Взаимодействие живых клеток с флуоресцентными полупроводниковыми наночастицами и органическими флуорофорами: проникновение и внутриклеточный транспорт

Салова, Анна Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Взаимодействие живых клеток с флуоресцентными полупроводниковыми наночастицами и органическими флуорофорами: проникновение и внутриклеточный транспорт
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие живых клеток с флуоресцентными полупроводниковыми наночастицами и органическими флуорофорами: проникновение и внутриклеточный транспорт"

4845890

САЛОВА Анна Владимировна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЖИВЫХ КЛЕТОК С ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМИ ПОЛУПРОВОДНИКОВЫМИ НАНОЧАСТИЦАМИ И ОРГАНИЧЕСКИМИ ФЛУОРОФОРАМИ: ПРОНИКНОВЕНИЕ И ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЙ

ТРАНСПОРТ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 2 МАЙ 2011

Санкт-Петербург 2011

4845890

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Беляева Татьяна Николаевна Институт цитологии РАН

Официальные оппоненты: кандидат биологических наук

Воронин Алексей Петрович Институт цитологии РАН

член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук Дубина Михаил Владимирович Санкт-Петербургский академический университет -научно-образовательный центр нанотехнологий РАН

Ведущее учреждение: Биолого-почвенный факультет

Санкт-Петербургского государственного университета

Защита диссертации состоится « 20 » мая 2011 года в 13 часов на заседании

Диссертационного совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу:

194064 Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4.

Адрес электронной почты Института: cellbio@mail.cvtspb.rssi.ru

Сайт института: ЬИр/Ауцгуу.су^рЬ.гакгч

Факс: 8(812) 297-35-41

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН Автореферат разослан апреля 2011г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

Е. В. Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Визуализация происходящих в живой клетке процессов имеет огромное значение для их понимания. Существенные усилия затрачиваются на создание оптических микроскопов с высокой разрешающей способностью и разработку новых методических подходов. Такие методы, как FRET, FRAP, TIRF и др., все шире используются для выявления локализации макромолекул и их взаимодействий. Во всех методах визуализации на оптическом уровне, в основном, используются флуоресцентные красители, например, проникающие через клеточную мембрану (акридиновый оранжевый (АО), LysoTracker) или способные встраиваться в гидрофобные липидные слои и таким образом метить плазматическую мембрану и производные ее структуры - эндосомы или Т-систему (RH 414, di-8-ANEPPS). Принципиально новый уровень исследования внутриклеточных процессов приобрели благодаря внедрению методов с использованием флуоресцентно меченых антител, узнающих определенные антигены, а также зеленого флуоресцентного белка (GFP) и его модификаций.

Несмотря на неоспоримые достоинства этих подходов, они имеют ряд существенных недостатков. Так, многие флуорофоры отличаются низкой фотостабильностью и быстро «выгорают», что делает невозможным длительные наблюдения. Относительно низкий квантовый выход позволяет выявлять интересующие исследователя молекулы лишь в достаточно высоких концентрациях, в некоторых случаях значительно превышающих физиологический уровень. Каждый флуорофор имеет, как правило, свой диапазон длин волн возбуждения и широкий спектр флуоресценции. Это ограничивает возможность использования некоторых красителей для детекции мишеней на микроскопах с определенным набором лазеров и затрудняет подбор пар для одновременного выявления двух мишеней. Кроме того, для выявления внутриклеточных белков в большинстве случаев применяют фиксацию и пермеабилизацию клеток, что может в определенной степени искажать результаты.

Опыт применения антител к поверхностным антигенам, например, к рецепторам фактора роста на живых клетках показал, что эти антитела могут влиять на внутриклеточную судьбу меченных ими молекул (например, стимулировать эндоцитоз в отсутствие лиганда), приводя, таким образом, к появлению артефактов. Так, например, ряд антител к HER2, одному из рецепторов семейства ErbB, не имеющего собственного лиганда и не способного подвергаться эндоцитозу, могут стимулировать этот процесс и таким образом удалять этот онкопротеин с поверхности клеток. Подобные антитела широко применяются в терапии опухолей, гиперэкспрессирующих HER2 (Ben-Kasus et al., 2009).

к «идеальной» флуоресцентной метке: (1) отсутствие влияния на поведение молекулы-мишени; (2) возможность длительных прижизненных наблюдений; (3) возможность выявления молекул, концентрация которых в клетке мала, вплоть до визуализации одиночных молекул; (4) возможность одновременного мечения нескольких мишеней. Однако в случае применения той или иной метки для прикладных целей (диагностика, терапия, адресная доставка лекарств и др.) способность метки изменять судьбу молекул-мишеней может, в конечном итоге, быть использована для усиления их действия или достижения дополнительных эффектов. С этой точки зрения, понимание того, как, когда и почему метка влияет на поведение мишени, становится особенно важным. Поскольку в этом случае предполагается введение меченых молекул в организм (например, для детекции опухолевых клеток), весьма существенным являются специфичность их взаимодействия с клетками-мишенями, токсичность, пути вывода из организма и т.д.

Очевидно, что ни один из широко применяемых красителей не удовлетворяет всему набору требований, поэтому усилия по поиску все новых и новых флуорофоров и улучшению свойств уже существующих не прекращаются.

Появившийся сравнительно недавно новый класс флуорофоров — полупроводниковые нанокристаллы - квантовые точки (КТ), - обладает многими свойствами, позволяющими считать его совершенно уникальным (А1т8ак>з, 1996; Олейников и др., 2007; Вуи е1 а!., 2008). Действительно, КТ имеют широкую полосу возбуждения (от УФ до видимой части спектра); узкий и симметричный спектр флуоресценции, максимум которого зависит от размера ядра КТ; высокий квантовый выход; исключительную фотостабильность. Однако материалы, из которых синтезируют КТ (элементы П-У1 (СёБе, СсГГе, Сс18 и 2пБе) и Ш-У (1пР и ГпАэ) групп периодической системы), сами по себе токсичны, а исходные размеры КТ (2-9 нм) значительно увеличиваются при их функционализации - придания им способности растворяться в биологических жидкостях и специфически связывать определенные мишени (ММ й а1„ 2008; Бе1еЬату а а1., 2009; Вци & а1., 2010).

Очевидно, что для введения КТ в исследовательскую практику и понимания возможных ограничений их применения, как в фундаментальных исследованиях, так и в прикладных областях, необходимо детальное исследование того, насколько они «нейтральны» по отношению к процессам, в которых участвуют меченные ими молекулы. В связи с этим возникает ряд вопросов. Во-первых, важно знать, зависит ли возможность взаимодействия КТ с клетками от типа клеток. Ответ на этот вопрос очень существенен для понимания последствий введения КТ в организм в диагностических или лечебных целях. Во-вторых, необходимо выяснить, влияют ли КТ на поведение лигандов, проникающих в клетку разными способами. В-третьих, чрезвычайно важно понять, насколько существующие представления о механизмах входа в клетку и последующей судьбе биологически активных молекул, полученные с

помощью традиционных иммунофлуоресцентых методов на фиксированных клетках, соответствуют данным, получаемым при мечении этих белков КТ на живых клетках.

В связи с вышеизложенным в настоящей работе исследовали три типа КТ (на основе CdSe/ZnS): (1) КТ, покрытые слоем полиэтиленгликоля (ПЭГ), которые минимально взаимодействуют с биологическим материалом и могут рассматриваться как инертные; (2) КТ, конъюгированные с ТАТ-пептидом, который представляет собой фрагмент ТАТ-белка вируса ВИЧ-1 и относится к пептидам, проникающим в клетку (cell penetrating peptide, СРР). ТАТ-пептид часто используют как вектор для переноса через мембрану различных макромолекул; (3) КТ, конъюгированные с эпидермальным фактором роста (ЭФР). Выбор ЭФР для решения поставленных задач связан, во-первых, с большим количеством данных по эндоцитозу рецептора этого ростового фактора, позволяющих провести корректное сравнение многих параметров эндоцитоза, стимулированного немодифицированным и меченным КТ лигандом. Во-вторых, рецептор ЭФР является сигнальным белком, участвующим в регуляции таких важных процессов, как пролиферация, клеточная подвижность, выживание при апоптозе и др., что позволяет в перспективе исследовать возможное влияние КТ на внутриклеточную сигнализацию. В-третьих, развитие многочисленных опухолей эпителиального происхождения, в частности, опухолей ЖКТ, коррелирует с гиперэкспрессией рецептора ЭФР, что делает исследования функционирования этой мишени особенно важными для медицинской практики.

Основные представления по динамике эндоцитоза рецептора ЭФР были сформированы на основе иммунофлуоресцентных исследований на фиксированных клетках (Beguinot et al., 1984). Неизвестно, насколько данные, получаемые при фиксации клеток, отражают нативные процессы, протекающие в живых клетках. Использование КТ позволяет проводить эксперименты на живых клетках. В настоящее время данные о системных исследованиях по динамике эндоцитоза рецептора ЭФР на живых клетках практически отсутствуют. Цель и задачи исследования

Целью данной работы являлось исследование проникновения в клетки и внутриклеточного транспорта различным образом функционализированных квантовых точек (КТ).

Задачи исследования сформулированы следующим образом:

1. Оценить возможность взаимодействия инертных ПЭГ-КТ с клетками разного происхождения.

2. Охарактеризовать пути проникновения в клетки КТ, конъюгированных с ТАТ-пептидом и с ЭФР.

3. Сравнить данные по динамике эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов, полученные на фиксированных клетках с помощью традиционного иммунофлуоресцентного подхода, с параметрами эндоцитоза КТ-ЭФР-

рецепторных комплексов, полученными как на фиксированных, так и на живых клетках.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Взаимодействие КТ с клетками зависит не только от свойств оболочки КТ, но и от типа клеток: инертные КТ, покрытые ПЭГ, не взаимодействуют с культивируемыми эпителиальными клетками линии HeLa. Связанные с внеклеточным пространством поперечные трубочки Т-системы мышечных волокон также оказываются недоступными для ПЭГ-КТ. Однако инертные ПЭГ-КТ поглощаются макрофагоподобыми клетками линии J774 и накапливаются в них.

2. Лиганд, связанный с КТ, определяет путь проникновения КТ в клетку.

3. Присоединение КТ к ЭФР с помощью системы «стрептавидин-биотин» избирательно влияет на одни стадии рецептор-опосредованного эндоцитоза рецептора ЭФР, не затрагивая другие.

Научная новизна полученных результатов

Показано, что макрофагоподобные клетки способны поглощать ПЭГ-КТ, которые инертны по отношению к биологическим молекулам. Впервые изучено взаимодействие КТ с миотубулами и скелетными мышечными волокнами. Использование органических липофильных красителей совместно с КТ позволило показать, что различия во взаимодействии ТАТ-КТ с миобластами и миотубулами не связаны с эндоцитозом. Проанализированы этапы эндоцитоза рецептора ЭФР, меченного КТ. Впервые выявлены различия в динамике эндоцитоза рецептора ЭФР, стимулированного немодифицированным ЭФР и комплексами ЭФР-КТ. Теоретическое и практическое значение работы

Показано, что динамика взаимодействия и путь проникновения КТ в клетки зависит от типа клеток и функционализации КТ, при этом способ проникновения КТ в клетку определяется лигандом, а не КТ. Продемонстрирована возможность выявления молекул, меченных КТ, в наномолярных концентрациях. Установление факта влияния мечения ЭФР с помощью КТ на динамику как ранней, так и поздней стадий эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов дает основания для анализа возможных изменений функционирования сигнальных каскадов, стимулируемых ЭФР, и использования этих данных в прикладных целях. Апробация работы

По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ (3 статьи в рецензируемом журнале). Основные положения были доложены и обсуждались на 16th ESGLD Workshop (Италия, 2007), на ELSO Meeting (Франция, 2008), на международном научно-методическом семинаре: "Современные методы микроскопии в исследовании живых систем" (Санкт-Петербург, 2008), на Политехническом симпозиуме "Молодые ученые - промышленности Северо-Западного региона" (Санкт-Петербург, 2008), на 1-й международной научной школе «Наноматериалы и

нанотехнологии в живых системах» (Москва, 2009), на 17lh ESGLD Workshop (Германия, 2009), на втором международном форуме по нанотехнологиям (Москва, 2009), на международной конференции "Modern Microscopy Techniques in Biology and Medicine" (Санкт-Петербург, 2009), на II конференции молодых ученых Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2010), на третьем международном форуме по нанотехнологиям (Москва, 2010).

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего /источник. Работа изложена на .96 страницах машинописного текста и иллюстрирована 2¿> рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культивирование клеток

Макрофагоподобные клетки линии J774, клетки линии L6J1, эпителиоподобные клетки карциномы человека HeLa (Российская коллекция клеточных культур Института цитологии РАН, Санкт-Петербург) культивировали в чашках Петри на покровных стеклах в среде DMEM (Биолот, Россия), содержащей 20 мМ глютамина, 10 % сыворотки крови плодов коровы (Биолот, Россия), 0.1 % гентамицина в атмосфере 5 % С02 при 37 "С. Клетки растили до 50-70 % монослоя. В отдельных опытах исследования проводили на миотубулах, которые получали путем дифференцировки миобластов L6J1 (Крылова, Фридлянская, 1988). Опыты проводили также на одиночных волокнах или пучках волокон (2-3 волокна), изолированных из ш. ileofibularis травяной лягушки Rana temporaria в зимний период. Подготовка волокон для наблюдения была описана ранее (Кроленко и др., 2003; Krolenko et al., 2006).

Квантовые точки

Использовали CdSe/ZnS КТ с разными максимумами флуоресценции (Invitrogen, США), функционализированные следующим образом:

]. КТ с максимумом флуоресценции 565 нм, покрытые полиэтиленгликолем (ПЭГ), в молекулах которого отсутствовали функциональные реактивные группы. Исходный раствор КТ (2 мкМ) в боратном буфере (50 мМ, рН 8.3) встряхивали на вортексе, разводили в 50 мкл боратного буфера (рН 8.3), снова встряхивали и затем вносили в культуральную среду до конечной концентрации 20 нМ.

2. КТ с максимумом флуоресценции 565 и 655 нм, конъюгированные с ТАТ-пептидом вируса ВИЧ-1. В опытах с миобластами концентрация ТАТ-КТ составляла 0.1 нМ, в опытах с миотубулами - 1 нМ. Исходный раствор ТАТ-КТ вносили в культуральную среду, встряхивали на вортексе, добавляли к клеткам.

3. КТ с максимумом флуоресценции 655 нм и 525 нм, конъюгированные со стрептавидином. Такие КТ способны взаимодействовать с биотинилированным ЭФР (биотин-ЭФР). Концентрация биотин-ЭФР составляла 0.1-10 нМ, концентрация КТ - 0.5 нМ. Введение КТ, конъюгированных со стрептавидином, осуществляли либо по схеме предварительного связывания, либо импульсным введением. Предварительное связывание. Комплексы ЭФР-КТ формировали на клеточной поверхности. Для этого предварительно охлажденные клетки

(10 мин при 4 °С) инкубировали в среде с биотинилированным ЭФР в течение часа при 4 °С. После этого клетки промывали средой, удаляя несвязавшийся ЭФР. Затем клетки инкубировали в среде с KT, конъюгированными со стрептавидином, в течение часа при 4 "С. После отмывки несвязавшихся KT эндоцитоз стимулировали добавлением в культуральную среду при 37 °С. Импульсное введение. Комплексы ЭФР-КТ формировали в буфере PBS, содержащим 0.1 % БСА. Для этого биотинилированный ЭФР в разных концентрациях смешивали с KT, конъюгированными со стрептавидином, в пробирке 1 ч при 4 "С, постоянно помешивая, и вводили в культуральную среду при 37 "С. В опытах с немодифицированным ЭФР использовали рекомбинантный ЭФР (Sigma, США) в концентрации 0.1-10 нМ.

Флуоресцентные витальиые красители

Для выявления «кислых» мембранных клеточных органоидов (цистерны аппарата Гольджи, поздние эндосомы, лизосомы) в живых клетках использовали флуоресцентный витальный краситель акридиновый оранжевый (Merck, Германия) в концентрации 0.25-1 мкг/мл. Для окраски лизосом и других кислых структур использовали флуорофор LysoTracker Green (Invitrogen, США) в концентрации 50 нг/мл. Окраску клеток проводили в атмосфере 5% С02 при 37 °С в течение 20 мин. Для прижизненной окраски плазматической мембраны клеток применяли липофильные красители RH 414 (Invitrogen, США) и di-8-ANEPPS (Invitrogen, США) в концентрации 15 и 5 мкг/мл, соответственно. RH 414 также использовали для окраски мембран Т-системы мышечных волокон. Окраску клеток проводили в атмосфере 5% С02 при 4 или 37 °С в течение 30 мин. Опыты с мышечными волокнами проводили при комнатной температуре.

Ингибиторы

Обработка клеток гипертоническим раствором сахарозы. Клетки HeLa инкубировали в течение 30 мин при 37 °С в культуральной среде, содержащей 0.45 М сахарозы (Sigma, США). Затем в эту же среду импульсно вводили комплексы ЭФР-КТ на 30 мин. В указанных случаях проводили трехкратную отмывку сахарозы средой и продолжали инкубацию как обычно.

Обработка клеток динасором. Клетки HeLa инкубировали в течение 30 мин при 37 °С в среде, содержащей 80 мкМ динасора (Sigma, США). Затем импульсно в эту же среду вводили комплексы ЭФР-КТ на 15-30 мин.

Обработка клеток вортманнином. Клетки HeLa инкубировали в течение 30 мин при 37 °С в среде, содержащей 100 нМ вортманнина (Sigma, США). Затем импульсно в эту же среду вводили комплексы ЭФР-КТ на 30-60 мин.

Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток

Клетки фиксировали в течение 15 мин 3.7 %-ным раствором формалина (Sigma, США), затем пермеабилизовали 0.1-0.5 %-ным раствором Тритона Х-100 (Sigma, США). Препараты инкубировали с первыми антителами против рецептора ЭФР (Cell Signaling Technology, США), ЕЕА1 (BD Transduction Lab, США), Lampl (Abeam, США), а-актинина (Sigma, США), тубулина (Sigma, США) и соответствующими вторыми антителами (каждая инкубация по 60 мин) с промывкой 0.1 %-ным Tween 20 (BioRad, США) после каждой инкубации.

Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия

Исследования проводили на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе Leica TCS SP5 (Zeiss, Германия). Флуоресценцию АО, di-8-ANEPPS, LysoTracker Green и Alexa

488 возбуждали аргоновым лазером (488 нм). Флуоресценцию Alexa 568 возбуждали гелий-неоновым (543 нм) лазером. Флуоресценцию RH 414 возбуждали аргоновым (488 нм) или гелий-неоновым (543 нм) лазерами. Флуоресценцию KT возбуждали диодным (405 нм) или аргоновым (488 нм) лазерами. Флуоресценцию АО регистрировали в двух спектральных областях: 500-560 нм и 590-660 нм, RH 414 - в области 590 660 нм, di-8-ANEPPS - в области 590-680 нм, LysoTracker Green - в области 500-550 нм, Alexa 488 - в области 500— 550 нм, Alexa 568 - в области 580-660 нм. В опытах с KT с максимумами флуоресценции 525, 565 и 655 нм флуоресценцию регистрировали в областях 510-540, 550-580 и 640-670 нм, соответственно. При возбуждении аргоновым лазером (488 нм) собственную флуоресценцию клеток регистрировали в области 540-575 нм, мышечных волокон - в области 505-535 нм. Регистрировали одиночные и серийные срезы (Z-серии), которые обычно состояли из 10-20 последовательных оптических срезов с шагом 0.5 мкм. Усреднение изображения проводилось по 4-6 кадрам сканирования. Изображения в каждом эксперименте регистрировали при одинаковой мощности лазера.

Анализ изображений осуществляли одинаковым образом для проведения корректного сравнения различных изображений с помощью стандартных программ микроскопа Leica Confocal Software (Zeiss, Германия) и программы Image J (National Institute of Health, США). Математическую обработку полученных данных проводили, учитывая параметры получения изображений и используя методы вариационной статистики с помощью программы «Microsoft Excel 2007». В работе представлены данные трех и более независимых экспериментов. На гистограммах полученные значения представлены средними значениями ± 95 %-ный доверительный интервал.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ проникновения в клетки инертных KT (ПЭГ-КТ)

В молекулах ПЭГ, которыми функционализированы KT, отсутствуют функциональные реактивные группы, поэтому их считают инертными, минимально взаимодействующими с биомолекулами. Теоретически такие KT могут использоваться в качестве контроля неспецифических взаимодействий. Мы исследовали взаимодействие инертных ПЭГ-КТ с живыми клетками, для которых возможно проникновение веществ из внешней среды через Т-систему (скелетные мышечные волокна лягушки), путем эндоцитоза (клетки карциномы человека линии HeLa) или фагоцитоза (макрофагоподобные клетки мыши линии J774).

На рис. 1, б и в, представлены результаты одновременной регистрации флуоресценции мышечного волокна через 1 ч после инкубации в растворе с ПЭГ-КТ565 в областях 545-590 и 505-530 нм. В области 505-530 нм выявляется только собственная флуоресценция волокна (рис. 1, б); в этих условиях KT в силу узкого диапазона их флуоресценции не детектируются. При регистрации флуоресценции в области 545-590 нм KT обнаруживаются в среде, но внутри волокна (темная полоса) не выявляются (рис. 1, в). При инкубации волокон с ПЭГ-КТ не наблюдали их проникновения в Т-систему и саркоплазму скелетных мышечных волокон, локализация которых выявляется при окраске с помощью флуоресцентного красителя

RH 414 (рис. 1, а). Инкубация мышечных волокон с КТ не сопровождается

вакуолизацией поперечных трубочек, которая является показателем начальных

стадий мышечного некроза и нарушений целостности Т-системы (Кроленко и др.,

2007). Полость поперечных трубочек скелетных мышечных волокон соединяется с

внеклеточным пространством и может рассматриваться как особая форма

организации внеклеточной среды внутри мышечного волокна, аналогичная узким

межклеточным пространствам многих тканей. Эта полость, по данным электронной

микроскопии, имеет размер 20-40 нм с локальными расширениями до 80 нм

(Кроленко, 1975; Dauber et al., 2000). Размеры КТ, покрытых ПЭГ, составляют 15 нм,

но их гидродинамический диаметр может достигать 20-35 нм; тем не менее, трубочки

Т-системы в наших экспериментах, оказались недоступными для ПЭГ-КТ.

---------------------------- Рис. 1. ПЭГ-КТ не

проникают в трубочки Т-системы скелетных мышечных волокон лягушки. а -локализация поперечных трубочек, окрашенных RH

__________414; б, в - мышечное волокно в среде

с ПЭГ-КТ (20 нМ; I ч); б - собственная флуоресценция волокна; в - флуоресценция КТ.

Основным путем поглощения макромолекул клетками эпителиального происхождения линии НеГа являются разные виды эндоцитоза. Мы обнаружили, что КТ, покрытые ПЭГ, не выявляются внутри клеток НеЬа ни через 3 ч инкубации, ни через 24 ч, несмотря на постоянное их присутствие в среде в течение всего этого времени (рис. 2, а).

Клетки HeLa

Макрофаги J774

шт

Границы клеток поверхностькпеток олиже к подложке Границы клетки

отмечены контурами Два 0П™ческих сРеза из одной г-серии отмечены контуром

Рис. 2. ПЭГ-КТ (20 нМ) не поступают в клетки линии НеЬа, но накапливаются в виде агрегатов в макрофагах.

Таким образом, в вышеприведенных экспериментах ПЭГ-КТ вели себя инертно по отношению к клеткам. Следует отметить, что в организме млекопитающих существуют клетки, способные осуществлять захват крупных макромолекулярных комплексов, частиц и бактерий с помощью фагоцитоза, так называемые

профессиональные фагоциты. В следующей серии экспериментов мы проверили, как макрофагоподобные клетки J774 будут вести себя в присутствии ПЭГ-КТ. Для этого их кратковременно (90 мин) инкубировали в среде, содержащей ПЭГ-КТ (рис. 2, б и е). На двух оптических срезах из одной Z-серии (10 срезов с шагом 0.5 мкм) видно, что на этом сроке КТ локализуются на поверхности и по периметру клетки, но отсутствуют во внутриклеточном пространстве. Следует отметить, что большое число агрегатов КТ распределено в виде ореола вокруг клеточной мембраны (рис. 2, б и в). Инкубация клеток J774 в среде с КТ в течение 3 ч выявляет отдельные случаи интернализации КТ. Однако длительная (около 24 ч) инкубация приводит к более интенсивному поглощению и накоплению агрегатов КТ внутри клеток (рис. 2, г). Таким образом, инертные ПЭГ-КТ способны проникать в клетки, обладающие фагоцитарной активностью, и накапливаться в них. Этот факт должен приниматься во внимание при использовании КТ на организменном уровне.

Исследование эндоцитоза ТАТ-КТ

Для исследования рафт-опосредуемого эндоцитоза наряду с органическими флуоресцентными красителями (АО, RH 414, di-8-ANEPPS) использовали КТ, конъюгированные с ТАТ-пептидом, который представляет собой фрагмент ТАТ-белка вируса ВИЧ-1 и относится к пептидам, проникающим в клетку (Lindgren et al., 2000). Аргинин- и (или) лизин-богатые ТАТ-пептиды конъюгируют с поверхностью КТ, в результате образуется положительно заряженный комплекс, который взаимодействует с отрицательно заряженными компонентами клеточной поверхности гепарансульфат-содержащими протеогликанами и входит в клетки, в основном, путем липидного рафт-опосредуемого макропиноцитоза (Rúan et al., 2007; Xue et al., 2007; Chen et al., 2008). Работу проводили на миобластах линии L6J1 и миотубулах, полученных путем дифференцировки миобластов, в ходе которой происходит пространственная реорганизация вакуолярного аппарата. Об образовании многоядерных миотубул судили по окраске с помощью АО. Степень дифференцировки миотубул определяли с помощью окраски актина и а-актинина.

Локализация органоидов с кислой внутренней средой (лизосомы, поздние эндосомы, цистерны аппарата Гольджи) с помощью АО основана на том, что диффундирующий через плазматическую мембрану краситель способен накапливаться в «кислых» органоидах благодаря градиенту протонов через мембрану и задерживаться в них. Мы исследовали распределение «кислых» органоидов, аккумулирующих АО (гранулы АО), в миобластах и миотубулах. В миотубулах (рис. 3, б и в) выявляются многочисленные гранулы АО, расположенные по всей цитоплазме, в отличие от миобластов (рис. 3, а), в которых гранул АО меньше и где они в основном локализованы в околоядерной области. В миотубулах гранулы в некоторых случаях образуют скопления в областях цитоплазмы между ядрами. Иногда наблюдаются продольно ориентированные цепочки гранул. Известно, что в ходе дифференцировки происходят изменения в структуре и топографии аппарата

Гольджи и поздних эндосом, связанные с формированием миофибрилл в процессе дифференцировки миобластов (Ralston et al., 1993; Lu et al., 2001). Наблюдаемые нами изменения локализации гранул АО, выявляемые в миотубулах, свидетельствуют о преобразованиях в эндосом но-лизосомном аппарате клетки в процессе дифференцировки.

Рис. 3. Различия в распределении гранул АО в миобластах L6J1 (а) и миотубулах (.6 и в).

•• - 1.5 мин 24 ч

и'« . •• " у, ., ? •

■ \

^ 10 мкм в . t 10 мкм

120 мин

+ LysoTracker Green

15 мин

д 10 мкм

24 ч . i

е 10 МКМ

Рис. 4. ТАТ-КТ (0.1 нМ) проникают в миоблас-ты L6J1 (а—г) и клетки HeLa (д и е). КТ655 (красный), окраска LysoTracker Green (зеленый).

4 ч - ' ■*> «я • 24 ч 24 ч

. "ж*:*-•• -4ч " ' л К - ' ' 1 '-'js • л*'

Уд^сЗ . .. '' . . 20 мкм •

20 м'км * ф ■ v • 2Э;мкм

Рис. 5. ТАТ-КТ (1 нМ) в миотубулы не проникают, д,

б - КТ655 (красный), окраска АО (зеленый); в -КТ565 (зеленый), окраска ЯН414 (красный).

В серии экспериментов на миобластах было продемонстрировано, что ТАТ-КТ проникают в миобласты. При инкубации миобластов в течение 15 мин комплексы ТАТ-КТ выявляются лишь на поверхности клеток (рис. 4, а). Через 60-120 мин ТАТ-КТ обнаруживаются в цитоплазме (рис. 4, б). Отсутствие диффузного распределения флуоресценции и выявление КТ в составе везикуло-подобных кластеров свидетельствуют в пользу проникновения ТАТ-КТ с помощью эндоцитозного

механизма. Следует отметить, что интернализация идет с небольшой скоростью, поскольку часть ТАТ-КТ все еще остается на поверхности клеток, несмотря на удаление ТАТ-КТ из среды после 15 мин инкубации (рис. 4, б). Это характерно для рафт-опосредуемого эндоцитоза. Через 24 ч укрупненные везикулы с ТАТ-КТ распределены по всей цитоплазме, свидетельствуя, таким образом, о многочисленных слияниях везикул (рис. 4, в). Дальнейшее подтверждение того, что ТАТ-КТ проникают в клетки путем эндоцитоза, было получено с помощью флуорофора LysoTracker Green, который легко проникает через клеточные мембраны и накапливается в поздних эндосомах и лизосомах клетки. Показано, что часть везикул, окрашенных этим флуорофором, также содержит ТАТ-КТ (рис. 4, г). Присутствие комплексов ТАТ-КТ в эндосомах и лизосомах свидетельствует о проникновении этих комплексов путем эндоцитоза. Такое поведение ТАТ-КТ не является специфичным для миобластов. Мы обнаружили, что клетки HeLa также медленно эндоцитируют ТАТ-КТ (рис. 4, дне).

При анализе взаимодействия комплексов ТАТ-КТ с миотубулами было обнаружено, что, в отличие от миобластов, КТ в них не проникают (рис. 5, а-в). Как показал анализ оптических срезов Z-серий миотубул, окрашенных АО или RH 414, комплексы выявляются только на плазматической мембране миотубул вплоть до 24 ч инкубации. В опытах использовали КТ с разными максимумами флуоресценции (565 и 655 нм), которые отличались по размерам CdSe-ядра (3 и 7 нм, соответственно). Однако, вследствие функционализации размеры КТ в обоих случаях составляли около 15-20 нм. И те, и другие КТ лишь связывались с плазматической мембраной и не проникали в миотубулы при инкубации от 15 мин до 24 ч (рис. 5, а-в).

Одной из возможных причин обнаруженных различий может быть подавление процесса рафт-опосредуемого эндоцитоза в процессе дифференцировки. Для сравнения процесса эндоцитоза в миобластах и миотубулах была использована окраска клеток липофильным красителем RH 414 (рис. 6). При 4 °С RH 414 выявляет только плазматическую мембрану клеток, не проникая в клетки, так как в этих условиях блокируется эндоцитоз (рис. 6, а). Однако при 37 °С процессы эндоцитоза стимулируются, и в соответствии с этим RH 414 окрашивает не только плазматическую мембрану, но и мембраны внутриклеточных структур, участвующих в процессе эндоцитоза (рис. 6, б). Следует подчеркнуть, что липофильный краситель, в отличие от АО, не проникает через мембрану, поэтому источником RH 414-позитивных внутриклеточных структур может быть только плазматическая мембрана. Наблюдается гранулярно-везикулярный характер окраски структур цитоплазмы. Сходные результаты были получены при окраске миотубул, образованных при слиянии миобластов L6J1 (рис. 6, в и г). Использование другого липофилыюго красителя di-8-ANEPPS при анализе эндоцитоза в миобластах и миотубулах позволило выявить те же закономерности окраски мембранных структур клетки, что и при использовании RH 414. Можно предположить, что распределение красителей

отражает процессы формирования и движения эндоцитозных пузырьков в миобластах и миотубулах (Niles, Malik, 1999; Minshall et al., 2000), и сделать вывод, что эти процессы в миотубулах не нарушены.

Рис. 6. Динамика эндоцитоза, выявляемая с помощью RH 414, в миобластах L6J1 (я, б) и миотубулах (в, г).

Известно, что организация везикулярного транспорта в многоядерных скелетных мышечных волокнах существенно отличается от таковой в одноядерных миобластах (Ralston, 1993; Kaisto et al., 1999; Ralston et al., 2001). В процессе дифференцировки миобластов происходит перестройка клеточной мембраны, в ходе которой формируются специализированные домены, которые обеспечивают транспортные пути в мышечных волокнах. Можно предположить, что обнаруженные различия в проникновении ТАТ-КТ в миобласты и миотубулы связаны с изменениями свойств клеточной мембраны в процессе дифференцировки, однако это предположение требует дальнейших исследований.

Исследование эндоцитоза ЭФР-КТ

Самым высокоспецифичным путем проникновения в клетки является рецептор-опосредованный эндоцитоз, поэтому именно этот механизм привлекает особое внимание при попытках создания инструментов адресной доставки лекарственных препаратов в клетки. ЭФР — полипептид, который при связывании с рецептором на клеточной поверхности запускает эндоцитоз ЭФР-рецепторных комплексов и стимуляцию сигнальных каскадов, осуществляя важную роль в регуляции клеточной пролиферации (Jorissen et al., 2003). ЭФР связывается со своим рецептором с высокой аффинностью (109—10" М"'). Образование димеров лиганд-рецепторных комплексов стимулирует их эндоцитоз через клатрин-окаймленные ямки. Окаймленные пузырьки отделяются от мембраны с помощью динамина - атипичной ГТфазы, способной образовывать на «горлышке» окаймленой ямки спираль, шаг которой резко увеличивается при гидролизе ГТФ. В соответствии с современными представлениями, активация тирозинкиназы рецептора опосредованно приводит к рекрутированию на вновь сформированные эндосомы малой ГТФазы Rab5 в ГТФ-связанной, т.е. активной, форме, которая и организует дальнейшие события, приводящие к деградации рецептора в лизосомах. Во-первых, она рекрутирует так называемый ранне-эндосомальный аутоантиген ЕЕА1, который необходим для гомотипического слияния ранних эндосом, обеспечивающего их укрупнение. Во-

вторых, активный Rab5 рекрутирует на мембрану фосфатидилинозитол(ФИ)-3-киназу Vps34, которая формирует на мембране эндосомы домены, обогащенные ФИ-3-монофоефатом. Этот липид узнается белковыми комплексами ESCRT0-IV, которые обеспечивают концентрацию белков-грузов в ФИ-З-фосфат-обогащенных доменах. В области этих же доменов далее начинают формироваться инвагинации эндосомной мембраны, впоследствии превращающиеся во внутренние пузырьки поздних мультивезикулярных эндосом (МВЭ). Ассоциированный с ними груз также попадает внутрь эндосом, тем самым предотвращая возможность рециклирования и обеспечивая в дальнейшем доступность грузов для деградации лизосомными ферментами после образования МВЭ гибридных органелл с лизосомами. Все эти процессы начинаются на периферии клетки, где ранние эндосомы заякориваются динамичными плюс-концами микротрубочек. Там же находится моторный динеиновый комплекс, который и обеспечивает дальнейшее перемещение эндосом в околоядерную область, где преимущественно локализуются лизосомы.

В настоящее время не установлено, влияют ли КТ на взаимодействие, проникновение, распределение и внутриклеточную судьбу меченных ими молекул ЭФР. В задачу работы входило исследование (1) специфичности поступления ЭФР, меченных КТ, в клетку, (2) динамики их перераспределения внутри клетки, (3) взаимодействия эндосом, содержащих ЭФР-КТ, с микротрубочками, (4) возможности слияний эндосом, содержащих ЭФР-КТ, и формирования МВЭ, (5) возможности взаимодействия МВЭ с лизосомами, а также сравнение этих данных с результатами, полученными на фиксированных клетках с выявлением рецептора ЭФР антителами.

КТ вводили в клетки HeLa двумя способами: (1) путем предварительного связывания лиганда, когда формирование комплексов ЭФР-КТ происходит на плазматической мембране при 4 "С; в этом случае к клеткам добавляли сначала биотин-ЭФР, а затем стрептавидин-КТ; (2) импульсно, когда комплексы ЭФР-биотин-стрептавидин-КТ готовили предварительно in vitro и добавляли к клеткам при 37 "С. Преимущество второго способа введения заключается в том, что во время эксперимента клетки находятся в оптимальных физиологических условиях. Ранее было показано, что при предварительном связывании лиганда (немодифицированного ЭФР) динамика эндоцитоза замедляется, по сравнению с импульсным введением, однако этот способ позволяет синхронизировать молекулярные события в ходе эндоцитоза (Kharchenko et al., 2007). Показано, что при использовании обоих способов ЭФР-КТ проникают в клетки. При формировании комплексов ЭФР-КТ на поверхности клеток при 4 °С КТ обнаруживаются первоначально на плазматической мембране (рис. 7, а), после стимуляции эндоцитоза через 15 мин (инкубация клеток при 37 °С) КТ выявляются в везикулярных структурах в области мембраны (рис. 7, б). При импульсном введении уже на начальных сроках инкубации (15 мин) значительная часть ЭФР-КТ сразу выявляется внутри клеток (рис. 7, в). Как и ожидалось, в этом случае процесс происходит быстрее.

Рис. 7. Распределение комплексов ЭФР-КТ в клетках HeLa при использовании метода предварительного связывания (а и б) и импульсного введения (в).

Для определения специфичности проникновения ЭФР-КТ в клетки HeLa были проведены опыты, в которых клетки инкубировали в среде со стрептавидин-КТ в отсутствие биотин-ЭФР. В этом случае стрептавидин-КТ не обнаруживались ни на плазматической мембране, ни внутри клеток (рис. 8, о). Это свидетельствует об ЭФР-зависимом поступлении комплексов ЭФР-КТ в клетки. Для проверки пути проникновения комплексов ЭФР-КТ клетки HeLa предварительно обрабатывали гипертоническим раствором сахарозы (0.45 М), который ингибирует эндоцитоз рецепторных комплексов, препятствуя формированию клатрин-окаймленных ямок (Heuser, Anderson, 1989). Через 30 мин после импульсного введения комплексы ЭФР-КТ выявлялись на плазматической мембране, в клетках они не обнаруживались (рис. 8, б). После удаления из среды сахарозы и последующей инкубации клеток в культуральной среде мы наблюдали проникновение комплексов ЭФР-КТ в клетки (рис. 8, в). Такое поведение комплексов совпадает с данными, полученными на клетках, обработанных гипертоническим раствором сахарозы, при стимуляции эндоцитоза немодифицированным ЭФР (Харченко и др., 2002) и свидетельствует об проникновении фактора роста, меченного KT, путем клатрин-зависимого эндоцитоза. Еще одно доказательство использования клатрин-зависимого пути входа было получено в опытах, когда клетки до введения ЭФР-КТ выдерживали в среде с динасором, специфическим ингибитором динамина. В этом случае ЭФР-КТ выявлялись в виде скоплений, вероятно, на плазматической мембране клеток (рис. 9, б). Анализы серий срезов клеток показали, что все флуоресцентные комплексы действительно оставались связанными с мембраной и не выявлялись внутри клеток. Можно предположить, что в таких условиях КТ-ЭФР-рецепторные комплексы находятся в окаймленных ямках, которые неспособны отсоединяться от мембраны из-за ингибирования динамина.

Рис. 8. KT (агрегаты отмечены стрелками) в отсутствие ЭФР не проникают в клетки HeLa (а). Блокирование поступления ЭФР-КТ в клетки гипертоническим раствором сахарозы (б) и восстановление клатрин-зависимого эндоцитоза после удаления ингибитора (в).

Рис. 9. Через 30 мин после стимуляции эндоцитоза ЭФР-К'Г наблюдаются в околоядерных эндосомах (я), тогда как подавление функции динамика с помощью дннасора блокирует отделение окаймленных ямок с ЭФР-КТ ог плазматической мембраны (б). Окраска ядер с помощью ЭАР1.

Для подтверждения того, что этот путь не только ЭФР-, но и рецептор-зависим, была использована иммунофлуоресцентная окраска фиксированных клеток антителами на рецептор ЭФР на разных сроках после стимуляции эндоцитоза комплексами ЭФР-КТ (от 0 мин до 150 мин) (рис. 10). Обнаружено, что до 80% ЭФР-КТ колокализуется с рецептор-позитивными структурами. Это доказывает, что КТ, ЭФР и рецептор находятся преимущественно в одних и тех же везикулярных структурах в клетке, что дает возможность сравнивать данные, полученные с помощью антител, с данными, полученными на живых клетках при использовании КТ.

Рис. 10. В ходе эндоцитоза комплексы ЭФР-КТ (красный) и выявляемый антителами рецептор ЭФР (зеленый) локализуются в одних и тех же везикулах.

Далее мы исследовали динамику поступления и распределения внутри клетки комплексов ЭФР-КТ (рис. 11, сне). При формировании комплекса ЭФР-КТ на поверхности клеток при 4 °С КТ обнаруживаются на плазматической мембране, повторяя очертания клеток. Через 15 мин после стимуляции эндоцитоза переводом клеток в среду температурой 37 "С ЭФР-КТ наблюдаются в виде мелких везикул, расположенных внутри клетки вблизи плазматической мембраны. Через 30 мин после запуска эндоцитоза более крупные везикулярные структуры, содержащие КТ, локализуются по всей цитоплазме. Через 90-150 мин КТ обнаруживаются в виде

скоплений в околоядерной области. КТ обнаруживаются в околоядерной области клеток и через 24 ч инкубации.

0 мин / ) { \ V _ Ч.#г" _ 1 С? . 10 мкм ■ •7 ■•'..>.' 1&%ин 6 10МИ1 30 МИН в 10 мкм

„90 мин 150 мин 24 ч б Юмкм

10 мкм д 10 мкм

15 30 60 90 120 1 50

Время, МИН

Рис. II. Динамика поступления и распределения внутри клеток НеЬа комплексов ЭФР-КТ;

гистограммы изменения числа эндосом с ЭФР-КТ и их площади с течением времени инкубации.

Необходимо отметить, что в некоторых экспериментах через 15 мин после стимуляции эндоцитоза КТ-содержащие эндосомы находились преимущественно под плазматической мембраной, тогда как в других опытах эндосомы перемещались по направлению к ядру. Первый тип локализации не характерен для эндосом, содержащих немодифицированные ЭФР-рецепторные комплексы, выявляемые антителами. Такие различия могут быть обусловлены тем, что при формировании эндосом, содержащих КТ-ЭФР-рецепторные комплексы, могут возникать стерические проблемы, имеющие два аспекта. Во-первых, окаймленные клатрином ямки имеют строго определенный диаметр (120 нм), и упаковка в них лиганд-рецепторных комплексов, размеры которых увеличиваются в результате присоединения к каждому из них стрептавидин-КТ (диаметром в 15-30 нм), может требовать «дополнительных усилий» со стороны клатриновой оболочки.

Во-вторых, известно, что каждая КТ конъюгирована с 5-10 молекулами стрептавидина (1пукго§еп); в свою очередь, стрептавидин имеет по 4 сайта связывания биотина. В связи с этим в зависимости от соотношения концентраций стрептавидин-КТ и биотин-ЭФР возможно формирование нескольких типов комплексов, способных влиять на характер последующего взаимодействия с рецепторами. В настоящее время невозможно контролировать число молекул ЭФР, связанных с КТ, и способ их распределения по поверхности КТ. Учитывая, что формирование димеров рецепторов даже в отсутствие лиганда способно стимулировать интернализацию рецепторов, соотношение, которое позволяет сформировать полноценные рецепторные димеры, должно быть наиболее эффективно с точки зрения интернализации. Из общих соображений, при повышении количества

молекул ЭФР в расчете на одну КТ растет вероятность связывания по крайней мере двух молекул ЭФР с одной или двумя соседними молекулами стрептавидина, покрывающими КТ, что должно способствовать формированию димеров. Для выяснения этого вопроса было изучено влияние различных соотношений биотин-ЭФР и стрептавидин-КТ (1:1; 4:1) на количество эндосом, образовавшихся после стимуляции эндоцитоза (рис. 12). Показано, что при введении КТ путем предварительного связывания биотин-ЭФР с рецептором выбранные соотношения существенно не влияют на число формирующихся везикул. Однако при импульсном введении комплексов ЭФР-КТ, приготовленных in vitro с использованием равных концентраций ЭФР и КТ, после стимуляции эндоцитоза формируется меньше везикулярных структур, содержащих КТ, чем при четырехкратном превышении концентрации ЭФР относительно КТ. Полученные различия могут быть обусловлены тем, что при предварительном связывании биотин-ЭФР с рецепторами сразу формируются полноценные димеры, и последующее добавление стрептавидин-КТ не оказывает влияния на димеризацию. Во втором же случае комплексы ЭФР-КТ сначала формируются in vitro и затем добавляются к клеткам и для образования димеров рецепторов важно, чтобы хотя бы одна из молекул стрептавидина связалась как минимум с двумя молекулами биотин-ЭФР, чему должно способствовать преобладание ЭФР.

Предварительное связывание лиганда Импульсное введение ЭФР-КТ

Рис. 12. Соотношение количества молекул ЭФР на одну КТ влияет на эффективность интернализации.

Соотношение концентраций ЭФР к КТ Соотношение концентраций ЭФР к КТ

Наши данные позволяют также утверждать, что КТ-содержащие эндосомы перемещаются по микротрубочкам. На ранней стадии эндоцитоза везикулы с КТ локализуются в непосредственной близости от микротрубочек (рис. 13, а). При этом с течением времени выявляются более крупные эндосомы, которые транслоцируются в околоядерную область с интенсивной флуоресценцией тубулина, характерной для области локализации центра организации микротрубочек (рис. 13, б). Точно такое же поведение и локализацию демонстрируют и эндосомы, содержащие немодифицированный ЭФР. Таким образом, эндосомы с немодифицированным ЭФР и эндосомы, содержащие ЭФР-КТ, по отношению к транспорту по микротрубочкам ведут себя одинаково.

Известно, что одним из маркеров ранних эндосом является димерный белок ЕЕА1, обеспечивающий гомотопические слияния ранних эндосом и их укрупнение. Он рекрутируется на рецептор-содержащие эндосомы через 10-15 мин после стимуляции эндоцитоза и ассоциируется с ними вплоть до перемещения в

околоядерную область. Подсчет числа везикулярных структур, содержащих КТ, в расчете на одну клетку, показал, что после 15-30 мин инкубации действительно происходит существенное уменьшение их количества, при этом видимый размер структур увеличивается, что свидетельствует о слиянии эндосом (рис. 11, ж и з). Окрашивание фиксированных клеток антителами на ЕЕА1 на разных сроках после стимуляции эндоцитоза как ЭФР (рис. 14, а-в), так и ЭФР-КТ (рис. 14, г-é) показало, что эндосомы в обоих случаях начинают колокализоваться с ЕЕА1 через 10-20 мин после стимуляции эндоцитоза, причем степень колокапизации достигает максимума через 30 мин и падает к 90-120 мин, что говорит о созревании эндосом и превращении их в поздние эндосомы.

Таким образом, были получены косвенные данные в пользу слияния эндосом на ранних стадиях эндоцитоза. До сих пор неясно, происходят ли эти взаимодействия на самых ранних стадиях эндоцитоза, продолжаясь до концентрации эндосом в околоядерной области. Применение ЭФР, меченных КТ, флуоресцирующих в зеленой (525 нм) и красной (655 нм) областях, позволило непосредственно оценить возможности слияния эндосом на ранних этапах эндоцитоза в живых клетках. Для этого сначала зеленые ЭФР-КТ, а потом красные импульсно вводили в клетки. Использовали два интервала между введением зеленых и красных ЭФР-КТ - 10 мин и 30 мин. После совместной инкубации с зелеными и красными КТ в клетках были обнаружены везикулы, обладающие только красной, только зеленой и одновременно красной и зеленой (желтой) флуоресценцией (рис. 15, а-е). Желтая флуоресценция возникает при слиянии красных и зеленых везикул. Определяли степень колокализации в процентах для 10- и 30-минутных интервалов между введением зеленых и красных КТ (рис. 15, гистограмма). При 10-минутном интервале слияние везикул наблюдается уже через 10 мин совместной инкубации с зелеными и красными КТ (40 %), с увеличением времени дальнейшей инкубации растет число таких везикул (до 70 %). Эти данные полностью согласуются с представлениями о том, что ранний этап созревания эндосом связан с их слияниями, что позволяет увеличить площадь поверхности и в дальнейшем сформировать мультивезикулярные структуры. Таким образом, ранняя стадия созревания эндосом, содержащих КТ, не нарушена. Дополнительное подтверждение этим наблюдениям получили, когда вводили КТ с интервалом в 30 мин. В этом случае число слияний значительно ниже, и на более поздних сроках инкубации клеток оно увеличивается незначительно (до 15 %). Это подтверждается и разницей в значениях коэффициента Пирсона, который определяет степень корреляции двух величин и также является одним из показателей колокализации. При 10-минутном интервале он составил 0.45, при 30-минутном -0.06. Уменьшение степени колокализации при 30-минутном интервале введения указывает на то, что за это время мембраны везикул с КТ претерпевают существенные изменения (созревают), продвигаясь по эндоцитозному пути, и уже не способны сливаться с вновь образующимися везикулами. Наши данные полностью

совпадают с результатами, полученными на фиксированных клетках (Murphy, 1991). Это позволяет предполагать, что процесс созревания эндосом, содержащих ЭФР и меченных KT, не отличается от созревания эндосом с немодифицированным ЭФР.

Си с. 13. КТ-содержащие эндосомы 1г1|'|1Л|Г ^^^^^^ИгРгBi'llЛ!1 перемещаются но микротрубочкам.

шЯЩЩЦ^^Л' Т^^^ШЖ тКчД^У * гШТ^Л Выявление тубулина (зеленый) мето-W* ^ТИДИ дом иммунофлуоресценции; КТ655

Рис. 14. Локализации рецептора ЭФР и ЕЕА1 (а-в) и ЭФР-КТ и ЕЕА1 (г-е) через разное время после стимуляции эндонитоза. Окраска антителами к рецептору ЭФР (красный) и ЕЕА1 (зеленый);

КТ655 (красный). Окраска ядер с помощью ОАР1.

■ Юмин Интервал □ зОмин интервал

ОЕ

ю 60 1го Время, мин

15. Последова-ное применение в м и том же эксперте ЭФР, мечен-зеленымн и красными КТ, показывает, что слияния эндосом происходят на ранних стадиях эндонитоза; гистограмма - степень колокализации в процентах для 10- и 30-минутных интервалов между введением зеленых и красных КТ.

Одной из поздних ключевых стадий эндоцитоза, связанной с созреванием эндосом, является формирование мультивезикулярных, или поздних, эндосом (МВЭ). МВЭ формируются из укрупнившихся ранее эндосом путем образования

120 мин 24 ч 24 ч

^ 10 мкм | б 10 мкм 6 10 мкм

Рис. 17. Локализация ЭФР-КТ (а-в) и рецептора (б) и Ьашр-1-позитивных структур (а и в) через разное время после стимуляции эндоцитоза. КТ655 (красный); окраска антителами: б - к рецептору ЭФР (зеленый),

а, в — Ьагпр! (зеленый). Окраска ядер с помощью ОАР1.

инвагинаций в областях, обогащенных ФИ-З-фосфатом, и превращающихся в дальнейшем в пузырьки, отпочковывающиеся внутрь везикулы. Чтобы выяснить, проходит ли этот процесс при мечении ЭФР с помощью КТ, использовали вортманнин - ингибитор ФИ-З-киназы, которая продуцирует ФИ-З-фосфат и, таким образом, является одним из ключевых регуляторов формирования внутренних пузырьков мультивезикулярных структур. Оказалось, что в присутствии вортманнина через 30-60 мин после стимуляции эндоцитоза ЭФР-КТ выявляются увеличенные полые везикулы в околоядерной области, при этом рецепторные комплексы ЭФР-КТ располагаются на внешней мембране эндосом, а не внутри (рис. 16, а). Это свидетельствует о том, что происходит слияние везикул и их транспорт в околоядерную область, но не происходит образования внутренних пузырьков мультивезикулярных структур. Этот факт может служить дополнительным подтверждением того, что ЭФР-КТ после интернализации попадают в эндосомы, которые подвергаются нормальному процессу созревания.

Рис. 16. При действии вортманнина, подавляющего формирование внутренних пузырьков МВЭ, ЭФР-КТ локализуются на внешней мембране укрупненных эндосом, расположенных в околоядерной области (а). Изображение этой же клетки в проходящем свете (б).

Следующей стадией эндоцитоза является взаимодействие поздних эндосом с лизосомами. Для выявления лизосом фиксированные клетки окрашивали антителами на лизосомный маркер Ьатр-1. В этих опытах обнаружена низкая колокализация КТ-содержащих везикул с лизосомами (ниже 10 %), свидетельствующая о том, что через 120 мин практически не происходит взаимодействия поздних эндосом с лизосомами (рис. 17, а). Однако и в случае стимуляции эндоцитоза немодифицированным ЭФР процент колокапизации с лизосомами также очень низкий. Вероятно, это может быть связано с замедленным типом эндоцитоза в использованных в эксперименте клетках.

С другой стороны, слияние поздней эндосомы и лизосомы приводит к быстрой деградации рецептора и, следовательно, к исчезновению антигена, детектируемого антителами к рецептору. Таким образом, даже быстрая деградация будет сопровождаться весьма кратковременной и ограниченной в пространстве совместной локализацией рецептора и маркера лизосом. Поэтому в экспериментах с немодифицированным ЭФР о высокой скорости деградации рецептора судят по исчезновению рецептор-позитивных везикулярных околоядерных структур, которое в большинстве случаев наблюдается через 120-150 мин после стимуляции эндоцитоза. Однако в случае ЭФР-КТ околоядерные структуры, содержащие КТ, выявляются и через 24 ч. Существенным является выяснение того, происходит ли деградация КТ-ЭФР-рецепторного комплекса за это время. Оказалось, что структуры, содержащие КТ, не являются рецептор-позитивными (рис. 17, б), в то время как около 70 % этих структур колокализуется с Ьатр-1 (рис. 17, в). Это свидетельствует о том, что поздние эндосомы, содержащие ЭФР-КТ, все же сливаются с лизосомами. Результатом этого является деградация белковой части комплекса, тогда как сами КТ остаются внутри лизосом. Выяснение судьбы таких КТ в клетках и их возможного влияния на внутриклеточную сигнализацию требует дальнейших исследований.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные нами данные свидетельствуют, что применение квантовых точек (КТ) делает возможным выявление меченных ими мишеней, находящихся в очень низких концентрациях, в живых клетках. Более того, КТ исключительно удобны для изучения и количественного анализа таких процессов, как транслокация везикул, меченных КТ, по микротрубочкам и слияние везикул. Проведенное исследование позволяет говорить о том, что не КТ, а лиганды определяют тот путь, с помощью которого комплексы будут входить в клетки. При этом необходимо учитывать особенности каждого конкретного механизма (например, необходимость димеризации рецепторов) для формирования наиболее эффективных с точки зрения интернализации и «полноценных» с точки зрения их биологических эффектов комплексов КТ с лигандами. Однако также очевидно, что КТ, даже инертные, нельзя считать нейтральными маркерами. Во-первых, они могут поглощаться клетками, которые исследователи даже не рассматривают в качестве мишени при постановке основной задачи. Во-вторых, мечение ими определенных лигандов в принципе способно изменять дальнейшую судьбу интернализованных лигандов. Имея в виду, что рецептор ЭФР не только участвует в регуляции широкого спектра клеточных процессов в норме, но и часто гиперэкспрессируется при трансформации клеток, разработка методов детекции таких одиночных клеток в доступных для неинвазивного вмешательства органах (например, в ЖКТ) представляется весьма привлекательной. Яркость и фотостабильность КТ делает их первыми кандидатами для использования в таких подходах. Однако наши данные говорят о том, что

необходимы дополнительные исследования, посвященные выяснению последствий выявленных изменений динамики эндоцитоза. Для применения КТ в медицине необходимо минимизировать все побочные эффекты, например, поглощение профессиональными фагоцитами несвязавшихся с клетками-мишенями ЭФР-КТ. Неясным также остается вопрос о судьбе клеток после аккумуляции в них КТ. Во время длительной инкубации клеток с КТ (до 24 ч) мы не наблюдали таких морфологических изменений клеток, как их открепление от субстрата или появление признаков гибели клеток. Тем не менее, дальнейшие исследования этих аспектов остаются первоочередной задачей. Важным также является определение того, соответствуют ли сигнальные свойства рецепторов, надолго задерживающихся в клетке, сигнальным свойствам нативных лиганд-рецепторных комплексов. В связи с появлением все большего количества доказательств сигнальной роли интернализованных тирозинкиназных рецепторов, в том числе на поздних стадиях эндоцитоза, этот вопрос становится одним из основных в рассматриваемой области.

ВЫВОДЫ

1. Динамика взаимодействия и путь проникновения квантовых точек (КТ) в клетки зависят от типа клеток и функционализации КТ; при этом способ проникновения КТ в клетку определяется лигандом, а не КТ.

2. Инертные ПЭГ-КТ не проникают в клетки НеЬа и в Т-систему и саркоплазму скелетных мышечных волокон, тогда как профессионально фагоцитирующие макрофагоподобные клетки 1774 при длительной инкубации способны поглощать и накапливать инертные ПЭГ-КТ.

3. Совместное использование КТ, акридинового оранжевого и липофильных красителей (ЯН 414 или сН-8-АНЕРР8) позволило продемонстрировать, что ТАТ-КТ, проникая путем эндоцитоза в миобласты, не способны интернализоваться миотубулами, несмотря на то, что процесс формирования эндосом в этих клетках не нарушен.

4. Основные стадии эндоцитоза комплексов ЭФР-КТ: взаимодействие с рецепторами, интернализация, слияние эндосом, их транспортировка по микротрубочкам и формирование мультивезикулярных тел - не отличаются от этапов эндоцитоза, стимулированного немодифицированным ЭФР.

5. Соотношение биотин-ЭФР и стрептавидин-КТ при формировании комплекса влияет на эффективность образования эндосом, при этом оптимальным молярным соотношением ЭФР:КТ является 4:1.

6. Использование КТ в качестве метки ЭФР вызывает изменения в динамике эндоцитоза рецептора ЭФР. Комплексы ЭФР-КТ выявляются в клетке в течение существенно более длительного времени, чем ЭФР-рецепторные комплексы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Беляева Т. Н., Адамян С. Я., Кроленко С. А., Леонтьева Е. А., Моженок Т. П., Салова А. В., Фаддеева М. Д. 2009. Распределение и спектры флуоресценции АО в миобластах и одиночных мышечных волокнах. Цитология. 51 (2) : 103-110.

2. Беляева Т. Н., Салова А. В., Леонтьева Е. А., Моженок Т. П., Корнилова Е. С., Кроленко С. А. 2009. Нецелевые квантовые точки в прижизненных конфокально-микроскопических исследованиях клеток. Цитология. 51 (10): 830-837.

3. Салова А. В., Леонтьева Е. А., Моженок Т. П., Корнилова Е. С., Кроленко С. А., Беляева Т. Н. 2011. Изменение локализации компонентов везикулярного аппарата клетки в процессе дифференцировки миобластов в миотубулы в культуре. Цитология. 53 (3): 19-26.

4. Belyaeva Т., Leontieva Е., Mozhenok Т., Salova А. 2007. Spectral characteristics of acridine orange accumulated within acidic organelles of myoblasts in culture and in skeletal muscle fibers. Abstracts of 16th ESGLD Workshop : 136.

5. Leontieva E., Belyaeva Т., Salova A., Mozhenok Т., Kharchenko M., Zlobina M., Krolenko S. 2008. The interactions of untargeted and targeted quantum dots with living cells. Abstracts of ELSO Meeting : 64.

6. Салова А. В., Беляева Т. H., Кроленко С. А., Леонтьева Е. А., Моженок Т. П., Е. С.Корнилова. 2008. Применение квантовых точек в исследованиях живых клеток. Материалы междунар. научно-методич. семинара: "Современные методы микроскопии в исследовании живых систем" : 33.

7. Салова А. В. 2008. Нецелевые и целевые квантовые точки в прижизненных конфокально-микроскопических исследованиях различных клеток. Материалы Политехнического симпозиума. "Молодые ученые - промышленности СевероЗападного региона": 126.

8. Салова А. В., Беляева Т. Н., Корнилова Е. С., Леонтьева Е. А., Моженок Т. П., Кроленко С. А. 2009. Прижизненные исследования динамики поступления квантовых точек в клетки HeLa (лазерная сканирующая конфокальная микроскопия). Материалы 1-й международной научной школы «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах» : 330-332.

9. Belyaeva Т. N., Leontieva Е. A., Kornilova Е. S., Mozhenok Т. P., Salova А. V., Krolenko S. А. 2009. Laser confocal microscopic study of Quantum Dots uptake into the cells by EGF-mediated endocytosis. Abstracts of 17"' ESGLD Workshop : 8.

10. Салова А. В., Беляева Т. H., Леонтьева Е. А., Моженок Т. П., Кроленко С. А, Корнилова Е. С. 2009. Проблемы и перспективы применения нецелевых и целевых квантовых точек в исследованиях живых клеток. Материалы второго международного форума по нанотехнологиям : 807-809.

11. Salova A., Belyaeva Т., Kornilova Е., Leontieva Е., Mozhenok Т., Krolenko S. 2009. Laser confocal microscopic study of targeted quantum dots uptake into HeLa cells. Abstracts of international conference "Modern microscopy techniques in biology and medicine" : 26.

12. Салова А. В., Леонтьева E. А., Моженок Т.П., Кроленко С. А, Корнилова E. С., Беляева Т.Н. 2010. Применение функционализированных квантовых точек в исследованиях эндоцитоза в живых клетках [Электронный ресурс, 1 диск (CD-ROM)]. Материалы третьего международного форума по нанотехнологиям. М.: Российская корпорация нанотехнологий.

13. Салова А. В., Беляева Т. Н., Леонтьева Е. А., Моженок Т. П., Кроленко С. А, Корнилова Е. С. 2010. Динамика поступления квантовых точек в клетки HeLa. Тезисы докладов и сообщений, представленных на II конференцию молодых ученых Института цитологии РАН. Цитология. 52 (6): 505.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Кроленко С. А. 1975. Л.: Наука. 128 с. Кроленко С. А., Адамян С. Я., Беляева Т. Н., Моженок Т. П., СаловаА. В. 2007. Цитология. 49 (2) : 107-114. Крылова Т. А., Фридлянская И. И. 1988. Л., Наука : 282-290. Олейников В. А., Суханова А. В., Набиев И. Р. 2007. Российские нанотехнологии. 2 (1-2) : 160-173. Харченко М. В., Аксенов Н. Д., Корнилова Е. С. 2002. Цитология. 44 (7) : 681-690. Beguinot L., LyallR. М„ Willingham М. С., Pastan I. 1984. Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 81 : 2384-2388. Biju V., Itoh Т., Anas A., Sujith A., hhikawa M. 2008. Anal. Bioanal. Chem. 391 : 2469-2495. Biju V., Itoh Т., hhikawa M. 2010. Chem. Soc. Rev. 39 (8) : 3031-3056. Chen В., Liu Q„ Zhang Y, Xu L„ Fang X. 2008. Langmuir. 24 : 11866-11871. Dauber IV, Voigt Т., Härtel X., Mayer J. 2000. J Muscle Res. Cell Motil. 21 : 443-449. Delehanty J. В., Mattoussi H„ Medintz I. L. 2009. Anal. Bioanal. Chem. 393 : 1091-1105. Heuser J. E„ Anderson R. G. 1989. J. Cell Biol. 108 : 389-400. Hild W. A„ Breunig M„ Goepferich A. 2008. Eur. J. Pharm. Biopharm. 68 : 153-168. Jorissen R.N., Walker F., Pouliot N.. Garrett T.P., Ward С. IV, Burgess A.W. 2003. Exp. Cell. Res. 284 : 31-53. Kaisto Т., Rahkila P., Marjomäki V., Parton R. G„ Metsikkö К. 1999. Exp. Cell Res. 253 : 551-560. Kharchenko M. V., Aksyonov A. A., Melikova M. M„ Kornilova E. S. 2007. Cell Biol. Int. 31 : 349-359. Lindgren M„ Hallbrink M„ Prochiantz A., Langel U. 2000. Trends Pharmacol. Sei. 21 : 99-103. Lu Z„ Joseph D„ Bugnard E„ Zaal K. J., Ralston E. 2001. Mol. Biol. Cell. 12 : 795-808. Mainardes R. M„ Gremiao M. P., Brunetti I. L„ da Fonseca L. M„ Khalil N. M. 2008. J. Pharm. Sei. 98 : 257-267. Minshall R. D„ Tiruppathi C„ Vogel S. M„ Niles W. D., Gilchrist A„ Hamm H. E„ Malik A. B. 2000. J. Cell. Biol. 150 : 10571070. Murphy R.F. 1991. Trends Cell Biol. 1 : 77-82. Niles W. D„ Malik A. B. 1999. J. Membr. Biol. 167 : 85-101. Ralston E. 1993. J. Cell Biol. 120 : 399-409. Ralston E„ Ploug Т., KalhovdeJ., Lomo T. 2001. J. Neurosci. 21 : 875-883. Ruan G„ Agrawal A., Marcus A. /., Nie S. 2007. J. Am. Chem. Soc. 129 : 14759-14766. Xue F. L„ Chen J. Y„ Guo J., Wang С. С., Yang W. L„ Wang P. N.. Lu D. R. 2007. J. Fluoresc. 17 :149-154.

Лицензия ЛР № 020593 от 07.08.97

Подписано в печать 18.04.2011. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,0. Уч.-изд. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 7484Ь.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.:(812)550-40-14 Тел./факс: (812) 297-57-76

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Салова, Анна Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность проблемы

1.2. Цель и задачи исследования

1.3. Основные положения, выносимые на защиту

1.4. Научная новизна полученных результатов

1.5. Теоретическое и практическое значение работы

1.6. Апробация работы

1.7. Структура и объем диссертации

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Эндоцитоз

2.1.1. Типы эндоцитоза

2.1.2. Клатрин-зависимый рецептор-опосредованный эндоцитоз

2.1.3. Эндоцитоз ЭФР-рецепторных комплексов

2.1.3.1. ЭФР и его рецептор

2.1.3.2. Регуляция эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов

2.2. Квантовые точки

2.2.1. Синтез и свойства КТ

2.2.2. Функционализация КТ

2.2.3. Взаимодействие с клетками неспецифических (нетаргетных) КТ

2.2.4. Специфическое взаимодействие КТ с клетками

2.2.5. Цитотоксичность КТ

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Культивирование клеток

3.2. Квантовые точки

3.3. Флуоресцентные витальные красители

3.4. Ингибиторы

3.5. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток

3.6. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия

4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1. Анализ проникновения в клетки инертных КТ (ПЭГ-КТ)

4.2. Исследование эндоцитоза ТАТ-КТ

4.3. Исследование эндоцитоза ЭФР-КТ

5. ОБСУЖДЕНИЕ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Взаимодействие живых клеток с флуоресцентными полупроводниковыми наночастицами и органическими флуорофорами: проникновение и внутриклеточный транспорт"

Визуализация происходящих в живой клетке процессов имеет огромное значение для их понимания. Существенные усилия затрачиваются на создание оптических микроскопов» с высокой разрешающей способностью и разработку новых методических подходов. Такие методы, как FRET, FRAP, TIRF и др., все шире используются для выявления локализации макромолекул и их взаимодействий. Во всех методах визуализации на оптическом уровне, в основном, используются флуоресцентные красители, например, проникающие через клеточную мембрану (акридиновый оранжевый (АО), LysoTracker) или способные встраиваться в гидрофобные липидные слои и таким образом метить плазматическую мембрану и производные ее структуры - эндосомы или Т-систему (RH 414, di-8-ANEPPS). Принципиально новый уровень исследования внутриклеточных процессов приобрели благодаря внедрению методов с использованием флуоресцентно меченых антител, узнающих определенные антигены, а также зеленого флуоресцентного белка (GFP) и его модификаций.

Опыт применения антител к поверхностным антигенам, например, к рецепторам фактора роста на живых клетках показал, что эти антитела могут влиять на внутриклеточную судьбу меченных ими молекул (например, стимулировать эндоцитоз в отсутствие лиганда), приводя, таким образом; к. появлению артефактов: Так, например, ряд антител к HER2, одному из рецепторов семейства ErbB, не имеющего собственного лиганда и не способного подвергаться эндоцитозу, могут стимулировать этот процесс и таким образом удалять этот онкопротеин с поверхности клеток. Подобные антитела широко применяются в терапии опухолей, гиперэкспрессирующих HER2 (Ben-Kasus et al., 2009).

Для фундаментальных исследований механизмов функционирования того или иного белка требования к метке, с помощью которой отслеживается поведение белка-мишени, совершенно- иные. В этом случае можно сформулировать набор требований к «идеальной» флуоресцентной метке: (1) отсутствие влияния на поведение молекулы-мишени; (2) возможность длительных прижизненных наблюдений; (3) возможность выявления молекул, концентрация которых в клетке мала, вплоть до визуализации одиночных молекул; (4) возможность одновременного мечения нескольких мишеней. Однако в случае применения той или иной метки для прикладных целей (диагностика, терапия, адресная доставка лекарств и др.) способность метки изменять судьбу молекул-мишеней может, в конечном итоге, быть использована для усиления их действия или достижения дополнительных эффектов. С этой точки зрения, понимание того, как, когда и почему метка влияет на поведение мишени, становится особенно важным. Поскольку в этом случае предполагается введение меченых молекул в организм (например, для детекции опухолевых клеток), весьма существенным являются специфичность их взаимодействия с клетками-мишенями, токсичность, пути вывода из организма и т. д.

Появившийся сравнительно недавно новый класс флуорофоров- — полупроводниковые нанокристаллы — квантовые точки (КТ), — обладает многими свойствами, позволяющими считать его совершенно уникальным (А1тза1:о8, 1996; Олейников и др., 2007; Вуи & а1., 2008). Действительно, КТ имеют широкую полосу возбуждения (от УФ до видимой части' спектра); узкий и симметричный спектр флуоресценции, максимум которого зависит от размера ядра КТ; высокий квантовый выход; исключительную фотостабильность. Однако материалы, из которых синтезируют КТ (элементы П-У1 (СсШе, Сс1Те, СёБ и гп8е) и Ш-У (1пР и 1пАз) групп периодической системы), сами по себе токсичны, а исходные размеры КТ (2— 9 нм) значительно увеличиваются при их функционализации — придания им способности растворяться в биологических жидкостях и специфически связывать определенные мишени (НПс1 е! а1., 2008; Ве1е11ап1у а1., 2009; Вуи Й а1., 2010).

Bs связи с вышеизложенным в настоящей работе исследовали три типа КТ (на основе CdSe/ZnS): (1) КТ, покрытые слоем полиэтиленгликоля (ПЭГ), которые минимально» взаимодействуют с биологическим материалом и могут рассматриваться как инертные;: (2) КТ. конъюгированные с ТАТ-пептидом, который; представляет собой фрагмент ТАТ-белка вируса ВИЧ-1 и относится' к пептидам; проникающим в клетку (cell penetrating peptide, GPP); TAT-пептид часто используют как вектор для ¡переноса через мембрану различных макромолекул; (3) КТ, конъюгированные с: эпйдермальным фактором роста; (ЭФР). Выбор ЭФР для решения поставленных задач связан^ во-первых, с большим количеством данных по эндоцитозу рецептора этого ростового фактора; позволяющих провести корректное сравнение многих параметров эндоцитоза, стимулированного немодифицированным и меченным КТ лигандом. Во-вторых, рецептор ЭФР является сигнальным белком, участвующим в регуляции таких важных процессов; как пролиферация; клеточная подвижность, выживание при апоптозе и др., что позволяет в перспективе исследовать возможное: влияние КТ на внутриклеточную сигнализацию; В-третьих, развитие многочисленных опухолей эпителиального происхождения, в частности, опухолей ЖКТ, коррелирует с гиперэкспрессией, рецептора ЭФР, что делает исследования функционирования этой мишени особенно важными для медицинской практики.

Основные представления по динамике эндоцитоза рецептора ЭФР были сформированы на основе иммунофлуоресцентных исследований на фиксированных клетках (Beguinot et al., 1984). Неизвестно, насколько данные, получаемые при фиксации клеток, отражают нативные процессы, протекающие в живых клетках. Использование КТ позволяет проводить эксперименты, на живых клетках. В настоящее время данные о системных исследованиях по динамике эндоцитоза рецептора ЭФР на живых клетках практически отсутствуют.

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Салова, Анна Владимировна

7. ВЫВОДЫ

1. Динамика взаимодействия и путь проникновения квантовых точек (КТ) в клетки зависят от типа клеток и функционализации КТ;.при этом способ проникновения КТ в клетку определяется лигандом, а не КТ.

3. Совместное использование КТ, акридинового оранжевого и липофильных красителей (ИН 414 или &-8-АЫЕРР8) позволило продемонстрировать, что ТАТ-КТ, проникая путем эндоцитоза в миобласты, не способны интернализоваться миотубулами, несмотря на то, что процесс формирования эндосом в этих клетках не нарушен.

4. Основные стадии эндоцитоза комплексов ЭФР-КТ: взаимодействие с рецепторами, интернализация, слияние эндосом, их транспортировка по микротрубочкам и формирование мультивезикулярных тел — не отличаются от этапов эндоцитоза; стимулированного немодифицированным ЭФР.

8. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

1. Беляева Т. Н., Адамян С. Я., Кроленко С. А., Леонтьева Е. А., Моженок Т. П., Салона А. В., Фаддеева М. Д. 2009. Распределение и спектры флуоресценции АО в миобластах и одиночных мышечных волокнах. Цитология. 51 (2) : 103-110.

2. Беляева Т. Н., Салона А. В., Леонтьева Е. А., Моженок Т. П., Корнилова Е. С., Кроленко С. А. 2009. Нецелевые квантовые точки в прижизненных конфокально-микроскопических исследованиях клеток. Цитология. 51 (10) : 830-837.

4. Belyaeva Т., Leontieva Е., Mozhenok Т., Salova А. 2007. Spectral characteristics of acridine orange accumulated within acidic organelles of tb — myoblasts in culture and in skeletal muscle fibers. Abstracts of 16 ESGLD Workshop : 136.

7. Салова А. В. 2008. Нецелевые и целевые квантовые точки в прижизненных конфокально-микроскопических исследованиях различных клеток. Материалы Политехнического симпозиума. "Молодые ученые — промышленности Северо-Западного региона" : 126.

8. Салова А. В., Беляева Т. Н., Корнилова Е. С., Леонтьева Е. А., Моженок Т. П., Кроленко С. А. 20091 Прижизненные исследования динамики поступления- квантовых точек в клетки HeLa (лазерная сканирующая, конфокальная- микроскопия). Материалы 1-й международной^ научной школы «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах» : 330-332.

9. Belyaeva Т. N., Leontieva Е. A., Kornilova Е. S., Mozhenok Т. P., Salova А. V., Krolenko S. А. 2009. Laser confocal microscopic study of Quantum-Dots uptake into the cells by EGF-mediated endocytosis. Abstracts of 17th ESGLD Workshop : 8.

10.Салова А. В., Беляева Т. H., Леонтьева Е. А., Моженок Т. П., Кроленко С. А, Корнилова Е. С. 2009. Проблемы и перспективы*применения нецелевых и целевых квантовых точек в исследованиях живых клеток. Материалы второго международного форума по нанотехнологиям : 807-809.

11.Salova A., Belyaeva Т., Kornilova Е., Leontieva Е., Mozhenok Т., Krolenko S. 2009. Laser confocal microscopic study of targeted quantum dots uptakeinto HeLa cells. Abstracts of international conference "Modern microscopy techniques in biology and medicine" : 26. i

12.Салова А. В., Леонтьева E. А., Моженок Т.П., Кроленко С. A, Корнилова E. С., Беляева Т.Н. 2010. Применение функционализированных квантовых точек в-исследованиях эндоцитоза в живых клетках [Электронный ресурс, 1 диск (CD-ROM)]. Материалы третьего международного форума по нанотехнологиям. М.: Российская корпорация нанотехнологий.

13.Салова А. В., Беляева Т. Н., Леонтьева Е. А., Моженок Т. П., Кроленко С. А, Корнилова Е. С. 2010. Динамика поступления квантовых точек в клетки HeLa. Тезисы докладов и сообщений, представленных на II конференцию молодых ученых Института цитологии РАН. Цитология. 52 (6) : 505.

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что применение квантовых точек (КТ) делает возможным выявление меченных ими мишеней, находящихся в очень низких концентрациях, в живых клетках. Более того, КТ исключительно удобны для изучения* и количественного анализа таких процессов, как транслокация везикул, меченных КТ, по микротрубочкам и слияние везикул. Проведенное исследование позволяет говорить о том, что не КТ, а лиганды определяют тот путь, с помощью которого комплексы будут проникать в клетки. При этом необходимо учитывать особенности каждого конкретного механизма (например, необходимость димеризации рецепторов) для формирования наиболее эффективных с точки зрения интернализации и «полноценных» с точки зрения их биологических эффектов комплексов КТ с лигандами. Однако также очевидно, что КТ, даже инертные, нельзя считать нейтральными маркерами. Во-первых, они могут поглощаться клетками, которые исследователи не рассматривают в качестве мишени при постановке основной задачи. Во-вторых, мечение ими определенных лигандов в принципе способно изменять дальнейшую судьбу интернализованных лигандов. Имея в виду, что рецептор ЭФР не только участвует в регуляции широкого спектра клеточных процессов в норме, но и часто гиперэкспрессируется при трансформации клеток, разработка методов детекции таких одиночных клеток в доступных для неинвазивного вмешательства органах (например, в ЖКТ) представляется весьма перспективной. Показанное нами накопление КТ, связанного с ЭФР, в лизосомах, делает возможным разработку протоколов выявления одиночных трансформированных клеток и длительного мониторинга поведения клеток в организме. Высокий квантовый выход и фотостабильность КТ делает их первыми кандидатами для использования в таких подходах. Однако наши данные говорят о том, что необходимы дополнительные исследования, посвященные выяснению последствий выявленных изменений динамики эндоцитоза. Для применения КТ в медицине необходимо минимизировать все побочные эффекты, например, поглощение профессиональными

78 фагоцитами несвязавшихся с клетками-мишенями ЭФР-КТ, а также клетками почек и печени. Неясным также остается вопрос о судьбе клеток после аккумуляции в них КТ. Дальнейшие исследования этих аспектов остаются первоочередной задачей. Важным также является выяснение того, соответствуют ли сигнальные свойства рецепторов, надолго задерживающихся в клетке, сигнальным свойствам нативных лиганд-рецепторных комплексов. В связи с появлением все большего количества доказательств сигнальной роли интернализованных тирозинкиназных рецепторов, в том числе на поздних стадиях эндоцитоза, этот вопрос становится одним из основных в рассматриваемой области.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Салова, Анна Владимировна, Санкт-Петербург

1. Кроленко С. А. 1975. Т-система мышечных волокон. Л.: Наука. 128 с.

2. Кроленко С. А., Адамян С. Я., Беляева Т. Н., Моженок Т. П. 2003. Локализация кислых органоидов в скелетных мышечных волокнах лягушки. Цитология. 45 (7) : 714-721.

3. Кроленко С. А., Адамян С. ЯБеляева Т. Н., Моженок Т. П., Салова А. В. 2007. Конфокально-микроскопическое исследование мембранных органоидов скелетного мышечного волокна в процессе распространяющегося некроза. Цитология. 49 (2) : 107—114.

4. Крылова Т. А., Фридлянская И. И. 1988. Культивирование скелетно-мышечных клеток. В кн.: Методы культивирования клеток. Л., Наука : 282-290.

5. Никольский Н. Н., Соркин А. Д., Соркин А. В. 1987. Эпидермальный фактор роста. Л.: Наука. 200 с.

6. Олейников В. А., Суханова А. В., Набиев И. Р. 2007. Флуоресцентные полупроводниковые нанокристаллы в биологии и медицине. Российские нанотехнологии. 2 (1-2) : 160-173.

7. Харченко М. В., Аксенов Н. Д., Корнилова Е. С. 2002. Влияние гипертонического раствора сахарозы и 5-(М,М-гексаметилен)-амилорида на рецептор-опосредованный и жидкофазный эндоцитоз. Цитология. 44 (7) : 681-690.

8. Abe Т., Такапо К., Suzuki A., Shimada Y., Inagaki М., Sato N., Obinata Т., Endo Т. 2004. Myocyte differentiation generates nuclear invaginations traversed by myofibrils associating with sarcomeric protein mRNAs. J. Cell Sci. 117 : 6523-6534.

9. Akerman M. E., Chan W. C., Laakkonen P., Bhatia S. N., Ruoslahti E. 2002. Nanocrystal targeting in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 : 12617-12621.

10. Alivisatos A. P. 1996. Semiconductor clusters, nanocrystals, and quantum dots. Science. 271 :933-937.

11. Anderson R. G. 1998. The caveolae membrane system. Annu. Rev. Biochem. 67 : 199-225.

12. Bache K. G., Raiborg C., Mehlum A., Stenmark H. 2003. STAM and Hrs are subunits of a multivalent ubiquitin-binding complex on early endosomes. J. Biol. Chem. 278 : 12513-12521.

13. Ballou B., Ernst L. A., Andreko S., Harper T., Fitzpatrick J. A., Waggoner A. S., Bruchez M. P. 2007. Sentinel lymph node imaging using quantum dots in mouse tumor models. Bioconjug. Chem. 18 : 389-396.

14. Barua S., Rege K. 2009. Cancer-cell-phenotype-dependent differential intracellular trafficking of unconjugated quantum dots. Small. 5 : 370-376.

15. Beguinot L., Lyall R. M., Willingham M. C., Pastan I. 1984. Down-regulation of the epidermal growth factor receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81 : 2384-2388.

16. Ben-Kasus T., Schechter B., Lavi S., Yarden Y., Sela M. 2009. Persistent elimination of ErbB-2/HER2-overexpressing tumors using combinations of monoclonal antibodies: relevance of receptor endocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 : 3294-3299.

17. BentzenE. L., Tomlinson I. D., Mason J., GreschP., Warnement M. R., Wright D., Sanders-Bush E., Blakely R., Rosenthal S. J. 2005. Surface modification to reduce nonspecific binding of quantum dots in live cell assays. Bioconjug. Chem. 16 : 1488-1494.

18. Biju V., Itoh T., Anas A., Sujith A., Ishikawa M. 2008. Semiconductor quantum dots and metal nanoparticles: syntheses, optical properties, and biological applications. Anal. Bioanal. Chem. 391 : 2469-2495.

19. Biju V., Itoh 71, Ishikawa M. 2010. Delivering quantum dots to cells: bioconjugated quantum dots for targeted and nonspecific extracellular and intracellular imaging. Chem. Soc. Rev. 39 : 3031-3056.

20. Bruchez M. Jr., Moronne M., Gin P., Weiss S., Alivisatos A. P. 1998. Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labels. Science. 281 : 2013-2016.

21. Burattini S., Ferri P., Battistelli M., Curci R., Luchetti F., Falcieri E. 2004. C2C12 murine myoblasts as a model of skeletal muscle development: morpho-functional characterization. Eur. J. Histochem. 48 : 223-233*.

22. Cahill K. 2009. Simple model of the transduction of cell-penetrating peptides. IET Syst. Biol. 3 : 300-306.

23. Cai W., Chen X. 2008. Preparation of peptide-conjugated quantum dots for tumor vasculature-targeted imaging. Nat. Protoc. 3 : 89-96.

24. Carpenter G. 1992. Receptor tyrosine kinase substrates: src homology domains and signal transduction. Faseb J. 6 : 3283-3289.

25. Carpenter G., Cohen S. 1979. Epidermal growth factor. Annu Rev. Biochem. 48 : 193-216.

26. Chan W.C.W., Nie S. 1998. Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection. Science 281 : 2016-2018.

27. Chan W. S. W., Maxwell D. J., Gao X., Bailey R. E., Han M., Nie S. 2002. Luminescent quantum dots for multiplexed biological detection and imaging. Curr. Opin. Biotechnol. 13 : 40^16.

28. Chen B., Liu Q., Zhang Y., Xu L., Fang X. 2008. Transmembrane delivery of the cell-penetrating peptide conjugated semiconductor quantum dots. Langmuir. 24 : 11866-11871.

29. Chen F., Gerion D. 2004. Fluorescent CdSe/ZnS nanocrystal-peptide conjugates for long-term, nontoxic imaging and nuclear, targeting in living cells. Nano Lett. 4 : 1827-1832.

30. Choi H. S., Liu IV., Liu F., Nasr K., Misra P., Bawendi M. G., Frangioni J. V. 2010. Design considerations for tumour-targeted nanoparticles. Nat. Nano. 5 : 42-47.

31. Cohen S. 1962. Isolation of a mouse submaxillary gland protein accelerating incisor eruption and eyelid opening in the new-born animal: J:. Biol; Chem. 237:1555-1562.

32. Dauber W., Voigt T., HärtelX., Mayer J. 2000. The T-tubular network and its triads in the sole plate sarcoplasm of the motor end-plate of mammals. J Muscle Res. Cell Motil. 21 : 443-449.

33. Delehanty J. B., Mattoussi H., Medintz I: L. 2009. Delivering quantum dots into cells: strategies, progress and remaining issues. Anal. Bioanal. Chem. 393 : 1091-1105.

34. Delehanty J. B., Medintz I. L., Pons T., Brunei F. M., Dawson P. E., Mattoussi H. 2006. Self-assembled quantum dot-peptide bioconjugates for selective intracellular delivery. Bioconjug. Chem. 17 : 920-927.

35. Derfus A. M., Chan W. C. W., Bhatia S. N. 2004a. Intracellular delivery of quantum dots for live cell labeling and organelle tracking. Adv. Mater. 16 : 961-966.

36. Derfus A. M., Chan W. C. W., Bhatia S. N. 2004b. Probing the cytotoxicity of semiconductor quantum dots. Nano Lett. 4 : 11-18.

37. Duan Hi, Nie S. 2007. Cell-penetrating* quantum dots based on multivalent and endosome-disruptingsurface coatings. J. Am. Chem. Soc. 129 : 3333-3338.

38. Dubertret B., Skourides P., Norris D. J., Noireaux V., Brivanlou A. H:, Libchaber A. 2002. In vivo imaging* of quantum» dots encapsulated in phospholipid micelles. Science. 298 : 1759-1762.

39. Duchardt F., Fotin-Mleczek M., Schwarz H., Fischer R., Brock R. 2007. A comprehensive model for the cellular uptake of cationic cell-penetrating peptides. Traffic. 8 : 848-866.

40. Dunn K. W., Maxfield F. R. 1992. Delivery of ligands from sorting endosomes to late endosomes occurs by maturation of sorting endosomes. J. Cell Biol. 117 : 301-310.

41. Dupre S., Volland C., Haguenauer-Tsapis R: 2001. Membrane transport: ubiquitylation in endosomal sorting. Curr. Biol. 11 : 932-934.

42. De Duve C. 1963. The lysosome. Sci. Am. 208 : 64-72.

43. Erogbogbo F., Yong K., Roy L, Xu G., Prasad P. N., Swihart M. T. 2008. Biocompatible luminescent silicon quantum dots for imaging of cancer cells. ACS Nano. 2 : 873-878.

44. Flucher B. E., Terasaki M., Chin H. M., Beeler T. J., Daniels M. P. 1991. Biogenesis of transverse tubules in skeletal muscle in vitro. Develop. Biol. 145 : 77-90.

45. Geys J., Nemmar A., Verbeken E., Smolders E., Ratoi M., Hoylaerts M. F., Nemery B., Hoet P. H. 2008. Acute toxicity and prothrombotic effects of quantum dots: impact of surface charge. Environ Health Perspect. 116 : 16071613.

46. Germain R. N. 2004. An innately interesting decade of research in immunology. Nat. Med. 10 : 1307-1320.

47. Gruenberg J., Griffiths G., Howell K. E. 1989. Characterization^ of the early endosome and putative endocytic carrier vesicles in vivo and' with an assay of vesicle fusion in vitro. J. Cell Biol. 108 : 1301-1316.

48. Hardman R. 2006. A toxicologic review of quantum dots: toxicity depends on physicochemical and environmental factors. Environ Health Perspect. 114 : 165-172.

49. Heuser J. E., Anderson R. G. 1989. Hypertonic media inhibit receptor-mediated endocytosis by blocking clathrin-coated pit formation. J. Cell Biol. 108 :38SM00.

50. Hild W. A., Breunig M., Goepferich A. 2008. Quantum dots nano-sized probes for the exploration of cellular and intracellular targeting. Eur. J. Pharm. Biopharm. 68 : 153-168.

51. Hines M. A., Guyot-Sionnest P. 1996. Synthesis and characterization of strongly luminescent ZnS-capped CdSe nanocrystals. J. Phys. Chem. 100 : 468-471.

52. Holbro T., Civenni G., Hynes N. E. 2003. The ErbB receptors and their role in cancer progression. Exp. Cell Res. 284 : 99-110.

53. Hoshino A., FujiokaK., Oku T., Suga M, Sasaki Y. F., Ohta T., Yasuhara M., Suzuki K., Yamamoto K. 2004. Physicochemical properties and cellular toxicity of nanocrystal quantum dots depend on their surface modification. Nano Lett. 4 : 2163-2169.

54. Howarth M., Liu W., Puthenveetil S., Zheng Y., Marshall L. F., Schmidt M: M., Wittrup K. D., Bawendi M. G., Ting A., Y. 2008. Monovalent, reduced-size quantum dots for imaging receptors on?living cells. Nat. Meth. 5 : 397—399.

55. Hurley J. H., Emr Si D. 2006. The ESCRT complexes: structure and mechanism of a membrane-trafficking network. Annu Rev. Biophys. Biomol: Struct: 35 : 277-298.

56. Jaiswal J. K, Mattoussi H., Mauro J. M., Simon S. M. 2003. Long-term multiple color imaging of live cells using quantum dot bioconjugates. Nat. Biotechnol. 21 : 47-51.

57. Jorissen R. N., Walker F., Pouliot N., Garrett T. P., Ward C. W., Burgess A. W. 2003. Epidermal growth factor receptor: mechanisms of activation and signalling. Exp. Cell. Res. 284 : 31-53.

58. Jovic M, Sharma M., Rahajeng J., Caplan S. 2010. The early endosome: a busy sorting station for proteins at the crossroads. Histol. Histopathol. 25 : 99-112.

59. Kairdolf B. A., Mancini M. C., Smith A. M., Nie S. 2008. Minimizing nonspecific cellular binding of quantum dots with hydroxyl-derivatized surface coatings. Anal. Chem. 80 : 3029-3034.

60. Kaisto T., Rahkila P., Marjomaki V., Parton R. G., Metsikko K. 1999. Endocytosis in skeletal muscle fibers. Exp. Cell Res. 253 : 551-560.

61. KelfT. A., Sreenivasan V. K., Sun J., Kim E. J., Goldys E. M., Zvyagin A. V. 2010. Non-specific cellular uptake of surface-fiinctionalized quantum dots. Nanotechnology. 21 :285105.

62. Kharchenko M. V., Aksyonov A. A., Melikova M. M., Kornilova. E. S. 2007. Epidermal growth factor (EGF) receptor endocytosis is accompanied by reorganization of microtubule system in HeLa cells. Cell Biol. Int. 31 : 349359.

63. Kingeter L. M., Schaefer B. C. 2009. Expanding the multicolor capabilities of basic confocal microscopes by employing red and near-infrared quantum dot conjugates. BMC Biotechnol. 9 : 49.

64. Kirchner C., Liedl T., Kudera S., Pellegrino T., Javier A. M., Gaub H. E., Stoelzle S., Fertig N., Parak W. J. 2005. Cytotoxicity of colloidal,' cdse and cdse/zns nanoparticles. Nano Lett. 5 : 331—338.

65. Kollias H. D., Perry R. L., Miyake T., Aziz A., McDermott J. C. 2006. Smad7 promotes and enhances skeletal muscle differentiation. Mol. Cell. Biol. 26 : 6248-6260.

66. Kong C., Su X., Chen P. /., Stahl P. D. 2007. Rinl interacts with signal-transducing adaptor molecule (STAM) and mediates epidermal growth factor receptor trafficking and degradation. J. Biol. Chem. 282 : 15294-15301.

67. Koshman Y. E., Waters S. B., Walker L. A., Los T., de Tombe P., Goldspink P. H., Russell B. 2008. Delivery and visualization of proteins conjugated to quantum dots in cardiac myocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 45 : 853-856.

68. Krolenko S. A., Adamyan S. Ya., Belyaeva T. N., Mozhenok T. P. 2006. Acridine orange accumulation in acid organelles of normal and vacuolated frog skeletal muscle fibres. Cell Biol. Int. 30 : 933-939.

69. Krolenko S. A., Lucy J. A. 2001. Reversible vacuolation of T-tubules in skeletal muscle: mechanisms and implications for cell biology. Int. Rev. Cytol. 202 : 243-298.

70. Kuo T. R., Lee C. F., Lin S. J., Dong C. Y., Chen C. C., Tan H. Y. 2011. Studies of Intracorneal Distribution and Cytotoxicity of Quantum Dots: Risk Assessment of Eye Exposure. Toxicol. 24 : 253-261.

71. Lee J., Kim J., Park E., Jo S., Song R. 2008. PEG-ylated cationic CdSe/ZnS QDs as an efficient intracellular labeling agent. Phys. Chem. Chem. Phys. 10 : 1739-1742.

72. Li S., Wang Y., Wang H., Bai Y., Liang G., Wang Y., Huang N., Xiao Z. 2011. MicroRNAs as participants in cytotoxicity of CdTe quantum dots in NIH/3T3 cells. Biomaterials 32 : 3807-3814.

73. Lidke D. S., Nagy P., Heintzmann R., Arndt-Jovin D. J., Post J. N., Grecco H. E., Jares-Erijman E. A., Jovin T. M. 2004. Quantum dot ligands provide new insights into erbB/HER receptor-mediated signal transduction. Nat. Biotechnol. 22 : 198-203.

74. Lin S., Xie X., Patel M. R., Yang Y H., Li Z., Cao F., Gheysens O., Zhang Y., Gambhir S. S., Rao J. H., Wu J. C. 2007. Quantum dot imaging for. embryonic stem cells. BMC Biotechnol. 7:67.

75. Lindgren M., Hallbrink M., Prochiantz A., Langel U. 2000. Cellpenetrating peptides. Trends Pharmacol. Sci. 21 : 99-103.

76. Lindmo K., Stenmark H. 2006. Regulation of membrane traffic by phosphoinositide 3-kinases. J. Cell Sci. 119 : 605-614.

77. Liu W., Howarth M., Greytak A. B., Zheng Y., Nocera D. G., Ting A. Y., Bawendi M. G 2008. Compact biocompatible quantum dots functionalized for cellular imaging. J. Am. Chem. Soc. 130 : 1274-1284.

78. Lu Z., Joseph D., Bugnard E., Zaal K. J., Ralston E. 2001. Golgi complex reorganization during muscle differentiation: visualization in living cells and mechanism. Mol. Biol. Cell. 12 : 795-808.

79. Mainardes R. M., Gremiao M. P., Brunetti I. L., da Fonseca L. M., Khalil N. M. 2008. Zidovudine-loaded PLA and PLA-PEG blend nanoparticles: Influence of polymer type on phagocytic uptake by polymorphonuclear cells. J. Pharm. Sci. 98 :257-267.

80. Mahto S. K., Park C., Yoon T. H., Rhee S. W. 2010. Assessment of cytocompatibility of surface-modified CdSe/ZnSe quantum dots for BALB/3T3 fibroblast cells. Toxicol In Vitro. 24 : 1070-1077.

81. Marsh M., McMahon H. T. 1999. The structural era of endocytosis. Science. 285 :215-220.

82. Maysinger D., Behrendt M, Lalancette-Hebert M., Kriz J. 2007. Real-time imaging of astrocyte response to quantum dots: in vivo screening model system for biocompatibility of nanoparticles. Nano Lett. 7 : 2513-2520.

83. Mellman I., Fuchs R., Helenius A. 1986. Acidification of the endocytic and exocytic pathways. Annu. Rev. Biochem. 55 : 663-700.

84. Miaczynska M., Pelkmans L., Zerial M. 2004. Not just a sink: endosomes in control of signal transduction. Curr. Opin. Cell Biol. 16 : 400-406.

85. Michalet X., Pinaud F. F., Bentolila L. A., Tsay J. M., Doose S., Li J. J., Sundaresan G., Wu A. M, Gambhir S. S., Weiss S. 2005. Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics. Science. 307 : 538-544.

86. Michalet X., Pinaud F., Lacoste T. D., Dahan M., Bruchez M. P., Alivisatos A. P., Weiss S. 2001. Properties of fluorescent semiconductor nanocrystals and their application to biological labeling. Single Mol. 2 : 261-276.

87. MinshallR. D., Tiruppathi C., Vogel S. M., Niles W. D., Gilchrist A., Hamm H. E., Malik A. B. 2000. Endothelial cell-surface gp60 activates vesicle formation and trafficking via G(i)-coupled Src kinase signaling pathway. J. Cell. Biol. 150 : 1057-1070.

88. Mok H., Bae K. H., Ahn C. H., Park T. G. 2009. PEGylated and MMP-2 specifically dePEGylated quantum dots: comparative evaluation of cellular uptake. Langmuir 25 : 1645-1650.

89. Mueller J., Kretzschmar I., Volbner R., Boisguerin P. 2008. Comparison of cellular uptake using 22 CPPs in 4 different cell lines. Bioconjugate Chem. 19 : 2363-2374.

90. Murphy R. F. 1991. Maturation models for endosome and lysosome biogenesis. Trends Cell Biol. 1 : 77-82.

91. Murray C. B., Norris D. J., Bawendi M. G. 1993. Synthesis and characterization of nearly monodisperse CdE (E = S, Se, Te) semiconductor nanocrystallites. J. Am. Chem. Soc. 115 : 8706-8715.

92. Niles W. D., Malik A. B. 1999. Endocytosis and exocytosis events regulate vesicle traffic in endothelial cells. J. Membr. Biol. 167 : 85-101.

93. Pan Y. L, Cai J. Y., Oin L., Wang H. 2006. Atomic force microscopy-based celli nanostructure for ligand-conjugated quantum dot endocytosis. Acta Biochirm Biophys. Sin. 38 : 646-652.

94. Park J., Gu L., von Maltzahn G., Ruoslahti E., Bhatia S. N., Sailor M. J. 2009. Biodegradable luminescent porous silicon nanoparticles for in vivo applications. Nat. Mater. 8 : 331-336.

95. Pelkmans L. 2005. Secrets of caveolae- and lipid raft-mediated endocytosis revealed by mammalian viruses. Biochim. Biophys. Acta. 1746 : 295-304.

96. Poon G. M., Gariepy J. 2007. Cell-surface proteoglycans as molecular portals for. cationic peptide and polymer entry into cells. Biochem. Soc. Trans. 35 : 788-793.

97. Pradhan N., Goorskey D., Thessing J., Peng X. 2005. An alternative of CdSe nanocrystal emitters: pure and tunable impurity emissions in ZnSe nanocrystals. J. Am. Chem. Soc. 127 : 17586-17587.

98. Puente L. G., Voisin S., Lee R. E., Megeney L. A. 2006. Reconstructing the regulatory kinase pathways of myogenesis from phosphopeptide data. Molt Cell Proteomics. 5 : 2244-2251.

99. Raj an S. S., Liu H. Y., Vu T. Q. 2008. Ligand-bound quantum dot probes for studying the molecular scale dynamics of receptor, endocytic trafficking in live cells. ACS Nano. 2 : 1153-1166.

100. Ralston E. 1993. Changes in architecture of the Golgi complex and other subcellular organelles during myogenesis. J. Cell Biol. 120 : 399-409.

101. Ralston E., Ploug T., Kalhovde J., Lomo T. 2001. Golgi complex, endoplasmic reticulum exit sites, and microtubules in skeletal muscle fibers are organized by patterned activity. J. Neurosci. 21 : 875-883.

102. Reiss P., Protiure M., Li L. 2009. Core/Shell semiconductor nanocrystals. Small. 5 : 154-168.

103. Ren Y„ Cheng L., Rong Z., Li Z, Li Y, Zhang X., Xiong S., Hu J., Fu X. Y., Chang Z. 2008. hSef potentiates EGF-mediated MAPK signaling through affecting EGFR trafficking and degradation. Cell Signal. 20 : 518-533.

104. Ruan G., Agrawal A., Marcus A. I., Nie S. 2007. Imaging and tracking of tat peptide-conjugated quantum dots in living cells: new insights into nanoparticle uptake, intracellular transport, and vesicle shedding. J. Am. Chem. Soc. 129 : 14759-14766.

105. Ryman-Rasmussen J. P., Riviere J. E., Monteiro-Riviere N. A. 2006. Penetration of intact skin by quantum dots with diverse physicochemical properties. Toxicol. Sei. 91 : 159—165.

106. Ryman-Rasmussen J. P., Riviere J. E., Monteiro-Riviere N. A. 2007a. Variables influencing interactions of untargeted quantum dot nanoparticles with skin cells and identification of biochemical modulators. Nano Lett. 7 : 1344-1348.

107. Ryman-Rasmussen J. P., Riviere J. E., Monteiro-Riviere N. A. 2007b. Surface coatings determine cytotoxicity and irritation potential -of quantum dot nanoparticles in epidermal keratinocytes. J. Invest. Dermatol. 127 : 143—153.

108. Sanger J. W., Chowrashi P., Shaner N. C., Spalthoff S., Wang J., Freeman N. L., Sanger J. M. 2002". Myofibrillogenesis in skeletal muscle cells. Clin. Orthop. Relat. Res. 66 : 153-162.

109. Sawant R., Torchilin V. 2011. Intracellular delivery of nanoparticles with CPPs. Methods Mol. Biol. 683 : 431-451.

110. Schlessinger J. 1988. Regulation of cell growth and transformation by the epidermal growth factor receptor. Adv. Exp. Med. Biol. 234 : 65—73.

111. Smith A. M., Nie S. 2009. Next-generation quantum dots. Nat. Biotech. 27 : 732-733.

112. Steinman R. M., Mellman I. S., Muller W. A., Cohn Z. A. 1983. Endocytosis and the recycling of plasma membrane. J. Cell Biol. 96 : 1-27.

113. Sukhanova A., Devy J., Venteo L., Kaplan H., Artemyev M., Oleinikov V., Klinov D., Pluot M., Cohen J. H., Nabiev I. 2004. Biocompatible fluorescent nanocrystals for immunolabeling of membrane proteins and cells. Anal. Biochem. 324 : 60-67.

114. Tekle C., Deurs B., Sandvig K., Iversen T. G. 2008. Cellular trafficking of quantum dot-ligand bioconjugates and their induction of changes in normal routing'of unconjugated ligands. Nano Lett. 8 : 1858-1865.

115. Thome R. G., Nicholson,C. 2006. In vivo diffusion analysis with quantum:dots and dextrans predicts the width of brain extracellular space. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 : 5567-5572.

116. Thornell L. E., Price M. G. 1991. The cytoskeleton in muscle cells in relation to function. Biochem. Soc. Trans. 19 : 1116-1119.

117. Ullrich A., Schlessinger J. 1990. Signal transduction by receptors with tyrosine kinase activity. Cell. 61 : 203-212.

118. Vu T. Q., MaddipatiR., Blute T. A., Nehilla B. J., Nusblat L., Desai T. A. 2005. Peptide-conjugated quantum dots activate neuronal receptors and initiate downstream signaling of neurite growth. Nano Lett. 5 : 603-607.

119. Walther C., Meyer K., Rennert R., Neundorf I. 2008. Quantum dot-carrier peptide conjugates suitable for imaging and delivery applications. Bioconjug Chem. 19 :2346-2356.

120. Wang C, Gao X, SuX. 2010. In vitro and in vivo imaging with quantum dots. Anal Bioanal Chem. 397 : 1397-1415.

121. Wang L., Nagesha D. K., Selvarasah S., Dokmeci M. R., Carrier R. L. 2008. Toxicity of CdSe nanoparticles in Caco-2 cell cultures. J. Nanobiotechnology. 6 : 11-26.

122. Wang Y., Pennock S., Chen X., Wang Z. 2002. Endosomal signaling of epidermal growth factor receptor stimulates signal transduction pathways leading to cell survival. Mol. Cell Biol. 22 : 7279-7290.

123. Wei Y., JanaN. R., TanS. J., YingJ. Y 2009. Surface coating directed cellular delivery of TAT-functionalized quantum dots. Bioconjug. Chem. 20 : 17521758.

124. Weisz O. A. 2003. Acidification and protein traffic. Int. Rev. Cytol. 226 : 259319.

125. Wileman T., Harding C., Stahl P. 1985. Receptor-mediated endocytosis. Biochem. J. 232 : 1-14.

126. Wiley H. S., Burke P. M. 2001. Regulation, of1 receptor tyrosine kinase signaling by endocytic trafficking. Traffic. 2001 2 : 12-18.

127. Wilkinson K. D. 2000.' Ubiquitination and deubiquitination: targeting of proteins for degradation by the proteasome. Semin. Cell Dev. Biol. 11 : !41

128. Wu X, Liu H., Liu J., Haley K. N., Treadway J. A., Larson J. P., Ge N., Peale' F., Bruchez M. P. 2003. Immunofluorescent labeling of cancer marker Her2 and other cellular targets with semiconductor quantum dots. Nat. Biotechnol. 21 :41-46.

129. Xiong R., Li Z., Mi L., Wang P. N., Chen J. Y., WangL., Yang W. L. 2010. Study on the intracellular fate of Tat peptide-conjugated quantum dots by spectroscopic investigation. J. Fluoresc. 20 : 551—556.

130. Xiao Y., Forry S. P., Gao X., Hoi brook R. D., Telford W. G., Tona A. 2010. Dynamics and mechanisms» of quantum dot nanoparticle cellular uptake. J. Nanobiotechnology.8 : 13 (000-000).

131. Xue F. L., Chen J. Y., Guo J., Wang C. C., Yang W. L., Wang P. N., Lu D. R. 2007. Enhancement of intracellular delivery of CdTe quantum dots (QDs) to living cells by Tat conjugation. J. Fluoresc. 17 : 149-154.

132. Yana M., Zhanga Y., Xua K., Fub T., Qinb H., Zhenga X. 2011. An, in vitro study of vascular endothelial toxicity of CdTe quantum dots. Toxicology. 282 :

133. Zhang L. W., Monteiro-Riviere N. A. 2009. Mechanisms of quantum dot nanoparticle cellular uptake. Toxicol Sci. 110 : 138-155.148.94.103.

Информация о работе

Салова, Анна Владимировна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2011
ВАК 03.03.04

Диссертация

Взаимодействие живых клеток с флуоресцентными полупроводниковыми наночастицами и органическими флуорофорами: проникновение и внутриклеточный транспорт - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы