Прижизненное исследование экзогенной флуоресценции тканей животных методом диффузионной флуоресцентной томографии

Ширманова, Марина Вадимовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Прижизненное исследование экзогенной флуоресценции тканей животных методом диффузионной флуоресцентной томографии
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Прижизненное исследование экзогенной флуоресценции тканей животных методом диффузионной флуоресцентной томографии"

На правах рукописи

□03482453

ШИРМАНОВА Марина Вадимовна

ПРИЖИЗНЕННОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКЗОГЕННОЙ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ТКАНЕЙ ЖИВОТНЫХ МЕТОДОМ ДИФФУЗИОННОЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ТОМОГРАФИИ

03.00.13 - физиология 03.00.02 - биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

У НОЯ

/.а. И

Нижний Новгород-2009

003482453

Работа выполнена на кафедре биофизики Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского

Научные руководители: Кандидат биологических наук

Балалаева Ирина Владимировна

Доктор медицинских наук Загайнова Елена Вадимовна

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук

Корягин Александр Сергеевич

Доктор физико-математических наук Казанцев Виктор Борисович

Ведущая организация: „. _

Учреждение Российской академии наук

Институт биофизики Сибирского отделения РАН

Защита состоится «26» ноября 2009 г. в «¿¿у> часов на заседании диссертационного совета Д 212.166.15 при Нижегородском государственном университете им. Н.И.Лобачевского по адресу 603950, Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Нижегородского государственного университета им. Н.И.Лобачевского

Автореферат разослан «&» 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н., доцент

КопыловаС.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В настоящее время флуоресцирующие соединения различной природы широко используются в биологии и медицине для изучения разнообразных физиологических функций организма в условиях нормы и при альтерации (Dustin, 2003; Jaffer et al., 2006). Все большее распространение получает флуоресцентная диагностика и фотодинамическая терапия с использованием органических фоточувствительных красителей - фотосенсибилизаторов (Чиссов и др., 2003; Красновский, 2006). В основе их применения лежит избирательное накопление и более длительное удержание в зоне неконтролируемой пролиферации, что создает предпосылки для ее обнаружения по характерной флуоресценции и селективного лечебного воздействия без повреждения окружающих нормальных тканей (Странадко и др., 1998; Гелъфонд, 2007). Многочисленные исследования последних лет демонстрируют, что все известные фотосенсибилизаторы обнаруживаются также в нормальных органах и тканях, а их распределение в организме зависит от многих факторов физиологического и физико-химического характера {Kazachkina et al, 1996). В тоже время, имеющихся данных недостаточно для формирования целостной картины механизмов неспецифического поступления флуорофоров в ткани животных и их элиминации.

Флуоресцентные свойства фотосенсибилизатора обеспечивают определение его локализации и содержания в организме флуоресцентными методами (Loschenov et al., 2ООО; Bulgakova et al., 2006). На сегодняшний день флуоресценция тканей, вызванная введением флуорофоров или их предшественников в организм животного, изучается, как правило, на изолированных органах и тканях методами, которые требуют большого количества материала и зачастую достаточно трудоемки (Смирнова и др., 2005). В проводимых исследованиях практически не учитывается фактор индивидуальности живого организма. Неинвазивное динамическое наблюдение флуоресценции внутренних органов у животного существующими методами -спектрально-флуоресцентными, микроскопическими и, тем более, экстракционными - невозможно в принципе.

Первостепенное место во всем мире отводится методам флуоресцентной визуализации in vivo, позволяющим неинвазивно исследовать механизмы функционирования тканей и органов, изучать физиологические процессы в динамике на уровне целого организма, учитывая индивидуальные особенности животных (Ntziachristos et al., 2005). Одним из таких методов является диффузионная флуоресцентная томография (ДФТ), основанная на регистрации флуоресцентного сигнала при прохождении возбуждающего излучения сквозь объект в различных проекциях (Zacliarakis et al. 2005; Turchin et al., 2008). Однако возможности метода применительно к визуализации и количественному анализу экзогенной флуоресценции тканей животных in vivo мало изучены, что делает данное направление исследований чрезвычайно актуальным.

Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы состояла в исследовании экзогенной флуоресценции в тканях животных in vivo в условиях нормы и альтерации методом диффузионной флуоресцентной томографии.

Для достижения поставленной цели нами решались следующие задачи:

1. Изучить возможности диффузионной флуоресцентной томографии для визуализации флуоресцирующих объектов в глубине биотканей в эксперименте post mortem.

2. Исследовать распределение и динамику циркуляции в организме животных in vivo экзогенных флуорофоров: препаратов для флуоресцентной диагностики и новых флуорофоров разных классов.

3. Провести сравнение результатов, полученных in vivo методом ДФТ, со стандартными флуоресцентными методами ex vivo - флуоресцентной спектроскопией и конфокальной флуоресцентной микроскопией.

4. На основании выполненных экспериментальных исследований предложить методики прижизненной визуализации, мониторинга и количественной оценки экзогенной флуоресценции тканей животных.

Научная новизна

Впервые показана возможность визуализации флуоресцирующих объектов миллиметрового размера в тканях животных методом ДФТ. Установлено, что флуорофоры красной области спектра могут быть обнаружены методом ДФТ в концентрациях, достижимых в живом организме после системного введения.

Впервые проведено прижизненное динамическое наблюдение распределения трех фотосенсибилизаторов (фотосенс, фотодитазин, 5-AJ1K-индуцированный Пп1Х) в организме животных.

Проведен анализ биораспределения полупроводниковых нанокристаллов CdSe/CdS, покрытых меркаптоуксусной кислотой, и CdTe/ZnS, покрытых нейтральным метокси-ПЭГ.

Впервые получены данные о распределении и динамике циркуляции в организме нового органического флуорофора - порфиразинового комплекса иттербия.

Предложены универсальные методики прижизненной неинвазивной визуализации, мониторинга и количественного анализа содержания флуорофоров в тканях экспериментального животного методом ДФТ.

Научно-практическая значимость

Работа обосновывает возможность прижизненного неинвазивного исследования экзогенной флуоресценции тканей животных на уровне целого организма методом ДФТ. Предложены универсальные методики наблюдения экзогенной флуоресценции и ее количественного анализа, применимые к исследованию соединений, поглощающих и флуоресцирующих в видимой области спектра. Полученные результаты имеют важное значение для

понимания механизмов взаимодействия флуоресцирующих соединений с тканями животных в условиях in vivo.

Результаты диссертационного исследования могут найти практическое применение в доклиническом испытании новых препаратов для флуоресцентной диагностики. Возможность прижизненной визуализации экзогенной флуоресценции тканей позволит снизить затраты на тестирование препаратов, осуществляя его в более короткие сроки, на меньшем количестве животных, с учетом влияния индивидуальных особенностей лабораторных животных.

Основные результаты работы могут быть включены в соответствующие разделы спецкурсов и лекций общего курса по физиологии человека и животных и биофизике.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Исследование экзогенной флуоресценции тканей животных методом диффузионной флуоресцентной томографии позволяет получить прижизненно данные о распределении флуорофора в органах и динамике его циркуляции в организме.

2. По двумерным флуоресцентным изображениям, полученным методом ДФТ, возможна количественная оценка содержания флуорофоров в ткани.

3. Данные метода ДФТ in vivo хорошо согласуются с данными стандартных флуоресцентных методов ex vivo - конфокальной флуоресцентной микроскопией и флуоресцентной спектроскопией.

Апробация работы

Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Международной школе «Биофизика для медицины» (Румыния, 2007 г.), где отмечены дипломом первой степени, Международном конкурсе научных работ в рамках I Международного форума по нанотехнологиям (Москва, 2008 г.), где отмечены дипломом третьей степени, Международном симпозиуме «Topical problems of biophotonics-2009» (Нижний Новгород-Самара, 2009 г.), VII и VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2008, 2009 гг.), 3 Троицкой конференции «Медицинская физика и инновации в медицине» (Троицк, 2008 г.), V Съезде Российского фотобиологичсского общества (Пущино, 2008 г.), Всероссийской научной конференции с международным участием «Нанотехнологии в онкологии 2008» (Москва, 2008 г.), 13-й Нижегородской сессии молодых ученых (Нижний Новгород, 2008 г.), VIII научной сессии «Современное решение актуальных научных проблем в медицине» (Нижний Новгород, 2009 г.), Международной Школе по Биофотонике (Швеция, 2009 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 22 работы, из них 6 в изданиях, рекомендованных ВАК. Запатентовано 1 изобретение.

Конкурсная поддержка работы

Проведенные исследования поддержаны проектами Федерального Агентства по Науке и Инновациям (02.522.11.2002, 02.512.11.2244, 02.740.11.0086), РФФИ (07-02-01262, 07-02-01146, 08-02-99049), Грантом в конкурсе научных работ аспирантов, выполняемых по приоритетным направлениям науки, технологии и техники в «Нижегородском объединенном научном центре университета и институтов РАН».

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на ¿^страницах, включает £ таблиц и ¿3 рисунков. Список литературы содержит о?У У источников, из них .¿¿^зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования служили линейные мыши и беспородные крысы обоего пола. Общее количество животных - 165, из которых 20 - беспородные 7-дневные крысы, 46 - аутбредные мыши CD-I, 12 - мыши гибриды BDF1, 65 -мыши линии СБА, 12- мыши линии Balb/c, 10- мыши линии nude.

В исследовании использованы следующие флуорофоры: препараты для флуоресцентной диагностики «Фотосенс», «Фотодитазин», «Аласенс», тетрафенилтетрацианопорфиразиновый комплекс иттербия, квантовые точки CdTe/ZnS, CdSe/CdS, флуоресцирующий белок DsRed2.

Работа выполнена на диффузионном флуоресцентном томографе ДФТ-2М, разработанном и сконструированном в ИПФ РАН (г. Нижний Новгород). В установке источником излучения служат лазеры на длинах волн 532 нм и 635 нм, детектирование флуоресценции осуществляется с помощью охлаждаемого высокочувствительного фотоэлектронного умножителя. Для разделения излучения накачки и флуоресценции использованы фильтры 575-640, 595/55, 710/50. Сканирование объекта проводится путем пошагового синхронного перемещения источника и приемника, расположенных в конфигурации "на просвет". Для получения изображения животное фиксируется за 4 конечности на специальной подставке между двумя стеклянными пластинами с легким прижатием. Волосяной покров предварительно удаляется. В результате сканирования получается двумерное изображение (ДФТ-изображение) животного во фронтальной плоскости. Изображение демонстрируется в псевдоцветовой шкале, на которой светлые тона соответствуют большей интенсивности ДФТ-сигнала, а темные - меньшей.

Количественную обработку ДФТ-изображений по уровню ДФТ-сигнала проводили программе ImageJ (Version 1.24o, National Institutes of Health, США).

С целью оценки возможности флуоресцентной диффузионной томографии для визуализации флуоресценции соединений разных классов в глубине биотканей была проведена серия экспериментов на животных post mortem. Исследование проводилось на 7-дневных крысах. Флуоресцирующий объект моделировали путем подкожной инъекции раствора флуорофора, а также введением капсул диаметром 1.5 - 2.5 мм, заполненных флуорофором, в пищевод животного.

Исследование биораспределения флуорофоров в организме животного in vivo методом ДФТ выполнено на здоровых мышах CD-I с использованием препаратов для флуоресцентной диагностики. Было сформировано 4 группы животных: «интактные», «фотосенс», «аласенс», «фотодитазин», из которых интактная группа включала 3 животных, остальные - по 6. ДФТ-изображения получали до введения фотосенсибилизатора, через 10 мин, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ч после введения. Далее сканирование проводили 1 раз в сутки в течение 7 дней. Для подтверждения результатов ДФТ стандартными методами ex vivo животных, получивших препарат, умерщвляли через 6 и 168 ч по 3 из каждой группы и анализировали флуоресценцию органов и тканей с помощью флуоресцентной спектроскопии и конфокальной флуоресцентной микроскопии.

Моделью локального флуоресцирующего очага для выполнения количественного анализа флуоресценции по данным ДФТ служила перевивная опухоль. Основанием для использования опухоли в качестве такой модели была возможность ее трансплантации на любой удобный для исследования участок тела, контроль размера и скорости роста и избирательное накопление флуоресцирующих агентов из-за особенностей метаболизма. Были апробированы опухоли карцинома Эрлиха ELD, карцинома легких Льюис LLC, рак шейки матки РШМ-5. Для эксперимента отбирали животных с одиночными узлами, имеющими объем 250-300 мм3.

Мониторинг накопления фотосенсибилизаторов методом ДФТ был выполнен на модели РШМ-5 с использованием фотосенса (1 мг/кг), аласенса (400 мг/кг) и фотодитазина (25 мг/кг). ДФТ-изображения получали до введения препарата, через 10-20 мин, 1, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8 ч. По окончании эксперимента животных (по 5 в каждой группе) подвергали эвтаназии под наркозом и забирали опухоль. Макроскопическое описание опухоли и анализ флуоресценции методами ex vivo выполняли сразу после забоя.

Анализ зависимости ДФТ-сигнала в опухоли от дозы фотосенсибилизатора был проведен с использованием фотодитазина (5, 10, 25 мг/кг, внутривенно). Группы с разными дозами включали по 5 животных. ДФТ-наблюдение проводили в течение 120 ч in vivo.

Для оценки концентрации флуорофора в ткани была выполнена калибровка интенсивности ДФТ-сигнала с использованием модельной среды, состоящей из липофундина и туши, показатели рассеяния и поглощения которой были близкими к оптическим параметрам биоткани. Определяли

значения ДФТ-сигнала в среде с концентрацией фотосенса 0.005 - 0.9 мкг/мл, фотодитазина 0.125-75 мкг/мл.

Исследование распределения в организме и динамики циркуляции полупроводниковых нанокристаллов проводили на мышах nude с опухолью карцинома молочной железы SKBR-3. Растворы квантовых точек CdTe/ZnS вводили животным внутривенно в дозах 0.15 нмоль, CdSe/CdS - 3.5 нмоль на 1 животное. ДФТ-изображения получали до введения раствора, через 15 мин, 1, 2,3,4,5, 6,7, 8,24 ч.

Исследование биораспределения порфиразинового комплекса иттербия выполняли на мышах СВА с опухолью РШМ-5. Доза порфиразинового комплекса для введения животным составляла 15 мг/кг. Сканирование методом ДФТ проводили в течение 150 ч in vivo в режиме: каждый час до 8 ч после введения, затем 1 раз в сутки.

Флуоресцентная спектроскопия выполнялась с помощью спектрометра QE65000 (Ocean Optics Inc., США). Исследовали спектры флуоресценции органов брюшной полости (почек, кишечника, печени, селезенки), сердца, мышечной ткани, кожи и опухоли мышей. Флуоресценцию детектировали в образцах ex vivo толщиной 1 мм, «на просвет», при возбуждении на длине волны 635 нм. С каждого образца получали по 5-8 спектров. При математической обработке спектров определяли интегральную интенсивность флуоресценции в диапазоне 660-760 нм.

Конфокальную лазерную сканирующую микроскопию проводили на установке Axiovert 200М LSM 510 МЕТА (Carl Zeiss, Германия). Изображения получали в отраженном свете (возбуждение на длине волны 488 нм, прием сигнала в диапазоне 438-485 нм) и в режиме флуоресценции (однофотонное возбуждение на длинах волн 543 нм или 633 нм, прием сигнала в диапазонах 575-640 нм и 651-704 нм соответственно).

Статистическую обработку результатов выполняли с использованием стандартных пакетов Microsoft Excel 2007 и Biostat (версия 4.03) с вычислением средних значений (М), стандартных отклонений (SD), коэффициента ранговой корреляции Спирмена и его уровня значимости. Для линейных зависимостей получали уравнение регрессии и достоверность аппроксимации.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Исследование возможностей метода ДФТ для визуализации экзогенной флуоресценции биотканей

В рамках задачи по изучению возможностей ДФТ для регистрации экзогенной флуоресценции биологических тканей первоначально мы исследовали влияние собственной (или авто-) флуоресценции на формирование изображений. Эндогенными флуорофорами тканей в видимой области спектра являются НАДН, флавопротеины, коферменты, связанный билирубин, продукты окисления белков и липидов, порфирины, ферменты антиоксидантной системы; за флуоресценцию в красной области отвечают в основном эндогенные порфирины (Девятков и др., 1987; Кару, 2001).

Исследование собственной флуоресценции тканей ex vivo здорового животного методами флуоресцентной спектроскопии и конфокальной флуоресцентной микроскопии показало наличие интенсивной флуоресценции в образцах кишечника, кожи, почек при возбуждении в зеленом диапазоне (532 нм). При возбуждении в красной области (635 нм) автофлуоресценция была крайне мала. Значительная автофлуоресценция тканей в зеленой области спектра приводила к тому, что для получения ДФТ-изображения флуоресцирующей капсулы, помещенной в пищевод животного post mortem, при работе в зеленом диапазоне требовались более высокие концентрации флуорофоров: концентрации квантовых точек CdSe/CdS и флуоресцирующего белка DsRed2 составляли 3-Ю"6 моль/л и 1-Ю'6 моль/л соответственно. Минимальные для детектирования концентрации флуорофоров красной области спектра составляли 10 мг/л для фотосенсибилизатора «Фотосенс» и 5-Ю"11 моль/л для квантовых точек CdTe/ZnS. Таким образом, использование красного излучения в качестве зондирующего в ДФТ и соответствующих флуорофоров более целесообразно с точки зрения минимальной автофлуоресценции. Более того, в красной области ткани животных обладают большей прозрачностью в связи со слабым поглощением излучения гемоглобином и меланином (Jacques, 1992).

Указанные концентрации флуорофоров красного диапазона могут быть достигнуты в тканях животных после системного введения в организм (Смирнова и др., 2005; Schipper et al., 2007).

В экспериментах с использованием капсул в качестве флуоресцирующих объектов было установлено, что используемая ДФТ-установка детектирует капсулы, размер которых сравним с теоретическим разрешением метода (1-2 мм).

Исследование экзогенной флуоресценции биотканей в условиях in vivo имеет некоторые особенности, связанные с обездвиживанием животного на время процедуры сканирования. Используемый нами способ фиксации не травмирует животное и делает необязательным использование для этой цели наркоза. С одной стороны, работа с животным без его наркотизации может приводить к артефактам движения на изображениях в виде темных поперечных полос, но с другой стороны - создает возможность проведения мониторинга в течение длительного времени, т.к. время действия большинства неингаляционных анестезирующих средств ограничено 20 - 60 мин. Более того, применение наркоза может вызвать тяжелые нарушения физиологических функций организма, что может сказываться на распределении флуорофоров и динамике их циркуляции.

Прижизненный мониторинг распределения фотосенсибилизаторов в организме здоровых животных методом ДФТ

Мы провели мониторинг распределения в организме животных in vivo трех соединений: фотодитазина, фотосенса и 5-АЛК-индуцированного Пп1Х, использованных в дозах, не превышающих терапевтические.

На рис. 1 показано динамическое наблюдение биораспределения методом ДФТ на примере фотодитазина. В результате его накопления натянутые участки кожи в области подмышечных впадин и небольшая зона в проекции брюшной полости становятся более светлыми уже в первые минуты после введения. В период с 1 до 5 ч в брюшной полости наблюдается повышение интенсивности сигнала и увеличение площади зоны флуоресценции. Через 24 ч уровень сигнала на изображении значительно снижается. К 72 ч наблюдается практически йодное выведение фотодитазина из организма животного.

Показано, что целый ряд факторов, включая оптическую толщину объекта, прозрачность, уровень автофлуорес ценшт, влияет на формирование ДФТ-изображения. После введения экзогенного флуорофора эти факторы сохраняются и их необходимо учитывать при анализе биораспределения, сравнивая интенсивность сигнала на изображениях в участках одинаковой локализации или нормируя ДФТ-сигнал на его значение в контроле до введения флуорофора - фон (СагЬеп а1. 2002). При численной обработке изображений мы получали усредненное значение сигнала в трех участках изображения (кожа, грудная клетка, брюшная полость) и нормировали его на значение сигнала в контроле до введения препарата. По результатам численной обработки изображений были получены сведения об изменении ДФТ-сигнала в указанных областях, которые позволили оценить накопление фотосенсибилизаторов в тканях и динамику циркуляции в организме.

Показано, что уровень флуоресценции нормальных тканей, обусловленный наличием фотосеисибияизатора, и динамика накопления и выведения различных фотосенсибилизаторов отличаются.

контроль 10 мин 5ч 24ч

Рис. I. Мониторинг биораспределения фотодитазина (25 мг/кг, внутривенно) в организме здорового животного методом ДФТ in vivo. Размер изображений 35x45 мм.

Для фотодитазина характерно быстрое накопление в тканях (рис. 2а). Максимальный уровень сигнала, превышающий контрольный в 12-17 раз в брюшной полости, в 5 раз в коже, в 2 раза в грудной клетке отмечается в период с 2 до б ч. Через 24 ч наблюдается значительное снижение интенсивности сигнала в анализируемых участках. Через 120 ч в брюшной

полости сигнал превышал фон в 2.5 раза, а в коже и грудной клетке значения интенсивности близки к исходному уровню.

Установлено, что накопление фотосенса происходит медленнее с достижением максимума к 4 ч и высоким уровнем сигнала в коже. Через сутки после введения отмечены значительные индивидуальные отличия в динамике циркуляции препарата: у 3 из 8 животных отмечалось увеличение отношения сигнал/фон, у 1 - сохранение на том же уровне, у 4 - снижение. Постепенное снижение интенсивности сигнала в брюшной полости и коже начиналось через 48 ч. Однако, даже через 7 суток уровень флуоресценции в нормальных тканях оставался высоким (рис. 26).

В течение 6 ч после введения аласенса увеличение сигнала в результате накопления 5-АЛА-индуцированного Пп1Х носило нарастающий характер. Через 24 ч сигнал снижался. Отмечено быстрое выведение фотосенсибилизатора из нормальных тканей: через 72 ч интенсивность сигнала на изображении приближалась к контролю (рис. 2в).

Рис. 2. Динамика изменения ДФТ-сигнала в ■ - брюшной полости, И - коже, Е2 - грудной клетке после введения препаратов: а - фотодитазипа (25 мг/кг, внутривенно), б - фотосенса (1 мг/кг, внутривенно), в - аласенса (400 мг/кг, перорально).

Распределение фотосенсибилизатора между нормальными органами и тканями неравномерно и определяется их структурно-функциональными особенностями и физиологическими функциями. Наибольшая концентрация отмечается в органах брюшной полости, отвечающих за элиминацию (печень, селезенка, почки), минимальная - в мышцах (Gomer et al., 1990; Rousseau et al., 1990). Поэтому наиболее высокий уровень флуоресценции на полученных нами изображениях отмечался в проекции брюшной полости, наименьший - в грудной клетке.

В нашем исследовании большая дисперсия значений ДФТ-сигнала, характерная для всех фотосенсибилизаторов, отражает индивидуальность в динамике накопления и распределении фотосенсибилизатора у животных в группе. Данные литературы также указывают на значительные индивидуальные колебания интенсивности флуоресценции (Sroka et al., 1996; Морозова, 2007).

При поступлении в кровяное русло фотосенсибилизаторы прежде всего достигают богато васкуляризованных органов. Затем происходит их перераспределение по водной фазе организма, а также по тканям с относительно замедленным кровотоком - скелетной мускулатуре, подкожной клетчатке, костной ткани и т.д. Дальнейшее распределение в организме обусловлено физико-химическими свойствами фотосенсибилизатора (молекулярной массой, гидрофильностыо/липофильностыо, зарядом) (Lee et al., 2001; Смирнова и др. 2005).

Для фотодитазина характерно экстрацелголярное распределение в тканях, быстрое выведение из организма преимущественно печенью через кишечник и низкая кожная фототоксичность (Corner et al., 1990).

Фотосенс отличается длительным временем циркуляции в организме, высоким уровнем флуоресценции в коже. Экскреция его происходит как через ретикуло-эндотелиальную систему, так и через почки, что объясняется неоднородным составом препарата (Смирнова и др., 2005).

Основным механизмом накопления 5-АЛК-индуцированного Пп1Х в тканях является синтез in situ в течение нескольких часов после введения аласенса, хотя некоторые авторы указывают также на возможность его поступления из органов с интенсивным метаболизмом (печени, почек) (Patrice, 2004; Kristiansson et al., 2005). Повышенный синтез Пп1Х отмечается в тканях с активной пролиферацией, эпителиальной выстилке органов, коже. Элиминация Пп1Х происходит, главным образом, в результате его превращения в фотонеактивный гем в течение 24 ч (Venosa et al., 2006).

Особенности в динамике накопления трех фотосенсибилизаторов в органах брюшной полости и коже, установленные в результате прижизненного исследования методом ДФТ, сходны с данными, полученными стандартными методами. В результате накопления фотосенсибилизаторов в тканях детектировалась интенсивная флуоресценция. Форма спектров флуоресценции тканей и органов ex vivo и положение максимумов совпадали с характерными для фотосенсибилизаторов в диапазоне 660-760 нм. На рис. 3 и 4 показаны результаты спектроскопии и конфокальной микроскопии для случая фотодитазина.

Было установлено, что области с высокой интенсивностью сигнала в проекции брюшной полости на изображениях топографически соответствуют тонкому кишечнику, почкам и мочевому пузырю. Повышение сигнала в проекции указанных органов позволило получить данные о возможных путях выведения фотосенсибилизаторов. В период с 1 до 6 ч после введения препаратов флуоресценция в области кишечника, почек и мочевого пузыря была характерна для всех исследуемых фотосенсибилизаторов. В литературе указывается, что в их

экскреции участвует преимущественно печень, в меньшей степени - почки. Поскольку печень на изображениях была не видна из-за высокого уровня поглощения, о выведении фотосенсибилизаторов с желчью через печень мы могли судить косвенно по флуоресценции в проекции кишечника.

Рис. 3. Спектры

-кишечник -сердце -почки -печень •мышцы -кожа -селезенка

§• 1000

680 700 720 Длина волны, нм

флуоресценции образцов органов и тканей ex vivo через б ч после введения фотодитазина (25 мг/кг, внутривенно). Возбуждение на длине волны 635 нм, прием сигнала в диапазоне 660-760 нм. Интенсивность флуоресценции в спектрах оганов и тканей интактного животного не превышала 30 отн.ед.

почки кишечник

Рис. 4. Конфокальная флуоресцентная микроскопия ex vivo образцов тканей, сенсибилизированных фотодитазином -6ч после внутривенного введения в дозе 25 мг/кг (слева), и без фотосенсибилизатора (справа). Возбуждение при 633 нм, прием сигнала в диапазоне 650-710 нм.

Однако, во многих случаях (39 % изображений) идентификация отдельных органов животного на ДФТ-изображениях была затруднена по причине особенностей анатомического строения или метаболизма. Тем не менее, оценка интенсивности флуоресцентного сигнала по отдельным областям изображения представляется важной при исследовании биораспределения и динамики циркуляции в организме флуоресцирующих соединений.

Количественный анализ экзогенной флуоресценции тканей животных на модели локального флуоресцирующего очага

В результате сравнения трех экспериментальных опухолей в качестве такой модели был выбран рак шейки матки РШМ-5 поскольку данная опухоль характеризуется медленным ростом, формирует объемные шарообразные узлы, не имеет крупных видимых некрозов.

Методом ДФТ было установлено, что избирательное накопление фотосенсибилизатора опухолевой тканью приводит к увеличению сигнала в проекции опухоли и визуализации ее на изображениях. Поскольку накопление фотосенсибилизатора в окружающих опухоль нормальных тканях мало, опухоль имеет вид локальной зоны с более высоким уровнем сигнала (рис. 5).

контроль 1ч 2 ч

Рис. 5. Прижизненный мониторинг накопления фотосенса (1 мг/кг, внутривенно) в опухоли РШМ-5 методом ДФТ. Размер изображений 20x25 мм. Возбуждение флуоресценции на длине волны 635 нм, прием сигнала в диапазоне 685-735 нм.

Точного объяснения механизмов селективного накопления и удержания фотосенсибилизаторов в опухоли пока нет. Предполагается влияние целого ряда факторов: повышенная проницаемость кровеносных сосудов, снижение дренажной функции лимфатической системы, более низкий рН, большое количество макрофагов, высокий уровень экспрессии рецепторов к липопротеинам низкой плотности и др. (Жданов и др., 1974; Dougherty et al., 1991).

Полученные нами данные демонстрируют различия в динамике накопления фотосенсибилизаторов в опухоли (рис. 6). Для фотодитазина характерно быстрое накопление. Уже через 1 ч кинетическая кривая интенсивности сигнала в опухоли выходит на плато. Высокая интенсивность ДФТ-сигнала сохраняется в течение всего времени наблюдения (6 ч). Накопление фотосенса происходит медленнее. Интенсивность сигнала 12

достигает максимума к 3 ч наблюдения и в дальнейшем слабо изменяется. Для протопорфирина IX, индуцированного пероральным введением аласснса, свойственно постепенное накопление в опухоли, которое отражается плавным возрастанием ДФТ-сигнала до б ч. Выявленные нами особенности в динамике накопления фотосенсибилизаторов соответствуют данным литературы, полученным ex vivo (Comer et al., 1990; Lee et al., 2003).

Рис. 6. Динамика накопления в опухоли РШМ-5 фотосенсибилизаторов: ~~-фотосенс (1 мг/кг), * — фотодитазин (25 мг/кг), я

5-АЛК-индуцированный Пп1Х (доза аласенса 400 мг/кг).

Конфокальная флуоресцентная микроскопия качественно подтвердила наличие флуоресценции фотосенсибилизаторов в опухолевой ткани в период накопления.

Обнаружена высокая корреляция между интенсивностью ДФТ-сигнала в опухоли in vivo и интенсивностью флуоресценции в спектрах, зарегистрированных с помощью флуоресцентной спектроскопии ex vivo. Коэффициент корреляции Спирмена между интенсивностью сигнала, усредненной по площади всей опухоли, и интегральной интенсивностью спектров флуоресценции в интервале 660-760 нм для фотосенса составлял 0.76 (Р<0.05), фотодитазина - 0.90 (Р<0.001), аласенса-0.86 (Р<0.02).

Таким образом, полученные in vivo данные метода ДФТ об изменении интенсивности сигнала в локальном очаге в результате накопления флуорофора хорошо согласуются с результатами стандартных флуоресцентных методов исследования ex vivo.

Мы исследовали in vivo зависимость ДФТ-сигнала в опухоли от дозы фотосенсибилизатора для случая фотодитазина (рис. 7). При минимальной использованной дозе 5 мг/кг интенсивность сигнала в опухоли достигает максимума уже через 1 ч после введения, превышая контрольное значение в среднем в 5 раз. Начиная с 4 ч, уровень сигнала начинает снижаться. Через 5 суток интенсивность сигнала близка к исходной.

При дозе 10 мг/кг через 1 ч после введения интенсивность сигнала в опухоли увеличивается в 10 раз. Через 1 сутки интенсивность ДФТ-сигнала уменьшается до значения отношения сигнал/фон около 5. К 5 суткам сигнал превышал контроль в 2.5 раза, т. е. полного выведения фотодитазина из опухоли не отмечено.

Время, часы

г з

Время, сутки б

Рис. 7 Динамика изменения интенсивности ДФТ-сигнала в опухоли РШМ-5 in vivo после внутривенного введения фотодитазина в дозах: 25

При наибольшей дозе 25 мг/кг максимум накопления в опухоли достигался к 4 ч - увеличение интенсивности сигнала составляло 20 раз. Начиная с 5 ч после инъекции, динамика изменения сигнала в группе животных отличалась. У трех из пяти животных сигнал в опухоли снижался, у двух других оставался на том же уровне, что привело к высоким значениям стандартного отклонения. Через сутки интенсивность сигнала была выше контроля в 7 раз, через 5 суток - в 3.5 раза, что свидетельствовало о сохранении флуорофора в опухоли.

Было установлено, что зависимость интенсивности ДФТ-сигнала в опухоли от дозы фотосенсибилизатора в диапазоне доз 0-25 мг/кг имеет линейный характер с достоверностью аппроксимации 0.98.

Для определения концентрации флуорофоров в опухолевой ткани была, выполнена калибровка интенсивности ДФТ-сигнала на модельной среде. По результатам измерения ДФТ-сигнала в среде было установлено, что зависимость уровня ДФТ-сигнала от концентрации фотосенсибилизатора в диапазоне концентраций 0-8 мкг/мл для фотодитазина и 0-0.6 мкг/мл для фотосенса близка к линейной. Интенсивность ДФТ-сигнала в опухоли PIIIM-5 in vivo в максимуме накопления фотодитазина при наибольшей дозе (25 мг/кг) не превышала 1000 отн. ед., что соответствует концентрации фотодитазина около 6 мкг/мл. В максимуме накопления фотосенса (1 мг/кг) интенсивность сигнала составляла около 1200 отн. ед., что соответствует концентрации порядка 0.25 мкг/мл.

На основании полученных результатов можно сделать заключение, что но интенсивности ДФТ-сигнала на изображении с некоторым приближением можно оценивать концентрацию фотосенсибилизатора в ткани. По нашим предположениям, данный способ количественной оценки может претендовать на точность не более порядка. Тем не менее, прижизненная оценка

мг/кг, * - 10 мг/кг.

5 мг/кг в интервале 0-8 ч (а) и 0-5 суток (б).

концентраций экзогенных флуорофоров в тканях даже с таким приближением представляется чрезвычайно перспективной, поскольку аналитические методы требуют большого числа животных и являются весьма трудоемкими. Отметим, что поскольку интенсивность сигнала зависит от множества факторов, помимо концентрации флуорофора, включая технические характеристики установки, геометрию эксперимента и оптические параметры ткани, при количественной оценке флуорофора необходимо строго соблюдать идентичность условий эксперимента и анализировать интенсивность сигнала в одном и том же участке изображения (Saarnak et al., 1998).

Исследование распределения и динамики циркуляции в организме животных новых флуорофоров методом ДФТ Мониторинг распределения квантовых точек в организме животного

in vivo

Имеются сведения, что вследствие структурного атипизма сосудов в опухоли наночастицы неспецифически накапливаются в зоне альтерации и могут быть использованы для диагностики (Gao et al., 2004).

Мы исследовали распределение квантовых точек в организме мышей nude с трансплантированной подкожно карциномой молочной железы человека SKBR-3. На рис. 8 представлена диаграмма изменения ДФТ-сигнала в опухоли, коже, грудной клетке и брюшной полости животных в течение 21 ч после внутривенного введения раствора квантовых точек CdTe/ZnS мышам. Установлено, что с током крови наночастицы очень быстро поступают в опухоль, вследствие чего уже через 10 мин после инъекции наблюдается повышение ДФТ-сигнала в среднем в 4.5 раза. К 5 ч сигнал в опухоли увеличивается до б раз по сравнению с контролем и в следующие 4 ч изменяется незначительно. Через 21 ч отмечено снижение отношения сигнал/фон в зоне опухоли до 3. В нормальных тканях показано возрастание ДФТ-сигнала в 2-2.5 раза с первых минут наблюдения. На данном уровне отношение сигнал/фон удерживалось в течение 3 ч. Начиная с 4 ч, сигнал в брюшной полости и коже плавно увеличивался, достигая максимума к 6 ч, а в грудной клетке немного снижался. Полагаем, что нарастание различий в интенсивности сигнала в указанных областях может быть связано с тем, что первоначально (до 3 ч) нанокристаллы циркулируют в крови и «равномерно» распределены в организме, а на более поздних этапах концентрируются в органах брюшной полости и коже. Характерно, что к 21 ч сигнал в коже и грудной клетке возвращается к исходному значению, а в брюшной полости остается повышенным.

В результате анализа ДФТ-изображений in vivo, нами обнаружены различия в распределении квантовых точек двух типов: CdTe/ZnS, покрытых нейтральным метокси-ПЭГ, и CdSe/CdS, покрытых меркаптоуксусной кислотой, в нормальных органах и тканях. В случае квантовых точек CdTe/ZnS с 1 до 9 ч после введения наблюдалась флуоресценция в проекции почек и

ДФТ-изображениях отмечена

Рис. 8. Динамика изменения ДФТ-сигнала в □ -опухоли, ■ - брюшной полости, □ - коже, 0 -грудной клетке после введения квантовых точек СсГГе/гпБ (0.15 нмоль на животное, внутривенно).

Наличие квантовых точек в органах и тканях подтверждено конфокальной флуоресцентной микроскопией ex vivo (рис. 9).

Особенностью в распределении квантовых точек CdSe/CdS была преимущественная аккумуляция частиц в лимфатических узлах (рис. 10). Флуоресценция в подмышечных лимфоузлах была детектирована на ДФТ-изображениях через 15 мин после введения квантовых точек и сохранялась на протяжении 2.5 ч.

Полученные нами результаты демонстрируют два варианта биораспределения квантовых точек - с преимущественным накоплением частиц в ретикуло-эндотелиальной или мочевыделительной системе, и согласуются с литературными данными о характере распределения частиц в зависимости от покрытия (Kim et al., 2003; Raymond et al., 2007).

В нашем исследовании наблюдалось значительное снижение ДФТ-сигнала через сутки после введения квантовых точек. Однако, мы не можем с уверенностью сказать, является ли это следствием их выведения или деградации в организме. Вопрос о выведении квантовых точек из организма активно дискутируется во всем мире и единого мнения среди исследователей о времени циркуляции частиц в организме и возможности их выведения пока нет {Cai et al., 2007; Ballou étal, 2008).

Прижизненное исследование методом ДФТ нового соединения порфиразиновой природы

С целью повышения эффективности флуоресцентной диагностики и фотодинамической терапии в настоящее время в мире ведется активный поиск новых фотосенсибилизаторов.

В данной работе мы исследовали in vivo методом ДФТ биораспределение и динамику циркуляции в организме нового соединения тетраазапорфиринового ряда - тетрафенилтетрацианопорфиразинового комплекса иттербия (Григорьев, 2009). Необходимо отметить, что данное соединение является новым, и его оценка как потенциального фотосенсибилизатора проводилась впервые.

мочевого пузыря. Б отдельных случаях на флуоресценция в области кишечника.

печень кишечник почки кожа

опухоль мышцы селезенка сердце

Рис. 9. Конфокальная флуоресцентная микроскопия ex vivo образцов тканей и органов мыши через 6 ч после внутривенного введения квантовых точек CdTe/ZnS. Возбуждение при 488 нм, прием сигнала в диапазоне 650710 нм.

а б в г

Рис. 10. Накопление квантовых точек CdSe/CdS в лимфатических узлах (3.5 нмоль на животное, внутривенно), а, б - ДФТ-изображения (20x20 мм), возбуждение флуоресценции на длине волны 532 нм, прием сигнала в диапазоне 575-640 нм; в, г - конфокальная флуоресцентная микроскопия ткани лимфатического узла ex vivo, а, в - контроль, б, г - изображения через 2.5 ч после введения квантовых точек.

В калибровочном эксперименте на модельной среде мы установили, что в диапазоне концентраций 0-0.25 мкг/мл зависимость интенсивности ДФТ-сигнала в среде от концентрации соединения линейна с достоверностью аппроксимации 0.99. При этом интенсивность сигнала на порядок ниже, чем при использовании близкого по химической природе фотосенсибилизатора «Фотосенс». Поэтому при выборе дозы нового соединения для введения в организм животных мы взяли более высокую дозу, чем для фотосенса - 15 мг/кг. Использованная доза не вызывала острой токсической реакции у животных.

На изображениях, полученных методом ДФТ in vivo, зарегистрировано повышение интенсивности сигнала в нормальных тканях и опухоли уже через 15 мин после инъекции (рис. 11). В период с 3 до 6 ч уровень сигнала был максимален. Значительное снижение сигнала брюшной полости отмечено через 24 ч. Флуоресценция в опухоли и коже сохранялась до 150 ч наблюдения. Область с высоким уровнем ДФТ-сигнала в брюшной полости анатомически соответствовала тонкому кишечнику, что дает основания предполагать, что основной путь элиминации нового соединения - с желчью через кишечник.

Отн.ед. 250

контроль 15 мин 6 ч 150 ч

Рис. 11. ДФТ-мониторинг распределения порфиразинового комплекса иттербия (15 мг/кг, внутривенно) in vivo в организме мыши с РШМ-5. Размер изображений 35x45 мм.

Численная обработка изображений позволила установить, что в максимуме накопления интенсивность сигнала в брюшной полости увеличивается по сравнению с контрольным значением в 7-8 раз, в грудной клетке в 1.5-2 раза, в опухоли и коже в 3 раза (рис. 12). Несмотря на слабую, по сравнению с традиционными фотосенсибилизаторами, флуоресценцию, новое соединение детектируется методом ДФТ в организме животных in vivo, что позволяет исследовать его биораспределение и динамику циркуляции. Однако, селективность его накопления в опухоли невысока и соизмерима с уровнем накопления в кожи. Оценочная концентрация порфиразинового комплекса в опухоли по данным ДФТ составляла около 0.1 мкг/г.

Время, ч

Рис. 12. Динамика изменения ДФТ-сигнала в □ -опухоли, ■ - брюшной полости, □ - коже, £2 -грудной клетке после введения порфиразинового комплекса иттербия (15 мг/кг, внутривенно).

Исследование образцов тканей и органов ex vivo методами флуоресцентной спектроскопии и конфокальной флуоресцентной микроскопии подтвердило результаты ДФТ.

В спектрах флуоресценции образцов, полученных в максимуме накопления порфиразинового комплекса в тканях (3 ч), наиболее интенсивное излучение зарегистрировано в печени и кишечнике (рис. 13). Минимальный уровень флуоресценции порфиразина был характерен для мышечной ткани, селезенки и почек. Через 150 ч максимальная интенсивность излучения зарегистрирована в образцах опухоли.

620 640 660 680 700 720 740 760 620 640 660 680 700 720 740 760

Длина полны, нм Длина волны, нм

а б

Рис. 13. Спектры флуоресценции образцов тканей и органов ex vivo: а-через 3 ч, б - через 150 ч после внутривенного введения порфиразинового комплекса иттербия (15 мг/кг, внутривенно). Возбуждение на длине волны 635 нм, прием сигнала в диапазоне 660-760 нм. Интенсивность флуоресценции в органах и тканях контрольного животного не превышала 30 отн.ед.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное исследование показало возможность метода ДФТ для визуализации в тканях животных экзогенной флуоресценции соединений различной природы: органических фотосенсибилизаторов, неорганических квантовых точек и флуоресцирующих белков. Установлено, что метод является достаточно чувствительным для детектирования малых концентраций флуорофора, достижимых в биологических тканях, и обеспечивает визуализацию объектов размером 1.5-2.5 мм.

Нами разработана универсальная методика динамического наблюдения и анализа биораспределения флуорофоров in vivo. Следует признать, что индивидуальные особенности анатомического строения и метаболизма животных в некоторых случаях затрудняют идентификацию отдельных органов. Тем не менее, оценка изменения ДФТ-сигнала в интересующих областях изображения - грудной клетке, коже, брюшной полости в целом -представляется перспективной в изучении накопления и выведения флуорофоров.

Полученные нами результаты количественной оценки флуорофора на модели локального флуоресцирующего очага говорят о том, что с помощью ДФТ принципиально возможна оценка концентрации флуорофора в ткани in vivo по двумерным флуоресцентным изображениям. Важнейшим фактом является то, что информация о распределении флуорофора в организме, динамике его циркуляции и содержании в тканях может быть получена быстро на небольшом количестве животных.

Объективность данных, полученных с помощью метода ДФТ, подтверждается высокой согласованностью с результатами стандартных флуоресцентных методов анализа ex vivo. При этом возможность прижизненного неинвазивного наблюдения флуоресценции на уровне целого организма является несомненным достоинством метода ДФТ.

ВЫВОДЫ

1. Диффузионная флуоресцентная томография визуализирует флуоресцирующие объекты миллиметрового размера в биологических тканях. Флуорофоры красного диапазона спектра могут быть детектированы методом ДФТ в концентрациях, достижимых в живом организме.

2. Показано in vivo методом ДФТ, что в органах брюшной полости и коже мышей фотодитазин максимально накапливается к 2 ч, 5-AJ1K-индуцированный Пп1Х - к 6 ч, фотосенс - к 4 ч, время выведения из организма составляет 5, 3 и более 7 суток соответственно.

3. Установлено, что нанокристаллы CdTe/ZnS, покрытые нейтральным метокси-ПЭГ, селективно накапливаются в опухоли мышей SKBR-3 и выводятся преимущественно мочевыделительной системой, a CdSe/CdS, покрытые меркаптоуксусной кислотой, аккумулируются в ретикуло-эндотелиальной системе.

4. Максимальное накопление в органах брюшной полости и коже мышей нового органического соединения - порфиразинового комплекса иттербия - наблюдается с 3 до 6 ч после введения. Отмечено удержание соединения в опухоли РШМ-5 и коже более 6 суток.

5. Результаты исследования экзогенной флуоресценции тканей животных методом ДФТ согласуются с данными флуоресцентной спектроскопии и конфокальной флуоресцентной микроскопии.

6. Предложены универсальные методики прижизненной неинвазивной визуализации и количественного анализа экзогенной флуоресценции с помощью диффузионной флуоресцентной томографии, которые позволяют охарактеризовать распределение флуорофора в организме экспериментального животного в динамике.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Turchin I.V., Plehanov V.I., Orlova A.G., Kamensky V.A., Kleshnin M.S., Shirmanova M.V., Shakhova N.M., Balalaeva I.V., Savitsky A.P. Fluorescence diffuse tomography of small animals with DsRed2 fluorescent protein // Laser Physics.- V.16.- №5,-2006,-P. 741-746

2. Turchin I.V., Balalaeva I.V., Vasil'ev R.B., Zlomanov V.P., Plehanov V.I., Orlova A.G., Zagaynova E.V., Kamensky V.A., Kleshnin M.S., Shirmanova M.V., Dorofeev S.G., Dirin D.N. Imaging of QDs-labeled tumors in small animals by fluorescence diffuse tomography // Laser Physics Letters.- V. 3.-№4.- 2006,- P. 20S-211

3. Балалаева И.В., Шнрманова M.B., Загайнова E.B., Орлова А.Г., Каршиева С.Ш., Романенко В.И. Неинвазивный мониторинг содержания фотосенсибилизаторов в тканях животных методом диффузионной флуоресцентной томографии // Вестник Нижегородского университета им. Н.И Лобачевского.- №3.- 2008.- С. 105-109

4. Загайнова Е.В., Шнрманова М.В., Сироткина М.А., Балалаева И.В., Клешнин М.С., Турчин И.В., Седакова Л.А., Романенко В.И., Трещалина Е.М. Мониторинг накопления фотосенсибилизаторов в опухоли методом диффузионной флуоресцентной томографии // Российский биотерапевтический журнал.- 2008.- т.7.- №4.- С. 30-33

5. Turchin I.V., Kamensky V.A., Plehanov V.I., Orlova A.G., Kleshnin M.S., Fiks I.I., Shirmanova M.V., Meerovich I.G., Arslanbaeva L.R., Jerdeva V.V., Savitsky A.P. Fluorescence diffuse tomography for detection of red fluorescent protein expressed tumors in small animals // J. Biomed. Opt.- V.13.- 2008,- 041310

6. Загайнова E.B., Шнрманова M.B., Сироткина M.A., Орлова А.Г., Балалаева И.В., Каменский В.А. Методы оптической томографии для оценки накопления металлических и полупроводниковых наночастиц в опухоли // Российский биотерапевтический журнал.-2009.- №1,- Т.8.- С. 14-15

7. Шнрманова М.В., Загайнова Е.В., Балалаева И.В., Сироткина М.А., Турчин И.В., Клешни il M .С. Способ прижизненного исследования фотосенсибилизаторов / заявка на изобретение РФ №> 2008132353/14 (решение о выдаче патента от 11.06.2009 г., приоритет от 07.08.2008 г.)

8. Шнрманова М.В., Сироткина М.А., Клешнин М.С., Турчин И.В., Снопова Л.Б., Орлова А.Г., Балалаева И.В., Загайнова Е.В., Трещалина Е.М. Визуализация экспериментальных опухолей с использованием фотосенса на флуоресцентном диффузионном томографе // Нижегородский медицинский журнал,- №4.- 2008.- С. 7-12

9. Turchin I.V., Savitsky A.P., Kamensky V.A., Plehanov V.I., Orlova A.G., Sergeeva E.A., Kleshnin M.S., Shirmanova M.V. Frequency domain fluorescent diffuse tomography of small animals with DsRed2-expressed tumors.- Proc. SP1E.- V. 6098-12.- 2006.- P. 76-83

10. Orlova A., Turchin I., Plehanov V., Balalaeva I., Sergeeva E., Kamensky V., Shirmanova M., Savitsky A. Frequency domain fluorescence diffuse tomography of small animals // 5th International conference on Photonics and Imaging in Biology and Medicine, China, 2006,- P. 128-129

11. Balalaeva I.V., Orlova A.G., Shirmanova M.V., Kibraeva E.A., Zagaynova E.V., Turchin I.V. Fluorescence diffuse tomography for tumors detection and monitoring // Proc. SPIE-V. 6535 .-2007

12. Turchin I.V., Savitsky A.P., Kamensky V.A., Plehanov V.I., Meerovich I.G., Arslanbaeva L.R., Jerdeva V.V., Orlova A.G., Kleshnin M.S., Shirmanova M.Y., Fiks 1.1. Fluorescence diffuse tomography for detection of RFP-expressed tumors in small animals // Proc. SPIE.- V. 6449, 644915.-2007

13. Orlova A.G., Turchin I.V., Kamensky V.A., Plehanov V.I., Balalaeva I.V., Sergeeva E.A., Shirmanova M.V., Kleshnin M.S. Frequency domain fluorescence diffuse tomography of small animals // Proc. SPIE. - Vol. 6534,- 2007

14. Balalaeva I.V., Shirmanova M.V., Zagainova E.V., Orlova A.G., Turchin I.V., Kamensky V.A. In vivo imaging of photosensitiser- and QDs-labeled tumors in small animals by fluorescence diffuse tomography // Proceedings of International Symposium «Topical problems of biophotonics-2007», Nizhny Novgorod, P. 144-145

15. Balalaeva I.V., Turchin I.V., Orlova A.G., Plekhanov V.I., Shirmanova M.V., Kleshnin M.S., Fiks I.I., Zagainova E.V., Kamensky V.A. Diffuse fluorescence tomography of exo- and endogenously labeled tumors // Proc. SPIE.- 6734,67340K.- 2007

16. Shirmanova M.V., Zagaynova E.V., Balalaeva I.V., Orlova A.G., Kamensky V.A. Diffuse fluorescence tomography of tumors with exogenouse fluorescent markers-photosensitisers and quantum dots // Abstracts book of International Autumn School "Biophysics for Medicine", Mangalia, Romania.- 2007.- P. 43

17. Загайнова E.B., Ширманова M.B., Сироткина M.A., Балалаева И.В., Клешнин М.С., Орлова А.Г., Седакова JI.A. Флуоресцентный имиджинг глубоко локализованных опухолей // Материалы VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 2008,- С. 16

18. Ширманова М.В., Сироткина М.А., Клешнин М.С., Леканова Н.Ю., Крутова И.В. Флуоресцентная визуализация экспериментальных опухолей in vivo с

использованием фотосенсибилизаторов и полупроводниковых нанокристаллов II Сборник тезисов 13-й Нижегородской сессии молодых ученых, 2008.- С. 34-35

19. Ширманова М.В., Загайнова Е.В., Сироткина М.А., Клешнин М.С., Орлова А.Г., Балалаева И.В. Визуализация экспериментальных опухолей на установке для диффузионной флуоресцентной томографии // Материалы 3 Троицкой конференции «Медицинская физика и инновации в медицине», Альманах клинической медицины.- Т. XVII.-№1.- Москва, 2008.- С. 128-131

20. Загайнова Е.В., Ширманова М.В., Сироткина М.А., Орлова А.Г., Балалаева И.В., Каменский В.А. Повышение информативности оптической томографии с использованием металлических и полупроводниковых наночастиц II Материалы 3 Троицкой конференции «Медицинская физика и инновации в медицине», Альманах клинической медицины,- Т. XVII.-№2,- Москва, 2008,- С. 334-338

21. Ширманова М.В., Загайнова Е.В., Балалаева И.В., Сироткина М.А., Орлова А.Г., Клешнин М.С. Фотосенсибилизаторы как опухолевые маркеры для визуализации экспериментальных новообразований методом диффузионной флуоресцентной томографии // Материалы V Съезда Российского фотобиологического общества, Пущино.-2008,-С.140

22. Ширманова М.В., Загайнова Е.В., Балалаева И.В., Сироткина М.А., Клешнин М.С. Прижизненная флуоресцентная визуализация экспериментальных опухолей // Тезисы докладов всероссийской научной конференции с международным участием «Нанотехнологии в онкологии 2008», Москва, 2008.- С.191

23. Shirmanova M.V. In vivo investigation of photosensitizer pharmacokinetics in mouse models of cancer by transilluminative fluorescence imaging // 4lh International graduate summer school "Biophotonics'09": book of abstracts, Ven, Sweden.- 2009.- P. 31

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ДФТ - диффузионная флуоресцентная томография Пп1Х - протопорфирин IX ПЭГ - полиэтиленгликоль

Подписано в печать 16.10.2009. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1. Тир. 100. Зак. 596.

Типография Нижегородского госуниверситета 603000, Н. Новгород, ул. Б. Покровская, 37.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ширманова, Марина Вадимовна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Общие представления о взаимодействии света с биологическими тканями. Автофлуоресценция.

1.2. Экзогенная флуоресценция. Физиологические механизмы распределения флуорофоров в тканях животных.

1.3. Методы исследования флуоресценции тканей животных.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Флуорофоры.

2.3. ДФТ-установка.

2.4. Методики исследований.

Глава 3. Результаты и их обсуждение.

3.1. Исследование возможностей метода ДФТ для визуализации экзогенной флуоресценции тканей животных.

3.2. Прижизненная визуализация и количественный анализ флуоресценции фотосенсибилизаторов в тканях животных.

3.2.1. Мониторинг распределения фотосенсибилизаторов в организме здоровых животных in vivo методом ДФТ.

3.2.2. Количественный анализ экзогенной флуоресценции ткани на модели локального флуоресцирующего очага.

3.3. Исследование распределения и динамики циркуляции в организме животных новых флуорофоров методом ДФТ.

3.3.1. Мониторинг распределения квантовых точек в организме животного in vivo.

3.3.2. Прижизненное исследование методом ДФТ нового соединения порфиразиновой природы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Прижизненное исследование экзогенной флуоресценции тканей животных методом диффузионной флуоресцентной томографии"

Актуальность проблемы

В настоящее время флуоресцирующие соединения различной природы широко используются в биологии и медицине для изучения разнообразных физиологических функций организма в условиях нормы и при альтерации [99, 133]. Все большее распространение получает флуоресцентная диагностика и фотодинамическая терапия с использованием органических фоточувствительных красителей — фотосенсибилизаторов [53, 55]. В основе их применения лежит избирательное накопление и более длительное удержание в зоне неконтролируемой пролиферации, что создает предпосылки для ее обнаружения по характерной флуоресценции и селективного лечебного воздействия без повреждения окружающих нормальных тканей [11, 47]. Многочисленные исследования последних лет демонстрируют, что все известные фотосенсибилизаторы накапливаются также в нормальных органах и тканях, а их распределение в организме зависит от многих факторов физиологического и физико-химического характера [35, 137, 209]. В тоже время, имеющихся данных недостаточно для формирования целостной картины механизмов неспецифического поступления флуорофоров в ткани животных и их элиминации.

Флуоресцентные свойства фотосенсибилизатора обеспечивают определение его локализации и содержания в организме флуоресцентными методами [76, 159]. На сегодняшний день флуоресценция тканей, вызванная введением флуорофоров или их предшественников в организм животного, изучается, как правило, на изолированных органах и тканях методами, которые требуют большого количества материала и зачастую достаточно трудоемки. В проводимых исследованиях практически не учитывается фактор индивидуальности живого организма. Неинвазивное динамическое наблюдение флуоресценции внутренних органов у животного существующими методами - спектрально-флуоресцентными, микроскопическими и, тем более, экстракционными - невозможно в принципе.

Первостепенное место во всем мире отводится методам флуоресцентной визуализации in vivo, позволяющим неинвазивно исследовать механизмы функционирования тканей и органов, изучать физиологические процессы в динамике на уровне целого организма, учитывая индивидуальные особенности животных [183]. Одним из таких методов является диффузионная флуоресцентная томография (ДФТ), основанная на регистрации флуоресцентного сигнала при прохождении возбуждающего излучения сквозь объект в различных проекциях [223, 243]. Однако возможности метода применительно к визуализации и количественному анализу экзогенной флуоресценции тканей животных in vivo мало изучены, что делает данное направление исследований чрезвычайно актуальным.

Цель и задачи исследования

Для достижения поставленной цели нами решались следующие задачи:

Научная новизна

Впервые проведено прижизненное динамическое наблюдение распределения трех фотосенсибилизаторов (фотосенс, фотодитазин, 5-АЛК-индуцированный Пп1Х) в организме животных.

Впервые получены данные о распределении и динамике циркуляции в организме нового органического флуорофора — порфиразинового комплекса иттербия.

Научно-практическая значимость

Результаты диссертационного исследования могут найти практическое применение в. доклиническом испытании новых препаратов для флуоресцентной диагностики. Возможность прижизненной визуализации экзогенной флуоресценции, тканей позволит снизить затраты на тестирование препаратов, осуществляя его в более короткие сроки, на меньшем количестве животных, с учетом влияния индивидуальных особенностей лабораторных животных.

Основные: результаты работы могут быть включены в* соответствующие разделы спецкурсов и лекций общего курса по физиологии человека и животных и биофизике.

Основные положения; выносимые на защиту

1. Исследование экзогенной флуоресценции* тканей животных методом-диффузионной' флуоресцентной томографии1 позволяет получить прижизненно данные о распределении флуорофора в органах и динамике его циркуляции в организме.

2. По двумерным флуоресцентным изображениям, полученным методом, ДФТ, возможна количественная оценка содержания флуорофоров в ткани.

3. Данные метода ДФТ in vivo хорошо согласуются с данными стандартных флуоресцентных методов ex vivo — конфокальной флуоресцентной микроскопией и флуоресцентной спектроскопией.

Апробация работы 5

Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Международной школе «Биофизика для медицины» (Румыния; 2007 г.), где отмечены дипломом первой степени, Международном конкурсе научных работ в рамках I Международного форума по нанотехнологиям (Москва, 2008 г.), где отмечены дипломом третьей степени, Международном симпозиуме «Topical problems of biophotonics-2009» (H. Новгород-Самара, 2009 г.), VII и VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые- препараты» (Москва, 2008, 2009 гг.), 3 Троицкой конференции «Медицинская* физика и инновации в медицине» (Троицк, 2008 г.), V Съезде Российского фотобиологического общества (Пущино, 2008 г.), Всероссийской научной* конференции с международным участием «Нанотехнологии в онкологии 2008» (Москва, 2008f г.), 13-й- Нижегородской сессии молодых ученых (Н. Новгород, 2008 г.), VIII научной сессии «Современное решение^ актуальных научных проблем в медицине» (Н* Новгород, 2009 г.), Международной> Школе по Биофотонике (Швеция, 2009 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 22 работы, из них 6 в изданиях, рекомендованных ВАК. Запатентовано Т изобретение.

Конкурсная поддержка работы

Объемги структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания-материалов и методов исследований, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 158 страницах, включает 6 таблиц и 53 рисунка. Список литературы содержит 244 источника, из них 187 зарубежных.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Ширманова, Марина Вадимовна

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные результаты показали возможность метода ДФТ для визуализации в тканях животных флуоресценции соединений различной природы: органических фотосенсибилизаторов, неорганических квантовых точек и флуоресцирующих белков [221-223]. Установлено, что метод является достаточно чувствительным для детектирования малых концентраций флуорофора, достижимых в тканях животных при системном введении в организм, и обеспечивает визуализацию объектов размером 1.52.5 мм. Характерно, что работа в красной области спектра позволяет минимизировать влияние собственной флуоресценции тканей на формирование изображения.

Мы обосновали возможность получения прижизненной информации о распределении флуорофора в организме животного на уровне целого организма [1, 22]. До сих пор флуоресценция тканей и внутренних органов животных анализируется инвазивными методами, которые позволяют проводить лишь «точечные» измерения или основываются на экстракции флуорофора из образца. Наши результаты продемонстрировали, что метод ДФТ позволяет наблюдать in vivo биораспределение флуорофоров в динамике.

В работе была исследована с помощью ДФТ флуоресценция трех фотосенсибилизаторов, использующихся в клинике для флуоресцентной диагностики и фотодинамической терапии. На основании анализа флуоресцентного сигнала по двумерным изображениям были получены in vivo данные о кинетике накопления фотосенсибилизаторов в нормальных тканях и их выведении. Было установлено, что фотосенсибилизатор хлориновой природы «Фотодитазин» характеризуется быстрой кинетикой поступления в ткани: уже через 2 ч после внутривенного введения отмечена максимальная флуоресценция в органах брюшной полости и коже мышей. Возвращение сигнала к контрольному уровню в результате элиминации препарата наблюдалось через 5 суток. Для ПпГХ, индуцированного пероральным введением препарата на основе 5-АЛК «Аласенс», максимум накопления в тканях достигался к 6 ч, а полное выведение из организма — к 3 суткам. Наиболее высокий уровень флуоресценции кожи и длительное время циркуляции в организме (более 7 суток) было характерно для фталоцианинового фотосенсибилизатора «Фотосенс». Следует отметить, что исследование флуоресценции указанных фотосенсибилизаторов в тканях животных на уровне целого организма проводилось впервые в-мире. При этом наши данные хорошо согласуются с результатами других авторов, полученными традиционными методами ex vivo.

Показано, что аккумуляция фотосенсибилизатора, в том или ином органе брюшной полости, создает предпосылки для идентификации данного органа на изображении. По результатам исследования нами сформулированы критерии'для идентификации почек, тонкого кишечника-и мочевого пузыря. Однако индивидуальные особенности анатомического ^ строения и метаболизма * животных в некоторых случаях затрудняют идентификацию отдельных органов на изображении. Тем не менее, оценка изменения ДФТ-сигнала в интересующих областях изображения - грудной- клетке, коже, брюшной полости в целом - представляется перспективной' в изучении экзогенной флуоресценции в тканях животных. Поскольку метод ДФТ позволяет визуализировать флуоресценцию в тканях одного и того же животного в течение длительного времени, его применение для^ исследования биораспределения флуорофоров имеет особое значение с точки зрения индивидуальности живого организма. Тогда как существующие флуоресцентные методы, ввиду инвазивности, факт индивидуальности не учитывают.

В данной^ работе мы. выполнили количественную оценку содержания фотосенсибилизаторов в ткани на модели локального флуоресцирующего очага. По причине избирательного накопления фотосенсибилизаторов, контроля размера и локализации такой моделью послужила перевивная опухоль. Полученная нами линейная зависимость интенсивности сигнала в очаге от введенной дозы фотосенсибилизатора свидетельствует о том, что уровень сигнала корректно отражает содержание флуорофора. Результаты оценки концентрации флуорофора на основе калибровки сигнала с использованием модельной среды говорят о принципиальной возможности количественной оценки содержания флуорофора в ткани in vivo с помощью ДФТ.

Объективность данных, полученных новым методом ДФТ, подтверждается высокой согласованностью с результатами стандартных флуоресцентных методов анализа ex vivo — флуоресцентной спектроскопией и конфокальной флуоресцентной микроскопией. Обнаруженная нами высокая корреляция между интенсивностью ДФТ-сигнала in vivo и интегральной интенсивностью флуоресценции в спектрах ткани ex vivo означает, что влияние различных факторов помимо флуоресценции фотосенсибилизатора, таких как неравномерное распределение фотосенсибилизатора в ткани, ее гистологическая гетерогенность, автофлуоресценция, на среднюю интенсивность ДФТ-сигнала незначительно. При этом возможность прижизненного неинвазивного наблюдения флуоресценции на уровне целого организма является несомненным достоинством метода ДФТ.

В итоге, на основании проведенного исследования экзогенной флуоресценции тканей животных, вызванной системным введением в организм фотосенсибилизаторов (или их предшественников), нами предложены методики наблюдения и количественного анализа флуорофоров в тканях животных in vivo в динамике. Получен патент на изобретение РФ [46].

Универсальность методик получила подтверждение при исследовании новых флуорофоров - квантовых точек и порфиразинового комплекса иттербия. На основании данных ДФТ мы установили различия в биораспределении квантовых точек с разными покрытиями. Наночастицы, покрытые нейтральным метокси-ПЭГ, после внутривенного введения были обнаружены преимущественно в мочевыделительной системе - почках и мочевом пузыре, а наночастицы, покрытые меркаптоуксусной кислотой, аккумулировались в лимфатических узлах. Это соответствует современным представлениям о том, что распределение флуорофора в организме во многом определяется его физико-химическими свойствами. В отношении порфиразинового комплекса иттербия нами была отмечена флуоресценция в проекции кишечника и сделано соответствующее предположение о механизме выведения его из организма. Слабая, по сравнению со стандартными фотосенсибилизаторами, селективность накопления его в неопластической ткани не позволяет прогнозировать его использование в качестве препарата для флуоресцентной диагностики.

Важнейшим фактом является то, что методом ДФТ информация о распределении флуорофора в организме, динамике его циркуляции и содержании в тканях может быть получена быстро на небольшом количестве животных. Это имеет высокую практическую значимость и позволяет предполагать, что в метод ДФТ станет незаменимым инструментом для исследования экзогенной флуоресценции тканей животных при доклиническом испытании новых препаратов для флуоресцентной диагностики и фотодинамической терапии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ширманова, Марина Вадимовна, Нижний Новгород

1. Беликов, А. В. Лазерные биомедицинские технологии (часть 1) / А.В. Беликов, А.В. Скрипник // Учебное пособие. СПб: СПбГУ ИТМО, 2008. -116 с.

2. Блохин, Н. Н. Клиническая онкология / Н.Н. Блохин, Б.Е. Петерсон. -М.: Медицина, 1971.- Т.1.- 440 с.

3. Бобров, А. П. Применение фотодитазина при лечении воспалительных заболеваний пародонта, вызванных зубными протезами / А.П. Бобров, А.Н. Бадмаева, А.В. Кузнецов // РБЖ. 2008. - Т.7, №4.- С. 44-46.

4. Боргуль, О. В. Фотодинамическая терапия кожных метастазов при диссеминированной меланоме кожи: автореф. дисс. канд. мед. наук : 14.00.19 / Боргуль Ольга Валентиновна Обнинск, 2007. - 16 с.

5. Булгакова, Н. Н. Изучение накопления фотосенсибилизатора Фотодитазин в гиперплазированной ткани предстательной железы человека / Н.Н. Булгакова, Д.М. Ягудаев, А.Е. Сорокатый и др. // Физическая Медицина. 2005. - Т. 2, № 15. - С. 15 - 21.

6. Вакуловская, Е. Г. Фотодинамическая терапия у больных раком слизистой оболочки рта, ротоглотки и нижней губы / Е.Г. Вакуловская, А.А. Стратонников, Т.Д. Таболиновская, Т.Т. Кондратьева // Сиб. Онкол. Журн. -2005.-Т. 2, № 14.-С. 13-17.

7. Владимиров, Ю. А. Некоторые особенности флуоресценции ароматических аминокислот / Ю.А. Владимиров // ДАН СССР. 1957. - Т. 116, №5.- С. 780-783.

8. Возовиков, И. Н. Возможности использования фотодинамической терапии для лечения и профилактики сердечно-сосудистых заболеваний / И.Н. Возовиков, Е.Р. Андреева, Е.С. Янцен и др. // Кардиологический вестник. 2006. - Т. 13, № 1. - С. 52-56.

9. Гельфонд, М. Л. Фотодинамическая терапия в онкологии / М.Л. Гельфонд // Практическая онкология. — 2007. Т. 8, № 4. — С. 204-210.

10. Гордиенко, В. И. Флуоресцентная диагностика опухолей на основе применения порфириновых соединений и лазерного излучения / В.И. Гордиенко, Н.М. Бондарь, В.Н. Залесский // Врач. дело. 1988. - №6. - С. 89—92.

11. Девятков, Н. Д. Физико-химические механизмы биологического действия лазерного излучения / Н.Д. Девятков, С.М. Зубкова, И.Б. Лапрун, Н.С. Макеева // Успехи совр. биол. 1987. - Т. 103, № 1. - С. 31-33.

12. Долгов, В. В. Фотометрия в лабораторной практике / В.В.Долгов, Е.Н.Ованесов, К.А. Щетникович // Москва, 2004. 142 с.

13. Дронова, О. Б. Исследование возможностей лазер-индуцированой ауто флуоресценции в диагностике пищевода Баррета / О.Б. Дронова, А.А. Третьяков, А.Н. Мищенко, Н.Н. Булгакова // Сибирский онкологический журнал. 2008. - №4 (28). - С. 11-16.

14. Дудин, М. Г. ФДТ артритов у детей и подростков / М.Г. Дудин, В.В. Ашмаров, Е.А. Мазуркевич и др. // Восстан. мед. и реабилитация: Тез. докл. ' IV Межд. конгресса, Москва. М., 2007. - С. 30.

15. Ефимов, И. Р. Прогресс в изучении механизмов электрической стимуляции сердца / И.Р. Ефимов, А.Т. Самбелашвили, В.Н. Никольский // Вестник аритмологии. — 2002. — № 26. С. 91-96.

16. Ефремова, Н. В. Клинико-функциональное обоснование лечения заболеваний пародонта методом фотодинамической терапии: автореф. дис. канд. мед. наук : 14.00.21 / Ефремова Наталья Владимировна.- Москва, 2005 .26 с.

17. Жданов, Д. А. Анатомия сосудов опухолей / Д.А. Жданов, JI.E. Этинген, Б.П. Ахмедов. Душанбе: Ирфон, 1974.- 192 с.

18. Загайнова, Е. В Мониторинг накопления фотосенсибилизаторов в опухоли методом диффузионной флуоресцентной томографии / Е.В. Загайнова, М.В. Ширманова, М.А. Сироткина и др. // РБЖ. 2008.- Т.7, №4.- С. 30-33.

19. Загайнова, Е. В. Методы оптической томографии для оценки накопления металлических и полупроводниковых наночастиц в опухоли / Е.В. Загайнова, М.В. Ширманова, М.А. Сироткина и др. // РБЖ.- 2009.- №1, Т.8.- С. 14-15.

20. Карнаухов, В.Н. Люминесцентный анализ клеток: Учебное пособие / В.Н. Карнаухов // Пущино: электронное изд-во "Аналитическая микроскопия", 2004. 131 с.

21. Конев, С. В. Спектры флуоресценции и спектры действия флуоресценции некоторых белков / С.В. Конев // ДАН СССР. 1957. - Т. 116, № 4.- С. 594-596.

22. Коссова, Г. В. Основы применения радиоиндикаторного метода в биологии / Г.В. Коссова, С.Ю. Егоров, Н.В. Алексеева и др. // М.: Изд-во Московского университета, 2004. 166 с.

23. Курченко, С. Н. Применение ФДТ с препаратом «Фотодитазин» при лечении дегенеративно-дистрофических и воспалительных заболеваний опорно-двигательного аппарата у детей и подростков / С.Н. Курченко, М.Г.

24. Дудин, Е.А. Мазуркевич, А.А. Шашко // Альманах клин. мед. 2008 . - Т. 17, ч.2.-С. 215-216.

25. Лакович, Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии / Дж. Лакович // М.: Мир, 1986. 496 с.

26. Лапченко, А. А. Антимикробная фотодинамическая терапия в комплексном лечении гнойного воспаления околоносовых пазух: автореф. дис. канд. мед. наук : 14.00.04 / Лапченко Александр Александрович,-Москва, 2009. 26 с.

27. Лебедева, Т. А. Синтез и физико-химические свойства комплексных соединений замещенных и аннелированных порфиразинов с лантанидами: автореф. дисс. канд. хим. наук : 02.00.03 / Лебедева Таисия Андреевна. — Иваново, 2008.-18 с.

28. Ломова, Т. Н. Основа синтеза и механизмы химических превращений порфиринов и их аналогов / Т.Н. Ломова // Текст лекций, часть 1. Иваново, 2006. - 70 с.

29. Лукьянец, Е. А. Новые сенсибилизаторы для фотодинамической терапии / Е.А. Лукьянец // Росс. хим. журнал. 1998. - Т. 42, №5. - С.9-16.

30. Международные рекомендации по проведению медико-биологических исследований с использованием животных // «Этический кодекс», разработан и опубликован в 1985 году Советом международных научных организаций

31. Миронов, А. Ф. Фотодинамическая терапия рака новый эффективный метод диагностики и лечения злокачественных опухолей / А.Ф. Миронов // Соросовский образовательный журнал. - 1996. - №8. - С. 32-40.

32. Морозова, Н. Б. Экспериментальное изучение нового фотосенсибилизатора «Фталосенс» для фотодинамической терапии злокачественных новообразований : автореф. дис.канд. биол. наук : 14.00.14 / Морозова Наталья Борисовна. Москва, 2007. - 28 с.

33. Морозова, Н. Б. Биораспределение препарата фталосенса у интактных животных и животных с опухолями различного гистогенеза / Н.Б. Морозова,

34. Р.И. Якубовская, В.М. Деркачева, Е.А. Лукъянец // Российский онкологический журнал. —2007. — № 1. — С. 37-43.

35. Назарова, А. И. Влияние заместителей на фотохимические и биологические свойства 13,15-.М-циклоимидных производных хлорина рб / А.И. Назарова, А.В. Феофанов, Т.А. Кармакова и др.] // Биоорган. Химия.2005.-Т. 31, №5.-С. 1-14.

36. Отдельнова, О. Б. Возможности фотодинамической терапии с использованием фотосенсибилизатора Фотодитазин в лечении гинекологических заболеваний / О.Б. Отдельнова, А.З. Хашукоева, М.И. Ибрагимова // РБЖ. 2008. - Т.7, №4. - С. 47-52.

37. Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных // Приказ Минздрава СССР от 12.08.1977 N 755 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных»

38. Пушкарева, А. Е. Методы математического моделирования в оптике биоткани / А.Е. Пушкарева // Учебное пособие. СПб: СПбГУ ИТМО, 2008. - 103 с.

39. Рубин, А. Б. Проблемы регуляции в биологических системах. Биофизические аспекты. Ижевск: НИЦ Регулярная и хаотическая динамика,2006. 480 с. - ISBN 978-5-93972-567-5.

40. Русаков, И. Г. Флюоресцентные методы диагностики и поверхностный рак мочевого пузыря: состояние / ИГ. Русаков, В.В. Соколов, Н.Н. Булгакова и др. // Урология. 2008. - № 3. - С. 67-72.

41. Синичкин, Ю. П. In vivo отражательная и флуоресцентная спектроскопия кожи человека / Ю.П. Синичкин, С.Р. Утц. Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2001. - 90 с. - ISBN 5-292-02626-3.

42. Смирнова, 3. С. Эффективность и фармакокинетика липосомальной лекарственной формы фотосенсибилизатора "Фотосенс" на основе сульфофталоцианина алюминия / З.С. Смирнова, Н.А. Оборотова, О.А. Макарова и др. // Хим.-фарм. Журн. 2005. - Т.39, № 7. - С. 3-7.

43. Соколов, В. В. Флуоресцентные методы в диагностике поверхностного рака мочевого пузыря /В.В. Соколов, И.Г. Русаков, Н.Н. Булгакова и др. // Сиб. Онкол. Журн. 2007. - №4 (24). - С. 117-126.

44. Странадко, Е. Ф. Фотодинамическая терапия базально-клеточного рака кожи с фотосенсибилизатором фотодитазином / Е.Ф. Странадко, В.Н. Волгин, И.А. Ламоткин и др. // РБЖ. 2008. - №4, Т.7. - С. 7-11.

45. Терещенко, А. В. Фотодинамическая терапия с фотосенсибилизатором «Фотодитазин» в офтальмологии / А.В. Терещенко, Ю.А. Белый, П.Л. Володин, М.А. Каплан. ООО «Издательство «Офтальмология»», 2008.- 288 е.- ISBN: 978-5-94289-038-4.

46. Толстых, П.И. Теоретические и практические аспекты лазерной фотохимии для лечения гнойных ран / П.И. Толстых, В.А. Дербенев, И.Ю. Кулешов // РБЖ. 2008. - Т.7, №4. -С.20-24.

47. Тучин, В. В. Лазеры и волоконная оптика в биомедицинских исследованиях / В.В. Тучин. Саратов: Изд-во Сарат. Ун-та, 1998. - 384 с. -ISBN: 5-292-01779-5.

48. Тучин, В. В. Оптическая биомедицинская диагностика. В 2 томах, Т.1 / В.В. Тучин. -М.: ФИЗМАТЛИТ, 2007. 559 е.- ISBN: 978-5-9221-0769-3.

49. Фомина, Г. И. Изучение новых фотосенсибилизаторов, предназначенных для флюоресцентной диагностики и фотодинамической терапии опухолей: автореф. дис. .канд. биол. наук : 14.00.14 / Фомина Галина Ивановна. Москва, 2001. - 33 с.

50. Цыб, А. Ф. Возможности и перспективы применения фотодинамической терапии (экспериментальные и клинические исследования) / А.Ф. Цыб, М.А. Каплан // Росс. Мед. Вести. 2002. - №2. - С. 19-24.

51. Черемисина, О. В. Современные возможности эндоскопических лазерных технологий в клинической онкологии / О.В. Черемисина, М.В. Вусик, А.Н. Солдатов, И.В. Рейнер // Сиб. Онкол. Журн. 2007. - №4 (24). -С. 5-11.

52. Чиссов, В. И. Флуоресцентная эндоскопия, дермаскопия и спектрофотометрия в диагностике злокачественных опухолей основных локализаций / В.И. Чиссов, В.В. Соколов, Н.Н. Булгакова, Е.В. Филоненко // РБЖ. — 2003. — Т. 2, № 4. — С. 45-56.

53. Шмидт, Р. Физиология человека. В 3 томах. Т. 3. / Р.Шмидт, Г. Тевс. -М.: Мир, 1996.- 313 с, ISBN: 5-03-002544-8

54. Штейн, Г. И. Руководство по конфокальной микроскопии / Г.И. Штейн, СПб: Изд-во Политехи, ун-та, 2007.- 77 с.

55. Akerman, М. Е. Nanocrystal targeting in vivo / M.E. Akerman, W.C. W. Chan, P. Laakkonen et. al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. - Vol. 99. - P. 12617-12621.

56. Al-Jamal, W. T. Blood circulation and tissue biodistribution of lipid-quantum dot (L-QD) hybrid vesicles intravenously administered in mice / W. T. Al-Jamal, K.T. Al-Jamal, A. Cakebread et al. // Bioconjugate Chem., Article ASAP.-2009

57. Alencar, H. Colonic adenocarcinomas: near-infrared microcatheter imaging of smart probes for early detection—study in mice / H. Alencar, M.A. Funovics, J. Figueiredo et al. // Radiology. 2007. - Vol. 244, №1. - P. 232-238.

58. Alivisatos, P. Quantum dots as cellular probes / P. Alivisatos, W. Gu, C. Larabell // Annu. Rev. Biomed. Eng. 2005. - Vol. 7. - P. 55-76.

59. Anas, A. Clathrin-mediated endocytosis of quantum dot-peptide conjugates in living cells / A. Anas, T. Okuda, N. Kawashima, K.Nakayama et al. // ACS Nano, Article ASAP. 2009 (http://pubs.acs.0rg/d0i/full/l0.102l/nn900663r).

60. Anetzberger, H. Validity of fluorescent microspheres method for bone blood flow measurement during intentional arterial hypotension / H. Anetzberger, E. Thein, M. Becker et al. // J Appl Physiol.- 2003. Vol. 95. - P. 1153-1158.

61. Ballou, B. Noninvasive imaging of quantum dots in mice / B. Ballou, B.C. Lagerholm, L.A. Ernst et al. // Bioconjugate Chem. 2004. - Vol.15, № 1. - P. 79-86.

62. Benson, R. C. Cellular autofluorescence- is it due to flavins? / R.C. Benson, R.A. Meyer, M.E. Zaruba, G.M. McKhann // J. Histochem. Cytochem. 1979, -Vol. 27, №1.-P. 44-48.

63. Berg, K. Lysosomes and microtubules as targets for photochemotherapy of cancer / K. Berg, J. Moan // Photochem. Photobiol. 1997. - Vol. 65. - P. 403409.

64. Berg, K. Porphyrin-related photosensitizers for cancer imaging and therapeutic applications / K. Berg, P.K. Selbo, A. Weyergang et al. // Journal of Microscopy. 2005. - Vol. 218. - P. 133-147.

65. Bernard, S. L. High spatial resolution measurements of organ blood flow in small laboratory animals / S. L. Bernard, J. R. Ewen, С. H. Barlow et al. // Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2000. - Vol. 279. - P.2043-2052.

66. Billinton, N. Seeing the wood through the trees: A review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence / N. Billinton, A. W. Knight // Anal. Biochem. 2001. - Vol. 291. - P. 175-197.

67. Bonnett, R. Chemical Aspects of Photodynamic Therapy / R. Bonnett-Gordon and Breach Science Publisher, 2000. 305 p. - ISBN 90-5699-248-1.

68. Bourayou, R. Fluorescence tomography technique optimized for noninvasive imaging of the mouse brain / R. Bourayou, H. Boeth, H. Benav et al. // J Biomed Opt. 2008. - Vol.13, № 4. - P. 041311

69. Bremer, C. In vivo molecular target assessment of matrix metalloproteinase inhibition / C. Bremer, C.H. Tung, R. Weissleder // Nat. Med. 2001. - Vol. 7, № 6.-P. 743-748.

70. Bremer, C. Molecular imaging of MMP expression and therapeutic MMP inhibition / C. Bremer, C.H. Tung, R. Weissleder // Acad Radiol. 2002. - Vol. 9 (Suppl2).-P. S314-5.

71. Bruchez, M. Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labels / M. Bruchez, M. Moronne, P. Gin et al. Science. - 1998. - Vol. 281. - P. 20132016.

72. Bulgakova, N. N. Local fluorescence spectroscopy and detection of malignancies using laser excitation at various wavelengths / N.N. Bulgakova, N.I. Kazachkina, V.V. Sokolov, V.V. Smirnov // Laser Physics. 2006. — V. 16, № 5. — P. 889-895.

73. Bums, A. A. Fluorescent silica nanoparticles with efficient urinary excretion for nanomedicine / A.A. Burns, J. Vider, H. Ow et. al. // Nano Lett. 2009. - Vol. 9,No. l.-P. 442-448.

74. Casas, A. Tissue distribution and kinetics of endogenous porphyrins synthesized after topical application of ALA in different vehicles / A. Casas, H. Fukuda, A.M. del C. Batlle // Br. J. Cane. 1999. - Vol. 81, №1. - P. 13-18.

75. Cai, W. Are quantum dots ready for in vivo imaging in human subjects? / W. Cai, A.R. Hsu, Z. Li, X. Chen // Nanoscale Res Lett. 2007. - Vol. 2. - P. 265281.

76. Centonze, V. E. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging / V.E. Centonze, J.G. White // Biophys J. 1998. - Vol. 75. - P. 2015-2024.

77. Chan, W-S. Tissue uptake, distribution, and potency of the photoactivable dye chloraluminum sulfonated phthalocyanine in mice bearing transplantable tumors / W-S. Chan, J.F. Marshall, G.Y.F. Lam, I.R. Hart. Cane. Res. - 1988. -Vol. 48.-P. 3040-44.

78. Chan, W. Effect of sulfonation on the cell and tissue distribution of the photosensitizer aluminum phthalocyanine / W. Chan, J.F. Marshall, R. Svensen, et. al. // Cane. Res. 1990. - Vol. 50. -P. 4533-4538.

79. Chan, W.C.W. Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection. / W. C. W. Chan, S. M. Nie // Science. 1998. - Vol. 281.- P. 20162018.

80. Chen, J. In vivo imaging of proteolytic activity in atherosclerosis / J. Chen, C.H. Tung, U. Mahmood et al. // Circulation. 2002. - Vol. 105, №23. - P. 2766-2771.

81. Chen, B. Liposomal delivery of photosensitising agents / B. Chen, B.W. Pogue, T. Hasan // Expert opinion on drug delivery. 2005. - Vol. 2, № 3. - P. 477-487.

82. Chen, L. The biocompatibility of quantum dot probes used for the targeted imaging of hepatocellular carcinoma metastasis / L. Chen, J. Liu, X. Yu et al. // Biomaterials. 2008. - Vol. 29. - P. 4170-4176.

83. Chen, W. Arthritis imaging using a near-infrared fluorescence folate-targeted probe / W. Chen, U. Mahmood, R. Weissleder, C.H. Tung // Arthritis Res Ther. -2005. Vol. 7. - P. R310-R317.

84. Choi, H. S. Renal clearance of quantum dots / H.S. Choi, W. Liu , P. Misra et al. // Nat Biotechnol. 2007. - Vol. 25, №10.- P. 1165-70.

85. Corlu, A. Three-dimensional in vivo fluorescence diffuse optical tomography of breast cancer in humans / A. Corlu, R. Choe, T. Durduran et al. // Optics Express. 2007. - Vol. 15, № 11. - P. 6696-6716.

86. Denk, W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy / W. Denk, J. Strickler, W. Webb // Science.- 1990.- Vol. 248, № 4951. P. 73-76.

87. Detter, C. Fluorescent Cardiac Imaging. A Novel Intraoperative Method for Quantitative Assessment of Myocardial Perfusion During Graded Coronary Artery Stenosis / C. Detter, S. Wipper, D. Russ et al. // Circulation. -2007. -V.l 16. -P. 1007-1014.

88. Diwu, Z. Phototherapeutic potential of alternative photosensitizers to porphyrins / Z. Diwu, J.W. Lown // Pharmacol. Ther. 1994. - Vol. 63, № 1. - P. 1-35.

89. Dolmans, D. Photodynamic therapy for cancer / D. Dolmans, D. Fukumura, R.K. Jain // Nature Reviews. 2003. - Vol. 3. - P. 380-387.

90. Dougherty, G. J. Photodynamic therapy: basic principles and clinical applications / G.J. Dougherty, B.W. Henderson. New York: Marcel Dekker, 1992. - 480 p. - ISBN: 0824786807.

91. Dougherty, T. J. Photodynamic Therapy / T.J. Dougherty, C.J. Gomer, B.W. Henderson et al. // J. Nat.Canc. Ins. 1998. - Vol. 90, No. 12 .- P. 889-905.

92. Dunn, K. W. Functional studies in living animals using multiphoton microscopy / K.W. Dunn, T.A. Sutton // ILAR Journal.- 2008.- Vol. 49, № 1. P. 66-77.

93. Dustin, M. L. In vivo imaging approaches in animal models of rheumatoid arthritis / M.L. Dustin // Arthritis Res Ther. 2003. - Vol. 5. - P. 165-171.

94. Eerbeek, O. Ratiometric intracellular calcium imaging in the isolated beating rat heart using indo-1 fluorescence / O. Eerbeek, E. G. Mik, C. J. Zuurbier et al. // J Appl Physiol.- 2004.- V.97. P.2042-2050.

95. Ferrario, A. Metabolic properties and photosensitizing responsiveness of mono-L-aspartyl chlorin еб in a mouse tumor model / A. Ferrario, D. Kessel, C.J. Gomer // Cancer Res. 1992. - Vol. 52. - P. 2890-3.

96. Fischer, H. C. Pharmacokinetics of nanoscale quantum dots: in vivo distribution, sequestration, and clearance in the rat / H.C. Fischer, L.Liu, K.S. Pang, W.C.W. Chan // Adv. Funct. Mater. 2006. - Vol. 16. - P. 1299-1305.

97. Fish, R. Anesthesia and analgesia in laboratory animals, 2nd Edition / R. Fish, PJ. Danneman, M. Brown, A. Karas // Academic Press, 2008. 672 p. -ISBN: 978-0-12-373898-1.

98. Fotinos, N. 5-Aminolevulinic acid derivatives in photomedicine: characteristics, application and perspectives / N. Fotinos, M.A. Campo, F. Popowycz et al. // Photochemistry and Photobiology. 2006. - Vol. 82. - P. 994-1015.

99. Frangioni, J. V. In vivo near-infrared fluorescence imaging / J.V. Frangioni // Current Opinion in Chemical Biology. 2003. - Vol. 7. - P. 626-634.

100. Frisoli, J. K. Pharmacokinetics of a fluorescent drug using laser-induced fluorescence / J.K. Frisoli, E.G. Tudor, T.J. Flotte et al. // Cane. Res. 1993. -Vol. 53.-P. 5954-61.

101. Funovics, M. Protease sensors for bioimaging / M. Funovics, R. Weissleder C.H. Tung // Anal Bioanal Chem. 2003. - Vol. 377. - P. 956-963.

102. Gao, X. In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots / X. Gao, Y. Cui, R.M. Levenson et al. // Nat. Biotech. 2004. - Vol. 22, № 8.-P. 696-976.

103. Garnett, M. C. Nanomedicines and nanotoxicology: some physiological principles / M. C. Garnett, P. Kallinteri // Occupational Medicine. 2006. - Vol. 56.— P. 307-311.

104. Glenny, R. W. Validation of fluorescent-labeled microspheres for measurement of regional organ perfusion / R. W. Glenny, S. Bernard, M. Brinkley // J Appl Physiol. 1993. - Vol. 74. - P. 2585-2597.

105. Godavarty, A. Fluorescence-enhanced optical imaging in large tissue volumes using a gain-modulated ICCD camera / A. Godavarty, M.J. Eppstein, C. Zhang et al. // Phys. Med. Biol. 2003. - Vol. 48. - P. 1701-1720.

106. Goiffon, R. J. Dynamic noninvasive monitoring of renal function in vivo by fluorescence lifetime imaging / R.J. Goiffon, WJ. Akers, M.Y. Berezin et al. // Journal of Biomedical Optics. 2009. - Vol. 14, № 2. - 020501-3

107. Gomer, C. J. Tissue distribution and photosensitizing properties of mono-L-aspartyl chlorin еб in a mouse tumor model / С.J. Gomer, A. Ferrario // Cane. Res. 1990. - Vol. 50. - P. 3985-90.

108. Grossweiner, L. I. The science of phototherapy / L.I. Grossweiner. CRC press, 1994. - 217 p. - ISBN: 084934980X.

109. Haller, J. Visualization of pulmonary inflammation using noninvasive fluorescence molecular imaging / J. Haller, D. Hyde, N. Deliolanis et al. // J Appl Physiol. 2008. - Vol. 104. - P. 795-802.

110. Hamblin, M. R. In vivo fluorescence imaging of the transport of charged chlorin еб conjugates in a rat orthotopic prostate tumour / M. R. Hamblin, M. Rajadhyaksha, T. Momma et al. // British Journal of Cancer. 1999 -„Vol.81, №2.-P. 261-268.

111. Hamblin, M. R. Pegylation of a Chlorin^ polymer conjugate increases tumor targeting of photosensitizer / M.R. Hamblin, J.L. Miller, I. Rizvi et al. // Canc.Res. 2001. - Vol. 61. - P. 7155-7162.

112. Hanaki, K. Semiconductor quantum dot/ albumin complex is a long-life and highly photostable endosome marker / K. Hanaki, A. Momo, T. Oku et al. // Biochem Biophys Res Commun. 2003. - Vol.302, №3. - P. 496-501.

113. Hansch, A. In vivo imaging of experimental arthritis with near-infrared fluorescence / A. Hansch, O. Frey, D. Sauner et al. // Arthritis Rheum. 2004. -Vol. 50, №3.-P. 961-967.

114. Hansch, A. Near-infrared imaging of flare-up arthritis with native fluorochrome Cy5.5 and albumin-bound Cy5.5 / A. Hansch. I. Hilger, O. Frey etal. // Journal of Experimental Animal Science. 2006. Vol. 43, № 3. - P. 129-139.

115. Hardman, R. A toxicologic review of quantum dots: toxicity depends on physicochemical and environmental factors / R. Hardman // Environmental Health Perspectives. 2006. - Vol. 114, № 2. - P. 165-172.

116. Henderson, B. W. Tissue localization of photosensitizers and the mechanism of photodynamic tissue destruction / B.W. Henderson, D.A. Bellnier // Ciba Foundation symposium. 1989. - Vol. 146. - P. 112-125.

117. Hillman, E. M. C. Optical brain imaging in vivo: techniques and applications from animal to man / E. M. C. Hillman // J Biomed Opt. 2007. - Vol.12, №5. -P. 051402.

118. Hogan, M. C. NAD(P)H fluorescence imaging of mitochondrial metabolism in contracting Xenopus skeletal muscle fibers: effect of oxygen availability / M.C. Hogan, C.M. Stary, R.S. Balaban et al. // J Appl Physiol. 2005. - Vol. 98. - P. 1420-1426.

119. Hoshino, A. Applications of T-lymphoma labeled with fluorescent quantum dots to cell tracing markers in mouse body / A. Hoshino, K. Hanaki, K. Suzuki, K. Yamamoto // Biochem Biophys Res Commun. 2004. - Vol. 314, № 1. - P. 46-53.

120. Hotz, C. Z. Quantum dots applications in biology / C.Z. Hotz, M. Bruchez.-Humana Press, 2007.- 323 p.- ISBN: 978-1-58829-562-0.

121. Hubler, M. Validation of fluorescent-labeled microspheres for measurement of relative blood flow in severely injured lungs / M. Hubler, J. E. Souders, E. D. Shade et al. // J Appl Physiol. 1999. - Vol. 87. - P.2381-2385.

122. Intes, X. Chance In vivo continuous-wave optical breast imaging enhanced with Indocyanine Green / X. Intes, J. Ripoll, Y. Chen et al. // Med. Phys. 2003. -Vol. 30, № 6. -P. 1039-1047.

123. Ivanov, A. V. One more PDT application of chlorin e6 / A.V. Ivanov, A.V. Reshetnickov, G. V. Ponomarev. Proc. SPIE. - 2000. - Vol. 3909. - P. 131-137.

124. Jackson, H. Quantum dots are phagocytized by macrophages and colocalize with experimental gliomas / H. Jackson, O. Muhammad, H. Daneshvar et al. // Neurosurgery. 2007. - Vol. 60, № 3. - P. 524-530.

125. Jacques, S. L. Laser-tissue interactions: photochemical, photothermal, and photomechanical / S.L. Jacques // Surgical Clinics. 1992. - Vol. 72. — P. 531558.

126. Jaffer, F. A. Molecular and cellular imaging of atherosclerosis / F.A. Jaffer, P. Libby, R. Weissleder // Journal of the American College of Cardiology. 2006. - Vol. 47, No. 7. - P. 1328-38.

127. Jain, R. K. Physiological barriers to delivery of monoclonal antibodies and other macromolecules in tumors / R.K. Jain // Cane. Res. 1990. - Vol. 50, №3 (suppl.). - P. 814s-819s.

128. Josefsen, L. B. Photodynamic therapy and the development of metal-based photosensitisers / L.B. Josefsen, R.W. Boyle // Metal-Based Drugs. 2008. - Vol. 2008. - 23 p.

129. Karabanovas, V. Examination of the stability of hydrophobic (CdSe)ZnS quantum dots in the digestive tract of rats / V. Karabanovas, E. Zakarevicius, A. Sukackaite et al. // Photochem. Photobiol. Sci. 2008. - Vol. 7. - P. 725 - 729.

130. Kazachkina, N. I. Pharmacokinetical study of Al- and Zn-sulphonated phthalocyanines / N.I. Kazachkina, N.N. Zharkova, G.I. Fomina et al. // Proc. SPIE. 1996. - Vol. 2924. - P. 233-249.

131. Kennedy, J. C. Endogenous protoporphyrin, a clinically useful photosensitizer for photodynamic therapy / J.C. Kennedy, R.H. Pottier // J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 1992. - Vol. 14. - P. 275-292.

132. Kessel, D. Chemical, biologic and biophysical studies on 'hematoporphyrin derivative' / D. Kessel, C.K. Chang, B. Musselman // Adv Exp Med Biol. 1985.-№ 193.-P. 213-227.

133. Kessel, D. Photodynamic therapy of neoplastic disease / D. Kessel. CRC Press, 1990. - Vol. 2. - 280 p. - ISBN: 9780849358166.

134. Kessel, D. Pharmacokinetics of N-aspartyl chlorin e6 in cancer patients / D. Kessel // J. Photochem. Photobiol. B, Biology. 1997. - Vol. 39, № 1. - P. 81-83.

135. Kim, S. Near-infrared fluorescent type II quantum dots for sentinel lymph node mapping / S. Kim , Y.T. Lim, E.G. Soltesz, A.M. De Grand et al. // Nat. Biotechnol. 2004. - Vol. 22. - P. 93-97.

136. Kimura, T. Infrared fluorescence endoscopy for the diagnosis of superficial gastric tumors / T. Kimura, N. Muguruma, S. Ito et al. // Gastrointest Endosc. -2007. Vol. 66, № 1. - P. 37-43.

137. Klohs, J. In-vivo imaging of the inflammatory receptor CD40 after cerebral ischemia using a fluorescent antibody / J. Klohs, M. Grafe, K. Graf et al. // Stroke. 2008. - Vol. 39, № 10. - P. 2845-52.

138. Kozloff, К. M. Non-invasive imaging of osteoclast activity via near-infrared cathepsin-K activatable optical probe / K.M. Kozloff, L. Quinti, C. Tung et al. // J Musculoskelet Neuronal Interact. 2006. - Vol. 6, № 4. - P. 353

139. Kozloff, К. M. Noninvasive optical detection of bone mineral / K.M Kozloff, R. Weissleder, U. Mahmood // J. Bone Mineral Res. 2007. - Vol. 22. -P. 1208-1216.

140. Kozloff, K. Non-invasive optical detection of cathepsin K-mediated fluorescence reveals osteoclast activity in vitro and in vivo / K. Kozloff, L. Quinti, S. Patntirapong et al. // Bone. 2009. - Vol. 44, № 2. - P. 190-198.

141. Kristiansson, S. Kinetics of protoporphyrin IX formation in rat oral mucosa and skin after application of 5-aminolevulinic acid and its methylester / S. Kristiansson, A. Juzeniene, P. Juzenas et al. // Photochem. Photobiol. 2005. -Vol. 81.-P. 394-397.

142. Kuebler, W. M. How NCR is the future in blood flow monitoring? / W. M. Kuebler // J Appl Physiol. 2008. - Vol. 104. - P. 905-906.

143. Kusaka, T. Estimation of regional cerebral blood flow distribution in infants by near-infrared topography using indocyanine green / T. Kusaka, K. Isobe, K. Nagano et al. // Neurolmage. 2001. - Vol. 13. - P. 944-952.

144. Larson, D. R. Water-Soluble quantum dots for multiphoton fluorescence ilmaging in vivo / D.R. Larson, W.R. Zipfel, R.M. Williams et al. Science. -2003. - Vol. 300. - P. 1434-1436.

145. Lidke, D.S. Quantum dot ligands provide new insights into erbB/HER receptor-mediated signal transduction / D.S. Lidke , P. Nagy , R. Heintzmann et al. // Nat Biotechnol.- 2004. Vol.22, №2. - P. 198-203.

146. Lim, Y.T. Selection of quantum dot wavelengths for biomedical assays and imaging / Y.T. Lim, A. Nakayama, N.E. Stott et al. // Mol Imaging. 2003. -Vol. 2.-P. 50-64.

147. Lipson, R. L. The use of a derivative of hematoporphyrin in tumor detection / R.L. Lipson, E.J. Baldes, A.M. Olsen // J Null Cancer Inst. 1961. - Vol. 26. - P. 1-11.

148. Liu, W. Compact cysteine-coated CdSe(ZnCdS) QDs for in vivo applications / W. Liu, H.S. Choi, J. P. Zimmer et al. // J Am Chem Soc. 2007. - Vol. 129, № 47.-P. 14530-14531.

149. Loschenov, V. В. Photodynamic therapy and fluorescence diagnostics / V.B. Loschenov, V.I. Konov, A.M. Prokhorov // Laser Physics. — 2000. — V. 10, № 6. — P. 1188-1207.

150. Lovri, J. Differences in subcellular distribution and toxicity of green and red emitting CdTe quantum dots / J. Lovri, H.S. Bazzi, Y. Cuie et al. //J. Mol. Med. -2005. Vol. 83, № 5. - P. 377-385.4/

151. Luksiene, Z. First studies on preclinical ALA-based photodynamic therapy of cancer / Z. Luksiene, L. Griciute, R. Gadonas et al. // Acta medica Lituanica. — 2002. Vol. 9, № 3. - P. 190-194.

152. Lukyanets, E. A. Phthalocyanines as photosensitizers in the photodynamic therapy of cancer / E.A. Lukyanets // J. Porphyrins Phthalocyanines. 1999. - №3. -P. 424-432.

153. Mahmood, U. Near-Infrared Optical Imaging of Proteases in Cancer / U. Mahmood, R. Weissleder // Molecular Cancer Therapeutics. 2003. - Vol. 2. - P. 489-496.

154. Massoud, T. F. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light / T.F. Massoud, S.S. Gambhir // Genes & Development. 2003. - Vol. 17. - P. 545-580.

155. Masumoto, K. Tissue distribution of a new photosensitizer ATX-SlONa(II) and effect of a diode laser (670 nm) in photodynamic therapy / K. Masumoto, I. Yamada, H. Tanaka et al. // Lasers Med Sci. 2003. - Vol. 18. - P. 134-138.

156. Mayevsky, A. A. Mitochondrial function in vivo evaluated by NADH fluorescence: from animal models to human studies / A.A. Mayevsky, G.G. Rogatsky // Am J Physiol Cell Physiol. 2007. - Vol. 292. - P. 615-640.

157. McNichols, R.J. Simultaneous optical and nuclear magnetic resonance spectroscopy for monitoring cardiac energetics in vivo / R.J. McNichols, G.L. Cote, J.S. Wasser, S.M. Wright // Biomedical Engineering. 2000. - Vol. 47, № 9. -P. 1261-1265.

158. Messmann, H. Fluorescence endoscopy and photodynamic therapy / H. Messmann, E. Endlicher, C.M. Gelbmann, J. Scholmerich // Dig Liver Dis.- 2002. -Vol. 34, № 10.-P. 754-761.

159. Michalet, X. Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics / X. Michalet, F. F. Pinaud, L. A. Bentolila et al. // Science. 2005. - Vol. 307, № 5709.-P. 538-544.

160. Misgeld, T. In vivo imaging of the diseased nervous system / T. Misgeld, M. Kerschensteiner // Nature Reviews Neuroscience. 2006. - V. 7.- 449-463.

161. Moan, J. Photodynamic effects on human cells exposed to light in the presence of hematoporphyrin. pH effects / J. Moan, L. Smedshammer, T. Christensen // Cancer Lett. 1980. - Vol. 9. - P. 327-332.

162. Montet, X. Tomographic fluorescence mapping of tumor targets / X. Montet, V. Ntziachristos, J. Grimm, R. Weissleder // Cancer Res. 2005. - Vol. 65, № 14. -P. 6330-6336.

163. Moser, J.G. Photodynamic tumor therapy. 2nd and 3rd generation photosensitizers / J.G. Moser. Harwood academic Publishers, 1998. — 242 p. -ISBN 90-5699-139-6

164. Noodt, В. В. Different apoptotic pathways are induced from various intracellular sites by tetraphenylporphyrins and light / B.B. Noodt, K. Berg, T. Stokke et al. //Br. J. Cane.- 1999. Vol. 79. - P. 72-81.

165. Nowis, D. Direct tumor damage mechanisms of photodynamic therapy / D. Nowis, M. Makowski, T. Stoklosa et al. // Acta biochimica Polonica. 2005. -Vol. 52, № 2. - P. 339-352.

166. Ntziachristos, V. Experimental three-dimensional fluorescence reconstruction of diffuse media by use of a normalized Born approximation / V. Ntziachristos, R. Weissleder // Opt Lett. 2001. - Vol. 26, No. 12. - P. 893-895.

167. Ntziachristos, V. Would near-infrared fluorescence signals propagate through large human organs for clinical studies? / V. Ntziachristos, J. Ripoll, R. Weissleder // Optics Lett. 2002. - Vol. 27. - P. 333-335.

168. Ntziachristos, V. Fluorescence molecular tomography resolves protease activity in vivo / V. Ntziachristos, C.H. Tung, C. Bremer, R. Weissleder // Nat. Med. 2002. - Vol. 8, № 7. - P. 757-760.

169. Ntziachristos, V. Visualization of antitumor treatment by means of fluorescence molecular tomography with an annexin V-Cy5.5 conjugate / V. Ntziachristos, E.A. Schellenberger, J. Ripoll et al. // PNAS. 2004. - Vol. 101, №33.-P. 12294-99.

170. Ntziachristos, V. Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging / V. Ntziachristos, J. Ripoll, L.V. Wang, R. Wesslender // Nat. Biotechnol. 2005. - Vol. 23. - P. 313-320.

171. Ntziachristos, V. Planar fluorescence imaging using normalized data / V. Ntziachristos, G. Turner, J. Dunham et al. // J. Biomed. Opt. 2005. - Vol. 10. -064007.

172. Ntziachristos, V. Optical imaging of molecular signatures in pulmonary inflammation / V. Ntziachristos // Proc Am Thorac Soc. 2009. - V. 6. - P. 416418.

173. Ortel, В. Differentiation-specific increase in ALA-induced protoporphyrin IX accumulation in primary mouse keratinocytes / B. Ortel, N. Chen, J. Brissette et al. // Br J Cancer. 1998. - Vol. 77. - P. 1744-1751.

174. Oseroff, A. R. Intramitochondrial dyes allow selective in vitro photolysis of carcinoma cells / A.R. Oseroff, D. Ohuoha, G. Ara et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. - Vol. 83. - P. 9729-9733.

175. Pal, G. Time-resolved optical tomography using short-pulse laser for tumor detection / G. Pal, S. Basu, K. Mitra, T. Vo-Dinh // Appl. Opt. 2006. - Vol. 45, No. 24.-P. 6270-6282.

176. Patrice, T. Photodynamic Therapy / T. Patrice. Great Britain: Royal Society of Chemistry, 2004. - 284 p.

177. Patterson, G. Fluorescent protein spectra / G. Patterson, R. N. Day, D. Piston // Journal of Cell Science. 2001. - Vol. 114. - P. 837-838.

178. Peng, Q. 5-aminolevulinic acid-based photodynamic therapy: principles and experimental research / Q. Peng, K. Berg, J. Moan et al. // J. Photochem. Photobiol. 1997. - Vol. 65. - P. 235-251.

179. Perotti, C. ALA and ALA hexyl ester induction of porphyrins after their systemic administration to tumour bearing mice / C. Perotti, A. Casas, H. Fukuda et al. // British Journal of Cancer. 2002. - № 87. - P. 790 - 795.

180. Pottier, R. H. Photodynamic therapy with ALA / R.H. Pottier, B. Krammer, R. Baumgartner, H. Stepp. Great Britain: RSC publishing, 2006. - 276 p.

181. Puliafito, C. A. Ocular Photodynamic therapy / C.A. Puliafito, A.H. Rogers, A. Martidis, P.B. Greenberg. Slack Inc., NJ. - 2001. - 160 p. - ISBN 1556424906.

182. Rao, J. Fluorescence imaging in vivo: recent advances / J. Rao, A. Dragulescu-Andrasi, H. Yao // Current Opinion in Biotechnology. 2007. - Vol. 18. -P.17-25.

183. Renaud, G. Hepatic metabolism of colloidal gold-low-density lipoprotein complexes in the rat: evidence for bulk excretion of lysosomal contents into bile / G. Renaud , R.L. Hamilton, R.J. Havel // Hepatology. 1989. - Vol. 9, №3. - P. 380-92.

184. Reshetnickov, A.V. Novel drug form of chlorin e6 / A.V. Reshetnickov, G.V. Ponomarev, O.Y. Abakumova et al. // Proc. SPIE. 2000. - Vol. 3909. -P.124-130.

185. Richards-Kortum, R. Quantitative optical spectroscopy for tissue diagnosis / R. Richards-Kortum, E. Sevick-Muraca // Annu Rev Phys Chem. 1996. - Vol. 47.-P. 555-606.

186. Robe, A. Quantum dots in axillary lymph node mapping: Biodistribution study in healthy mice / A. Robe, E. Pic, H. Lassalle et al. // BMC Cancer. 2008. -Vol. 8.-P. 111.

187. Roy, D. 3D Cryo-Imaging: a very high-resolution view of the whole mouse / D. Roy, GJ. Steyer, M. Gargesha et al. // The Anatomical record. 2009. -Vol. 292, №3.-P. 342-351.

188. Sadauskas, E. Kupffer cells are central in the removal of nanoparticles from the organism / E. Sadauskas, H. Wallin, M. Stoltenberg et al. // Particle and Fibre Toxicology. 2007. - Vol. 4, № 10. - 7 p.

189. Sharma, R. Quantitative imaging of lymph function / R. Sharma, W. Wang, J. C. Rasmussen et al. // Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2007. - Vol. 292. -P. H3109-H3118.

190. Schipper, M. L. MicroPET-based bio distribution of quantum dots in living mice / M.L. Schipper, Z. Cheng, S.-W. Leel et al. // J. Nucl. Med. 2007. - Vol. 48, No. 9. - P. 1511-1518.

191. Schipper, M. L. Particle size, surface coating, and PEGylation influence the biodistribution of quantum dots in living mice / M.L. Schipper, G. Iyer, A. L. Koh et al. // Small. -2009. Vol. 5, No. 1. - P. 126-134.

192. Schulman, S. G. Molecular luminescence spectroscopy: methods and applications / S.G. Schulman. John Wiley & Sons, 1985. - 848 p. - ISBN: 0471868485.

193. Smith, A.M. Quantum dot nanocrystals for in vivo molecular and cellular imaging / A.M. Smith, X. Gao, S. Nie // Photochem. Photobiol. 2004. - Vol. 80. -P. 377-385.

194. Soltesz, E. G. Intraoperative sentinel lymph node mapping of the lung using near-infrared fluorescent quantum dots / E.G. Soltesz, S. Kim, R.G. Laurence et al. // Ann Thorac Surg. 2005. - Vol. 79. - P. 269-277.

195. Song, E. Tumor cell targeting using folate-conjugated fluorescent quantum dots and receptor-mediated endocytosis / E. Song, Z. Zhang, Q. Luo et al. // Clinical Chemistry. 2009. - Vol. 55. - P. 955-963.

196. Soubret, A. Fluorescence molecular tomography in the presence of background fluorescence / A. Soubret, V. Ntziachristos // Phys. Med. Biol. 2006. -Vol. 51.-P. 3983-4001.

197. Sroka, R. Pharmacokinetics of 5-aminolevulinic-acid-induced porphyrins in tumour-bearing mice / R. Sroka, W. Beyer, L. Gossner et al. // J. Photochem. Photobiol. B: Biology. 1996. - Vol. 34. - P. 13-19.

198. Steinbrink, J. Towards noninvasive molecular fluorescence imaging of the human brain / J. Steinbrink, A. Villringer, A. Liebert et al. // Neurodegen Dis. — 2008. Vol. 5, №5. - P. 296-303.

199. Steyer, G. J. Cryo-Imaging of fluorescently-labeled single cells in a mouse / G J. Steyer, D. Roy, O. Salvado et al. // Proc Soc Photo Opt Instrum Eng. 2009.- Vol. 7262. P. 72620W-72620W8.

200. Theer, P. Two-photon imaging to a depth of 1000 jim in living'brains by use of a Ti:A1203 regenerative amplifier / P. Theer, M.T. Hasan, W. Denk // Opt Lett.- 2003. Vol. 28. - P. 1022-1024.

201. Thomas, J. P. Glucose administration augments in vivo uptake and phototoxicity of tumor localizing fraction of hematoporphyrin derivative / J.P. Thomas, A.W. Girotti // Photochem. Photobiol. 1989. - Vol. 49. - P. 24Г- 247.

202. Tuchin, V. V. Tissue Optics: Light Scattering Methods and Instruments for Medical Diagnosis / V.V. Tuchin. SPIE Press, 2007. - 882 p. - ISBN: 9780819464330.

203. Tung, C.H. In Vivo imaging of p-galactosidase activity using far red fluorescent switch / C.H. Tung, Q. Zeng, K. Shah et al. // Cane. Res. 2004. -Vol. 64.-P. 1579-1583.

204. Turchin, I. V. Imaging of QDs-labeled tumors in small animals by fluorescence diffuse tomography / I.V. Turchin, I.V. Balalaeva, R.B. Vasil'ev et al. // Las. Phys. Lett.- 2006. Vol. 3, № 4. - P. 208-211.

205. Turchin, I. V. Fluorescence diffuse tomography of small animals with DsRed2 fluorescent protein / I.V. Turchin, V.I. Plehanov, A.G. Orlova et al. // Las. Phys.-2006.-Vol. 16, № 5. P. 741-746.

206. Turchin, I. V. Fluorescence diffuse tomography for detection of red fluorescent protein expressed tumors in small animals / I.V. Turchin, V.A. Kamensky, V.I. Plehanov et al. // J. Biomed. Opt. 2008. - Vol. 13, № 041310.

207. Upadhyay, R. Quantitative real-time catheter-based fluorescence molecular imaging in mice / R. Upadhyay, R.A. Sheth, R. Weissleder, U. Mahmood // Radiology. 2007. - Vol. 245, № 2. - P. 523-531.

208. Varghese, H. J. Mapping of the functional microcirculation in vital organs using contrast-enhanced in vivo video microscopy / H.J. Varghese, L.T. MacKenzie, A.C. Groom et al. // Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2005. — Vol. 288. - P.H185-H193.

209. Vasiliev, R.B. Synthesis and optical properties of PbSe and CdSe colloidal quantum dots capped with oleic acid / R.B. Vasiliev, S.G. Dorofeev, D.N. Dirin, et al. // Mendeleev Commun. 2004. - № 4.- P. 169-171.

210. Venosa, G.D. Distribution of 5-aminolevulinic acid derivatives and induced porphyrin kinetics in mice tissues / G.D. Venosa, A. Batlle, H. Fukuda, et. al. // Cancer Chemother Pharmacol. 2006. - Vol. 58. - P. 478-486.

211. Vo-Dinh, T. Biomedical Photonics Handbook / T. Vo-Dinh. CRC Press, 2003. - 1872 p. -ISBN: 9780849311161.

212. Wagnieres, G. In vivo fluorescence spectroscopy and imaging for oncological applications / G. Wagnieres, W. Star, B. Wilson // Photochemistry and Photobiology. 1998. - Vol.68, №5. -P.603-632.

213. Walther, S. M. Pulmonary blood flow distribution has a hilar-to-peripheral gradient in awake, prone sheep / S. M. Walther, К. B. Domino, R. W. Glenny, et al. // J Appl Physiol. 1997. - Vol. 82. - P.678-685.

214. Weissleder, R. In vivo imaging of tumors with protease activated near-infrared fluorescent probes / R. Weissleder, C. Tung, U. Mahmood, A. Bogdanov Jr. // Nat. Biotech. 1999. - Vol. 17. - P. 375-378.

215. Wilson В. С. The physics, biophysics and technology of photodynamic therapy / B.C. Wilson, M.S. Patterson // Phys. Med. Biol. 2008.- Vol. 53. - P. R61-R109.

216. Wilson, D. Whole mouse cryo-imaging / D. Wilson, D. Roy, G.Steyer et al. //Proc. SPIE. 2008. - Vol. 6916. - P. 69161I-69161I-9.

217. Windisch, H. Fluorescence monitoring of rapid changes in membrane potential in heart muscle // H. Windisch, W. Muller, H.A. Tritthart // Biophysical Journal. 1985. - Vol. 48, № 6. - P. 877-884.

218. Wohrle, D. Photodynamic therapy of cancer: second and third generations of photosensitizers / D. Wohrle, A. Hirth, T. Bogdahn-Rai et al. // Russian Chemical Bulletin. 1998.- Vol. 47, No. 5.- P. 807-816.

219. Wunder, A. In vivo imaging of protease activity in arthritis: a novel approach for monitoring treatment response / A. Wunder, C.H. Tung, U. Muller-Ladner et. al. // Arthritis Rheum. 2004. - Vol. 50, № 8. - P. 2459-65.

220. Wunder, A. Optical imaging of vascular pathophysiology / A. Wunder, J. Klohs // Basic Res Cardiol. 2008. - Vol. 103. - P. 182-190.

221. Yang, L. Single chain epidermal growth factor receptor antibody conjugated nanoparticles for in vivo tumor targeting and imaging / L. Yang, H. Mao, Y. A. Wang et al. // Small. 2009. - Vol. 5, No. 2. - P.235-243.

222. Yang, M. Dual-color fluorescence imaging distinguishes tumor cells from induced host angiogenic vessels and stromal cells / M. Yang, L. Li, P. Jiang et al. //PNAS.-2003.-Vol. 100, №24.-P. 14259-14262.

223. Yang, R. S. H. Persistent tissue kinetics and redistribution of nanoparticles, quantum dot 705, in mice: ICP-MS quantitative assessment / S.H. R. Yang, L.W. Chang, J. Wu et al. // Env. Health Persp. 2007. -Vol. 115, № 9. - P. 1339-1343.

224. Yu, W. W. Water-soluble quantum dots for biomedical applications / W.W. Yu, E. Chang, R. Drezek, V.L. Colvin // Biochem Biophys Res Commun. 2006. -Vol. 348.-P. 781-786.

225. Zacharakis, G. Volumetric tomography of fluorescent proteins through small animals in vivo / G. Zacharakis, H. Kambara, H. Shih et al. // PNAS. 2005. -Vol. 102, №51.-P. 18252-57.

226. Zhang, Y. Subcellular localization of thiol-capped CdTe quantum dots in living cells / Y. Zhang, L. Mi, R. Xiong et al. // Nanoscale Res. Lett. 2009. -Vol. 4, №7.-P. 1931-7573.

Информация о работе

Ширманова, Марина Вадимовна
кандидата биологических наук
Нижний Новгород, 2009
ВАК 03.00.13

Диссертация

Прижизненное исследование экзогенной флуоресценции тканей животных методом диффузионной флуоресцентной томографии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы