Морфофункциональный статус нейтрофилов при взаимодействии с наноразмерными флюорофорами

Горшкова, Екатерина Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Морфофункциональный статус нейтрофилов при взаимодействии с наноразмерными флюорофорами
ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Морфофункциональный статус нейтрофилов при взаимодействии с наноразмерными флюорофорами"

На правах рукописи

Горшкова Екатерина Николаевна

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ СТАТУС НЕЙТРОФИЛОВ ПРИ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С НАНОРАЗМЕРНЫМИ ФЛЮОРОФОРАМИ

Специальность: 03.03.01 - Физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 6 ОКТ 2014

Ульяновск - 2014

005553489

Работа выполнена в ФГАОУ ВО «Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского» на кафедре молекулярной биологии и иммунологии и в научно-образовательном центре «Физика твердотельных наноструктур».

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, доцент Плескова Светлана Николаевна

Малиновская Светлана Львовна

доктор биологических наук, профессор, государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Нижегородская государственная медицинская академия», профессор кафедры медицинской физики и информатики

Копытова Татьяна Викторовна

доктор биологических наук, зав. лабораторным центром Нижегородского филиала федерального

государственного бюджетного учреждения

«Государсвенный научный центр дерматовенерологии и косметологии» Минздрава России

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего

профессионального образования «Башкирский государственный университет», г. Уфа

Защита состоится «14» ноября 2014 г. в 12.00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.278.07 при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ульяновский государственный университет» по адресу: г. Ульяновск, ул. Набережная реки Свияги, 106, корп.1, ауд.703.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке Ульяновского государственного университета, на сайте ВУЗа - http://ppo.ulsu.ru и на сайте Высшей аттестационной комиссии при Министерстве образования и науки Российской Федерации - http://vak.ed.gov.ru.

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 432017, г. Ульяновск, ул. Л. Толстого, 42, Ульяновский государственный университет, Отдел послевузовского и профессионального образования.

Автореферат разослан ууО^^л^Л^А 20 /^г/О

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент

С. В. Пантелеев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. В исследованиях адаптационных резервов организма человека в ответ на воздействие факторов окружающей среды большое внимание уделяется системе неспецифической резистентности. Одним из основных клеточных эффекторов системы неспецифической резистентности являются нейтрофильные гранулоциты (Ярилин A.A., 2010). В последнее время они подвергаются атаке новых видов ксенобиотиков поскольку постоянно синтезируются новые разновидности наноматериалов. Исследование гомеостатических реакций нейтрофилов в ответ на наночастицы является принципиальной задачей. Антропогенная нагрузка может изменять стандартные реакции клеток. Вместе с тем, ослабление реактивности нейтрофилов снижает резистентность организма к инфекционным агентам (Ашкинази В.И., 1998). Активная секреторная и медиаторная деятельность нейтрофилов способствует реализации цитолитического и цитотоксического действия в отношении опухолей (Абакумова Т.В., 2009). Кроме того, нейтрофильные гранулоциты являются активной категорией клеток, которая служит чувствительным индикатором нарушений гомеостаза (Маянский А.Н., Пикуза О.И., 1993). Поэтому необходимо проводить всестороннее исследование функциональных и структурно-морфологических перестроек клетки для определения физиологического резерва нейтрофилов в условиях присоединения к стандартным гомеостатическим реакциям необходимости отвечать на воздействие ксенобиотиков нового вида.

Установлено, что большинство известных к настоящему времени наноматериалов вызывают срыв гомеостатических реакций и гибель как единичных клеток, так и целых организмов (Lam H.W. и соавт., 2006; Choi H.S. и соавт., 2010; Sohaebuddin S.K. и соавт., 2010). Однако, выявляя интегральный токсический эффект авторы редко фокусируются на оценке функционального резерва единичных клеточных структур. Вместе с тем, задача дифференцирования отдельных, критичных для сохранения жизнеспособности нейтрофила мишеней, как и комплексная оценка нарушения гомеостаза клетки, несомненно, является важной для понимания механизмов взаимодействия нейтрофилов и наноматериалов.

При выявлении токсического действия наноматериалов принципиальным является вопрос о вариантах клеточной гибели. В частности, у нейтрофилов обнаружены как классические пути клеточной гибели: некроз, апоптоз, аутофагия (Манских В.Н., 2007), так и относительно новые, ранее не известные варианты: NETo3 (neutrophil extracellular traps) (Remijsen Q. и соавт., 2011) и окситоз (Tan S. и соавт., 2001). Механизм гибели нейтрофильного гранулоцита в процессе взаимодействия с наноматериалами принципиален как для целостности окружающих тканей, так и для поддержания гомеостаза организма в целом (Маянский H.A., 2001). Использование полиморфноядерных лейкоцитов для определения вариантов клеточной гибели прежде всего обусловлено природой этих клеток с их высокой степенью дифференцировки и настроенностью на быструю гибель (Homburg С., Roos D., 1996).

Наряду с фундаментальными проблемами исследования границ резистентности клеток в ответ на новую антропогенную нагрузку и изучения

вариантов клеточной гибели, происходящих в результате такого взаимодействия, важным направлением является решение практических вопросов. В частности, важно разрабатывать флуоресцентные наночастицы (НЧ) с нетоксичными и биодеградируемыми свойствами. Одним из вариантов таких наноматериалов являются апконверсионные наночастицы (АК-НЧ). Они создаются на основе биогенных матриц, легированных редкоземельными элементами для обеспечения эффекта флюоресценции. Такие НЧ могут применяться как в качестве меток для исследования интрацеллюлярных метаболических путей, так и для диагностических и лечебных целей в медицинской практике (Lei Y.A. и соавт., 2011).

Однако физиологический эффект от воздействия такого рода наноматериалов изучен мало. Существуют литературные данные, подтверждающие, что АК-НЧ демонстрируют высокую биосовместимость и низкую цитотоксичность в отношении ряда клеточных линий (Yang J. и соавт., 2010, Zhou J. и соавт. 2010, Wangl К. и соавт., 2013). Но о механизмах их взаимодействия с клетками крови практически ничего не известно.

Таким образом, изучение феноменологии и механизмов взаимодействия нейтрофилов с новыми классами наноматериалов позволит определить основной комплекс субклеточных структур, участвующих в поддержании гомеостаза клеток, в условиях новой антропогенной нагрузки, выявить варианты клеточной гибели, возникающие при срыве гомеостатических реакций. Прикладным аспектом такого исследования является поиск наноматериалов, которые обладают как клинической, так и экологической безопасностью.

Цель работы: исследовать реакции нейтрофильных гранулоцитов на наноразмерные флюорофоры и оценить адаптивные возможности клеток в процессе такого взаимодействия.

Задачи исследования:

1. Определить жизнеспособность нейтрофильных гранулоцитов под влиянием разных видов апконверсионных наночастиц и сравнить медиальные летальные дозы для наноматериалов разного состава. Выявить основные варианты клеточной гибели.

2. Исследовать структурно-морфологические и биохимические перестройки нейтрофилов в процессе взаимодействия с наноразмерными флюорофорами.

3. Оценить адаптивные возможности кислородзависимого и кислороднезависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов, а также резистентность реакций СЗЪ-зависимой адгезии клеток к воздействию апконверсионных наночастиц.

4. Выявить кондиционирующие особенности опсонизации компонентами сыворотки крови на взаимодействие в системе «нейтрофильный гранулоцит -апконверсионные наночастицы».

5. Сравнить упругость мембрано-цитоскелетного комплекса интактных нейтрофилов и нейтрофилов, подвергшихся воздействию наноматериалов.

Научная новизна работы. Впервые изучено влияние апконверсионных наночастиц разного состава на жизнеспособность нейтрофильных гранулоцитов и проанализированы последствия воздействия на процессы внутриклеточного метаболизма. Установлено, что резистентность клеток в отношении наночастиц в биогенной матрице витлокита является высокой, т.е. они более безопасны для нейтрофилов, тогда как матрицы на основе фторидов подавляют их гомеостатические реакции и вызывают гибель клеток по механизму некроза.

Впервые выявлено, что инкубация нейтрофилов с апконверсионными наночастицами приводит к подавлению эффекторного потенциала клеток. Методом высокоразрешающей атомно-силовой микроскопии изучена динамика взаимодействия нейтрофилов с апконверсионными наночастицами. Продемонстрировано, что под их влиянием происходит снижение упругости мембрано-цитоскелетного комплекса, а опсонизация снижает токсический эффект, что отражается в сохранении нормальной морфологии и упругости клеток.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные в работе результаты дополняют имеющиеся научные данные о влиянии наноматериалов на клеточном уровне организации живой материи, в том числе раскрывают особенности взаимодействия в системе «нейтрофилы - наноматериалы», в зависимости от строения матрицы и химического состава наночастиц. Полученные данные объясняют реакции неспецифической резистентности организма на ксенобиотики нового типа, раскрывая механизмы клеточного (нейтрофильные гранулоциты) и гуморального (сыворотка крови) ответа. Результаты, полученные при исследовании взаимодействия нейтрофилов с апконверсионными наночастицами, могут быть использованы для дальнейшей адаптации этих материалов и их практического применения, в том числе в системах in vivo. Например, при выборе состава, структуры и покрытия апконверсионных наночастиц, а также концентрации и способа введения в организм в диагностических и лечебных целях. Полученные результаты позволили дополнить курсы «Физиология животных», «Физиология человека» и «Биомедицинские нанотехнологии».

Положения, выносимые на защиту:

1. При взаимодействии нейтрофилов с апконверсионными наночастицами на основе фторидной матрицы происходят необратимые изменения в клеточной структуре, биохимическом статусе и метаболизме, приводящие к подавлению эффекторного потенциала и гибели клеток.

2. Сывороточные белки обладают протективным действием и снижают степень альтерирующего влияния апконверсионных наночастиц, что выражается в сохранении морфологических параметров нейтрофилов и упругости мембрано-цитоскелетного комплекса.

3. Апконверсионные наночастицы на основе фторидных матриц и фосфата кальция по-разному влияют на жизнеспособность нейтрофилов, тогда как соотношение лантаноидов в составе наночастиц не влияет на степень токсичности.

Апробация работы. Основные положения работы были доложены и обсуждены на XIV, XVI, XVII международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (г. Пущино, 2010, 2012, 2013) на XV, XVI, XVII сессии молодых

ученых (г. Нижний Новгород, 2010, 2011, 2012), на 1-ой международной научной школе «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах» (г. Москва, 2009), на XVII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010» (г. Москва, 2010), на III и IV международной конференции «AFM BioMed» (Red Island, Хорватия, 2010 и Париж, Франция, 2011, Китай, 2013), на международной конференции «Neuroplasticity: nervous substrate for health and disorder» (г. Тбилиси, Грузия, 2010, 2012), на III Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010» (г. Нижний Новгород, 2010), на XVII Российском симпозиуме по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел «РЭМ-2011» (г. Черноголовка, 2011), на V международной конференции «Современные достижения бионаноскопии» (Москва, 2011), на IV съезде биофизиков России (г. Нижний Новгород, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 41 научная работа, из них 5 - в изданиях, рекомендованных ВАК.

Личный вклад автора. Соискателем лично разработана программа исследований, сформулирован план проведения исследований, производилась подготовка и анализ материалов и объектов исследования, сделаны теоретические обобщения полученных экспериментальных данных.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 117 страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы, содержит 22 рисунка и 8 таблиц. Список литературы включает 214 источников, из которых 170 на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования являлись нейтрофильные гранулоциты, выделенные из венозной крови 86 здоровых доноров.

В работе использовались наноразмерные флуорофоры двух видов:

1. Наночастицы на основе фторидных соединений F3:Er/Yb (синтезированы в НИФТИ ННГУ им. Н.И. Лобачевского). Состоят из порошкообразной матрицы на основе стеклокерамики преимущественно фторидных или фторидногаллатных стекол, легированных фторидами редкоземельных элементов: иттербия в качестве сенсибилизатора и эрбия - активатора (Патент РФ №2174173). Пики флуоресценции - 525, 553 и 672 нм при возбуждении в ИК-диапазоне (полупроводниковый лазер, работающий в импульсном режиме, X =977 нм). Размер частиц - 82,2 ±21,8 нм.

2. Наночастицы, полученные из фосфатов со структурой биогенного минерала витлокита, на основе соединения ß-Ca3(P04)2 и лантаноидов Er и Yb в разных соотношениях (синтезированы на химическом факультете ННГУ им. Н.И. Лобачевского под руководством д.х.н., проф. Орловой А.И.):

а) ß-Ca3(PO4)2:Er3+,Yb3+(Er/Yb=0,17). Химическая формула соединения имеет вид CagEro.HBiYbo.sse^PO^T, размер частиц 57,1±17,9 нм.

б) ß-Ca3(P04b:Er3+,Yb3+ (Er/Yb=0,l). Химическая формула соединения имеет вид Ca9Ero.o909Ybo.909i(P04)7, размер частиц 83,3±21,9 нм. Для обоих флюорофоров

характерны пики флуоресценции Х= 525, 550, 650 нм при накачке полупроводниковым лазером на длине волны X = 977 нм.

Нейтрофилы выделяли по методу И.С. Подосинникова и соавт. (1981) из венозной крови здоровых доноров. Суспензию наночастиц помещали в УЗ-ванну (Рэлтек, Москва), после чего разводили до необходимой концентрации. Затем вносили в культуру нейтрофилов и инкубировали (37°, 30 мин). Для опсонизации наночастиц использовали сыворотку, выделенную из венозной крови.

Жизнеспособность клеток оценивали с помощью постмортального красителя пропидиума йодида (PI). Суспензию клеток в растворе Хенкса, проинкубированных с наночастицами, фиксировали в чашках Петри 70% этиловым спиртом, затем отмывали и окрашивали 0,025% раствором PI («Sigma», США). Возбуждение флуоресценции PI осуществляли галогенной лампой (100 Вт), свечение регистрировали с использованием светофильтра Olympus U-MNG2 на оптическом микроскопе Olympus 1X71 (Olympus, Япония). Определяли процент окрашенных (погибших) клеток. Медиальную летальную дозу (LD5o) вычисляли с помощью модели бинарного выбора - пробит-регрессии (Ллойд Э. и соавт., 1989) и метода экстраполяции кривой. Все математические преобразования и подсчеты производили с использованием программы Statistica 8 (StatSoft, USA).

Для всех последующих экспериментов по определению физиологического и биохимического статуса использовали суспензию нейтрофилов (106 клеток/мл) и НЧ в концентрации 8,25Т0~5мМ и 1-10"3мМ.

Кислородзависимую активность нейтрофилов определяли по реакции восстановления нитросинего тетразолия в спонтанном и стимулированном НСТ-тесте (Виксман М.Е., Маянский А.Н., 1979). Также по результатам рассчитывали индекс стимуляции и функциональный резерв нейтрофилов (Щербаков В.И., 1989).

Исследование активности миелопероксидазы нейтрофилов проводили цитохимическим методом с использованием набора реагентов для определения пероксидазы в лейкоцитах «Диахим-цитостейн-МПО» (НПФ «АБРИС+», Россия). Тест основан на реакции окисления бензидина, в результате которой образуются интенсивно окрашенное соединение - оксибензидин.

Для исследования активности кислой фосфатазы использовали цитохимический метод, предложенный Burstone C.J. и соавт. (1958), основанный на гидролизе органических эфиров фосфорной кислоты. Активность щелочной фосфатазы определяли с помощью метода азосочетания по Rutenburg и соавт. (1965). В каждом мазке подсчитывали 100 клеток. Результат выражали в виде СЦК.

Определение количества гликогена проводили с использованием PAS-реакции, основанной на окислении йодной кислотой гликолевых групп, или их. амино- или алкиламино- производных до альдегидов, которые при взаимодействии с реактивом Шиффа образуют продукт красного цвета. Внутриклеточное содержание гликогена в нейтрофилах, проинкубированных в физиологическом растворе в пристутсвии наночастиц, оценивали с использованием среднего цитохимического коэффициента (СЦК).

Лизосомально-катионный тест проводили по методу В.Е. Пигаревского (1987), который основан на избирательном окрашивании катионных белков гранулоцитов буферным раствором прочного зеленого. Внутриклеточное

содержание катионных белков гранулоцитов оценивали по величине среднего цитохимического коэффициента (СЦК).

Исследование способности нейтрофилов к СЗЬ-зависимой адгезии проводили по методу А.Н. Маянского и соавт. (1991). Результаты оценивались по количеству гранул сефадекса, связавших 3 или более нейтрофилов.

Исследование нейтрофилов с помощью атомно-силового микроскопа (АСМ) в режиме реального времени проводили по методу С.Н. Плесковой и соавт. (2005). Нейтрофилы инкубировали в чашках Петри (Coning, США) при 2224° С, 10-15 мин. За это время происходила спонтанная адгезия клеток к подложке. Изучение поверхности клеток проводили в физиологическом растворе на установке SOLVER BIO™ (NT-MDT, Зеленоград). Нейтрофилы исследовали в витальном состоянии с использованием полуконтактного режима сканирования зондом DNP (Bruker, США) с жесткостью 0,58 Н/м, либо 0,32 Н/м, радиусом закругления 50 нм, углом при вершине 70° и резонансными частотами в жидкости около 14 кГц.

Для оценки упругости использовали метод FS-спектроскопии. Упругость мембрано-цитоскелетного комплекса оценивалась по модулю Юнга (Bukharaev A.A. и соавт., 2003). В используемой модели рассматривается взаимодействие двух упругих полусфер, одна из которых имеет условно бесконечно малый диаметр (зонд), а другая условно бесконечно большой (клетка). Упругость определялась по степени отклонения кантилевера, на котором закреплен зонд, и регистрировалась системой как сигнал рассогласования на четырехсекционном фотодиоде. Значения тока рассогласования при взаимодействии с твердой подложкой (калибровка) и с мембраной клетки (опыт) обсчитывали по модели Герца. После инкубации (30 мин, 37°С) проводили 20 измерений на каждой клетке.

Для оценки достоверности различий между двумя выборками использовали критерий Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при р<0,05. Статистический анализ проводили с использованием лицензионного программного обеспечения Origin 7.0 SRO (OriginLab Corparation, США) и Statistica 8 (StatSoft, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ Изучение влияния АК-НЧ на жизнеспособность нейтрофилов и определение медиальных летальных доз (LD50)

Инкубация нейтрофилов с тремя видами АК-НЧ (F^Er/Yb, ß-Ca3(P04)2:Er3+,Yb3+ (Er/Yb=0,17) и ß-Ca3(P04)2:Er3+,Yb3+ (Er/Yb=0,l)) в большой концентрации (5-10"3 М) привела к тому, что уже после 30 мин наблюдалась 100% гибель клеток. На основании результатов взаимодействия нейтрофилов с АК-НЧ были построены графики зависимости жизнеспособности клеток от концентрации АК-НЧ при инкубации (30 мин, 37° С) (Рис. 1-3).

Поскольку LD5o является одним из основных показателей токсичности, для изучаемых АК-НЧ были найдены концентрации, вызывавшие 50% гибель клеток (Таблица 1). Для этого был использован метод пробит-анализа и метод экстраполяции кривой.

Рис. 1. График зависимости количества погибших нейтрофилов от концентрации наночастиц вида Г,:Ег/УЬ при инкубации (30 мин, 37° С)

т1(, 2.86- ю*1 м

Рис. 2. График зависимости количества погибших нейтрофилов от концентрации наночастиц вида Р-Са3(Р04)2:Ег3+,¥Ь',+(Ег/УЬ=0,17) при инкубации (30 мин, 37° С)

Эти результаты демонстрируют, что для всех трёх видов АК-НЧ значения ЬЭ50 отличаются, и наиболее токсичными являются АК-НЧ на основе фторидной матрицы, при этом АК-НЧ на основе биогенного минерала витлокита не вызывают срыва гомеостатических реакций и гибели клеток даже в высоких концентрациях. Причем соотношение флюорофоров в составе биогенной матрицы существенно не отражается на этом показателе.

Таблица 1

Медиальные летальные дозы (LD50) для разных видов апконверсионных наночастиц

Тип АК-НЧ F3:Er/Yb ß-Ca3(P04)2:Er3+,Yb3+ (Er/Yb=0,17) ß-Ca3(P04)2:Er3+,Yb3+ (Er/Yb=0,1)

LD50 (М), пробит-анализ 7,68-106 3,31 -10"4 3,25-104

LD50 (М), экстраполяция кривой 5,75-10 6 2,86-10^ 1,25-10"4

Наблюдалось поглощение АК-НЧ нейтрофильными гранулоцитами, о чем свидетельствовало наличие локальных внутриклеточных включений. Все три вида исследованных АК-НЧ вызывали изменения в морфологии нейтрофилов. Для нейтрофилов, проинкубированных с АК-НЧ вида Р3:Ег/УЬ, был зафиксирован эффект блеббинга, описанный ранее С.Н. Плесковой (2009) (Рис.4).

t , Ч /

■ у

5 мкм

Рис. 4. Нейтрофилы после инкубаиии (30 мин, 37° С) с АК-НЧ вида F3:Er/Yb (8,25-10 7М). Эффект блеббинга цитоплазматической мембраны, сопровождающий гибель нейтрофилов по механизму некроза. Изображение получено с использованием оптического микроскопа Olympus 1X71, увеличение х60

Вероятно, это связано с активацией процесса окислительного стресса, который является характерным механизмом токсического воздействия НЧ на клетку (Brown и соавт., 2001; Li и соавт., 2003). Некроз, сопровождающийся блеббингом, обусловлен, прежде всего, альтерацией цитоскелета, связанной с повреждением и перераспределением F-актина (Hinshaw и соавт., 1986). Доказательство альтерации цитоскелета будет приведено ниже: оно получено при исследовании ригидности мембрано-цитоскелетного комплекса.

