Разработка подходов к созданию лекарственных форм антибиотиков на основе полимерных наночастиц

Гельперина, Светлана Эммануиловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка подходов к созданию лекарственных форм антибиотиков на основе полимерных наночастиц
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка подходов к созданию лекарственных форм антибиотиков на основе полимерных наночастиц"

На правах рукописи Гельперина Светлана Эммануиловна у?

004600783

РАЗРАБОТКА ПОДХОДОВ К СОЗДАНИЮ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ АНТИБИОТИКОВ НА ОСНОВЕ ПОЛИМЕРНЫХ НАНОЧАСТИЦ

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва - 2010

1 5 ДПР 2010

004600783

Работа выполнена в Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова, научно-исследовательской лаборатории ООО «НПК «Наносистема» и Институте молекулярной медицины Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова.

Научный консультант: доктор химических наук, профессор,

академик РАМН Швец Виталий Иванович

Официальные оппоненты: академик РАН и РАМН, доктор биологических наук,

профессор Ткачук Всеволод Арсеньевич

член-корр. РАН, доктор химических наук, профессор Костров Сергей Викторович

доктор химических наук, профессор Штильман Михаил Исаакович

Ведущая организация: Институт по изысканию новых антибиотиков

им. Г.Ф. Гаузе РАМН

Защита диссертации состоится ир апреля 2010 г в 15 часов на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр. Вернадского, д. 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова.

С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте ВАК РФ: ЬНр//уак.е(1.gov.ru

Автореферат разослан « № » .Ш^гГ^ 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета

кандидат химических наук,

старший научный сотрудник / /

у! Лютик А.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Современная фармакотерапия располагает арсеналом мощных лекарственных средств, однако результаты лечения часто остаются неудовлетворительными. Среди факторов, снижающих эффективность лекарственных веществ (ЛВ), следует отметить неблагоприятное биораспределение, которое может быть обусловлено трудностями при проникновении в очаг патологии. Причинами этого могут быть затрудненный доступ в орган-мишень из-за структурных особенностей тканей (например, из-за наличия гастогематических барьеров) или недостаточный внутриклеточный транспорт ввиду физико-химических свойств ЛВ. Тривиальным способом преодолеть эти препятствия и повысить эффективность лечения является увеличение дозы ЛВ. При этом терапевтический эффект часто достигается ценой повышения неспецифической токсичности. Проблема приобретает особую остроту в случае сильнодействующих ЛВ, таких как, например, противоопухолевые агенты и антибиотики, применение которых сопряжено с побочными эффектами, выраженными настолько, что они значительно снижают терапевтическую ценность этих препаратов. Актуальность этой проблемы послужила стимулом для разработки подходов к созданию разнообразных систем направленной доставки ЛВ. Особый интерес среди таких систем представляют полимерные наночастицы (НЧ), то есть частицы размером от 10 до 1000 нм, сочетающие такие важные для носителей качества, как стабильность и высокая емкость в отношении широкого спектра ЛВ.

К настоящему времени можно считать доказанным, что включение в НЧ может существенно изменять профиль распределения ЛВ в организме, и накоплен значительный опыт по разработке и исследованию наносомальных форм различных ЛВ. Однако некоторые аспекты этой технологии изучены недостаточно. Так, несмотря на очевидную целесообразность использования НЧ для доставки антибиотиков, систематические исследования в этой области не проводились. Транспорт НЧ через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) к началу данного исследования также оставался практически неизученным.

Дель работы состояла в выявлении закономерностей, определяющих способность полимерных НЧ влиять на фармакологическое действие различных антибиотиков. В частности, представлялось необходимым изучить влияние состава наносомальных форм на параметры биораспределения антибиотиков. Преодоление ГЭБ является важнейшей проблемой химиотерапии; в связи с этим одна из наиболее существенных задач состояла в изучении возможности использования полибутилцианоакрилатных (ПБЦА) НЧ для доставки

противоопухолевого антибиотика доксорубицина через ГЭБ в мозг и оценке эффективности наносомальной формы доксорубицина на модели интракраниальной глиобластомы. Наконец, для достижения цели исследования необходимо было изучить влияние наносомальной формы на активность антибактериальных антибиотиков в отношении экспериментальных инфекций, в том числе туберкулеза.

Научная новизна

1. Впервые выявлены закономерности, позволяющие осуществить направленный транспорт антибиотиков, связанных с полимерными наночастицами, через гематоэнцефалический барьер.

2. Разработана технология получения наносомальной формы доксорубицина на основе ПБЦА НЧ. Изучено влияние условий полимеризации на свойства наночастиц. Изучено влияние состава наночастиц на биораспределение и противоопухолевый эффект доксорубицина.

3. Показано, что модификация ПБЦА НЧ полисорбатом 80, позволяет доставить в мозг терапевтически эффективные концентрации доксорубицина при внутривенном введении. При этом связанный с наночастицами доксорубицин после внутривенного введения проникает в мозг так, как если бы он не был защищен ГЭБ.

4. Показано, что наносомальная форма доксорубицина оказывает выраженное противоопухолевое действие на интракраниальную глиобластому у крыс, тогда как его стандартная лекарственная форма малоэффективна. Выявлено влияние состава наночастиц на фармакологический эффект.

5. На примере доксорубицина и лоперамида показано, что модификация ПБЦА НЧ полоксамером 188 (Pluronic® F68) позволяет при внутривенном введении доставить в мозг терапевтически эффективные концентрации JIB, не способных преодолеть ГЭБ в свободном виде.

6. Впервые изучена сорбция белков плазмы на поверхности ПБЦА НЧ, нагруженных доксорубицином и модифицированных полоксамером 188 или полисорбатом 80, и найдена корреляция между профилями сорбции белков и фармакологическим эффектом наносомальных форм. Предложен новый механизм транспорта НЧ через ГЭБ, основанный на взаимодействии аполипо-протеина A-I, найденного на поверхности НЧ, со скавенджер-рецептором SR-BI, экспрессируемым эндотелиальными клетками капилляров мозга.

7. Показано, что наносомальная форма доксорубицина на основе ПБЦА НЧ обладает радиационной устойчивостью, то есть может быть стерилизована радиационными методами.

8. Разработана технология получения наносомальных формы антибактериальных антибиотиков - рифампицина, моксифлоксацина и стрептомицина. На примере наносомальных форм рифампицина изучено влияние структуры полимера на кинетику выделения ЛВ из наночастиц.

9. Впервые изучено влияние модификации наночастиц поверхностно-активными веществами (ПАВ) на фармакокинетику рифампицина и его распределение по органам. Показано, что влияние ПАВ на распределение наночастиц зависит от типа полимера.

10. Показана возможность снижения терапевтических доз рифампицина и моксифлоксацина при лечении экспериментального туберкулеза путем создания наносомальных форм этих антибиотиков.

11. Показана высокая эффективность наносомальных форм антибиотиков различных классов - рифампицина и стрептомицина - при лечении острых бактериальных инфекций.

12. Предложен и реализован на примере наносомальной формы лоперамида и паклитаксела в ПБЦА НЧ подход, позволяющий значительно повысить содержание в водной фазе нерастворимых в воде субстанций.

Практическая значимость

1. Показано, что, в отличие от стандартной лекарственной формы доксорубицина, его наносомальная форма на основе ПБЦА НЧ, модифицированных полисорбатом 80, проявляет высокий противоопухолевый эффект в отношении высоко злокачественной интракраниапьной глиобластомы. Этот результат позволяет расширить спектр действия доксорубицина и наряду с установленной более низкой кардиотоксичностью наносомальной формы свидетельствует о перспективности этой формы для лечения опухолей мозга.

2. Дня наносомальных форм рифампицина и моксифлоксацина показана возможность снижения терапевтических доз по сравнению со стандартными лекарственными формами при лечении экспериментального туберкулеза.

3. Для наносомальных форм стрептомицина и рифампицина показана возможность снижения терапевтических доз по сравнению со стандартными лекарственными формами при лечении острых бактериальных инфекций.

4. Применение ПБЦА наночастиц. позволит создавать парентеральные формы для нерастворимых субстанций.

5. Создана технология, практическая ценность которой определяется возможностью создавать наносомальные формы на основе носителей, сочетающих селективность, безопасность и емкость, а также использованием

фармацевтических ингредиентов и мягкими условиями получения, позволяющими сохранять структуру биологически активных веществ.

Основные положения, выносимые на защиту :

1. Создана технология, позволяющая с помощью полимерных наночастиц достичь в головном мозге терапевтически значимых концентраций доксорубицина и реализовать его противоопухолевый эффект в отношении интракраниальной опухоли.

2. Разработаны и применены подходы, позволяющие с помощью полимерных наночастиц усиливать фармакологическое действие антибактериальных антибиотиков различных классов за счет повышения их концентрации в органах-мишенях. При этом параметры биораспределения можно в определенной степени регулировать путем изменения состава наночастиц.

Личный вклад автора. Автору принадлежит решающая роль на всех этапах исследования - от постановки задачи, планирования и проведения ключевых экспериментов до обсуждения и литературного оформления полученных результатов.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на Российском Национальном конгрессе «Человек и лекарство» (1996, 1997, 1998, 2000, 2004; Москва), Международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развитая" (2005, 2006, 2009; Москва), VIII Съезде фтизиатров России (2007, Москва), III Международной конференции по коллоидной химии и физико-химической механике (2008, Москва), XX симпозиуме «Современная химическая физика» (2008, Туапсе), Роснанофоруме (2008, Москва), Gordon Research Conference (2002, Tilton, U.S.), Nano Science and Technology Institute (NSTI) BioNanoConference (2006, Boston, U.S.), 5th Conference on Formulation Technology (2007, Potsdam, Germany), World Meetings of Pharmaceutics & Biopharmaceutics (1998, 2000, 2002, 2004, 2006, 2008), Annual Meetings of Controlled Release Society (2000, 2001, 2002, 2004, 2006-2008), International Symposium on Microencapsulation (2005), 6th Congress of the Global College of Neuroprotection & Neuroregeneration / 5th Congress of the Society for the Study of Neuroprotection and Neuroplasticity (2009, Vienna, Austria).

Обьем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 302 страницах машинописного текста, содержит 133 рисунка, 43 таблицы и состоит из введения, литературного обзора, изложения и обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы (225 наименований).

Публикации» По теме диссертации опубликовано 2 главы в монографиях, 2 патента, 29 оригинальных статей, в том числе 16 в зарубежной печати, более 40 тезисов докладов на российских и международных конференциях.

Работа выполнена при участии НИИ морфологии человека РАМН (Москва), НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе РАМН (Москва), ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии (Оболенск), Всероссийского научного центра молекулярной диагностики и лечения, Еврейского медицинского и исследовательского центра (Денвер, США) и Института фармацевтической технологии Университета им. Гёте (Франкфурт-на-Майне, Германия).

Работа является частью научных исследований, проводимых на кафедре биотехнологии и бионанотехнологии МИТХТ им. М.В. Ломоносова по госконтракту с Роснаукой № 02.512.11.2328 «Разработка субмикронных носителей и новых лекарственных форм биологически активных субстанций таргетного действия для терапии распространенных болезней человека (онкология, внутриклеточные инфекции)» в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы».

Работа выполнена при поддержке гранта №2440 по программе БиоПромышленная Инициатива (BII) Государственного Департамента США, грантов INTAS № 94-310 и 00-838 и грантов Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. РАЗРАБОТКА И ИССЛЕДОВАНИЕ НАНОСОМАЛЬНОЙ ФОРМЫ

ДОКСОРУБИЦИНА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГЛИОБЛАСТОМЫ

Как отмечалось во введении, причиной неэффективного проникновения ЛВ в орган-мишень могут быть гистогематические барьеры. В частности, мозг является одним из наименее доступных объектов для фармакотерапии из-за наличия ГЭБ. Применяемые в настоящее время способы доставки ЛВ в мозг, в том числе интрацеребральное введение, а также повышение проницаемости ГЭБ с помощью гиперосмотических растворов или вазоактивных веществ, часто не дают желаемых результатов и сопряжены с большим риском для пациента.

Ранее путем фармакологических тестов было показано, что включение ряда веществ, не способных преодолевать ГЭБ (в том числе даларгин, киоторфин и тубокурарин) в ПБЦА НЧ, поверхность которых модифицирована нолисорбатом 80 (Твин® 80, полиоксиэтилен (20) сорбитан моноолеат), приводит к их воздействию на центральную нервную систему (ЦНС). Эти

результаты послужили основанием для создания концепции о том, что НЧ могут служить средством доставки JIB в мозг. Однако практическая значимость этой концепции для терапии заболеваний ЦНС, а также ее важнейшие аспекты, такие как количественные параметры биораспределения, токсикологические особенности наносомальных форм и механизм доставки в мозг оставались неопределенными.

Соответственно, целью настоящего исследования являлось изучение возможности применения ПБЦА НЧ для доставки в мозг цитостатиков и определение потенциала таких наносомальных форм для лечения глиобластомы - одного из наиболее тяжелых заболеваний ЦНС. С точки зрения безопасности для парентерального введения благоприятными свойствами ПБЦА являются низкие молекулярные массы, способствующие быстрому выводу полимера из организма, а также быстрая биодеградация до нетоксичных метаболитов — полицианоакриловой кислоты и бутанола.

В качестве модельного препарата для исследования выбрали противоопухолевый антибиотик доксорубицин [(88-цис)-10-(3-амино-2,3,6-тридезокси-а-Ь-ликсо-гексопиранозил)окси-7,8,9,10-тетра-гидро-6,8,11-тригид-рокси-8-(гидроксилацетил)-1-метокси-5,12-нафтацендион], который не применяется для лечения опухолей мозга, поскольку практически не проникает через ГЭБ при внутривенном введении. Технологическими достоинствами доксо-рубицина для целей данного исследования является амфифильный характер, предопределяющий возможность сорбции наночастицами, а также установленная нами устойчивость в условиях образования НЧ и флуоресцентные свойства, обусловливающие возможность определения антибиотика in vitro и in vivo, используя стандартные методы.

В задачи настоящего исследования входили: 1) разработка наносомальной формы доксорубицина на основе ПБЦА НЧ; 2) изучение влияния состава наносомальной формы на ее биологические свойства, в том числе биораспределение, противоопухолевую активность при лечении экспериментальной глиобластомы у крыс и токсичность; 3) изучение механизма доставки в мозг с помощью наночастиц.

1.1. Разработка наносомальной формы доксорубицина на основе ПБЦА. ПБЦА НЧ, нагруженные доксорубицином (Докс-ПБЦА), получали методом полимеризации 2-п-бутилцианоакрилата в кислой водной среде в присутствии стабилизаторов (Рис. 1). С целью оптимизации процесса получения было изучено влияние рН полимеризационной среды (в пределах рН = 1-^3), концентрации Доке (0,1 + 0,25%) и времени введения его в реакцию (через 0

или 40 мин после начала полимеризации), концентрации мономера (0,5-ь2%), а также концентрации и типа стабилизатора (декстран или полоксамер 188) на основные параметры - размеры НЧ, эффективность сорбции Доке и устойчивость при лиофилизации. В качестве криопротектора использовали D-маннит.

Показано, что наиболее заметное влияние на эффективность сорбции оказали тип стабилизатора и рН среды. Устойчивая наносуспензия с высоким выходом ПБЦА образовывалась при введении Доке в полимеризационную среду через 40 мин после начала мономера. Наибольшая степень сорбции Доке — 71% и наибольшая нагрузка его на полимер — 0,33 мг Докс/мг ПБЦА достигаются при следующих условиях: рН2, концентрация Доке 0,25%, концентрация мономера 1%, стабилизатор - декстран (1%). Размеры НЧ, определенные методами трансмиссионной электронной микроскопии и фотонной корреляционной спектроскопии, составляли 200 - 250 нм.

Кинетика выделения доксорубицина из НЧ в водной среде при 37°С имеет двухфазный характер. Быстрое выделение Доке в начале эксперимента (50% в течение 30 мин) и последующая фаза медленного выделения предполагает, что антибиотик адсорбирован как на поверхности, так и внутри частиц.

1.2. Биораспределение наносомальной формы доксорубицина.

1.2.1. Биораспределение доксорубицина в составе наносомальной формы. Для обоснования возможности использования Доке, включенного в ПБЦА НЧ, модифицированные полисорбатом 80 (Докс-ПБЦА+Пс), при лечении опухолей мозга необходимо было, прежде всего, установить, доставляют ли НЧ в мозг терапевтически значимые концентрации этого антибиотика. Контрольным группам вводили растворы Доке в воде (Доке) или в 1% растворе полисорбата 80 (Докс+Пс), а также НЧ с немодифицированной поверхностью (Докс-ПБЦА). Препараты вводили в хвостовую вену здоровых крыс однократно в дозе 5 мг/кг.

Показано, что включение Доке в НЧ приводит к существенному изменению его фармакокинетики. В начальной фазе распределения (10 мин - 1 ч) уровень концентраций Докс-ПБЦА в крови был в 1,4-2 раза ниже уровня свободного антибиотика (Рис. 2). Докс-ПБЦА задерживается в организме крыс

Рис. 1. Реакция полимеризации 2-п-бутилцианоакрилата

дольше, чем свободный: константы периода полувыведения (Тщр) и среднего времени удерживания (МЯТ) увеличиваются в 3,5 и 4 раза, соответственно, по сравнению с Доке, что свидетельствует о значительном накоплении антибиотика в тканях. Для Докс-ПБЦА отмечено также характерное для НЧ повышение концентраций в печени.

А Б

Рис. 2. Концентрации различных форм доксорубицина в плазме (А) и печени (Б) крыс (п = 6)

Рис. 3. Концентрации различных форм доксорубицина в сердце крыс

Рис. 4. Концентрации ПБЦА+Пс, в головном здоровых крыс

Влияние полисорбата на фармакокинетические параметры наносомальной формы Докс-ПБЦА+Пс проявилось в снижении клиренса на 30% по срав-нению с Докс-ПБЦА; при этом интегральный показатель А1ГС возрос примерно в 1,5

раза, а показатели Тшр и MRT снизились на -30%. Кроме того, несколько уменьшилось накопление Доке в органах РЭС - печени, селезенке и легких.

Как известно, применение Доке часто ограничивается высокой кардиотоксичностью, обусловленной его значительным поступлением в сердечную мышцу, причем особую роль в развитии этого побочного эффекта играет пиковая концентрация. Действительно, максимальная концентрация Доке в сердечной мышце достигалась через 2 ч и составляла 6,57 ± 0,55 мкг/г (Рис. 3). В то же время при введении наносомальных форм пиковая концентрация Доке в сердце снижалась в 22 раза. Уже через 1 ч после введения концентрация наносомальных форм Доке была ниже предела чувствительности измерений (< 0,1 мкг/г).

Наиболее интересные данные, полученные при изучении фармакокинетики наносомальной формы Доке, относятся к способности модифицированных НЧ доставлять антибиотик через ГЭБ. При ассоциации с НЧ, модифицированными полисорбатом 80, значимые концентрации Доке в мозге (> 1 мкг/г) определялись в течение 8 ч после введения. При этом максимальная концентрация достигала весьма значительного уровня - 6 мкг/г -через 2 ч после введения и поддерживалась на этом уровне в течение последующих 2 ч (Рис. 4). При введении остальных форм (Доке, Докс+Пс, Докс-ПБЦА) уровень антибиотика в ткани мозга оставался ниже предела чувствительности измерений (<0,1 мкг/г) в течение всего периода наблюдения.

1.2.2. Биораспределение полибутшцианоакршатных наночастиц. Задачей исследования было определить, существует ли корреляция между биораспределением Доке и самих НЧ. Кроме того, интерес представляло изучение распределения НЧ в мозге в условиях развивающейся глиобластомы. Для решения этих задач исследовали распределение полибугал-2-циано[3-14С]акрилата (ИС-ПБЦА) в составе НЧ, покрытых полисорбатом 80 - пустых (ПБЦА) или нагруженных Доке (Докс-ПБЦА+Пс), а также пустых НЧ с немодифицированной поверхностью (ПБЦА). В качестве модели опухоли головного мозга использовали глиобластому 101/8 (из коллекции Института морфологии человека РАМН), имплантированную интракраниально крысам Wistar. Наночастицы вводили крысам через 5, 8 и 10 дней после имплантации опухоли в дозе 20 мг/кг.

Все НЧ обладали близкими параметрами (ср. размер 220-260 им, заряд поверхности -27 * -29 мВ). При этом состав НЧ оказывал определенное влияние на профиль их биораспределения (Рис. 5), что, по-видимому, объясняется изменениями свойств поверхности (см. раздел 1.7). В целом полученные

результаты коррелируют с данными описанного выше исследования распределения наносомального Доке. Распределение НЧ по изученным органам у здоровых крыс и крыс с опухолью (на рисунке не показано) не различалось.

Кровь Сердце Легкие Печень Селезенка Почки

ШПБЦА ШПБЦА+Пс80 ЯДокс-ПБЦА+Пс 80

Рис. 5. Биораспределение [ИС]-ПБЦА наночастиц через 1 ч после введения крысам (п =10)

Рис. 6. Концентрации [|4С]-ПБЦА в Рис. 7. Концентрации [ЫС]-ПБЦА в

ткани мозга крыс с глиобластомой опухоли и нормальной ткани мозга

101/8 (полушарие с опухолью) на 5-й через 1 ч после введения крысам с

и 10-й дни после имплантации (через глиобластомой 101/8: 10-й день

1 ч после введения) после имплантации

Распределение наночастиц в мозге крыс. Концентрации НЧ определяли на 5, 8 и 10 дни после имплантации глиобластомы 101/8. К 10-ому дню в полушарии мозга с опухолью наблюдалась тенденция к росту концентраций всех НЧ (Рис. 6 и 7). При этом максимальное значение — 0,93 % дозы -наблюдалось при введении Докс-ПБЦА+Пс80. Кроме того, концентрация НЧ в полушарии с имплантированной опухолью на 10-й день после имплантации

была значительно выше, чем в контралатеральном полушарии (Рис. 7), что свидетельствует о тенденции к росту концентрации по мере роста опухоли и объясняется повышением проницаемости ГЭБ.

Итак, исследование биорасцределеиия , показало, что ПБЦА НЧ, модифицированные полисорбатом 80, проникают через ГЭБ и доставляют связанный с ними Доке в мозг. При этом количество Доке (~ 1% введенной дозы), доставленное в мозг, пропорционально относительной массе мозга (1% массы тела), то есть наносомальный Доке после внутривенного введения распределяется так, как если бы мозг не был защищен ГЭБ. В случае интракраниальной опухоли проникновению НЧ в мозг способствует нарушение ГЭБ в зоне опухолевого роста, однако НЧ эффективно доставляют Доке и в здоровый мозг. Уровень концентраций Доке в ткани мозга (6 мкг/г) в 15-25 раз превышает уровень ГС50, определенный нами для клеток экспериментальных глиом крысы (0,24 - 0,38 мкг/мл).

1.3. Изучение противоопухолевой активности наносомальпых форм доксорубицина на модели интракраниальной глиобластомы 101/8 у крыс. Противоопухолевую активность оценивали по продолжительность жизни и числу животных с длительной ремиссией. Животные получали следующие препараты: 1) модифицированную полисорбатом 80 наносомальную форму (Докс-ПБЦА+Пс), 2) ^модифицированную наносомальную форму (Докс-ПБЦА); 3) пустые НЧ, модифицированные полисорбатом 80 (плацебо), 4) субстанцию доксорубицина в водном растворе (Доке), 4) субстанцию доксорубицина в 1% растворе полисорбата 80 (Докс+Пс). В качестве контроля использовали нелеченных животных. Препараты вводили трехкратно в хвостовую вену крыс на 2, 5 и 8 день после перевивки опухоли в дозе 1,5 мг/кг.

Наиболее высокий противоопухолевый эффект был достигнут в группе животных, леченных Докс-ПБЦА+Пс. В этой группе отмечено статистически значимое увеличение продолжительности жизни как по сравнению с нелеченным контролем (УПЖ = 85%), так и по сравнению с группой, получавшей эквивалентные дозы субстанции Доке (УПЖ = 24%). Кроме того, у 20% животных (5/23), получавших Докс-ПБЦА+Пс наблюдалась длительная ремиссия (Рнс. 8). Патоморфологическое обследование животных, выживших к 180-ому дню, не выявило признаков опухоли. Эффект был подтвержден в трех независимых экспериментах (всего 156 животных, п = 8 + 10). Умеренный противоопухолевый эффект наблюдали также в группах Докс-ПБЦА и Докс+Пс, что объясняется, вероятно, повышением проницаемости ГЭБ в

процессе роста опухоли. Введение эквивалентных доз пустых НЧ не оказывало противоопухолевого действия.

Выраженный противоопухолевый эффект Докс-ПБЦА+Пс коррелирует с результатами, полученными при изучении €иораспределения: НЧ, модифицированные полисорбатом, Moiyr доставлять антибиотик в опухоль на ранней стадии роста, когда ГЭБ еще сохраняет свои функции.

1.4. Влияние состава наночастиц на противоопухолевую активность доксорубицина. Целью эксперимента было сравнение влияния полоксамера 188 и полисорбата 80 на противоопухолевый эффект наносомального доксорубицина. В опыте использовали НЧ, стабилизированные декстраном (Докс-ИБЦА/Dex) и покрытые полоксамером 188, и НЧ, а также НЧ, стабилизированные полоксамером 188 (Докс-ПБЦА/Р188), покрытые полисорбатом 80 или без покрытия. Для того чтобы обеспечить возможность сравнения результатов, в качестве модели использовали глиобластому 101/8 и аналогичный режим лечения (3 х 1,5 мг/кг в дни 2,5 и 8 после имплантации опухоли). Для выявления роли наночастиц животным вводили также доксорубицин в 1% растворе полисорбата 80 или полоксамера 188 (Докс+Пс80, Докс+Р188). Все наночастицы имели сходные физико-химические параметры.

Результаты этого эксперимента обнаруживают влияние состава наносомальной формы Доке на его эффективность. Нано'сомальные формы, содержащие полоксамер 188 в качестве стабилизатора (Докс-ПБЦА/Р188) или модификатора поверхности (Докс-ПБЦА/Декс+Р188), не только увеличили продолжительность жизни, но и обеспечили длительную ремиссию у 20% животных (2/10 и 4/20, соответственно) (Рис. 8). Таким образом, по эффективности эти формы сравнимы с Докс-ПБЦА/Декс+Пс, обеспечившим длительную ремиссию 22% (5/23) животных.

Способность ПБЦА НЧ, модифицированных Р188, доставлять вещества в мозг была показана также для другого субстрата P-gp, агониста опиатных рецепторов лоперамида, наносомальная форма которого проявила выраженный аиальгезирующий эффект.

Следует отметить, что включение лоперамида в ПБЦА НЧ позволило повысить его содержание в водной фазе в 400 раз - от 2 мкг/мл до 800 мкг/мл. Аналогичный эффект наблюдали при получении наносомальной формы другой малорастворимой субстанции - паклитаксела (растворимость в воде 1 мкг/мл): содержание его в водной фазе повысилось в 450 раз. Эти результаты могут

свидетельствовать о целесообразности использования ПБЦА НЧ при разработке парентеральных форм малорастворимых субстанций.

Контроль Доке

Доге+Пс80 Докс+Р18Э

Докс-ПБЦ<\/Декс+Р188 Докс-ГБЦ^/Декс+ПсвО

Контроль Докс-ЛБЦА/Декс+ЛсБО Докс-ПБЦМР188 Докс-ПБЦ^/Pl 88+ПС80

20 40 60 80

Дни после имплантации опухоли

20 40 60 80 Дни после имплантации опухоли

А Б

Рис. 8. Выживаемость крыс с глиобластомой 101/8 после в/в введения наносомальных форм доксорубицина на основе ПБЦА НЧ, стабилизированных декстраном (А) и полоксамером 188 (Б): влияние ПАВ.

1.5. Углубленные исследования противоопухолевой активности наносомального доксорубицина в отношении глиобластомы 101/8. Для получения более полного представления о противоопухолевой активности наносомального доксорубицина (Докс-ПБЦА+Пс/Декс) в отношении глиобластомы 101/8 было проведено углубленное исследование, целью которого являлась патоморфологическая оценка динамики роста опухоли, а также оценка результатов химиотерапии с помощью гистологических и иммуногистохимических методов.

Патоморфологические исследования: динамика роста опухоли. Патоморфологические исследования позволили проследить за влиянием лекарственных форм Доке и Докс-ПБЦА+Пс на динамику роста глиобластомы. Как показали исследования срезов мозга контрольных и опытных животных на 10, 14 и 18 день после имплантации, наносомальная форма Докс-ПБЦА+Пс тормозит рост глиобластомы значительно эффективнее, чем свободный Доке (Рис. 9 и 10). К 14-ому дню в контрольной группе у всех животных наблюдались обширные опухоли с очагами некроза; средний размер опухолей достигал 24,9 ± 7,6 мм2. В группе, получавшей Докс-ПБЦА+Пс, у 4/6 животных опухоли обнаружено не было. У остальных животных размер опухолей не превышал 0,4 ± 0.2 мм2.

Дни после имплантации опухоли и Контроль и Доке цДоке-ПБЦД+Пс

Рис, 9. Средний размер опухолей после введения Доке и Докс-ПБЦА+Пс (без учета большой

опухоли).

♦> - размер большой опухоли Режим лечения 3 х 1,5 мг/кг (п = 6)

Рис. 10. Репрезентативные гистологические срезы мозга крыс на 10, 14 и 18 день после имплантации (окрашивание гематоксилин - эозином). Режим лечения: 3x1.5 мг/кг на 2, 5 и 8 дни (п = 6)

Оау 10 Оау 14 Оау 13

СоМгй

[}0Х-Б01

□ох-пр

К 18-ому дню средний размер опухолей в группе, леченной Докс-ПБЦА+Пс, был в ~50 раз меньше, чем в группе, получавшей стандартный препарат. У 2/6 животных введение Докс-ПБЦА+Пс предотвратило развитие опухоли. У 3/6 животных размер опухолей на срезе был менее 1 мм2 и лишь у одного животного развилась опухоль размером 45 мм2. Без учета этого животного средний размер опухолей составил 0,48 ± 0,29 мм и был достоверно ниже, чем в группе Доке, где средний размер опухолей достигал 23,0 ± 13,5 мм" (р < 0.0005). Контрольные животные к этому сроку погибли. Таким образом, противоопухолевый эффект язносомзльного доксорубицина выражался в значительном торможении роста опухоли.

Иммуногистохгшические критерии. Иммуногистохимическими критериями оценки противоопухолевой активности доксорубицина в различных лекарственных формах служили пролиферативная активность опухолевых

клеток, а также активность ангиогенеза в опухоли и микроваскулярная пролиферация.

Пролиферативная активность. Для выявления пролиферативной активности клеток глиобластомы использовали моноклональные антитела к антигену пролиферирующих клеток Кл67. Пролиферирующие клетки были обнаружены во всех группах, при этом в группе Докс-ПБЦА+Пс доля клеток, экспрессирующих Кл67*, была достоверно ниже, чем в контрольной группе и группе, получавшей Доке (Рис. НА). Таким образом, наносомальный докеорубицин эффективно тормозил пролиферацию опухолевых клеток.

щ . а гс 2 й *

Дни после имплантации опухоли 3 Контроль ЭДокс О Докс-ПБЦА-^Пс

6 8 10 12 14 16

Дни после имплантации опухоли Я Контроль Е) Доке О Докс-ПБЦА+Пс

Рис. 11. Влияние различных форм доксорубицина на количество клеток глиобластомы, экспрессирующих маркер пролиферативной активности Кл67 (А) и маркер эндотелиальных клеток изолектин В4 (Б)

Плотность сосудов. Плотность сосудов в опухоли оценившга по площади на срезе, занятой эндотелиальными клетками, экспрессирующими антиген к изолектину В4 (т.е. по площади, занятой сосудами). Как видно из Рис. 11Б, на 14-ый день плотность сосудов в группе Докс-ПБЦА+Пс была ниже предела чувствительности измерений. В группе Доке и в контроле плотность сосудов составляла 8 ± 6% и 9 ± 4%, соответственно.

На 18-ый день плотность сосудов в группе Докс-ПБЦА+Пс была ниже, чем в группе Доке (3 ± 5 % и 6 ± 1 %, соответственно). Без учета единственного животного с большой опухолью средняя плотность сосудов в этой группе составляла 0.85 ± 0.28 %; в этом случае различие межу Докс-ПБЦА+Пс и Доке было статистически достоверным (р < 0.0005).

Таким образом, данные иммуногистохимического исследования предполагают, что противоопухолевый эффект наносомального доксорубицина в отношении глиобластомы в значительной мерее обусловлен ингибированием

роста сосудов в опухоли. Сравнение Рис. 8 и 11 позволяет видеть, что данные патоморфологического и иммуногистохимического исследований коррелировали с данными по выживаемости животных.

1.6. Токсикологическое исследование наносомальной формы доксорубицина. Очевидно, что именно оценка безопасности наносомальных форм позволит окончательно решить вопрос о целесообразности их практического применения, поскольку изменяя биораспределение ЛВ, наночастицы неизбежно влияют и на их токсикологические характеристики. Первые данные о благоприятном влиянии НЧ на токсические свойства доксорубицина появились еще в 80-е годы, однако систематические исследования с тех пор не проводились. О токсикологических характеристиках ИИ, модифицированных ПАВ, было практически ничего не известно.

Соответственно, целью настоящего исследования являлось изучение токсических свойств наносомальной формы Докс-ПБЦА+Пс. Для получения объективной оценки исследование носило сравнительный характер: во всех экспериментах в качестве контроля использовали стандартную лекарственную форму (субстанцию) Доке. Для выявления роли полисорбата 80 исследовали также токсичность формы Докс-ПБЦА, для выявления роли других ингредиентов - токсичность пустых ПБЦА НЧ (плацебо). Исследование проводили на крысах \\^з1аг.

Прежде всего, следует отметить, что пустые НЧ (плацебо) не обнаружили ни острой и субхронической токсичности. Оценка острой токсичности не выявила существенных различий между наносомальной и стандартной формами доксорубицина. При исследовании субхронической токсичности различия проявились в наибольшей степени при оценке воздействия на сердце и семенники, причем наименее токсичной была наносомальная форма, содержащая полисорбат 80.

Значительное ослабление кардиотоксичности доксорубицина в результате связывания его с НЧ, зафиксированное как функционально, так и морфологически, является наиболее важным наблюдением. При введении наносомальных форм количество и размеры очагов атрофии миокарда существенно уменьшалось, лимфоидные инфильтраты отсутствовали (Рис. 12 и 13). Функциональный тест (ЭКГ) показал, что в группе, получавшей Докс-ПБЦА+ПС, частота пульса и интервал С?Т не отличались от контроля, что свидетельствовало об отсутствии признаков декомпенсации сердечной деятельности.

Рис. 12. Миокард крысы. ДОКС. 30 сутки после курса. Очаги деструкции кардиомиоцитов, сильный отек, лимфоидные инфильтраты в области атрофии мышечных волокон, х 20

Рис. 13. Миокард крысы. ДОКС-ПБЦА+ПС. 30 сутки после курса. Уменьшение количества и размеров очагов отека и атрофии мышечных волокон. Отсутствие лимфоидных инфильтратов, х 20

По кардиотоксическим свойствам формы доксорубицина можно расположить следующим образом: ДОКС»ДОКС-ПБЦА>ДОКС-ПБЦА+ПС. Это феномен определенно объясняется изменением биораспределения доксорубицина. Действительно, если расположить формы в порядке убывания концентраций в сердце (Рис. 3), то этот ряд в точности совпадет с приведенным выше.

Важно отметить также значительно менее выраженную тестикулярную токсичность наносомальной формы. Не отмечено также повышения токсичности наносомального доксорубицина в отношении органов ретикулоэндотелиальной системы, а именно печени и селезенки. Токсичность Докс-ПБЦА+Пс в отношении печени даже снизилась по сравнению с Док с.

1.7. Исследование механизмов доставки веществ в мозг с помощью наночастиц

1.7.1. Оценка проницаемости ГЭБ после введения наночастиц. Прежде всего, было важно установить, не является ли проникновение JTB в мозг результатом неспецифического повышения проницаемости ГЭБ в результате токсического действия НЧ и/или ПАВ. Следует отметить, что этот механизм сразу казался маловероятным, поскольку ни в одном из многочисленных экспериментов ш vivo мы не наблюдали клинических признаков нейротоксичности. С Другой стороны, если бы при введении НЧ в кровь барьерные функции ГЭБ действительно нарушались, то в связывании вешеств с НЧ не было бы необходимости: при ведении после НЧ эти вещества могли бы проникать через нарушенный ГЭБ в результате простой диффузии.

Для того чтобы проверить эту гипотезу, мы провели эксперимент, позволяющий судить о состоянии ГЭБ после введения покрытых полисорбатом ПБЦА НЧ (ПБЦА НЧ+Пс). В этом эксперименте определяли анальгезирующее действие даларгина, свободного или включенного в ПБЦА НЧ, при различных режимах введения. Даларгин является субстратом опиатных рецепторов, однако не оказывает анальгезирующего действия при в/в введении, поскольку практически не проникает в мозг. Показано, что значительное понижение порога болевой чувствительности достигалось только при введении даларгина, включенного в ПБЦА НЧ+Пс. Анальгезирующее действие даларгина или ПБЦА НЧ, введенных по отдельности или последовательно, было незначительным.

Результаты этого эксперимента позволяют сделать два важных вывода: 1) в/в введение ПБЦА НЧ+Пс, не приводит к повышению проницаемости ГЭБ, достаточному для проникновения через него низкомолекулярных субстратов Р-gp; 2) субстраты P-gp проникают в мозг, только будучи связанными с НЧ, покрытыми полисорбатом 80.

Кроме того, целостность ГЭБ при контакте с ПБЦА НЧ была исследована нами в опытах in vitro. В опытах использовали модель ГЭБ, состоящую из совмещенных слоев эндотелиальных клеток капилляров мозга быка и астроцитов крысы. В качестве маркеров проницаемости ГЭБ использовали [3Н]-инулин и [14С]-сахарозу. Было показано, что количество этих гидрофильных маркеров, проникающих через ГЭБ, не изменяется после инкубации клеток с НЧ.

1.7.2. Изучение сорбции белков плазмы на поверхности наночастиц. Согласно современным представлениям, среди факторов, определяющих распределение НЧ в организме при в/в введении, ключевым является профиль белков, адсорбируемых частицами в плазме. В связи с этим мы провели исследование состава белков плазмы, адсорбирующихся на поверхности ПБЦА НЧ, нагруженных Доке и покрытых полисорбатом 80 или полоксамером 188. НЧ инкубировали в плазме крыс, затем белки отделяли и анализировали методом двухмерного электрофореза в акриламидном геле (2-D PAGE).

Несмотря на различную химическую структуру ПАВ, использованных для модификации, профили белков на поверхности ПБЦА НЧ, нагруженных Доке, обнаружили как количественное, так и качественное сходство (Рис. 14). При этом на поверхности обоих типов частиц в значительном количестве присутствовал АроА-1 (24 % от общего количества).

30 -j

CH.

H-

■OH

Химическая структура полоксамера 188 (a = 52, b = 30, MM 8400)

Ю(СН2СН2С).Х (ОС1-гСН2)„ОН

(ЛГ.НгПН;);—I

.(OCH2CHj)yOH

Poiysorbaîe ВО (SumQiw,x,y andzis20)

одокс-пбца+Пс 0ДОКС-ПБЦА+Р188 Химическая структура полисорбата 80

Рис. 14. Сходство состава белков плазмы крысы, адсорбированных на поверхности ПБЦА наночастиц, нагруженных доксорубицином и модифицированных полисорбатом 80 (Докс-ПБЦА+Пс) и полоксамером 188 (Докс-ПБЦА+Р 188) (п = 4)

Сопоставление этих результатов с данными о противоопухолевом эффекте Докс-ПБЦА+Пс и Докс-ПБЦА+Р 188, позволяет предположить, что аполипопротеин АроА-I играет важную роль во взаимодействии НЧ с эндотелиальными клетками, формирующими ГЭБ. Так возможно, что доставка веществ в мозг осуществляется путем взаимодействия АроА-1, адсорбированного на поверхности частицы, со скавенджер-рецептором BI (SR-BI), зкспрессированным на поверхности эндотелиальных клеток. АроА-1 участвует в переносе липидов; при этом АроА-1 связывается с клеточной мембраной посредством SR-BI, который и передает яипид клетке. Возможно, что поступление НЧ в эндотелиальные клетки осуществляется по той же схеме: АроА-1 взаимодействует с рецептором SR-B1, но вместо липида в клетку поступает частица. Позже мы показали, что модификация альбуминовых НЧ АроА-1 позволяет осуществить транспорт этих носителей в мозг, что подтверждает гипотезу об участии этого белка в преодолении ГЭБ.

Сопоставление данных, полученных при исследовании белков на поверхности НЧ в отсутствие полисорбата, а также пустых и нагруженных Доке частиц показало, что свойства поверхности в значительной степени зависят от всех компонентов системы доставки.

J.8. Радиационная стерилизация наносомальной формы доксорубицина. Стерилизация лекарственных форм на основе ПБЦА НЧ является сложной

задачей, поскольку возможность применения традиционных методов стерилизации, таких как термическая или химическая обработка, а также стерильная фильтрация, ограничена физико-химическими свойствами НЧ. Принципиальная возможность радиационной стерилизации НЧ была показана нами ранее на примере наносомальной формы ампициллина. Ампициллин после гамма-облучения в дозах до 27,4 кГр не терял антибактериальной активности; также не наблюдалось достоверных различий в кинетике выделения антибиотика из НЧ до и после облучения.

Задачей настоящего исследования являлось определение максимально переносимой и оптимальной стерилизующей доз излучения для наносомальной формы Доке, а также определение влияния ионизирующего излучения на основные ингредиенты формы - Доке и ПБЦА. Облучение проводили двумя способами - гамма-облучением и потоком ускоренных электронов в дозах 10, 15,25 и 35 кГр.

Микробиологическое исследование показало, что после облучения в дозах 15 кГр и выше все образцы были стерильны независимо от типа излучения. Для определения влияния облучения на свойства лекарственной формы и ее основных ингредиентов - доксорубицина и ПБЦА - в образцах определяли содержание Доке и родственных примесей, размеры НЧ, а также ММР ПБЦА и концентрацию стабильных при комнатной температуре радикалов, оставшихся в образцах НЧ после облучения.

Облучение при максимальной поглощенной дозе 35 кГр не выявило образования побочных продуктов. Содержание Доке в образцах после облучения практически не изменялось. Облучение также не влияло на средний размер НЧ и не вызывало их агломерации независимо от дозы и использованного метода облучения. При дозах до 25 кГр оба типа облучения не оказали существенного влияния на ММР ПБЦА, входящего в состав НЧ.

Таким образом, показана радиационная устойчивость наносомальной формы Доке и установлена оптимальная стерилизующая доза - 15 кГр .

2. РАЗРАБОТКА И ИССЛЕДОВАНИЕ НАНОСОМАЛЬНЫХ ФОРМ РИФАМПИЦИНА

Целесообразность применения наносомальных форм при лечении внутриклеточных инфекций обусловлена эффективным транспортом НЧ в макрофаги. Однако возможность применения наносомальных форм при лечении такого распространенного и опасного заболевания, как туберкулез легких, остается мало изученной проблемой.

В задачи данного этапа исследований входили: разработка наносомальных форм противотуберкулезного антибиотика I ряда рифампицина (Риф); изучение влияния состава наносомальной формы на биораспределение рифампицина; оценка эффективности наносомальных форм на модели экспериментального туберкулеза и острых инфекций; оптимизация наносомальных форм в соответствии с результатами биологических экспериментов. Так же, как и в случае Доке, возможность использования рифампицина обусловлена установленной нами устойчивостью в условиях образования НЧ и амфифильным характером, предопределяющим возможность сорбции различными наночастицами.

2.1. Влияние технологических параметров на свойства полимерных наночастиц, содержащихрифампицин

2.1.1. Полибутилцианоакрилатные наночастицы. Устойчивая наиосуспензия с размером частиц 350 - 450 нм образуется только в диапазоне рН - от 1,5 до 3, при этом наибольшая степень сорбции Риф достигается при рН 2 (Рис. ¡5). Так же как и в случае Доке, введение мономера в среду, содержащую Риф, приводило к образованию аморфной полимерной массы. Видимо, Риф, обладая нуклеофильными свойствами, влияет на процесс полимеризации, ускоряя его и приводя к агломерации полимера.

рН

♦ Размер О Степень сорбции

Рис. 15. Влияние рН полимеризационной среды на размер ПБЦА НЧ и степень сорбции рифампицина (СрИф = 1 мг/мл).

5 Ы

0 40

2,5

Концентрация рифампицина, мг/мл

Рис. 16. Влияние исходной концентрации рифампицина на степень сорбции (рН 2, п = 3)

Введение Риф в реакционную среду через 30 мин после начала полимеризации позволяло избежать агломерации и получать пригодные для в/в введения НЧ размером 350 - 450 нм. Следует отметать эффективную сорбцию

Риф: при относительно высоком соотношении Риф - полимер (1 : 6) степень сорбции Риф составляла не менее 60% {Рис. 16). Нагрузка Риф на полимер составляла ~ 170-180 мг Риф /г ПБЦА.

2.1.2. Полилактидные наночастицы. Полилактидные НЧ получали методом гомогенизации (эмульгирования) под давлением с последующим испарением растворителя. Поскольку как полилактиды, так и Риф хорошо растворимы в дихлорметане или этилацетате, получали простые эмульсии типа масло в воде, Раствор полимера и Риф в дихлорметане или этилацетате прибавляли к водному раствору стабилизатора - поливинилового спирта (ПВС) или человеческого сывороточного альбумина (ЧСА); затем смесь гомогенизировали с помощью высокоскоростного гомогенизатора. Полученную первичную эмульсию дополнительно гомогенизировали при давлении 400 бар.

2.1.2.1. Влияние структуры полимера на эффективность сорбции рифампицина. Эффективность сорбции Риф полилактидными НЧ может быть обусловлена: 1) образованием водородных связей между гидроксильными группами Риф и карбонильными группами полилактидов; 2) гидрофобным взаимодействием Риф с полимерной матрицей (можно было ожидать более выраженного сродства Риф к НЧ из гомополимеров РЬА, поскольку, по сравнению с РЬОА, эти полимеры более гидрофобны из-за дополнительных метальных групп (Рис. 17А и Б).

Рис. 17А. Химическая Рис. 17Б. Химическая структура гомополимера структура рифампицина молочной кислоты (РЬА) и сополимера

молочной и гликолевой кислот (РЬвА)

Наконец, поскольку молекула Риф представляет собой цвштер-ион (рКа 1,7 для 4-гидроксигруппы и рКа 7,9 для азота 3-пиперазина), то в растворах с близким к нейтральному значением рН часть азот-содержащих групп протонирована, что может обеспечить дополнительное электростатическое взаимодействие этих групп с концевыми карбоксильными группами полимеров.

Таблица 1. Влияние природы стабилизатора и органического растворителя на эффективность сорбции рифампицина наночастицами полилактидов

Полимер (лактид: гликолид) Орг. растворитель ПАВ* Степень сорбции**,%

hmPLA CH2C12 ПВС 42

hmPLA CH2Cl2 ЧСА 63

hm PLA EtOAc ПВС 58

hmPLA EtOAc ЧСА 64

hm PLA-COOH CH2C12 ПВС 83 ± 1,1*

hm PLA-COOH CH2C12 ЧСА 76

hm PLA-COOH EtOAc ПВС 81

hm PLA-COOH EtOAc ЧСА 70

hm PLGA (50: 50) CH2C12 ПВС 40

hm PLGA (50 : 50) CH2CI2 ЧСА 51

hm PLGA (50 : 50) EtOAc ПВС 57

hm PLGA (50 : 50) EtOAc ЧСА 53

hm PLGA-COOH (50 : 50) CH2C12 ПВС 88 ±0,8*

hm PLGA-COOH (50 : 50) CH2CI2 ЧСА 88

hm PLGA-COOH (50: 50) EtOAc ПВС 89

hm PLGA-COOH (50: 50) EtOAc ЧСА 67

* концентрация стабилизатора 0,5%,

** во всех случаях, кроме отмеченных (*), приведены репрезентативные данные из двух серий экспериментов; для (*) приведены средние значения ± sd (г) - 3)

В связи с этим для исследования влияния структуры полимера на сорбцию Риф были выбраны следующие полилактиды (Lactel®)-. высокомолекулярный PLA (вм PLA, 85-160 кДа) и низкомолекулярный PLA (нм PLA, 40 кДа), высокомолекулярный PLGA (вм PLGA, 90-126 кДа) и низкомолекулярный PLGA (нм PLGA, 14 кДа) PLGA, а также полимеры с дополнительными концевыми СООН-групнами (PLA-COOH и PLGA-COOH).

Наиболее значимым из исследованных факторов оказалось наличие дополнительных концевых СООН-групп как для гомополимера PLA-COOH, так и для сополимера PLGA-COOH (степень сорбции Риф > 80) (Табл. 1%). Влияние таких параметров, как гидрофобность и ММ полимеров, оказалось менее выраженным, равно как и влияние органического растворителя и ПАВ.

2.1.2.2. Исследования смеси рифампицина с полилактидами методами ИК-спектроскопии и дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК).

Данные ИК-спектроскопии указывают на то, что и РЬА и Р1ЛЗА эффективно связывают Риф благодаря его взаимодействию с карбонилом в сложноэфирных группах основных цепей полимеров.

№

V-/

libo

17^0

17'JC 1730

Рис. 18. ИК-спектры PLA(a) и смеси PLA/RIF (10:1) (Ь) в области поглощения v<>o

Рис. 19. ИК-спектры PLA-COOH (а) и смеси PLA-COOH/RIF (10:1) (Ь) в области поглощения \'с=о

В случае полимеров с концевыми -СООН группами это взаимодействие усиливается. Так на ИК-спектрах смеси Риф-PLA-COOH отчетливо видно появление полос от группы -СООН в области 1700-1715 см"1; в спектре исходного PLA-COOH эти полосы имеют малую интенсивность (Рис. 19). По-видимому, столь резкое увеличение интенсивности этих полос связано с участием концевых групп -СООН в водородном связывании с Риф, в пользу чего свидетельствует также и возрастание интенсивности полос vc<). В то же время в случае PLA никаких изменений в спектре под влиянием Риф не происходит (Рис. 18). Аналогичные данные получены для PLGA (не показано).

Взаимодействие Риф с PLA-COOH было показано также при изучении поведения смеси методом ДСК. Показано, что температура стеклования PLA-COOH существенно понижается в присутствии Риф (Риф : полимер =1:10 в/в), составляя б°С против 44,8°С для чистого полимера (Рис. 20). Этот факт свидетельствует об увеличении подвижности макромолекул полимера в присутствии Риф, то есть Риф фактически является пластификатором для полимера. Таким образом, при содержании до 10% Риф образует с полимером гомогенную смесь, при этом пластификация полимера указывает на взаимодействие компонентов.

Рис. 20.

ДСК-спектры РЬА-СООН (1) и смеси РЬА-СООН / ЮТ (10:1) (2)

•9£

а.

0 2 4 6

Концентрация рифампицина, мг/мл

■ Средний диаметр НЧ 1

■Степень сорбции

& о

1 _*

___ 1

Концентрация рифампицина, мг/мл Средний диаметр НЧ ■» о "Степень сорбции

Рис. 21. Влияние концентрации рифампицина на параметры наночастиц на основе низкомолекулярных РЬА-СООН (А) и РЬвА-СООН (Б) (п = 3)

2.1.2.3. Влияние концентрации рифампицина в реакционной смеси на параметры наночастиц. Влияние концентрации Риф в реакционной среде на размеры НЧ и степень сорбции было изучено доя РЬА-СООН и РЬСА-СООН. Для обоих типов НЧ изменение концентрации Риф в пределах от 1 до 5 мг/мл (Риф : полимер = от 1 : 50 до 1 : 10, в/в) практически не влияло на размер частиц; их средний диаметр составляет 200-250 нм (Рис. 21). В то же время степень сорбции Риф с увеличением его исходной концентрации достоверно уменьшалась, что свидетельствует о насыщении полимерной матрицы антибиотиком при концентрациях выше 1,7 мг/мл (Риф : полимер = 1 : 30, в/в). В последующих экспериментах использовали НЧ, полученные при соотношении Риф - полимер = 1 : 10 или 1 : 20. Нагрузка Риф на полимер составляла в среднем 70 мг/г ПБЦА и 35 мг/г ПБЦА, соответственно.

2.1.2.4. Исследование кинетики высвобождения рифампицина из наночастиц. Моделирование профиля выделения ЛВ из НЧ in vitro является неотъемлемой частью исследований по разработке наносомальной формы, поскольку позволяет сравнивать различные лекарственные формы между собой и оптимизировать их в соответствии с конкретной фармакологической задачей. В данной работе изучение кинетики выделения Риф из НЧ позволило выявить влияние типа полимера и химического состава полилактидов на этот процесс.

120

■е-

£ юо £

S 60 г«

Рис. 22. Кинетика выделения Рис. 23. Кинетика выделения рифампицина из ПБЦА НЧ рифампицина из полилактидных НЧ

(Риф : ПБЦА = 1,5 : 10 в/в, п = 3). (Риф : полимер = 1:20 в/в, п=3)

Эксперимент проводили в условиях, близких к физиологическим (PBS, рН7,4; 37°С), при 25-кратном разбавлении. Поскольку известно, что Риф легко окисляется кислородом воздуха с образованием соответствующего хинона, в среду добавляли 0,1% аскорбиновой кислоты в качестве антиоксиданта. Исследование кинетики ограничивали временным интервалом 0-24 часа. В качестве нулевой точки использовали данные, полученные при определении степени сорбции Риф, то есть без дополнительного разбавления суспензии НЧ.

Основное количество Риф выделялось в течение 2 ч; через 4 ч антибиотик полностью переходит в приемный раствор (Рис. 22). Профили выделения Риф из полилактидных НЧ различаются в зависимости от структуры полимера. PLA и PLGA, не имеющие дополнительных карбоксильных групп, под влиянием градиента концентрации при разбавлении суспензии высвобождают Риф практически сразу (Рис. 23). В то же время PLA-COOH и PLGA-COOH, как и ожидалось, позволяют замедлить скорость выделения антибиотика из НЧ. При этом если высвобождение Риф из НЧ на основе PLGA-COOH завершается практически полностью за 2 ч, то в случае PLA-COOH антибиотик выделяется существенно медленнее: через сутки эти НЧ продолжают удерживать около

20% рифампицина. Как и в случае доксорубицина, двухфазный характер выделения Риф предполагает, что антибиотик адсорбирован как на поверхности, так и внутри частицы.

2.2. Влияние состава ианосомальной формы рифампицина на его биораспределение. Исследование проводили на мышах линии BALB/c. Все формы вводили в дозе 27 мг/кг. В качестве препарата сравнения использовали лекарственную форму «Рифампицин Ферейн для в/в инъекций» (Риф).

2.2.1. Внутривенное введение

2.2.1.1. Наносомальная форма на основе ПБЦА наночастиц. Связывание Риф с ПБЦА НЧ (Риф-ПБЦА) привело к значительному повышению накоплення антибиотика в печени и селезенке: интегральные показатели AUC выросли на 100% и 150%, соответственно (Рис. 25). Влияние наносомалыюй формы на концентрации антибиотика в плазме и легких было менее выраженным: значения AUC выросли всего на 30% и 13%, соответственно.

2.2.1.2. Наносомальные формы на основе полтактидов. В исследовании использовали наносомальные формы Риф на основе PLGA (75:25), стабилизированные ПВС (Rif-PLGA/PVA) или ЧСА (Rif-PLGA/HSA), а также НЧ из PLA-COOH, стабилизированные ПВС (Rif-PLA-COOH/PVA). Степень сорбции рифампицина в этих образцах составляла 60-70%. Нагрузка на полимер составляла 60-70 мг/г полимера.

НЧ из PLGA также значительно повлияли на биораспределение рифампицина (Табл. 2, Рис. 24-25). По сравнению со стандартным препаратом, интегральный показатель AUC для плазмы вырос, а скорость клиренса упала; при этом накопление в печени, селезенке и легких возросло. Параметры распределения значительно изменялись в зависимости от используемого полимера — PLGA или PLA-COOH — и стабилизатора - PVA или HSA. Концентрации Rif-PLGA/PVA в органах были выше, чем в случае Rif-PLGA/HSA. К тому же форма Rif-PLGA/PVA также обеспечила двукратное увеличение AUC в легких по сравнению с субстанцией Риф. Распределение НЧ из PLA-COOH/PVA отличалось еще более высоким, по сравнению с PLGA/PVA, накоплением в печени и селезенке, в то время как концентрации в плазме и легких практически не изменились. Этот феномен, вероятно, можно объяснить тем, что НЧ из полимера PLA-COOH/PVA, несущие более отрицательный заряд, быстрее накапливаются в печени, поскольку в большей степени активируют комплемент сыворотки крови. Кроме того, НЧ из PLGA-

СООН лучше удерживают Риф, что приводит к более эффективному его удерживанию в органах (Рис. 24 и 25).

Рис. 24. Значения интегральных Рис. 25. Относительные значения

показателей AUC рифампицина в интегральных показателей (AUC

плазме и органах мышей для наночастиц/AUC рифампицина) для

наночастиц из PLGA/PVA и PLGA- различных типов наночастиц

COOH/PVA (в/в, 27 мг/кг, п = 6). (в/в, 27 мг/кг, п=6).

Итак, при внутривенном введении наносомальная форма оказывает значительное влияние на распределение рифампицина в организме, приводя к повышению его концентраций в плазме и изученных органах; при этом количественные параметры распределения зависят от типа НЧ.

Сравнение относительных интегральных показателей наносомальных форм (AUC рИф-нч/ AUC р„ф) на основе НЧ из полилактидов и НБЦА показало, что состав наносомальной формы, в частности тип носителя и стабилизатора, значительно влияют, как на способность частиц циркулировать в плазме, так и на их накопление в органах, богатых макрофагами. При этом ПБЦА НЧ в большей степени накапливаются в печени и селезенке; в то же время доставка Риф в легкие с помощью этих частиц менее эффективна. PLGA НЧ, стабилизированные ПВС, повысили накопление Риф в легких в 2 раза, при этом накопление в печени и селезенке было значительно ниже, чем в случае ПБЦА НЧ. Важным наблюдением является совпадение относительных значений AUC плазмы и легких для всех изученных форм, предполагающее, что для достижения более высоких концентраций рифампицина в легких необходимо повысить концентрации НЧ в плазме, а также время их циркуляции.

2.2.2. Оптимизация биораспределения наносомальных формрифампицина при внутривенном введении. Анализ литературных данных и собственный экспериментальный опыт позволили предположить, что наиболее простым способом оптимизировать биораспределение наносомального рифампицина, то есть повысить его концентрации в плазме и легких, является понижение накопления в печени с помощью ПАВ, обеспечивающих стелс-эффект.

Соответственно, задачей настоящего исследования было изучение возможности повышения легочных концентраций Риф путем модификации поверхности частиц полоксамером-407 (Р407) и полоксамином-908 (Р908) (Рис. 26). В эксперименте использовали следующие наносомальные формы рифампицина: 1) Риф-ПБЦА+Р407, 2) Риф-ПБЦА+Р908, 3) ИГ-РЬА/Н8А+Р407. Модификацию поверхности ПБЦА НЧ проводили путем ресуспендирования лиофилизованных НЧ в 1% водном растворе ПАВ. Для модификации полилактидных НЧ при получении в водную фазу наряду с ЧСА прибавляли 0,3

Модификация ПБЦА НЧ полоксамером Р407 и полоксамином 908 привела к снижению накопления рифампицина в печени и повышению концентрации в плазме и селезенке (Рис. 27). Одновременно выросли и показатели AUC в легких. Влияние ПАВ было несколько более выраженным для РИФ-ПБЦА-Р407: показатель AUC в плазме вырос на 40%, для легких - на 80%. Поведение НЧ из PLA-COOH, стабилизированных смесью альбумина и Р407, было парадоксальным: они хорошо накапливались в легких — показатель AUC на 50% выше, чем для Риф, при этом вырос также показатель AUC в печени (Рис. 41), a AUC в плазме снизился.

ЕО РО ЕО

Рис. 26а. Химическая структура полоксамера 407 (п = 98, m = 67)

. PtV-njVnjTj

EOft— POw «3„—EO„

Рис. 266. Химическая структура полоксамина 908 (n = 119, ш = 17)

% Р407.

рифлена««

СЗЛегкие

Рис. 27. Влияние полоксамера 407 и полоксамина 908 на биораспределение наносомальной формы рифампидина на основе ПБЦА: А: АПС рифампицина в печени и селезенке; Б: АиС рифампицина в плазме и легких.

Рис. 28. Корреляция между изменениями параметров А11С в легких и плазме при в/в введении

Рис. 29. Соотношение параметров AUC в печени и селезенке при в/в введении

2.2.3. Пероральное и подкожное введение. Наносомальная форма Rif-PLGA/PVA влияет на распределение Риф и при пероральном введении. Так применение НЧ позволяет значительно повысить концентрации Риф в легких и селезенке: интегральные показатели площади под фармакокинетической кривой (AUC), найденные для наносомальной формы, на 100% превышали показатели субстанции. При этом концентрации в легких поддерживались на уровне 30-40 мкг/г в течение 3 ч после введения («плато»), что не отмечалось при в/в введении.

С другой стороны, в сравнении с в/в введением формы Rif-PLGA/PVA, при пероралышм введении отмечены более низкие концентрации в плазме крови и печени, что отражает процесс поступления антибиотика из ЖКТ в системный кровоток.

Сравнение биораспределепия наносомальной формы при различных способах введения показало, что концентрации Риф в селезенке и легких при подкожном введении Rif-PLGA/PVA достоверно в 2-2,5 раза ниже, чем при пероральном или внутривенном. При этом концентрации в плазме практически одинаковы. По сравнению с пероральным при подкожном введении отмечена тенденция к более медленному снижению концентрации Риф в органах в период наблюдения 3-5 ч, что указывает на пролонгированное всасывание препарата при подкожном введении.

2.3. Активность наносомальной формы рифампицина в отношении внутриклеточных бактерий in vitro. Антибактериальную активность Риф-ПБЦА, изучали в экспериментах in vitro, когда внутри изолированных макрофагов находились фагоцитированные, но сохраняющие жизнеспособность бактерии Mycobacterium avium и Staphylococcus aureus. Показано, что антибактериальная активность РИФ-ПБЦА в отношении микобактерий, локализованных во внутриклеточной среде моноцитов крови человека, превышает активность стандартной лекарственной формы приблизительно в 7 раз.

Таблица 2. Влияние различных форм рифампицина на жизнеспособность Staphylococcus aureus, локализованных в легочных макрофагах кролика (п = 6)

Препарат Колониеобразующие единицы, % от контроля

Время инкубации клеток с препаратом

Зч 20 ч

РИФ-ПБЦА 21 ± 8 0

Рифампицин 68 ±13 18 ± 3

Антибактериальная активность РИФ-ПБЦА в отношении St. aureus также превышала активность субстанции в течение всего периода наблюдения (Табл. 2). В опыте использовали клинический изолят St. aureus, чувствительный к рифампицину (МПК 1,56мкг/мл).

Очевидно, высокая активность наносомального рифампицина объясняется эффективным транспортом НЧ в макрофаги: применение НЧ позволило

повысить внутриклеточные концентрации в 2,4-3,2 раза (Табл. 3). Кроме того, результаты этого эксперимента позволяют заключить, что: 1) Риф, включенный в НЧ, сохраняет антибактериальную активность, 2) НЧ не ограничивают биодоступность Риф во внутриклеточной среде.

Таблица 3. Накопление рифампицина в легочных макрофагах кролика (п=8)

Время инкубации, мин Коэффициент распределения между внутриклеточной и внеклеточной средой

Рифампицин РИФ-ПБЦА

5 3,30(2,29-4,31) 8,90 (7,40-10,40)

30 3,61 (3,10-4,12) 11,50 (9,70-13,30)

240 4,20 (3,69-4,71) 10,20(8,10-12,30)

2.4. Оценка эффективности наносомальных форм рифампицина на модели экспериментального туберкулеза у мышей. Как показали описанные выше фармакокинетические исследования, наносомальные формы обеспечивают повышение концентрации рифампицина в печени, легких и селезенке по сравнению со стандартным препаратом. Как известно, при туберкулезе эти органы являются очагами инфекции.

Задача исследования - установить, сопровождается ли повышение концентрации наносомальной формы антибиотика в печени, легких и селезенке повышением антибактериального эффекта.

Исследование проводили на модели экспериментального туберкулеза (М. tuberculosis) у мышей. Антибактериальный эффект оценивали по количеству микобактерий (число колониеобразующих единиц, КОЕ) в легких, селезенке и печени. Для выявления влияния наносомальной формы во все серии экспериментов включали группу, получавшую стандартную форму рифампицина (Риф). В качестве контроля использовали инфицированных животных, не получавших лечение.

2.4.1. Внутривенное введение. Первую серию экспериментов проводили по следующей схеме: 1-й день эксперимента — внутривенное заражение; 2-4 дни эксперимента — лечение; 5-й день — эвтаназия мышей и высев из легких. Лечение начинали через 24 ч после заражения. В связи с высокой противотуберкулезной активностью рифампицина для выявления различий между лекарственными формами все формы вводили в субтерапевтической дозе - 3 х 5 мг/кг с интервалом 24 ч. В исследовании использовали следующие

наносомальные формы рифампицина: Риф-ПБ1ДА, Риф-ПБЦА+Р407, Риф-РЬйА, Риф-РЬОА-СООН.

2.4.1.1. Полибутилциамоакрилатные наночастицы. Как показали результаты этой серии экспериментов, наиболее эффективной оказалась наносомальная форма на основе ПБЦА НЧ, модифицированных Р407 (Риф-ПБЦА+Р407). Число КОЕ в легких мышей, получавших Риф-ПБЦА+Р407, снизилось более чем в 5 раз по сравнению с Риф (Рис. 30). Немодифицированная наносомальная форма показала промежуточный результат. Та же тенденция наблюдалась и в селезенке, однако в этом случае различия между наносомальными формами были недостоверны.

X 15

4,7 ёП» ..........j

i 14

2 Р 6,34

Г! Щ 2,5

Контроль

РИФ-ИЧ Риф-НЧ-407

Рис. 30. Число КОЕ в легких мышей, инфицированных М. tuberculosis, через 24 ч после лечения наносомальными формами рифампицина на основе ПБЦА (в/в, 3x5 мг/кг в дни 2, 3 и 4 после заражения, п = 3).

Рис. 31. Интегральные показатели накопления рифампицина в легких мышей после внутривенного введения наносомальных форм рифампицина на основе ПБЦА (доза 27 мг/кг, п = 6)

Сопоставление данных, полученных в данном исследовании, с данными по биораспределению (Рис. 30 - 33) позволяет видеть, что, стерилизующий эффект различных форм рифампицина коррелирует с их фармакокинетическими параметрами. Во-первых, максимальный стерилизующий эффект достигается при использовании Риф-ПБЦА+Р407 — лекарственной формы, обеспечивающей также наивысший показатель AUC в легочной ткани. Во-вторых, выраженность стерилизующего эффекта также коррелировала со значениями максимальных концентраций рифампицина в исследованных органах.

; 300

Ъ £

Контроль Pttffl РИФ-РВСА риф-

PBCA.P407

Рис, 32. Число КОЕ в селезенке мышей, инфицированных М. tuberculosis, через 24 ч после лечения наносомальными формами

рифампицина (в/в, 3x5 мг/кг, п = 3).

Рис. 33. Интегральные показатели АиС рифампицина в селезенке мышей после в/в введения наносомальных форм рифампицина на основе ПБЦА (27 мг/кг, п = 6)

Рис. 34. Число КОЕ в органах мышей, инфицированных М. tuberculosis, после лечения различными формами

рифампицина (в/в 3x5 мг/кг)

В целом, полученные данные свидетельствуют о высокой активности и биодоступности наносомальных форм рифампицина на основе ПБЦА.

2.4.1.2. Наночастицы на основе полшактидов. По эффективности полилактидные НЧ не уступали стандартному препарату. Тем не менее, в целом антибактериальный эффект полилактидных НЧ при в/в введении был менее выражен по сравнению с ПБЦА НЧ (Рис. 34). Поскольку параметры биораспределения наносомальных форм схожи, можно предположить, что более низкая эффективность наносомальной формы на основе полилактидных НЧ

вызвана значительно более медленной, по сравнению с ПБЦА, скоростью их деградации, что, в свою очередь, обусловливает меньшую биодоступность Риф, заключенного в эти частицы. С другой стороны, не исключено, что эффект полилактидных НЧ мог бы проявиться при более длительных сроках лечения, достаточных для их деградации и полного выделения антибиотика.

2.4.2. Пероралыюе и подкожное введение. Это предположение подтверждают результаты, полученные при пероральном и подкожном путях введения. При проведении 4-недельного курса лечения (введение 1 раз в неделю) наносомальная форма оказалась значительно более эффективной, чем свободный антибиотик; причем преимущество наносомального рифампицина наблюдалось как при пероральном, так и при подкожном введении (Табл. 4). При введении препаратов 2 раза в неделю достоверных различий между свободным и наносомальным антибиотиком не было.

Таблица 4. Число КОЕ в органах мышей Balb/c, инфицированных М. tuberculosis, после лечения различными формами рифампицина: подкожное и пероральное введение______

Орган Число КОЕ х 106

Контроль Риф Риф-PLGA/PVA Риф Риф-PLGA/PVA

Подкожно Per os

Режим лечения: 8 х 20 мг/кг, два раза в неделю в течение 4 недель

Легкие 50,2 ± 2,8 1,9 ±1,2 1,1 ±0,53 0,21±0,03 0,13 ±0,04

Селезенка 2,3 ±0,92 1,5 ±0,89 0,83 ±0,21 0,28±0,1 0,23 ± 0,07

Режим лечения: 4 х 20 мг/кг, один раз в неделю в течение 4 недель

Легкие 50,2 ± 2,8 39,2±33,2 5,57 ±0,56 20,1 ±22,0 3,7 ±2,04

Селезенка 2,3 ±0,92 3,07±3,7 0,49 ±0,21 0,26±0,07 0,41 ±0,11

Высокий стерилизующий эффект Риф-РЬвА, наблюдавшийся в легких при пероральном введении — снижение числа КОЕ в 6 - 7 раз по сравнению со стандартным препаратом — хорошо коррелирует с данными, полученными при изучении биораспределения этой формы. Концентрации Риф-РЬОА/РУА в легких значительно превышали концентрации свободного Риф в течение 15 ч после введения, при этом в течение первых 5 ч концентрации удерживались на высоком уровне — до 35 мкг/г; концентрации Риф, напротив, снижались уже через 1 ч.

2.5. Изучение эффективности наносомальной формы рифампицина при лечении острых бактериальных инфекций. Наиболее подходящими для лечения острых инфекций, очевидно, являются ПБЦА НЧ, которые, подвергаясь быстрой внутриклеточной деградации, также быстро выделяют антибиотик. Эффективность наносомальной формы Риф на основе ПБЦА в отношении острых инфекций ранее не изучалась. Сравнительное изучение эффективности этой формы проводили на моделях стафилококкового сепсиса (St. aureus) и сальмонеллеза (S. typhimurium) у мышей.

Введение стандартной формы Риф в дозе 50 мг/кг и РИФ-ПБЦА в дозе 25 мг/кг обеспечивало излечение 90% и 100% животных, соответственно (Табл. 5). Снижение доз препаратов — рифампицина до 10 мг/кг и РИФ-ПБЦА до 5 мг/кг — приводило к излечению 50% животных. Таким образом, при лечении острого стафилококкового сепсиса наносомальная форма повысила эффективность Риф в 2 раза по сравнению со стандартной формой.

Таблица 5. Эффективность различных лекарственных форм рифампицина при

Препарат Доза, мг/кг Кол-во выживших животных* Суммарная продолжительность жизни, дни

Стафилококковый сепсис

Контроль - 0/10 10

Рифампицин 50 9/10 97

10 5/10 58

Рпф-ПБЦА 25 10/10 100

5 5/10 61

Салъмонеллез

Контроль - 0/10 63

Рифампицин 50 1/10 87

Риф-ПБЦА 25 8/10 136

5 5/10 115

* при стафилококковом сепсисе - на 10-е сутки, при сальмонеллезе — на 15-е сутки.

Влияние наносомальной формы было еще более значительным при ■химиотерапии сальмонеллеза. Стандартная лекарственная форма оказалась малоэффективной: даже введение очень высокой дозы - 50 мг/кг - защищала от гибели лишь 10% животных. РИФ-ПБЦА был значительно более эффективен: введение его в дозах 25 мг/кг и 5 мг/кг привело к выживанию 80% и 50% зараженных животных, соответственно. Таким образом, при сальмонеллезе

эффективность наносомальной формы рифампицина более чем в 10 раз превышала эффективность стандартного препарата.

3. РАЗРАБОТКА И ИССЛЕДОВАНИЕ НАНОСОМАЛЬНОЙ ФОРМЫ СТРЕПТОМИЦИНА

Аминогликозидный антибиотик стрептомицин активен в отношении большинства возбудителей опасных инфекционных заболеваний. Среди недостатков, снижающих эффективность стрептомицина при лечении острых инфекций, следует отметить медленное проникновение в клетку.

Задача настоящего исследования - получение наносомальной лекарственной формы стрептомицина на основе ПБЦА НЧ и изучение ее активности на модели септической инфекции.

3.1. Влияние технологических параметров на характеристики наносомальной формы стрептомицина. Для изучения влияния рН на свойства ПБЦА НЧ, содержащих стрептомицин, полимеризацию проводили в интервале рН от 1,4 до 3.

Синтез НЧ в присутствии стрептомицина позволяет достичь ~ 20% (1726%) сорбции стрептомицина; при этом степень сорбции практически не зависела от концентрации антибиотика, соотношения стрептомицин : мономер в диапазоне 1 : 3 - 1 : 10, а также от рН среды. Нагрузка стрептомицина возрастала по мере увеличения его исходной концентрации от 0,5 до 3 мг/мл; при этом значение рН практически не влияла на характер этой зависимости. В исследованном диапазоне концентраций стрептомицина насыщения полимерной матрицы не наблюдали. При снижении рН среды с 3 до 1.4 происходило укрупнение НЧ с 250 нм до 570 нм.

Невысокие значения степени сорбции стрептомицина по сравнению с рифампицином и доксорубицином, очевидно, объясняются его более высокой гидрофильностью по сравнению с этими антибиотиками.

3.2. Оценка эффективности наносомальной формы стрептомицина на модели острой септической инфекции. Эффективность наносомальной формы стрептомицина исследовали на модели острой септической инфекции, вызванной виутрибрюшинным введением вирулентного штамма Е. coli 0157.

Применение наносомальной формы стрептомицина привело к значительному повышению его эффективности при лечении септической инфекции по сравнению со стандартным препаратом (Рис. 35). Введение наносомальной формы в дозе 25 мг/кг через 4 ч после заражения обеспечило выживание 50% животных (5/10), в то время как в группе, получавшей

стандартную лекарственную форму, выжило лишь 20% животных (2/10). В группе животных, получивших эквивалентную дозу пустых НЧ (плацебо), выживаемость не отличалась от контрольной группы (на рисунке не показано).

Рис. 35. Выживаемость мышей, инфицированных Е. coli, после лечения различными формами стрептомицина

(1 х 25 мг/кг внутрибрюшинно) (п=10)

Полученные данные подтверждают концепцию о возможности повышения эффективности антибактериальной химиотерапии с помощью наносомальных препаратов. Действительно, значительное преимущество наносомального стрептомицина в данном эксперименте получено при содержании в наносомальной форме лишь 20% связанного антибиотика.

4. РАЗРАБОТКА И ИССЛЕДОВАНИЕ НАНОСОМАЛЬНОЙ ФОРМЫ МОКСИФЛОКСАЦИНА

Моксифлоксацин (Мокс), фторхинолоновый антибиотик с высокой активностью в отношении М. tuberculosis, обладает весьма благоприятными биологическими свойствами; биодоступность его достигает 86-92%, при этом Мокс эффективно проникает в клетки: равновесная внутриклеточная концентрация превышает экстраклеточную в 4 -10 раз.

Ставя своей целью разработать и изучить наносомальную форму этого антибиотика, мы полагали, что в совокупности с описанными выше результатами полученные данные помогут точнее определить влияние наночастиц на эффективность ЛВ с различной биодоступностью.

В задачи данного исследования входили: 1) разработка наносомальной формы Мокс на основе ПБЦА, 2) оценка активности наносомальной формы в отношении микобактерий, локализованных в макрофагах in vitro, 3) исследование активности наносомальной формы на модели экспериментального туберкулеза in vivo.

120 ■ 100 i 80 -6040 20 0 -

- Конт(»ль -СГР

-СТР-ГЕЦЬ

О 5 10

Дни после заражения

4.1. Влияние технологических параметров на характеристики наносомальной формы моксифлоксацина. ПБЦА НЧ получали методом анионной полимеризации в водной среде в присутствии Мокс, как описано выше. С целью оптимизации процесса получения наносомальной формы было изучено влияние рН полимеризационной среды и концентрации Мокс на степень сорбции и размер частиц.

-степень сорбции -

-средний размер НЧ

Рис. 36. Зависимость степени сорбции моксифлоксацина и размера наночастиц от рН

Макс . ,

¡С = ¡мг/мл п _ю/.

С""» ,Сщца-1%;

п = 3; Р = 0,95)

4.1.1. Выбор рН реакционной среды. Результаты изучения влияния рН полимеризационной среды на степень сорбции Мокс и размеры НЧ представлены на Рис. 36. Максимальная степень сорбции достигается при рН2, В интервале рН 1,5 - 2,5 образуются близкие по размеру НЧ (350 - 400 нм). При рН 3 размер НЧ уменьшается до ~250 нм.

0 12 3

Концентрация Мокс, мг/мл

Рис. 37. Влияние концентрации Мокс на степень сорбции и размеры НЧ (рН2; СпБид=1%; п = 3; р = 0,95)

0 12 3

Концентрация Мокс, мг/мл

Рис. 38. Зависимость сорбции и нагрузки Мокс на полимер от его концентрации (рН2; Спбна = 1%)

Рис. 39. Кинетика высвобождения моксифлоксацина из наночастиц (п = 3; р = 0,95)

4.1.2. Выбор концентрации моксифлоксацина. Влияние исходной концентрации Мокс на эффективность сорбции и размер НЧ изучали в диапазоне 0,25-2 мг/мл при рН2. Степень сорбции возрастает с уменьшением концентрации Мокс, достигая максимального значения при концентрации 0,25 мг/мл. При этом независимо от исходной концентрации Мокс, получают НЧ приблизительного одного размера (350 - 400 им) (Рис. 37). Максимальная сорбция достигается в интервале концентраций 0,25 - 0,5 мг/мл, однако нагрузка на полимер при концентрациях <1 мг/мл невысока (Рис. 38).

Таким образом, оптимальные параметры лекарственной формы (степень сорбции ~45% и нагрузка 50 мкг Мокс/мг ГОДА) достигаются при концентрации Мокс в полимеризационной среде 1 мг/мл.

4.1.3. Исследование кинетики выделения моксифлоксацина из наночастиц. Как видно из Рис. 39, около 55 % Мокс оказывается в водной фазе практически сразу после разбавления наносуспензии. Очевидно, в первые минуты опыта в водную фазу переходит несвязанный с НЧ Мокс, содержание котрого в наносомальной форме и составляет - 55%. В течение первых суток скорость выделения Мокс составила 37 мкг/сутки, в течение последующих суток - 12 мкг/сутки. При этом через 48 ч в НЧ остается около 26% Мокс.

4.2. Исследование наносомальной формы моксифлоксацина на культуре макрофагов ТНР-1. В первой серии экспериментов было показано, что связывание Мокс с НЧ значительно увеличивает его поступление в макрофаги (ТНР-1). В то время как концентрация свободного Мокс достигла максимального значения 125 мкг/мл через 5 мин, наносомальный Мокс продолжал накапливаться в клетках в течение часа, при этом его концентрация достигла 325 мкг/мл. Примечательно также, что наносомальный Мокс значительно дольше удерживался в клетках.

На следующем этапе оценивали активность наносомального Мокс в отношении М. tuberculosis, локализованных в макрофагах ТНР-1. Инфицированные макрофаги подвергали периодическому воздействию антибиотика. Как видно из Рис. 40, наносомальный Мокс проявил более высокую активность, чем свободный антибиотик, что коррелирует с более эффективным накоплением наночастиц в клетках.

Рис. 40. Активность наносомального моксифлоксацина (Mox-NP) в отношении внутриклеточных М tuberculosis.

Периодическое воздействие на макрофаги: зависимость величины бактерицидного эффекта от:

a) времени воздействия;

b) концентрации моксифлоксацина в среде (п = 3, р < 0.05 [*])

[ЮХН..9«)

о «¿.я-------Isa ШЛ

Контроль Мокс Мокс-НЧ

Рис. 41. Число колониеобразующих единиц (КОЕ) в легких мышей, инфицированных М. tuberculosis, после лечения стандартной (Мокс) и наносомальной (Мокс-НЧ) формами моксифлоксацина.

Режим лечения; в/в, 3x10 мг/кг в дни 4, 5 и 6 после заражения (п = 10; р = 0,95).

4.3. Эффективность наносомального моксифлоксацина при лечении экспериментального туберкулеза у мышей. Как видно из Рис. 41, число КОЕ в легких мышей, леченных наносомальным Мокс, уменьшилось в 2,2 раза по сравнению со стандартной лекарственной формой. Этот результат коррелирует с повышенной активностью Мокс-ПБЦА в отношении М. tuberculosis, найденной в опытах in vitro.

Заключение. Полученные результаты уточняют наши представления о сфере применения наночастиц как носителей ЛВ, а также свидетельствуют о высокой практической ценности этой технологии.

Так на примере доксорубицина показано, что способность наночастиц преодолевать ГЭБ не только позволяет расширить спектр действия этого известного препарата, но и открывает новые возможности для неинвазивной химиотерапии опухолей мозга. Впоследствии мы показали, что ПБЦА НЧ, модифицированное полисорбатом, доставляют в мозг не только низкомолекулярные вещества, но и белки, такие как, например, фактор роста нервов, что предполагает возможность применения этой технологии для лечения нейродегенеративных заболеваний.

Успех будущей наносомальной лекарственной формы зависит от множества факторов, наиболее важными из которых являются правильная постановка фармакологической задачи и выбор лекарственной субстанции. Последний, в свою очередь, определяется свойствами субстанции, как биологическими (особенности распределения в организме, фармакокинетические параметры, способность проникать в орган-мишень, клетки и пр.), так и технологическими (устойчивость в условиях образования наночастиц, достаточная растворимость, способность к сорбции и пр.). Важную роль играет также выбор носит еля.

Основой рационального дизайна наносомальных форм является показанная нами корреляция фармакокинетических и фармакодинамических параметров включенных в наночастицы лекарственных веществ, свидетельствующая также о том, что наночастицы не ограничивают биодоступность этих веществ. Так на примере доксорубицина и рифампицина хорошо видно, что, изменяя состав наночастиц, можно в значительной степени контролировать/оптимизировать биораспределение и эффективность наносомальных форм. Действительно, наносомальная форма позволяет повысить эффективность рифампицина при лечении туберкулеза путем оптимизации его биораспределения и повышения концентрации в легких, печени и селезенке. При этом обнаружена корреляция между концентрацией антибиотика в легких и антибактериальным эффектом.

Примечательно, что наносомальная форма обеспечивает двукратное повышение эффективности антибактериальных антибиотиков при лечении экспериментального туберкулеза и в том случае, когда эти антибиотики, как рифампицин и моксифлоксацин, быстро и хорошо проникают в клетки. Данные, полученные при оценке эффективности наносомальных форм рифампицина на моделях септических инфекций и сальмонеллеза, также

свидетельствуют об эффективности химиотерапии острых инфекций с помощью наносомальных препаратов.

ВЫВОДЫ

1. Разработана технология получения наносомальной формы доксорубицина на основе ПБЦА НЧ. Изучено влияние условий полимеризации на свойства НЧ.

2. ПБЦА НЧ, модифицированные полисорбатом 80, являются эффективным средством доставки доксорубицина в мозг при внутривенном введении. НЧ доставляют в мозг ~1% дозы введенной дозы, то есть проникают в мозг так, как если бы он не был защищен ГЭБ.

3. Наносомальная форма доксорубицина оказывает выраженное противоопухолевое действие на интракраниальную глиобластому у крыс, тогда как его стандартная лекарственная форма малоэффективна. Выявлено влияние состава наносомальной формы на фармакологический эффект.

3. Модификация ПБЦА НЧ полоксамером 188 позволяет при внутривенном введении доставить в мозг терапевтически эффективные концентрации ЛВ, поступление которых в мозг ограничивается ГЭБ.

4. Найденная корреляция между профилями сорбции белков и фармакологическим эффектом наносомальных форм доксорубицина предполагает, что проникновение в мозг ПБЦА НЧ, модифицированных полоксамером 188 или полисорбатом 80, происходит при участии аполипопротеина A-I, который эти частицы адсорбируют при введении в кровь.

5. Показано, что наносомальная форма доксорубицина на основе ПБЦА НЧ обладает радиационной устойчивостью, то есть может быть стерилизована радиационными методами. Определена стерилизующая доза 15 кГр.

6. Разработана технология получения наносомальных форм рифампицина на основе наночастиц ПБЦА и полилактидов. Кинетика выделения рифампицина из наночастиц зависит от структуры полимера.

7. Показано, что легкие не накапливают изученные НЧ с рифампицином. При этом концентрации наносомальных форм в легких зависят от градиента концентраций между кровью и легкими.

8. Модификация ПБЦА НЧ полоксамером 407 приводит к повышению концентрации связанного с НЧ рифампицина в легких. Показано, что шгаяние полоксамера 407 на распределение НЧ зависит от структуры полимера.

9. Включение рифампицина и моксифлоксацина в НЧ приводит к повышению их эффективности при лечении экспериментального туберкулеза по сравнению со стандартными лекарственными формами

10. Включение рифампицина и стрептомицина в НЧ приводит к повышению их эффективности при лечении острых бактериальных инфекций по сравнению со стандартными лекарственными формами.

11. Включение в ПБЦА НЧ нерастворимых в воде субстанций позволяет значительно повысить их содержание в водной фазе.

12. Использование исключительно фармацевтических ингредиентов, мягкие условия получения, позволяющие сохранять структуру биологически активных веществ, емкость, стабильность и возможность стерилизации предопределяют технологичность лекарственных форм на основе полибутилцианоакрилатных и полилактидных наночастиц.

Автор выражает искреннюю признательность проф. Й. Кройтеру (Университет им. Гёте, Франкфурт/Майн, Германия) и проф. Л.Б. Хейфецу (Еврейский медицинский исследовательский центр, Денвер, США), оказавшим неоценимую поддержку при выполнении работы и получении грантов INTAS, DFG и BII, благодаря которым работу удалось успешно завершить.

Автор сердечно благодарит к.б.н. A.C. Халанского, к.х.н. О.М. Максименко, к.х.н. Л.В. Ванчугову, к.х.н. Е.В. Шипуло, к.б.н. И.И. Любимова, д.м.н. Э.Р. Переверзеву, к.м.н. И.Д. Трещалина и А.П. Будько за высокопрофессиональное содействие в процессе выполнения работы и ценные советы при ее написании.

Публикации по теме диссертации

1. Парамонов Д.В., Антонова Е.А., Жарова Н.Г., Гельперина С.Э., Столбова Г.А., Васин В.Б., Васильев А.Е., Трофимов В.И. О радиационной устойчивости лекарственной формы ампициллина на основе полиалкилцианоакрилатных наночастиц. //Хим.-фарм. ж. -1996. - Т.30. - С.42-45.

2. Gulyaev А.Е., Gelperina S.E., Skidan I.N., Antropov A.S., Kivman G.Ya., Kreuter J. Significant transport of doxorubicin into the brain with Ps 80-coated nanoparticles. //Pharm. Res. - 1999. - V. 16. - P. 1564-1569.

3. Гельперина С.Э., Гуляев A.E., Иванов A.A., Пальцев М.А., Северин Е.С., Северин С.Е., Скидан И.Н. Композиция для лечения легочных инфекций. Патент РФ №2185818, приоритет от 10.07.2001

4. Скидан И.Н., Бобрускин А.И., Гуляев А.Е., Шалхарбаева С.Д., Северин С.Е., Штайнигер С., Кройтер Й., Гельперина С.Э. Оптимизация фармакокинетики препарата «Фотосенс» с помощью биодеградируемых наночастиц. //Антибиотики и химиотерапия. - 2001. - Т.46, №4. - С. 6-10.

5. Gelperina S., Khalansky A.S, Skidan I.N., Smirnova Z.S., Bobruskin A.I., Severin

5.E., Turowski В., Zanella F.E., Kreuter J. Toxicological studies of doxorubicin bound to polysorbate 80-coated poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles in healthy rats and rats with intracranial glioblastoma. //Toxicol. Lett. - 2002. - V.126, No 2. - P.131-141.

6. Скидан И., Гельперина С., Северин С., Гуляев А. Повышение антибактериальной активности рифампицина в отношении внутриклеточных инфекций с помощью биодеградируемых наночастиц. // Антибиотики и химиотерапия - 2003. - Т.48, №1. - С.23-26.

7. Kreuter J., Ramge P., Petrov V., Hamm S., Gelperina S., Engelhardt В., Alyautdin R., von Briesen H., Begley D.J. Direct evidence that polysorbate-80-coated poly(butylcyanoacrylate) nanoparticles deliver drugs to the CNS via specific mechanisms requiring prior binding of drug to the nanoparticles. //Pharm. Res, — 2003. -V.20, No3. -P.409-416.

8. Гельперина С.Э., Смирнова 3.C., Халанский A.C.,. Скидан И.Н, Северин С.Е., Кройтер И. Исследование наносомальной лекарственной формы доксорубицина. // Рос, биотерапевт, ж. - 2004. - Т.З. - С. 56-64

9. Гельперина С.Э., Оганесян Е.А., Свешников П.Г., Северин Е.С., Хейфец Л.Б. Применение наносомальных лекарственных форм для лечения внутриклеточных инфекций. //Ремедиум. - 2004. - Т.12. - С.43-44

lO.Steiniger S., Kreuter J., Khalansky A., Skidan I., Bobruskin A., Smirnova Z., Severin S., Uhl R., Kock M., Geiger K., Gelperina S. Chemotherapy of glioblastoma in rats using doxorubicin-loaded nanoparticles.//Int. J. Cancer. - 2004. - V.109.- P.159-167. П.Ванчугова Л.В., Максименко O.O., Шипуло E.B., Любимов И.И., Стукалов Ю.В., Свешников П.Г., Бикетов С.Ф., Хейфец Л.Б., Гельперина С.Э. Разработка наносомальной формы стрептомицина и изучение ее активности на модели септической инфекции мышей. //Антибиотики и химиотерапия. - 2005.- Т.50. - С. 13-19.

12.Оганесян Е.А., Будько А.П., Максименко О.О., Стукалов Ю.В., Любимов И.И.. Бикетов С.Ф., Свешников П.Г., Хейфец Л.Б., Гельперина С.Э. Разработка и изучение наносомальной лекарственной формы рифампицина. //Антибиотики и химиотерапия. - 2005. - Т.50.- С. 15-19.

13.Gelperina S., Kisich К., Iseman M.D., Heifets L. The potential advantages of nanoparticle drug delivery systems in chemotherapy of tuberculosis. Am. J. Respir. Crit. Care Med. //2005. - V. 172, Nol2. - P. 1487-1490.

14.Gelperina S. Brain delivery by nanoparticles. In: Nanoparticle Technology for Drug Delivery. Ed. Gupta R, KompellaU: Taylor & Francis, NY, US, 2006,273-318.

15.Басел A.A., Петров B.E., Балабаньян В.Ю., Гельперина С.Э., Трофимов С.С., Воронина Т. А., Аляутдин Р.Н. Транспорт прозерина в головной мозг при помощи поли(бутил)цианоакридатных наночастиц, покрытых полисорбатом. //Рос. мед. ж. - 2006. - Т.4. - С.28-32.

16.Северин Е.С., Свешников П.Г., Гельперина С.Э., Максименко О.О., Шипуло Е.В., Ванчугова Л.В. Антибактериальное средство для лечения внутриклеточных инфекций. Патент РФ № 2308970, приоритет- от 10.03.2006

17.Ambruosi A., Khalansky A.S., Yamamoto H., Gelperina S.E., Begley D.J., Kreuter J. Biodistribution of polysorbate 80-coated doxorubicin-loaded [I4C]-poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles after intravenous administration to glioblastoma-bearing rats. //J. Drug Target. - 2006. - V.14, No2. - P.97-105.

18.Gelperina S. Nanocarriers and drug deliveiy. In: Regional Cancer Chemotherapy. Eds. Schlag P.M., Stein U. Humana Press, USA, 2007, 163-180.

19.Kisich K.O., Gelperina S., Higgins M.P., Wilson S., Shipulo E., Oganesyan E., Heifets L. Encapsulation of moxifloxacin within poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles enhances efficacy against intracellular Mycobacterium tuberculosis. //Int. J. Pharm. -2007. - V.345, No 1-2. - P.154-162.

20.Kreuter J., Hekmatara Т., Dreis S., Vogel Т., Gelperina S., Langer К. Covalent attachment of apolipoprotein A-I and apolipoprotein B-100 to albumin nanoparticles enables drug transport into the brain.//J. Control. Release. - 2007. V. 118, Nol - P.54-58.

21.Petri В., Bootz A., Khalansky A., Hekmatara Т., Müller R„ Uhl R., Kreuter J., Gelperina S. Chemotherapy of brain tumour using doxorubicin bound to surfactant-coated poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles: revisiting the role of surfactants. //J. Control. Release. - 2007. - V.l 17, No 1. - P.51-58.

22.Pereverzeva E., Treschalin I., Bodyagin D., Maksimenko O., Langer К., Dreis S., Asmussen В., Kreuter J., Gelperina S. Influence of the formulation on the tolerance profile of nanoparticle-bound doxorubicin in healthy rats: focus on cardio- and testicular toxicity. //Int. J. Pharm. - 2007. - V.337, Nol-2. - P.346-356.

23. Kreuter J., Gelperina S. Use of nanoparticles for cerebral cancer. //Tumori. - 2008. -V.94, No2. -P.271-277.

24.Maksimenko O., Pavlov E., Toushov E., Molin A., Stukalov Y., Prudskova Т., Feldman V., Kreuter J., Gelperina S. Radiation sterilisation of doxorubicin bound to poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles. //Int. J. Pharm. -2008. - V.356.- 325-332.

25.Pereverzeva E., Treschalin I., Bodyagin D., Maksimenko O., Kreuter J., Gelperina S. Intravenous tolerance of a nanoparticle-based formulation of doxorubicin in healthy rats. //Toxicol. Lett. - 2008. - V.178, Nol. - P. 9-19.

26.Максименко O.O., Павлов Е.П., Тушов Э.Г., Молин A.A., Стукалов Ю.В., Прудскова Т.Н., Кройтер Й., Гельперина С.Э. Радиационная стерилизация лекарственной формы доксорубицина на основе полибутилцианоакрилатных наночастиц. //Хим.-фарм. ж. - 2008. - Т. 6. - С.52-56.

27.Трещалин И.Д., Переверзева Э.Р., Бодягин Д.А., Трещалин М.И., Максименко 0.0, Кройтер Й., Гельперина С.Э. Сравнительное экспериментальное токсикологическое исследование доксорубицина и его наиосомальных лекарственных форм. //Рос. биотерапевт, ж. - 2008. - Т. 7. №3. С. 24-33.

28.Шипуло Е.В., Любимов И.И., Максименко О.О., Ванчугова Л.В., Оганесян Е.А., Свешников П.Г., Бикетов С.Ф., Северин Е.С., Хейфец Л.Б., Гельперина С.Э. Получение и исследование наносомальной формы моксифлоксацина на основе полибутилцианоакрилата. //Хим.-фарм. ж. - 2008. - Т.42. - С.43-47.

29.Hekmatara Т., Gclperina S., Vogel V., Yang Sh-R., Kreuter J. Encapsulation of water-insoluble drugs in poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles. J. Nanosci. Nanotechnol. //2009. - V.9. - P.5091-5098.

30.Гельперина С.Э., Швец В.И. Системы доставки лекарственных веществ на основе полимерных наночастиц. //Биотехнология. - 2009. - Т.З. - С. 8-23.

31.Hekmatara Т., Bernreuther С., Khalansky A., Theisen A., Weissenberger J., Matschke J., Gelperina S., Kreuter J., Glatzel M. Efficient systemic therapy of rat glioblastoma by nanoparticle-bound doxorubicin is due to antiangiogenic effects. // Clin. Neuropathol. - 2009. - V.28. - P.153-164.

32.Wohlfart S., Bernreuther C., Khalansky A.S., Theisen A., Weissenberger J., Gelperina S., Glatzel M., Kreuter J. Increased numbers of injections of doxorubicin bound to nanoparticles lead to enhanced efficacy against rat glioblastoma 101/8. // J Nanoneuroscience. - 2009. - V.l. - P.144 - 151.

33.Гельперина С.Э., Максименко O.O., Ванчугова Jl.В., Шипуло Е.В., Шандрюк Г.А., Бондаренко Г.Н., Швец В.И. Влияние технологических параметров на физико-химические свойства полилактидных наночастиц, содержащих рифампицин. //Хим.-фарм. ж. в печати

Заказ № 11_Объём 3,0 п.л._Тираж 100 экз.

Издательский центр РХТУ им. Д.И.Менделеева

Содержание диссертации, доктора химических наук, Гельперина, Светлана Эммануиловна

Список основных сокращений.

Введение.

1. Обзор литературы. Коллоидные системы доставки лекарственных веществ на основе полимерных наночастиц.

1.1. Технология.

1.2. Распределение наночастиц в организме.

1.3. Распределение наночастиц в условиях патологии: эффект EPR.

1.4. Химиотерапия экспериментальных опухолей.

1.5. Активный транспорт с помощью наночастиц.

1.6. Лечение экспериментальных внутриклеточных инфекций.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка подходов к созданию лекарственных форм антибиотиков на основе полимерных наночастиц"

2.1. Состояние проблемы и актуальность. .39

2.2. Разработка наносомальной формы доксорубицина на основе полибутилцианоакрилата.45

2.2.1. Устойчивость доксорубицина в условиях получения наночастиц. .47

2.2.2. Влияние технологических параметров на характеристики наносомальной формы доксорубицина.49

2.3. Исследование биораспределения наносомальной формы доксорубицина.56

2.3.1. Биораспределение наносомального доксорубицина.55

2.3.2. Биораспределение [14С]-полибутилцианоакрилатных наночастиц.64

2.4. Изучение противоопухолевой активности наносомальных форм доксорубицина в отношении интракраниальной глиобластомы 101/8 у крыс.73

2.5. Влияние технологических параметров на противоопухолевую активность наносомальных форм доксорубицина.79

2.6. Углубленные исследования противоопухолевой активности наносомального доксорубицина в отношении глиобластомы 101/8.87

2.7. Токсикологическое исследование наносомальной формы доксорубицина.93

2.7.1. Исследование острой токсичности.93

2.7.1.1. Ненагруженные ПБЦА наночастицы (плацебо).94

2.7.1.2. Наносомальные формы доксорубицина.97

2.7.2. Исследование субхронической токсичности.100

2.7.3. Заключение.120

2.8. Исследование механизма доставки лекарственных веществ в мозг 122 с помощью наночастиц.

2.9. Радиационная стерилизация наносомальной формы доксорубицина.144

2.10. Заключение.155

3. Разработка и исследование наносомальных форм рифампицина.159

3.1. Состояние проблемы и актуальность.159

3.2. Влияние технологических параметров на физико-химические свойства полимерных наночастиц, содержащих рифампицин.161

3.2.1. Полибутилцианоакрилатные наночастицы.161

3.2.2. Полилактидные наночастицы.165

3.2.3. Исследование кинетики высвобождения рифампицина из наночастиц.173

3.3. Влияние состава наносомальной формы рифампицина на его биораспределение.177

3.3.1. Внутривенное введение.177

3.3.1.1. Наносомальная форма на основе 177 полибутилцианоакрилатных наночастиц.

3.3.1.2. Наносомальные формы на основе полилактидов.181

3.3.1.3. Оптимизация биораспределения наносомальных форм 187 рифампицина при внутривенном введении.

3.3.2. Пероральное введение.199

3.3.3. Подкожное введение.205

3.4. Активность наносомальной формы рифампицина в отношении внутриклеточных бактерий in vitro.208

3.5. Оценка эффективности наносомальных форм рифампицина на модели экспериментального туберкулеза у мышей.209

3.5.1. Внутривенное введение.210

3.5.1.1. Полибутилцианоакрилатные наночастицы.211

3.5.1.2. Наночастицы на основе полилактидов.215

3.5.2. Пероральное и подкожное введение.217

3.6. Оценка эффективности наносомальной формы рифампицина при лечении острых бактериальных инфекций.218

3.7. Заключение.220

4. Разработка и исследование наносомальных форм стрептомицина.223

4.1. Влияние технологических параметров на характеристики наносомальной формы стрептомицина.223

4.2. Оценка эффективности наносомальной формы стрептомицина на модели острой септической инфекции.231

5. Разработка и исследование наносомальной формы моксифлоксацина.231

5.1. Влияние технологических параметров на характеристики наносомальной формы моксифлоксацина.233

5.2. Исследование наносомальной формы моксифлоксацина на культуре макрофагов ТНР-1.238

5.2.1. Оценка цитотоксического действия наночастиц.239

5.2.2. Кинетика накопления моксифлоксацина в макрофагах.240

5.2.3. Оценка активности наносомального моксифлоксацина в отношении

М. tuberculosis, локализованных в макрофагах ТНР-1.243

5.3. Эффективность наносомального моксифлоксацина при лечении экспериментального туберкулеза у мышей.247

6. Материалы и методы.250

6.1. Получение наносомальной формы доксорубицина.250

6.2. Исследование биораспределения наносомальной формы доксорубицина.253

6.3. Исследование биораспределення [14С]-полибутилцианоакрилатных наночастиц.254

6.4. Экспериментальная модель опухоли мозга.255

6.5. Оценка проницаемости гематоэнцефалического барьера у крыс с интракраниально имплантированной глиобластомой 101/8.256

6.6. Оценка противоопухолевой активности на модели интракраниальной глиобластомы 101/8 у крыс.256

6.7. Оценка острой токсичности наносомальной формы доксорубицина.257

6.8. Оценка субхронической токсичности наносомальной формы доксорубицина.257

6.9. Определение белков плазмы, адсорбированных на поверхности ПБЦА наночастиц методом двухмерного электрофореза в полиакриламидном геле (2-D PAGE).262

6.10. Радиационная стерилизация наносомальной формы доксорубицина на основе ПБЦА наночастиц.263

6.11. Получение наносомальной формы рифампицина на основе полибутшшианоакрилата.267

6.12. Получение наносомальной формы рифампицина на основе полилактидов.268

6.13. Биораспределение наносомального рифампицина.271

6.14. Определение активности наносомальной формы рифампицина в отношении внутриклеточных бактерий in vitro.273

6.15. Определение накопления наносомальной формы рифампицина в легочных макрофагах кролика. 274

6.16. Исследование антибактериального эффекта наносомального рифампицина на модели экспериментального туберкулеза у мышей. 275

6.17. Оценка эффективности наносомальной формы рифампицина при лечении острых бактериальных инфекций. 276

6.18. Получение наносомальной формы стрептомицина. 277

6.19. Оценка эффективности наносомальной формы стрептомицина на модели септической инфекции у мышей. 278

6.20. Получение наносомальной формы моксифлоксацина. 278

6.21. Исследование антибактериального эффекта наносомального моксифлоксацина на модели экспериментального туберкулеза у мышей. 280

Выводы. 281

Список литературы. 282

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ГЭБ гематоэнцефалический барьер

Доке доксорубицин

Докс-ПБЦА доксорубицин, включенный в наночастицы из полибутилцианоакрилата Докс-ПБЦА+Пс доксорубицин, включенный в наночастицы из полибутилцианоакрилата, модифицированные полисорбатом 80 ЛВ лекарственное вещество

МОКС моксифлоксацин

НЧ наночастицы

ПАВ поверхностно-активное вещество

ПБЦА полибутилцианоакрилат

ПВС поливиниловый спирт

ПС полисорбат 80

РИФ рифампицин

РИФ-ПБЦА рифампицин, включенный в наночастицы из полибутилцианоакрилата РИФ-ПБЦА-407 рифампицин, включенный в наночастицы из полибутилцианоакрилата, модифицированные полоксамером 407 РИФ-ПБЦА-908 рифампицин, включенный в наночастицы из полибутилцианоакрилата, модифицированные полоксамином 908 СМФ система мононуклеарных фагоцитов

СТР стрептомицин

СТР-ПБЦА стрептомицин, включенный в наночастицы из полибутилцианоакрилата ЦНС центральная нервная система

ЧСА человеческий сывороточный альбумин

AUC интегральный показатель площади под фармакокинетической кривой EPR эффект повышенной проницаемости и удерживания

F68 Pluronic F68

HSA человеческий сывороточный альбумин

Р188 полоксамер 188

Р407 полоксамер 407

Р908 полоксамин 908

PVA поливиниловый спирт

Rif-PLGA/PVA рифампицин, включенный в полилактидные наночастицы, стабилизированные поливиниловым спиртом

Rif-PLGA/HSA рифампицин, включенный в полилактидные наночастицы, стабилизированные человеческим сывороточным альбумином VEGF эндотелиальный фактор роста сосудов

ВВЕДЕНИЕ

Современная медицина располагает арсеналом мощных лекарственных средств, однако результаты лечения часто остаются неудовлетворительными. Среди факторов, снижающих эффективность химиотерапии, следует отметить недостаточную селективность действия лекарств: при введении лекарственного вещества (ЛВ) в организм происходит его неконтролируемое распределение по органам и тканям, при этом концентрации в очаге патологии не достигают терапевтического уровня. Причинами неэффективной доставки ЛВ могут быть трудности при проникновении в орган-мишень из-за наличия гистогематических барьеров, таких как, например, гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), или структурных изменений ткани (например, в случае роста опухоли), а также неспособность проникать в клетки ввиду физико-химических свойств ЛВ или особенностей клеточной мембраны (например, в случае множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток). Кроме того, неблагоприятными факторами являются низкая биодоступность ЛВ вследствие их недостаточной растворимости или быстрой инактивации и, наконец, неблагоприятная фармакокинетика.

Тривиальным способом преодолеть эти препятствия и повысить эффективность лечения является увеличение дозы ЛВ. При этом терапевтический эффект часто достигается ценой повышения неспецифической токсичности. Проблема приобретает особую остроту в случае сильнодействующих ЛВ, таких как, например, противоопухолевые агенты и антибиотики, применение которых сопряжено с побочными эффектами, выраженными настолько, что они значительно снижают терапевтическую ценность этих препаратов.

Другим подходом к решению этой проблемы является создание принципиально новых препаратов, отличающихся более высокой селективностью. Актуальность этой проблемы послужила стимулом для разработки подходов к созданию разнообразных систем направленной доставки ЛВ. Особый интерес среди таких систем представляют полимерные наночастицы (НЧ), то есть частицы размером от 10 до 1000 нм, сочетающие такие важные для носителей качества, как стабильность и высокая емкость в отношении широкого спектра ЛВ.

К настоящему времени можно считать доказанным, что включение в НЧ может существенно изменять профиль распределения ЛВ в организме, и накоплен значительный опыт по разработке и исследованию наносомальных форм различных ЛВ. Однако некоторые аспекты этой технологии изучены недостаточно. Так, несмотря на очевидную целесообразность использования НЧ для доставки антибиотиков, систематические исследования в этой области не проводились. Транспорт НЧ через наименее проницаемый из гистогематических барьеров - гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) к началу данного исследования также оставался практически неизученным.

Несмотря на обширный опыт по созданию наносомальных форм различных JIB, подходы к созданию таких форм недостаточно систематизированы и остаются, как правило, эмпирическими, видимо, вследствие разнообразия фармакологических задач и применяемых материалов. В связи с этим разработка наносомальной формы каждого конкретного JIB требует длительной и трудоемкой экспериментальной работы.

Цель работы состояла в выявлении закономерностей, определяющих способность полимерных НЧ влиять на фармакологическое действие различных антибиотиков. В частности, представлялось необходимым изучить влияние состава наносомальных форм на параметры биораспределения антибиотиков. Преодоление ГЭБ является важнейшей проблемой химиотерапии; в связи с этим одна из наиболее существенных задач состояла в изучении возможности использования полибутилцианоакрилатных (ПБЦА) НЧ для доставки противоопухолевого антибиотика доксорубицина через ГЭБ в мозг и оценке эффективности наносомальной формы доксорубицина на модели интракраниальной глиобластомы. Наконец, для достижения цели исследования необходимо было изучить влияние наносомальной формы на активность антибактериальных антибиотиков в отношении экспериментальных инфекций, в том числе туберкулеза.

Работа выполнена при участии НИИ морфологии человека РАМН (Москва), НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф, Гаузе РАМН (Москва), ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии (Оболенск), Всероссийского научного центра молекулярной диагностики и лечения (Москва), Еврейского медицинского и исследовательского центра (Денвер, США) и Института фармацевтической технологии Университета им. Гёте (Франкфурт-на-Майне, Германия).

Исследования выполнены при поддержке гранта №2440 по программе БиоПромышленная Инициатива (BII) Государственного Департамента США, грантов Международной ассоциации по содействию сотрудничеству с учеными из Новых независимых государств бывшего Советского Союза

INTAS) M» 94-310 и 00-838 и грантов Немецкого научно-исследовательского сообщества (DFG).

Работа также является частью научных исследований, проводимых на кафедре биотехнологии и бионанотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М,В. Ломоносова по госконтракту с Роснаукой № 02.512.11.2328 «Разработка субмикронных носителей и новых лекарственных форм биологически активных субстанций таргетного действия для терапии распространенных болезней человека (онкология, внутриклеточные инфекции)», в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы».

Автор выражает глубокую признательность проф. Й. Кройтеру (Университет им. Гёте, Франкфурт-на-Майне, Германия) и проф. Л.Б. Хейфецу (Еврейский медицинский исследовательский центр, Денвер, США), оказавшим неоценимую поддержку при выполнении работы и получении грантов INTAS, DFG и BII, благодаря которым работу удалось успешно завершить.

Автор также сердечно благодарит к.б.н. A.C. Халанского, к.х.н. О.М. Максименко, к.х.н. Л.В. Ванчугову, к.х.н. Е.В. Шипуло, к.б.н. И.И. Любимова, д.м.н. Э.Р. Переверзеву, к.м.н. И.Д. Трещалина и А.П. Будько за высокопрофессиональное содействие в процессе выполнения работы и ценные советы при ее написании.

1. Обзор литературы. Системы доставки лекарственных веществ на основе полимерных наночастиц

Впервые концепцию направленной доставки JIB сформулировал еще Пауль Эрлих, мечтавший о лекарстве, которое при введении в организм находит орган-мишень как «волшебная пуля». Наряду с прогрессом физических и химических наук актуальность этой проблемы послужила стимулом для разработки подходов к созданию разнообразных систем направленной доставки JIB.

Такие системы можно разделить на две основные группы: конъюгаты JIB с макромолекулярным носителем и коллоидные системы, некоторые типы которых приведены в Табл. 1.1. Размер всех коллоидных носителей составляет менее одного микрона, то есть, в соответствии с определением Энциклопедии фармацевтической технологии [1], все эти носители являются объектами нанотехнологии. Как правило, для терапевтических целей применяют носители размером 100 - 500 нм.

Самым известным представителем коллоидных носителей являются липосомы [2,3]. Среди альтернативных носителей наибольший интерес представляют полимерные НЧ. Эту технологию, зародившуюся еще в начале 70-х годов [4], отличает гибкость, обусловленная разнообразием полимеров, применяемых для получения НЧ.

В настоящем обзоре рассмотрены наиболее важные аспекты направленной доставки JIB с помощью НЧ и приведены примеры успешного применения этой технологии. Применение НЧ в диагностических целях выходит за рамки данного обзора.

Таблица 1.1. Типы коллоидных систем, используемых для доставки ЛВ

Тип Типичные размеры, нм Характеристика

Липосомы 100—200 Капсулы, внешняя мембрана которых состоит из природных фосфолипидов; активный ингредиент растворен во внутренней водной фазе или в липидной мембране

Полимерные наночастицы 100—500 Твердые частицы из полимеров (природных или синтетических); активный ингредиент распределен (растворен) в твердой фазе и/или адсорбирован на поверхности

Липидные наночастицы 100—500 Частицы из твердых липидов; активный ингредиент распределен (растворен) в твердой фазе и адсорбирован на поверхности

Полимерные нанокапсулы 100—300 Капсулы с внутренней масляной фазой, внешняя оболочка состоит из биодеградируемых полимеров; активный ингредиент растворен во внутренней фазе

Наногели 50—250 Частицы из гидрофильного геля, состоящего из поперечно-сшитых полимеров (например, система ПЭГ - полиэтиленимин или полисахариды)

Полимерные мицеллы 20—150 Самоорганизующиеся мицеллы из блок-сополимеров типа А-В или А-В-А; активный ингредиент солюбилизирован или ковалентно связан с полимером

Полиплексы /липоплексы 50—150 Комплексы ДНК с поликатионами или положительно заряженными липидами

Дендримеры 5—10 Сверхразветвленные полимеры, макромолекулы которых имеют сферическую форму; активный ингредиент иммобилизован во внутренних полостях макромолекул

Нано-кристаллы 100—500 Кристаллическая форма активного ингредиента; кристаллы стабилизированы поверхностно-активным веществом

1.1. Технология

Итак, полимерные НЧ представляют собой твердые частицы размером от 10 до 1000 нм, состоящие из полимеров как природного (например, альбумин, хитозан, альгинат), так и синтетического (например, полилактиды, полиакрилаты и пр.) происхождения и содержащие активный ингредиент, который может быть инкапсулирован, адсорбирован или присоединен ковалентной связью [1]. Данное определение распространяется также на нанокапсулы, состоящие из полимерной оболочки, внутри которой находится масляная фаза.

СНЭ(Н) СН3 I

-С - С - С I

СОО-А1ку1 Я а

С— сн3 о

I II -0-СН—сб

СНз

Р1А О

РЕС в

О II

-о-сн2—с т

-о—сн-со о—(сн,)—с

Г д

Рис. 1.1. Химическая структура некоторых полимеров, применяемых для получения наночастиц: а) полиметакрилаты (К- = СООСН3, СООС4Н9, СООСН2СН2^(СНз)зСГ, СООСН2СН2М+(СНз)2; б) гомополимер молочной кислоты (РЬА); в) гомополимер молочной кислоты, модифицированный полиэтиленгликолем (РЕС-РЬА); г) сополимер молочной и гликолевой кислот (РЬвА); д) поли-е-капролактон.

Как правило, НЧ получают из готовых полимеров путем эмульгирования или осаждения. Так, например, получают НЧ из полилаьсгидов, полиакрилатов и поли-е-капролактона [5,6]; структуры этих полимеров приведены на Рис. 1.1. ЛВ включается в частицу в процессе ее формирования и, в зависимости от физико-химических свойств (растворимости), может присутствовать в органической или водной фазе. НЧ из полиакрилатов можно получать также полимеризацией соответствующих мономеров в водной фазе; при этом наиболее эффективная сорбция достигается, когда J1B присутствует в полимеризационной среде [7].

Помимо упомянутых выше стабильности и высокой емкости, к технологическим достоинствам НЧ следует отнести их способность связывать как гидрофильные, так и гидрофобные вещества, а также пригодность для разнообразных путей введения в организм, в том числе для перорального и ингаляционного. При получении НЧ, предназначенных для парентеральных путей введения, используют только биодеградируемые полимеры.

При введении в организм JIB высвобождается из НЧ путем диффузии и/или десорбции. Выделению веществ также способствуют набухание полимерной матрицы, ее эрозия и деградация. Поскольку скорость деградации полимеров, используемых для получения НЧ, варьирует в широких пределах — от нескольких часов (полиалкилцианоакрилаты, ПАЦА) до нескольких месяцев (полилактиды) — применение наносомальной формы позволяет достигать контролируемого (в том числе пролонгированного) выделения активного ингредиента. Таким образом, выбор полимера-носителя является одним из ключевых факторов этой технологии, в значительной степени определяющим такие важные параметры наносомальной формы, как эффективность включения активного ингредиента и скорость его выделения, свойства поверхности, скорость биодеградации и, в конечном счете, параметры биораспределения и терапевтическую эффективность такой формы.

В частности, целесообразность применения ПАЦА для получения НФ обусловлена, прежде всего, их низкой токсичностью и биосовместимостью. Алкилцианоакрилаты, применяемые для получения этих НЧ, широко используют в медицине в качестве хирургических клеев, таких как Indennil® (2-п-бутилцианоакрилат, Henkel, Germany), Trufill® (2-п-бутилцианоакрилат, Cordis Neurovascular Inc., U.S), Dermabond® (2-п-октилцианоакрилат, Ethicon Inc., Johnson & Johnson, U.S.) и др. В процессе получения НЧ образуются низкомолекулярные полимеры (3000 - 4000 Да), которые в организме подвергаются быстрой деградации в результате ферментативного гидролиза; продукты деградации (полицианоакриловая кислота и соответствующий спирт) выводятся из организма в течение нескольких суток (Рис. 1.2) [7, 8].

Таблица 1.2.

Сравнительные характеристики полилактидов и полиалкилцианоакрилатов

Полимеры Достоинства Недостатки

Полиалкилциано- акрилаты (РАСА) Простота получения Низкая токсичность Экономичность Быстрая биодеградация Низкая молекулярная масса (2-4 кДа) обеспечивает полное и быстрое выведение полимера из организма Неэффективная сорбция высоко гидрофобных и высоко гидрофильных соединений Быстрая биодеградация

Гомополимеры молочной кислоты (РЬА) и сополимеры молочной и гликолевой кислот (РЬвА) Гибкая технология: Широкий выбор полимеров фармацевтического назначения Возможность регулировать скорость биодеградации и гидрофобность Возможность сорбции гидрофобных и гидрофильных соединений Низкая токсичность и биосовместимость Наличие лекарственных препаратов на основе РЬА/РЬвА Многоступенчатый процесс получения, сложное аппаратурное оформление

Инициация полимеризации ионами ОН"*

Рост цепи внутрь фазы мономера

Терминация растущих цепей протонами водной фазы

Выделение олигомеров в отдельную фазу. Солюбилизация мономера этой фазой

С-» Кг-шдщмп

Инициирование Рост цепи Установление равновесной Терминация

ММ олигомера

Рис. 1.2. Превращения растущей цепи полиалкилцианоакрилатов [8]).

Сравнительные характеристики полилактидов и полиалкил-цианоакрилатов с точки зрения целесообразности их применения для получения наночастиц - носителей JIB приведены в Табл. 1.2.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Гельперина, Светлана Эммануиловна

выводы

3. Модификация ПБЦА НЧ полоксамером 188 позволяет при внутривенном введении доставить в мозг терапевтически эффективные концентрации JIB, поступление которых в мозг ограничивается ГЭБ.

8. Модификация ПБЦА НЧ полоксамером 407 приводит к повышению концентрации связанного с НЧ рифампицина в легких. Показано, что влияние полоксамера 407 на распределение НЧ зависит от структуры полимера.

И. Включение в ПБЦА НЧ нерастворимых в воде субстанций позволяет значительно повысить их содержание в водной фазе.

2.10. Заключение

Разработана наносомальная лекарственная форма доксорубицина на основе ПБЦА, модифицированных полисорбатом 80. Эффективность наносомальной формы в сравнении со стандартной лекарственной формой исследована на модели интракраниальной глиобластомы 101/8 у крыс.

Для того чтобы обеспечить возможность сравнения результатов в большинстве экспериментов использовали одинаковый режим лечения: 3 х 1,5 мг/кг внутривенно в дни 2, 5 и 8 после имплантации опухоли. Противоопухолевый эффект оценивали по ряду критериев, в том числе увеличение продолжительности жизни, число животных с длительной ремиссией, а также морфометрические (динамика роста опухоли), гистологические и иммуногистохимические показатели (пролиферация, плотность сосудов).

Наносомальная форма доксорубицина проявила противоопухолевый эффект в отношении глиобластомы, который по всем вышеупомянутым показателем был более выраженным, чем эффект стандартной формы доксорубицина. Увеличение продолжительности жизни составило 85%; более того, наносомальный доксорубицин обеспечивал длительную ремиссию у > 20% животных. Отсутствие опухоли у этих животных не наблюдалось, по крайней мере, в течение 6 месяцев, в то время как нелеченные животные погибали в течение 20 дней. Воспроизводимость полученных результатов подтверждена при проведении более 10 серий экспериментов на более чем 300 животных.

Как свидетельствуют результаты фармакокинетических исследований, противоопухолевый эффект наносомального доксорубицина в отношении интракраниальной, опухоли обусловлен созданием в мозге терапевтических концентраций этого антибиотика. Иначе говоря, наночастицы доставляют в мозг антибиотик, который в свободном виде практически в мозг не проникает.

Данные иммуногистохимнческого исследования предполагают, что противоопухолевый эффект наносомального доксорубицина в отношении глиобластомы в значительной мерее обусловлен ингибированием роста сосудов в опухоли.

Результаты токсикологического исследования показали, что гематологическая, кардио- и тестикулярная токсичность доксорубицина могут быть значительно ослаблены при связывании антибиотика с ПБЦА наночастицами. Добавление в наносомальную лекарственную форму полисорбата 80 способствует снижению ее токсичности.

Библиография Диссертация по биологии, доктора химических наук, Гельперина, Светлана Эммануиловна, Москва

1. Kreuter J. Nanoparticles. 1.: Swarbrick J., Boylan J.C. (Eds.), Encyclopedia of Pharmaceutical Technology. // M. Dekker. - New York. - 1994. - V.10. - P. 165-190.

2. Швец В.И., Каплун А.П., Краснопольский Ю.М., Степанов А.Е., Чехонин В.П. От липосом семидесятых к нанобиотехнологии XXI века. // Рос. нанотехнол. 2008. - Т.З. - С.52-56.

3. Дудниченко A.C., Краснопольский Ю.М., В.И. Швец. Липосомальные лекарственные препараты в эксперименте и клинике. // Харьков: РА-Каравелла. 2001. — 144 с.

4. Kreuter J. Nanoparticles~a historical perspective. // Int J Pharm. 2007. -V.331, №1. - P.1-10.

5. Bala I., Hariharan S., Kumar M.N. PLGA nanoparticles in drug delivery: the state of the art. // Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 2004. - V.21, No5. -P.387-422.

6. Nguyen C.A., Konan-Kouakou Y.N., Allemann E., Doelker E., Quintanar-Guerrero D., Fessi H., Gurny R. Preparation of surfactant-free nanoparticles of methacrylic acid copolymers used for film coating. // AAPS PharmSciTech.- 2006. V.7, №3. - Article 63.

7. Vauthier C., Bouchemal K. Methods for the preparation and manufacture of polymeric nanoparticles. // Pharm. Res. 2008 - V.26, No5. -P.1025-1058

8. Behan N., Birkinshaw C., Clarke N. Poly(n-butyl cyanoacrylate) nanoparticles: a mechanistic study of polymerisation and particle formation. // Biomaterials. -2001. V.22, Nol. -P.1335-1344.

9. Pinto-Alphandary H., Andremont A., Couvreur P. Targeted delivery of antibiotics using liposomes and nanoparticles. Int. J. Antimicrob. Agents // -2000. V.13, No3. - P. 155-168.

10. Moghimi S.M., Hunter A.C., Murray J.C. Long-circulating and target-specific nanoparticles: theory to practice. // Pharmacol. Rev. 2001. - V. 53, No2. -P. 283-318.

11. Moghimi S.M., Hunter A.C. Capture of stealth nanoparticles by the body's defences. // Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 2001. - V. 18. - P.527-550.

12. Moghimi S.M., Hunter A.C. Poloxamers and poloxamines in nanoparticle engineering and experimental medicine. // Trends Biotechnol. 2000. - V. 18.- P.412-420.

13. Araujo L., Loebenberg R., Kreuter J. Influence of the surfactant concentration on the body distribution of nanoparticles. // J. Drug Targeting. 1999. - V.6.- P.373-385.

14. Redhead H.M., Davis S.S., Ilium L. Drug deliveiy in poly(lactide-co-glycolide) nanoparticles surface modified with poloxamer 407 and poloxamine 908: In vitro characterisation and in vivo evaluation. // J. Control. Release. 2001. - V.70. - P.353-363.

15. Stolnik S., Ilium L., Davis S.S. Long circulating microparticle drug carriers. Adv. DrugDeliv. Rev. 1995. - V.l6. - P. 195-214.

16. Moghimi S.M., Gray T. A single dose of intravenously injected poloxamine-coated long-circulating particles triggers macrophage clearance of subsequent doses in rats. // Clin. Sci. (Lond). 1997. - V. 93. - P.371-379.

17. Peracchia M.T, Vauthier C., Passirani C., Couvreur P., Labarre D. Complement consumption by poly(ethylene glycol) in different conformations chemically coupled to poly(isobutyl 2-cyanoacrylate) nanoparticles. // Life Sci. 1997.- V.61.-P.749-761.

18. Florence A.T., Hussain N. Transcytosis of nanoparticle and dendrimer delivery systems: evolving vistas. // Adv. Drug Deliv. Rev. 2001. - V.50. Suppl 1. - S69-89.

19. Florence A.T. Issues in oral nanoparticle drug carrier uptake and targeting. // J. Drug Target. 2004. - V. 12. - P.65-70.

20. Delie F., Blanco-Prfeto M.J. Polymeric particulates to improve oral bioavailability of peptide drugs. // Molecules. 2005. - V.10, Nol. - P.65-80.

21. Sakuma S., Sudo R., Suzuki N., Kikuchi H., Akashi M., Ishida Y., Hayashi M. Behavior of mucoadhesive nanoparticles having hydrophilic polymeric chains in the intestine. // J. Control. Release. 2002. - V.81. - P.281-290.

22. Yang S., Zhu J., Lu Y., Liang B., Yang C. Body distribution of camptothecin solid lipid nanoparticles after oral administration. // Pharm. Res. 1999. -V.16. - P.751-757.

23. Ubrich N., Schmidt C., Bodmeier R., Hoffman M., Maincent P. Oral evaluation in rabbits of cyclosporin-loaded Eudragit RS or RL nanoparticles. // Int. J. Pharm. 2005. - V.288. - P. 169-175.

24. Arbos P., Campanero M.A., Arangoa M.A., Irache J.M. Nanoparticles with specific bioadhesive properties to circumvent the pre-systemic degradation of fluorinated pyrimidines. // J. Control. Release. 2004. - V.96. - P.55-65.

25. Moghimi S.M., Hawley A.E., Christy N.M., Gray T., Ilium L., Davis S.S. Surface engineered nanospheres with enhanced drainage into lymphatics and uptake by macrophages of the regional lymph nodes. // FEBS Lett. 1994. -V.344. -P.25-30.

26. Moghimi S.M. Modulation of lymphatic distribution of subcutaneously injected poloxamer 407-coated nanospheres: the effect of the ethylene oxide chain configuration. // FEBS Lett. 2003. - V.540. - P.241-244.

27. Jain R.K. Delivery of molecular medicine to solid tumors: lessons from in vivo imaging of gene expression and function. // J. Control. Release. 2001. -V.74. - P. 7-25

28. Padera T.P., Stoll B.R., Tooredman J.B., Capen D., di Tomaso E., Jain R.K. Cancer cells compress intratumour vessels. // Nature. 2004. - V.427. - P. 695.

29. Maeda H., Matsumura Y. Tumoritropic and lymphotropic principles of macromolecular drugs. // Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 1989. — V.6. -P.193-210.

30. Yi Y„ Kim J.H., Kang H.W., Oh H.S., Kim S.W., Seo M.H. A polymeric nanoparticle consisting of mPEG-PLA-Toco and PLMA-COONa as a drug carrier: improvements in cellular uptake and biodistribution. // Pharm. Res. -2005. V.22. - P.200-208.

31. Miura H., Onishi H., Sasatsu M., Machida Y. Antitumor characteristics of methoxypolyethylene glycol-poly(DL-lactic acid) nanoparticles containing camptothecin. // J. Control. Release. 2004. - V.97. - P. 101-113.

32. Lenaerts V., Labib A., Chouinard F., Rousseau J., Ali H., van Lier J.E. Nanocapsules with a reduced liver uptake: targeting of phthalocyanines to EMT-6 mouse mammary tumor in vivo. // Eur. J. Pharm. Biopharm. 1995. -V.41. -P.38-43.

33. Kaul G., Amiji M. Biodistribution and targeting potential of poly(ethylene glycol)-modified gelatin nanoparticles in subcutaneous murine tumor model. // Drug Target. 2004. - V.12. - P.585-591.

34. Hobbs S.K., Monsky W.L., Yuan F., Roberts W.G., Griffith L., Torchilin V.P., Jain R.K. Regulation of transport pathways in tumor vessels: Role of tumor type and microenvironment. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. -V.95. - P.4607-4612.

35. Alexis F., Rhee J.W., Richie J.P., Radovic-Moreno A.F., Langer R., Farokhzad O.C. New frontiers in nanotechnology for cancer treatment. // Urol Oncol. 2008. - V.26, Nol. - P.74-85.

36. Vijayaraghavalu S., Raghavan D., Labhasetwar V. Nanoparticles for delivery of chemotherapeutic agents to tumors. // Curr. Opin. Investig. Drugs. 2007. - V.8, No6. - P.477-484.

37. Moghimi S.M. Recent developments in polymeric nanoparticle engineering and their applications in experimental and clinical oncology. // Anticancer Agents Med. Chem. 2006. - V.6, No6. -P.553-561.

38. Chiannilkulchai N., Driouich Z, Benoit J.P., Parodi A.L., Couvreur P. Doxorubicin-loaded nanoparticles: increased efficiency in murine hepatic metastases. // Sel. Cancer Ther. 1989. - V.5. -P.l-11.

39. Leslie E.M., Deeley R.G., Cole S.P. Multidrug resistance proteins: role of P-glycoprotein, MRP1, MRP2, and BCRP (ABCG2) in tissue defense.// Toxicol. Appl. Pharmacol. 2005. - V. 204, No3. - P.216-237.

40. Vauthier C, Dubernet C, Chauvierre C, Brigger I, Couvreur P. Drug delivery to resistant tumors: the potential of poly(alkyl cyanoacrylate) nanoparticles. // J. Control. Release.-2003. V.93, No2.-P.151-160.

41. Soma C.E., Dubernet C., Bentolila D., Benita S., Couvreur P. Reversion of multidrug resistance by co-encapsulation of doxorubicin and cyclosporin A in polyalkylcyanoacrylate nanoparticles. // Biomaterials. 2000. - V.21. - P. 1-7.

42. Nobs L., Buchegger F., Gurny R., Allemann E. Current methods for attaching targeting ligands to liposomes and nanoparticles. // J. Pharm. Sci. 2004. -V.93.-P. 1980-1992.

43. Olivier J.C. Drug transport to brain with targeted nanoparticles. // NeuroRx. -2005. V.2, Nol. - P. 108-119.

44. Xu Z., Gu W., Huang J., Sui H., Zhou Z., Yang Y., Yan Z„ Li Y. In vitro and in vivo evaluation of actively targetable nanoparticles for paclitaxel delivery. // Int. J. Pharm. -2005. V.288. - P. 361-368.

45. Sahoo S.K., Ma. W., Labhasetwar V. Efficacy of transferrin-conjugated paclitaxel-loaded nanoparticles in a murine model of prostate cancer. // Int. J. Cancer. 2004. - V. 112. - P.335-340.

46. Sudimack J., Lee R.J. Targeted drug delivery via the folate receptor. // Drug Delivery Rev. 2000. - V.41. - P. 147-162.

47. Zhang Z., Huey Lee S., Feng S.S. Folate-decorated poly(lactide-co-glycolide)-vitamin E TPGS nanoparticles for targeted drug delivery. // Biomaterials. 2007. - V.28, No 10. - P. 1889-1899.

48. Stevens P.J., Sekido M., Lee R.J. A folate receptor-targeted lipid nanoparticle formulation for a lipophilic paclitaxel prodrug. // Pharm. Res. 2004. - V.21. - P.2153-2157.

49. Hood J.D., Bednarski M., Frausto R., Guccione S., Reisfeld R.A., Xiang R, Cheresh D.A. Tumor regression by targeted gene delivery to the neovasculature. // Science. 2002. - V.296. - P.2404-2407.

50. Murphy E.A., Majeti B.K., Barnes L.A., Makale M., Weis S.M., Lutu-Fuga K., Wrasidlo W., Cheresh D.A. Nanoparticle-mediated drug delivery to tumor vasculature suppresses metastasis. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. -V.105, No27. - P.9343-9348.

51. Silverstein S.C., Kabbash C. Penetration, retention, intracellular localization, and antimicrobial activity of antibiotics within phagocytes. // Curr. Opin. Hematol. 1994. - V.l. - P.85-91.

52. Carryn S., Chanteux H., Serai C., Mingeot-Leclercq M.P., Van Bambeke F., Tulkens P.M. Intracellular pharmacodynamics of antibiotics. // Infect. Dis. Clin. North Am. 2003. - V.l7, No3. - P.615-634.

53. Couvreur P., Fattal E., Andremont A. Liposomes and nanoparticles in the treatment of intracellular bacterial infections. // Pharm. Res. 1991. - V.8, No9. - P.1079-1086.

54. Fattal E., Youssef M., Couvreur P., Andremont A. Treatment of experimental salmonellosis in mice with ampicillin-bound nanoparticles. // Antimicrob. Agents Chemother. 1989. -V.33. P. 1540-1543.

55. Fawaz F., Bonini F., Maugein J., Lagueny A.M. Ciprofloxacin-loaded polyisobutylcyanoaciylate nanoparticles: pharmacokinetics and in vitro antimicrobial activity. // Int. J. Pharm. 1998. - V. 168. - P.255-259.

56. Gonzalez-Martin G., Merino I., Rodríguez-Cabezas M.N. Characterization and trypanocidal activity of nifurtimox-containing and empty nanoparticles of polyethylcyanoacrylates. // Pharm. Pharmacol. 1998. - V.50. - P.29-35.

57. Pandey R., Zahoor A., Sharma S., Khuller G.K. Nanoparticle encapsulated antitubercular drugs as a potential oral drug delivery system against murine tuberculosis. // Tuberculosis. 2003. - V.83. - P.373-378.

58. Kreuter J. Liposomes and nanoparticles as vehicles for antibiotics. // Infection. 1991. - V.19, Suppl 4. - S.224-228.

59. Gelperina S., Kisich K., Iseman M.D., Heifets L. The potential advantages of nanoparticle drug delivery systems in chemotherapy of tuberculosis. // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2005. - V.l72, Nol2. - P.1487-1490.

60. Gelperina S. Brain delivery by nanoparticles. in Gupta R.B., Kompella U.B. (Eds.), Nanoparticle Technology for Drug Delivery. // Taylor and Francis. -New York, U.S.A. 2006. - P. 273-318.

61. Gelperina S. Nanocarriers and drug delivery. In: Regional Cancer Chemotherapy. Schlag P.M., Stein U. (Eds.) // Humana Press. USA. - 2007. -P. 163-180.

62. Гельперина С.Э., Швец В.И. Системы доставки лекарственных веществ на основе полимерных наночастиц. //Биотехнология. 2009. - Т.З. - С. 8-23.

63. Misra A., Ganesh A., Shahiwala A., Shah S.P. Drug delivery to the central nervous system: a review. // J. Pharm. Pharmaceut. Sci. 2003. - V.6, No2. -P.252-273. URL http://www.ualberta.ca/~csps

64. Begley D.J., Brightman M.W. Structural and Functional Aspects of the Blood-Brain Barrier. In: Prokai L., Prokai-Tatrai K. (Eds). Progress in Drug Research. V.61. // Birkhauser Verlag. - Basel (Switzerland). - 2003. - P.39-78.

65. Pardridge W.M. CNS drug design based on principles of blood-barrier transport. // J. Neurochem. 1998. - V.70. - P.1781-1792.

66. Tsuji A., Tamai I. Carrier-mediated or specialized transport of drugs across the blood-brain barrier. // Adv. Drug Delivery Rev. 1999. - V.36. - P.277-290.

67. Groothuis D.R. The blood-brain and blood-tumor barriers: A review of strategies for increasing drug delivery. // Neuro-Oncology. 2000. - V.2. - P. 45-59.

68. Pardridge W.M. Non-invasive drug delivery to the human brain using endogeneous blood-brain barrier systems. // PSTT. 1999. - V.2. - P.49-59.

69. Huwyler J., Wu D., Pardridge W.P. Brain drug delivery of small molecules using immunoliposomes. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - V.93. - P. 14164-14169.

70. Kreuter J., Alyautdin R.N., Kharkevich D.A., Ivanov A.A. Passage of peptides through the blood-brain barrier with colloidal polymer particles (nanoparticles). // Brain Res. 1995. - V.674. - P. 171-174.

71. Alyautdin R., Gothier D., Petrov V., Kharkevich D., Kreuter J. Analgesic activity of the hexapeptide dalargin adsorbed on the surface of Ps 80-coated poly(butyl cyanoaciylate) nanoparticles. // Eur. J. Pharm. Biopharm. 1995. -V.41. - P.44-48.

72. Alyautdin R.N., Petrov V.E., Langer K., Berthold A., Kharkevich D.A., Kreuter J. Delivery of loperamide across the blood-brain barrier with Ps80-coated polybutylcyanoacrylate nanoparticles. // Pharm. Res. 1997. - V.14. -P.325-328.

73. Басел A.A., Петров B.E., Балабаньян В.Ю., Гельперина С.Э., Трофимов С.С., Воронина Т.А., Аляутдин Р.Н. Транспорт прозерина в головной мозг при помощи поли(бутил)цианоакрилатных наночастиц, покрытых полисорбатом. // Рос. Мед. Ж. 2006. - №4. - С. 28-32.

74. Grossman S.A., Batara J.F. Current management of glioblastoma multiforme. // Semin. Oncol. 2004. - V.31, No5. - P.635-644.

75. Stupp R, van den Bent M.J., Hegi M.E. Optimal role of temozolomide in the treatment of malignant gliomas. // Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 2005. — V.5, No3. - P.198-206.

76. Fleming A.B., Saltzman W.M. Pharmacokinetics of the carmustine implant. // Clin. Pharmacokinet. 2002. - V.41, No6. - P.403-419.

77. Kaajik P., Troost D., de Boer O.J. Daunorubicin and doxorubicin but not BCNU have deleterious effects on organotypic multicellular spheroids of gliomas. // Br. J. Cancer. 1996. - V.74. - P. 187-193.

78. Stan A.C., Casares S., Radu D. Walter GF, Brumeanu TD. Doxorubicin-induced death in highly invasive human gliomas. // Anticancer Res. 1999. -V.19, 2A. - P. 941-950.

79. Vauthier C., Dubernet C., Fattal E., Pinto-Alphandary H., Couvreur P. Poly(alkylcyanoacrylates) as biodegradable materials for biomedical applications. // Adv. Drug Deliv. Rev. 2003. - V.55, No4. - P.519-548.

80. Gulyaev A.E., Gelperina S.E., Skidan I.N., Antropov A.S., Kivman G.Ya., Kreuter J. Significant transport of doxorubicin into the brain with Ps 80-coated nanoparticles. // Pharm. Res. 1999. - V.16. - 1564-1569.

81. Bootz A., Russ Т., Gores F., Karas М., Kreuter J. Molecular weights of poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles determined by mass spectrometiy and size exclusion chromatography. // Eur J. Pharm. Biopharm. 2005. - V.60, No3. -P.391-399.

82. Rolland A. Clinical pharmacokinetics in hepatoma patients after a single intravenous injection of free or nanoparticle-bound anthracyclines. // Int. J. Pharm. 1989. V.54. - P.' 113-121.

83. Danesi R., Fogli S., Gennari A., Conte P., Del Tacca M., Pharmacokinetic-pharmacodynamic relationships of the anthracycline anticancer drugs. // Clin. Pharmacokinet. 2002. - V.41. - P.431-444.

84. Schlageter K.E., Molnar P., Lapin G.D., Groothuis D.R. Microvessel organization and structure in experimental brain tumors: microvessel populations with distinctive structural and functional properties. // Micro vase. Res. 1999. V.58. - P.312-328.

85. Vajkoczy P., Menger M.D. Vascular microenvironment in gliomas. // Cancer Treat Res. 2004. - V. 117. - P.249-262.

86. Яблоновекая Л.Я., Спрышкова H.A. Морфологическая и биологическая характеристика экспериментальных опухолей мозжечка крыс. // Арх. Патол. 1971. - Т.ЗЗ, №2. - С. 50-53.

87. Смирнова З.С., Герасимова Г.К., Родионова Ю.В. и др. Экспериментальные опухоли мозга в системе доклинического изучения новых противоопухолевых препаратов. // Материалы 5 Всероссийского съезда онкологов. Казань. - 4-7 октября 2000. - С. 214-217.

88. Tröster S.D., Muller U., Kreuter J. Modification of the body distribution of poly(methyl methacrylate) nanoparticles in rats by coating them with surfactants. // Int. J. Pharm. 1990. - V.61. - P. 85-100.

89. Borchardt G., Kreuter J. Interaction of serum components with poly(methylmethacrylate) nanoparticles and the resulting body distribution after intravenous injection in rats. // J. Drug Target. 1993. — V.l, Nol. -P.15-19.

90. Labarre D., Vauthier C., Chauvierre C., Petri В., Müller R., Chehimi M.M. Interactions of blood proteins with poly(isobutylcyanoacrylate) nanoparticles decorated with a polysaccharide brush. // Biomaterials. 2005. - V.26, No24. - P.5075-5084.

91. Wilkins D.J., Myers P.A. Studies on the relationship between the electrophoretic properties and their blood clearance and organ distribution in the rat. // Brit. J. Exp. Pathol. 1966. - V.47. - P.568 - 576.

92. Ambruosi A., Yamamoto H., Kreuter J. Body distribution of polysorbate-80 and doxorubicin-loaded 14C.poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles after i.v. administration in rats. // J. Drug Target. 2005. - V.13, NolO. - P.535-542.

93. Л Y., Powers S.K., Brown J.T., Miner R. Characterization of the tumor invasion area in the rat intracerebral glioma. // J. Neurooncol. 1996. - V.30, No3. - P.189-197.

94. Moos Т., Molgärd К. Cerebrovascular permeability to azo dyes and plasma proteins. // Neuropath. Appl. Neurobiol. 1993. - V. 19. - P. 120-127.

95. Lemarchand С., Gref R., Couvreur P. Polysaccharide-decorated nanoparticles. // Eur. J. Pharm. Biopharm. 2004. - V.58. - P.327-341.

96. Kante В., Couvreur P., Dubois-Krack G., De Meester C., Guiot P., Roland M., Mercier M., Speiser P. Toxicity of polyalkylcyanoacrylate nanoparticles I: Free nanoparticles. // J. Pharm. Sci. 1982. - V.71. - P.786-790.

97. Kreuter J., Gelperina S. Use of nanoparticles for cerebral cancer. Tumori. -2008. V.94, No2. - P.271-277.

98. Hekmatara Т., Gelperina S., Vogel V., Yang Sh.-R., Kreuter J. Encapsulation of water-insoluble drugs in poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles. // J. Nanosci. Nanotechnol. 2009. - V.9. - P.5091-5098.

99. Zhou R., Mazurchuk R., Straubinger R.M. Antivasculature effects of doxorubicin-containing liposomes in an intracranial rat brain tumor model. // Cancer Res. 2002. - V.62. - P.2561-2566.

100. Straubinger R.M., Arnold R.D., Zhou R., Mazurchuk R., Slack J.E. Antivascular and antitumor activities of liposome-associated drugs. // Anticancer Res. 2004. - V.24. - P.397-404.

101. Гельперина С.Э., Смирнова 3.C., Халанский A.C., Скидан И.Н, Северин С.Е., Кройтер Й. Исследование наносомальной лекарственной формы доксорубицина. // Рос. биотерапевт, ж. 2004. - Т.З. - С.56-64.

102. Pereverzeva Е., Treschalin I., Bodyagin D., Maksimenko О., Kreuter J., Gelperina S. Intravenous tolerance of a nanoparticle-based formulation of doxorubicin in healthy rats. // Toxicol. Lett. 2008. - V.178, Nol. - P. 9-19.

103. Stojiljkovic M.P., Zhang D., Lopes H.F., Lee C.G., Goodfriend T.L., Egan B.M. Hemodynamic effects of lipids in humans. // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 2001. - V.280, No 6. - R1674-R1679.

104. Szebeni J. Complement activation-related pseudoallergy caused by liposomes, micellar carriers of intravenous drugs, and radiocontrast agents. // Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 2001. - V. 18, No6. - P.567-606.

105. Mazue G., Iatropoulos M., Imondi A., Castellino S., Brughera M., Podesta A., Delia Torre P., Moneta D. Anthracyclines: a review of general and special toxicity studies. // Int. J. Oncol. 1995. - V.7. - 713-726.

106. Zucchi R, Danesi R. Cardiac toxicity of antineoplastic anthracyclines. // Curr. Med. Chem. Anti-Cancer Agents. - 2003. - V.3. - P.151-171.

107. Olivier J.C., Fenart L., Chauvet R., Pariat C., Cecchelli R„ Couet W. Indirect evidence that drug brain targeting using polysorbate 80-coated polybutylcyanoacrylate nanoparticles is related to toxicity. // Pharm. Res. -1999. V. 16. - P. 1836-1842.

108. Simeonova M., Chorbadjiev K., Antcheva M. Study of the effect of polybutylcyanoacrylate nanoparticles and their metabolites on the primary immune response in mice to sheep red blood cells. // Biomaterials. 1998. - -19, No23.-P.2187-21893.

109. Couvreur P., Kante В., Grislain L., Roland M., Speiser P. Toxicity of polyalkylcyanoacrylate nanoparticles II: Doxorubicin-loaded nanoparticles. // J. Pharm. Sei. 1982. - V.71. -P.790-792.

110. Borchardt G., Audus K.L., Shi F., Kreuter J. Uptake of surfactant-coated poly(methyl methacry late)-nanoparticles by bovine brain microvessel endothelial cell monolayers. // Int. J. Pharm. 1994. - V.l 10. - P.29-35.

111. Lück M. Plasmaproteinadsorption als möglicher Schlüsselfaktor für eine kontrollierte Arzneistoffapplikation mit partikulären Trägern. // Ph.D. Thesis. Freie Universität Berlin. - 1997. - P. 13 7-154.

112. Alyautdin R., Reichel A., Löbenberg R., Ramge P., Kreuter J., Begley D. Interaction of poly(butylcyanoacrylate) nanoparticles with the blood-brain barrier in vivo and in vitro.// J. Drug Targeting. 2001. - V.9. - P.209-221.

113. Kreuter J., Shamenkov D., Petrov V., Ramge P., Cychutek K., Koch-Brandt C., Alyautdin R. Apolipoprotein-mediated transport of nanoparticle-bound drugs across the blood-brain barrier. //J. Drug Targeting. 2002. - V.10. -P.317-326.

114. Panzenboeck U., Balazs Z., Sovic A., Hrzenjak A., Levak-Frank S., Wintersperger A., Malle E., Sattler W. ABCA1 and scavenger receptor class

115. B, type I, are modulators of reverse sterol transport at an in vitro blood-brain barrier constituted of porcine brain capillary endothelial cells. //J. Biol. Chem.- 2002. V.277. - P.42781-42789.

116. Hu Y.-P., Jarillon S., Dubernet C., Couvreur P., Robert J. On the mechanism of action of doxorubicin encapsulation in nanospheres for the reversal of multidrug resistance. // Cancer Chemother. Pharmacol. 1996. - V.37. -P.556-650.

117. Sommerfeld P., Schroeder U., Sabel B. Sterilization of unloaded polybutylcyanoacrylate nanoparticles. // Int. J. Pharm. 1998. - V. 164. -P.113-118.

118. Сборник нормативно-методических документов, регламентирующих радиационную стерилизацию медицинских материалов и изделий. // Москва. 1980. - Методики 1.5.2., 1.5.3.

119. El-Egakey М.А., Bentele V., Kreuter J. Molecular weights of polycyanoacrylate nanoparticles. //Int. J. Pharm. 1983. - V.13. - P.349 -352.

120. Милинчук В.К., Клиншпонт Э.Р., Тупиков В.И. Основы радиационной стойкости органических материалов. // Энергоатомиздат. Москва. -1994. - С.142-147.

121. Lenaerts V., Couvreur P., Christiaens-Leyh D., Joiris E., Roland M., Rollman В., Speiser P. Degradation of poly (isobutyl cyanoacrylate) nanoparticles. // Biomaterials. 1984. - V.5, No2. - P.65-68.

122. Müller R.H., Lherm C, Herboit J., Couvreur P. In vitro model for the degradation of alkylcyanoacrylate nanoparticles. // Biomaterials. 1990. -V. 11, No8. — P.590-595.

123. Lherm C., Müller R., Puisieux F., Couvreur P. II. Cytotoxicity of cyanoacrylate nanoparticles with different alkyl chain length. // Int. J. Pharm. 1992. -V.84.- P. 13-22.

124. Mohamed F., van der Walle C.F. Engineering biodegradable polyester particles with specific drug targeting and drug release properties. // J. Pharm. Sei. 2008. - V.97, Nol. - P.71-87.

125. Langer К., Seegmueller Е., Zimmer А., Kreuter J. Characterization of polybutylcyanoacrylate nanoparticles. I. Quantification of PBCA polymer and dextrans. // Int. J. Pharm. 1994. - V.l 10. - P.21-27.

126. Agrawal S., Panchagnula R. In vitro analysis of rifampicin and its effect on quality control tests of rifampicin containing dosage forms. // Pharmazie. -2004. V.59, NolO. - P.775-781.

127. Ueda M., Kreuter J. Optimization of the preparation of loperamide-loaded poly (L-lactide) nanoparticles by high pressure emulsification-solvent evaporation. // J. Microencapsul. 1997. - V.14, No5. - P.593-605.

128. Lamprecht A., Ubrich N., Perez M.H., Lehr C.-M., Hoffman M., Maincent P. Influences of process parameters on nanoparticle preparation performed by a double emulsion pressure homogenization technique. // Int. J. Pharm. -2000.-V.196.-P. 177-182.

129. Гельперина С.Э., Максименко O.O., Ванчугова Л.В., Шипуло Е.В., Шандрюк Г.А., Бондаренко Г.Н., Швец В.И. Влияние технологических параметров на физико-химические свойства полилактидных наночастиц, содержащих рифампицин. // Хим.-фарм. ж, в печати

130. Marzipans Т.Т., Sharda N., Singh S. Atypical Log D profile of rifampicin. // Indian J. Pharm. Sei. serial online. 2007. - V.69. - P.l97-201.

131. Bain D.F., Munday D.L., Cox P. Evaluation of biodegradable rifampicin-bearing microsphere formulations using a stability-indicating highperformance liquid chromatographic assay. // J. Eur. J. Pharm. Sci. 1998. -V.7, No 1. - P.57-65.

132. Siepmann J., Faisant N., Akiki J., Richard J., Benoit J.P. Effect of the size of biodegradable microparticles on drug release: experiment and theory. // J. Control. Release. 2004. - V.96, Nol. - P. 123-134.

133. Faisant N., Siepmann J., Benoit J.P. PLGA-based microparticles: elucidation of mechanisms and a new, simple mathematical model quantifying drug release. // Eur. J. Pharm. Sci. 2002. - V.5, No4. - P.355-366.

134. Vandervoort J., Ludwig A. Biocompatible stabilizers in the preparation of PLGA nanoparticles: a factorial design study. // Int. J. Pharm. 2002. -V.238. - P.77-92.

135. Birnbaum D.T., Kosmala J.D., Brannon-Peppas L. Optimization of preparation techniques for poly(lactic acid-co-glycolic acid) nanoparticles. // J. Nanoparticle Res. 2000. - V.2. - P. 173-181.

136. Wang X.Y., Ishida Т., Ichihara M., Kiwada H. Influence of the physicochemical properties of liposomes on the accelerated blood clearance phenomenon in rats. // J. Control. Release. 2005. - V. 104, Nol. - P. 91-102.

137. Ishida Т., Harashima H., Kiwada H. Liposome clearance. // Biosci. Rep. -2002. V.22, No2. - P .197-224.

138. Скидан И.Н., Гельперина С.Э., Северин C.E., Гуляев А.Е. Повышение антибактериальной активности рифампицина в отношении внутриклеточных инфекций с помощью биодеградируемых наночастиц. // Антибиот. Химиотер. 2003. - Т.48, №1. - С.23-26.

139. Гельперина С.Э., Гуляев А.Е., Иванов А.А., Пальцев М.А., Северин Е.С., Северин С.Е., Скидан И.Н. Композиция для лечения легочных инфекций. // Патент РФ № 2185818, приоритет 10.07.2001.

140. Anisimova Y., Gelperina S., Peloquin С., Heifets L. Nanoparticles as antituberculosis drug carriers: effect on activity against Mycobacterium tuberculosis in human monocyte-derived macrophages. // J. Nanoparticle Res. 2000. V.2. -P.165-171.

141. Heifets L. MIC as a quantitative measurement of the susceptibility of Mycobacterium avium strains to seven antituberculosis drugs. // Antimicrob Agents Chemother. 1988. - V.32, No8! - P.l 131-1136.

142. Shoen C.M., DeStefano M.S., Sklaney M.R., Monica B.J., Slee A.M., Cynamon M.H. Short-course treatment regimen to identify potential antituberculous agents in a murine model of tuberculosis. // J AC. 2004. -V.53.-P.641-645.

143. Burman W.J., Gallicano K., Peloquin C. Comparative pharmacokinetics and pharmacodynamics of the rifamycin antibacterials. // Clin. Pharmacokinet. -2001. V.40, No5. - P.327-341.

144. Schultz M.J., van der Poll T. Animal and human models for sepsis. // Ann. Med. 2002. - V.34. - P.573-581.

145. Calandra T. Pathogenesis of septic shock: implication for prevention and treatment. // J. Chemotherapy. 2001. - V. 13. - P.l73-180.

146. Fresta M., Puglisi G. Association of netilmicin sulphate to poly(alkylcyanoacrylate) nanoparticles: factors influencing particle delivery behaviour. // Drag Development Industr. Pharm. 1994. - V.20, No 14. -P.2227-2243.

147. Beutler В., Milsark I.W., Cerami A.C. Passive immunization against cachectin/tumor necrosis factor protects mice from lethal effect of endotoxin. // Science. 1985. - V.229. -P.869-871.

148. Dhillon J., Mitchison D.A. Activity and penetration of antituberculosis drugs in mouse peritoneal macrophages infected with Micobacterium microti OV254. // Antimicrob. Agents Chemother. 1989. - V.33, No8. - P. 12551259.

149. Maincent P., Thouvenot P., Amicabile C., Hoffman M., Kreuter J., Couvreur P., Devissaguet J.P. Lymphatic targeting of polymeric nanoparticles after intraperitoneal administration in rats. // Pharm. Res. 1992. - V.9, No 12. -P.1534-1539.

150. Перёльман М.И., Соколова Г.Б., Можохина Г.Н., Лазарева Я.В., Стрекачев А.Ю., Елистратова Н.А. Применение моксифлоксацина для оптимизации комплексной терапии туберкулеза. // Антибиот. химиотер.- 2004. Т.49, №6. - С.20-24.

151. Страчунский Л.С., Кречиков В.А. Моксифлоксацин фторхинолон нового поколения с широким спектром активности (Обзор литературы). // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2001. Т.З. - С. 3-40.

152. Ballow С., Lettieri J., Agarwal V., Liu P., Stass H., Sullivan J. Absolute bioavailability of moxifloxacin. // Clin. Ther. 1999. - V.21. - C.513-522.

153. Stass H., Kubitza D. Pharmacokinetics and elimination of moxifloxacin after oral and intravenous administration in man. // J. Antimicrob. Chemother. -1999. V.43, Suppl B. - P.83-90.

154. Douglas S.J., Ilium L., Davis S.S., Kreuter J. Particle size and size distribution if poly(butyl-2-cyanoacrylate) nanoparticles. // J. Colloid Interface Sci. 1984. - V. 101, No 1. - P. 149-175.

155. Fawaz F., Guyot M., Lagueny A.M., Devissageut J.Ph. Ciprofloxacin-loaded polyisobutylcyanoacrylate nanoparticles: preparation and characterization. // Int. J. Pharm. 1997. - V.154. - P. 191-203.

156. Lherm C., Mueller R., Puisieux F., Couvreur P. II. Cytotoxicity of cyanoacrylate nanoparticles with different alkyl chain length. // Int. J. Pharm.- 1992.-V.84.-P. 13-22.

157. Page-Clisson M.E. Pinto-Alphandary H., Ourevitch M., Andremont A., Couvreur P. Development of ciprofloxacin-loaded nanoparticles: physicochemical study of the drug carrier. //J. Control. Release. 1998. -V.56. - P.23-32.

158. Hall, I.H., Schwab, U.E., Ward, E.S., Ives, T. Disposition and intracellular levels of moxifloxacin in human THP-l monocytes in unstimulated and stimulated conditions. // Int. J. Antimicrob. Agents. 2003. - V.22. - P. 579-587.

159. Clemens D.L., Lee B.Y., Horwitz M.A. The Mycobacterium tuberculosis phagosome in human macrophages is isolated from the host cell cytoplasm. // Infect. Immun. 2002. - V.70. - P.5800-5807.

160. Северин E.C., Свешников П.Г., Гельперина С.Э., Максименко О.О., Шипуло Е.В., Ванчугова JI.B. Антибактериальное средство для лечения внутриклеточных инфекций. // Патент РФ № 2308970, приоритет 10.03.2006

161. Лабораторные животные (Положение и руководство), под ред. Н.Н. Каркищенко, М. // Межакадемическое издательство «ВПК». 2003. -С.138.

162. Harnisch S., Muller R.H. Plasma protein adsorption patterns on emulsions for parenteral administration: establishment of a protocol for two-dimensional polyacrylamide electrophoresis. // Electrophoresis. 1998. - V.19. - P.349-354.

163. Методика определения инициальной контаминации продукции, стерилизуемой радиационным способом. Утверждена МЗ 11.02.82, per. № 2535-82.

164. Методические указания по использованию непрямого метода определения радиорезистентности производственной микрофлоры на предприятии, выпускающем радиационно-стерилизуемую продукцию. Утверждены МЗ 10.10.90, per. № 15-6/37.

165. Першин Г.Н. Методы экспериментальной химиотерапии. Практическое руководство. // 1971. -"Медицина". Москва.

Информация о работе

Гельперина, Светлана Эммануиловна
доктора химических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.06

Диссертация

Разработка подходов к созданию лекарственных форм антибиотиков на основе полимерных наночастиц - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы