Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование электрофоретической подвижности и агрегационных свойств эритроцитов при действии пчелиного яда и его препаратов

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование электрофоретической подвижности и агрегационных свойств эритроцитов при действии пчелиного яда и его препаратов"

рге он

На правах рукописи

22 «

Дсрюпша Анна Вячеславовна

Исследование электрофоретической подвижности и агре-гационных свойств эритроцитов при действии пчелиного пда и

его препаратов

03.00.13 - физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Нижний Новгород 1998

Работа выполнена на кафедре физиологии и биохимии человека и животных Нижегородскою государственного университега им. Н.И.Лобачепекою

Научный руководитель: д.б.н., проф. Крылов В.Н.

Официальные оппоненты: д.б.н., проф. Конторщикова К.Н. д.м.н., проф. Левин Г.Я.

Ведущая организация:

Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт, г.Казань

Защита состоится " 7 " 0/С-1$¿>/¿¿2- 1998 г. в /Г часов на заседании диссертационного совета К 063.77.13 Нижеюродского государственного университета им Н.И.Лобачевсого (603600, Нижиий Новгород, ггр.Гагарина, 23)

С диссергацией можно ознакомиться в библиотеке университета Автореферат разослан "3 "ССМ/Х'Ьр^ 1998г.

Ученый секретарь диссертационного о

к.б.н., доц.

Александрова И.Ф.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

В настоящее время анализу электрофоретической подвижности эритроцитов (ЭФПЭ) как одному из жизненно важных параметров гомеоегаза человека уделяется повышенное внимание. Это связано с тем, что регистрация перемещения клеток крови в электрическом поле позволяет оценить не только их электрокинетический потенциал и, следовательно, морфофункциональное состояние мембран, но и состояние гомеостаза организма в целом. Так, снижение отрицательного заряда и, как следствие, ЭФПЭ, определяет повышение агрегабельности эритроцитов, свидетельствуя о нарушении реологических свойств крови (Харамоненко, Ракитян-ская, 1974), и инициируя процесс тромбообразования (Stoltz, Donner, 1991).

Актуальность изучения мембранных характеристик эритроцитов, определяющих их электрофоретическую подвижность, возрастает при анализе взаимодействия организма с экзогенными биологически активными веществами. При этом совершенствование неспецифических критериев оценки степени воздействия важно при контакте организма с малотоксическими веществами или с токсическими соединениями в малых дозах, поскольку клиническая картина и морфологические изменения в таких случаях теряют относительную специфику и на первый план выступают "неспецифические" реакции организма (Гильмутдинов, 1994). В этом плане анализ ЭФП эритроцитов может быть использован при раскрытии молекулярных механизмов развития патологических процессов и выработки подходов к лечению конкретных заболеваний.

Интенсивно развивающаяся в последнее время апитерапия - лечение заболеваний продуктами пчеловодства, базируется, в основном, на широких терапевтических свойствах пчелиного яда (Лудянский, 1994; Крылов, 1995). Кроме общепризнанного использования в лечении ревматических и воспалительных заболеваниях, яд и его препараты все шире применяются в терапии патологии сердечнососудистой системы (Люсов, Зимин, 1983; Крылов, 1990). Терапевтический эффект яда при лечении системы кровообращения обусловлен, в частности, его выраженным антикоагулирующими и дезагрегирующими свойствами (Артемов, 1969; Омаров, 1982). В свою очередь, эти свойства яда могут обеспечиваться поверхностными характеристиками клеток крови.

Недостаточная изученность механизмов структурной реорганизации клеточных мембран эритроцитов, взаимосвязи ЭФПЭ с агрегационными свойствами мембраны в этих условиях диктует необходимость их дальнейшего изучения.

Работа выполнялась в соответствии с планом научно-исследовательских работ кафедры физиологии и биохимии человека и животных ННГУ (№ Госрегист-

рации 81062913), а также в рамках программы "Университеты России" - биология, проект "Зоотоксины в патофизиологии и медицине".

Цель работы. Целью работы явилось изучение электрофоретической подвижности (ЭФП) и агрегации эритроцитов человека и животных при действии пчелиного яда и его препаратов.

В задачи работы входило:

¡.Исследовать динамику изменения ЭФПЭ при действии пчелиного «да, фосфолипазы А2, мелиттина и роль происходящих электрокинетических изменений мембраны эритроцитов в агрегации клеток.

2.Изучить зависимость величины ЭФПЭ и их агрегации при действии пчелиного яда от изменений физико-химической структуры эритроцитарной мембраны.

3.Провести анализ механизмов изменения ЭФП и агрегации эритроцитов при действии пчелиного яда и стресс-гормонов.

4. Изучить ЭФПЭ и их агрегацию в условиях альтерации организма и апитерапии.

Научная новизна исследований

В работе впервые проведено исследование электрокинетических свойств эритроцитов и роли поверхностного заряда клеток в процессе агрегации при действии пчелиного яда и его препаратов. В этих условиях обнаружено фазное изменение ЭФПЭ и выявлена зависимость данного параметра от морфо-функционального состояния мембран. Установлено, что изменения ЭФПЭ определяются в большей степени совместным действием ингредиентов яда пчелы, чем самостоятельным действием его компонентов.