Для нейтрофилов, проинкубированных с АК-НЧ вида ß-Ca3(P04)2:Er ,Yb не были зафиксированы выраженные изменения в морфологии, однако отмечалось активное образование псевдоподий (Рис. 5).

Наблюдалось поглощение комплексов АК-НЧ нейтрофилами, о чем свидетельствовало образование псевдоподий и наличие внутриклеточных включений наночастиц.

Рис. 5. Нейтрофилы после инкубации (30 мин, 37° С) с АК-НЧ вида ß-Ca3(P04)2:Er3+,Yb3+ (Er/Yb=0,17) (10'4 М). Изображение получено с помощью оптического микроскопа Olympus 1X71, увеличение х60

Гибель клеток, проинкубированных с АК-НЧ этого вида, также была отмечена, преимущественно для нейтрофилов, характеризовавшихся большим количеством включений в цитоплазме, т.е. поглотивших большое количество АК-НЧ (Рис. 6). Для них было зафиксировано более интенсивное локальное свечение PI.

10 мкм

Рис. 6. Нейтрофилы (фиксация этанолом) после инкубации (30 мин, 37° С) с АК-НЧ вида ß-CajiPO^Er^.Yb^ (Er/Yb=0,l) (10"4 М). Изображение получен о с использованием оптического микроскопа Olympus 1X71, увеличение х60

Таким образом, инкубация нейтрофильных гранулоцитов с АК-НЧ разного состава приводит к гибели клеток. Основным механизмом клеточной гибели является некроз, который начинается с блеббинга. Этот вариант клеточной гибели наблюдается при любом химическом составе наночастиц. Учитывая высокий цитотоксический потенциал нейтрофила, высвобождающийся при некротической гибели клеток, можно сделать вывод о том, что при взаимодействии нейтрофилов с АК-НЧ происходит срыв гомеостатических реакций клеток и такого рода взаимодействие не безопасно для окружающих тканей. Данные по исследованию медиальных летальных доз дают отчетливое представление о том, что границы резистентности клеток к воздействию АК-НЧ полностью обусловлены составом, матрицы НЧ, поскольку фторсодержащая матрица обуславливает гибель клеток даже при очень низкой концентрации НЧ, тогда как замена матрицы на биогенный

витлокит способствует выживанию клеток даже при достаточно высоких концентрациях наноматериала. Вместе с тем, изменение соотношения и концентрации ионов лантаноидов Ег и УЬ в составе АК-НЧ практически не изменяют жизнеспособности клеток.

Оценка биохимического и функционального статуса нейтрофилов после взаимодействия с АК-НЧ

Для исследования влияния АК-НЧ на морфофункциональный и биохимический статус нейтрофилов использовали АК-НЧ вида Р3:Ег/УЬ, поскольку именно они проявили себя как наиболее токсичные и, по результатам оптической микроскопии, вызывали более выраженные изменения морфологии клеток даже в небольших концентрациях. Кроме того эти НЧ на сегодняшний день является наиболее распространенным и широко используемыми в медико-биологических исследованиях.

После инкубации нейтрофилов с АК-НЧ вида Р3:Ег/УЪ (60 мин, 37°С) как в спонтанном, так и в стимулированном зимозаном НСТ-тесте, наблюдалось статистически значимое снижение количества НСТ-положительных клеток (Рис.7). Результаты демонстрируют интересную особенность: кислородзависимый метаболизм нейтрофила подавлялся до определенного уровня, и дальнейшее увеличение концентрации АК-НЧ не вносило значительных корректив в количественное содержание НСТ-позитивных клеток. Причем такой эффект наблюдался как в спонтанном, так и в стимулированном НСТ-тесте. Таким образом, гомеостатический резерв кислородзависимого метаболизма клеток в отношении АК-НЧ рестриктирован определенными значениями. Для решения вопроса о том, является ли этот уровень критическим, или возможно дальнейшее истощение функционального резерва необходимы эксперименты по совместной инкубации нейтрофилов с наноматериалами и традиционными стимуляторами (например, бактериальными клетками).

Рис.7. Показатели спонтанного и стимулированного НСТ-теста нейтрофильных гранулоцитов после инкубации (30 мин, 37° С) с АК-НЧ вида Г3:Ег/УЬ в разных концентрациях

* - различия с контролем статистически значимы (р<0,05)

Контроль

АК-НЧ (8,25- 10"5мМ) АК-НЧ (Ы03мМ)

|улирова1

Были рассчитаны индекс стимуляции (ИС) и функциональный резерв нейтрофилов (ФРН) (Таблица 3).

Таблица 3

Индекс стимуляции (ИС) и функциональный резерв нейтрофилов (ФРН) после инкубации (30 мин, 37° С) с апконвсрсионными наночастицами по результатам

Показатель Контроль АК-НЧ (8,25105мМ) АК-НЧ (Н0'3мМ)

ИС 3,17±0,99 2,44±0,40 (1=1,61; п=10; р=0,14) 2,54±0,64 0=1,32; 11=10; р=0,22)

ФРН 27,67±12,52 12,67±2,81* (1=2,86; п=10; р=0,02) 12,67±4,27* (1=2,78; п= 10; р=0,02)

* - различия с контролем статистически значимы (р<0,05)

Снижение ФРН нейтрофилов почти на 40% наблюдалось даже при низкой концентрации НЧ. Этот факт, а так же данные о снижении количества НСТ-позитивных клеток после инкубации с НЧ в концентрации 8,25-10"5мМ, вероятно свидетельствуют о том, что взаимодействие клеток даже с небольшим количеством АК-НЧ приводит к подавлению эффекторного потенциала и препятствует реализации такого важного компонента кислородзависимого защитного механизма нейтрофильных гранулоцитов, как генерация АФК.

Эксперименты, направленные на определение активности миелопероксидазы после взаимодействия с АК-НЧ, показали, что происходит статистически значимое увеличение активности этого фермента, причем даже в случае инкубации с АК-НЧ в малых концентрациях (8,25Т0~5мМ) (Таблица 4).

Таблица 4

Показатели среднего цитохимического коэффициент а для внутриклеточного содержания миелопероксидазы после инкубации (30 мин, 37° С) с апконвсрсионными

Контроль АК-НЧ (8,2510°мМ) АК-НЧ (МО'мМ)

1,62±0,42 2,26±0,24* (1=3,54; п=22; р=0,002) 2,53±0,23* (1=6,11; п=25; р=0,000002)

*- различия с контролем статистически значимы (р<0,05)

Рост этого показателя на фоне подавления кислородзависимого метаболизма говорит о том, что клетка за счет увеличения активности фермента пытается скомпенсировать «утраченную» гомеостатическую функцию. О сопряженности этих процессов свидетельствует и тот факт, что активность миелопероксидазы вновь увеличивается до некоторого критического уровня при использовании разных концентраций АК-НЧ. Действительно, показатели СЦК статистически значимо отличаются от контроля, но не отличаются друг от друга при использовании разных концентраций АК-НЧ.

После взаимодействия с АК-НЧ происходит статистически значимое снижение количества лизосомально-катионных белков (по результатам лизосомально-катионного теста) (Таблица 5). Однако, аналогично результатам НСТ-теста, внесение наноматериалов даже в небольшой концентрации значительно

ингибировало выработку физиологически-активных веществ, поскольку с увеличением концентрации АК-НЧ при инкубации эти показатели не снижались.

Таблица 5

Показатели среднего цитохимического коэффициента для лизосомально-катионных белков нейтрофильных гранулоцитов после взаимодействия е апконверсионными наночастицами вида Р^Ег/УЬ в разных

Контроль АК-НЧ (8,2510"5мМ) АК-НЧ (1 • 10"3мМ)

1,37±0,11 0,85±0,14* (1=7,22; п=10; р=0,00003) 0,89±0,21 * (1=4,87; п=9; р=0,0009)

*- различия с контролем статистически значимы (р<0,05)

Для более подробного изучения последствий влияния АК-НЧ на катионные белки нейтрофилов был проведен дифференцированный анализ полученных резул ьтатов.

Было замечено, что после инкубации с АК-НЧ лишь небольшой процент клеток сохранял высокую и среднюю активность лизосомально-катионных белков, при этом количество клеток с низкой активностью значительно увеличивается (Рис. 8).

а клетки с низкой активностью (СЦК < 0.5) □ клетки со средней активностью (1 < СЦК <2) И клетки с высокой активностью (СЦК >2)

Рис.8. Показатели дифференцированного ЛКТ после инкубации (30 мин, 37° С) с АК-НЧ вида Г3:Ег/\'Ь в разных концентрациях

* - различия с контролем статистически значимы (р<0,05)

Также наблюдалось статистически-значимое подавление активности ферментов кислой и щелочной фосфатазы, что свидетельствует об общем ингибировании метаболической активности нейтрофилов и их способности к защитным реакциям (Рис.9). Как и в случае исследования кислородзависимого и кислороднезависимого метаболизма нейтрофильных гранулоцитов, отмечалось

ингибирование активности ферментов до критического уровня даже при малой концентрации АК-НЧ. Её увеличение не вносило существенных корректив во взаимоотношения в системе «клетки-наночастицы».

0.8 О.в 0.4

0,2

Контроль АК-НЧ (8,25-10 *мМ> АК-НЧ (I-10 лмМ) □ Кислая фосфатаза ■ Щелочная фосфатаза

Рис.9. Показатели внутриклеточного содержания кислой и щелочной фосфатазы после инкубации (30 мин, 37° С) с АК-НЧ вида F3:Er/Yb в разных концентрациях * - различия с контролем статистически значимы (р<0,05)

1 ffi fi

Для определения внутриклеточных запасов гликогена была использована РАБ-реакция. Мы наблюдали, что для нейтрофилов, проинкубированных с АК-НЧ, количество гликогена было больше, чем для клеток в контроле (Таблица 6).

Таблица 6

Показатели среднего цитохимического коэффициента внутриклеточного содержания гликогена после инкубации (30 мин, 37° С) с апконверсионными наночастицами вида

Контроль АК-НЧ (8,25-10"5ММ) АК-НЧ (110"3мМ)

1,08±0,36 1,20±0,37 (t=l,34; n=44; р=0,19) 1,65±0,71* (1=4,12; п=48; р=0,0002)

*- различия с контролем статистически значимы (р<0,05)

Причиной тому могло послужить угнетение физиологических процессов клетки, что в свою очередь привело к недостаточному использованию энергетических субстратов, в том числе и из-за подавления фагоцитарной функции нейтрофила.

Статус рецепторного аппарата нейтрофилов исследовали с использованием методики определения способности к СЗЬ-зависимой адгезии на опсонизированных гранулах сефадекса. В отличие от функциональных и биохимических показателей, функциональный тест обнаружил дозозависимый характер. Если после инкубации нейтрофилов с АК-НЧ Р3:Ег/УЬ в концентрации 8,25-10° мМ наблюдалась лишь тенденция к снижению рецепторзависимой адгезии, то увеличение концентрации до МО"3 мМ приводило к статистически значимому подавлению этого показателя.

(Таблица 7). Таким образом, рецепторный аппарат нейтрофильного гранулоцита оказался наиболее резистентным к воздействию АК-НЧ.

Таблица 7

Количество СЗЬ-позитивных (связавших 3 и более нейтрофилов) гранул сефадекса

после инкубации (30 мин, 37° С) с апконверсионными наночастицами вида Г^Ег/УЬ в __разных концентрациях _

Контроль АК-НЧ (8,25-10'5мМ) АК-НЧ (110 3мМ)

29,56±13,29 30,13±5,28 (1=0,68; п=13;р=0,51) 22,43±1,90* 0=2,30; п=12; р=0,04)

*- различия с контролем статистически значимы (р<0,05)

Полученные данные свидетельствуют, что результатом взаимодействия АК-НЧ на основе фторидной матрицы с нейтрофильными гранулоцитами является подавление их функциональной, биохимической и общей метаболической активности, при этом использование сублетальных доз АК-НЧ приводит к истощению функционального резерва клеток до определенного уровня в независимости от дозы наноматериалов.

Измерение упругости мембрано-цитоскелетного комплекса нейтрофильных гранулоцитов после взаимодействия с АК-НЧ вида Р3:Ег/УЬ

Для исследования упругости нейтрофильных гранулоцитов использован режим РБ-спектроскопии атомно-силового микроскопа. Определяемый при этом модуль упругости - модуль Юнга - отражает состояние ригидности клетки (Плескова и соавт., 2006). После инкубации (30 мин, 37° С) с АК-НЧ вида Р3:Ег/УЬ мы наблюдали статистически значимое снижение значения модуля Юнга для нейтрофилов (Таблица 8). Эти результаты подтверждают гибель клеток по механизму некроза при использовании АК-НЧ, поскольку модуль Юнга в данных экспериментах отражает упругость мембрано-цитоскелетного комплекса, а снижение ригидности цитоскелета, как и мембраны, является неотъемлемой характеристикой некроза.

Кондиционирование взаимодействия в системе «нейтрофильный гранулоцит-наночастицы» было исследовано с использованием предварительной опсонизации АК-НЧ сывороткой крови. Измерение упругости клетки с определением модуля Юнга показало, что опсонизация действительно существенно модулирует реакции клетки в ответ на поглощение наноматериалов. В частности, отмечалась лишь тенденция к снижению упругости, тогда как статистически достоверного падения данного показателя, как это отмечается в случае взаимодействия с неопсонизированными наночастицами, не происходило.

Таблица 8

Ригидность (абсолютное значение модуля Юнга) мембраны нейтрофилов после инкубации (30 мин, 37° С) с апконверсионными наночастицами вида Г3:Ег/УЬ в разных

концентрациях

Контроль АК-НЧ АК-НЧ после опсонизации

26,46 ± 2,49 кПа 19,07 ±3,34 кПа * (1=4,75; п= 13; р=0,0004) 23,98 ±3,46 кПа (1=1,87; п=12; р=0,087)

*- различия с контролем статистически значимы (р<0,05)

Эти результаты показали, что взаимодействие АК-НЧ с белками плазмы инициирует и упрощает процесс фагоцитоза, и при этом минимизирует риск повреждения клетки под действием АК-НЧ на основе фторидной матрицы.

Исследование изменений морфологических параметров нейтрофилов в результате взаимодействия с АК-НЧ методом атомно-силовой микроскопии

Исследования проводили в витальном состоянии в физиологическом растворе в режиме реального времени. В экспериментах использовали неопсонизированные и предварительно опсонизированные АК-НЧ. После внесения в чашку Петри, содержащую адгезированные на поверхность нейтрофилы, АК-НЧ вида Р3:Ег/УЬ в концентрации 10"6 мМ мы наблюдали, что с клеткой происходят деструктивные изменения, приводившие к тому, что её поверхность становилась бугристой и шероховатой (Рис. 10, 11).

Как и в случае измерения ригидности мембраны, предварительная опсонизация способствовала снижению токсического эффекта от АК-НЧ вида Р3:Ег/УЬ. После взаимодействия с опсонизированными АК-НЧ клетка достаточно долго сохраняла форму, близкую к морфологической норме (Рис. 12).

Наблюдалось образование псевдоподий, что может свидетельствовать о поглощении АК-НЧ или их агрегатов путем фагоцитоза (Рис. 13). Кроме того, это подтверждает тот факт, что после взаимодействия с опсонизированными АК-НЧ сохраняется целостность и функциональная активность цитоскелета.

а б в

Рис. 10. Нейтрофил, адгезированный на поверхности чашки Петри, до (а-г) и после (д, е) инкубации с апконверсионными наночастицами вида Fj:Er/Yb. Время с момента начала сканирования: а - 5 мин, 6-10 мин, в - 15 мин, г - 20 мин, д - 45 мин, е - 60 мин. Изображение получено в физиологическом растворе с использованием атомно-силовот о микроскопа Solver-Bio

Рис. 1). Поверхность мембраны иейтрофилов после инкубации (50 мин, 37° С) с апконверсионными наночастицами вида Гз:Ег/УЬ. Изображение получено в физиологическом растворе с использованием атомно-силового микроскопа Solver-Bio

15 мкм 30 мкм

Рис.12. Нейтрофил, адгезированный на поверхности чашки Петри до (а, б) и после (в-е) инкубации с АК-НЧ. Время с момента начала сканирования: а - 5 мин, б - 10 мин, в - 15 мин, г - 20 мин, д - 60 мин, е - 80 мин. Изображение получено в физиологическом растворе с использованием атомно-силового микроскопа Solver-Bio

15 мкм

О мкм

15 мкм

30 мкм

НЧ (F.:Er/Yb)

Рис. 13. Образование псевдоподии нейтрофилом в процессе инкубации с опсонизированными АК-НЧ. Изображение получено в физиологическом растворе на атомно-силовом микроскопе Solver-Bio

Таким образом, предварительная опсонизация АК-НЧ компонентами сыворотки упрощала элиминацию наночастиц нейтрофилами и при этом снижала негативное воздействие на клетки.

ВЫВОДЫ

1. Исследование жизнеспособности нейтрофильных гранулоцитов под влиянием апконверсионных наночастиц показало, что гибель клеток происходит по механизму некроза. Методами экстраполяции кривой и пробит-анализа установлены LD50 при использовании наночастиц разного состава. Полученные результаты показали, что не токсичными и биосовместимыми являются только наночастицы вида Р-Саз(Р04)2:Ег,УЬ, и только их можно рекомендовать в качестве флюоресцентных маркеров в системах in vivo.

2. Обнаружено, что нейтрофильные гранулоциты обладают определенным гомеостатическим резервом в отношении наноматериалов, и использование сублетальных доз апконверсионных наночастиц на основе фторидной матрицы вызывает подавление кислородзависимого и кислороднезависимого метаболизма до критического уровня. Этот уровень определяется только функциональным резервом клеток и не меняется при изменении концентрации наночастиц.

3. Установлено, что под действием апконверсионных наночастиц на основе фторидной матрицы происходит угнетение биохимической активности нейтрофила, что выражается в ингибировании ферментов кислой и щелочной фосфатазы, а также в сохранении внутриклеточных запасов гликогена.

4. Выявлено, что рецепторный потенциал нейтрофилов, оцененный по реакциям СЗЬ-зависимой адгезии является наиболее резистентным к альтерирующему воздействию наноматериалов. Вместе с тем для него характерен дискретный характер ответа на увеличение концентрации наночастиц вида F3:Er/Yb. Лишь при увеличении концентрации наночастиц до 10 мМ приводит к подавлению рецепторных реакций.

5. Определено, что взаимодействие с фторидными апконверсионными наночастицами приводит к снижению упругости мембрано-цитоскелетного комплекса и изменению в морфологии нейтрофилов, которые доказывают некротический вариант гибели клеток.

6. Показано, что опсонизация наночастиц компонентами сыворотки, предшествующая инкубации с нейтрофилами, приводит к снижению альтерирующего эффекта.

Список опубликованных работ по теме диссертации

Работы, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Горшкова, E.H. Нарушения ферментативной активности нейтрофильных гранулоцитов под воздействием наноразмерных флуорофоров / С.Н. Плескова, Э.Р. Михеева, E.H. Горшкова, А.Е. Хомутов // Вестник Нижегородского Университета им. Н.И. Лобачевского. - 2010. - № 5(1). - С. 106-109.

2. Горшкова, Е.Н, Исследование биосовместимости нанопорошка с флюоресцирующим центром Er/Yb в системе с нейтрофильными гранулоцитами / С.Н. Плескова, E.H. Горшкова, Э.Р. Михеева, А.Н. Шушунов // Цитология. - 2011. - Т.53 - №5. - С. 444-449.

3. Горшкова, E.H. Синтез, люминесценция и биосовместимость кальций- и лантаноидсодержащих соединений со структурой NaZr2(P04)3 // А.И. Орлова, А.Е. Канунов, E.H. Горшкова, А.Н. Шушунов, С.Н. Плескова, Э.Р. Михеева, Д.О. Савиных, Е.С. Леонов // Неорганические материалы. - 2012. - Т.48. - № 12. - С. 1365-1371.

4. Горшкова, E.H. Ап-конверсионный люминофор Саз(Р04)г:Ег ,Yb для живых систем / А.И. Орлова, С.Н. Плескова, Н.В. Маланина, А.Н. Шушунов, E.H. Горшкова, Е.Е. Пудовкина, О.Н. Горшков // Неорганические материалы. —2013. — Т. 49. -№7. - С. 745-751.

5. Горшкова, E.H. Взаимодействие квантовых точек с эритроцитами крови здоровых доноров в системе in vitro / С.Н. Плескова, Е.Е. Пудовкина, Э.Р. Михеева, E.H. Горшкова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2013. - Т. 156. - №9. - С.362-366.

Публикации в научных журналах:

6. Горшкова, E.H. Цитохимический анализ нейтрофильных гранулоцитов в системе с квантовыми точками / Э.Р. Михеева, С.Н. Плескова, E.H. Горшкова, Е.Е. Пудовкина // Актуальные проблемы гуманитарных и естественных наук. - 2010. -№ 10.-с. 17-19.

7. Горшкова, E.H. Влияние флуоресцентных наночастиц Er/Yb на биохимические реакции нейтрофильных гранулоцитов / E.H. Горшкова, С.Н. Плескова, Э.Р. Михеева, Е.Е. Пудовкина // Актуальные проблемы гуманитарных и естественных наук. - 2010. - № 10. - с. 15-17.

8. Горшкова, E.H. Атомно-силовая микроскопия клеток крови человека / E.H. Горшкова, С.Н. Плескова, Э.Р. Михеева // Научно-технический журнал «Наноиндустрия». - 2012. -№ 4. - С. 106-109.

9. Gorshkova, E.N. Elaboration of luminescent materials on the basis of phosphates ofNaZr2(P04)3-type for research of living systems / A.E. Kanunov, E.N. Gorshkova, A.I. Orlova, A.N. Shushunov, E.R. Mikheeva, S.N. Pleskova // Physics Procedia. - 2013. -V.44. - P.224 - 230.

Публикации в сборниках научных статей, материалах конференций:

10. Горшкова, E.H. Фотоиндуцированные (лазерной энергией) и темновые токсические эффекты квантовых точек в системе in vitro / Э.Р. Михеева, С.Н. Плескова, И.В. Балалаева, E.H. Горшкова // Труды 2-ой Всероссийской научной школы для молодежи «Концентрированные потоки энергии в индустрии наносистем, материалов и живых систем». Москва. - 2009. - С. 268-273.

11. Горшкова, E.H. Влияние флюоресцирующих частиц Er/Yb на нейтрофильные гранулоциты / E.H. Горшкова, С.Н. Плескова, Э.Р. Михеева // Труды 2-ой Всероссийской научной школы для молодежи «Концентрированные потоки энергии в индустрии наносистем, материалов и живых систем». Москва - 2009. - С. 135-139.

12. Горшкова, E.H. Биоцидные свойства наноматериалов / С.Н. Плескова, И.В. Балалаева, Э.Р. Гиматдинова, E.H. Горшкова, И.С. Голубева, Е.А. Першин, Е.Ю. Весновских // Материалы 1-ой Международной научной школы «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах». Москва. - 2009. - С. 312 -314.

13. Горшкова, Е.Н. Исследование методом проточной цитометрии взаимодействия квантовых точек с клетками крови человека / Э.Р. Михеева, С.Н. Плескова, Е.Н. Горшкова, Е.Е. Пудовкина // Сборник трудов I всероссийской интернет-конференции «Современные проблемы биохимии и бионанотехнологии». Казань. - 2010. - С. 106-108.

14. Горшкова, Е.Н. Влияние наноматериалов на активность миелопероксидазы нейтрофильных гранулоцитов / Э.Р. Михеева, С.Н. Плескова, Е.Н. Горшкова, Е.Е. Пудовкина // Сборник трудов первой международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине». Санкт-Петербург. - 2010. - С. 284-285.

15. Горшкова, Е.Н. Лизосомально-катионный тест для исследования воздействия нанопорошка Er/Yb на нейтрофильные гранулоциты / Е.Н. Горшкова, С.Н. Плескова, Э.Р. Михеева, Е.Е. Пудовкина // Сборник тезисов 14 Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино. - 2010. - С. 119.

16. Gorshkova, E.N. AFM application in research of integration Neutrophils with Er/Yb nanoparticles / E.N. Gorshkova , S.N. Pleskova, E.R. Mikheeva // Third international meeting on AFM in life sciences and medicine. Red Island, Croatia. - 2010. -P. 104.

17. Gorshkova, E.N. Research of the semiconductor nanoparticles influence on the neutrophil granulocytes by AFM / E.R. Mikheeva, S.N. Pleskova, E.N. Gorshkova // Third international meeting on AFM in life sciences and medicine. Red Island, Croatia. -2010.-P. 113.

18. Gorshkova, E.N. Using of AFM for morphological and visco-elastic characteristics of living cells under hydrogen peroxide conditions / S.N. Pleskova, E.R. Mikheeva, E.N. Gorshkova // Third international meeting on AFM in life sciences and medicine. Red Island, Croatia. -2010.-P.119.

19. Gorshkova, E.N. Nanomechanical properties of living cells under different conditions estimated by AFM / S.N. Pleskova, E.N. Gorshkova, E.R. Mikheeva // Neuroplasticity: nervous substrate for health and disorder/ ISTC international scientific workshop abstract book. Tbilisi, Georgia. - 2010. - P. 56-57.

20. Горшкова, Е.Н. Ингибирование защитных реакций нейтрофильных гранулоцитов в системе с квантовыми точками и нанопорошком Er/Yb / Э.Р. Михеева, Е.Н. Горшкова // Материалы III Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010». Нижний Новгород. - 2010. - С. 179.

21. Горшкова, Е.Н, Исследование влияния квантовых точек на лизосомально-катионные белки нейтрофильных гранулоцитов / Е.Е. Пудовкина, Э.Р. Михеева, Е.Н. Горшкова // «Биосистемы: организация, поведение и управление». Материалы 62-й и 63-й студенческих научных конференций биологического факультета. Нижний Новгород. - 2010. - С. 70-71.

22. Горшкова Е.Н. Применение цитохимических тестов для оценки воздействия полупроводниковых нанокристаллов на нейтрофильные гранулоциты / Э.Р. Михеева, Е.Н. Горшкова, С.Н. Плескова, Е.Е. Пудовкина // XV Нижегородская

сессия молодых ученых. Труды молодых ученых по естественнонаучным дисциплинам, Нижний Новгород. - 2010. - С. 18-19.

23. Горшкова, E.H. Ингибирование защитных реакций нейтрофильных гранулоцитов в системе с квантовыми точками и нанопорошком Er/Yb / Э.Р. Михеева, E.H. Горшкова // Сборник тезисов III Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010». Нижний Новгород. - 2010. - С. 179-180.

24. Горшкова, E.H. Цитотоксический эффект наноразмерных флюорофоров с ионами Er/Yb оцененный по их влиянию на цитохимические реакции нейтрофильных гранулоцитов / E.H. Горшкова, С.Н. Плескова, Э.Р. Михеева // Сборник материалов четвертой всероссийской конференции по наноматериалам «НАНО-2011». Москва. - 2011. - С. 50.

25. Горшкова, E.H. Разработка люминесцентных материалов на основе ортофосфатов структурного типа NaZr2(PC>4)3 для исследования живых систем / А.Е. Канунов, E.H. Горшкова, Э.Р. Михеева // Тезисы докладов V Всероссийской конференции студентов и аспирантов «Химия в современном мире». Санкт-Петербург. - 2011. - С. 181-182.

26. Горшкова, E.H. Влияние квантовых точек на выживаемость нейтрофилов / Э.Р. Михеева, С.Н. Плескова, E.H. Горшкова, Е.Е. Пудовкина // Сборник тезисов 15 Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века». Пущино. - 2011. - С. 194.

27. Gorshkova, E.N. Difference kind morphology of pseudopodia neutrophil in phagocytosis of bacteria and xenobiotics investigated by atomic force microscopy / E.R. Mikheeva, S.N. Pleskova, E.N. Gorshkova // Fourth international meeting on AFM in Life sciences and Medicine. Paris, France. - 2011. - P. 85.

28. Горшкова, E.H. Взаимодействие нативных клеток крови с наноразмерными флюорофорами / С.Н. Плескова, Э.Р. Михеева, E.H. Горшкова // Сборник тезисов 5 международной конференции «Современные достижения бионаноскопии». Москва.-2011.-С. 39.

29. Горшкова, E.H. Накопление квантовых точек лейкоцитарной фракцией крови / Э.Р. Михеева, С.Н. Плескова, E.H. Горшкова, Е.Е. Пудовкина // Материалы IV Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2011». Воронеж. - 2011. - Т. 2. - С. 38-40.

30. Горшкова, E.H. Атомно-силовая микроскопия для исследования изменений в морфологии нейтрофилов под воздействием вносимых наноразмерных флуорофоров / E.H. Горшкова, С.Н. Плескова, Э.Р. Михеева // Сборник материалов XVII Российского симпозиума по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел «РЭМ-2011». Черноголовка. -2011.-С. 236.

31. Горшкова, E.H. Применение атомно-силовой микроскопии для оценки изменения упругости мембран нейтрофильных гранулоцитов под воздействием квантовых точек / Э.Р. Михеева, С.Н. Плескова, E.H. Горшкова // Сборник материалов XVII Российского симпозиума по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел «РЭМ-2011». Черноголовка. -2011.-С. 253.

32. Горшкова, E.H. Влияние нанопорошков с флуоресцентным центром Er/Yb на секрецию миелопероксидазы нейтрофильными гранулоцитами / Е.Е. Пудовкина, С.Н. Плескова, E.H. Горшкова, Н.В. Маланина // Сборник тезисов 16-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века». Пущино. - 2012. - С. 69.

33. Gorshkova, E.N. Elaboration of luminescent materials on the basis of phosphates of NaZr2(P04)3 f°r research of living systems /А.Е. Kanunov, A.I. Orlova, E.N. Gorshkova, A.N. Shushunov, S.N. Pleskova, D.O. Savinykh, E.R. Mikheeva // Book of abstracts 10th International Conference Solid State Chemistry 2012. Pardubice, Czech Republic.-2012.-P. 157.

34. Горшкова, E.H. Изменение локальных упругих свойств мембран нейтрофилов после взаимодействия с наноразмерными люминофорами / E.H. Горшкова, Е.Е. Пудовкина, Н.В. Маланина // Материалы докладов IV съезда биофизиков России, Нижний Новгород. -2012. - Т. 1. - С. 78.

35. Горшкова, E.H. Цитохимическое определение активности миелопероксидазы нейтрофильных гранулоцитов после инкубации с полупроводниковыми квантовыми точками / Е.Е. Пудовкина, С.Н. Плескова, E.H. Горшкова // Материалы докладов IV съезда биофизиков России, Нижний Новгород. - 2012. - Т.З. - С. 194.

36. Горшкова, E.H. Исследование биосовместимости новых классов флюоресцентных наноматериалов / Е.Е. Пудовкина, С.Н. Плескова, E.H. Горшкова // Тезисы докладов Всероссийской молодежной школы «Биоматериалы и нанобиоматериалы: актуальные проблемы и вопросы безопасности». Казань. -2012.-С. 38.

37. Горшкова, E.H. Влияние флюоресцентных наноматериалов различного состава на жизнеспособность нейтрофильных гранулоцитов / Е.Е. Пудовкина, E.H. Горшкова, С.Н. Плескова, Н.В. Маланина, Э.Р. Михеева // Сборник материалов III Всероссийской молодёжной конференции с элементами научной школы «Функциональные наноматериалы и высокочистые вещества». Москва. - 2012. - С. 482-483.

38. Горшкова, E.H. Лантоноидсодержащие поликристаллические соединения структурного типа NaZ^PO^ как основа новых материалов для биоимиджинга / Д.О. Савиных, А.Е. Канунов, E.H. Горшкова // Пятнадцатая конференция молодых ученых-химиков Нижегородской области: Сборник тезисов докладов. Нижний Новгород. - 2012. - С. 76-77.

39. Горшкова, E.H. Синтез и исследование люминофоров вида Саю.5-1.5(х+у) ErxYby(P04)7 для визуализации живых систем / Н.В. Маланина, А.Н. Шушунов, E.H. Горшкова // Пятнадцатая конференция молодых ученых-химиков Нижегородской области: Сборник тезисов докладов. - Нижний Новгород: Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского. - 2012. - С. 61-62.

40. Горшкова, E.H. Влияние наноразмерных люминофоров на способность нейтрофилов к СЗЬ-зависимой адгезии / E.H. Горшкова // Сборник тезисов 17-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых Биология -наука XXI века. Пущино. - 2013. - С. 109.

41. Горшкова, E.H. Биосовместимость флюоресцентных наноматериалов / Е.Е. Пудовкина, С.Н. Плескова, E.H. Горшкова // XXV Международная зимняя молодежная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 11-15 февраля 2013 г. — С. 59.

Автор выражает благодарность и глубокую признательность научному руководителю д.б.н. С.Н. Плесковой. Так же, особую благодарность д.б.н., профессору В.В. Новикову. За возможность проведения экспериментов и помощь в выполнении научной работы Ю.Ю. Гущиной, а также сотрудникам НОЦ ФТНС ННГУ, в особенности директору, к.ф.-м.н. О.Н. Горшкову, за помощь в проведении экспериментов к.б.н. Э.Р. Михеевой и Е.Е. Пудовкиной, за плодотворную совместную работу и предоставленные материалы для исследований сотрудникам кафедры химии твердого тела химического факультета ННГУ д.х.н., проф. А.И. Орловой, А.Е. Канунову и Н.В. Маланиной. За помощь в освоении методик сотруднице кафедры физиологии и патофизиологии Ульяновского государственного университета к.б.н. Т.В. Абакумовой. За помощь в проведении исследований сотрудникам каф. физиологии и биохимии человека и животных, в особенности A.B. Дерюгиной, а также сотрудникам НИФТИ ННГУ к.х.н. Е.С. Леонову и А.Н. Шушунову.

Список сокращений

АК-НЧ - апконверсионные наночастицы

АСМ - атомно-силовая микроскопия

АФК - активные формы кислорода

ИС - индекс стимуляции

ЛКТ - лизосомально-катионный тест

КФ — кислая фосфатаза

нет - нитросиний тетразолий

нч - наночастицы

ФРН — функциональный резерв нейтрофила

ЩФ — щелочная фосфатаза

PI - propidium iodide (пропидиум йодид)