-417.

49. Clift M.J.D:, Boyles M.S., Brown D.M., Stone V. An-investigation into the potential for different surface-coated quantum dots to cause oxidative stress and affect macrophage cell signaling in vitro // Nanotoxicology. — 2010. — V. 4. — p. 139149.

50. Conner S.D., Schmid S.L. Regulated portals of entry into the cell // Nature. 2003. - V. 422. - p. 37-44.

51. Dailey M.E., Manders E., Soil D.R., Terasaki M. Confocal microscopy of living cells. // In: Handbook of biological confocal microscopy, Pawley J.B. (Ed.). Springer Science Business Media: New York. — 2006. p. 381-403.

52. Das G.K., Chan P.P., Teo A., Loo J.S., Anderson J.M., Tan T.T. In vitro cytotoxicity evaluation of biomedical nanoparticles and their extracts. // J Biomed Mater Part A. 2009. - V. 93. - p. 337-346.

53. Dausend J., Musyanovych A., Dass M., Walther P., Schrezenmeier H., Landfester K., Mailänder V. Uptake mechanism of oppositely charged fluorescent nanoparticles in HeLa cells // Macromol Biosci. 2008. - V. 8. - p. 1135-1143.

54. Derfus A.ML, Chan W.C.W., Bhatia S.N. Probing the cytotoxicity of semiconductor quantum dots// Nano latters. 2003. - V. 4. - p. 11-18.

55. Derfus A.M., Chan W.C.W., Bhatia S.N. Intracellular delivery of quantum dots for live cell labeling of organelle tracking. // Advanced Materials. -2004.-V. 16.-p. 961-966.

56. Ehrlich M., Boll W., Van Oijen A., Hariharan R., Chandran K., Nibert M.L., Kirchhausen T. Endocytosis by random initiation and stabilization of clathrin-coated pits // Cell! 2004. - V. 118. - p. 591-605.

57. Fischer H., Liu L., Pang K.S., Chan W.C.W. Pharmacokinetics of nanoscale quantum dots: in vivo distribution, sequestration and clearance in the rat // J. Adv Funct Mater. 2006. - V. 16. - p. 1299-1305.

58. Fleckenstein' J.M., Kopecko D.J. Breaching the mucosal* barrier by stealth: an emerging pathogenic mechanism for enteroadherent bacterial pathogens.// J. Clin. Invest. 2001. - V. 107. - p. 27-30.

59. Gao X., Cui Y., Levenson R.M., Chung L.W.K., Nie S. In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots // Nat. Biotechnol. — 2004. -V. 22.-p. 969-976.

60. Geys J., Nemmar A., Verbeken E., Smolders E., Ratoi M., Hoylaerts M.F., Nemery B., Hoet P.H.M. Acute toxicity and prothrombotic effects of quantum dots: impact of surface charge // Environ. Health Perspect. 2008. - V. 116. - p. 1607-1613.

61. Geys J., Vos.R.D., Nemery B., Hoet P.H.M. In vitro translocation of quantum dots and influence of oxidative stress // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2009. - V. 297. - p. L903-L911.

62. Gibson P.R., Anderson R.P., Mariadason J.M., Wilson A.J. Protective role of the epithelium of the small intestine and colon // Inflamm Bowel Dis. — 1996. -V. 2.-p. 279-302.

63. Gratieri T., Schaefer U.F., Jing L., Gao M., Kostka K.H:, Lopez R.F.V., Schneider M: Penetration of quantum dot particles through human skin // Journal of Biomedical Nanotechnology. 2010. - V. 6. - p. 586-595.

64. Gratton S.E., Ropp P.A., PoHlhaus P.D., Luft J.C., Madden V.J., Napier M.E., DeSimone J.M. The effect of particle design on cellular internalization pathways//ProcNatl Acad Sei U S A. 2008. - V. 105.-p. 11613-14618.

65. Green M., Howman E. Semiconductor quantum dots and free radical induced DNA nicking // Chem Commun. 2005. - p. 121-123.

66. Guo G., Liu W., Liang J., He Z., Xu H., Yang X. Probing the cytotoxicity of CdSe quantum dots with surface modification // Materials Letters. — 2007.-V. 61.-p. 1641-1644.

67. Guo Z., Tan L. Fundamentals and applications of nanomaterials // Artech House. Boston, London. - 2009. - 249>p.

68. Hanaki K., Momo A., Oku T., Komoto A., Maenosono S., Yamaguchi Y., Yamamoto K. Semiconductor quantum dot/albumin complex is a long—life and highly photostable endosome marker // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. -V. 302. - p. 496-501.

69. Hardman R. A toxicologic review of quantum dots: toxicity depends on physiochemical and environmental factors // Environ. Health Perspect. — 2006. — V. 114.-p. 165-172.

70. Harush-Frenkel O., Debotton N., Benita S., Altschuler Y. Targeting of nanoparticles to the clathrin-mediated endocytic pathway // Biochem. Biophys. Res. Commun.-2007.-V. 353.-p. 26-32.

71. Hassan E.A., Heinz W.F., Antonik M.D., D'Costa N.P., Nageswaran S., Schoenenberger C.A., Höh J.H. Relative microelastic mapping of living cells by atomic force microscopy // Biophys J. — 1998. —V. 74. — p. 1564—1578.

72. Hauck T.S., Anderson-R.E., Fischer H.C., Newbigging S., Chan W.C.W. In vivo quantum-dot toxicity assessment // Small. — 2010: — V. 6. — p. 138-144.

73. Henderson R.M., Oberleithner H. Pushing, pulling, dragging, and vibrating renal epithelia by using atomic force microscopy // Am J Physiol Renal Physiol: 2000. -V. 27.8. - p. F689-F701.

74. Hoet P.H.M1. Nanoparticles-knew and unknew risks of health // Nanobiotechnology. 2004. - V. 2. - p. 1-12.

75. Hohng S., Ha T. Near-complete suppression of quantumidot blinking in ambient conditions,// J-. Am. Chem. Soc. 2004'. - V. 126. - p: 1324!-1325>.

76. Holzapfel V., Musyanovych A., Landfester K., Lorenz M.R., MailänderI

77. V. Preparation of fluorescent carboxyl and amino functionalized polystyrene particles by miniemulsion^ polymerization as markers for cells // Macromol. Chem. Phys. -2005. V. 206. - p. 2440-2449.

78. Hoshino A., Fujioka K., Oku T., Nakamura S., Suga M., Yamaguchi Y., Suzuki K., Yasuhara M., Yamamoto K. Quantum dots targeted to the assigned organelle in living cells// Microbiology. Immunology. 2004. — V. 48. - p. 985-994.

79. Hoshino A., Suzuki K., Yamamoto K. Applications of T-lymphoma labeled with fluorescent quantum dots to cell tracing markers in mouse body // Biochem. Biophys Res Commun. 2004. - V. 314. - p. 46-53.

80. Ipe B.I., Lehnig M., Niemeyer C.M. On the generation of free radical species from quantum dots // Small. — 2005. —V. 1. — p. 706-709.

81. Jain T.K., Reddy M.K., Morales M.A., Leslie-Pelecky D.L., Labhasetwar V. Biodistribution, clearance, and biocompatibility of iron oxide magnetic nanoparticles in rats // Mol. Pharm. — 2008. — V. 5. p. 316-327.

82. Jaiswal J.K., Mattoussi H., Mauro J.M., Simon S.M. Long-term multiple color imaging of live cells using quantum dot bioconjugates // Nat. Biotechnol. — 2003.-V. 21.-p. 47-51.

83. Jiang W., Kim B.Y.S., Rutka J.T., Chan W.C.W. Nanoparticle-mediated cellular response is size-dependent // Nature Nanotechnology. — 2008. — V. 3. — p. 145-150.

