Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биораспределение интактных квантовых точек с различными полимерными покрытиями

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биораспределение интактных квантовых точек с различными полимерными покрытиями"

На правах рукописи

Логинова Яна Федоровна

БИОРАСПРЕДЕЛЕНИЕ ИНТАКТНЫХ КВАНТОВЫХ ТОЧЕК С РАЗЛИЧНЫМИ ПОЛИМЕРНЫМИ ПОКРЫТИЯМИ

03.01.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г в ПАР 2013

005051226

МОСКВА-2013

005051226

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Савицкий Александр Павлович

Официальные оппоненты: Карапетян Навасард Ваганович

доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук, заведующий лабораторией

Зубов Виталий Павлович,

доктор химических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, заведующий лабораторией

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт физиологически активных веществ Российской академии наук

Защита состоится «11» апреля 2013 г. в 13ш часов на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, строение 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д.ЗЗ стр. 1.

Автореферат разослан« » 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Благодаря развитию современных методов визуализации биологических объектов (биоимиджинга), основанных на использовании флуоресцентных меток, флуорофоры стали одним из важнейших инструментов многих научных направлений. В настоящее время спектр флуоресцентных меток достаточно широк. Условно можно выделить три основные группы: 1) флуоресцентные белки; 2) органические красители; 3) флуоресцентные нанокристаллы - квантовые точки (КТ). Наиболее перспективными для развития методов биоимиджинга являются полупроводниковые КТ типа ядро/оболочка CdSe/ZnS, обладающие уникальными оптическими и фотофизическими свойствами, такими как широкий спектр поглощения, узкая симметричная полоса эмиссии, значительный стоксов сдвиг, высокая яркость, а также высокая устойчивость к фотовыцветанию. Положение максимумов в спектрах флуоресценции КТ строго зависит от их размеров, при этом для возбуждения нанокристаллов всех цветов достаточно одного источника излучения.

Перечисленные свойства КТ открывают широкие перспективы для их использования в качестве флуоресцентных маркеров для многоцветной визуализации биологических объектов in vivo. Однако главным фактором риска применения КТ является недостаток информации об их взаимодействии с живым организмом. На сегодняшний день остаются малоизученными биораспределение КТ как интактных наноразмерных объектов (при отсутствии адресного агента на поверхности), аспекты их взаимодействия с мишенями на разных уровнях организации живой материи, а также пути и скорости элиминации из организма млекопитающих. Имеющиеся исследования выполнены, в большинстве случаев, методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой и касаются исключительно распределения кадмия, введенного в организм в составе КТ. При этом указанный метод'не позволяет выявить различий между интактными КТ и частицами, которые были подвержены деградации до составляющих компонентов. Подтверждением целостности структуры КТ является сохранение ими способности флуоресцировать. Следовательно, существует необходимость в разработке комплексного подхода, основанного на использовании различных флуоресцентных методов, который позволил бы регистрировать специфическую флуоресценцию КТ на уровне целого организма in vivo, в органах и тканях ex vivo, а также в биологических пробах для получения полной картины метаболизма.

По-прежнему остается открытым вопрос о ключевых факторах, определяющих поведение нанокристаллов в организме животного. Большинство исследователей связывают характер биораспределения КТ исключительно с их размером и свойствами покрытия, однако вопрос о степени возможного влияния агрегатного состояния КТ на их биологические эффекты in vivo в литературе практически не освещен. Кроме того, в большинстве экспериментов использовалось преимущественно внутривенное введение КТ. Однако не менее важным вопросом является зависимость кинетики биораспределения КТ от способа поступления частиц в организм. При этом in vivo распределение при парентеральном введении или введении частиц в пищеварительный тракт изучалось лишь в единичных публикациях.

Таким образом, вышесказанное свидетельствует об актуальности проблемы исследования биораспределения интактных КТ как для целей биоимиджинга, так и для оценки общей биологической безопасности наночастиц.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение биораспределения и стабильности квантовых точек с разными полимерными покрытиями в организме мелких лабораторных животных в зависимости от способа введения.

3

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработка методологического подхода для комплексной оценки биораспределения интактных КТ;

2. Исследование распределения и возможных путей экскреции КТ при разных способах введения (внутривенном, внутрибрюшинном и внутрижелудочном);

3. Исследование химической стабильности и влияния КТ на различные органы и ткани животных в зависимости от модификации их поверхности при разных способах введения;

4. Исследование влияния агрегатного состояния КТ на их распределение и токсические свойства.

Научная новизна. Предложен методологический подход, основанный на использовании комплекса флуоресцентных методов, для прижизненной неинвазивной визуализации и ex vivo мониторинга содержания интактных КТ в тканях экспериментального животного. Впервые показана возможность визуализации КТ в тканях методом флуоресцентного имиджинга с временным разрешением.

Проведен комплексный анализ особенностей биораспределения и путей экскреции интактных КТ с разными типами модификации поверхности в зависимости от способа поступления в организм: исследован внутривенный, внутрибрюшинный и внутрижелудочный пути введения. Впервые получены данные о зависимости биораспределения и токсических свойств КТ от их агрегатного состояния на момент введения. Показана перспективность использования КТ с двойной оболочкой на основе полимерного и кремнийорганического слоев для флуоресцентного биоимиджинга in vivo, что обусловлено высокой стабильностью их флуоресценции в условиях среды живого организма.

Практическая значимость работы. Предложенная методологическая модель визуализации распределения КТ в органах экспериментальных животных может служить основой для разработки стратегии скрининга полупроводниковых наночастиц, включающего получение первичной информации об их фармакокинетических свойствах (абсорбции, распределении, метаболизме, экскреции). Подобный скрининг позволит проводить эффективный отбор перспективных КТ как потенциальных объектов для целей биоимиджинга.

Идентификация КТ в тканях флуоресцентными методами с временным разрешением является перспективной альтернативой спектральным методам детекции КТ по интенсивности флуоресценции, в особенности в случаях высокого фонового сигнала тканей и органов.

Полученные результаты по биораспределению и токсическим свойствам КТ могут внести существенный вклад в понимание механизмов взаимодействия наночастиц с тканями животных в условиях in vivo.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих международных и российских конференциях: II International symposium «Topical problems of biophotonics - 2009» (Nizhny Novgorod - Samara - Nizhny Novgorod, 2009), Всероссийская научная школа для молодежи «Горизонты нанобиотехнологии» (Звенигород, 2009), XIV International School for Junior Scientists and Students on Optics, Laser Physics & Biophotonics «Saratov Fall Meeting-2010» (Saratov, 2010), 3rd Nanotechnology International Forum RUSNANOTECH 2010 (Moscow, 2010), III International symposium «Topical problems of biophotonics - 2011» (St.-Petersburg - Nizhny Novgorod, 2011), VI Съезд Российского фотобиологического общества (пос. Шепси, 2011), Вторая международная научно-практическая конференция «Высокие технологии,

4

фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей и 7 тезисов докладов на конференциях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (230 ссылок). Диссертация содержит 152 страницы печатного текста, включает 62 рисунка и 14 таблиц.

Список сокращений.

АПС - 3-аминопропилтриэтоксисилан;

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт;

КТ - квантовые точки;

ЛФС - локальная флуоресцентная спектроскопия;

МПК- меркаптопропионовая кислота;

РЭС - ретикуло-эндотелиальная система;

FLIM - fluorescence lifetime imaging microscopy (флуоресцентный имиджинг с

временным разрешением);

PBS - phosphate buffer saline (фосфатно-солевой буфер).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ КТ

В настоящей работе проводилось исследование трех типов водорастворимых КТ с ядром на основе селенида кадмия и эпитаксиальными оболочками из сульфида кадмия и сульфида цинка с различными полимерными покрытиями (ООО "НТИЦ "Нанотех-Дубна", Россия):

(1) CdSe/CdS/ZnS КТ, покрытые 3-меркаптопропионовой кислотой (КТ-МПК), максимум эмиссии 615 ± 5 нм;

(2) CdSe/CdS/CdZnS/ZnS КТ, покрытые комбинированной оболочкой из полимерного слоя, состоящего из остатков полиакриловой кислоты, модифицированной дигидролипоевой кислотой и полиэтиленгликолем, и кремнийорганического слоя на основе 3-аминопропилтриэтоксисилана (КТ-АПС), максимум эмиссии 685 нм;

(3) CdSe/CdS/CdZnS КТ, покрытые кремнийорганической оболочкой (при отсутствии полиакрилового полимера) с остатками лимонной кислоты на поверхности (KT-SSi02), максимум эмиссии 666 нм.

По результатам динамического светорассеяния диапазон значений гидродинамического диаметра КТ-МПК в водном растворе составлял в среднем 8±2 нм, КТ-АПС - 36±2 нм. В случае KT-SSi02 наблюдался существенный разброс частиц по размерам, однако преимущество по массовой доле определялось за фракцией с диаметром около 36 нм, сходным с результатами для КТ-АПС.

Все КТ характеризовались заряженной поверхностью. В диапазоне рН 5.5 - 7.5 значения дзета-потенциала КТ-МПК и KT-SSi02, заряженных отрицательно за счет карбоксильных групп на поверхности, находились в пределах от -30 до -40 и от -8 до -16 милливольт (мВ), соответственно. Многочисленные аминогруппы на поверхности КТ-АПС обеспечивали положительный заряд со значениями дзета-потенциала 20-25 мВ.

Помимо изучения спектральных свойств, проводились измерения времен жизни флуоресценции исследуемых КТ. Было установлено, что время жизни возбужденного

5

состояния КТ-МПК описывается с помощью функции трех экспонент с временами жизни 4.7, 15.3 и 36 не; КТ-АПС - 1.6, 5.9 и 17.4; KT-SSi02 - 1.7, 6.0 и 17.6. Полученные результаты коррелируют с ранее опубликованными данными литературы. В большинстве работ для различных типов КТ было показано многоэкспоненциальное затухание флуоресценции.

Влияние растворителя на стабильность и склонность к агрегации коллоидного раствора КТ оценивали по изменениям интенсивности флуоресценции и гидродинамического диаметра частиц. Помимо водного раствора, были охарактеризованы следующие типы растворителей: 5% раствор глюкозы в воде, рН 5.7; 0.9% раствор хлорида натрия (изотонический раствор) в воде, рН 5.4-5.5; PBS (10 мМ фосфатный буфер, 137 мМ хлорид натрия, рН 7.4). Исследование показало, что КТ-МПК сохраняли стабильность преимущественно в воде и 5% глюкозе, в отличие от солевых растворов, где наблюдалось снижение интенсивности флуоресценции (на 50% от исходного уровня) и увеличение гидродинамического диаметра КТ с 8 до 46-47 нм (табл. 1). Агрегационные процессы в большей степени были выражены в PBS, рН 7.4.

Таблица 1. Изменение размеров КТ-МПК в различных растворителях в зависимости от времени инкубации по результатам динамического светорассеяния._

Растворитель Время инкубации

0 -30 мин 1 -2 часа 24 часа

Диаметр, нм Массовая доля, % Диаметр, нм Массовая доля, % Диаметр, нм Массовая доля, %

Вода 8.0 99.5 8.0 98.5 8.0 99.7

5% глюкоза 7.5 80.7 7.5 81.3 18.8 94.6

23.0 19.7 23.0 18.4

0.9% хлорид натрия 46.8 78.3 82.0 23.1 - -

128.0 22.1 536.0 27.7 - -

PBS, рН 7.4 47.4 78.7 153.2 1.2 - -

124.0 4.9 1015.8 30.8

* Среднее значение гидродинамического диаметра и распределение для каждой пробы определяли после пяти последовательных измерений по 100 с ("DynaPro Titan", Wyatt technology corporation, США). C=60 пмоль/мл. «-» - радиус частиц более 3000 нм.

КТ-АПС показали высокую коллоидную стабильность и отсутствие тенденции к агрегации во всех растворителях в течение 24 часов инкубации. В случае КТ-ввЮг отслеживание изменений в значениях их гидродинамического диаметра было затруднено наличием существенного разброса частиц по размерам. Однако фракция порядка 36 нм являлась преобладающей, что вполне соотносилось с исходными данными по водному раствору. Флуоресцентные измерения показали увеличение интенсивности флуоресценции КТ-БвЮг во всех исследуемых растворителях. Следовательно, исходный раствор КТ-ЭБЮг представлял собой смесь агрегатов, а повышение интенсивности флуоресценции позволило выявить процессы частичного гидролиза агрегатов.

Таким образом, было установлено, что влияние растворителя на агрегатное состояние КТ в значительной степени определяется природой их органического покрытия.

II. ОСОБЕННОСТИ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ КТ-МПК ВО ВНУТРЕННИХ ОРГАНАХ МЫШЕЙ

2.1 Распределение КТ-МПК после внутрижелудочного введения

Поскольку одним из потенциальных путей попадания наночастиц в организм является пероральный путь, исследовалось распределение КТ после их введения в

желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) мышей. КТ-МПК вводили однократно внутрижелудочно мышам линии Nu/Nu и аутбредным мышам CWF в физиологическом растворе (0.9% водный раствор хлорида натрия) в дозе 10 пмоль на 1 г веса (или 300 пмоль/мышь). Выбор дозы определялся тем, что интенсивность экзогенной флуоресценции при использовании данной дозы была достаточной для того, чтобы фиксировать места локализации и аккумуляции KT в органах и тканях.

На рисунке 1 показано динамическое наблюдение биораспределения КТ-МПК in vivo методом планарного флуоресцентного имиджинга. В течение первых 10 минут после введения КТ-МПК еще оставались в желудке животного, через 20 мин происходило их продвижение в область двенадцатиперстной кишки. Далее флуоресцентный сигнал KT продолжал смещаться в область тонкого кишечника, при этом интенсивность флуоресценции постепенно падала.

Рисунок 1. Динамика изменения интенсивности флуоресценции КТ-МПК in vivo в желудочно-кишечном тракте мышей линии Nu/Nu по результатам флуоресцентного имиджинга. КТ-МПК вводили внутрижелудочно в дозе 10 пмоль/г. Изображения представлены в псевдоцветной шкале по интенсивности флуоресценции. Возбуждение -502-547 нм, регистрация - 605-680 нм, экспозиция 10 сек. "Контроль - до введения KT.

Методом локальной флуоресцентной спектроскопии (ЛФС) специфическая флуоресценция КТ-МПК регистрировалась точечно в отдельных участках желудка и тонкого кишечника в период около 4 ч после введения. Спектры флуоресценции органов измеряли локально, при контакте с волоконно-оптическим зондом флуоресцентного спектрометра, передающим возбуждающее и флуоресцентное излучение. Не удалось детектировать флуоресцентный сигнал КТ-МПК в толстом кишечнике, вероятно, вследствие тушения флуоресценции большей части KT на этапе прохождения желудка и отделов тонкой кишки. В печени, селезенке и почках сигнал КТ-МПК отсутствовал.

Образцы мочи и кала подопытных животных также были проанализированы методом ЛФС. Показано, что КТ-МПК выводились с экскрементами. Полоса специфической флуоресценции КТ-МПК определялась в спектрах, регистрируемых с образцов кала мышей через 24 ч после введения KT (рис. 2). Интенсивность экзогенной флуоресценции была крайне низкой, что затрудняло ее идентификацию в условиях высокого фонового сигнала.

Полученные результаты позволили предположить, что КТ-МПК подвергались влиянию агрессивной среды пищеварительной системы и деградировали под воздействием желудочного сока. Данная гипотеза была подтверждена результатами in vitro моделирования. При инкубировании КТ-МПК с 0,1 М соляной кислотой (pH 1,06) происходило снижение интенсивности флуоресценции примерно в 100 раз, сопровождаемое смещением основного пика эмиссии в коротковолновую область спектра и появлением дополнительного пика на длине волны 580 нм.

600

700

t lHH.I волны, нм

Значительное падение интенсивности, сдвиг и раздваивание пика эмиссии флуоресценции КТ-МПК предположительно объясняется тем, что в сильнокислых условиях данные КТ необратимо теряют свою наноструктуру, имеют тенденцию к агрегированию и необратимой деградации ZnS-оболочки.

2.2 Распределение КТ-МПК после внутрибрюшинного введения

Для выявления возможности применения КТ в /л vivo приложениях логично рассмотреть их введение в организм путем прямых инъекций (внутрибрюшинных и внутривенных).

КТ-МПК вводили однократно внутрибрюшинно аутбредным мышам CWF в установленной дозе 10 пмоль/г (300 пмоль/мышь). По результатам планарного флуоресцентного биоимиджинга /л vivo в брюшной полости мышей визуализировалась отчетливая экзогенная флуоресценция (рис. 3). В течение первого часа интенсивность флуоресценции КТ-МПК повышалась, затем шло её постепенное снижение. Это можно объяснить процессом всасывания КТ-МПК из брюшной полости в кровь, в результате которого начинали светиться кровеносные сосуды передней брюшной стенки и кожи, располагающиеся ближе к детектору, и интенсивность флуоресценции, соответственно, повышалась. Последующее перераспределение КТ-МПК приводило к снижению сигнала при регистрации с более глубоких слоев тканей.

Контроль 0 мин 1 час 3 часа

Рисунок 3. Динамика изменения интенсивности флуоресценции КТ-МПК in vivo в брюшной полости мышей CWF по результатам флуоресцентного имиджинга. КТ-МПК вводили внутрибрюшинно в дозе 10 пмоль/г. Возбуждение - 502-547 нм, регистрация -605-680 нм, экспозиция 10 сек. "Контроль - до введения КТ, 0 мин - сразу после введения КТ.

1000-

Рисунок 2. Спектр флуоресценции (^вх=532 нм) экскрементов: пунктир -контрольный спектр, сплошная линия -через 24 ч после внутрижелудочного введения КТ-МПК в дозе 10 пмоль/г.

Содержание КТ-МПК в крови и последующая локализация в органах были подтверждены методом ЛФС. После всасывания из брюшной полости КТ-МПК с током крови доставлялись в печень, селезенку и легкие, где был зафиксирован максимальный уровень их флуоресценции, который сохранялся в течение суток после введения (рис. 4). Помимо указанных органов-мишеней, экзогенная флуоресценция была зафиксирована в тимусе всех подопытных животных на одном экспериментальном сроке - через 40 мин после введения КТ. Некоторая часть КТ-МПК задерживалась в жировой ткани брюшной полости и не подвергалась всасыванию. КТ-МПК не экскретировались в интактном состоянии ни с мочой, ни с экскрементами.

3 «сю

40 мин 3 4 24 4

Время после введения КТ

Рисунок 4. Динамика изменения интенсивности флуоресценции КТ-МПК в сыворотке крови и внутренних органах мышей по результатам ЛФС. КТ-МПК вводили внутрибрюшинно в дозе 10 пмоль/г. ке%=532 нм. Оценивали интенсивность флуоресценции КТ после вычета фона.

2.3 Распределение КТ-МПК после внутривенного введения

КТ-МПК вводили однократно внутривенно аутбредным мышам CD-1 и мышам линии Nu/Nu в установленной дозе 10 пмоль/г (300 пмоль/мышь). Визуализация флуоресценции внутренних органов мышей методом планарного флуоресцентного биоимиджинга осуществлялась только ex vivo после вскрытия брюшной и грудной полостей (рис. 5). Полученные изображения показали наличие экзогенной флуоресценции в легких и печени мышей в период 20 мин -4ч после введения КТ-МПК.

По результатам ЛФС максимальный уровень флуоресценции КТ-МПК во всех протестированных органах (печень, легкие, селезенка, почки, сердце, мозг, 12-перстная кишка, тимус) отмечался через 20 минут после их введения и был обусловлен их высоким содержанием в крови. Начиная с 3-х часов наблюдения, флуоресценция КТ-МПК определялась только в печени, легких и селезенке.

Стоит отметить разницу кинетики накопления КТ-МПК в органах-мишенях в зависимости от способа введения. При внутривенном введении наиболее высокая интенсивность экзогенной флуоресценции внутренних органов определялась в первый час после введения КТ, при внутрибрюшинном введении - через 3 ч. Кинетика накопления КТ-МПК в органах коррелировала с изменением флуоресцентного сигнала в сыворотке крови, и, следовательно, при внутрибрюшинном введении скорость накопления КТ-МПК в органах определялась, главным образом, скоростью их всасывания из брюшной полости в кровь.

Легкие ■ 5-j

•• 'Ч к

Щ .

Печень

/<i

jr fütfi

* ^

Контроль

20 МИН

40 мин

1,5 ч

4ч

24 ч

Рисунок 5. Динамика изменения интенсивности флуоресценции КТ-МПК post mortem во внутренних органах мышей линии Nu/Nu по результатам флуоресцентного имиджинга. КТ-МПК вводили внутривенно в дозе 10 пмоль/г. Возбуждение - 502-547 нм, регистрация -605-680 нм, экспозиция 25 сек. 'Контроль - до введения KT.

1000000

100000 -

-

■е-

-2

р

U 2 Е я

= 10000

V

3

1000

I

■ Кровь

■ Печень

■ Легкие

■ Селетенкп

■ Почки » Сердце

■ Moir

■ Тимус

■ Двенпдцатиперстна я кишки

20 Mim 90 Mini Зч 6 ч 9 ч 12 ч Время после введения KT, miih

24 ч

48 ч

Рисунок 6. Динамика изменения интенсивности флуоресценции КТ-МПК в сыворотке крови и внутренних органах мышей CD-1 по результатам ЛФС. КТ-МПК вводили внутривенно в дозе 10 пмоль/г. Хех=532 нм. Оценивали интенсивность флуоресценции КТ после вычета фона.

Ни в экскрементах, ни в моче специфическая флуоресценция КТ-МПК не была обнаружена. Таким образом, значительное падение интенсивности экзогенной флуоресценции в тканях подопытных животных не было обусловлено экскрецией КТ-МПК, а точнее их экскрецией в неизменном виде. Причиной этого может являться постепенное разрушение КТ в организме, приводящее к утрате флуоресцентных свойств в результате нарушения целостности покрытия и деградации ядра.

На дальнейшем этапе представляло интерес исследование тканевого распределения КТ-МПК с использованием микроскопического анализа. Анализ органов ех

10

)

vivo методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии через 40 мин после введения КТ-МПК показал наличие специфической флуоресценции КТ в органах с высоким кровоснабжением: легких, печени, селезенке, почках, лимфоузлах, а также сосудах головного мозга и сердца (табл. 2). Метод оказался также высокоэффективным для обнаружения флуоресценции КТ на отдаленных сроках после введения: на 22-ые сутки после внутривенного введения КТ-МПК по-прежнему детектировались в легких, селезенке и печени, причем наибольшее их количество было зафиксировано в виде скоплений в легочной ткани. Следовые количества КТ-МПК обнаруживались в почках, тонком кишечнике и лимфатических узлах (табл. 2).

Таблица 2. Оценка флуоресценции тканей через 40 мин и 22 дня после внутривенного введения КТ-МПК по данным конфокальной флуоресцентной микроскопии. __

Название органа или ткани Легкие Печень Селезенка Почки Лимфоузлы Мозг Сердце Мышцы | Кишечник Кожа

Уровень

флуоресценции +++ +++ +++ ++ ++ +* +* +* + +*

через 40 мин

Уровень флуоресценции через 22 дня +++ ++ ++ + + - - - + -

Примечание: флуоресценция слабая +, умеренная ++, высокая +++, отсутствует -. Знаком (*) отмечены ткани, где флуоресценция КТ была обнаружена только в кровеносных сосудах.

Таким образом, по результатам ЛФС было показано существенное падение флуоресцентного сигнала КТ-МПК в тканях в течение суток после введения, свидетельствующее о возможных процессах деградации наночастиц, в особенности на фоне отсутствия следов КТ в моче и экскрементах подопытных животных. Однако методом конфокальной микроскопии удалось установить, что некоторая часть КТ-МПК сохраняла флуоресцентные свойства в течение длительного времени. Были выявлены основные органы-мишени, длительно аккумулирующие КТ-МПК, а именно: печень, селезенка, легкие и почки

2.3.1 Влияние агрегатного состояния КТ-МПК на их распределение в органах мышей после внутривенного введения

Флуоресцентный анализ органов мышей, проведенный методом ЛФС, показал, что агрегатное состояние КТ-МПК оказывало специфическое влияние на их распределение. КТ-МПК, вводимые в буфере PBS, рН 7.4, т.е. в форме крупных агрегатов (d > 40 нм), накапливались преимущественно в печени, в то время как введение дезагрегированных КТ-МПК (d = 8 нм) в 5% глюкозе сопровождалось более равномерным их распределением по органам, включая высокий уровень интенсивности флуоресцентного сигнала в легких (рис. 7).

Объяснение этому явлению связано с размерами частиц. Ранее было показано, что КТ размером >20 нм в диаметре в наибольшей степени подвержены захвату фагоцитирующими клетками ретикуло-эндотелиальной системы (РЭС). В условиях in vivo отрицательно заряженные агрегаты КТ опсонизирутся белками плазмы крови за счет большого количества электростатических связей между карбоксильными группами на

поверхности КТ и заряженными участками белков. Такие комплексы КТ с белками быстро распознаются макрофагами и транспортируются в печень.

Свободные от агрегатов, сохраняющие наноразмер КТ в гораздо меньшей степени связываются с белками крови, а, следовательно, в меньшей степени подвергаются захвату макрофагами и быстро разносятся с током крови по всем органам. Формирование скоплений КТ-МПК в легочной ткани может быть сопряжено с процессами агрегации частиц, происходящими уже после их попадания в кровь и капилляры ткани. Вероятно, образующиеся скопления вызывают закупорку легочных капилляров. При этом большая часть подобных заторов в просветах капилляров рассасывается со временем, о чем свидетельствует снижение сигнала КТ-МПК в легком в течение суток после введения. Ранее сообщалось о схожих агрегационных процессах накопления в легких кремниевых наночастиц после их внутривенного введения животным.

Рисунок 7. Нормированная флуоресценция тканей мышей после внутривенного введения КТ-МПК в 5% глюкозе и PBS (pH 7.4) по результатам ЛФС. Доза 5 пмоль/г, ^ех=473 нм. С уровнем достоверности *р < 0.05, **р s 0.003, *** р < 0.0003 относительно группы, подвергавшейся введению КТ-МПК в PBS. При математической обработке интегральную интенсивность регистрируемого спектра флуоресценции в диапазоне максимума флуоресценции КТ-МПК (590-620 нм) нормировали на интегральную интенсивность автофлуоресценции ткани в диапазоне 500-540 нм.

Стоит отметить, что в большинстве работ, представленных в литературе, введение КТ осуществлялось в натрий-фосфатном буфере без предварительной оценки его влияния на агрегатные свойства исследуемых наночастиц

2.3.2 Флуоресцентный имиджинг с временным разрешением

Помимо спектральных исследований, была показана возможность идентификации КТ в криосрезах печени мышей, получавших внутривенно КТ-МПА, методом флуоресцентного имиджинга с временным разрешением (FLIM, fluorescence lifetime imaging microscopy). Данные, получаемые с криосрезов в ходе FLIM измерений, представляли собой распределение среднего времени жизни флуоресценции со всей области среза и экспоненциальное разложение для отдельных точек (областей интереса).

Распределение среднего времени жизни, получаемое со всей области среза, характеризовалось мультимодальным поведением с широким диапазоном от 1 до 9 не

(при диапазоне 1.3 - 2.0 не в контроле). Разложение на экспоненты в отдельно взятых точках среза позволило успешно дискриминировать сигнал КТ-МПК и автофлуоресценцию тканей. В контрольном срезе затухание флуоресценции описывалось с помощью трех экспонент, в опытном срезе наблюдалось появление еще одной компоненты т2= 15.4 не (табл. 3). Наличие долгоживущей компоненты может быть приписано флуоресценции КТ-МПК, поскольку её значение соответствовало времени жизни флуоресценции раствора КТ-МПК при измерении в кювете. Принадлежность флуоресценции в исследуемой точке среза именно КТ-МПК подтверждалось также спектроскопическими измерениями (рис. 8).

Таблица 3. Времена жизни флуоресценции и предэкспоненциальные множители для криосрезов печени мышей до и после внутривенного введения КТ-МПК, Хе»=469 пт._

11, НС А, т2, не а2 т3, не Аз т4, не А4

контроль 0.6 50111.3 (74%) 2.1 16131.1 (24%) 6.1 1642.3 (2%) - -

КТ-МПК 0.9 137961.3 (35%) 2.5 122314.5 (31%) 6.3 102478.7 (26%) 15.4 28647.6 (8%)

*г -время жизни, А - амплитуда

Рисунок 8. Спектр флуоресценции КТ-МПК, измеренный в точке криосреза печени мышей после внутривенного введения КТ-МПК в дозе 10 пмоль/г. Хех=469 нм.

Таким образом, была показана возможность идентификации КТ в тканях методом флуоресцентных измерений с временным разрешением. Анализ литературных данных показал, что в настоящий момент исследования в этом направлении практически отсутствуют. Однако разработка данной методики является актуальной задачей, поскольку она обеспечит эффективную идентификацию КТ в тканях за счет долгоживущей компоненты во времени жизни их флуоресценции, в частности, в условиях высокого фонового сигнала, низкой концентрации образца в ткани или же в случаях спектрального перекрывания.

III. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЛИЯНИЯ КТ-МПК НА ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ И СТРУКТУРНОЕ СОСТОЯНИЕ ВНУТРЕННИХ ОРГАНОВ МЫШЕЙ 3.1 Исследование токсических свойств КТ-МПК при однократном и многократном введении

По данным флуоресцентного анализа основными органами, длительно аккумулирующими КТ-МПК, являются печень, селезенка, легкие и почки. Таким образом, были выявлены потенциальные мишени повреждающего действия КТ-МПК, в отношении которых можно было ожидать токсических эффектов в результате воздействия как целых

КТ, так и продуктов их деградации.

Было установлено, что при внутривенном введении КТ-МПК в физрастворе в дозе 10 пмоль/г наблюдалось статистически достоверное увеличение относительной массы селезенки у опытных мышей по сравнению с контролем на 21 и 30-е сутки после введения КТ (р=0.007). Так, в опыте абсолютная и относительная масса селезенки (мг/10 г веса тела) составляли 237±15 мг и 0.86±0.07, соответственно, а в контроле - 100±0.01 мг и 0.36±0.004. Поскольку патоморфологическое исследование, проведенное на 22-ые сутки после введения КТ-МПК, не выявило каких-либо патологических изменений в структуре селезенки, можно предположить, что увеличение массы данного органа обусловлено формированием иммунного ответа на введение КТ.

Функциональное состояние печени и почек оценивали по ряду стандартных биохимических показателей в сыворотке крови мышей: по уровню активности аланиновой и аспарагиновой трансаминаз (АЛТ и ACT, соответственно) и щелочной фосфатазы (ЩФ), а также по концентрации мочевины и креатинина. Биохимические исследования проводились на 3, 7, 14, 21 и 30 сутки после внутривенного введения КТ-МПК. Проведенные исследования показали, что КТ-МПК не ухудшали функциональное состояние указанных органов, поскольку достоверных изменений в биохимических показателях крови обнаружено не было. Патоморфологический анализ печени и почек также не выявил изменений в структуре этих органов.

Несмотря на то, что клинически значимых отклонений при проведении вышеописанных анализов состояния почек обнаружено не было, этого недостаточно для однозначного заключения об отсутствии нефротоксичности у КТ-МПК. В спектрах, зарегистрированных при измерении флуоресценции почек через 1.5-3 часа после введения КТ-МПК, пик специфической флуоресценции КТ отсутствовал, однако у всех мышей регистрировались полосы люминесценции с максимумами на 635 и 700 нм, характерные для эндогенных порфиринов (рис. 9). Повышение уровня эндогенных порфиринов характерно для отравления ионами тяжелых металлов, и кадмия, в частности. Следовательно, индукция синтеза порфиринов в тканях может оказаться ранним признаком интоксикации, обусловленным деградацией КТ.

Длина волны, нм

Рисунок 9. Полосы флуоресценции эндогенных порфиринов в спектрах флуоресценции ткани почек через 90 минут после внутривенного введения КТ-МПК в дозе 10 пмоль/г. *Контроль - почка контрольной мыши, опыт - почка опытной мыши, спектр после вычитания контроля - выделенный спектр эндогенного порфирина. Х.еж=532 нм.

КТ-МПК оказывали токсическое воздействие на легкие мышей. При аутопсии мышей, проведенной через сутки после введения КТ-МПК, в легких выявлялись множественные обширные кровоизлияния. Патоморфологическое исследование на 22-ой день после внутривенного введения КТ-МПК показало наличие изменений гистологической структуры легких у опытных животных по сравнению с контролем: утолщение стенок альвеол и уменьшение их просвета, расширение и полнокровие капилляров межальвеолярных перегородок и артерий, локальные геморрагии с альвеолами, заполненными кровью (рис. 10А). У одного из опытных животных выявлена артерия с изменением стенки по типу атеросклероза - с локальным участком утолщения интимы, вследствие чего происходило резкое сужение ее просвета (рис. 10Б).

А Б

Рисунок 10. Гистологическая структура легких мышей через 22 дня после внутривенного введения КТ-МПК: (А) полнокровие артерий и локальные геморрагии; (Б) сужение просвета артерии за счет локального утолщения интимы. Окраска гематоксилином и эозином, ув. хЮО.

В экспериментах по изучению многократного воздействия наночастиц животные получали КТ-МПК внутрибрюшинно в течение 5 дней. Проведение многократного внутривенного введения не представлялось возможным по причине непереносимости мышами повторных внутривенных инъекций. Суммарная доза составила 23.2 пмоль/г (700 пмоль/мышь). Через 3 дня после последней внутрибрюшинной инъекции оценивали состояние внутренних органов и биохимические показатели сыворотки крови. По данным морфометрического анализа внутренних органов и оценки биохимических показателей крови состояние печени, почек, селезенки, головного мозга, тимуса у всех животных опытной группы не отличалось от контроля. В легких мышей наблюдались обширные кровоизлияния, и их относительная масса была достоверно выше, чем в контроле (р=0.047). Таким образом, легкие оказались основной мишенью токсического действия как после однократного, так и после многократного введения КТ-МПК.

3.2 Влияние агрегатного состояния КТ-МПК на выраженность токсических реакций

По результатам исследований было показано, что при внутривенном введении КТ-МПК оказывали существенное негативное воздействие на состояние подопытных животных, вплоть до их гибели. Суммарные данные о переносимости мышами внутривенного введения КТ-МПК в различных дозах и растворителях приведены в

таблице 4. Было установлено, что агрегатное состояние КТ-МПК оказывало существенное влияние на выраженность токсических реакций у мышей. Токсичность дезагрегированных КТ-МПК при введении их в воде или 5% глюкозе была более выражена (повышенная смертность животных в течение суток после введения), чем токсичность КТ-МПК в агрегированном состоянии при введении в солесодержащих растворах (0.9% хлориде натрия и PBS, рН 7.4).

Таблица 4. Суммарные данные по гибели мышей после внутривенного введения КТ-МПК в различных растворителях._

Растворитель Гибель, %

20 пмоль/г 10 пмоль/г 5 пмоль/г

Вода 67% (п=6)* 0% (п=4) 0% (п=4)

5% глюкоза 80% (п=5) 57% (п=7) 14% (п=7)

0.9% натрия хлорид 40% (п=5) 13% (п=15) 0% (п=6)

PBS, pH 7.4 33% (п=5) 14% (п=8) 0% (п=5)

* - число мышей в группе

Острая токсичность проявлялась резким снижением двигательной активности животных сразу после инъекции. Двигательная активность либо восстанавливалась (такие мыши выживали), либо - нет (такие мыши гибли). Гибель подопытных мышей происходила в течение первых суток после введения КТ-МПК.

У большинства животных, получавших КТ-МПК, наблюдались серьезные осложнения: временные парезы задних и передних лап (чаще правых), экзофтальмы на фоне кровоизлияния в ретроорбитальный синус, множественные кожные кровоизлияния (предположительно, синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови), кровоизлияния в головной мозг. Клинические проявления токсического действия КТ-МПК наблюдались в течение первого часа после инъекции KT. В этот же период в тестируемых органах был зафиксирован максимальный уровень интенсивности флуоресценции КТ-МПК, следовательно, в первый час после введения они сохраняли целостность и не подвергались процессам деградации. Это позволяет установить, что даже в интактном состоянии КТ-МПК проявляли высокую степень токсичности. Стоит отметить, что при внутрибрюшинном введении КТ-МПК у мышей наблюдались схожие реакции (снижение двигательной активности, у одной мыши - развитие одностороннего экзофтальма с кровоизлиянием в ретроорбитальный синус).

Таким образом, клиническая картина интоксикации при внутривенном и внутрибрюшинном введении КТ-МПК согласуется с предположением о наличии у данных квантовых точек протромботической активности. КТ-МПК в форме крупных агрегатов быстро удаляются из кровотока макрофагами печени, в то время как дезагрегированные КТ-МПК в большей степени разносятся с током крови по органам, легко проникают в мелкие сосуды и капилляры тканей, становясь причиной тромбозов мелких сосудов и острой легочной эмболии.

IV. ОСОБЕННОСТИ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ КТ-АПС ВО ВНУТРЕННИХ ОРГАНАХ МЫШЕЙ

4.1 Распределение КТ-АПС после внутрижелудочного введения

КТ-АПС вводили однократно внутрижелудочно мышам линии Nu/Nu и аутбредным мышам CWF в установленной дозе 10 пмоль/г (300 пмоль/мышь). Методом планарного

16

флуоресцентного биоимиджинга специфическая флуоресценция КТ-АПС детектировалась в органах ЖКТ in vivo в период более 4-х часов после введения (рис. 11). При этом высокая интенсивность сигнала КТ-АПС, в сравнении с используемыми ранее КТ-МПК, обеспечивала более эффективную визуализацию процессов перераспределения КТ по мере их продвижения из желудка в отделы кишечника. Анализ внутренних органов мышей ex vivo методом ЛФС показал, что сигнал КТ-АПС фиксировался точечно в желудке, в тонком и толстом кишечнике подопытных животных вплоть до 6 ч после введения КТ. Для сравнения: флуоресцентный сигнал КТ-МПК при их внутрижелудочном введении не был обнаружен в толстом кишечнике мышей ни на одном из экспериментальных сроков. В печени, поджелудочной железе и селезенке сигнал КТ-АПС отсутствовал.

Рисунок 11. Динамика изменения интенсивности флуоресценции КТ-АПС in vivo в желудочно-кишечном тракте мышей линии Nu/Nu по результатам флуоресцентного имиджинга. КТ-АПС вводили внутрижелудочно в дозе 10 пмоль/г. Изображения представлены в псевдоцветной шкале по интенсивности флуоресценции. Возбуждение -502-547 нм, регистрация - 670-720 нм, экспозиция 10 сек. "Контроль - до введения КТ.

Было показано выведение КТ-АПС с экскрементами (рис. 12). Важно отметить, что интенсивность флуоресцентного сигнала не уступала уровню сигнала исходного раствора КТ в буфере.

Рисунок 12. Спектр флуоресценции (А.ех=532 нм) экскрементов: пунктир -контрольный спектр, сплошная линия -через 24 ч после внутрижелудочного введения КТ-АПС в дозе 10 пмоль/г

1/ШНЯ RonНhi. НМ

По всей видимости, двойная оболочка на основе полимера и кремнийорганического соединения обеспечивает стабильность КТ-АПС, поскольку не подвергается деградации в условиях сильнокислой среды желудка. Данное предположение получило подтверждение в дополнительных in vitro экспериментах. Было показано, что воздействие соляной кислоты (рН 1,0) не оказывало негативного влияния на интенсивность флуоресценции КТ-АПС. Наличие кремнийорганического слоя в структуре комбинированной оболочки препятствует протонированию функциональных групп органического полимера, его деградации и тушению флуоресценции.

4.2 Распределение КТ-АПС после внутрибрюшинного введения

КТ-АПС вводили внутрибрюшинно однократно аутбредным мышам CWF в установленной дозе 10 пмоль/г (300 пмоль/мышь). Специфическая флуоресценция КТ-АПС успешно визуализировалась в брюшной полости подопытных мышей, существенно превосходя по интенсивности собственную флуоресценцию тканей (рис. 13). Получаемые in vivo изображения позволили отслеживать перераспределение интенсивности флуоресценции КТ-АПС в брюшной полости мышей, обусловленное их всасыванием из брюшной полости в кровь. Двойная оболочка, как и в случае внутрижелудочного введения, обеспечила высокую устойчивость КТ-АПС в условиях организма. Методом ЛФС специфическая флуоресценция КТ-АПС детектировалась в органах ex vivo и сыворотке крови мышей в период более 3-х дней после введения (рис. 14).

тг

Контроль 0 мин 1 час 3 час

Рисунок 13. Динамика изменения интенсивности флуоресценции КТ-АПС in vivo в брюшной полости мышей CWF по результатам флуоресцентного имиджинга. КТ-АПС вводили внутрибрюшинно в дозе 10 пмоль/г. Возбуждение - 502-547 нм, регистрация -670-720 нм, экспозиция 10 сек. "Контроль - до введения КТ, 0 мин - сразу после введения КТ.

40 мин 3 ч 24 ч 3 .шя

Время после введения КТ

Рисунок 14. Динамика изменения интенсивности флуоресценции КТ-АПС в сыворотке крови и внутренних органах мышей по результатам ЛФС. КТ-АПС вводили внутрибрюшинно в дозе 10 пмоль/г. ?ч,х=532 нм. Оценивали интенсивность флуоресценции КТ после вычета фона.

КТ-АПС накапливались в печени, селезенке, легких, а также тимусе. Сигнал КТ-АПС в тимусе был зафиксирован на всех этапах исследования, в отличие от КТ-МПК, которые обнаруживались в тимусе только на одном сроке - через 20 мин после введения. Помимо указанных органов, специфическая флуоресценция КТ-АПС фиксировалась также в жировой ткани брюшной и грудной полостей. Ни в экскрементах, ни в моче опытных животных характерные пики эмиссии КТ-АПС зафиксированы не были.

4.3 Распределение КТ-АПС после внутривенного введения

Как известно, с увеличением длины волны излучения возрастает проницаемость тканей для света, что обеспечивает большую глубину его проникновения и получение изображений с большей глубины, что и наблюдалось при использовании КТ-АПС. КТ-АПС вводили в хвостовую вену аутбредных мышей CD-1 в установленной дозе 10 пмоль/г (300 пмоль/мышь). На этапе флуоресцентного биоимиджинга длинноволновая флуоресценция КТ-АПС (Ает=680 нм) обеспечила визуализацию экзогенной флуоресценции в печени без вскрытия брюшной полости (рис. 15). Это позволило сделать заключение о преимущественном накоплении КТ-АПС в этом органе уже на этапе in vivo исследований.

% м.

/с, \

f "

Контроль 10 мин 30 мин 1ч

Рисунок 15. Динамика изменения интенсивности флуоресценции КТ-АПС in vivo во внутренних органах мышей линии CD-1 по результатам флуоресцентного имиджинга. КТ-МПК вводили внутривенно в дозе 10 пмоль/r. Возбуждение - 502-547 нм, регистрация -670-720 нм, экспозиция 25 сек. 'Контроль - до введения КТ

Интенсивность флуоресценции КТ-АПС в различных органах и тканях в динамике по результатам измерений методом ЛФС представлена на рисунке 16. Наиболее высокие сигналы флуоресценции КТ-АПС регистрировались в тканях в течение первого часа после введения. Флуоресценция КТ-АПС детектировалась в печени, легких и селезенке в течение 48 часов, в то время как флуоресценция КТ-МПК на данный срок наблюдения выявлена не была. КТ-АПС показали доминирующее накопление в селезенке наряду с печенью. Ни в экскрементах, ни в моче опытных животных экзогенная флуоресценция не была зафиксирована.

Сопоставление данных по внутрибрюшинному и внутривенному введению КТ-АПС выявило особенности, описанные ранее и для КТ-МПК. Кинетика биораспределения КТ-АПС по органам определялась кинетикой их циркуляции в кровяном русле. При внутривенном введении максимальный уровень накопления КТ-АПС наблюдался уже через 40 мин после инъекции. При внутрибрюшинном введении по мере всасывания КТ-АПС из брюшной полости в кровь происходило их медленное накопление в органах с пиком аккумуляции в печени и селезенке через 3 ч после введения.

Рисунок 16. Динамика изменения интенсивности флуоресценции КТ-АПС в сыворотке крови и внутренних органах мышей по результатам ЛФС. КТ-АПС вводили внутривенно в дозе 10 пмоль/г. ^=532 нм. Оценивали интенсивность флуоресценции КТ после вычета фона.

4.3.1 Флуоресцентный имиджинг с временным разрешением

Показано успешное применение КТ-АПС при проведении флуоресцентных измерений с временным разрешением. Долгое время жизни флуоресценции (> 17 не) позволило дискриминировать сигнал КТ-АПС на фоне автофлуоресценции в криосрезах печени мышей, получавших КТ внутривенно (табл. 5, рис. 17). При этом в случае КТ-АПС предэкспоненциальный множитель долгоживущей компоненты (табл. 5), отображающий относительное содержание в образце, был в 2,5 раза больше множителя для долгоживущей фракции в случае КТ-МПК (табл. 3).

Таблица 5. Времена жизни флуоресценции и предэкспоненциальные множители для криосрезов печени мышей до и после внутривенного введения КТ-АПС, А.е>=469 пт._

11, НС А, 12, не А2 13, не Аз 14, НС А4

контроль 0.6 50111.3 (74%) 2.1 16131.1 (24%) 6.1 1642.3 (2%) - -

КТ-АПС 0,8 113509.7 (29%) 2.5 117420.6 (30%) 6.0 90022.5 (23%) 17.6 70452.4 (18%)

*т -время жизни, А - амплитуда

я19*

Дшшц ШМ1НЫ, НМ

Рисунок 17. Спектр флуоресценции КТ-АПС, измеренный в точке среза печени мышей после внутривенного введения КТ-АПС в дозе 10 пмоль/г. ?1ех=469 нм

Таким образом, на основании полученных данных по внутривенному и внутрибрюшинному введению КТ-АПС можно сделать вывод о том, что флуоресцентные свойства КТ-АПС позволяют отслеживать их поведение на уровне организма более эффективно, чем в случае КТ-МПК. Флуоресценция КТ-АПС визуализировалась в печени in vivo, чего не удавалось достигнуть при внутривенном введении КТ-МПК, обладающих коротковолновым максимумом флуоресценции. Кроме того, КТ-АПС дольше циркулировали в организме (в тканях) в интактном состоянии, чем КТ-МПК, как при внутривенном, так и при внутрибрюшинном введении, однако они также не экскретировались в неизменном виде. Долгое время жизни флуоресценции (17,6 не) позволило более успешно дискриминировать сигнал КТ на фоне автофлуоресценции при проведении флуоресцентных измерений с временным разрешением.

4.4 Токсичность КТ-АПС при многократном введении в физрастворе

КТ-АПС показали хорошую переносимость животными. Однократные инъекции КТ-АПС не оказывали заметного токсического воздействия, гибели животных отмечено не было. В связи с этим, первоочередной интерес представляло исследование влияния данных КТ с применением многократного введения. Аутбредные мыши CWF получали КТ-АПС внутрибрюшинно в течение пяти дней. Суммарная доза составила 50 пмоль/г (1500 пмоль/мышь). Через 3 дня после последней инъекции оценивали состояние внутренних органов и биохимические показатели сыворотки крови. Макроскопически у всех подопытных животных состояние печени, почек, селезенки, головного мозга, тимуса не отличалось от контроля. В легких мышей опытной группы наблюдались обширные кровоизлияния. Однако достоверных различий в относительной массе исследуемых внутренних органов между опытом и контролем выявлено не было. Значения биохимических показателей сыворотки крови также находились в пределах нормы.

Наличие кровоизлияний в легких подопытных мышей позволяет предположить, что, как и в случае КТ-МПК, легкие могут являться потенциальной мишенью токсического действия КТ-АПС.

V. ОСОБЕННОСТИ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ KT-SSI02B0 ВНУТРЕННИХ ОРГАНАХ МЫШЕЙ

KT-SSi02 вводили однократно внутривенно аутбредным мышам CD-1 в дозе 10 пмоль/г (300 пмоль/мышь). Видимых проявлений токсичности от введения KT-SS¡02 не наблюдалось. Методом ЛФС было обнаружено преимущественное накопление KT-SSi02 в печени, в меньшей степени в селезенке (рис. 18). В остальных органах спектры флуоресценции по форме и интенсивности не отличались от контроля. В селезенке максимальная интенсивность флуоресценции KT-SS¡02 зарегистрирована через 20 минут после введения КТ, в печени - через 3 часа. На последующие сроки наблюдения происходило снижение интенсивности экзогенной флуоресценции. В моче и экскрементах специфическая флуоресценция KT-SSi02 не была выявлена.

Поскольку KT-SSi02 и КТ-АПС обладали сходным диапазоном размеров, разница в их распределении может быть обусловлена модификацией поверхности. Вероятно, специфическое отрицательно заряженное покрытие KT-SS¡02, функционализированное остатками лимонной кислоты, в условиях in vivo приводило к образованию крупных агрегатов в комплексе с белками плазмы крови, которые быстро утилизировались органами РЭС.

J.

+1

т

h

m

■ Печень

□ Селе icii ii.i

41) мщ 90 млн 3 ч

Время после введения KT

Рисунок 18. Динамика изменения интенсивности флуоресценции KT-SSi02 (в отн ед.) во внутренних органах мышей CD-1 по результатам ЛФС. KT-SSi02 вводили внутривенно в дозе 10 пмоль/г. ^вх=532 нм. При математической обработке сигнал флуоресценции в диапазоне 650-670 нм нормировали на интенсивность собственной флуоресценции в диапазоне 580-600 нм.

VI. СРАВНЕНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ОСОБЕННОСТЕЙ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ КТ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ МОДИФИКАЦИИ ИХ ПОВЕРХНОСТИ

В данной главе представлено обобщение полученных данных по распределению КТ с разными полимерными оболочками в сравнительном аспекте. Целью подобного обобщения является выявление общих закономерностей и различий в поведении КТ в зависимости от химии поверхности.

Показано, что при внутривенном введении все исследуемые КТ вне зависимости от химического состава оболочки, заряда и размера накапливались в органах с развитой ретикулоэндотелиальной системой - печени и селезенке. Однако, по результатам микроскопического анализа криосрезов печени подопытных мышей, была обнаружена разница на уровне тканевого распределения КТ. КТ-МПК и KT-SSi02 аккумулировались в межклеточном пространстве в виде отдельных, ярко-выраженных скоплений, в то время как для КТ-АПС было характерно диффузное гомогенное распределение по всей ткани (рис. 19).

КТ-АПС КТ-МПА KT-SSi02 контроль

Рисунок 19. Тканевое распределение отрицательно заряженных КТ-МПК и KT-SSi02, и положительно заряженных КТ-АПС после внутривенного введения мышам в дозе 10 пмоль/г. На рисунке - криосрезы печени мышей. Микроскоп Eclipse TE2000-U (Nikon, Япония). Возбуждение 510-560 нм. Увеличение х20.

Наличие в тканях скоплений отрицательно заряженных КТ-МПК и КТ-БвЮг еще раз подтвердило тот факт, что они имеют тенденцию к агрегации, в отличие от более стабильных положительно заряженных частиц КТ-АПС, которые распределялись более равномерно.

Тропность к легким в большей степени проявили мелкие отрицательно заряженные наночастицы - КТ-МПК. Среди крупных частиц с кремнийорганическим слоем на поверхности сигнал КТ-АПС детектировался в легких на всех экспериментальных сроках, а флуоресценция КТ-БвЮг не была обнаружена ни на один срок наблюдения. По всей видимости, тип модификации в данном случае был критическим фактором.

Природа покрытия КТ влияла на кинетику их накопления и выведения из внутренних органов. Максимальная интенсивность экзогенной флуоресценции во внутренних органах мышей, получавших внутривенно различные типы КТ, наблюдалась в течение первых часов после введения. Однако через 24 часа после воздействия интенсивность флуоресценции КТ с кремнийорганическими покрытиями в тканях мышей была выше, чем таковая КТ-МПК (рис. 20), что было обусловлено меньшей химической стабильностью последних.

140

в

3 120

1 100 Я «

£ 80

60 40

Я. Й в о

ё.' ~ и А о

с = 20 в

я о 0

щ Я

-"©-КТ-МПА -«-КТ-АПС КТ-ЗЭЮ

Рисунок 20. Кинетика изменения интенсивности флуоресценции КТ в тканях мышей после внутривенной инъекции в дозе 10 пмоль/г по результатам ЛФС (данные представлены на примере селезенки и печени). За 100% принимали значения интенсивности флуоресцентного сигнала КТ через 20 мин после введения.

При внутрибрюшинном ведении тип покрытия (КТ-МПК и КТ-АПС) не влиял на общую картину биораспределения. Скорость накопления КТ в органах определялась скоростью их всасывания из брюшной полости в кровь. Максимальное накопление наблюдалось к 3 ч после введения. Органы-мишени - печень, селезенка, легкие, тимус. Комбинированная двойная оболочка КТ-АПС, как и в случае внутривенного введения, обеспечила им большую устойчивость к деградации в условиях организма, что позволило детектировать флуоресценцию КТ-АПС в органах гораздо дольше (около 3-х дней после инъекции), чем флуоресценцию КТ-МПК (около суток после инъекции). Сигнал КТ-АПС в тимусе был зафиксирован на всех этапах исследования, а КТ-МПК - только на одном сроке (через 20 мин после введения). Специфическая флуоресценция всех исследованных типов КТ после внутривенного и внутрибрюшинного введения

а) печень

20 шш 40 шгн 90 ьпш 3 ч 24 ч Время поме введения КТ

б) селезенка

20мин 40мин 90мил Зч 24ч Время меле введения КТ

отсутствовала в моче и кале животных.

При внутрижелудочном введении модификация поверхности не влияла на характер распределения, но определяла стабильность флуоресцентного сигнала КТ в условиях ЖКТ. Флуоресценция КТ-МПК претерпевала тушение в желудке и отделах тонкого кишечника, в то время как КТ-АПС продолжали флуоресцировать в указанных органах, а также в толстом кишечнике вплоть до 6 ч после введения. Накопления их во внутренних органах за пределами ЖКТ не наблюдалось. Показано выведение КТ-МПК и КТ-АПС из организма с экскрементами. Уровень интенсивности флуоресцентного сигнала КТ-МПА в экскрементах приближался к фоновым значениям, в то время как КТ-АПС сохраняли высокую интенсивность флуоресценции.

Таким образом, на основании сравнительного анализа данных, полученных для трех типов исследуемых КТ, можно сделать общее заключение о том, что флуоресцентные свойства КТ-АПС позволяют отслеживать их поведение на уровне организма более эффективно, чем КТ-МПК и KT-SSÍ02.

VII. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Особенности локализации и кинетики накопления КТ в органах-мишенях, специфичные для каждого из рассмотренных путей введения, позволяют сделать теоретически обоснованное заключение о зависимости общей картины биораспределения КТ от способа введения наночастиц в организм.

Химическая природа поверхности КТ также является одним из ключевых факторов, который определяет поведение частиц в организме животного. Модификаторы поверхности КТ обеспечивают контраст накопления КТ в органах-мишенях (КТ-МПК показали наиболее высокую тропность к легким, KT-SS¡02 -доминирующее накопление в печени, КТ-АПС доминировали в селезенке наряду с печенью). Это является важным моментом при применении КТ для целей биоимиджинга, поскольку правильно подобранный модификатор поверхности может обеспечить значительный контраст накопления в целевом органе. Не менее важным является и свойство покрытия квантовых точек определять их устойчивость к деградации в условиях живого организма. В настоящем исследовании сложная комбинированная оболочка КТ-АПС обеспечила их высокую стабильность, по сравнению с КТ-МПК и KT-SSi02, что, в свою очередь, повысило эффективность их отслеживания в органах и тканях экспериментальных животных.

Агрегатное состояние КТ, подразумевающее либо сохранение ими наноразмера, либо переход в форму крупных агрегатов, также оказывает влияние на характер распределения КТ по органам. Органы РЭС являются основной мишенью для накопления КТ в агрегированной форме. КТ, сохраняющие исходный размер, распределяются по органам более равномерно.

Степень выраженности токсических эффектов КТ обусловлена целым комплексом факторов, включая природу покрытия КТ, степень увеличения диаметра КТ вследствие агрегации, а также путь введения. Согласно результатам наших исследований, КТ-МПК оказывали наиболее существенное токсическое воздействие на состояние животных при внутрибрюшинном и, в особенности, при внутривенном введении, вплоть до их гибели. КТ с кремнийорганическими покрытиями показали хорошую переносимость животными.

выводы

1. На основе комплекса флуоресцентных методов разработан методологический подход, позволяющий отслеживать биораспределение интактных KT в органах мышей. Показана принципиальная возможность детекции KT в срезах тканей методом конфокальной микроскопии с временным разрешением.

2. Способ введения определяет характер распределения KT по органам. При внутривенном и внутрибрюшинном введении KT аккумулируются в печени, селезенке, легких и не экскретируются в интактном состоянии. При внутрибрюшинном введении появляется дополнительная мишень накопления KT - тимус. При внутрижелудочном введении KT не накапливаются за пределами пищеварительного тракта животных и выводятся с экскрементами.

3. Тип модификации поверхности определяет стабильность флуоресцентного сигнала KT в условиях организма. KT с кремнийорганическими покрытиями (КТ-АПС и КТ-SS¡02) дольше сохраняются в тканях в интактном состоянии и менее токсичны, в отличие от КТ-МПК. Токсический эффект КТ-МПК проявляется осложнениями, предположительно связываемыми с их протромботической активностью в интактном состоянии, а также последующим поражением легочной ткани.

4. Агрегатное состояние КТ-МПК влияет на их токсические эффекты и распределение в органах мышей. Токсичность дезагрегированных КТ-МПК (d = 8 нм) более выражена, чем КТ-МПК в форме агрегатов (d > 40 нм). Агрегированные частицы накапливаются преимущественно в печени, с уменьшением степени агрегации равномерность распределения KT по органам увеличивается.

5. Флуоресцентные свойства КТ-АПС позволяют отслеживать их поведение на уровне организма более эффективно, чем КТ-МПК и KT-SSi02. Низкий уровень токсичности и высокая стабильность флуоресцентного сигнала КТ-АПС определяют перспективность их применения в качестве потенциальных агентов для различных направлений in vivo биоимиджинга.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Loginova Y.F., Kazachkina N.I., Zherdeva V.V., Rusanov A.L., Shirmanova M.V., Zagaynova E.V., Sergeeva E.A., Dezhurov S.V., Wakstein M.S., Savitsky A.P. Biodistribution of intact fluorescent CdSe/CdS/ZnS quantum dots coated by mercaptopropionic acid after intravenous injection into mice. - J. Biophotonics, 2012, vol. 11-12, pp. 848-859.

2. Loginova Y.F., Dezhurov S.V., Zherdeva V.V., Kazachkina N.I., Wakstein M.S., Savitsky A.P. Biodistribution and stability of CdSe core quantum dots in mouse digestive tract following per os administration: Advantages of double polymer/silica coated nanocrystals. -Biochem. Biophys. Res. Comm., 2012, vol. 419 (1), pp. 54-59

3. Salykina Y.F., Zherdeva V.V., Dezhurov S.V., Wakstein M.S., Shirmanova M.V., Zagaynova E.V., Martyanov A.A., Savitsky A.P. Biodistribution and clearance of quantum dots in small animals. - Proc. SPIE, 2011, vol. 7999, pp. 799908-799908-10. doi:10.1117/12.888959

4. Ширманова M.В., Кузнецова М.М., Жердева В.В., Салыкина Я.Ф., Евдокимова О.С., Савицкий А.П. Исследование биораспределения и влияния на организм лабораторных животных коллоидных квантовых точек. - Медицинский альманах, 2011. -спецвыпуск по материалам Х-ой научной сессии молодых ученых и студентов

"Современное решение актуальных научных проблем в медицине" (Н. Новгород, март, 2011).- С. 223.

5. Логинова Я.Ф., Жердева В.В., Казачкина Н.И., Савицкий А.П. Биораспределение и фармакокинетика квантовых точек при разных способах введения. - Сборник статей Второй международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» / Под ред. А.П.Кудинова и Б.В.Крылова.-СПб.: Изд-во Политехи, ун-та, 2011, т. 2, сс. 217-219.

Тезисы докладов

1. Salykina Y.F., Jerdeva V.V., Wakstein M.S., Dezhurov S.V., Savitsky A.P. In vivo detection of quantum dots in nude mice. - Proceedings of II International symposium «Topical problems of biophotonics - 2009», Nizhny Novgorod - Samara - Nizhny Novgorod, 19-24 July 2009, pp. 183-184.

2. Салыкина Я.Ф., Жердева В.В., Бакштейн М.С., Дежуров С.В., Савицкий А.П. Изучение in vivo распределения квантовых точек на мышах линии nude при пероральном введении. - Материалы всероссийской научной школы для молодежи «Горизонты нанобиотехнологии», Москва, 12-16 октября 2009 г., сс. 74-75.

3. Salykina Y.F., Zherdeva V.V., Dezhurov S.V., Wakstein M.S., Shirmanova M.V., Zagaynova E.V., Savitsky A.P. Biodistribution and clearance of quantum dots in small animals. - Abstracts of XIV International School for Junior Scientists and Students on Optics, Laser Physics and Biophotonics «Saratov Fall Meeting-2010», Saratov, 5-8 October 2010, http://optics.sgu.ru/SFM/2010/report/1179 (дата обращения 09.02.2013).

4. Salykina Y.F., Zherdeva V.V., Dezhurov S.V., Wakstein M.S., Savitsky A.P. Biodistribution and stability of quantum dots in mouse digestive tract following per os administration. - 3rd Nanotechnology International Forum «Rusnanotech 2010», Moscow, 1-3 November 2010, CD disc.

5. Loginova (Salykina) Y.F., Zherdeva V.V., Dezhurov S.V., Wakstein M.S., Savitsky A.P. Advantages of double polymer/silica coated quantum dots for in vivo application in the gastrointestinal tract. - Proceedings of III International symposium «Topical problems of biophotonics - 2011», St.-Petersburg - Nizhny Novgorod, 16-22 July 2011, pp. 162-163.

6. Kazachkina N.I., Salykina Y.F., Zherdeva V.V., Savitsky A.P. The influence of solvent on the toxicity and biodistribution of quantum dots in mice. - Proceedings of III International symposium «Topical problems of biophotonics - 2011», St.-Petersburg - Nizhny Novgorod, 1622 July 2011, p. 159.

7. Логинова (Салыкина) Я.Ф., Жердева B.B., Ширманова М.В., Загайнова Е.В., Савицкий А.П. Изучение фармакокинетических свойств квантовых точек флуоресцентными методами на мелких лабораторных животных. Материалы VI Съезда Российского фотобиологического общества, пос. Шепси, 15-22 сентября 2011 г., с. 171.

Подписано в печать 28.02.2013 г.

Формат 60x90/16. Заказ 1650. Тираж 100 экз. Усл.-печ. л. 1,2.

Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов.

Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, Ленинский пр. 42, тел. (495)774-26-96