Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение биоаналитических реагентов на основе полимерно-капсулированных полупроводниковых (CdSe)ZnS нанокристаллов

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Получение биоаналитических реагентов на основе полимерно-капсулированных полупроводниковых (CdSe)ZnS нанокристаллов"

Учреждение Российской академии наук ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

ИМ. АКАДЕМИКОВ М.М.ШЕМЯКИНА И Ю.В.ОВЧИННИКОВА

(.ИБХРАН)

На правах рукописи

СИЗОВА Светлана Викторовна

ПОЛУЧЕНИЕ БИОАНАЛИТИЧЕСКИХ РЕАГЕНТОВ НА ОСНОВЕ ПОЛИМЕРНО-КАПСУЛИРОВАННЫХ ПОЛУПРОВОДНИКОВЫХ (Са8е)гп8 НАНОКРИСТАЛЛОВ

специальность 03.00.23 биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

ииа47 Ю43

Москва - 2009

003471043

Работа выполнена в лаборатории Полимеры для биологии Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук

Научные руководители: доктор химических наук, профессор доктор физико-математических наук

Зубов Виталий Павлович Олейников Владимир Александрович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор доктор химических наук, профессор

Бовин Николай Владимирович Штильман Михаил Исаакович

Ведущая организация:

Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова

Защита состоится и+ОКсР 2009 года в_часов на заседании

диссертационного совета при Институте биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук по адресу: 117997, ГСП-7, Москва, В-437, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Автореферат разослан « ¥ » //¿2^ 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, у

доктор физико-математических наук В.А.Олейников

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Интенсивное развитие широкого класса методов анализа, основанных на использовании различных флуоресцентных меток, сделало их одними из важнейших экспериментальных методов во многих научных дисциплинах. В частности, их применение в биотехнологии и медицине привело к появлению и развитию методов, облегчающих изучение живых клеток и клеточных структур, фундаментальных клеточных процессов и методов регистрации биоспецифических взаимодействий, находящих применение в медицинской диагностике и разнообразных биологических анализах.

В последние годы интенсивно разрабатываются подходы к визуализации процессов на уровне клеток, тканей и целых организмов, основанные на введении специализированных флуоресцентных меток. Одними из наиболее перспективных меток нового поколения являются флуоресцентные полупроводниковые нанокристаллы (НК), состоящие из элементов групп II-VI, Ш-V и имеющие структуру ядро/оболочка.

Полупроводниковым НК присущи два основных достоинства, отличающие их от органических флуорофоров: I) широкий набор узких полос флуоресценции, положение которых зависит от диаметра НК и является управляемым параметром при возможности возбуждения излучением с одной длиной волны; при этом длина волны возбуждения может варьироваться для получения максимального отношения сигнал/шум с учетом конкретного изучаемого объекта; 2) высокая фотостабильность НК, в 100-4000 раз превышающая фотостабильность лучших органических флуорофоров. Такие свойства делают НК идеальными флуоресцентными биомаркерами в анализах, основанных на биоспецифическом взаимодействии «лиганд-рецептор» в разнообразных in vitro и in vivo биоаналитических системах, в которых использование традиционных органических флуорофоров ограничено недостаточной фотостабильностью и невозможностью одновременной регистрации в многопараметрических (многоцветных) системах. Кроме того, такие НК весьма перспективны для создания новых флуоресцентных сенсоров, действие которых основано на использовании эффекта резонансной передачи энергии (FRET-эффект). Химический анализ многокомпонентных смесей, в частности, детектирование наличия в смеси определенных ионов металлов, биологических соединений и т.д., и анализ ряда физических параметров, таких как рН, электрохимический потенциал, температура в наномасштабных областях также является потенциальной областью применения данных сенсоров.

НК состава CdSe/ZnS с диаметром 2-6 нм, используемые в данной работе, являются альтернативой органическим флуоресцентным меткам, традиционно применяемым в биотехнологии и медицине благодаря высокой яркости, возможности получения флуоресценции по всему оптическому диапазону и доступности. Оболочка из широкозонного полупроводника ZnS предохраняет флуоресцирующее ядро от влияния окружения и позволяет получить НК с квантовым выходом до 70%.

Одной из основных проблем использования таких флуоресцентных НК является трудность получения биосовместимых, легко конъюгируемых с биологическими молекулами флуоресцентных комплексов на их основе, что ограничивает их применение в медицине и биотехнологии в качестве эффективных флуоресцентных биомаркеров и сенсоров. Для решения указанной проблемы в

настоящей работе разработан ряд способов модификации и функционализации поверхности НК для создания высокоэффективных и специфичных флуоресцентных биомаркеров и продемонстрированы примеры их использования в таких видах биоанализа, как реакция латексной агглютинации (РЛА), визуализация клеток и клеточных рецепторов, цитофлуориметрия.

Цели и задачи работы. Цель работы заключалась в разработке и создании серии специфичных, биосовместимых, флуоресцентных аналитических реагентов, содержащих флуоресцентные полупроводниковые НК для биотехнологии.

В рамках данной работы были поставлены следующие задачи:

■ Разработка методов включения полупроводниковых НК в полимерную матрицу из синтетических (гомо- и сополимеры акролеина) и природных (наночастицы на основе этилцеллюлозы) полимеров;

■ Создание модифицирующих слоев на поверхности индивидуальных НК из синтетических и природных полимеров двумя способами:

1) модификацией поверхности НК бифункциональными тиолсодержащими молекулами путем замещения три-н-октилфосфиноксида (ТОФО), стабилизирующего НК в процессе синтеза, с последующим формированием изолирующего слоя из биологически активных молекул (полипептидов, полисахаридов, антител и т.д.);

2) формированием полимерного слоя вокруг НК посредством гидрофобных взаимодействий с амфифильными полимерами без удаления молекул ТОФО с поверхности НК.

■ Разработка подхода для создания эффективных флуоресцентных зондов и биоаналитических сенсоров для сканирующей ближнепольной оптической микроспектроскопии;

■ Апробация полученных реагентов в биоаналитических методах. Научная новизна и практическая ценность работы

Впервые разработаны методы синтеза универсальных полимерных носителей, содержащих полупроводниковые НК для биоанализа, которые характеризуются:

■ однотипной полимерной матрицей на основе акролеина с функционализированной поверхностью;

■ широким диапазоном размеров частиц (100-500 нм) и узким распределением частиц по размерам (РЧР);

■ коллоидной и химической стабильностью в широком диапазоне рН и физиологических жидкостях;

■ возможностью введения НК с различными длинами волн испускаемой флуоресценции, а также смесей НК для осуществления многоцветного оптического кодирования полимерных дисперсий;

■ фотостабильностью и высоким квантовым выходом;

■ возможностью возбуждения различных длин волн испускаемой флуоресценции одним монохроматическим источником;

■ универсальным протоколом иммобилизации белковых молекул на поверхности разработанных полимерных флуоресцентных биомаркеров.

Показана возможность введения НК в дисперсии полимерных частиц природного происхождения на примере наночастиц из этилцеллюлозы.

Продемонстрированы примеры использования данных флуоресцентных полимерных носителей в качестве эффективных и высокоселективных биомаркеров в таких анализах, как реакция латексной агглютинации (PJIA) на стекле и в планшете, проточная цитофлуориметрия, визуализация клеток и клеточных рецепторов.

Впервые получена серия флуоресцентных наноразмерных частиц-биомаркеров в диапазоне диаметров 5-80 нм для in vitro и in vivo исследований путем модификации НК синтетическими и природными полимерами.

Показана эффективность использования таких биомаркеров для окрашивания и визуализации клеток, а также перспективность их использования для визуализации объектов внутри живых тканей.

Впервые разработан подход к созданию флуоресцентных зондов и биоаналитических сенсоров для сканирующей ближнепольной оптической микроспектроскопии, целью которой является ультрачувствительный многопараметрический анализ наноразмерных структур.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на //^страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, включающего /^ссылок. Диссертация содержит ^рисунков и Ч таблицы.

Апробация работы. Основные материалы диссертации были доложены на международной конференции «Лазерная физика и оптические технологии» (Гродно, Белоруссия, 2006), Международной конференции по нанобиотехнологии NACBO (Урбино, Италия, 2006), Российской школе-конференции молодых ученых «Биосовместимые наноструктурные материалы и покрытия медицинского назначения» (Белгород, 2006), III Международной конференции по коллоидной химии и физико-химической механике (Москва, 2008), 5 московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано четыре статьи в рецензируемых журналах.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Инкапсулирование НК в частицы полимерных дисперсий

1.1 Включение НК в полимерную матрицу на основе акролеина

Возросшая в последнее время популярность использования субмикронных полимерных микросфер для методов иммуноанализа белковых молекул, а также фракционирования или визуализации клеток обусловила интерес к выбору таких микросфер в качестве матрицы для включения НК и последующего создания биомаркеров для методов биоанализа, основанных на измерении параметров флуоресценции.

В настоящее время для вышеуказанных целей в основном используются флуоресцентные полимерные дисперсии, содержащие органические красители, однако их эффективность ограничена недостаточной фотостабильностью и необходимостью использования нескольких источников для возбуждения флуоресценции разных длин волн. Следовательно, разработка подходов к формированию флуоресцентных субмикронных полимерных дисперсий с заданным в зависимости от области применения диапазоном диаметров, узким распределением частиц по размерам (РЧР), наличием функциональных групп на поверхности для образования прочной связи с

белковыми молекулами, высокой фотостабильностью, сохраняющих коллоидную устойчивость в широком диапазоне рН и в физиологических средах, а также позволяющих реализовать многопараметрические методы анализа, является весьма перспективной задачей.

Анализ литературных данных и проведенные исследования показали, что в наибольшей степени всем вышеперечисленным требованиям удовлетворяют полимерные дисперсии на основе акролеина. В зависимости от способа полимеризации и сополимеризации акролеина в водных средах могут бьггь получены полимерные дисперсии в широком диапазоне диаметров - от 100 до 1,5 мкм при сохранении коллоидной стабильности. Наличие поверхностных альдегидных групп для прямого ковалентного связывания с белковыми молекулами, контролируемые параметры частиц на стадии синтеза, возможность расширения спектра получаемых частиц и их свойств путем сополимеризации со стиролом и последующим введением в них НК позволит использовать их в качестве флуоресцентных носителей -биомаркеров в разнообразных диагностических тестах (различные виды РЛА, цитофлуориметрия).

Полимерные дисперсии на основе акролеина синтезировали методами анионной полимеризации в водно-щелочной среде (ПАа , соотношение фаз 1:20, рН 11, ТКГ,Ш1.) и радикальной полимеризации (ПАР соотношение фаз 1:9, водорастворимый инициатор персульфат калия К^С^, Т=65°С). Как видно из данных, представленных в таблице 1, полимерные микросферы обоих типов характеризовались высокой коллоидно-химической стабильностью и низкой растворимостью в органических растворителях (не более 2%, данные не приведены), при этом полимерные микросферы с минимальным диаметром и максимальным содержанием альдегидных групп получены методом радикальной полимеризации.

Таблица 1. Характеристики полимерных дисперсий на основе акролеина

№ Тип О, Коэффициент С альдегидных Устойчивость

полиакролеиновых дисперсий нм вариации, % групп, мкмоль/г пол. в 0.2 М N301

1.1 ПАа 510 12 26,40 Стаб.

1.2 ПА1, 230 8 41,25 Стаб.

Введение гидрофобных НК в полимерные микросферы на стадии синтеза приводило к тушению флуоресценции. Таким образом, была разработана методика введения НК в уже синтезированные полимерные дисперсии, которая заключается в предварительном набухании полимерных частиц в органическом растворителе (этанол, изопропиловый спирт), добавлении НК в смеси того же растворителя с хлороформом, удалении растворителя и переводе полученных полимерных микросфер с включенными НК в водную среду.

Рис. 1. Сравнение интенсивности флуоресценции (норм.) полимерных дисперсий ПАа (1) и ПАР(2).

ВДЗ 1 день ЕЗ 1 неделя СИ 1 месяц СП 2 месяца

1,40 я 1 1,20 | 1,00 | 0,80 | 0,60 \ 0,40 1 0,20 X 1 0,00 / ж * а; Е* 1 : :

1 2

Полученные флуоресцентные полимерные дисперсии ПАа и ПА характеризовались высокой степенью включения НК; при этом максимальная интенсивность флуоресценции наблюдалась у полиакролеиновых дисперсий, полученных радикальной полимеризацией (рис. 1).

Оценку флуоресцентных свойств ПАа и ПАр проводили методом флуоресцентной лазерной микроскопии. Для этого дисперсии наносили на кремниевые подложки и высушивали. Флуоресценцию микросфер возбуждали аргоновым лазером с длиной волны возбуждения 488 нм и мощностью не более 0.01 мВт. Найдено, что включение НК в полиакролеиновые микросферы приводит к смещению пика эмиссии НК в синюю область в зависимости от состава микросфер и параметров НК (в случае НК с ХэМ.=546 нм - смещение в синюю область на 12 нм, Ж с ^,„=583 нм - на 18 нм соответственно). Наиболее вероятной причиной синего сдвига пика эмиссии НК при включении в микросферы является устранение излучающих поверхностных состояний НК при формировании вокруг него полимерной оболочки и подавление каналов тушения флуоресценции НК.

В случае полиакролеиновых дисперсий ПАа присутствовал сильный фон от подложки, что свидетельствует о наличии свободных НК вне полимерных микросфер. По-видимому, это связано с образованием значительного количества конъюгатов олигомеров акролеина с НК; что приводит к снижению степени включения НК в микросферы и появлению общего флуоресцентного фона. Полиакролеиновые дисперсии ПАР характеризовались высокой степенью включения НК в микросферы, однако при этом наблюдалось снижение агрегативной стабильности при хранении.

Полученные результаты показали необходимость повышения агрегативной устойчивости полимерных дисперсий и снижения образования олигомерных продуктов в процессе хранения дисперсий. С этой целью была проведена сополимеризация акролеина со стиролом. Во-первых, путем встраивания мономерных звеньев стирола возможно снизить количество образующихся полуацетальных групп, характерных для гомополимеризации акролеина, и таким образом повысить коллоидную и химическую устойчивость полимерных дисперсий, во-вторых, варьируя соотношения сомономеров - акролеина и стирола, можно получить частицы в широком диапазоне диаметров для различных биологических приложений.

1.2 Включение НК в сополимерную матрицу на основе акролеина и стирола

Сополимерные дисперсии на основе акролеина и стирола с отношением сомономеров 1:1 (ПА'ЛС1), 5:1 (ПА5:ПС'), 10:1 (ПА10:ПС') были синтезированы радикальной сополимеризацией (соотношение фаз 1:9, инициатор ^БгОа, Т=65°С).

Наибольшая скорость роста диаметра микросфер и минимальный диаметр дисперсий были отмечены в случае максимального (10:1) содержания акролеина в исходной мономерной смеси. В этом же случае (10:1) отмечена и более неоднородная структура полимерных микросфер, чем при соотношении мономеров 1:1 (рис.2).

Характеристики полученных сополимерных дисперсий приведены в таблице 2. Как видно, все полимерные дисперсии характеризуются высокой коллоидной стабильностью, содержат поверхностные альдегидные группы, а диапазон диаметров полученных микросфер (145 - 420 нм) позволит их использовать в качестве маркера в различных биоаналитических тестах, например, РЛА в планшете и на стекле, цитофлуориметрии, а также для окрашивания и визуализации клеток и клеточных рецепторов.

кйгл- у'

■гзян

оУЮ^Ё!

Рис. 2. Микрофотографии полимерных микросфер, полученных сополимеризацией акролеина и стирола при соотношении мономеров

акролеин.'стирол 1:1 (а) и 10:1 (6).

Таблица 2. Характеристики сополимерных дисперсий на основе акролеина и стирола с различным соотношением сомономеров

№ Мольное Содержание Диаметр Концентрация Устойчивость в

отношение стирольных сополимерных альдегидных 0,2 м ИаС1

сомономеров акролеин/стирол звеньев в сополимере, % микросфер, нм групп, мкмоль/г

1 1:1 48,8 420 19,8 Стаб.

2 5:1 14,3 250 25,5 Стаб.

3 10:1 8,1 145 32,1 Стаб.

Оценку флуоресцентных свойств проводили методом флуоресцентной лазерной микроскопии. Во всех трех случаях флуоресцентный фон от подложки отсутствовал полностью, что свидетельствует об отсутствии свободных НК и практически полном их включении в микросферы. Однако сополимерные дисперсии характеризовались относительно невысокой интенсивностью флуоресценции, а также недостаточной коллоидной устойчивостью, и в дальнейшем исследование их свойств не проводилось (рис. 3).

Рис. 3. Сравнение интенсивности флуоресценции (норм.) сополимерных ПА-ПС дисперсий с включенными НК (583 нм): ПА':ПС' (1), ПА5:ПС' (2), ПА'^ПС1 (3).

Так же как и в случае гомополимеров акролеина, для сополимерных микросфер было отмечено смещение пика эмиссии в синюю область спектра, при этом для микросфер ПА':ПС' со включенными НК с Х^м=583 нм смещение составило 16 нм, в случае микросфер ПА1 :ПС10 - 8 нм.

Сравнение флуоресцентных свойств единичной микросферы и агрегатов микросфер показало, что положение максимума флуоресценции практически не смещается (рис. 4). Это свидетельствует о том, что НК в микросфере распределены достаточно равномерно и нет перехода энергии между НК, находящимися в соседних микросферах.

Высокая интенсивность флуоресценции синтезированных полимерных дисперсий, фотостабильность, возможность в широких пределах варьировать диаметр полимерных микросфер и цвет флуоресценции, используя при этом монохроматический источник возбуждения, открывают перспективы разнообразных применений полученных полимерных микросфер в медицине и биологии. Частными примерами таких приложений является использование микросфер в РЛА и цитофлуориметрии.

Рис. 4. Спектры флуоресценции сополимерных дисперсий, содержащих НК (диаметр ядра С<15е 3,7 нм): ПА'-ПС'(а), ПА10-ПС'(б).

1.3 Введение в полимерные дисперсии смеси НК с различными длинами волн флуоресценции

Вводя в полимерные микросферы смеси НК с разными длинами волн флуоресценции и, таким образом, осуществляя оптическое кодирование, можно создавать тест-системы, позволяющие проводить экспрессный многопараметрический анализ разного числа биологических объектов, основанный на технике микрочипов. Одним из преимуществ таких тест-систем является использование смесей НК с разными длинами волн флуоресценции, которую можно возбуждать одним монохроматическим источником.

В качестве модельного полимерного носителя для включения смеси НК с разными длинами волн флуоресценции мы использовали сополимерные микросферы на основе акролеина и стирола с диаметром частиц 420 нм. Для кодирования полимерных дисперсий использовали НК с максимумами флуоресценции 546 и 583 нм в различных соотношениях. Как видно из рис. 5, интенсивность флуоресценции сополимерных частиц с включенными НК не пропорциональна добавляемой концентрации НК. Вероятно, инклюзия зависит от диаметра НК: чем меньше диаметр НК, тем легче и глубже НК проникают внутрь полимерной частицы.

1

I

Рис. 5. Флуоресценция полимерных микросфер,

кодированных НК двух цветов: НК с = 583 нм (1); смесь НК с = 620 и 546 нм в соотношении: 1:1 - (2), 10:1 -(3), 100: 1 - (4); НК с =546 нм (5).

Полученные оптически кодированные полимерные микросферы сохраняли коллоидную и химическую устойчивость в течение по крайней мере 6 месяцев. Изучение флуоресцентных свойств показало, что спектры флуоресценции отдельных полимерных микросфер и агрегатов микросфер не отличаются между собой, что свидетельствует о практически полном отсутствии взаимодействия между НК, находящихся в разных полимерных микросферах (рис. 6).

Рис. 6 (а) Спектры флуоресценции отдельной полимерной микросферы (красная кривая) и агрегатов микросфер (зеленая и черная), содержащих НК двух цветов.

(б) Разложение пика флуоресценции на полосы флуоресценции включенных в полимерные микросферы двух цветов НК.

Отсутствие взаимодействия между НК как внутри одной, так и между соседними полимерными микросферами является необходимым условием для разработки метода введения заданного количества НК разных цветов в полимерные дисперсии, т.е. оптического кодирования полимерных микросфер и последующего создания мультиплексной диагностической тест-системы.

1.4 Включение НК в частицы на основе природных полимеров В качестве флуоресцентного носителя-биомаркера для использования в тест-системах, разработке диагностикумов, а также для визуализации клеток и клеточных структур могут выступать и наночастицы на основе природных полимеров, в частности производные целлюлозы. Такие гидрофобные наночастицы нетоксичны, химически и коллоидно-устойчивы и могут выступать в качестве матрицы для включения НК и создания флуоресцентных реагентов для использования в in vitro и in vivo исследованиях. В настоящей работе использовали наночастицы из этилцеллюлозы, любезно предоставленные A.JI. Камышным (Hebrew University, Israel).

Рис. 7. Сравнение интенсивностей флуоресценции исходных НК и НК, включенных в ЭЦ частицы. НК с = 546 нм. На врезке изображения ЭЦ частиц с включенными НК и исходных НК в водно-метанольной (1:1) смеси.

Включение гидрофобных НК в этилцеллюлозные (ЭЦ) наночастицы осуществляли аналогично включению НК в полимерные микросферы на основе акролеина, при этом прирост диаметра частиц после включения НК был незначительным. Изучение флуоресцентных свойств показало, что квантовый выход НК, включенных в ЭЦ наночастицы, увеличивается более чем в 2 раза по сравнению с исходными НК, что дает возможность существенно повысить достоверность и чувствительность анализов (рис. 7).

Введение НК в полимерную матрицу как из полимеров на основе акролеина, так и из этилцеллюлозы, привело к подавлению каналов тушения флуоресценции НК, что следует из увеличения квантового выхода. Кроме того, подавлением каналов тушения можно частично или полностью устранить флуктуации флуоресценции одиночных НК, которые весьма нежелательны при разработке многоцветных флуоресцентных реагентов для высокочувствительной визуализации в биоанализе, и таким образом стабилизировать сигнал флуоресценции.

Перечень разработанных типов флуоресцентных полимерных носителей и их характеристики приведены в сводной таблице 3.

Таблица 3. Характеристики флуоресцентных полимерных дисперсий

№ Тип Функц. группы Диаметр Коэф-т Метод биоанализа

полимерных на поверхности частиц, им вариации,

дисперсии %

1.1 ПАа СОН 510 12 -

1.2 ПАГ сон 230 8 РЛА на стекле

1.3 ПА'-ПС' сон 420 7 РЛА в планшете, цитофлуориметрия

1.4 па5-пс' сон 250 11 -

1.5 ПА|и-ПС' сон 145 8 РЛА на стекле, детекция клеточных рецепторов

1.6 ЭЦ он 211 10 РЛА на стекле

«-» соответствует тем типам полимерных дисперсий, которые не удовлетворяют комплексу свойств, предъявляемым к носителям для использования в биоанализе.

2. Получение индивидуальных наноразмерных частиц для in vitro и in vivo

анализа путем модификации флуоресцентных НК природными и синтетическими

полимерами

Разработка способов получения индивидуальных флуоресцентных наноразмерных частиц имеет практическое значение: во-первых, наличие функциональных групп на поверхности частиц позволит использовать их для визуализации образования комплекса "лиганд - антилиганд", во-вторых, малый размер таких наночастиц (5-80 им) даст возможность применять их как в in vitro, так и in vivo анализах для визуализации клеток, кодирования ДНК, направленной доставки наночастиц в клетки и т.д.

2.1 Модификация индивидуальных НК посредством замещения ТОФО бифункциональными лигандами с последующим формированием защитного слоя

Данный способ модификации основан на образовании дисульфидной связи между атомами, входящими в состав оболочки гпБ и меркаптогруппой тиолсодержащих соединений путем замещения стабилизирующего лиганда ТОФО на поверхности НК и последующим формированием дополнительного защитного полимерного слоя.

Рис. 8 (а) Интенсивность флуоресценции (норм.) НК, модифицированных цистеином (Цис-НК) и смесью меркаптоуксусная кислота/меркаптоэтанол (МУК/МЭ-НК). (б) Распределение частиц по размерам для НК, модифицированных цистеином.

Исходные гидрофобные НК модифицировали тиолсодержащими молекулами, в частности цистеином и смесью меркаптоэтанол /меркаптоуксусная кислота (мольное соотношение 1/1). Полученные солюбилизированные НК характеризовались размерами частиц 5 и 8 нм соответственно, а также высокой интенсивностью флуоресценции (рис. 8), однако в водном растворе сохраняли коллоидную устойчивость не более 1 месяца. Причиной снижения коллоидной устойчивости является, вероятнее всего, динамический характер связи (2п-8, Б-в) бифункционального лиганда с поверхностью НК; солюбилизирующий лиганд постепенно переходит в водную среду, приводя к агрегации модифицированных НК. Кроме того, ионы кадмия, входящие в состав ядра НК, также могут переходить в раствор и контактировать с окружением НК, что ограничивает их биосовместимостъ.

С целью увеличения коллоидной устойчивости и повышения биосовместимости была разработана методика формирования дополнительного защитного слоя посредством образования ковалентных связей или электростатических взаимодействий между отрицательно заряженными карбоксильными группами гидрофилизированных НК и аминогруппами биомолекул или катионных ПАВ. В настоящей работе использовали полипептиды - поли-Ь-лизин, инсулин, А и В цепи инсулина, полисахариды (хитозан), мини-антитела 4Б5-Н185, а также поликатион полидиаллилдиметиламмоний хлорид (ПДАДМАХ). Проведенные исследования показали, что НК, модифицированные короткими тиолсодержащими молекулами и дополнительно стабилизированные формированием защитной оболочки, сохраняют коллоидную устойчивость в течение как минимум 2 месяцев. Кроме того, формирование защитного слоя приводит к увеличению квантового выхода НК (Рис. 9,

100 ■ ,- б

й

0 0.5 _ 10

Диаметр, им

0 0.5

10

Длина волны, нм

Рис. 9. Интенсивность флуоресценции и положение максимума флуоресценции исходных НК (1), Цис- НК (2), Цис-НК, модифицированных хитозаном (3), поли-1,-лизином (4), ПДАДМАХ (5).

Рис. 10. Сравнение и стабильность во времени квантового выхода Цис-НК, модифицированных хитозаном и поли-Ь-лизином. 1 день, 1 месяц, 1 месяца.

2.2 Модификация индивидуальных НК амфифильными полимерами

Данный способ модификации НК основан на использовании гидрофобных взаимодействий между октальными лигандами ТОФО на поверхности НК и гидрофобными группами амфифильных полимеров. Это позволяет полностью защитить и гидрофилизовать поверхность НК, при этом не удаляя ТОФО с поверхности частиц. В отдельных случаях для создания более прочной и стабильной оболочки необходима дополнительная сшивка макромолекул в поверхностном слое диаминами.

В настоящей работе использовали следующие амфифильные полимеры: полиакриламидный конъюгат, содержащий 15% мол. р-галактозы и 10% мол. диолеоилфосфатидилэтаноламина (РНЕАА-Оа1 Р( 15%)-ООРЕ( 10%)) и чередующийся сополимер малеинового ангидрида и 1- тетрадецена (табл. 4).

НК, модифицированные РНЕАА-Са1р(15%)-ВОРЕ(Ю%) и сополимером малеинового ангидрида и 1- тетрадецена, сохраняли коллоидную устойчивость в течение 3 месяцев, при этом квантовый выход увеличился по меньшей мере в 2 раза по сравнению с исходными гидрофобными НК (рис. 11).

Другой перспективный вариант реализации данного способа модификации НК состоит в использовании 1-меркаптоундеканоил-11-тетраэтиленгликоля, имеющего в составе меркаптогруппу, обеспечивающую связывание с оболочкой НК, гидрофобный фрагмент, имеющий сродство к оболочке НК и облегчающий проникновение меркаптогруппы к поверхности НК, а также гидроксильную группу для последующего связывания с биолигандами (табл. 4).

НК, модифицированные 1-меркаптоундеканоил-11-тетраэтиленгликолем, сохраняли коллоидную устойчивость в течение 3 месяцев, при этом квантовый выход увеличился минимум в 3 раза по сравнению с исходными гидрофобными НК (рис.12).

Рис. 11 (а). Интенсивность флуоресценции НК (608 нм), НК, модифицированных РНЕАА-Са1р15-БОРЕ10 и сополимером малеинового ангидрида и 1Г тетрадесена; (б). Сравнение квантового выхода и стабильности во времени исходных НК, НК, модифицированных цистеином, сополимером малеинового ангидрида и 1- тетрадецена (РМАО-НК) и конъюгатом РНЕАА-Оа1р(15%)-ООРЕ(Ю%).

***** **♦♦♦ **♦♦♦ **♦♦♦ **♦♦♦ ***** **♦♦♦ ♦♦♦♦♦ **♦♦♦ *****

«ш **♦♦♦

**♦♦♦ **♦♦♦ **♦♦♦

Рис. 12. Сравнение квантового выхода и положение максимума флуоресценции исходных НК (1) и НК, модифицированных цистеином (2) и (1-меркаптоундеканоил-11-ил)тетраэтш1енгликолем (3).

Следует отметить, что модификация НК тиолсодержащими молекулами приводит к уменьшению квантового выхода более чем на 10% (Рис. 12), при этом красное смещение максимума флуоресценции составляет не менее 5-10 нм. В случае модификации НК амфифильными полимерами (без удаления стабилизирующего лиганда ТОФО с поверхности НК) смещения максимума флуоресценции не происходит (рис. 11,12).

Высокий квантовый выход, стабильные флуоресцентные свойства, малые размеры таких частиц и наличие функциональных групп на поверхности открывают перспективу их использования в in vitro и in vivo анализах для сверхчувствительной детекции биологических объектов на уровне единичных молекул (белков, нуклеиновых кислот, вирусов и др.), визуализации клеток и клеточных рецепторов, направленной доставки наночастиц в клетки и др.

Перечень разработанных типов флуоресцентных наноразмерных частиц и их характеристики приведены в сводной таблице 4. НК, модифицированные

соединениями № 2.1 и 2.6 апробированы в биоаналитических тестах для визуализации онкомаркеров, а также в качестве активного излучающего элемента для создания РКЕТ-зондов.

№ Модифицирующий агент Функциональные группы на поверхности модифицированных нк Диаметр частиц, им

2.1 Цистеин ш2, соон 5

2.2 Меркаптоэтанол/меркаптоуксусная кислота он, соон 8

2.3 Поли-Ь-лизин гидробромид, (ММ 15000-30000) nh2, соон 65

2.4 Инсулин, А и В цепи инсулина nh2, соон 88

2.5 Хитозан NHI 76

2.6 Мини-антитела 405-Н1з5, (28 кДа) nhj, соон

2.7 пдадмах ч - 24

Оа](5(15%)- РНЕАА- ЕЮРЕ(10%)

2.8 и I". ^ С л чХХД он 68

Сополимер малеинового ангидрида и 1- тетрадецена

2.9 1 соон 44

2.10 1 -меркаптоундеканоил-11 -тетраэталенгпиколь он 9

3. Примеры использования флуоресцентных полимерных частиц в биоанализе

3.1. Реакция латексной агглютинации в планшете и на стекле

Применение полученных флуоресцентных полимерных дисперсий в биоаналитических анализах проиллюстрировано рядом примеров. Флуоресцентные полимерные дисперсии №№ 1.2, 1.3 и 1.6 использованы в реакции латексной агглютинации.

Диагностические системы на основе РЛА в настоящее время получили широкое распространение в лабораторной диагностике. По своей чувствительности РЛА значительно превышает иммунодиффузные тесты, реакцию преципитации в геле и

встречный иммуноэлектрофорез, не уступает реакции пассивной гемагглютинации и может конкурировать с иммуноферментным и радиоиммунным анализами, прежде всего при использовании специальных анализаторов для учета степени агглютинации. Преимуществом метода РЛА является быстрота проведения реакции (в зависимости от разновидности - в планшете, объеме, на стекле или на фильтре - от 5 мин до 3 ч), а также возможность длительного хранения диагностикума. Полимерные дисперсии, используемые в этом анализе, должны удовлетворять всем ранее указанным требованиям и иметь диаметры в диапазоне 200-500 нм.

Способ проведения реакции, т.е. образования комплекса" «антитело-антиген», состоит в том, что антитела (антигены) связывают с твердыми полимерными носителями таким образом, что факт агглютинации иммобилизованных антител (антигенов) фиксируется визуально. Агглютинация наблюдается в виде образования равномерного покрытия полимерным носителем дна лунки, а если реакция агглютинации не прошла, то носитель скапливается на дне лунки в виде точечного преципитата. Разработано несколько вариантов реакции агглютинации, различающихся по методическому исполнению и цели исследования.

3.1.1 Микротитрационный вариант РЛА является одним из наиболее простых и чувствительных полуколичественных методов иммуноанализа. Реакцию проводят в 96-луночной планшете с Ч-образными лунками аналогично гемагглютинационному тесту. Обычно в этом анализе используют полимерные дисперсии с диаметром частиц более 300 нм.

Моноклональные антитела к антигену иммобилизовали на поверхность

флуоресцентных микросфер №1.2 и 1.3 за счет образования оснований Шиффа между поверхностными альдегидными группами полимерных частиц и аминогруппами антител. Антитела добавляли в количестве от 3 до 10 мг/г полимера. Результаты реакции РЛА в УФ - свете представлены на фото (рис. 13). При этом было найдено, что при использовании сополимерных микросфер №1.3 (диаметр 450 нм) и концентрации добавленных антител 4.8 мг/мл, минимально детектируемая концентрация составляет 15 нг/мл, что несколько выше, чем при использовании иммуноферментного анализа, но при более простой процедуре проведения анализа; при этом время проведения реакции в данном случае составило не более 2 ч.

В случае использования сополимерных дисперсий №1.2 с диаметром 230 нм минимально определяемая концентрация составила всего 250 нг/мл, а время проведения анализа превысило 8 ч (рис. 13).

Таким образом, полученные результаты подтвердили, что оптимальный размер полимерных микросфер для проведения РЛА в планшете соответствует 450 нм.

3.1.2 Анализ, основанный на реакции пассивной агглютинации на стекле, нашел широкое применение как метод, не требующий высокой квалификации и позволяющий быстро, в течение нескольких минут, дать ответ о присутствии детектируемого антилиганда. Для проведения РЛА на стекле диаметр полимерных микросфер должен быть не более 300 нм. Моноклональные антитела к антигену У.ре5//.г в количестве от 1 до 20 мг/г пол. иммобилизовали на поверхность флуоресцентных микросфер №1.2 с диаметром 230 нм. Постановку реакции агглютинации осуществляли в капле на предметном стекле, учет результатов производили при наблюдении в УФ-свете через 10 мин после добавления антигена. Чувствительность метода составила в данном случае 50 мкг/мл.

3.1.3 Флуоресцентные ЭЦ наночастицы с диаметром в диапазоне 80-120 нм также могут выступать в качестве носителей для биолигандов и флуоресцентных маркеров и полностью удовлетворяют требованиям для постановки РЛА на стекле. На

поверхность флуоресцентных этилцеллюлозных частиц №1.6 иммобилизовали моноклональные антитела к антигену Y.pestis.

1 0.5 0.25 0.125 0.062 0.031 0.015 control

№1.3

1/20 1

1/40 0.5

1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 control 0.25 0.125 0.062 0.031 0.015 control

№1.2

Рис. 13. РЛА

флуоресцентных сополимерных микросфер №№1.3 и 1.2 с включенными НК (диаметр ядра СЖе 3,7 нм). Микросферы

сенсибилизированы моноклональными антителами к У.ре^ (0,8 мг/г полимера). 1-й ряд - реакция агглютинация при добавлении антигена У./геуйг (начальная

1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 control концентрация антигена 1 мг/мл). 2-й ряд - отрицательный контроль - при добавлении нормальной кроличьей сыворотки.

Рис. 14. PJ1A ЭЦ флуоресцентных частиц (№1.6) с включенными НК (максимум флуоресценции 546 нм). 1. ЭЦ частицы, сенсибилизированы моноклональными антителами к Y.pestis. 1 - реакция агглютинации при добавлен™ антигена Y.pestis с концентрацией 10 мкг/мл). 2 - отрицательный контроль - ЭЦ наночастицы, сенсибилизированные моноклональными антителами к Y.pestis в отсутствии антигена.

(методика описана в диссертационной работе). Антитела добавляли в количестве от 3 до 10 мг/г полимера. Результаты реакции РЛА в УФ-свете показали, что чувствительность анализа составляет 5 мкг/мл, а время проведения анализа не превышает 5 мин (рис. 14).

Таким образом, продемонстрирована возможность создания экспресс-диагностических систем на основе флуоресцентных синтетических и природных полимерных дисперсий с размерами в диапазоне 150-500 нм и функциональными группами на поверхности, позволяющая проводить скрининговые исследования методами РЛА в планшете и на стекле.

3.2. Цитофлуориметрический анализ

Другой не менее перспективный вариант использования флуоресцентных полимерных дисперсий - проточная цитофлуориметрия, позволяющая анализировать спектральные свойства каждой из проходящих через детектор микросферы. Использование спектрально кодированных полимерных микросфер предполагает анализ каждой микросферы для выявления и анализа значимых событий, свидетельствующих о присутствии в анализируемой пробе каждого из детектируемых объектов.

Полимерные дисперсии №1.3, полученные при эквимолярном соотношении сомономеров акролеина и стирола и содержащие НК двух типов с максимумами флуоресценции 530 и 610 нм, использовали для мечения и регистрации клеток линии 1игка1 (Т-лимфобластной лейкемии) методом проточной цитофлуориметрии (рис.15). В результате инкубации в течение 20 минут на поверхности клеток 1игка1 сорбировалось в среднем 10-15 флуоресцентных полимерных микросфер (рис. 15).

Таким образом, продемонстрирована возможность использования полимерных дисперсий, содержащих флуоресцентные НК, для мечения и разделения клеток.

а I 6 S- ■ в ж

■ш

ш | 1 0е 10' io1 10' Ь If а® W

Рис. 15. Мечение клеток Jurkat субмикронными флуоресцентными полимерными микросферами № 1.3: (а) - исходные клетки, (б) - клетки, меченные микросферами, кодированными «красными» НК (Х,шсс = 610 нм) и (в) - клетки, меченные микросферами, кодированными смесью «красных» и «зеленых» НК (Хшисс = 610 нм и 530 нм). Клетки анализировали на проточном цитофлуориметре Beckman Coulter Epics XL (каналы регистрации - FL1 - 505-545 нм; FL3 - 605-635 нм; возбуждение - аргоновый лазер, Xb036. = 488 нм).

Фон рассеяния немеченых клеток (рис. 15) отсекается выбором минимального уровня регистрации по каналу FL3 (605-635 нм) - МО2 (показан горизонтальной линией). Регистрация сигнала выше этого уровня позволяет выявить клетки, меченные «красными» полимерными микросферами (^,мисс=610 нм). Клетки с адсорбированными на поверхности полимерных микросфер двух цветов ХзМИСС=610 нм и 530 нм дают примерно одинаковый вклад в оба канала регистрации: FL1 (505-545 нм) и FL3 (605-635 нм). Сигналы от этих клеток выделяются выбором минимальных уровней регистрации по каналам FL1 и FL3 - 5 -102 и 1 • 102 соответственно (показаны вертикальной и горизонтальной линиями).

3.3. Иммунофлуоресцентное мечение клеток

3.3.1 Иммунофлуоресцентное мечение клеток полимерными микросферами, наполненными НК

Для анализов, связанных с визуализацией специфических рецепторов на поверхности клеток, необходимо использовать флуоресцентные полимерные носители-маркеры, диаметр которых не превосходит 250 нм. Данному требованию наилучшим образом удовлетворяют полимерные дисперсии № 1.5. Указанные флуоресцентные полимерные микросферы (соотношение мономеров акролеин:стирол 10:1 с включенными НК с Ь,ы=610 нм), конъюгировали с мини-анителами 4П5~Н]'55, взятыми в различных концентрациях, для визуализации онкомаркера НЕЮ/пеи, гиперэкспрессирующегося на поверхности многих раковых клеток (при раке молочной железы, предстательной железы, яичника, желудка, легких). Ранняя диагностика НЕ112/пеи, гиперэкспрессия которого ассоциирована со злокачественными опухолями и неблагоприятным прогнозом у пациентов, является в настоящее время одной из наиболее актуальных проблем современной медицины. После обработки полученными конъюгатами клеток ЭКВЯ-З, гиперэкспрессирующих онкомаркер НЕ112/пеи, наблюдалось характерное свечение клеток, причем интенсивность флуоресценции коррелировала с концентрацией антител в образцах (рис.16).

После инкубации клеток с полимерными частицами, конъюгированными с овальбумином в тех же концентрациях, флуоресцентного свечения клеток не наблюдалось (рис.16). Таким образом, связывание полимерных частиц, конъюгированных с мини-анителами 405-Н1б5 с НЕ112/пеи-гиперэкспрессирующими

клетками является специфическим, и полученные конъюгаты могут быть использованы для мечения и визуализации опухолевых клеток.

Рис. 16. Микрофотографии клеток SKBR-3, меченные флуоресцентными полимерными микросферами №1.5, конъюированными с 4D5-His5.

Концентрация 4D5-His5 в конъюгирующей смеси 0.425 мкг/мл (1) и 0,085 мкг/мл (2), (3) - контроль, клетки SKBR-3, меченные флуоресцентными полимерными микросферами №1.5, конъюгированными с овальбумином.

3.3.2. Иммунофлуоресцентное меченые клеток НК, модифицированными бифункциональными тиолсодержащими молекулами

НК, модифицированные тиолсодержащими молекулами, характеризующиеся высокими флуоресцентными свойствами и наличием функиональных групп на поверхности, также весьма перспективны для визуализации комплекса "лиганд-антилиганд". Малый размер таких комплексов (5-10 нм) даст возможность применять их в анализах in vitro и in vivo для мечения и визуализации клеток и клеточных рецепторов.

;

9 В

Рис. 17. Микрофотографии клеток ЭКОУ-3, окрашенных конъюгатом барстар-Цис-НК.

а - 8КОУ-3, меченные конъюгатом барстар-Цис-НК после обработки барназой.

б - Контроль - ЯКОУ-З, меченные конъюгатом барстар-Цис-НК.

Для разработки биоаналитического теста для идентификации онкомаркера НЕК2/пеи НК, модифицированные цистеином (частицы №2.1), конъюгировали с белком барстаром методом карбодиимидной активации карбоксильных групп. Тест был выполнен на клетках человеческой аденокарциномы яичника линии 8КОУ-3 (рис. 17). После предварительной обработки клеток барназой полученные конъюгаты гидрофилизированных цистеином НК с барстаром с высокой специфичностью окрашивали поверхность НЕЛ2/пеи -гиперэкспрессирующих клеток линии ЭКОУ-З.

Таким образом, продемонстрирована специфичность взаимодействия полученных конъюгатов, а также показана потенциальная возможность использования

таких НК для визуализации опухолевых клеток, экспрессирующих онкомаркер HER2/neu, и последующей разработки диатостикумов рака.

3.4. Визуализация объектов внутри биологических тканей

Уникальные оптические свойства полупроводниковых НК, такие как фотостабильность и широкий диапазон полос флуоресценции в зависимости от диаметра ядра НК, в том числе и в ближнем инфракрасном диапазоне, делают их привлекательными для использования в качестве in vivo маркеров при визуализации глубоко расположенных тканей и органов. Для имитации опухоли гидрофилизированные НК №2.1 с максимумом флуоресценции 620 нм в диапазоне концентраций 0.003-0.3 мг/мл запаивали в стеклянную капсулу и помещали в пищевод животных. Исследуемый объект сканировали в конфигурации «на просвет» лазерным источником излучения во флуоресцентном оптическом диффузионном томографе (ФДТ-установке). В результате методом флуоресцентной оптической диффузионной томографии были получены изображения капсул с высоким контрастом, что хорошо видно на рис. 18.

Рис. 18. Стеклянная капсула с гадрофшшзированными НК (№2.1, концентрация -0.3 мг/мл). Внутренний диаметр капсулы 2 мм. Флуоресцентный диффузионный томограф, экспериментальный прибор (ИПФАН).

Характеристики прибора: лазерный источник излучения Nd:YAG с удвоением частоты, X = 532 нм, детектор: Hamamatsu Н7422-20.

Данный результат указывает на возможность использования НК, конъюгированных со специфическими биолигандами, для установления точной локализации опухолей в in vivo диагностике.

4. Применение гидрофилизированных полупроводниковых НК для создания биоаналитических флуоресцентных сенсоров

Одним из наиболее актуальных направлений современной аналитической биотехнологии является создание новых ультрачувствительных измерительных методик, позволяющих регистрировать наличие единичных биологических молекул в многокомпонентных биосистемах и определять основные параметры их межмолекулярного взаимодействия. Исторически одним из наиболее распространенных подходов является регистрация оптических параметров биообъектов, таких как спектры электронного поглощения, флуоресцентные свойства, колебательные спектры и т.д. Технические достижения последнего десятилетия позволили довести пространственную область измерений и пределы детекции ряда вышеперечисленных оптических методик до возможности регистрации единичных молекул. В частности, объединение аппаратного комплекса сканирующей зондовой микроскопии и конфокальной микроспектроскопии привело к появлению такого метода, как сканирующая спектроскопия резонансной передачи энергии (сканирующая FRET-микроспектроскопия, «Förster resonance energy transfer»). Измерительная методика сканирующей FRET-микроспектроскопии основана на регистрации изменения сигнала флуоресценции полупроводниковых НК, нанесенных на острие

зондов ближнепольного оптического микроскопа (БОМ) и модулируемой эффективностью резонансной передачи энергии (FRET-эффект) при контакте с исследуемым биообъектом, нанесенным на подложку.

В качестве излучающего элемента FRET-зонда предложено использовать смеси гидрофилизированных НК с двумя различными диаметрами ядер и имеющих, соответственно, две полосы испускания флуоресценции, нанесенные на излучающую апертуру оптоволоконного БОМ - зонда. Наличие двух достаточно далеко разнесенных полос флуоресценции от НК двух типов позволит проводить не прямое измерение интенсивности флуоресценции, модулируемой взаимодействием донорных НК с исследуемым объектом, а измерение относительных интенсивностей двух пиков флуоресценции - от донорных (взаимодействующих по механизму FRET с исследуемым веществом) и от референсных (не взаимодействующих) НК, что значительно повысит достоверность получаемых результатов. Полоса флуоресценции донорных НК может легко варьироваться в зависимости от задач, при этом источник возбуждения остается прежним.

Рис. 19. Спектрально - морфологическое исследование тестовых участков №1, 2, 3 покровного стекла с нанесенными монослоями из «зеленых» и «красных» гидрофилизированных цистеином НК.

Полученные в настоящей работе гидрофилизированные НК (№2.1) использованы в качестве активного излучающего элемента для создания флуоресцентных FRET-зондов. В рамках проведенных исследований разработана методика нанесения моно- и суб-монослоев смеси гидрофилизированных НК (№2.1) с двумя различными длинами волн флуоресценции на поверхность покровных стекол, модифицированных поли-Ь-лизином, которая является первым подготовительным шагом перед формированием подобных структур на поверхности излучающей апертуры оптоволоконного БОМ-зонда. Полученные суб- и монослои характеризовались плотной упаковкой и высокой пространственной однородностью, что, в конечном счете, определяет стабильность флуоресцентных свойств на

макромасштабном уровне (рис. 19) при многократном сканировании одного и того же участка. Полученные в результате монослои флуоресцентных гидрофилизированных НК обладают высоковоспроизводимыми свойствами и полностью удовлетворяют требованиям для последующего создания ближнепольных РЮБТ-зондов: отношение сигнального пика флуоресценции к референсному составляет = 1.5±0.1 и не изменяется на макромасштабных расстояниях более чем на 0.2%. Кроме того, монослои обладают очень высокой трибологической устойчивостью и не требуют дополнительных защитных покрытий (рис. 20 А, Б).

Рис. 20 А. Опытный образец покровного стекла с нанесенными на поверхность монослоями флуоресцентных НК (№2.1), с двумя различными диаметрами ядер. Морфология монослоев гидрофилизированных НК и их флуоресцентные свойства исследовались на участках 1, 2 и 3. Б. Демонстрация трибологической устойчивости осажденных на покровное стекло монослоев гидрофилизированных НК (№2.1). Последовательное сканирование одного и того же участка 10 раз подряд, показаны результаты первого и десятого сканирования.

Работа по формированию монослоев двухцветных флуоресцентных НК с подобной воспроизводимостью проведена впервые и ее результаты могут внести существенный вклад в создание ближнепольных Р11ЕТ-зондов и сенсоров, что, в свою очередь, должно привести к созданию измерительных методик ближнепольной РРЕТ-микроскопии.

1. Разработаны способы получения универсальных флуоресцентных полимерных носителей на основе акролеина, содержащих полупроводниковые НК. Широкий диапазон диаметров частиц (100-500 нм), фотостабильность и высокий квантовый выход, оптическое кодирование носителей путем введения смесей НК с различными длинами волн флуоресценции при возбуждении флуоресценции одним монохроматическим источником, а также универсальный протокол иммобилизации открывают новые возможности их использования в качестве маркеров для различных видов биоанализа.

2. Показано, что использование флуоресцентных полимерных носителей в таких анализах, как реакция латексной агглютинации, проточная цитофлуориметрия, иммунофлуоресцентное мечение клеток позволяет детектировать биоспецифическое взаимодействие «лиганд-антилиганд», используя более простую процедуру проведения анализа по сравнению с традиционными анализами (ИФА, флуороиммуноанализ и т.д.).

а

Выводы

3. Разработаны способы модификации поверхности индивидуальных НК с замещением и без октального лиганда, стабилизирующего НК в процессе получения, синтетическими и природными полимерами. Получена серия коллоидно-устойчивых, функционализированных, флуоресцентных наноразмерных (5-80 нм) аналитических реагентов с высоким квантовым выходом для in vitro и in vivo анализа.

4. Показана эффективность использования таких флуоресцентных наноразмерных реагентов для мечения клеток, а также продемонстрирована перспективность их использования для визуализации объектов внутри живых тканей.

5. Впервые разработан подход к созданию флуоресцентных зондов для сканирующей ближнепольной оптической микроспектроскопии, целью которой является ультрачувствительный многопараметрический анализ наноразмерных структур.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Chistyakov A. A., Martynov I. L., Mochalov К. Е., Oleinikov V. A., Sizova S.V., Ustinovich Е. А., Zakharchenko К. V. Interaction of CdSe/ZnS Core-Shell Semiconductor Nanociystals in Solid Thin Films, Laser Physics, 2006, Vol. 16, No. 12, pp. 1625-1632.

2. Генералова A.H., Сизова C.B., Артемьев В.П., Баранов A.B., Олейников В.А., Зубов В.П., Синтез субмикронных сополимерных (акролеин/стирол) микросфер, содержащих флуоресцентные полупроводниковые CdSe/ZnS нанокристаллы. Российские нанотехнологии, 2007, т.2, №7-8, стр. 144-154.

3. Зубов В.П., Капустин Д.В., Генералова А.Н., Ягудаева Е.Ю., Вихров A.A., Сизова C.B., Муйдинов М.Р., Модификация твердых материалов полимерными нанослоями как способ получения новых биоматериалов. Высокомолекулярные соединения, Серия А, т. 49, № 12, 2007, стр. 2042-2062.

4. Generalova A.N., Sizova S.V., Oleinikov V.A., Zubov V.P., Artemyev M.V., Spemath L., Kamyshny A., Magdassi Sh. Highly Fluorescent Ethyl Cellulose Nanoparticles Containing Embedded Semiconductor Nanociystals. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. Doi: 101016/j.colsurpa.2009.04.007.

5. Сизова C.B., Гонцова M.C., Генералова АН., Зубов В.П., Артемьев М.В., Набиев И.Р., Вихров A.A., Мочалов К.Е., Олейников В.А., Полиакролеиновые латексы, содержащие (CdSe)ZnS нанокристаллы, для флуоресцентного мечения биологических объектов, Международная конференция «Лазерная физика и оптические технологии». Гродно, Белоруссия, 25-29 сентября, 2006.

6. Балалаева И.В., Орлова А.Г., Турчин И.В., Клешнин М.С., Плеханов В.И., Ширманова М.В., Здобнова Т.А., Сизова C.B., Каменский В.А., Метод флуоресцентной диффузионной томографии для визуализации опухолей, меченых квантовыми точками. Труды VIII Международной конференции «Опто-, наноэлектроника, нанотехнологии и микросистемы», Ульяновск, 26-30 июня, 2006, стр. 241.

7. Generalova A.N., Sizova S.V., Zubov V.P. Labeled polymer particles. Iм NACBO International Nanobiotechnology Conference "New materials in nanobiotechnology and its applications". Urbino, Italy, 11-13 September, 2006.

8. Sizova S.V., Generalova A.N., Zubov V.P., Semiconductor Nanocrystals (CdSe)ZnS modification with fimctioanalized polymers. 1* NACBO International Nanobiotechnology Conference "New materials in nanobiotechnology and its applications", Urbino, Italy, 11-13 September, 2006.

9. Сизова C.B., Генералова A.H., Баранов A.B., Зубов В.П., Олейников В.А., Получение полимерно-капсулированных (CdSe)ZnS налокристаллов для использования в биоанализе. Российская школа-конференция молодых ученых «Биосовместимые наноструктурные материалы и покрытия медицинского назначения». 25 сентября-1 октября, Белгород, 2006, стр. 242.

10. Сизова C.B., Генералова А.Н., Клинов Д.В., Мочалов К.Е., Олейников В.А., Зубов В.П., Новые флуоресцентные полимерсодержащие реагенты для биоанализа. XVIII менделеевский съезд по общей и прикладной химии. Тезисы докладов, Москва, 23-28 сентября, 2007 г., т.2, стр. 518.

11. Олейников В.А., Генералова А.Н., Сизова C.B., ХанефтМ.С., Клинов Д.В., Мочалов К.Е., Зубов В.П. Новые полимерные реагенты для биоанализа, содержащие флуоресцентные полупроводниковые CdSe(ZnS) нанокристаллы. В сб. III Международная конференция по коллоидной химии и физико-химической механике, Москва, 24-28 июня, 2008.

12. Генералова А.Н., Сизова C.B., Клинов Д.В., Мочалов КЕ., Здобнова Т.А., Деев C.M., Зубов В.П., Олейников В.А. Флуоресцентные сополимерные частицы для биоанализа, содержащие инкапсулированные полупроводниковые нанокристаллы. В сб. III Международная конференция по коллоидной химии и физико-химической механике, Москва, 24-28-июня, 2008, с.57.

13. Сизова C.B., Генералова А.Н., Мочалов К.Е., Зубов В.П., Олейников В.А. Новые полимерные конъюгаты полупроводниковых (CdSe)2nS налокристаллов для биотехнологии. Пятый московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Материалы конгресса. Москва, 16-20 марта, 2009, стр. 484.

Бумага для множительных аппаратов. Печать офсетная.

Формат 60x84/16. Тираж 100 экз. Заказ №804

Типография ООО "ФЭД+", Москва, ул. Кедрова, д. 15, тел. 774-26-96

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Сизова, Светлана Викторовна

ВВЕДЕНИЕ.б

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ ПОЛУПРОВОДНИКОВЫЕ НАНОКРИСТАЛЛЫ ДЛЯ БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЫ.

1.1 Синтез полупроводниковых НК.

1.2 Оптические свойства НК.

1.3 Способы гидрофилизации полупроводниковых нк./.

1.3.1 Перевод НК в водную фазу посредством замещения ТОФО бифункциональными тиолсодержащими лигандами.

1.3.2 Перевод НК в водную фазу посредством гидрофобных взаимодействий между молекулами ТОФО и гидрофобными группами амфифильных полимерных молекул.

1.3.3 Включение НКв полимерные микросферы.

1.4 Способы иммобилизации биологических молекул на флуоресцентные НК.

1.5 Применение полупроводниковых НК в биологии и биотехнологии.

1.5.1 Использование НКв иммуноанализе.

1.5.2 Применение полупроводниковых НК в генных технологиях.

1.5.3 Мечение клеток и клеточных рецепторов.

1.5.4 Методы, основанные на резонансном переносе энергии флуоресценции(РЯЕТ).

1.5.4.1 РКЕТ-спектроскопия.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение биоаналитических реагентов на основе полимерно-капсулированных полупроводниковых (CdSe)ZnS нанокристаллов"

Интенсивное развитие широкого класса методов анализа, основанных на использовании различных флуоресцентных меток, сделало их одними из важнейших экспериментальных методов во многих научных дисциплинах. В частности, их применение в биотехнологии и медицине привело к появлению и развитию методов, облегчающих изучение живых клеток и клеточных структур, фундаментальных клеточных процессов и методов регистрации биоспецифических взаимодействий, находящих применение в медицинской диагностике и разнообразных биологических анализах.

В последние годы интенсивно разрабатываются подходы к визуализации процессов на уровне клеток, тканей и целых организмов, основанные на введении специализированных флуоресцентных меток. Одними из наиболее перспективных меток нового поколения являются флуоресцентные полупроводниковые нанокристаллы (НК), состоящие из элементов групп II-VI, III-V и имеющие структуру ядро/оболочка.

Полупроводниковым НК присущи два основных достоинства, отличающие их от органических флуорофоров: 1) широкий набор узких полос флуоресценции, положение которых зависит от диаметра НК и является управляемым параметром при возможности возбуждения излучением с одной длиной волны; при этом длина волны возбуждения может варьироваться для получения максимального отношения сигнал/шум с учетом конкретного изучаемого объекта; 2) высокая фотостабильность НК, в 100-4000 раз превышающая фотостабильность лучших органических флуорофоров. Такие свойства делают НК идеальными флуоресцентными биомаркерами в анализах, основанных на биоспецифическом взаимодействии «лиганд-рецептор» в разнообразных in vitro и in vivo биоаналитических системах, в которых использование традиционных органических флуорофоров ограничено недостаточной фотостабильностью и невозможностью одновременной регистрации в многопараметрических (многоцветных) системах. Кроме того, такие НК весьма перспективны для создания новых флуоресцентных сенсоров, действие которых основано на использовании эффекта резонансной передачи энергии (БКЕТ-эффект). Химический анализ многокомпонентных смесей, в частности, детектирование наличия в смеси определенных ионов металлов, биологических соединений и т.д., и анализ ряда физических параметров, таких как рН, электрохимический потенциал, температура в наномасштабных областях также является потенциальной областью применения данных сенсоров.

НК состава Сс18е/7п8 с диаметром 2-6 нм, используемые в данной работе, являются альтернативой органическим флуоресцентным меткам, традиционно применяемым в биотехнологии и медицине благодаря высокой яркости, возможности получения флуоресценции по всему оптическому диапазону и доступности. Оболочка из широкозонного полупроводника предохраняет флуоресцирующее ядро от влияния окружения и позволяет получить НК с квантовым выходом до 70%.

Одной из основных проблем использования таких флуоресцентных НК является трудность получения биосовместимых, легко конъюгируемых с биологическими молекулами флуоресцентных комплексов на их основе, что ограничивает их применение в медицине и биотехнологии в качестве эффективных флуоресцентных биомаркеров и сенсоров. Для решения указанной проблемы в настоящей работе разработан ряд способов модификации и функционализации поверхности НК для создания высокоэффективных и специфичных флуоресцентных биомаркеров и продемонстрированы примеры их использования в таких видах биоанализа, как реакция латексной агглютинации (РЛА), визуализация клеток и клеточных рецепторов, цитофлуориметрия.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Сизова, Светлана Викторовна, Москва

1. 1. Олейников В. А., Суханова A.B., Набиев И.Р. Флуоресцентные полупроводниковые НК в биологии и медицине // Российские нанотехнологии. - 2007.- Т.2.- № 1-2. С. 160-173.

2. Bruchez, M.Jr., Moronne, М., Gin, P., Weiss, S., Alivisatos. A.P. Semiconductor Nanociystals as Fluorescent Biological Labels // Science,- 1998.- V. 281.- p. 20132016.

3. Haugland, R.P. The Handbook A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies; Tenth Edition. Invitrogen Corporation // San Diego.- 2005.

4. A.L. Efros, A.L. Efros. "Interband Absorption of Light in a Semiconductor Sphere // Sov. Phys. Semicond.- 1982.- №16.- p. 772.

5. Екимов А.И., Онущенко A.A. Квантовый размерный эффект в оптических спектрах полупроводниковых микрокристаллов. Физика и техника полупроводников//ФШ/- 1982.-Т. 16.-С. 1215-1219.

6. Murray С.В., Norris DJ., Bawendi. M.G. Synthesis and Characterization of Nearly Monodisperse CdE (E = Sulfur, Selenium, Tellurium) . Semiconductor Nanociystallites. II J. Am.Chem. Soc.-1993.-V.l 15.- p. 8706-8715.

7. Peng X., Schlamp M.C., Kadavanich A.V., Alivisatos A.P. Epitaxial Growth of Highly Luminescent CdSe/CdS Core/Shell Nanocrystals with Photostability and Electronic Accessibility. II J. Am. Chem. Soc. -1997.V. 119.- P. 7019-7029.

8. Murray C.B., Kagan C.R., Bawendi M.G. Synthesis and Characterization of Monodisperse Nanocrystals and Close-Packed Nanociystal Assemblies.//^««. Rev. Mater. Sci.- 2000.-V. 30.- P. 545-610.

9. Hines M.A., Guyot-Sionnest. Synthesis and Characterization of Strongly Luminescing ZnS-Capped CdSe Nanociystals HP. J. Phys. Chem. B.- 1996.-V. 100.-P. 468.

10. Baranov A.V., Rakovich Yu.P., Donegan J.F., Perova T.S., Moore R.A., Talapin D.V., Rogach A.L., Masumoto, Y., Nabiev Effect of ZnS shell thickness on the phonon spectra in CdSe quantum dots///. Phys. Rev. B 2003.- V. 68.- P. 165306.

11. Sukhanova A., Devy J., Venteo L., Kaplan H., Artemyev M., Oleinikov V., • Klinov D., Pluot M., Cohen J.H.M., Nabiev I. Biocompatible fluorescent nanocrystalsfor immunolabeling of membrane proteins and cellsIIAnal. Biochem.- 2004.- V. 324, P. 60 67.

12. Henglein A. Small-particle research: physicochemical properties of extremely small colloidal metal and semiconductor particles //Chem. Rev.- 1989.- V. 89.- P. 1861.

13. Alivisatos A.P. Semiconductor clusters, nanocrystals, and quantum dots// Science.- 1996.- V. 271.- P. 933.

14. Nirmal M., Brus L.E. Luminescence photophysics in semiconductor nanocrystals HAcc. Chem. Res. 1999.- V. 32.- P. 407 - 414.

15. Dubertret B., Calame M., Libchaber A.J. Single-mismatch detection using gold-quenched fluorescent oligonucleotides//Nat. Biotechnol- 2001.- V. 19.- P. 365.

16. Elghanian R., Storhoff J .J., Mucic R.C., Letsinger R.L., Mirkin C.A. Selective Colorimetric Detection of Polynucleotides Based on the DistanceDependent Optical Properties of Gold Nanoparticles //Science.- 1991.- V. 277.- P. 1078.

17. De Smet Y., Deriemaeker L., Parloo E., Finsy R. On the Determination of Ostwald Ripening Rates from Dynamic Light Scattering Measurements // Langmuir.1999.-V. 15.-P. 2327.

18. C.W. Chan, S. Nie, Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection. Science.- 281.- 1998.- P. 2016-2018.

19. Koberling F., Kolb U., Philipp G., Potapova I., Basche T., Mews A. Fluorescence Anisotropy and Crystal Structure of Individual Semiconductor Nanocrystals // J. Phys. Chem. B.- 2003.-V. 107.- N. 30.- p. 7463.

20. T. Kundu, J. Bereiter-Hahn, and I. Karl. Cell Property Determination from the Acoustic Microscope Generated Voltage Versus Frequency Curves UBiophys. J.2000.- V. 78.- P. 2270.

21. Dahan M., Laurence T., Pinaud F., Chemla D.S., Alivisatos A.P., Sauer M., Weiss S. Time-gated" biological imaging by use of colloidal quantum dots. // Opt. Lett.2001.- V. 26.-P. 825.

22. Lounis B., Bachtel H.A., Gerion D., Alivisatos P., Moerner W.E. Photon antibunching in single CdSe/ZnS quantum dot fluorescence //Chem. Phys. Lett.-2000.- V. 329.- P. 399 404.

23. Micic O.I., Cheong H.M., Fu H., Zunger A., Sprague J.R., Mascarenhas A., Nozik A J. Size-dependent spectroscopy of InP quantum dots///. Phys. Chem. B.- 1997.- V. 101.- P. 4904.

24. Prieto J:A., Armelles G., Groenen J., Cales R. Size and strain effects in the E-l-like optical transitions of InAs/InP self-assembled quantum dot structures. //Appl. Phys. Lett. 1999.- V. 74.- P. 99.

25. Hu J.T., Li L., Yang W., Manna L., Wang L., Alivisatos A.P. Linearly polarized emission from colloidal semiconductor quantum rods. //Science.- 2001.- Y. 292.- P. 2060.

26. Efros A.L. Luminescence polarization of CdSe microciystals//Phys. Rev. B.-1992.- V. 46.- P. 7448.

27. Empedocles S.A., Neuhauser R., Bawendi M.G. Three-dimensional orientation measurements of symmetric single chromophores using polarization microscopy //Nature, 1999, v. 399, p. 126.

28. J. Aldana, Y.A. Wang, X. Peng, Photochemical instability of CdSe nanocrystalls coated by hydrophilic thiols //J. Am. Chem. Soc. -2001.- V. 123.- P. 8844-8850.

29. S.F. Wuister, I. Swart, F. van Driel, S.G. Hickey, C. de Mello Donega, Highly luminescent water-soluble CdTe quantum dots //Nano Lett.- 2003.- V.3.- P. 503-507.

30. S. Pathak, S.K. Choi, N. Arnheim, M.E. Thompson, Hydroxylated quantum dots as luminescent probes,for in situ hybridization //J. Am. Chem. Soc.- 2001.-V. 123.- P. 4103-4104.

31. H.M. Mattoussi J.M, E. Goodman, G.P. Anderson, V.C. Sundar, F.V. Mikulec, M.G. Bawendi, Self-assembly of CdSe-ZnS quantum dot bioconjugates using an engineered recombinant protein // J. Am. Chem. Soc.- 2000.- V. 122.- P. 12142.

32. S. Kim, M.G. Bawendi, Oligomeric ligands for luminescent and stable nanocrystal quantum dots IIJ. Am. Chem. Soc.-2003.- V. 125.- P. 14652-14653.

33. Sukhanova A., Artemyev M., Sharapov O., Baranov A., Jardillier J.C., Nabiev I. Ultrasensitive non-isotopic water-soluble nanocrystals // European, Eurasian and USA patents EP1366347; US2004105973; W002073155. 09/03/2001.

34. Mitchell G.P., Mirkin C.A., Letsinger R.L. Programmed Assembly of DNA Functionalized Quantum Dots HJ. Am. Chem. Soc.- 1999.- V. 121.- P. 8122.

35. Willard D.M., Carillo L.L., Jung J. Van Orden A. CdSe-ZnS Quantum Dots as Resonance Energy Transfer Donors in a Model Protein-Protein Binding Assay IINano Lett.- 2001.-V. 9.- P. 469.

36. Hong R., Fischer N.O., Verma A., Goodman C.M., Emrick T., Rotello V.M. J. Control of Protein Structure and Function through Surface Recognition by Tailored Nanoparticle Scaffolds I/Am. Chem. Soc.- 2004.- V. 126.- P. 739.

37. Guo W., Li J.J., Wang Y.A., Peng X. Conjugation chemistry and bioapplications of semiconductor box nanocrystals prepared via dendrimer bridging.//C/2em. Mater.-2003.-V. 15.-P. 3125.

38. Kim S., Bawendi M.G. Oligomeric Ligands for luminescent and stable nanocrystal quantum dots HJ. Am. Chem. Soc.- 2003.-V. 125.- P. 146-52.

39. Sukhanova A., Devy J., Venteo L., Artemyev M., Oleinikov V. Biocompatible fluorescent nanocrystals for immunolabeling of membrane proteins and cells // Analytical Biochemistry.- 2004.- V. 324.- P. 60-67.

40. Pellegrino T., Manna L., Kudera S., Koktish D., Rogach A.L., Natile G., Parak W.J. Hydrophobic Nanocrystals Coated with an Amphiphilic Polymer Shell: A General Route to Water Soluble Nanociystals // Nano Lett.- 2004.- V. 4.- P. 703.

41. X. Wu, H. Liu, J. Liu, K.N. Haley, J.A. Treadway, J.P. Larson, N. Ge, F. Peale, M.P. Bruchez. Immunofluorescent labeling of cancer marker Her2 and other cellular targets with semiconductor quantum dots //Nat. Biotechnol.- 2003.-V.21.- P. 41-46.

42. Zhivko Zhelev, Hideki Ohba, and Rumiana Bakalova, Single Quantum Dot-Micelles Coated with Silica Shell as Potentially Non-Cytotoxic Fluorescent Cell Tracers, // J. Am. Chem. Soc.-2006.-V.128.- P. 6324-6325.

43. Han M., Gao X., Su J. Z., Nie S. Quantum-Dot-Tagged Microbeads for Multiplexed Optical Coding of Biomolecules //Nat. Biotechnol.- 2001.-V. 19.- P.631.

44. Radtchenko I. L., Sukhorukov G. B., Gaponik N., Kornowski A., Rogach A. L., Mohwald H. Uniform Complete Shells in One Step //Adv. Mater.-2001.- V.13.-P.1684.

45. Hirai T., Saito T., Komasawa I. Stabilization of CdS nanoparticles immobilized on thiol-modified polystyrene particles by encapsulation with polythiourethane HJ. Phys. Chem. 5.-2001.- V.105.-P. 9711.

46. Yang X., Zhang Y. Encapsulation of Quantum Nanodots in Polystyrene and Silica Micro-/Nanoparticles // Langmuir.-2004.-V.-20.- P. 6071.

47. Paul O'Brien, Siobhan S. Cummins, Dan Darcy, Angela Dearden, Ombretta Masala, Nigel L. Pickett, Steve Ryley and Andrew J. Sutherland, Quantum dot-labelled polymer beads by suspension polymerization HChem. Commww.-2003.-P. 2532-2533.

48. D. Wang, A. Rogach, F. Caruso, Semiconductor quantum dotlabeled microsphere bioconjugates prepared by stepwise selfassembly // Nano Lett. -2002.-V.2.-P. 857 -861.

49. Miiller F, Gotzinger S, Gaponik N, Weller H, Mlynek J, Benson Article Investigation of Energy Transfer between CdTe Nanocrystals on Polystyrene Beads and Dye Molecules for FRET-SNOM Applications// J Phys Chem Д-2004.-У.108.-P. 14527.

50. J. Riegler . O. Ehlert. T. Nann, A facile method for coding and labeling assays on polystyrene beads with differently colored luminescent nanocrystals. IIAnal Bioanal Chem.-2006.-V. 384.- P. 645-650.

51. Gao X., Nie S. Quantum dot-encoded mesoporous beads with high brightness and uniformity: rapid readout using flow cytomQtryIIAnal. Chem.-2004.- V. 76.- P. 24062410.

52. JoumaaN., Lansalot M., Thretz A., Elaissari A., Sukhanova A., Artemyev M.,Nabiev Г;, Cohen J.H.M. Synthesis of Quantum Dót-Tagged Submicrometer Polystyrene Particles by Miniemulsion Polymerization //Langmuir.-2006,- V. 22.- P. 1810.

53. Сизова C.B., Гонцова M.C., Генералова A.H., Зубов В.П., Артемьев М:В., Набиев И.Р., Баранов А.В., Мочалов К.Е., Олейников В.А. // Материалы VI Межд. Конф. «Лазерная физика и оптические технологии».- Гродно.-2006. -Ч. 1.-C. 278:

54. Slomkowski S. Polyacrolein containing microspheres: synthesis, properties and possible medical applications //Prog. Polym. Science.-1998.-V. 231- P. 815 874.

55. Bo C., Ping Z. A New Determining Method of Copper(III) Ions at ng ml(-l) Levels Based on Quenching of the Water-Soluble Nanocrystals Fluorescence. I I Anal. Bioanal: Chem. -2005.- V. 381.тР. 986-992.

56. Chan P.M., Yuen Г., Ruf F., Gonzalez-Maeso J., Seal fon S.С. Method for Multiplex Cellular Detection: of mRNAs Using Quantum Dot Fluorescent In Situ Hybridization. I/Nucleic Acids Research 2005.-V. 33.-P. 161.

57. Zhang C.Y., Ma I I., Nie S.M., Ding Y., Jin L., Chen D.Y. Quantum Dot-Labeled Trichosanthin. //Analyst.- 2000.-V. 125.-P. 1029-1031.

58. Berti L., Xie J:, Medintz I.L., Glazer A.N:, Mathies R.A. Energy Transfer Cassettes for Facile Labeling of Sequencing and PGR Primers. //Anal. Biochem.-2001 V. 292.- P. 188-197.

59. Ozkan M. Quantum Dots and Other Nanoparticles: What Can They Offer to Drug Discovery //Drug Discovery Today.--2004.- V. 9.- P. 1065-1071.

60. Goldman E.R., Medintz I.L., Mattoussi H. Luminescent Quantum Dots in Immunoassays. //Anal. Bioanal. Chem. -2006.- V. 384.- P. 560-563.

61. Zhang, P. Investigation of Novel Quantum Dots/Proteins/Cellulose Bioconjugate using NSOM and Fluorescence. HJ. Fluorescence.-2006.- V. 1,- P. 349-353.

62. Slocik J.M., Moore J.T., Wright D.W. Monoclonal Antibody Recognition of Histidine-Rich Peptide Encapsulated Nanoclusters. //NanoLett.-2002.- V. 2.- P. 169173.

63. Sandros M.G., Gao D., Benson D.E. A Modular, Nanoparticle-Based System for Reagentless Small Molecule Biosensing. HJ. Am. Chem. Soc-2005.-V. 127.- P. 12198-12199.

64. Sandros M.G., Gao D., Gokdemir C., Benson D.E. General. High-Affinity Approach for the Synthesis of Fluorophore Appended Protein Nanoparticle Assemblies. //Chem. Comm. -2005.-V. 22.- P. 2832-2834.

65. Sandros,M.G., Shete V., Benson D.E. Selective, Reversible, Reagentless Maltose Biosensing with Core-Shell Semiconducting Nanoparticles. //The Analyst- 2006.-V.131.- P. 229-235.

66. Medintz I.L., Clapp A.R., Mattoussi H., Goldman E.R., Fisher B:, Mauro J.M. Self-Assembled Nanoscale Biosensors Based on Quantum Dot FRET Donors //Nature Materials.- 2003.- V. 2.-P. 630-638.

67. Ding S.Y., Jones M., Tucker M.P., Nedeljkovic J.M., Wall J., Simon M.N., Rumbles G., Himmel M.E. Quantum Dot Molecules Assembled with Genetically Engineered ProteinsIINanoLetters.- 2003.-V. 3. P. 1581-1585.

68. Pinaud F., King D., Moore H.P., Weiss S. Bioactivation and Cell Targeting of Semiconductor CdSe/ZnS Nanocrystals with Phytochelatin-Related Peptides HJ. Am. Chem. Soc.-2004.- 126.-P. 6115- 6123.

69. Tsay J.M., Doose S., Weiss S. Rotational and Translational Diffusion of Peptide-Coated CdSe/CdS/ZnS Nanorods Studied by Fluorescence Correlation Spectroscopy II J. Am. Chem. Soc.-2006.-V. 128.-P. 1639-1647.

70. Tsay, J.M., Doose S., Pinaud F., Weiss S. Enhancing the Photoluminescence of Peptide-Coated Nanocrystals with Shell Composition and UV Irradiation. HJ. Phys. Chem. B.-2005.- V. 109.-P. 1669-1674.

71. Ji X.J., Zheng J.Y., Xu J.M., Rastogi V.K., Cheng T.C., DeFrank J.J., Leblanc R.M. (CdSe)ZnS Quantum Dots and Organophosphorus Hydrolase Bioconjugate as Biosensors for Detection of Paraoxon. HJ. Phys. Chem. J5.-2005.-V.109.-P. 37933799.

72. Constantine C.A., Gattas-Asfura K.M., Mello S.V., Crespo G., Rastogi V., Cheng T.-C., DeFrank J.J., Leblanc R.M. Layer-by-Layer Biosensor Assembly Incorporating Functionalized Quantum Dots // Langmuir.-2003.- V. 19.-P. 9863-9867.

73. Goldman E.R., Mattoussi H.M., Anderson G.P., Medintz I.L., Mauro J.M. Fluoroimmunoassays Using Antibody-Conjugated Quantum Dots //Methods Molecular Biology.-2005.- V. 303.-P. 19-34.

74. Goldman E.R., Balighian E.D., Kuno M.K., Labrenz S., Tran P.T., Anderson G.P., Mauro J.M., Mattoussi H. Luminescent Quantum Dot-Adaptor Protein-Antibody Conjugates for Use in Fluoroimmunoassays HPhys. Stat. Sol. B.-2002.-V.229.- P. 407-414.

75. Goldman E.R., Balighian E.D., Mattoussi H., Kuno M.K., Mauro J.M., Tran P.T., Anderson G.P. Avidin: A Natural Bridge for Quantum Dot-Antibody Conjugates HJ. Am. Chem. 5oc.-2002.-V. 124.-P. 6378-6382.

76. Li J., Zhao K., Hong X., Yuan H., Ma L., Li J.H., Bai Y.B., Li T.J. Prototype of Immunochromatographic Assay Strips Using Colloidal CdTe Nanocrystals as Biological Luminescent Label IIColloids and Surfaces B-Biointerfaces.-2005.-V. 40,-P. 179-182.

77. Jaiswal J.K., Mattoussi H., Simon S.M. Use of Quantum Dots for Live Cell Imaging //Nature Methods.- 2004.-V. 1.- P. 73-78.

78. Ornberg R.L., Harper T.F., Hongjian L. Western Blot Analysis with Quantum Dot Fluorescence Technology: a Sensitive and Quantitative Method for Multiplexed Proteomics //Nature Methods.-2005.- V. 2. -P. 79-81.

79. Makrides S.C., Gasbarro C., Bello J.M. Bioconjugation of Quantum Dot Luminescent Probes for Western Blot Analysis HBiotechniques.- 2005.- V.39.- P. 501-506.

80. Bakalova R., Zhelev Z., Ohba H., Baba Y. Quantum Dot-Based Western Blot Technology for Ultrasensitive Detection of Tracer Proteins HJ. Am. Chem. Soc. -2005.-V. 127. -P. 3928-9329.

81. Zhelev Z„ Bakalova R., Ohba H., Jose R., Imai Y., Baba Y. Uncoated, Broad Fluorescent, and Size-Homogeneous CdSe Quantum Dots for Bioanalyses HAnal. Chem. -2006.-V. 78.- P. 321-330.

82. Goldman E.R., Clapp A.R., Anderson G.P., Uyeda H.T., Mauro J.M., Medintz LL., Mattoussi H. Multiplexed Toxin Analysis Using Four Colors of Quantum Dot FluororeagentsIIAnal. Chem-2004.-V.76.-P. 684-688.

83. Heyduk T. Measuring protein conformational changes by FRET/ LRET l/Curr Opin Biotechnol.- 2002.-V.13.- P. 292-6.

84. Day R.N., Periasamy A., Schaufele F. Fluorescence resonance energy transfer microscopy of localized protein interactions in the living cell nucleus /I Methods.-2001.-V. 25.-P. 4-18.

85. Riegler J., Nann T. Application of luminescent nanocrystals as labels for biological molecules IIAnal Bioanal Chem.- 2004.- V.379.- P. 913-9.

86. Hohng S., Ha T. Single-molecule quantum-dot fluorescence resonance energy transfer /IChemphyschem.-2005.-Y. 6.- P. 956-60.

87. Pathak S., Choi S.K., Arnheim N., Thompson M.E. Hydroxylated quantum dots as luminescent probes for in situ hybridization ///. Am. Chem.Soc.- 2001.-V.123.-P. 4103-4.

88. Gerion D., Parak W.J., Williams S.C., Zanchet D., Micheel C.M., Alivisatos A.P. Sorting fluorescent nanocrystals with DNA IIJ. Am. Chem. Soc- 2002.- V.124.-P.7070-4.

89. Xiao Y., Barker P.E. Semiconductor nanocrystal probes for human metaphase chromosomes // Nucleic Acids Res 2004.-V. 32.

90. Mansson A., Sundberg M., Balaz M., Bunk R., Nicholls I.A., Omling P., et al. In vitro sliding of actin filaments labelled with single quantum dots UBiochem. Biophys. Res. Commun.- 2004.-V. 314.-P. 529-34.

91. Wu X.Y., Liu H.J., Liu J.Q., Haley K.N., Treadway J.A., Larson J.P., et al. Immunofluorescent labeling of cancer marker Her2 and other cellular targets with semiconductor quantum dots II Nat. Biotechnol. 2003.-V. 21.-P.41-6.

92. Hanaki K., Momo A., Oku T., Komoto A., Maenosono S., Yamaguchi Y. et al. Semiconductor quantum dot/albumin complex is a long-life and highly photostable endosome marker // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 2003.-V. 302.-P. 496-501.

93. Hoshino A., Fujioka K., Oku T., Nakamura S., Suga M., Yamaguchi Y. et al. Quantum dots targeted to the assigned organelle in living cell // Microbiol. Immunol.-2004.- V.48.- P. 985-94.

94. Dahan M., Levi S., Luccardini C., Rostaing P., Riveau B., Triller A. Diffusion dynamics of glycine receptors revealed by single-quantum dot tracking HScience-2003.- V.302.-P. 442-5.

95. Howarth M, Takao K, Hayashi Y, Ting AY. Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2005.-V. 102.-P. 7583-7588.

96. Raj an SS, Vu TQ. Quantum dots monitor TrkA receptor dynamics in the interior of neural PC12 cells IINano. Lett.- 2006.-V.6.-P. 2049 2059.

97. Sukhanova A., Venteo L., Cohen J.H.M., Pluot M., Nabiev I. Nano-biocaptures for research and diagnostics in inflammation diseases and cancer I ¡Ann. Acad. Pharm. Franc.-2006.-V. 64.-P. 125.

98. Wang L.-Y., Kan X.-W., Zhang M.-C., Zhu C.-Q., Wang L. Fluorescence for the determination of protein with fiinctionalized nano-ZnS// Analyst.-2002.- V. 127.-P. 1531 1534.

99. Goldman E.R., Medintz I.L., Whitley J.L. Avidin: A Natural Bridge for Quantum Dot-Antibody Conjugates// J. Amer. Chem.Soc.-2005.-N. 127.- P. 6744 -6751.

100. Riu J., Maroto A., Rius F.X. Nanosensors in environmental analysisIITalanta.-2006.-V. 69.- P. 288-301.

101. Goldman E.R., Clapp A.R., Anderson G.P., Yueda H.T., MauroJ.M., Medintz I.L., Mattoussi H. IIAn Multiplexed Toxin Analysis Using Four Colors of Quantum Dot Fluor or eagentsal. Chem.-2004.-V. 76.-P. 684 688.

102. Willard D.M., Van Orden A. Quantum dots: Resonant energy-transfer sensor IINat. Mater.-2003.-V. 2, P. 575 576.

103. Pohl D. W., Denk W. and Lanz M. Optical stethoscopy: Image recording with resolution lambda/20 //Appl. Phys. Lett.-1984.- V.44.- P. 651 653.

104. Lewis A, Isaacson M. Harootunian A and Murray A. Development of a 500 A spatial resolution light microscope. I. Light is efficiently transmitted through A/16 diameter apertures HUltramicroscopy- 1984.- V.13.- P. 227.

105. Betzig E., Trautman J.K., Harris T.D., Weiner J.S., Kostelak R.L., Breaking the Diffraction Barrier: Optical Microscopy on a Nanometer Scale I I Science-1991.- V. 251.-P. 1468- 1470.

106. Specht M., Pedarning J.D., Heckl W.M., Hansch T.W., Scanning plasmon near-field microscope II Phys.Rev.Lett .-1992.-V. 68.-P. 476 479.

107. Inouye Y., Kavata S., Near-field scanning optical microscope with a metallic probe tip // Opt.Lett.993.-V. 19.- P. 159 161.

108. Hollander R.B.G., Hilst N.F., Kooyman R.P.H., Near-field plasmon and force microscopy HUltramicroscopy.-1995.- V. 57.- P. 263 269.

109. Bachelot R., Gleyzes P., Boccara A.C., Near-field optical microscopy by local perturbation of differaction spot, Microscopy Microanalysis Microstructures, 1994, 5 (4-6), p. 389 397.

110. Zenhausern F., O'Boyle M.P., Wickramasinghe H.K., Apertureless near-field optical microscop II Appl.Phys.Lett.- 1994.-V. 65.-P. 1623 1625.

111. Гигантское комбинационное рассеяние. Под ред. Р.Ченга, Т. Фуртака.-1984.- М.- Мир.

112. Gerton J.M., Wade L.A., Lessard G.A., Ma Z., Quake S.R., Tip-Enhanced Fluorescence Microscopy ar 10 Nanometer Resolution // Physical Review Letters.-2004.-V. 9.- P. 18001.

113. Yang T.J., Lessad G.A., Quake S.R., An apertureless near-field microscope for fluorescence imagin I/Applied Physics letters- 2000.-V. 76.- P. 378 380.

114. Anderson N., Hartschuh A., Novotny L., Near-field Raman microscopy //Materials Today.-2005.-?. 50 54.

115. Novotny L. The history of near-field optics // Progress in optics.- 2007.-V. 50.-P. 137- 184.

116. Sekatskii S.K., Letkhov V.S., Single fluorescence centers on the tips of crystal needles: First observation and prospects for application in scanning one-atom fluorescence microscopy IIAppl. Phys.-\996.-~4. 63.- P. 525 530.

117. Секацкий С.К., Летохов B.C., Сканирующая оптическая микроскопия нанометрового разрешения с резонансным возбуждением флуоресценции образцов от одноатомного возбуждающего центра //Письма в ЖЭТФ,-1996.-636.- С. 311 -315.

118. Michaelis J., Hettich С., Mlynek J., Sandoghdar V., Optical microscopy using a single-molecule light source H Nature.-2000,- V. 405.- P. 325 328.

119. Vickery S.A., Dunn R. C., Scanning near-field fluorescence resonance energy transfer microscopy //Biophysical Journal -1999.- V. 76.-P.1812 1818.

120. Vickery S.A., Dunn R. C., Combining AFM and FRET for high resolution fluorescence microscopy HJournal of Microscopy.-2000. -V. 202. P.408 - 412.

121. Aigouy L., De Wilde Y., Mortier M., Gierak J., Bourhis E., Fabrication and Characterization of Fluorescent Rare-Earth-Doped Glass-Particle-Based Tips for Near-Field Optical Imaging Applications HApplied Optics.-2007.- V. 43.- P. 3829 -3837.

122. N. Chevalier, M. J. Nasse, J .C. Woehl, P. Reiss, J. Bleuse, F. Chandezon, S. Huant, CdSe-single-nanoparticle based active tips for near-field optical microscopy HNanotechnology.-2005.-V. 16.- P. 613-618.

123. United States Patent, 4,636,479, Martin; Francis J., Kung; Viola T. Enhanced agglutination method and kit. January 13,1987.

124. L. Spernarth, S. Magdassi. Preparation of ethyl cellulose nanoparticles from nano-emulsion obtained by inversion at constant temperature //Micro and Nano Letters.-2№1 2.- V.4.- P. 90 95.

125. Königsberg, W. Reduction of disulfide bonds in proteins with miioXbreitoV/Methods Enzymol.- 1972.- V.25.- P. 185.

126. В.И.Елисеева, Т.Р. Асламазова. Эмульсионная полимеризация в отсутствие эмульгатора и латексы на ее основе //Успехи химии.- 1991.-Т.60.- №4.-С. 398 -429.

127. Kondo A., Kawano T., Higashitani К. Immunological agglutination kinetics of latex particles with covalently immobilized antigens HJ. of Fermentation & Bioengin.- 1992.-V. 73.-N 6.- P. 435 439.

128. Okubo M., Yamamoto Y., Uno M. Immunoassay tests // J. ColloidPolym. Sci-1987.-V.265.-P. 1061.

129. Schmelz, O., Mews, A., Basche, Th., Herrmann, A., Mullen, K. Supramolecular complexes from CdSe nanocrystals and organic fluorophors. Langmuir, 2001, 17, 2861 -2865.

130. Leatherdale, C.A., Woo W.-K., Mikulec F.V., Bawendi M.G. On the absorption cross section of CdSe nanocrystal quantum dots. J. Phys. Chem. B, 2002, 106(31), 7619-7622.

131. Yu, W. W., Qu, L., Guo, W., Peng, X. Experimental determination of the extinction coefficient of CdTe, CdSe, and CdS nanocrystals. Chem. Mater., 2003, 15, 2854 - 2860.

132. Nazzal, A.Y., Wang, X., Qu, L., Yu, W., Wang, Y., Peng, X., Xiao, M. Environmental effects on photoluminescence of highly luminescent CdSe and CdSe/ZnS core/shell nanocrystals in polymer thin films. J. Phys. Chem. B, 2004, 108(18), 5507-5515.f)

133. Gattas-Asfura, K.M., Constantine, C.A., Lynn, M.J., Thimann, D.A., Ji, X., Leblanc, M.L. Characterization and 2D self-assembly of CdSe quantum dots at the air-water interface. J. Am. Chem. Soc.; 2005; 127(42), 14640 - 14646.

134. Рейхсфельд B.O., Еркова JI.H., Рубан B.JI. Лабораторный практикум по синтетическим каучукам.- М.: Химия.-1976,- С.226.

135. Б.Э. Геллер, А.А. Геллер, В.Г. Чиртулов //Практическое руководство по физикохимии волокнообразующих полимеров. М.- Химия,- 1996,- С. 243.

136. J. Hearn, М.С. Wilkinson, A.R. Goodall Polymer latices as model colloids // Colloid Interface 5a.-1981-V.14.- P.173.

137. Margel S., Rembaum A., Synthesis and characterization of poly(glutaraldehyde), a potential reagent for protein immobilization and cell separation // Macromol. Chem. Suppl.-\9%0.-N 13.-p. 19 24.

138. Kumakura V., Kaetsu I. Polymeric microspheres by reaction copolymerization of acrolein and various monomers at low temperature I/Coll. Polym. SW.-1984.-V. 262.-P. 450 454.