84. Johannes L., Lamaze C. Clatrin-dependent or not: Is it still the question? // Traffic. 2002. - V. 3. - p. 443-451.

85. De Jong W.H., Hagens W.I., Krystek P., Burger M.C., Sips A.J., Geertsma R.E. Particle size-dependent organ distribution of gold nanoparticles after intravenous administration // Biomaterials. 2008. — V. 29. — p. 1912-1919.

86. Klingauf J. Synaptic vesicle dynamics sans dynamin // Neuron. 2007. -V. 54.-p. 857-858.

87. Klionsky D.J., Cuervo A.M., Seglen P.O. Methods for monitoring autophagy from yeast to human // Autophagy. — 2007. — n. 3. — p. 181-206.

88. Koeneman» B.A., Zhang Y., Westerhoff P., Chen Y., Crittenden J.C., Capco D.G. Toxicity and cellular, responses of intestinal cells exposed to titaniumf dioxide // Cell biology and toxicology. 2010. - V. 26. - p. 225-238.

89. Kozlow M.M. Dynamin: possible mechanism of «Pinchase» action // Biophys. J. 1999.-M. 77.-p. 604-616.

90. Krolenko S.A., Adamian S.I., Lucy J.A'. Functional role of vacuolization of the T-system of skeletal muscle fibers // Tsitologiia 1997. - V.39. - p. 878-888.

91. Lajoie P., NabiT.R. Regulationof raft-dependent endocytosis // J. Cell. Mol. Med. 2007. - V. 11. - p. 644-653.

92. Lajoie P., Nabi I.R. Review lipid rafts, caveolae, and their endocytosis // Cell-Mol. Biolt -2010. — V. 282. p: 135-163.

93. Lahtinen U., Hoshino M., Parton R.G., Simons K., Verkade P.1.volvement of caveolin-2 in caveolar biogenesis in MDCK cells // FEBS Lett. I2003.-V. 538.-p. 85-88.

94. Lamaze C., Dujeancourt A., Baba T., Lo C.G., Benmerah A., Dautry-Varsat A. Interleukin 2 receptors and detergent-resistant membrane domains define a clathrin-independent endocytic pathway // Mol. Cell. 2001. - V. 7. — p. 661-671.

95. Leatherdale C!A., Woo W.K., Mikulec F.V., Bawendi M.G. On the absorption cross section of CdSe nanociystal quantum dots // Journal of Physical Chemistry B. -2002. -V. 106.-p. 7619-7622.

96. Lenz M., Prost J., Joanny J.F. Mechanochemical action of the dynamin protein // Phys. Rev. E. Stat. Nonlin. Soft Matter Phys. 2008. - v. 78. - p. 1-16.

97. Levine B., Yuan J. Autophagy in cell death: an innocent convict? // J. Clin. Invest -2005. -V. 115. p. 2679-2688.

98. Lim Y.T., Kim S., Nakayama A:, Stott N.E., Bawendi M.G., Frangioni J.V. Selection of quantum dot wavelengths for biomedical assays and imaging // Mol. Imaging. 2003. - V. 2. - p. 50-64.

99. Liu Y., Zhang S.P., Cai Y.Q. Cytoprotective effects of selenium on cadmium-induced LLC-PK1 cells apoptosis by activating JNK pathway // Toxicol, in vitro. 2007. - V. 21. - p. 677-684.

100. Llorente A., Rapak A., Schmid S.L., van Deurs B., Sandvig K.i

101. Expression of mutant dynamin inhibits toxicity and .transport of endocytosed ricin to the Golgi apparatus // J.Cell Biol. 1998. - V. 140. - p. 553-563.

102. Lovric J., Bazzi H.S., Cuie Y., Fortin G.R.A., Winnik F.M., Maysinger

103. D. Differences in subcellular distribution and toxicity of green and red emitting CdTe /quantum dots// Journal of Molecular Medicine. 2005. - V. 83 - p. 377-385.

104. Lovric J., Cho S.J., Winnik F.M., Maysinger D. Unmodified cadmium telluride1 quantum dots induce reactive oxygen species formation leading to multiple organelle damage and cell death // Chemistry and biology. — 2005. V. 12. - p. 12271234.

105. Lu Z., Li C.M., Bao H., Qiao Y., Toh Y., Yang X. Mechanism of antimicrobial! activity of CdTe quantum dots. // Langmuir. 2008. - V. 24. — p. 54455452.

106. Mahto S.K., Yoon T.H., Rhee S.W. Cytotoxic effects of surface-modified quantum dots on neuron-like PC 12 cells cultured inside microfluidic devices // Biochip Journal. 2010. - V. 4. - p. 82-88.

107. Mancini M.C., Kairdolf B.A., Smith A.M., Nie S. Oxidative quenching and degradation of polymer-encapsulated quantum dots: new insights into the long-term fate and toxicity of nanocrystals in vivo // J Am Chem Soc. 2008. — V. 130. -p. 10836-10837.

108. Maxfield F.R., McGraw T.E. Endocytic recycling // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004. - V. 5. - p. 121-132.

109. May R.C., Machesky L.M. Phagocytosis and the actin cytoskeleton // J Cell Sci —2001. —V. 114. — p. 1061-1077.

110. Medina C., Santos-Martinez M.J., Radomski A., Corrigan O.I., Radomski M.W. Nanoparticlees: pharmacological and toxicological significance // British Jornal of Pharmocology. 2007. - V. 150. - p. 552-558.

111. Medintz I.L., Uyeda H.T., Goldman E.R., Mattoussi H.Quantum dot bioconjugates for imaging, labelling and sensing // Nature Materials. — 2005. — V. 4. -p. 435-446.

112. Mercer J., Helenius A. Virus entry by macropinocytosis // Nature cell biology. 2009. - V. 11. - p. 510-520.

113. Merwe D., Brooks J.D., Gehring R., Baynes R.E., Monteiro-Riviere N.A., Riviere J.E. A physiologically based pharmacokinetic model of organophosphate dermal absorption // Toxicol. Sci. — 2006. — V. 89. p. 188-204.

114. Michalet X., Pinaud F.F., Bentolila L.A., Tsay J.M., Doose S., Li J.J., Sundaresan G., Wu A.M., Gambhir S.S., Weiss S. Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics // Science. 2005. - V. 307. - p. 538-544.

115. Mohs A.M., Duan H., Kairdolf B.A., Smith A.M., Nie S. Proton-resistant quantum dots: stability in gastrointestinal fluids and implications for oral delivery of nanoparticle agents // Nano Res. 2009. - V. 2. — p. 500-508.

116. Monteiro-Riviere N.A. Chapter 4: Anatomical factors that affect barrier function. In: Zhai H., Maibach H.I. // Dermatology. New York: CRC Press . 2008. -p. 43-69.

117. Mortensen L.J., Oberdorster G., Pentland A.P., DeLouise L.A. In vivo skin penetration of quantum dot nanoparticles in the murine model: the effect of UVR // Nano Lett. 2008. - V. 8. - p. 2779-2787.

118. Mousavi S.A., Malerad L., Berg T., Kjeken R. Clathrin-dependent endocytosis // Biochem. J. 2004. - V. 377. - p. 1-16.

119. Myers J.N., Tabas I., Jones N.L., Maxfield F.R. Beta-very low density lipoprotein is sequestered in surface-connected tubules in mouse peritoneal macrophages//J Cell Biol.-1993.-V. 123.-p. 1389-1402.

120. Nel A., Xia T., Madler L., Li N. Toxic potential of materials at the nanolevel // Science. 2006. - V. 311. - p. 622-627.

121. Nel A.E., Madler L., Velegol D., Xia T., Hoek E.M.V., Somasundaran P., Klaessig F., Castranova V., Thompson M. Understanding biophysicochemical interactions at the nano-bio interface // Nat. Mater. — 20091 — V. 8. — p. 543-557.

122. Nemmar A., Hoet P.H.M., Vanquickenborne B., Dinsdale D., Thomeer M., Hoylaerts M.F., Vanbilloen H., Mortelmans L., Nemery B. Passage of inhaled particles-into the blood circulation in humans // Circulation. — 2002. — V. 105. — p. 411-414.

123. Nichols B. Caveosomes and endocytosis of lipid rafts // J. Cell Sci. -2003. V. 116. - P. 4707-4714.

124. Nguyen K., Seligy V., Rippstein P., Tayabali A. Cadmium Telluride quantum dot nanoparticles cause oxidative stress and apoptosis in mammalian cells // European Cells and Materials. 2010. — V. 20. — p. 187.

125. Oberdorster G., Oberdorster E., Oberdorster J. Nanotoxicology: an emerging discipline evolving from studies of utrafine particles // Environ Health Perspect. 2005. - V. 113. - p. 823-839.

126. Pari L., Murugavel P., Sitasawad S.L., Kumar K.S. Cytoprotective and antioxidant role of diallyl tetrasulfide on cadmium induced renal injury: an in vivo and in vitro study // Life Sci. 2007. - V. 80. - p. 650-658.

127. Parton R.G., Richards A.A. Lipid rafts and caveolae as portals for endocytosis: new insights and common mechanisms // Traffic. — 2003. — V. 4. — p. 724-738.

128. Pelkmans L., Puntener D., Helenius A. Local actin-polymerization and dynamin recruitment in SV40-induced internalization of caveolae // Science. — 2002. -V. 296.-p. 535-539.

129. Pison U., Welte T., Giersig M., Groneberg D.A. Nanomedicine for respiratory- diseases // Eur. J. Pharm. — 2006. — V. 533. p. 341-350.

130. Pujalte I., Passagne I., Brouillaud B., Treguer M., Durand E., Ohayon-Courtes G., L'Azou B. Cytotoxicity and oxidative stress induced by different metallic nanoparticles on human-kidney cells // Particle and Fibre Toxicology. — 2011. — V. 8 -p. 1-16.

131. Ramachandran R. Vesicle scission: dynamin // Seminars in cell & developmental biology. -2011. -V. 22. -p: 10-17.

132. Rejman J., Oberle V., Zuhorn I.S., Hoekstra D. Size-dependent internalization of particles via pathways of clatrin- and caveolae-mediated endocytosis // Biochem. J. 2004. - V. 377. - p. 159-169.

133. Robe A., Pic E., Lassalle H.P., Bezdetnaya L., Guillemin F., Marchai F. Quantum dots in axillary lymph node mapping: biodistribution: study in healthy mice //BMC Cancer. 2008. - V. 8,-p. 111.

134. Romoser A.A., Chen P.L., Berg J.M., Seabury C., Ivanov I., Criscitiello M.F., Sayes C.Mi Quantum dots trigger immunomodulation of the NFkB pathway in human skin cells. //Mol Immunol. -2011.-V. 48.-p. 1349-1359.

135. Ryman-Rasmussen-J., Riviere J.E., Monteiro-Riviere N.A. Penetration of intact skin by quantum dots with diverse physicochemical properties // Toxicol. Sci. — 2006. V. 91. - p. 159-165.

136. Ryman-Rasmussen J.P., Rivière JiE., Monteiro-Riviere Surface coatings determine cytotoxicity and irritation potential of quantum dot nanoparticlcs in epidermal keratinocytes // Journal of Investigative Dermatology. 2007. - V. 127. -p. 143-153.

137. Sansonetti P.J:, Tran Van Nhieu G., Egile : C. Rupture of the intestinal epithelial barrier and mucosal invasion by Shigella, flexneri II. Clin. Infect. Dis. 1999. V. 28.-p. 466-475.

138. Schneider M., Stracke F., Hansen S., Schaefer U.F. Nanoparticles and their interactions with the dermal barrier // Dermatoendocrinol. — 2009. — V. 1. — p. 197-206.

139. Seglen, P.O. Inhibitors of lysosomal function // Methods Enzymol. -1983.-V. 96.-p. 737-764.

140. Shan Y., Hao X., Shang X., Cai M., Jiang J., Tang Z., Wang H. Recording force events of single quantum dot endocytosis // Chem. Commun. 2011. -V. 47.-p. 3377-3379.

141. Shin J.S., Gao Z., Abraham S.N. Involvement of cellular caveolae in bacterial entry into mast cells // Science. 2000. - V. 289. - p. 785-788.

142. Shiohara A., Hoshino A., Hanaki K., Suzuki K., Yamamoto K. On the cyto-toxicity caused by quantum dots// Microbiol. Immunol. — 2004. — V. 48. p. 669-674.

143. Sieczkarski, S.B., Whittaker, G.R. Dissecting virus entry via endocytosis // J. Gen. Virol. 2002. - V. 83. - p. 1535-1545.

144. Stern S.T., Zolnik B.S., McLeland C.B., Clogston J., ZhengJ., McNeil S.E. Induction of autophagy in porcine kidney cells by quantum dots: a common cellular response to nanomaterials,// Toxicological'Sciences. — 2008. — V. 106. p. 140-152.

145. Stuart, A.D., Brown, T.D. Entry of feline calicivirus is dependent on clathrin-mediated endocytosis and acidification in endosomes // J. Virol. — 2006. V. 80.-p. 7500-7509.

146. Swanson J.A., Watts C. Macropinocytosis //Trends cell biology. — 1995. -V. 1-p. 424-428.

147. Szentkuti L. Light microscopical observations on luminally administered dyes, dextrans, nanospheres and microspheres in the pre-epithelial mucus gel layer of the rat distal colon // J. Control Release. 1997. - V. 46. - p. 233-242.

148. Way M:, Parton R.G. M-caveolin, a muscle-specific caveolin-related protein // FEBS Lett. 1995. - V. 376. - p. 108-112.

149. Yoshimori T. Autophagy: a regulated bulk degradation process inside cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. - V. 313. - p. 453-458.

150. Yu X., Chen L., Li K., Li Y., Xiao S., Luo X., Liu J., Zhou L., Deng Y.,

151. Pang D., Wang Q. Immunofluorescence detection with quantum dot bioconjugatestfor hepatoma in vivo // J. Biomed. Opt. 2007. - V. 12. - p. 014008 (1,-5).

152. Zabirnyk O., Yezhelyev M., Seleverstov O. Nanoparticles as a novel class of autophagy activators // Autophagy. 2007. - V. 3. - p. 278-281.

153. Zhang L.W., Monteiro-Riviere N.A. Assessment of quantum dot penetration into intact, tape-stripped, abraded and flexed rat skin // Skin Pharmacology and Physiology. 2008. - V. 21. - p. 166-180.

154. Zhang L.W., Monteiro-Riviere N.A. Mechanisms of quantum dot nanoparticle cellular uptake // Toxicol. Sci. 2009. - V. 110. - p. 138-155.

155. Zhang L.W., Yu W.W., Colvin V.L., Monteiro-Riviere N.A. Biological interactions of quantum dot nanoparticles in skin and in human epidermal keratinocytes // Toxicology and Applied Pharmacology. — 2008. — V. 228. — p. 200211.

Информация о работе

Михеева, Эльза Равилевна
кандидата биологических наук
Нижний Новгород, 2011
ВАК 03.03.01

Диссертация

Морфофункциональная и биохимическая альтерация клеток крови квантовыми точками - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Морфофункциональная и биохимическая альтерация клеток крови квантовыми точками ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Морфофункциональная и биохимическая альтерация клеток крови квантовыми точками"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Михеева, Эльза Равилевна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Морфофункциональная и биохимическая альтерация клеток крови квантовыми точками"

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Михеева, Эльза Равилевна

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Михеева, Эльза Равилевна, Нижний Новгород

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Морфофункциональная и биохимическая альтерация клеток крови квантовыми точками
ВАК РФ 03.03.01, Физиология