Показано, что ЭФПЭ изменяется в соответствии с фазностью развивающейся в организме стрессовой реакции, связанной с активацией ведущих стресс-реализующих систем при действии пчелиного яда. Выявлено, что пчелиный яд и его препарат солапивен в условиях альтерации организма вызывают изменения ЭФП и агрегации эритроцитов, отражающие эффективность проводимой апитерапии.

Научно-практическая ценность работы

Результаты исследования позволили вскрыть механизмы изменения ЭФП и агрегации эритроцитов и их приспособительную роль в формировании целостной реакции организма в ответ на введение пчелиного яда. Анализ изменений электрокинетических и агрегационных свойств эритроцитов позволил обосновать эффективность применения пчелиного ада в терапии радиационного поражения животных и включения в реабилитационный комплекс методов при лечении больных

дисциркуляторной энцефалопатией и люмбоишиалгией. Выявленная направленность изменений ЭФПЭ при идущем в организме патологическом процессе и фармакологическом воздействии, позволяет рекомендовать микроэлектрофорез эритроцитов при исследовании крови с целью ранней диагностики развития патологии и проводимой терапии.

Основные положения диссертации, вьшосимые на защиту

Пчелиный ад и его препараты определяют фазное изменение ЭФП, сопровождающееся дезагрегирующим эффектом, что проявляется как в опытах in vitro, так и в условиях целостного организма. Указанные реакции эритроцитов опосредованы комплексом изменений, связанных со структурным состоянием клеточной мембраны. Механизмы изменения ЭФП и агрегации эритроцитов сочетаются с активацией ведущих стресс-реализующих систем в ответ на действие пчелиного яда. Увеличение ЭФПЭ при действии пчелиного яда и его препарата солапивена, проявляющееся в условиях альтерации организма крыс радиационным облучением и апитерапии больных дисциркуляторной энцефалопатией И стадии и вертоб-рогенной люмбоишиалгией, является прогностическим признаком, и, в сочетании с физико-химическими характеристиками крови, отражает эффективность проводимой апитерапии.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на заседании Нижегородского отделения Российского биохимического общества (Н.Новгород, 1997), на научно-практических конференциях по апитерапии (Рыбное, 1994; Сочи, 1996; Рыбное, 1997), на Третьей Нижегородской сессии молодых ученых (Н.Новгород, 1998), научных семинарах кафедры физиологии и биохимии человека и животных ННГУ.

По теме диссертации опубликовано 17 работ.

Структура и объем работы

Материалы диссертации изложены на страницах машинописного текста, иллюстрированы 27 таблицами, 16 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, раздела собственных исследований, заключения, выводов, списка цитированной литературы, содержащего 254 источника (183 на русском и 71 на иностранных языках).

Материалы и методы исследования

Было проведено 8 серий экспериментов в опытах in vitro и in vivo. Эксперименты in vitro выполнены с использованием эритроцитарной массы 280 доноров. В условиях введения препаратов животным проведены исследования крови 171 белых крыс. Кроме того исследовали кровь 80 больных людей с диагнозом дис-циркуляторная атеросклеротическая энцефалопатия II стадии (50 человек) и вер-теброгенная люмбоишиалгия (30 человек) при апитерапии солапивеном. Общее распределение исследований представлено в таблице 1.

Таблица 1

Распределение исследований по сериям

воздействующий агент объект исследования кол-во опытов

опыты in vitro

пчелиный яд интактные эритроциты 100

мелитгин

фосфолипаза А2

пчелиный яд эритроциты, преинкубированные с нейраминидазой, глкхгаровым альдегидом и с измененным уровнем АТФ в клетках 100

адреналин, кортизол, интактные эритроциты 80

адреналин+пчелиный яд

кортизол+пчелиный ад

пчелиный яд+кортизол

опыты in vivo

пчелиный яд интактные крысы сюрреналэктомированные крысы 45

гепарин, пчелиный яд, интактные крысы 72

гепарин+пчелиный яд

апитерапия

пчелиный яд облученные крысы 54

солапивен больные ДЭ 50

" " - больные люмбоишиалгией 30

В опытах in vitro объектом исследования служила стабилизированная 20% раствором глюгицира эритроцитарная масса крови человека. Используемые в опытах эритроциты отмывали 0,85% раствором хлористого натрия трехкратным центрифугированием при 1000 об/мин 15 мин и разводили в ЮмМ трис-HCl буфере СрН-7,4).

В первой серии экспериментов эритроциты инкубировали с пчелиным ядом в концентрации (МО^-МО^г/мл) и его основными компонентами: мелиттином (5-10"7-5-10"8г/мл), фосфолипазой Аг (5-10"8г/мл). Использовали яд пчелиный - субстанцию для приготовления лекарственных форм (ФС 42-2683-96, МЗ РФ). Препараты яда - мелитгин и фосфолипаза А: получены в АО "Восток" (Омутнинский химический завод) методом ВЖХ и любезно предоставлены с.н.с. АО Ершовым АВ.

С целью выявления роли структурных компонентов мембраны эритроцита при действии пчелиного яда на ЭФП и агрегацию эритроцитов в опытах второй серии использовали эритроциты с искусственно измененным поверхностным зарядом и модифицированной структурой. Изменение поверхностного заряда и модификацию структуры мембраны достигали путем обработки эритроцитов:

а) инкубировали эритроциты при t=37°C 30 мин с нейраминидазой из Vibrio cholerae в конечной концентрации 0,1 мг/мл.

б) варьировали концентрацию АТФ в эритроцитах (Feo, Leblond, 1974). Эритроциты с пониженным уровнем АТФ получали инкубацией 10% суспензии эритроцитов в ЮмМ трис-HCl буфере, содержащем 14бмМ NaCl при t=37°, 18 часов. Для повышенния уровнем АТФ эритроциты инкубировали (15часов) в среде, содержащей 146мМ NaCl, 15мМ трис-HCl, 2мМ адении, ЮмМ инозин и глюкозу, 150мМ Na2HP04. При этом повышение уровеня АТФ в клетках составляло 2,86±0,17мкМ/мл против 1,16±0,08мкМ/мл в контроле, понижение 0,36+0,05мкМ/мл. Концентрацию внутриклеточной АТФ определяли ферментативным методом, используя набор реактивов фирмы "Boehringer".

в) фиксировали эритроциты глютаровым альдегидом, используя методику Н. Waiter и J.Krob (1989). Взвесь эритроцитов инкубировали при t=22-24°C в течение 12 часов в 0,1% растворе глютарового альдегида

После трехкратной отмывки физиологическим раствором обработанные эритроциты инкубировали с пчелиным ядом (1.10'6-1.10'7г/мл).

В третей серии экспериментов in vitro производили инкубацию отмытых эритроцитов человека с адреналином (МО"9-МО"10г/мл), кортизолом (М0'7-5-10' 7г/мл), а так же различных их сочетаний в следующих вариантах: действие пчелиного ада (1-10'7г/мл) на эритроциты преинкубированные в течении 10 мин с кортизолом (МО'7,5-10"7г/мл) или адреналином (М0'9г/мл) и кортизолом (МО 7,5-10' 7г/мл) на эритроциты, преинкубированные в течении 10 мин с пчелиным адом (М0'7г/мл).

Инкубацию эритроцитов в растворах пчелиного яда, адреналина , кортизола и их совместном использовании (1,3-я серии) проводили в течении 3-х часов, замеряя ЭФП, агрегацию эритроцитов и концентрацию в них малонового диальде-гида (МДА) на 30, 60, 120, 180 мин. ЭФП и агрегацию интактных эритроцитов и

эритроцитов с измененной структурой (1,2-я серии) измеряли в течении первых 60 мин каждые 10 мин. Контролем во всех сериях служили ЭФП, агрегации и концентрации МДА интактных эритроцитов.

В следующей части работы изучали действие пчелиного яда и препарата -солапивен в условиях их введения в организм. Эксперименты четвертой серии были проведены на белых крысах массой 180-200гр. Раствор яда вводили внутри-брюшинно в дозе 0,5мг/кг. Контрольным животным вводили физиологический раствор в эквивалентном объеме.

Для анализа механизмов изменения ЭФПЭ при действии пчелиного яда в опытах in vivo в отдельной серии производили внутрибрюшинное введение пчелиного яда сюрреналэктомированным крысам (Лазарев, 1954). В части опытов наряду с пчелиным ядом животным вводили раствор гепарина (150МЕ/кг).

Кровь в опытах in vivo брали из подъязычной вены через 1час, 1, 7, 14, 21 сутки после введения препаратов. У животных регистрировали динамику изменения ЭФП, агрегации отмытых и неотмытых эритроцитов, концентрации МДА и времени свертывания крови.

Дальнейшие исследования были проведены в условиях моделирования альтерации организма крыс и апитерапии больных дисциркулягорной энцефалопатией (ДЭ) II стадии и вертеброгенной люмбоишиалгей.

Эксперименты с моделированием альтерации проводили на крысах, подвергшихся общему однократному облучению у-лучами при помощи терапевтической установки "Агат-с". Доза облучения составила 5Гр. Опытным животным через час после облучения и далее ежедневно, в течении 7 дней, внутрибрюшинно вводили пчелиный яд. Суммарная доза токсина составила 0,5мг/кг. В другой серии опытов пчелиный яд животным вводили однократно (0,5мг/'кг). Контрольной группе животных вводили в том же объеме физиологический раствор. Забор крови производили из подъязычной вены через 7,14, 21, 28 суток после облучения.

В серии исследований крови людей анализировали ЭФПЭ и ее взаимодействие с другими гематологическими показателями при апитерапии солапивеном больных с диагнозом ДЭ и вертеброгенная люмбоишалгия.*

Обследовали больных с ДЭ II стадии (в возрасте от 60 до 80 лет) и с симптомами люмбоишиалгии (возраст 28-63 лет). В процессе исследования пациенты были разделены на две группы (контрольная и основная), сопоставимые по полу, возрасту и клинической картине заболевания. В контрольной группе пациентов апитерапия не применялись.

Пациентам основной группы на фоне традиционной терапии в акупунктур-

* - исследования данной серии были проведены совместно с ассистентом кафедры неврологии и медицинской реабилитации с курсом геронтологии факультета усовершенствования врачей НМА, канд. мед. наук Антипенко Е. А

ные точки вводился инъекционный препарат пчелиного яда - солапивен*. В ходе лечения больных ДЭ использовались точки общего воздействия и точки шейно-воротниковой зоны, в дозе от 0,5 до 2,0 мг на одну процедуру. Препарат вводили в возрастающих дозировках. Количество процедур 5-7 на курс лечения, часто та процедур через 1-2 дня в зависимости от степени выраженности местных реакций. Курсовая доза равнялась 8-10 мл. Группе больных с вертеброгенной люмбоишиал-гией дополнительно к стандартному лечению вводили солапивен в дозе 0,2 мл б раз парентерально через день в зоны болевых точек поясницы и по ходу нерва. Перед лечением больным проводили биологическую пробу на переносимость препарата (0,1 мл внутрикожно на внутренней стороне предплечья).

При поступлении больных в стационар и в конце курса лечения у обследованных больных производили забор крови в количестве 3-5 мл и проводили анализ ЭФП и агрегации эритроцитов. У больных ДЭ дополнительно исследовали время начала, конца и общее время свертывания крови, время рекальцификации, протромбиновое время, фибриноген, концентрацию сиаловых кислот в плазме. У больных люмбоишалгией дополнительно проводили ряд биохимических исследований липид-белкового состояния плазмы (Кост, 1975, Меньшиков, 1987).

ЭФП определяли микроэлектрофорезом по методу С.С.Харамоненко (1974) в нашей модификации. Установка для электрофореза состояла из горизонтальной микрокамеры, соединенной через электроды с источником постоянного тока. Использовали электроды системы Ag/AgCl. Сила тока составляла ЮмА.

Показатели агрегации эритроцитов исследовали методом подсчета одиночных эритроцитов и их агрегатов в камере Горяева по методу И.Я.Ашкинази (1977). В качестве стимулятора агрегации использовали 20% раствор декстраиа голубого.

Концентрацию МДА определяли методом, основанным на способности молекулы МДА в кислой среде при температуре 90-100°С реагировать с двумя молекулами тиобарбитуровой кислоты с образованием окрашенного триметинового комплекса (Владимиров, Арчаков, 1972).

Результаты исследований обрабатывали статистически с использованием Т-критерия Стьюдента. Обработку данных осуществляли на IBM РС/АТ-386 с помощью программы STADIA.

* - препарат солапивен - инъекционный, стерильный, апирогенный 0,06% раствор пчелиного ада, разработанный на кафедре физиологии и биохимии человека и животных Нижегородского государственного университета (патент № 2057539 на изобретение "Средство, обладающее обезболивающим действием для парентерального введения"). Работа была проведена с препаратом, изготовленном на экспериментальном заводе института органического синтеза Латвийской АН (серия №01-030491).

Результаты исследований

Физиологический анализ ЭФП и агрегации эритроцитов при действии пчелшгого яда в опытах in vitro

В экспериментах in vitro установлено, что изменение ЭФПЭ при действии пчелиного яда носило фазовый характер. Обработка эритроцитов пчелиным адом (1.10" -1.10'6г/мл) вызывала резкое (30-40мин) падение ЭФПЭ, восстанавливающейся к 1 часу. Затем следовало продолжительное (40-120мин) возрасгакОФП (с максимумом 5-16%) относительно исходного уровня.

Установлено, что пчелиный яд как в фазу уменьшения, так и фазу возрастания ЭФПЭ вызывал однонаправленное выраженное уменьшение их агрегации (рис. 1).

Фазное изменение ЭФПЭ и снижение уровня агрегации сопровождалось до-зозависимым уменьшением концентрации МДА, наиболее выраженным в течение 30 мин эксперимента (на 14-16%).

110

-ЭФП - агрегация -МДА

время

Рис. 1. Динамика изменения электрофоретической подвижности, агрегации и концентрации малонового диальдегида эритроцитов при действии пчелиного яда (М0"7г/мл) in vitro

*- р<0,05 по отношению к интактным клеткам

Из полученных результатов следует, что понижение агрегации и концентрации МДА коррелирует лишь с фазой увеличения ЭФПЭ, что позволяет полагать роль структурных изменений мембраны при действии компонентов яда. Поэтому, было целесообразно рассмотреть вклад основных компонентов (мелитгина и фос-фолипазы А3) в механизмы изменения ЭФПЭ при действии пчелиного яда.

Из рис. 2 видно, что мелитгин не оказывал существенного влияния на ЭФПЭ (достижение эффекта, сравнимого с действием нативного пчелиного ада на

и

ЭФПЭ, происходило только при увеличении концентрации мелитпша в инкубационной среде в 10 раз). Фосфолиназа Л2 уменьшала эти показатели кропи также в меньшей степени, чем цельный яд. В то же время важно отметить, что этот фермент яда однонаправлено усиливал агрегацию эритроцитов.

- пчелиный яд, 5Е-7г/мл

-мелиттин, 2,5Е-7г/мл

-фосфолипаза А 5Е-8г/мл

время, Ьлл

Рис 2. Динамика изменения электрофоретической подвижности при действии пчелиного яда и его компонентов *- р<0,05 по отношению к интактным клеткам

Из приведенных исследований следует, что электрокинетическое действие пчелиного яда, является более сложным, чем действие мелитпша и фосфолипазы А2, и, вероятно, связанно с синергизмом действия изученных компонентов яда, адсорбция которых приводит к последующей структурной перестройке мембраны, определяющей агрегацнонные свойства клеток.

Для проверки данного положения было проведено три серии экспериментов.

Было установлено, что преинкубация эритроцитов с нейраминидазой, снижающей на 60-90% суммарный отрицательный заряд клеток (Dauson et al., 1978), препятствовала снижению ЭФП клеток и их агрегации при действии яда. Мы полагаем, что это происходило за счет уменьшения нейраминидазой эффективного отрицательного заряда клеток, определяющего взаимодействие с эритроцитами основных компонентов яда, обладающих катионными свойствами.

