Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиологический анализ кардио- и вазостимулирующего эффектов пчелиного яда

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Физиологический анализ кардио- и вазостимулирующего эффектов пчелиного яда"

, оа

, Ц №

па правах рукописи

Г \ СУВИГР ГлпгоП «и^пилпопп

------- .......-...........

ф ; ¡ч и ол о гп чг( кип анализ кардко- я 1АЗОСТИМУЛ11РУГОЩЕГО ЭФФЕКТОВ ПЧЕЛИНОГО ЯДЛ

03.00.13 - физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань 1998

РййО 1 Й ьЬишлпсКа НЗ КйфСдрс шИЗКПяЛГКгТ г[ бпОлИМш! '1£лС1!£Кй I» /I Нижегородского государственного университета им. Н.И.Лобачевского

Научный руководитель: д.б.н., профессор В.Н.Крылов

официальные отюнешы: д.б.н., профессор А.Д. Димитриев

Ведущая организация: Московская медицинская академия им. И.Ш.Сеченова

эащи1а С0С10И1СЯ «

¿9»

;та К 113,19,02«

1УУО 1 .в

часе ля (гни диссептаттионногп совета К 113,19,02 на соискание ученой степени кандидата биологических наук в Казанском государственном педагогическом университете по адресу: 420021, Казань, ул. Межлаук-1.

С диссертацией тиг^сно ознакомиться р библиотеке Казанского

государственного педагогического университета.

Автореферат разослан

« »

1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, профессор

Макалеев И.Ш.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Анализ закономерностей взаимодействия организма человека и животных с природными биолопгчески активными веществами был и остается одним из важкейтпкх путей понимания механизмов функционирования живых систем в окружающем мире. Указанные вещества, попадая в организм, вызывают многостороннее действие, в зависимости от их химической структуры, дозы, путей воздействия, могут вызывать как нарушение функций, так и их восстановление при имеющихся нарушениях.

В этом плане пристальное внимание заслуживают физиологически активные вещества, продуцируемые ядовитыми животными - зоотоксины. В настоящее время к зоишкеинам приявляс 1ъя пивышёмный шисрсС, связанный с ¡ix чрезвычайно высокой и специфтеской активностью (Каменская, 1982; Орлов, Гелашвшш, 1985; Крылов, 1995). Как отмечают авторы, такая избирательная активность, выработанная ядовитыми животными в ходе многовековой эволюции для эффективной добычи пищи или защиты,

cuuiäcieiseiuiu, сивс^шспкая в иьчишиши избирательно!'О ПОротсНИЯ наиболее кажнмх интегрипуюм'.их сиг.тем ппгянизмя (нервная, сепдечно-сосупистая) позволила подучить в руки исследователей чрезвычайно тонкие инструменты -блокаторы ионных каналов, дезинтеграторы мембран и т.д. (Овчинников, 1982; Witkop, Gossinger, 1983 и др.).

С другой стороны, вместе с отравляющими свойствами ядов, сегодня все шире начинают использоваться их целебные свойства. Давно известные, но незаслуженно забытые в период увлечения синтетическими лекарствами, указанные природные соединения начинают занимать достойное место в Фармакопеях многих стран.

Наиболее известен в этом отношегаш пчелиный яд, относящийся к нейретокснчесхим ядам (Артемов, 1969). С одной стороны, как типичный яд, он может вызвать гибель человека при ужалении одной пчелой, а с другой -используется в терапии многих заболеваний (Крылов, 1995). Кроме того, выделенные из яда компоненты сказались эффективными инструментами в биологических исследованных. Так, один из хтолппептидсв яда - апампн является селективным блокатором кальций-зависимых калиевых токов и используется в мембранологии (Lazdunski, 1983).

Вместе с многочисленными данными о действии пчелиного яда на нервную систему отмечены и его свойства вызывать изменения функций системы кровообращения. При этом наиболее часто отмечаются гипотензивные свойства пчелиного яда (Артемов, Зевеке, 1967; Люсов, Зимин, 1985; Отроков, Фомина, 1995, Bance,Sliipolini,1986, и др.). С другой стороны, известные данные о снижении пчелиным ядом артериального давления у человека и животных противоречат данным о повышении уровня эндогенных катехоламинов при его внутривенном введении животным (Вик, Брукс, 1970). Имеются также экспериментальные данные о повышении артериального давления в некоторых опытах (Асафова, 1978). Указанные противоречия могут быть заложены в самой композиции яда. Так, апамин пчелиного яда активирует факторы расслабления гладких мышц сосудов (Busse et al., 1985), а другой полипептид - мелиттин -

вызывает сокращение гладких мышц вплоть до их контрактуры (НйЬсппапл, 1080). Мы полагаем, что дальнейший анализ выявленных кардио- и вазостш.гулнрутощ1[х эффектов может служить восполнению теоретической базы о механизмах взаим о действия пчелиного яда с эффекторными системами организма к бьпь востребованным как при лечении отравлений ядом пчел, так к при использовании пчелиного яда в терапии заболеваний человека.

В связи с вышеизложенным в настоящей раиии: проведены исследования по анализу кардко- и вазостимулирухощего эффектов пчелшюго яда. Райота выполнялась в соответствии с планом научно-исследовательских работ кафедры физиологии и биохимии человека и животных ННГУ ( № Госрегистрации 81062913), а также в рамках грантов ( головной совет по биологии - код 2-102-341 и программа"Университеты России' - биология, проект "Зоотоксины в патофизиологии и медицине").

Цель и задачи исследования.

Целыо работы явилось изучение кардио- и вазоешмулирующею эффемоъ пчелиного яда. В качестве материала исследования был использован стабшхизтфстзакньтй растзср гг:сл;:::сгс яда - сслалтеея (еял - раствор, апи-пчела, пен-яд; патент № 2057539 от 10.04. 1996 г. на изобретение «Средство, обладающее обезболивающим действием для парентерального введения). Работа была проведена с раствором яда, изготовлешюм на экспериментальном заводе института органического синтеза Латвийской АН (серия № 01-030491).

При этом решались следующие задачи:

1. Провести анализ гипертензивного и кардиоешмулирующего действия яда в условиях внутривенного введения животным.

2. Изучить кардиотропные свойства солапивепа в условиях изолированного сердца.

3. Изучить кардио- к вазотропкыс свойства б условиях гипсфу::::ц;": системы кровообращения животных:

- ггри обескровливании животных, адреналиновом миокардите аритмиях сердца

при тотальной ишемии изолированного сердца

Научная новизна.

При внутривенном введении пчелиного яда впервые проанализирован его гипертензивньш эффект. Установлено, что стимуляция системы кровообращения является второй фазой действия яда при одномоментном введении. При устранении первой- гипотензивной фазы рефлекторного происхождения капельное введете солапивена сразу приводит к стимуляции сердечной деятельности и повышению сосудистого тонуса. Показано, что кардио- и вазостимулирующий эффекты препарата опосредуются через активацию адренергнческих рецепторов органов- мишеней и связаны с эндогенными катехоламинами.

В опытах выявлено, что кардио - и вазостимулирующее действие пчелиного яда проявляются в условиях гипофункции сердечно-сосудистой

системы. Показано, что солапивен обладает выраженным антиаритмическим эффектом на моделях адреналиновых, бариевых и электрогенных аритмий. Выявлено, что яд позволяет эффективно проводить реанимацию животных после 10-,".«¡мутной клинической смерти, повышая артериальное давление и сократительную активность сердца, способствует восстановлению сердечной деятельности изолированного сердиа крыс после тотальной ишемии и реперфузии, снимает тяжесть морфо-фушашональных нарушений при адреналиновом миокардите.

Теоретическая и практическая значимость работы .

В работе выявлены механизмы вазотоннчсского действия пчелиного яда, его кардиостидГулирующий эффект. Установлено, что солапивен проявляет кярлиостимуптфуюттгре и карпиопрптрктппнре действие R условиях ослабления сердечной деятельности, что позволяет наметить перспективы его внедрения в медицину для терапии и профилактики сердечно-сосудистой патологии.

1. Пчелиный яд обладает выраженным кардио- и вазостпмулирующпч действием, проявляющимся как в условиях интактного организма, так и при альтерации системы кроиооОрашения.

2. Кардио- и вазостнмулирутоший эффект яда в большей мере проявляется при ослаблении функции сердечно-сосудистой системы и связан с эндогенными катехоламинами.

Апробации работы.

По теме диссертации опубликовано 7 работ. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на конференциях по апитерапии (Рыбное.1994; Сочи, 1996; Антверпен, 1997), научном семинаре кафедры физиологии и биохимии человека и животных И!!ГУ (1998).

Структура и объем работы.

Материалы диссертации изложены на 126 страницах машинописного текста, иллюстрированы 17 таблицами и 12 рисунками. Работа состоит из ¿;Всде1П1Я, сиЗира литературы, характеристики материала и методов исследования, результатов исследований, обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего 143 источника, из которых 98 на русском и 45 на иностранных языках.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Опыты были проведены на беспородных животных - кошках (масса 3,0-3,5 кг) и белых крысах (масса 150-250 г), наркотизированных нембуталом (50 мг/кг, внутрибрюшинно). В таблице 1 приведено общее количество использованных животных и их распределение по сериям экспериментов.

Таблица 1

Общее количество животных и распределение по сериям экспериментов

Наименование серий экспериментов Вид животных Количество

Анализ лардко- и Вазостнмулирующих свойств солапивена

1. Вну 1ривснкос введение КО ШШ1 крысы крысы 41 "0

2. Изолированное сердце 54

Анализ кардио- и вазостимулирующих свойств солапивена при гипофункции сердечно-сосудистой системы

¿.Клиническая смерть и реанимация крысы 4L»

4.Миокардит крысы 36

5. Аритмии кошки крысы 16 48

Всего животных 265

Л тут гттгг, vnn-trtrt_ Т* II ' -J т ITU .Л т т 1 Г J Г>Т1 ГЧ If П П Г»1 ГЦ JTJO t Ю ГТП1 Г

внутривенном введении. У животных регистрировали ЭКГ во 2 стандартном отведении, периферическую реограмму, систолическое артериальное давление (САД). Для анализа сократительной способности сердца кошек, в условиях торакотомии и ИВЛ, по данным прямой манометрии левого желудочка рассчитывались скорости нарастания давления (dp/dt шах), развиваемого давления, максимальной скорости расслабления (- dp/dt max) в левом желудочке (Меерсон, Капелько,1970; Мелентьев, 1978).

Для выяснения некоторых механизмов действия солапивена на мекфофизио логические характеристики сердца, при искусственном дыхании и торакотомии определялась длительность рефрактерного периода сердца кошки (Гацура,1974).

Наряду с одномоментным введением солапивена применяли капельное введение- «биологическое титрование». С целью анализа механизмов изменения АД использовали различные фз—л—т^пттогнч^ски^ ягрнты в общ^плххнятых доз-х а также основной полипептид пчелиного яда мелиттин.

В следующих сериях анализ кардио- и вазостимулирующего эффектов яда был проведен в условиях моделирования гипофункции сердечно-сосудистой системы.

Клиническая смерть и реанимация, Обескровливание крыс вызывали свободным кровопусканием из общей сонной артерии до остановки дыхания и падения артериального давления до неопределяемых величин. По истечении 10 мин клинической смерти осуществляли реанимационные мероприятия, при которых аугокровь с пчелиным ядом или веществами сравнения внутриартериально вводили животному. Реанимационные мероприятия проводились в течение 40 минут.

Адреналиновый миокардит.. Крысам-самцам, с целью воспроизведения миокардита вводилось одномоментно 0,6 мл 0,1% раствора адреналина гидрохлорида внутрнбрюшшшо (Андреев, 1973).

В опытной серки крысам ежедневно, в 1ечение 10 дней, виу 1ри6рюшннно вводился солапивсн (0.05 мг/кг) и на 11-й лень - адреналин. Животным контрольной группы вводился физиологический раствор

На протяжешн: эксперимента (15 дней) оценивали влияние пчелиного яда на выживаемость крыс, функциональную активность сердца и уровень перекисного окисления липидов (ПОЛ)в миокарде. Для гистологического исследования в конце эксперимента из препаратов сердца готовились срезы, которые окрашивали гематоксилин-эозином и просматривали в световой

МШСПОСКПП

фармакологических (введение хлористого оария, адреналина) и элсктрогенных моделях аритмии. Солапивсн и антиаритмические средства сравнения вводили предварительно или на фоне развившихся аритмий.

В сепии опытен с мппепиппиянием ччектпогенных аритмий псушеггнляпн пряг.гуто электростнмуляцию сердца крыс со вскрытой грудной клеткой через электроды, установлешпле на ушко правого предсердия и верхушку сердца. Измеряли амплитуду раздражения, при которой возникала фибрилляция желудочков. После измерения порога раздражения в контроле определяли его величш<у после предварительного введения солапивена.

Анализ кардиотропных свойств солаливена на изолированном сердце. Зксттеримешы бь1ли выполнены на изолированном сердце лимс но Лангсндорфу. У животных извлекали сердце и перфузировалн

оксигенированкым раствором Кребса-Ханзеляйтг при температуре 37 С. В этих условиях исследовали сократительную функцию сердца по методике Fallen et al (1967). На основан]!!! регистрируемых кривых Екутрижслудо!1коЕого давления определяли конечное диастолическое давле1ше (КДД), частоту сердечных сокращений (ЧСС), развиваемое давление (Рр) и скорости развития (+dP/dt) и падения (-dP/dt) давления и коронарный отток перфузата. Пчелиный яд добавляли в перфузат на фоне регистрируемых показателей.

С целью анализа кардиотропных свойств пчелиного яда в условиях гипофункции изолированного сердца использовали модель его тотальной ишемии. Ишемическая остановка сердца осуществлялась путем одновременного пережатия аорты и наружного охлаждения миокарда до температуры 8-10 С и длилась 90 минут, после чего осуществлялась реперфузия. На 7 минуте реперфузии измеряли коронарный кровоток и исследовали сократительную функцию сердца, после чего сердце замораживали в жидком азоте и проводили анализ содержания иродукюь ПОЛ (диеновые коньклаты и основания Шиффа) в миокарде по Ланкнн и др., 1979, Fletcher, 1973. Солапивен добавляли в перфузат перед ишемией или внутрибрюшинно животным за 1-3 суток до опыта.

Полученные результаты обработали статистически (Ойвин, 1959). Достоверность различий оценивали с применением критерия Стьюдента при р<0,05.

Результаты исследований и их обсуждение

АНАЛИЗ КАРДИО- И ВАЗОСТЙМУЯИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ СОЛАПИВЕНА ПРИ ВНУТРИВЕННОМ ВВЕДЕНИИ

В экспериментах на кошках и крысах было установлено, чю реакция сердечно-сосудистой системы животных при внутривенном введении раствора 11ЧСЛИЖНО и Да НОСШ1с1 СЛОЖ11ЫИ Характер, ЗаБНСЯЩПП КаК от ДОЗЫ, ТЦК и ог

исходного уровня САД животных и способа введения. Введение малых доз солапивена(0,01-0,05 мг/кг) приводило к незначительному снижению САД(10-20% от исходного уровня), которое через 1-3 мин восстанавливалось до исходного уровня. Ъолюсное введете солапивена в более значительных дозах (0,2-2 мг/кг), как правило, также приводило к первоначальному, относительно скоротечному падению артериального давления. Однако затем, вслед за его восстановлением следовало продолжительное (10-30 мин) возрастание САД выше исходного уровня (на 25-40%). Измените периферической реограммы, отражающей перераспределение крови в организме в этот период, коррелггрегало с указанными фазами изменения САД. Первоначальное повышение амплитуды пеограымы приходилось на фазу снижетиг давления крови, а ее понижение - на фазу восстановлен»;; и подъема артериального давления. Анализ сократительной функции сердца кошек, показал, что в фазу подъема артериального давления и снижения периферической реограммы давление в левом желудочке сердца значительно возрастало. Увеличивались основные показатели сократимости - максимальная скорость нарастания и падения давления в изоволюмическую фазу (табл. 2).

Таблица 2.

Изменение функции кровообращения кошек при одномоментном и

КаисльНОМ ВНухрйВСННОМ пвсДСНпп СОЛаПйвСНа.

Показатели Исходные параметры Время (мин) после введения

1 ! 3 1 15

Одномоментное введение

ЧСС, уд/мин 108±13 102+10 104±17 10818

Рсограмма (ампл., мм) Г Г» 1 п п 13,412,7 * 8,2±0,6 6,711,3

(1р/си шах (мм.рт.ст./с) 1720±30 1800+15 4200150* 1750140

Капельное введение

ЧСС, уд/мин 90+12 102±15 108±18 102+15

Реограмма (ампл., мм) 6,0+1,0 8,9±2,1 7,1±0,5 5,912,0

с1р/с11 шах (мм.рт.ст./с) 1800±45 1960+75 2070165* 3050170*

Примечание: *- отмечены показатели, существенно отличающиеся от исходного уровня (р<0,05).

Более выраг-кенное кардио- и вазоетимудирующее дейстчир пчелиного яда было установлено при ею биологическом титровании (капельное введение): в этих условиях фаза снижения АД и сократительной функции сердца огсутс !вовала н проявлялась только 2-я фаза - пшерф-ункыин системы кровообращения (табл. 2).

Важные результаты были получены в опытах на животных, у которых артериальное давление было исходно ниже среднего уровня (менее 100 мм рт ст.: 60- 80 мм рт.ст.). В этих случаях гипертензия и кардиостимуляция на введение солапивена проявлялись так же, как и при капельном введении, - без первоначальной фазы гипотензшт, приводя к повышению САД на 5-15-й мин до 133-145 мм рг.иг.

Таким образом, было установлено, что кардио- и вазостнмулируюшие эффекты пчелиного яда более выражено, проявляются в отсутствие рефлекторных гистамтшэргических реакций, а также при гипофункции системы кровообращения животных.

: ! 1'г" оььчо уС1аНо»лспО, 410 ввеДсггИс

СОняпииеня -ж-инптным ня фоне чрнгтмня Гпок-атпря агтъфя-апренореиепторов

сосудов дигидрозрготокстпи, существенно ослабляло его гипертеюивиын эффект. Гиперфункция системы кровообращения не проявлялась также и в опытах с введением яда на фоне истощения депо катехоламинов резерпином. Из этих результатов следует, что гтшертензивный эффект пчелиного яда может быть опосредован эндогенными катехоламинами.

Как было показано выше, в опытах отчетливо проявилось кардиостимулирующее действие яда, которое ослаблялось при предварительном введении животным блокатора бета-адренорецепторов обзидана (1 мг/кг). Так, гипертензивный эффект пчелиного яда существенно ослаблялся и составлял 1020 % от исходного уровня. Такнл: образом, реакция гкпертензни на введение солапивена может быть обусловлена не только повышением сосудистого тонуса, но и повышением сократимости сердца.

Повышение функциональных характеристик сердца, таких как скорости

в ответ на введение яда реализуется соответствующим повышением его электрофизиологических характеристик. В опытах было установлено, что внутривешюе введение солапивена в дозе 0,2 мг/кг приводило к уменьшению рефрактерного периода с 192 + 7 мс до 172 + 6 мс на 1-5 минутах, с последующим восстановлением. Поскольку рефрактерный период отражает возбудимость и лабильность сердца, можно считать, что кардиостимуляция пчелиным ядом находит свое электрофизиологическое обеспечение. Учитывая, что катехоламтпгы непосредственно повышают указанные электрофизиологические характеристики сердца, можно предположить, что повышение их уровня в крови животных при действии пчелиного яда опосредует его кардиостимулирующее действие.

На основашш описанных результатов можно заключить, что кардио- и вазостимулирующие эффекты пчелиного яда при внутривенном введении животным могут быть опосредованы через активацию адренергических

механизмов системы кровообращения континиумом катехолашшов, выделившихся в ответ на введение стресс-агента - пчелиного яда.

КАРДИО- И ВАЗОСТИМУЛИРУЮИЩЙ ЭФФЕКТ СОЛАПИВЕНА В

УСЛОВИЯХ ОБЕСКРОВЛИВАНИЯ И РЕАНИМАЦИИ ЖИВОТНЫХ.

Кате следует из вышеописанных опытов кардио- и Еазосткмулирующие эффекты пчелиного яда более выражено проявлялись при исходной гипотензии. Поэтому мы предположили, что эти эффекты будут в большей степени реализовыватьея при гипофункции системы кровообращения и приводить к сс коррекции.

Это положение было подтверждено в опыт?.х с обсскрокдииянием жиь о тных. Было показано, что 1> контрольных 31чспер*".1снтах рсанигиация после 10-минутной клинической смерти - ИВЛ, закрытый массаж сердца, возмещение аутокрови - приводила к восстановлению вегетативных функций (АД, ссрдсчная деятельность, дыхание) у 30% животных. У остальных самостоятельное дыхание не вос-ствня.вднвядось до конца экспртшментя и пи было зарегистрировано более позднее восстановление дыхания, значительно более выраженная брадикардия и низкий уровень САД.

В отличие от контрольных экспериментов, добавление в нагнетаемую

Ет*-1 гттщптйптгп пт тгл от ЛГ1Т ллттиттттат»1 п ттлол Л Л^.П 1 »гг/»лг ЛГТЛОЛ^ОТТЗЛООПЛ

более быстрому восстановлению самостоятельных сердечных сокращений, дыхания и подъему артериального давления (табл.3).

Кроме того, после реинфузии животному собственной крови с раствором солапииена, в половине опытов не требовалось применения непрямого массажа сердца для поднятия артериального давления и восстановления сердечной деятельности. ГТр" сравнении эффективности действия па данной модели веществ, используемых в реаниматологии, было показано, что эффективность реанимации с применением солапивена была сравнима с эффективностью катехоламина дофамина.

Таблица 3.

Изменение САД (к 100 % исходного уровня, М ± т) крыс в процессе реанимации после 10-минугной клинической смерти с использованием солапивена (0,2 мг/'кг): при добавлении в нагнетаемую аутокровь (опыт 1) и при предварительном в/в введешш (опыт 2).

Серия опытов Время после начала реанимации (мин)

1-2 12-15 25-30

Контроль (п=10) 41,9+ 8,3 64,1+ 11,2 32,4 + 6,6

Опыт 1 (п=8) 70,5 + 5,5 * 85,1+ 10,0 61,5+ 10,5 *

Опыт 2 (п=7) 115,1+ 9,6*,** 98,4 + 9,8 * 87, 7+ 8,5 *

Примечание: * - отмечены существенные (Р<0,05) различия показателей между опытом и контролем; ** - между опытом 1 и 2.

В другой серии экспериментов солапизен добавлялся не в аутокровь перед реипфузией, а вводился животному за 3 мин перед кровопусканием. В этих условиях было установлено, чш эффективность реанимационные мероприятий была въппе. чем в предыдущей серии опытов. Так, если в контроле самостоятельное дыхание восстанавливалось через 13,3 + 1,1 шш, в опытах с добавлением препарата в аутокровь - через 7,8 + 0,6 мин, то в опытах с предварительным введением солаиивена животным - через 6,5 + 0,5 мин. Аналогичное преимущество предварительного введения солашшена было установлено и со стороны артериального давления (табл.3).

Мы полагаем, что выявленное повышение эффективности реанимации может развиваться ПО гттедуютпей ттепи- предварительное введение яла. приводит разпппло стрессовой реакции па ведение экзотоксина и активирует эндогенные нейрогуморальные регуляторкые системы перед обескровливанием; это создает определенный фон с повышением содержания в крови катеходаминов и других стресс-гормонов перед обескров.шпшшем, что птвопяет более эффективно стимулировать функции сердечно-сосудистой и дыхательной систем в период реанимации, после реинфузии такой аутокрови,

АНТИГИПОКСМЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ СОЛАПИВЕнА ПРИ АДЕНАЛИНОВОМ МИОКАРДИТЕ.

Принимая во снимание результаты опытов предыдущей серии, мы предположили, что адаптогенное действие яда пчелы, связанное с созданием в организме «¡шехоламиновою фона» можег уменьшать и тяжесть токсических эффектов катсхоламкнов. Для этого были проведены эксперимент;,: с воспроизведением миокардита у крыс введением токсической дозы адреналина.

В ходе экспериментов в данной серии из 30 крыс с адреналиновым миокардитом ка 2 с утки заболевания погибли 3 крысы контрольной группы, что свидетельствовало о тяжести моделируемой патологии. В отличие от этого, в опытной группе, где животным предварительно, перед введением токсической дозы адреналина, на протяжении 7 дней ежедневно вводился солапивен, гибели животных не наблюдалось в течение всего эксперимента.

Курсовое введение солаиивена улучшало характер ЭКГ относительно контроля. Анализ биоэлектрической активности сердца в этой группе показал увеличение амплитуды комплекса QRS в 1,7 раза, что составило 110,9% по отношению к ннтактным животным. Применение солаиивена не нарушало сердечного ритма, то есть не оказывало отрицательного воздействия на ритмогенную активность сердца в условиях адреналинового миокардита.

Выявленные ритмостабилизирующие свойства солапивена при профилактике животных с адреналиновым миокардитом свидетельствуют о его кардиозащитном действии не только функции, но и структуры. Гистологический анализ изменений структуры миокарда показал, что проявления патологических изменений (деструкция кардиомиоцитов, периваскулярный отек и др.) под воздействием пчелиного яда были ниже, чем в контрольной группе.

il

Содержание МДА, отражающего активность ПОЛ, в сердечной мышце крыс, прошедших курс профилактики сплашшеиом. снизилось по сравнению с повышенной концентрацией МДА в сердце контрольных животных. 11 было сравнимо с уровнем в миокарде интактных животных (табл. 4).

Таблица 4

Концентрация МДЛ /нМоль/г ткать' г. сердце крыс при профилактике адреналинового миокардита солаххивеном.

Серия Пнтакгные животные Контроль Профилактика солапивсном

М 1,94 4,21 1,65

±т V, ¿0 и,/о

п 6 14 6

Р< 0,05 0,05

Таким образом, следует заключить, что использование пчелиного яда б качестве кардионротекторного средства при адреналиновом миокардите, позволило существенно уменьшить биохимические и морфологические нарушения в ал± г-грированнон миокарде и нормализовать функциональную активность сердца. Можно предположить, что КатсхоламнноБая ластроика организма и ответ на хроническое действие яда приводит к соответствующей адаптации миокарда к токсической дозе адреналина.

КАРДИОТРОТЕКТОРНЫЕ СВОЙСТВА ПЧЕЛИНОГО ЯДА ПРИ НАРУШЕНИЯХ РИТМА СЕРДЦА Результаты предыдущей серии опытов позволили предположить, что ¡щашигсммыс свойства пчелиною яда, защищающие сердце от юмлчссмли воздействия адреналина, могут реализоваться и при других проявлениях этого действия. Для этого мы изучили кардиотропные свойства солапивена при нарушениях сердечного ритма, вызываемых с участием катехоламинов.

Ка адреналиновой модели аритмий, которая имитирует перевозбуждение симпатической регуляции сердца с соответствующим нарушением процессов медленной диастолической деполяризации клеток водителя ритма, было установлено, что солапивен, вводимый предварительно в дозе 0,2 мг/кг эффективно предупреждал нарушения ритма сердцебиений. Так, внутривенное введение адреналина в дозе 20 мкг/кг вызывало через 5-15 с появление желудочковой экстрасистолии, продолжающейся 3-5 мин. Предварительное введение солапивена у 50% животных полностью предупреждало возникновение экстрасистолии, а в остальных случаях уменьшало их продолжительность и увеличивало латентный период их возникновения. Сравнительные опыты показали,что аналогичный эффект оказывали известные антиаритмики 1-й группы новокаинамид (5 мг/кг) и этацизин (1 мг/кг). Однако, антиаритмическое действие солапивена отличалось тем, что препарат пчелиного яда не вызывал снижения биоэлектрической активности сердца, оцениваемой по амплитуде ЭКГ. Таким образом, повышение амплитуды ЭКГ в этих опытах также

доказывает кзрдностимулирующее действие пчелиного яда, установленное выше.

Важные результаты, доказывающие карлиозашитные свойства силанмвеш, были получены на электрогешюй модели аритмий. В опытах с прямым электрическим раздражением сердца крыс было шж;иаш>, -по препарат существенно повышает порог раздражения, необходимый для возникновения фибрилляции желудочков сердца крыс(табл. 5).

Влияние солапивена (0,2 мг/кг, в/в) на электрический порог фибрилляции сердца крыс (В) при прямом электрическом раздражении.

Показатели

М +111

п = У

До введения

0,87 +.0,1

После введения солапивена

1,4.3 и,/

г <•

Проведенные эксперименты позволили заключить, что модификация нейрогуморальной регуляции рнтмогенней функции сердца под влиянием пчелиного яда, позволяющая повысить ее устойчивость к альтерации, может обеспечиваться мембраностабилизирующими механизмами. В этом случае, пчелиный яд мог быть эффективным на модели нарушения функции мембран с известным механизмом действия, например, хлористым барием (Меерсон.1985).

В серии опытов с моделированием аритмий введением хлористого бария было установлено, что в контрольной группе при достижении токсических концентраций агента, в результате дестабилизации мембран и нарушения ионно-обменных процессов, возникала политопная экырасисголия, перемежающаяся желудочковой тахисистолией, переходящая по мере дальнейшего титрования аритмика к асистолии. Предварительное введение солапивена в дозе 0,4 мг/кг в определенной мере препятствовало как возникновению аричмий, так и токсической остановке сердца. Было установлено, что на фоне введенною препарата существенно увеличивалась доза хлористого бария вызывающая аритмии и остановку сердца (табл. 6)

Таблица 6.

Влияние солапивена (0,4 мг/кг, в/в) на хлорбариевые аритмии сердца крыс

Серия экспериментов Доза хлористого бария, вызывающая (мг/кг, М +.ш)

Аритмии Остановку сердца

Контроль (п=9) 0,046 + 0,005 0,072 ±0,01

Солагошен (й=7) 0,085 +. 0,01 0,111+.0,02

Р<0.05

Таким образом, полученные нами экспериментальные данные, подтверждают имеющиеся данные литературы о наличии у пчелиного яда выраженных антиаритмических свойств. Мы полагаем, ни ритмостабилидирующее действие солашшена опосредуется через несколько механизме!!, одним из которых может быть мембраностабллизирующсе действие, как компонентов яда, так и нейрогормональных механизмов регуляции ритма сердца. Следует отметить, что пчелиный яд не оки:<ыкае1 кардиодепресснвного действия - не угнетает биоэлектрическую и функциональную активность сердца при стабилизации сердечного ритма.

ВЛИЯНИЕ СОЛАПИВЕНА НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ И ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ ИЗОЛИРОВАННОГО СЕРДЦА.

Установленное в опытах с внутривенным введением пчелиного яда его кардиостимулирующее и кардиоиротекторное действие могло быть результатом как активации нейро-гуморальной регуляции сердечной деятельности, так и непосредственного действия яда на миокард. С целью выяснения данного вопроса были проведены опыты на изолированном сердце крыс.

Б опытах было установлено, что добавление пчелиного яда в перфузат изолированного сердца в "азведениях 10 3 — 10 ' г/мл не приводило к каким-либо существенным изменениям параметров его функциональной активности. При повышении концентрации раствора яда до 1(Г6 г/мл происходило угнетение сердечной деятельности, выражающееся в уменьшении показателей сократимости: скоростей повышения я еннжеккл давления б левом желудочке б кзоЕодюмичесхую фазу (dp/dt), разнимаемого давления, коне'пю диастолического давления. В меньшей степени это отражалось на оттоке перфузата из коронарных сосудов и ритме сердцебиений.

Таким образом, в отлитие от внутривенного введения, при непосредственном действии на сердце пчелиный яд в действующих концентрациях не приводил к стимуляции его деятельности, а наоборот, снижал сократимость сердца. В то же время, можно было предположить, что кардиостимулирующие свойства яда могут проявиться в условиях исходно сниженных его функций, как это было показано в опытах с внутривенным введением. Поэтому в дальнейших экспериментах мы изучили действие яда в условиях гипофункцию изолированного сердца путем создания тотальной ишемии.

В серии контрольных экспериментов было установлено, что реперфузия после 90 мин. ишемии, при температуре 8-12 С, изолированного по Лангендорфу сердца крыс физиологическим раствором, приводила к восстановлению сердечной деятельности через 94±14 секунд после начала реперфузии. К 7 мин. реперфузии (контрольный период) ритм и амплитуда сердцебиений только в 70% опытов достигали исходной величины. В остальных экспериментах они оставались достоверно (р <0,05) ниже исходного уровня. При этом конечное диастолическое давление(КДД) возрастало на 22%, что свидетельствовало о возникающей миофибриллярной контрактуре. Существенно уменьшался отток

перфузата из коронарных сосудов, свидетельствуя о повышении их тонуса. Ритм сердечных сокращений на протяжении всего перипла реперфузии был нерегулярным, с частым возникновением экстрасистол. В отдельных опытах наблюдалась фибрилляция сердца с последующей остановкой.

13 опытной серии - с добавлением содапнгсна в перфузат в действующей концентрации было установлено, что при реперфузии восстановление сердечной деятельности по скорости существенно не отлзгталось от контрольной серии опытов. Однако, в отличие от контроля, в ряде опытов уже на 2 мин реперфузии и до конца эксперимента регистрировался синусовый ритм сердца. Существенно в меньшей степени уменьшались показатели сократимости сердца: развиваемое давление, скорость нарастания давления в изоволюмическую фазу изменялись незначительно по отношению к доишемическому уровню В отличие от

контроля не было отмечено уменьшении оттока перфузата из коронарных сосудов.

Таким образом, добавление пчелиного яда в перфузат изолированного сердца в условиях его гсгпофункцтги существенно ослабляло ишемичесже нарушения его деятельности. Выявленные кардиозащитные свойства яда могут быть связаны с коррекцией нарушенного метаболизма в клетках миокарда, что было подтверждено нами при анализе ПОЛ, активирующегося при ишемии миокарда.

Было показано, что добавление в перфузат препарата пчелиного яда приводило в восстановительном периоде к существенному уменьшению продуктов ПОЛ в миокарде реперфузируемых сердец. Так, по сравнению с контролем при действии солапивена содержание ДК и ОШ уменьшилось в 2 раза. Опыты показали, что по силе влияния на интенсивность ПОЛ миокарда крыс в постишемкческий период солашгоен превосходил взятые для сравнения известные антиоксиданты буфотин и гутимин.

Так же вырнжено капд?*оз?.щи*п?ые свойств?, пчелиного ядя проявились при его предварительном введении крысам перед изоляцией и ишемией сердца. Опыты с введением солапивена (0,05 и 0,2 от/кг, внутрибрюшинно) животным за сутки до изоляции сердца и проведения эксперимента показали более полное

опл/>тЧ1т пппашш лл^ат^гтошгглЛ <1ч'1-1-ттт1т1 лапттч п папмлт ">т!Ч

---------------— "-]»—г*

В указанных экспериментах проявилось выраженное ритмостабилизирующее действие препарата. Так на 5 минуте реперфузии во всех опытах регистрировался правильный синусовый ритм сердца, не превышающий по частоте исходную ЧСС. На 7 мин. реперфузии наблюдалось практически полное восстановление сердечной активности (р<0,05). Важно отметить, что при этом не наблюдалось возрастания КДЦ, как это было установлено в контроле. Из приведенных результатов следует, что адаитогениое действие солапивена при предварительном введении в организм привело не только к стабилизации ритмогенной функции сердца, но и снизило его постишемическую миофибриллярную контрактуру.

Таким образом, в проведенных нами экспериментах Солапивен оказал эффективное защитное действие на миокард при тотальной ишемии изолированного сердца. Можно заключить, что превентивное внутрибрюшинное введение, или добавление в перфузат солапивена перед ишемией вызывает в

кардиомиоцитах формирование адаптационных реакций, позволяющих обеспечить лучшую сохранность миокарда в период ишемии и на начальных этапах реперфузии.

И1ЛС1ПГТ1Л

1. При внутривенном введении наркотизированным животным (кошки, крысы) раствора пчелиного яда (солапивена) в дозах, вызывающих обратимый эффект, вслед за кратковременной реакцией гипотензии следует продолжительная гипертензивная реакция.

2. Гипертензивная реакция животных обеспечивается повышением тонуса сосудов и усилением сократительной активности сердца, и проявляется в виде уменьшения амплитуды периферической рсограммы и повышения показателен сокпэтимости мипкапдя. уменьшения рефрактерного периода серппа. Эта реакция реализуется путем активации адрснсргическкх рецепторов сердца и сосудов, и уменьшается после блокады альфа- и бета-адренорецепторов, и резерпинизацни животных.

3. Выражешюсть гиперфупкцтш системы кровообращештя зависит от условий введения пчелиного яда (капельно или одномоментно) и исходного уровня артериально!о давления живошош. Наиболее существенная реакция

ТиаСрТсШИИ И КарДИОС ХИмуЛлЦиИ ЬЫЛВЛСНЛ у ЖИВОТНЫХ С ИСХОДНЫМ ииЗЮШ

артериальным давлением.

4. Кардио- и вазостшуГу'лирующес деиствис пчелиного яда проявляется в условиях гипофункции системы кровообращения - обескровливании крыс и 10-минутной клинической смерти. При реанимации - добавлении в реинфузкруемую кровь, г также в кровоток перед кровопотерей, солаштвен способствовал более быстрому восстановлению адекватной кардиогемодинамики и дыхания животных по сравнению с контролем.

5. Профилактическое введение крысам солапивена в качестве адаптогена уменьшало тяжесть морфо-функииональных нарушений при адреналиновом миокардите. Это выражалось в торможении активности ПОЛ, увеличении биоэлектрической активности сердца, меньшей выраженностью деструктивных изменений миокарда по сравнению с контролем.

6. Солапивен при внутривенном введении обладает выраженным кардиозатцитным действием при нарушениях ритма сердца Он предупреждает аритмии, вызванные внутривенным введением животным адреналина, хлористого бария, электрическим раздражением. В отличке от известных антиаритмиков (этмозин, новокаинамид) пчелиный яд не угнетает ЭДС сердца.

7. Пчелиный яд в исследованных концентрациях не вызывал кар дно стимул иру ю ще го эффекта при непосредственном действии на изолированное сердце крыс. В то же время в условиях гипофункции - тотальной ишемии изолированного сердца крыс, установлено кардиопротекторное действие солапивена, вводимого перед ишемией. Это проявлялось в стабилизации функциональной активности сердца, торможении ПОЛ миокарда в период реперфузии, что приводило к уменьшению времени восстановления правильного синусового ритма, нормализации индексов сократимости сердца, коронарного кровотока в постишемический период.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сабурцев С.А., Бобылевя П л., Крылов В.Н. Анализ гинертензивного эффекта пчелиного яда // Вестник Нижегородского государственного университета им, Н.И.Лобачевского: Сб. научн. -грудой ¡шоиишпоа. Н.-Новгород: Изд-во ННГУ, 1995. -С. 12-14.

2. Крылов В.Н., Парни С.Б., Кузьмин Е.1., Сйиурцев С.А. ьуфогкн и налорфин в экспериментальной терапии геморрагического шока // X Всероссийский пленум анестезиологов и реаниматологов: Тез. докладов. Н.Новгород, 1995,- С. 9*5.

3. Krylov V.N., Moukhina I.V.. Sabourtzev S.A. Les eilets thérapeutiques üu "solapiven" sur ¡es maladies vaseuiaires // XXXV Congres international u' apiculture: Résumés des rapports. Anvers, Belgique, 1997-P.129.

4. Крылов В.П., Миши И.Б., Сабурнев С.А. Терапевтический ¿ффе.м солагпгеепа на моделях патологии кровообращения // Материалы ^ Научни-пряктич канф до апитерапии "Апитерапия сегодня". Рыбное. 1997. - С. 88-90.

5. Сабурнев С.А. Исследование реанимирующего действия препарата пчелиного яда солапивена // Вестник Нижегородского государственного университета им. Н.И.Лобачевского. Сер. Биол. Вып. 1. Н.-Новгород: Изд-во ННГУ, 1998.-С. 122-124.

6. Крылов В.Н., Сабурцев С.А., Подобухова Л. Н. К вопросу об антиаритмическом эффекте солапивена // Материалы б Научно-практич.конф. по

--„------,— «А-------------.—....—" Т1----- irtoo О П1 тз

шш 1 tpaiirii-i ¿TaLnibpaiiJ'La vciv^La • 1 л-uuuj, ~ > i-'->.

7. Сабурцев C.A., Ястребова E.B. Кардио- и вазостимулирующие свойства яда пчел // Матер, копф. молодых ytïû;России с мелсд. участием

_______________т._ ___________________. _ _______________* * ТТ„ —--AiïXiA

Ч'умдамсп 1ОЛЬМЫС I1.1V t\ И И ilpuipc^ J\JiluliintcI4Üil л i Ь, l II и м 11 > " . .H., 11.1,1 114 >1.11. 1

им. И.М.Сеченова, 1998.-С. 171-172.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сабурцев, Сергей Александрович, Нижний Новгород

Нижегородский государственный университет им. Н.И.Лобачевского

На правах рукописи

Сабурцев Сергей Александрович

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КАРДИО- И ВАЗОСТИМУЛИРУЮЩЕГО ЭФФЕКТОВ ПЧЕЛИНОГО ЯДА

03.00.13 - физиология человека и животных

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д.б.н., профессор В.Н.Крылов

Нижний Новгород - 1998

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 4

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9

1.1. Физико-химические свойства и биологическая активность пчелиного яда. 9

1.2. Влияние пчелиного яда и его препаратов на систему кровообращения 18

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 34

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ 48

3.1.Анализ кардио- и вазостимулирующего действия пчелиного

яда при внутривенном введении животным 48

3.2.Кардио- и вазостимулирующий эффекты солапивена

в условиях обескровливания и реанимации животных 66

3.3. Антигипоксическое действие солапивена

при адреналиновом миокардите 70

3.4. Кардиопротекторные свойства пчелиного яда

при нарушениях ритма сердца 76

3.5. Влияние солапивена на функциональную активность

и перекисное окисление липидов изолированного сердца 83

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 105

ВЫВОДЫ 110

Список литературы 112

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АД, САД - артериальное давление

ДК - диеновые конъюгаты

КДД - конечное диастолическое давление

МДА - малоновый диальдегид

ОШ - основания Шиффа

ПОЛ - перекисное окисление липидов

Р р - развиваемое желудочком давление

ЦВД - центральное венозное давление

ЧД - частота дыхания

ЧСС - частота сокращений сердца

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭКГ - электрокардиограмма

± - dp/dt - максимальная скорость нарастания

и падения давления в левом желудочке сердца

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Анализ закономерностей взаимодействия организма человека и животных с природными биологически активными веществами был и остается одним из важнейших путей понимания механизмов функционирования живых систем в окружающем мире. Указанные вещества, попадая в организм вызывают многостороннее действие, в зависимости от их химической структуры, дозы, путей воздействия, могут вызывать как нарушение функций, так и их восстановление при имеющихся нарушениях.

В этом плане пристальное внимание заслуживают физиологически активные вещества, продуцируемые ядовитыми животными - зоотоксины. В настоящее время к зоотоксинам проявляется повышенный интерес во всем мире ( Каменская, 1982; Орлов, Гелашвили, 1985; Гелашвили, 1989; Крылов, 1995). Этот интерес связан с чрезвычайно высокой и специфической физиологической активностью соединений, получаемых их животных ядов. Как отмечают авторы, такая избирательная активность, выработанная ядовитыми животными в ходе многовековой эволюции для эффективной добычи пищи или защиты, соответственно, совершенная в отношении избирательного поражания наиболее важных интегрирующих систем организма (нервная, сердечно-сосудистая), позволила получить в руки исследователей чрезвычайно тонкие инструменты исследования. Так, тетродотоксин - яд из рыбы Фугу, и сакситоксин - яд моллюсков, избирательно блокирующие натриевые каналы мембран клеток, широко используются в электрофизиологических исследованиях ( Каменская, 1982; \¥йкор, Ооэз^ег, 1983 и др.). При моделировании активации ионных мембранных токов применяются нейротоксины скорпиона, колумбийской лягушки (Овчинников с соавт.,1982).

С другой стороны, вместе с отравляющими свойствами ядов, сегодня все шире начинают использоваться их целебные свойства. Давно известные,

но незаслуженно забытые в период увлечения синтетическими лекарствами, указанные природные соединения начинают занимать достойное место в Фармакопеях многих стран.

Наиболее известен в этом отношении пчелиный яд, относящийся к нейротоксическим ядам (Артемов, 1969). С одной стороны, как типичный яд, он может вызвать гибель человека при ужалении одной пчелой, а с другой - используется в терапии многих заболеваний. Лечение пчелиным ядом лежит в основе современной апитерапии, основанной на применении продуктов пчеловодства и широко распространенной в мире. В разных странах даже организованы ассоциации врачей, лечащих при помощи пчелоужалений (Кривцов, 1995). Кроме того, выделенные из яда компоненты оказались эффективными инструментами в биологических исследованиях. Так, один из полипептидов яда - апамин как селективный блокатор кальций-зависимых калиевых токов используется в мембранологии ( Lazdunski, 1983 ).

Вместе с многочисленными данными о действии пчелиного яда на нервную систему отмечены и его свойства вызывать изменения функций системы кровообращения. При этом наиболее часто отмечаются гипотензивные свойства пчелиного яда ( Артемов, Зевеке, 1967; Люсов, Зимин, 1985; Отроков, Фомина, 1995 и др.). С другой стороны, известные данные о снижении пчелиным ядом артериального давления у человека и животных противоречат данным о повышении уровня эндогенных катехоламинов при его внутривенном введении животным ( Вик, Брукс, 1970). Имеются также экспериментальные данные о повышении артериального давления в некоторых опытах (Асафова, 1978). Указанные противоречия могут быть заложены в самой композиции яда. Так, апамин пчелиного яда активирует факторы расслабления гладких мышц сосудов (Busse et al., 1985), а другой полипептид - мелиттин - вызывает сокращение гладких мышц вплоть до их контрактуры ( Habermann, 1980 ).

Несомненно, дальнейший анализ выявленных кардио- и вазостимулирующих эффектов может служить восполнению теоретической базы о механизмах взаимодействия пчелиного яда с эффекторными системами организма и быть востребованным как при лечении отравлений ядом пчел, так и при использовании пчелиного яда в терапии заболеваний человека.

В связи с вышеизложенным в настоящей работе проведены исследования по физиологическому анализу кардио- и вазостимулирующего эффектов яда пчел. Работа выполнялась в соответствии с планом научно-исследовательских работ кафедры физиологии и биохимии человека и животных ННГУ ( № Госрегистрации 81062913), а также в рамках грантов ( головной совет по биологии - код 2102-3-41 и программа"Университеты России" - биология, проект "Зоотоксины в патофизиологии и медицине").

Цель и задачи исследования.

Целью работы явилось изучение кардио- и вазостимулирующего эффектов пчелиного яда. В качестве материала исследования был использован стабилизированный раствор пчелиного яда - солапивен (сол -раствор, апи- пчела, вен - яд; патент № 2057539 от 10.04.1996 г. на изобретение «Средство, обладающее обезболивающим действием для парентерального введения). Работа была проведена с раствором яда, изготовленном на экспериментальном заводе органического синтеза Латвийской АН (серии № 01-03 04 91).

При этом решались следующие задачи:

1. Провести анализ гипертензивного и кардиостимулирующего действия яда в условиях внутривенного введения животным.

2. Изучить кардиотропные свойства солапивена в условиях изолированного сердца

3. Изучить кардио- и вазотропные свойства солапивена в условиях гипофункциии системы кровообращения животных:

- при обескровливании животных,

- адреналиновом миокардите,

- аритмиях сердца,

- при тотальной ишемии изолированного сердца

Научная новизна.

При внутривеном введении пчелиного яда впервые проанализирован его гипертензивный эффект. Установлено, что стимуляция системы кровобращения является второй фазой действия яда при болюсном введении. При устранении первой- гипотензивной фазы рефлекторного происхождения капельное введение солапивена сразу приводит к стимуляции сердечной деятельности и повышению сосудистого тонуса. Показано, что кардио- и вазостимулирующий эффекты препарата опосредуются через активацию адренергических рецепторов органов-мишеней и связаны с эндогенными катехоламинами.

В опытах выявлено, что кардио - и вазостимулирующее действие пчелиного яда полностью проявляются и в условиях гипофункции сердечно-сосудистой системы. Показано, что солапивен обладает выраженным антиаритмическим эффектом на моделях адреналиновых, бариевых и электрогенных аритмий. Выявлено, что яд позволяет эффектино проводить реанимацию животных после 10-минутной клинической смерти, повышая артериальное давление и сократительную активность сердца, способствует восстановлению сердечной деятельности изолированного сердца крыс после тотальной ишемии и реперфузии, снимает тяжесть морфо-функциональных нарушений сердца при адреналиновом миокардите.

Теоретическая и практическая значимость работы .

В работе выявлены механизмы вазотонического действия пчелиного яда, его кардиостимулирующий эффект. Установлено, что солапивен проявляет кардиостимулирующее и кардиопротекторное действие в условиях ослабления сердечной деятельности, что позволяет наметить перспективы его внедрения в медицину для терапии и профилактики сердечно-сосудистой патологии.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Пчелиный яд обладает выраженным кардио- и вазостимулирующим действием, проявляющимся как в условиях интактного организма, так и при альтерации системы кровообращения.

2. Кардио- и вазостимулирующий эффект яда в большей мере проявляется при ослаблении функции сердечно-сосудистой системы и связан с эндогенными катехоламинами.

Апробация работы.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на конференциях по апитерапии ( Рыбное, 1994; Сочи, 1996; Антверпен, 1997), научном семинаре кафедры физиологии и биохимии человека и животных (1998).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 7 работ.

1. Обзор литературы.

1.1. Физико- химические свойства и биологическая активность пчелиного яда.

Полученный от живых насекомых пчелиный яд - секрет ядовитых желез - представляет собой густую, прозрачную жидкость горько-жгучего вкуса, кислой реакции (рН водных растворов 4,5-5,5), плотностью 1,081,13, быстро высыхающую на воздухе (Крылов, 1995). Летучие вещества пчелиного яда- это вода и сложные эфиры: изоамилацетат, изоамилпропионат, изоамилбутират и др. Считается, что в процессе ужаления выделяющиеся эфиры вызывают сигнальную реакцию "тревоги" в пчелиной семье и активируют других пчел к ужалению. Объем выделяющегося от одной пчелы секрета составляет около 1 мкл жидкости массой 0,5-1 мг. Секрет легко растворим в воде, заключает 12% нерастворимых примесей. Высушенный яд имеет вид прозрачной массы, составляющей 30-40% от нативного секрета, которая при размоле превращается в порошок от белого до желтоватого оттенка.

Высушенный пчелиный яд представляет собой многокомпонентную смесь из неорганических и органических веществ (табл. 1). Минеральные вещества, остающиеся после сжигания яда при температуре 500-800°С (зольность яда), составляют 2-4% сухой массы яда. В золе установлены кальций, фосфор, магний, медь, хлориды.

Благодаря современным методам анализа компоненты пчелиного яда сегодня хорошо изучены ( Haberman, 1980 и др.). Из яда выделены белки, обладающие ферментативными свойствами- фосфолипаза А, гиалуронидаза, фосфатазы; высокоактивные пептиды- мелиттин, апамин, МСД- пептид, тетриапин, секапин, адолапин, минимин, кардиопеп;

биогенные амины- гистамин, серотонин, дофамин; летучие вещества, в том числе вещества тревоги- аттрактанты.

Органические вещества яда представлены практически всеми группами соединений, встречающихся в животном организме - углеводы, жиры, белки, пептиды, аминокислоты, биогенные амины, ароматические и алифатические соединения и т. д. Установлено наличие в яде 2-6% Сахаров (глюкоза, фруктоза). Однако, чем меньше загрязняется секрет при получении, тем меньше содержание углеводов. Жироподобные вещества имеются в яде в еще меньших концентрациях и составляют 1-3%. Около 1% яда составляют свободные аминокислоты.

Основная часть сухого вещества яда представлена белками и пептидами - около 80%. Все они являются активными веществами. Благодаря современным методам выделения и анализа сегодня идентифицировано 98% компонентов пчелиного яда. Ниже приведены литературные данные о физико-химических свойствах и биологической активности наиболее важных из них.

Фосфолипаза А2. Габерманн и Нейман (1952-1965), впервые выделившие активный фермент из пчелиного яда, определили его содержание около 14% в расчете на высушенный яд. Позднее Шаполини с сотр. (1967-1972) определили, что фермент состоит из 128 аминокислотных остатков и установили их последовательность.

Фосфолипаза пчелиного яда является наиболее устойчивой из его ферментов. Она сохраняет свою активность при длительном хранении высушенного яда. Оптимальная ферментативная активность фосфолипазы, в отношении фосфолипидов куриного яйца проявляется при рН=8,0. У фермента высокий температурный оптимум, составляющий 60-65°С.

Возникшие под действием фосфолипазы нарушения на клеточном и субклеточном уровне приводят к нарушениям функций организа. Так, введение фосфолипазы под кожу вызывает местное воспаление, а

внутривенное введение приводит к падению кровяного давления, отеку легких, кровоизлияниям в тканях.

Таблица 1.

Химический состав пчелиного яда ( по Habermann с соавт., 1967-1985; Banks, Shipolini, 1986; Шкендерову, 1985).

Класс веществ Вещества Содерж. Молекулярная

в яде , % масса

Белки Гиалуронидаза 1-3 41000

(ферменты) фосфолипаза А2 10-12 20000

Другие 2-3 55000-170000

Пептиды Мелиттин 40-50 12000

(полипептиды) (тетрамер)

Апамин 1-3 2000

МСД-пептид 1-2 2500

( 401-пептид)

Другие пептиды 15-25 600-11000

Биологически Гистамин 0,5-2 150

активные аминь Допамин 0,2-1 150

Норадреналин 0,1-0,5 150

Сахара Глюкоза, Фруктоз 2 180

Фосфолипиды 5 700

Свободные 1 700

аминокислоты

Летучие в-ва 4-8 200

Ввиду того, что фосфолипаза является высокомолекулярным чужеродным белком для организма, подвергнувшегося воздействию яда, она является сильным антигеном и аллергеном. Отсюда весьма значительное число случаев анафилактического шока при пчелиных ужалениях. У большинства ужаленных пчелами людей в крови обнаруживается большое количество IgE антител с соответствующим уменьшением Igc (Hoffman et al., 1977; Kemeny et al., 1983).

Гиалуронидаза. Биологическое назначение этого фермента пчелиного яда сводится к организации путей для токсических компонентов в направлении функциональных структур клеток и органов ужаленного организма (Артемов, 1970).

Впервые выделивший гиалуронидазу Габерманн (1965), получил фермент, в 40 раз более активный, чем в нативном пчелином яде. Оказалось, что гиалуронидаза пчелиного яда по своим свойствам сходна с аналогичными ферментами, полученными из других источников. Фермент термолабилен и при нагревании теряет свою активность. Это один из самых высокополимерных компонентов яда. Его молекулярная масса составляет 35000-41000 дальтонов, в зависимости от степени очистки от присоединенных к пептидной цепи молекулы углеводов (Ivanov et al., 1972; Kemeny et al., 1984). От степени очистки, а также от методов получения пчелиного яда зависит также и количество фермента. Оно составляет 1-3% от массы высушенного яда.

Мелиттин. В 1952 году Нейман и Габерманн методом

электрофореза разделили белки пчелиного яда на две фракции. В первой фракции, более подвижной в направлении анода, был выявлен полипептид, непосредственно разрушающий эритроциты и вызывающий сокращение гладких мышц, впоследствии названный мелиттином - от видового названия пчелы - меллифера (медоносная). Авторы установили его

содержание в яде в количестве 40-55% и определили его первичную структуру. Молекула пептида содержит 26 аминокислотных остатков, С-концевая карбоксильная группа его амидирована: Гли-Иле-Гли-Ала—Вал-Лей-^Тре-Тре-Гли-Лей-Про-Ала-Лей-Иле-Лиз-Арг-Лиз-Арг-Глн-Глн-КН2.

Основное биологическое действие мелиттина связано со способностью нарушать структуру мембран. В частности, он вызывает лизис различных клеток и является сильным гемолитиком. Биосинтез мелиттина включает образование соответствующих предшественников-препромелиттина и промелиттина. Синтез мелиттина был осуществлен Шредером в 1971 году. Ныне свойства пептида хорошо изучены. Установлено, что особенностью поведения мелиттина в растворе является его способность к агрегации и образованию тетрамеров с соответствующей массой 12000 Да. Агрегации способствуют высокие концентрации пептида, а также повышение ионной силы раствора и его рН.

Мелиттин разрушает различные природные и искусственные мембраны, однако, в отличие от других лизирующих веществ (лизолицетин, детергенты и др.), в небольших концентрациях не вызывает растворения мембран полностью. В клетках образуются поры, сквозь которые высвобождается их содержимое, а мембраны (тени клеток) могут сохранять целостность (Габерманн, 1972 и др.). Действует мелиттин уже в концентрации Ю-6 м. При этом образуются поры, через которые может происходить утечка не только ионов, но и макромолекул типа гемоглобина. Клеточная мембрана может быть устойчива к действию низких концентраций пептида, тогда �