Преинкубация эритроцитов с глютаровым альдегидом, фиксирующим белки и значительно ограничивающим структурную лабильность белковых молекул (Walter, Krob, 1989) приводила к модификации изменения электрофоретаческих и агрегацнонных свойств эритроцитов под действием пчелиного яда. Это выражалось в уменьшении и укорочении (10-20мин) 1-й фазы изменения ЭФП и агрегации эритроцитов с последующей стабилизацией данных показателей до конца эксперимента. Существенное ослабление эффекта свидетельствует о влиянии яда,

главным образом, именно на белок-липвдную фазу, и в меньшей степени - на структуры гликокаликса.

Важным аргументом в пользу вышеприведенных рассуждений о том, что механизмы изменения ЭФПЭ опосредуются взаимодействием пчелиного яда с мембраной, могут быть эксперименты с моделированием ее исходного функционального состояния. Для уточнения роли исходного состояния мембраны были смоделированы условия с повышением и понижением уровня АТФ в клетках. Было показано, что качественная картина динамики изменения ЭФП и агрегации под действием пчелиного яда у эритроцитов с измененным уровнем АТФ, была сходной с шггактными эритроцитами. Вместе с тем, увеличение содержания АТФ в клетках приводило к ускорению и углублению падения ЭФП эритроцитов и усиливало дезагрегацию эритроцитов. При уменьшении содержания АТФ дезагрегирующий эффект пчелиного яда сопровождался замедлением ЭФП клеток. Таким образом, влияние токсина на ЭФП и агрегацию эритроцитов определяется исходным состоянием мембраны, определяющим лабильность ее белково-липидных структур.

Установленные данные дают основание предполагать, что действие пчелиного яда на ЭФП и агрегацию эритроцитов является многоступенчатым процессом: первоначальное электростатическое взаимодействие яда с элементами гликокаликса с последующим внедрением его основных активных компонентов в липопротсиновый матрикс. При этом ведущим фактором в изменении ЭФП эритроцитов будет перераспределение поверхностного заряда клеток, происходящее при действии токсина на бедок-липидную структуру мембраны, и в меньшей степени - первичная адсорбция компонентов яда на клеточной поверхности.

Учитывая, что причиной изменений ЭФП эритроцитов при действии пчелиного яда в условиях целостного организма может явиться развитие стресс-реакции и опосредованного ответа на уровне клетки из-за возрастания в крови уровня катехоламинов и глюкокортикоидов (Крылов, 1995) мы провели анализ этих возможностей с использованием наиболее важных стресс-агентов - адреналином и кортизолом.

Использование адреналина в концентрации, соответствующей его концентрации в крови в условиях физиологической нормы (1-10"10г/мл) не вызывало значительных изменений электрокинетических свойств эритроцитов (р>0,05). Добавление адреналина в концентрации, соответствующей его уровню яри стрессовых реакциях организма (1.10 г/мл) приводило к уменьшению ЭФП на 15%, увеличению агрегации на 15% и концентрации МДА на 28% (табл. 2).

В отличие от опытов с адреналином, инкубация эритроцитов с кортизолом в концентрации 1 • 10'7-5 • 10'7 г/мл определяла достоверное дозозависимое увеличение ЭФП на 11-16% в интервале от 30 мнн до 2 часов, понижение агрегации (на 715%) и понижение концентрации МДА (иа 8-11%).

Таблица 2

Электрофоретическая подвижность (мкм-см-В"'-с"1), агрегация (%) и концентрация малонового диальдегида (нмоль/мг) эритроцитов при действии адреналина и кортизола

воздейств ующий агент показатели время инкубации, мин

контроль 30 60 120 180

адреналин М0'9г/мл ЭФП 1,33±0,02 1.19±0,09* 1,15±0,07* 1,14±0,05* 1,16±0,03*

агрегация 89.3 ±1,2 101,8±3,2* 102,6±3,0* 98,4±4,4* 94,9±2,4*

МДА 4,62i0.20 5.19+0,11* 5,26±0,28* 5,5&±0,29* 5.90±0,35*

кортизол 5-10"7г/мл ..... ЭФП 1,33±0.02 1.54±0.03* 11.37*0.05 1.31 ±0,04 1,27±0,06

агрегация 84.5±1,3 79.4±3,0* 72,7±3,0* 73,5±2,0* 71,8±3,2*

МДА 4,62±0,20 |4ЛЗ±0,20*|4,38±0,23 4,16±0,19* 4,30±0,24

Примечание: * - р<0,05 по сравнению с контролем

Анализ динамики изменения ЭФПЭ при действии адреналина и кортизола позволил установить сходство первичного изменения подвижности эритроцитов при действии адреналина и пчелиного яда. Последующее (2-я фаза) повышение ЭФПЭ под влиянием яда совпадало с увеличением ЭФПЭ при действии кортизола. Вместе с тем, полученные данные свидетельствуют, что изменение агрегаци-онных свойств эритроцитов при действии кортизола и адреналина опосредованы ПОЛ-зависимым изменением их ЭФП.

Совместное действие пчелиного яда и стресс-агентов подтвердили роль адреналина и кортизола в ЭФП клеток. Сочетание адреналина и пчелиного яда усугубило проявление первой фазы изменения ЭФП, а пчелиного яда и кортизола -второй фазы.

Влияние пчелиного яда на ЭФП и агрегацию эритроцитов при внут-рибрюшиииом введении

В экспериментах на крысах показано, что в качественном отношении картина изучаемых процессов, протекающих в организме при введении пчелиного яда, была сходной с динамикой изменения исследуемых характеристик в опытах in vitro, но характеризовалась более длительным развитием во времени (рис. 3).

Параллельно с изменением ЭФПЭ наблюдалось изменение агрегации эритроцитов, концентрации в них МДА и времени свертывания крови. Проявление дезагрегирующего эффекта, выраженного уже к ! часу эксперимента при действии пчелиного яда протекало в том же временном промежутке, что и модуляция ЭФПЭ. Понижение степени агрегации эритроцитов совпадало с удлинением общего времени свертывания крови и уменьшением концентрации МДА.

Сопоставление однотипности изменения ЭФП, агрегации эритроцитов и содержания в них МДА в опытах in vitro и in vivo позволяет предположить участие в развитии указанных реакций ведущих стресс реализующих систем организма при действии пчелиного яда. Это было подтверждено в опытах на крысах с двухсторонней сюрреналэктомией, ограничивающей выброс эндогенного адреналина и

х 60 -

«.О

50 -I-1-1-1-1-1

0 1ч 1с 1н 2н Зн врем*

Рис. 3. Динамика изменения электрофоретической подвижности, агрегации и концентрации малонового диальдегида эритроцитов при действии пчелиного яда (0,5мг/кг) in vivo

* - р<0,05 по отношению к интактным животным

кортизола. Внутрнбрюшинное введение пчелиного яда животным с удаленными надпочечниками вызывало несущественные (р>0,05) изменения исследуемых процессов по сравнению с интакпшми животными (рис. 4).

к 60 -

V©

50 -I-1-1-1-1-1

О 1ч 1с 1к 2н Зн «Ре*"1

Рис.4. Динамика изменения электрофоретической подвижности, агрегации и концентрации малонового диальдегида эритроцитов в опыте in vivo при внутри-брюшинном введении пчелиного яда сюрреналэктомированным крысам

Из анализа показателей следует выделить значительно повышенный исходный уровень ЭФИ эритроцитов у сюрреналэктомированных крыс. Это может быть связано с повышением в крови гепарина у животных с удаленными надпочечниками (Абесадзе и др., 1982). Учитывая, что в адаптившлх реакциях, сопровождаемых секрецией и выбросом адреналина. АКТГ и глюкокортихоидов, рефлекторно увеличивается концентрация гепарина (Калишевская, 1982; Умарова и др., 1997), обладающего высоким анионным зарядом , мы проанализировали возможность его участия в изучаемых реакциях.

Опыты показали, чго внутрибрюшинное введение гепарина крысам сопровождалось увеличением ЭФПЭ, концентрации МДА и общего времени свертывания крови уже к 1 часу и дезагрегирующим эффектом при последующем увеличении агрегации. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об участии эндогенного гепарина в реализации исследуемых процессов, который может усиливать электрокинетическое и антикоагулиругощее действие и лимитировать дезагрегирующий и антиоксидантный эффекты в ответ на введение пчелиного яда.

Влияние пчелиного яда на ЭФП и агрегшопо эритроцитов в условиях альтерации оргашпма

Выявленное в опьпах снижение агрегабельности и свертывания крови, сочетающееся с антиоксидантным эффектом, дало основание изучить выявленные свойства пчелиного яда в условиях моделирования альтерации организма с повышенным уровнем исследуемых показателей. Опыты с облучением крыс в дозе 5 Гр, вызывающей тяжелую форму лучевой болезни, показали прогрессирующее увеличение ЭФПЭ, их агрегации, рост уровня МДА в клетках и удлинение времени свертывания крови (табл. 3). У животных, получавших терапию пчелиным ядом, после облучения происходило торможение исследуемых процессов, что выражалось в стабилизации концентрации МДА степени агрегации эритроцитов, ЭФП и общего времени свертывания крови до конца эксперимента.

Таким образом, модулирующее действие пчелиного яда на ЭФП, агрегацию эритроцитов, МДА и свертывание крови проявилось и в условиях тяжелой альтерации организма, что дало выраженный терапевтический эффект. В свою очередь, известная эффективная апитерапия пчелиным ядом больных с разной патологией, может быть объяснена улучшением реологических и электрокинетических свойств крови. Это было подтвержено нами в условиях апитерапии больных дисциркуля-ториой энцефалопатией и вертебротенной люмбоишиалгией.

При исследовании крови больных людей было установлено, что ЭФПЭ крови как больных ДЭ, так н больных люмбошиалтией, характеризовалась понижен-ныл» уровнем по сравнению с уровнем ЭФПЭ контроля - крови доноров.

Таблица 3

Электрофоретичеекая подвижность (мкм-см-В"'-с"'), агрегация (%), концентрация малонового диальдегида (нмоль/мг) эритроцитов и время свертывания крови (с) облученных животных

показатели время после облучения, сутки

до облучения 7 14 21 24

облучение

ЭФП 1,46±0,04 1,50±0,06 1,78±0,06 0,82±0,01 0,80±0,02

агрегация 63,62±0,14 93,94±0,20 92,10±0,22 98,36±0,31 100,1 ±0,2

МДА 4,22±0,24 5,69±0Д0 5,66±0,49 6,62±0,40 6,69±0,21

свертывание 116,5±10,2 152,0+14,2 70,5 ±9,00 85,3±Д1,2 70,2±7,8

облучение + пчелиный яд

ЭФП 1,46±0,04 1,20±0,01* 1,11±0,02* 1,05±0,02* 1,0610,02*

агрегация 63,62±0,14 91,06 ±0,12* 94,94^0,23« 93,68±Р,26* 96,22±0,22*

МДА 4,22+0,24 5,60±0,36 5,60±0,30 5,58*0,44» 5,54±0,34*

свертывание 116,5+0,3 75,4±13,6* 69,2±12,2 87,0*11,4 100,8*9,4*

Примечание: * - р<0,05 по сравнению с облученными животными

Лечение больных ДЭ с включением в комплекс терапии препарата пчелиного «да определило увеличение ЭФПЭ, что сопровождалось уменьшением их агрегации и удлинением общего времени свертывания крови. Также было отмечено удлинение времени рекальцификацни, протромбинового времени, снижение концентрации фибриногена (рис. 5).

Анализ крови больных ДЭ выявил, что применение солапивена в терапии оказало эффективное влияние на реологическую картину крови. Увеличение ЭФП эритроцитов и связанное с этим улучшение реологии крови, приводящее к восстановлению нормального функционирования микроцнркуляторного русла совпадало с клиническими показателями выздоровления больных. При проведении исследования нейропсихологического статуса пациентов отмечено, что в основной группе больных, получавших препарат пчелиного яда, в отличие от контрольной группы, достоверно снижается степень выраженности цефалгического и веетибулярно-атактического синдромов.

Анализ результатов больных люмбоишиалгией в ходе их лечения с включением солапивена в стандартный курс терапии подтвердил типичность изменений ЭФП и агрегации эритроцитов при апитерапии. Мы полагаем, что однонаправленность изменений ЭФПЭ, показанная и при других видах патологии -гепатите (Матюшичев В.Б., Шамратова В.Г., 1995), инфекционных (Гильмутдинов, 1994) и опухолевых (Гонян, 1993) процессах и др., и характеризующаяся ее снижением,

180 т 170 -160 -150 -

Ш основная группа О контрольна» группа

1Ш

123456789 10 11

Рис.5. Динамика показателей крови у больных с дисциркуляторной энцефалопатией

1-ЭФП отмытых эритроцитов, 2-ЭФП неотмытых эритроцитов, 3-агрегация отмытых эритроцитов, 4-агрегация неотмытых эритроцитов, 5-общее время свертывания крови, 6-начало свертывания крови, 7-копец свертывания крови, 8-время ре-кальцификации, 9-протромбииовое время, 10-фнбриноген, 11-сиаловые кислоты * - р<0,05 по сравнению с исходным уровнем исследуемых показателей.

является отражением общей неспецифической реакции организма на раздражитель. На основании получешгых результатов следует заключить, что ЭФПЭ закономерно изменяется при протекании в организме стрессовой реакции, вызываемой как идущим (независимо от этиологии) патологическим процессом, так и экзогенным стресс-фактором, которым является пчелиный яд. В свете вышеизложенного, изменение ЭФПЭ может быть чувствительным методом выявления определенных этапов стресса различной природы и диагностирования эффективности проводимой терапии больных.

1. Установлено, что пчелиный яд в опытах на донорской крови in vitro (1-10 6 -МО'7 г/мл) и при внугрибрюшишюм введении крысам (0,5мг/кг) вызывает первоначальное уменьшение ЭФПЭ с последующим ее увеличением, сопровождающееся однонаправленным уменьшением агрегации эритроцитов и содержания в них МДА. Мелитгин и фосфолипаза Аг, примененные в пропорциях их содержания в яде, оказывали менее выраженное действие на указанные показатели.

2. Модификация стуктурно-функционального состояния мембраны эритроцитов их инкубацией с нейраминидазой, глютаровым альдегидом и сниженным уровнем АТФ вызывала изменение выраженности ЭФП и агрегации, свидетельст-

Выводы

вующее о роли как белок-липндной фазы, так и структур гликокаликса в проявлении электрокинетических свойств эритроцитов при действии нчелнного яда.

3. Установлено, что фазность изменения ЭФПЭ как в опытах in vitro, так н при введении пчелиного яда животным коррелирует с действием стресс-гормонов: адреналина и кортизола - ЭФПЭ снижается при добавлении адреналина, возрастает при воздействии кортизола в опытах in vitro и не изменяется у сюрреналэктоми-рованных животных. Сюрреналэкгомия также лимитирует уменьшение агрегации н активности ПОЛ эритроцитов при введении ада в организм.

4. Установлено, что гепарин усиливает электрокинетическое и антикоагу-лирующее действие пчелиного яда и лимитирует его дезагрегирующий и антиоксид антный эффекты.

5. Показано, что в условиях альтерации организма, вызванного лучевым поражением крыс и приводящего к снижению ЭФП, повышению агрегации и уровня МДА, апитерапия пчелиным ядом приводит к стабилизации гематологических показателей, что вносит существенный вклад в проявление терапевтического эффекта . Применение апитерапии препаратом солапивен в комплексе лечения больных ДЭ и вертеброгенной любмоишиал-гией приводило к существенному повышению ЭФПЭ с соответствующим изменением реологических свойств крови, что сочеталось с клиническим -улучшением состояния больных.

6. Выявлено, что в условиях различных видов альтерации организма или введения стресс-агента (пчелиный яд) ЭФПЭ характеризуется типичной динамикой изменений и отражает идущую в организме ответную реакцию на экстремальное воздействие. Это.позволяет рекомендовать метод микроэлектрофореза эритроцитов при исследовании крови с целью ранней диагностики развития патологии и проводимой терапии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Смирнова A.B., Ошевенский Л.В., Крылов В.Н. Влияние солапивена на кровь при электрофоретическом введении // Материалы IV Научно-практической конференции по апитерапии "Апитерапия сегодня": Тезисы докладов.- Рыбное: НИИ пчеловодства, 1994.-С.63.

2. Troitskaya V.T., Smimova A.B., Krylov V.N. The influence of the elecirophoretic mobility of erythrocytes // In book: The XXXIV th international apicultural congress of apimondia, Lausanne, 1995,- P.405-406.

3. Смирнова A.B., Крылов В.Н. Дезагрегирующее действие пчелиного яда // Материалы V Научно-практической конференции по апитерапии "Пчелы и ваше

здоровье"(г.Сочи, 9-12окт.1996г): Тезисы докладов.- Рыбное: НИИ пчеловодства, 1997.-С.97.

4. Густов АВ., Дудкина О.В., Смирнова АВ., Крылов В.Н. Солапивен в лечении больных с вертеброгенной люмбоишалгией // Материалы V Научно-практической конференции по апитерапии "Пчелы и ваше здоровье" (г.Сочи, 9-12 окт. 1996г.): Тезисы докладов,-Рыбное, 1997.-С.130.

5. Антипенко Е.А, Анисимова Л.М., Крылов В.Н., Смирнова АВ., Николаев И.Н. Апипунктура у пожилых больных хронической цереброваскулярной недостаточностью // Материалы V Научно-практической конференции по апитерапии "Пчелы и ваше здоровье" (г.Сочи, 9-12 окт. 1996г.): Тезисы докладов,- Рыбное, 1997.-С. 131.

6. Дерюгина АВ. Свертываемость крови и перекисное окисление в условиях действия на организм гепарина и пчелиного яда !/ Экология, здоровье и природопользование. Материалы Российской научно-практической конференции, посвященной 200-летию саратовской губернии (г.Саратов, 10-11 сентября, 1997г.): Саратов, 1997.-С.26.

7. Антипенко Е.А, Анисимова Л.М., Густов АВ., Дерюгина АВ., Крылов В.Н. Эффективность апипунктуры в нейропедиатрической практике //Акупунюурные Белые Ночи: Материалы Второго Европейского конгресса,-Санкт-Петсрбург, 1997,- С.27-28.

8. Дерюгина АВ. Анализ изменения электрофоретической подвижности и агрегации эритроцитов при действии пчелиного яда // Вторая Нижегородская сессия молодых ученых: Тезисы докладов,- Н.Новгород, 1997,- С.213.

9. Gustov AV., Dudkina O.V., Smimova AV., Krilov V.N. Solapiven in the treatment of patients with vertebral lumboisehialgesis // In book: XXXVth intemntiona! apicultura! concress, lst-6th, September, 1997, Antwerp, Belgium. P.203.

10. Хомутов AE., Дерюгина A.B., Зимина T.A. Стабилизация показателей гемостаза при действии пчелиного яда и гепарина // Кислотно-основной и температурный гомеостаз: физиология, биохимия и клиника: Материалы конференции. -Сыктывкар: Сыктывкарский гос. ун-т, 1997.- С 175-178.

11. Антипенко Е.А, Анисимова Л.М., Дерюгина АВ., Густов АВ., Крылов В.Н. Опыт применения апитерапии у пожилых больных дисциркуляторной энцефалопатией // Неврологический вестник,- 1997.- Вып. 3/4,- С.95-97.

12. Крылов В.Н., Дерюгина АВ. Влияние пчелиного яца и его компонентов на электрофоретическую подвижность эритроцитов // Укр. биохим. журн.- 1998.-Т.70.- № 2.- С.36-41.

13. Дерюгина А.В. Влияние гепарина на коагулирующие свойства крови в условиях действия на организм пчелиного яда // Регуляция и управление в биосистемах: Сборник трудов молодых ученых биол. фак. ННГУ.- Н.Новгород: Изд-во ННГУ (в печати).

14. Дерюгина А.В., Дудкина О.В. Изменение гематологических показателей при использовании солапивена в патологии // Регуляция и управление в биосистемах: Сборник трудов молбдых ученых биол. фак. ННГУ.- Н.Новгород: Изд-во ННГУ (в печати).

15. Дерюгина А.В. Исследование терапевтического действия пчелиного ада на систему крови при радиационном поражении организма // Третья Нижегородская сессия молодых ученых: Тезисы докладов.- Н.Новгород, 1998 (в печати).

16. Дерюгина А.В., Попов М.В., Крылов В.Н. Влияние солапивена на электрокинетические свойства эритроцитов // Материалы VI Научно-практической конференции по апитерапии: Тезисы докладов. Рыбное.-НИИ пчеловодства, 1998.-С.57-58.

17. Крылов В.Н., Гусгов В.Н., Дерюгина А.В. Электрофоретическая подвижность эритроцитов и стресс // Физиол. человека.-1998.-Т.24.-№4.-С.1~4.