Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние различных режимов замораживания на сохранность эмбрионов крупного рогатого скота

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние различных режимов замораживания на сохранность эмбрионов крупного рогатого скота"

УКРАИНСКАЯ АКАДЕМИЯ АГРАРНЫХ НАУК.

РГ6 , од

2 3 ДО? 1994

ИНСТИТУТ ЖИВОТНОВОДСТВА

На правах рукописи

ВАШГУРА ЕКАТЕРИНА ГЕННАДИЕВНА

УДК 636. 23/. 28. 082.4-089.843.

ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ РЕЖИМОВ ЗАМОРАЖИВАНИЯ НА СОХРАННОСТЬ ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

03.00.13. - физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

\

Харьков - 1994

Работа выполнена в отделе биологии размножения и искусствен* осеменения сельскохозяйственных животных института кивотноводс7 УААН.

Научный руководитель: 0СТА1Ж0 Федор Иванович, академик УААН, доктор биологических нау профессор.

Официальные оппоненты: ВИШНЕВСКИЙ Валентин Андреевич, доктор биологических наук. ГУЗЕВАТЫЙ Олег Евгеньевич, кандидат биологических наук.

Ведущее предприятие: Украинский научно-исследовательский инсть тут биохимии и физиологии сельскохозяйственных животных, г.Львов.

Защита состоится "Л- '^¿ЮЛ 199 4 года в ¿О часов н заседании специализированного Совета Д.020.10.02. при институт животноводства УААН С312120. г.Харьков, п/о Кулиничи)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан " «^¿^ 1994 года.

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат биологических наук

Соловьева Т. Л.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

туальность темы. Криоконсерваиия эмбрионов значительно облегчает пользование метода трансплантации зародышей и открывает большие зможности для его широкого использования в животноводстве. Кроме1 го, замораживание и длительное хранение эмбрионов позволяет решить ряд научных задач, таких как сохранение гибридных линий различных :вотных, комбинаций мутаций, сохранение эмбрионов редких или исче-лщих видов животных.

Разработка эффективных методов низкотемпературного охлаждения »логических объектов, которые позволяли бы сохранить высокий уро-!нь жизнеспособных клеток, возможна лишь на основе исследований гзиологической реакции биологических объектов на воздействие холо-I. Именно на основе тщательного изучения физико-химических процес->в, протекающих в биомакромолекулах, клетках, тканях и органах, >жно разработать наиболее целесообразные методы защиты от поврежда-;его действия низких температур.

Методы низкотемпературной консервации, разработанные для эм-мганов лабораторных Смыли, крыс, хомяков) и сельскохозяйственных срупнго рогатого скота, овец, коз, кроликов) животных, позволяют зеле пересадки деконсервированных зародышей в ряде случаев получать 1вое потомство. Все разработанные режимы замораживания эмбрионов текопитавдих на момент начала наших исследований вкдючали медленное жжение температуры, медленное оттаивание, искусственное вызывание ристаллизации среды. Характерной особенностью этих режимов является эстоянная скорость снижения температуры на отдельных этапах от 1чальной температуры до переноса в жидкий азот. Однако, применяемые этоды низкотемпературного консервирования в значительной мере яв-яются следствием эмпирических подходов,,и не ясно, насколько "они гражают реакцию эмбрионов на воздействие низких температур. К тому э они имеют, с нашей точки зрения, ряд недостатков, таких как зна-ительная длительность и большая трудоемкость процесса, необходи-ость применения сложного и дорогостоящего оборудования.

Анализ процессов, происходящих при низкотемпературном охлажде-ии данных биообъектов, недостаточно полно отражает реальные физи-еские явления. Это касается анализа выхода воды из клетки при замо-аживании, изучения кристаллизации цитоплазмы и т.п. В связи с этим еобходима разработка обоснованного режима замораживания эмбрионов

на базе исследований физиологической реакции зародышей на воздейст вие холода.

Цель и задачи исследований. Исходя из вышесказанного, целью данно] работы было изучение механизмов, отвечающих за специфичность реакци эмбрионов крупного рогатого скота на воздействие различных режимо] снижения температуры. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Определение температуры внутриклеточной кристаллизации эмбрионов крупного рогатого скота.

2. Изучение обезвоживания эмбрионов коровы при замораживании переменными скоростями.

3. Исследование механизма повреждающего действия начально1 переохлаждения на эмбрионы коровы.

4. Усовершенствование метода искусственной инициации кристаллизации.

5. Разработка установки для замораживания эмбрионов коровы бе применения электронных устройств.

Научная новизна работы:

-показано, что степень обезвоживания, позволяющая избежать внутриклеточной кристаллизации эмбрионов крупного рогатого скота, мокет быть достигнута как при замораживании с постоянной скоростью, так и с использованием режима переменной скорости по закону пассивного остывания;

-установлено, что вероятность образования льда внутри клетки, расчитанная как отношение величин переохлаждения цитоплазмы и внеклеточной среды не отражает реальных физических процессов, происходящих в системе клетка-окружающая среда при замораживании; реальные физико-химические процессы отражает вероятность внутриклеточной кристаллизации как отношение остаточного объема внутриклеточной воды и количества воды, которое должно было выйти из клетки при равновесном замораживании;

-показано, что сравнение жизнеспособности эмбрионов с вероятностью их внутриклеточной кристаллизации можно применять для расчета оптимальной скорости замораживания эмбрионов крупного рогатого скота;

- разработана методика определения температуры образования кри-

- з •

сталлсв льда внутри клеток на основе анализа сохранности эмбрионов после быстрого охлаждения до низких температур и медленного оттаивания;

-определено среднее значение температуры внутриклеточной кристаллизации эмбрионов коровы, равное -34,7°С 0,3°С;

— доказано,что ни на >льное переохлаждение, ни выделение скрытой теплоты кристаллиэац:-'- ни изменение режима снижения температуры после плато кристаллизации -;е уменьшает сохранность эмбрионов крупного рогатого скота после оа.мораживания-еттаивания;

- установлено, что повреждающим началом переохлаждения является изменение процесса обезвоживания клетки: понижение температуры инициации кристаллизации уменьшает время выхода воды из клетки а, следовательно, увеличивает вероятность образования кристаллов льда внутри нее, а искусственная инициация кристаллизации необходима для увеличения времени обезвоживания эмбрионов;

— предложен метод самопроизвольной инициации кристаллизации замораживаемой среды, основанный на прорастании кристаллов льда из одной части контейнера в другу» по градиенту температура;

- предложен способ замораживания эмбрионов крупного рогатого скота с переменной скоростью по закону пассивного остывания. •

Практическая значимость работы. Разработанный нами способ самопроизвольной инициации кристаллизации, названный нами "саыспосевом льда", делает грацесс замораживания эмбрионов более технологичным, чем ранее тедложенные. Сакопосев льда по предлагаемому нами методу происходит так же, как к инициация кристаллизации. арсводикая оператором, однако вмешательства извне не требует.

На основании изучения обезвоживания эмЗриоксв круглого рогатого скота при замораживании с переменными скоростями и определения температуры внутриклеточного льдообразования был разработан режим снижения температуры для криоконсерваиии эмбрионов крупного рогатого скота по закону пассивного остывания. Для реализации данного режима и способа самопосева1 льда была разработана и изготовлена технологичная и несложная установка для замораживания эмбрионов без электронных и электромеханических устройств.

Внедрение результатов работы. Разработанные способы самопроизвольной инициации кристаллизации и установка для замораживания эмбрионов

заявлекы как изобретения. На изобретения "Способ замораживания эм< рионов" и "Установка для замораживания эмбрионов" получены патенты Разработки использовались в лаборатории трансплантации А1 "Св:танок" Ахтырского района Сумской обл.,ПН0 "Прогресс"'г.Баркау; колхозе им. Кирова Золочевск.ого района Харьковской обл., лаборатор: трансплантации г. Целинограда.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доклад! вались на ежегодных ученых Советах ИЖ УААН, в отчетах- о научгк исследовательской работе за 1985-1092 годы, на 2-й республиканце научно-производственной конференции молодых ученых и специалисте С г. Харьков, 19853, Всесоюзном симпозиуме по трансплантации эмбрион« С г. Тарту. 1SS63, Республиканской научно-практической конференции С г. Львов,1987}, Республиканских практических конференциях (г. Xapi ков, 1988; г. Львов, 1990), опубликованы в трудах 11-го международно! конгресса по воспроизводству и •искусственному осеменению животи С г. Дублин ,1388) к 25-го Международного конгресса по криобиолог* С г.Аахен.1988).

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзра литературь материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, вь веков, практических предложений. Работа изложена на //О страница машинописного текста, включает /¿Гтаблиц к рисунка. Список ис пользованной литературы состоит из источников, в том числ

иностранных

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДУ ИССЛЕДОВАНИИ В качестве объектов исследований были использованы эмбрион крупного рогатого скота. Получение эмбрионов ^поизводилось на 6-дни полового цикла нехирургическим способом CL.. A.Rowson et al. , 1969). В качестве осноеной рабочей среды испольс:вали модифицирован ный буфер Дюльбекко - PBS CD.G.Whitiingham, 19713. Жизнеспособное? эмбрионов после получения или проведения опыта определялась несколь киии способами: морфологическим' Сметодом световой микроскопии), п способности эмбрионов к развитию in vitro, по реакции эмбрионов н действие гипо- к гипертонических растворов.

Замораживание эмбрионов крупного • рогатого скота проводилось н установках ЗЗМ Сг.Харьков), "Mimcool" (Фракция), а также на уста

овке, разработанной в институте животноводства УААН. Э качестве. .онтейкеров для диоматериаяа использовались пробирки Уленгута, паЗ-¡ты отечественного и импортного производства. В качестве криопротек-■орачиспользовали глицерин.

Температуру образца измеряли при помощи медь-константановых термопар. Режим снижения температуры репкприрсвали с помоада саыо-гашущего потенциометра КСП-4.

Полученные результаты были статистически обработаны по общепри-!ятым методикам.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

[. Анализ обезвоживания эмбрионов крупного рогатого скота,

Изучая различные режимы замораживания клеточных суспензий ис-гледователи пришли к выводу, что важнейшей характеристикой всех решив является скорость охлаждения В. Для получения максимальной выживаемости эыбриков клекопитасвдх' необходима некоторая оптимальная скорость охлаждения CWhittingham D.G. eL ai. ,1972,1975, Bank H., Иэагег 5.R., 1973, WiliadsenS.N. et al, 1970,1578).

При достаточно малых скоростях охлаждения вся свободная вода успевает выходить из клетки, но при этом клетка повреждается за счет высоких концентраций электролитов и разрушен;;..? клеточной мембраны вследствие достижения клеткой минимального c6v.-;/a. При высоких скоростях охлаждения вода не успевает выходить из клеток, что ведет-к их гибели из-за внутриклеточной кристаллизации. Гу^ествует несколько экспериментальных работ, в которых показано, что образование кристаллов льда в бластомерах эмбрионов приводит их к гибели CLeibo S.Р. et al.,1975, Leibo S. P.,1977, Lehn-Jensen H., rali H, 1983).

Влияние скоростей охлаждения на ссура.-гкссть эмбрионов можно изучать как эмпирически, так к теоретически. Количественные расчеты влияния скоростей замораживания на процессы обезвоживания клеток и образования внутриклеточных кристаллов льда проводились нами при помощи физико-метематического моделирования.•

На рис. 1 -представлен общий вид решения дегикратациокных уравнений при различных постоянных скоростях замораживания. Нижняя кривая-равковеская, означает замораживание клеток с бесконечно малой скоростью (В -0), когда цитоплазма клетки находится в осмотическом равновесии с окружающей средой.

Все графические решения показывают,что уменьшение скорости з морансивания приближает дегидратаиионнув кривую к равновесной. Отн сительный объем эмбрионов уменьшается с понижением температуры и т сильнее, чем медленнее скорость замораживания. Данные физико-

рогатого скота при замораживании с указанными постоянными скорости

математические расчеты подтверждаются криомикроскопическими наблю; ниями за процессами замораживания. Так, при замораживании со ско{ стью 0,3°С/мин 7-дневные эмбрионы крупного рогатого скота сжималис и площадь их поперечного сечения уменьшалась вдвое при температз -30°С С Н. Lehn-Jensen, 1980, Н.Lehn-Jensen,H.Rai1,1983 ). Расчет значение клеточного объема при такой температуре равно 0,39. Ее клеточный объем достигает равновесного до температуры внутриклетс ной кристаллизация, то клетка не будет содержать кристаллов льда цитоплазме. Вычисления показывают, что при замораживании с экспе; ментально установленными оптимальными скоростями равновесие с ок] жающей средой наступает несколько раньше температуры внутриклеточ! кристаллизации, т.е. расчетные значения оптимальной скорости npej шают наблюдаемые для всех типов эмбрионов.

Более точная количественная оценка влияния скорости заморажи) ния на выживаемость эмбрионов может быть получена при расчете вер< ятности внутриклеточного льдообразования.

Согласно существующим предположениям вероятность внутриклет( ной кристаллизации определяется как отношение переохлаждения клег относительно равновесной кривойТу-Тцк переохлаждению внеклеточ] среды 273-Тц (переохлаждение клетки при данной скорости рассматри;

этся как разность температур д,Т;,на которую данная кривая отлича-этся от равновеснойХрис. 2):

П - , тг ~Ть1__С15

Гт дТв " 273

где^Т,.- переохлаждение цитоплазмы, дТв -переохлаждение внеклеточной :реды.

V

Тег Т,°С

Рис.2. Изменение относительного объема внутриклеточной воды при ¡амораживании клетки как функция температуры.

Полученные графические решения (рис.3) не отражают объективно ютинную вероятность внутриклеточной кристаллизации. Так, при темле-)атурах ~ -0°С вероятность внутриклеточной кристаллизации, опреде-генная по кривым, составляет ~ 0,5, хотя должна быть равна примерно ., потому что в таком случае в клетке, не успевшей обезводиться, ¡одержится максимально возможное количество воды. Эта вода в клетке ¡разу бы замерзла, будь температура внутриклеточной кристаллизации

1 М {О

К ■

ч'о -20 -во Цо -50 Т,6С

Рис.3. Вероятность внутриклеточной кристаллизации, определенная

;ак отношение переохлаждений цитоплазмы и внеклеточной среды.

равна 0*С. .Далее по мере выхода воды из клетки с понижение температуры, вероятность должна бы уменьшиться, а на кривых у видим даже некоторое ее увеличение, хотя далее она имеет тенденции уменьшение. Из проведенного графического анализа ш сделали вывал что такой способ вычисления не согласуется с физическим механизме процесса.

Поэтому нами был предложен икой подход к расчету вероятное-:; Определяющей величиной в этом случае будет количество внутриклете кой воды, а не величина переохлаждения клетки. Вероятность внутри клеточной кристаллизации будет определяться как отношение остаток ного объема внутриклеточной воды и количества воды, которое дол к* было выйти из клетки при равновесном замораживании:

А VI

(2)

где: а VI - разность между количествам внутриклеточной воды, задав; мыми равновесной кривой и кривой дегидратации с какой-то данной ск< ростьс; - количеств» внутриклеточной воды, которое должно был* бы выйти из клетки при' температуре внутриклеточной кристаллизаци! когда такое замерзание могло бы произойти. Используя рис.2, псяуч;л

Ъ I "" Уг

С ЗУ

.пи

афические результаты вероятности внутриклеточной кристаллиз. объему -&при различных скоростях замораживания пре:

пас-

лены на рис.4.

-10 -20 -50 -ко »50 Т°С

Рис.4. Значение вероятности внутриклеточной кристаллизаци

определенное как* отношение остаточного и равновесного объемов вод клетке.

Из рисунка видно, что при температуре внутриклеточной кристаллизации ~(Яс значение вероятности внутриклеточной кристаллизации равно 1. Это согласуется с физическим механизмом процесса. Далее, по мере обезвоживания клетки вероятность внутриклеточной кристаллизации убывает. С увеличением скорости замораживания повышается вероятность внутриклеточной кристаллизации. Это объясняется тем, что с ростом скорости■ охлаждения клетки не успевают обезводиться до достижения температуры внутриклеточной кристаллизации, . содержат сверхкригиче-ский объем внутриклеточной воды, который и обеспечивает боль ;иую вероятность льдообразования в клетке. Скорости замораживания ~10°С/мин не обеспечивают необходимого обезвоживания и вся вода в клетке замерзает почти сразу.

Изложенный ранее анализ дегидратации эмбрионов и вероятности внутриклеточной кристаллизации позволил сделать вывод, что одним из главных повреждающих факторов является образование кристаллов льда внутри зародыша. Сравнение выживаемости и внутриклеточной кристаллизации эмбрионов крупного рогатого скота при различных скростдх замораживания представлено на рис.5. Из рисунка видно, что наличке льда внутри клетки несовместимо с выживаемостью эмбрионов крупного рогатого скота и. наоборот, максимальная выживаемость наблюдается, когда вероятность внутриклеточной кристаллизации равна нулю.

Рис.5. Сравнение внутриклеточной кристаллизации и выживаемости шбрионов крупного рогатого скота.

По нашим расчетам, оптимальная скорость замораживания !=0,5°С/мин. Ранее экспериментально получено значение оптимальной ¡корости замораживания 7-дневных эмбрионов крупного рогатого скота -

0,3°С/шн С УШаазеп £.Н. е1 а1. , 1976, 1978 ). Таким образом, наблюдается соответствие экспериментальных данных и полученных расчетных. Отсюда следует, что этот метод можно применять для расчета оптимальной скорости замораживания для эмбрионов крупного . рогатого окота.

2. Опре; пение температуры внутриклеточной кристаллизации крупно! рогатого скота.

Мы рассмотрели один из важнейших параметров, влкящих на выживаемость эмбрионов крупного рогатого скота - скорость замораживания. Но кроме него существуют еде две не менее важных характеристики -температура внутриклеточной кристаллизации к температура инициации кристаллизации, так как именно в интервале между ними происходит выход воды из клетки.

Температура внутриклеточной кристаллизации некоторых клеток, определенная криомикроскогтическк. сильно колеблется от -5... -13°С для яйцеклеток морской свинки до -4(Яс для яйцеклеток мыши. Для нас представляло интерес определение этой температуры для эмбрионов крупного рогатого скота.

Мы предлагаем методику определения температуры внутриклеточной кристаллизации, которая заключается в изучения чувствительности клеток к медленному оттаиванию после замораживания со сверкопткмальными скоростями. Разработанная методика предполагает, что жизнеспособными будут лишь те эмбрионы, в которых не произошло внутриклеточное формирование льда. Непосредственно определение температуры внутриклеточной кристаллизации проводилось следующим образом. Эксперимент состоял «з двух частей. В первой части проводилось замораживание эмбрионов с большими скоростями до температур -10, -20, -30, -40, -50°С. Таким образом был определен температурный интервал, в которо» погибает ¡'.¿^большее количество эмбрионов. Замораживание проводило« в термостатированных спиртовых банях. После заысракйвакия эмбриош оттаивали погружением пайета в воду температуры 3~Рс. Извлеченные эмбрионы культивировались в течение £4 час., после чего проводнике: сравнительные микроскопические исследования морфологии замороженно-оттаянных и контрольных эмбрионов. Результаты исследований представ' лены в табл. 1. Б .этой таблице и в последующих одинаковые суп&рскр/.п ты обозначают значения, достоверно не рааличаюаиеся между собой, разные суперскрипты обозначают значения, которые различаются мекд

и -

собой достоверно с вероятностью не менее, чем 0,55.

Сравнительный анализ морфологии пяти групп замороженных эмбрионов с группой контрольных зародышей С табл.1) показал, что процент эмбрионов с явными нарушениями деления и происшедшими дегенеративными процессами в клетках максимален в группах эмбрионов, замороженных до -40 и -50°С. Еще при температурах до -30°С процент жизнеспособных после оттаивания эмбрионов достаточно высок (83?) и достоверно не отличется от контрольной группы, что можно объяснить отсутствием внутриклеточного формирования льда.

Таблица 1.

Жизнеспособность эмбрионов после замораживания до разных температур С опыт N1 )

Температура замораживания,

Количество эмбрионов

в опыте

из них жизнеспссо:

Жизнеспособность эмбрионов после оттаивания, %

- 10 - 20- 30

- 40

- 50

10 13

12 д

8

9 И 10

90 а

88а

83а пъ

0е

Контроль

89

0

8

При замораживании до -АО3 С виден резки;: сп;.т доли жизнеспособ-ых эмбрионов после оттаивания ло 111 Таким образ:;!.«., можно сделать включение, что температура ^нутр;:клатсчнси ку/ггзллизашш лежит в бласти от -30°С до -40°С. .

Далее проводилась вторая часть эксперимента (табл.2).Для опре-еления более точного значения данной температуры интересующий нас нтервал температур был разбит дополнительно -а 5 интервалов по 2° и роизведено замораживание эмбрионов до -З'^С. -Зс? С, С и

42°С. В температурном диапазоне ст -ЗС до -42'" С в каждом из выде-энных нами двухградусных интервалов погибала часть клеток, т.к. зответствующие каждой температуре замораживания выживаемости эмбри-юв отличались достоверно. Резкий спад доли жизнеспособных эмбрио->в наблюдался при замораживании до -З^С ( с 7'Л до 46%). В качест-5 контроля в первом и втором опыте использовали эмбрионы, заморо-шные по стандартному режиму. Среднее значение температуры внутри геточной кристаллизации, полученное после математической обработки

- 12 -

результатов, составило= -34,7°С ± 0,3°С.

Таблица 2.

Жизнеспособность эмбрионов после замораживания до разных температур С опыт N2 )

Температура замораживания, °С Количество эмбрионов Жизнеспособность эмбрионов после оттаивания, %

в опыте из них жизнеспособных

- 30 12 10 83а

- 32 14 10 71ь

- 34 13 6 46°'

- 36 И 4 37 у

- за 12 3 23й

- 40 9 1 11е

- 42 7 0 0£

Контроль 9 8 83й

3. Искусственная инициация кристаллизации.

Следующим изучаемым параметром была температура инициации кристаллизации среды Эта температура не постоянна. Если не проводить ее искусственно, тс среднее ее значение равноТ^р = -11,С 2,9'С и происходит сна е диапазоне от -7°С до -21°С. Для того, чтобы ответить на вопрос, каким образом этот параметр влияет на выживаемость за.\;орож~ннс-отта?нкых эмбрионов, рассмотрим результаты эксперимента, пг:-дстгь.1екные в табл.3.

Таблица 3

Выживаемость эмбрионов при различных температурах инициации кристаллизации

Температура инициации, С, СЮ, 5) Количество эмбрионов

заморожено-оттаяно развивалось в культуре жизнеспособных , %

- 6 19 17 89*

- 8 12 з . 25ь -

- 10 9 1 11е

-14. . . -21 6 0 С*

Контроль 16 14 9С*

Инициацию кристаллизации - посев льда осуществляли при темпера грах -6, -8, -1б С, при температуре -11... -2? С происходила спон-шная кристаллизация. Каждое снижение температуры инициации досто-зрно уменьшает выживаемость эмбрионов от 89!? до 2555 и 11%,, при юнтанной инициации кристаллизации все эмбрионы были дегенерированы в культуре не развивались. Посев льда при -б3С обеспечил макси-альную степень выживаемости, когда в культуре развивалось 89% замо-эженно-оттаяннкх эмбрионов, что достоверно не отличается от контроля з качестве контроля использовали свежег.олученные и прокультивиро-анные эмбрионы). Обсуждая проведенный опыт, можно сказать, что пе-эохлаждение достоверно понижает выживаемость замороженно-оттаянных мбрионов. Для выяснения влияния механизма процесса кристаллизации неклеточной среды было проведено охлаждение эмбрионов до различных арактеркых точек, кривой замораживания (рис. о).

Рис.6. Характерные зтапы ре:«::.« замораживания: -АВ - резкое жлаждение и начальное я^реомлажаение- до момента кристаллизации вке-:леточной среды; -ВС - видел**;:« ?к?ьтоП теплоты кристаллизации; -СД • изменение режим а замора*жчя;:я после плато кристаллизации; - изме ¡ение процесса дегидратации, с кст:-?..м можно судить по выживаемости 5 точках Е и Р.

Методика эксперимента заключалась ь следующем: эмбрионы охлаж-1ались до'температур, соответствую^:!:: характерным точкам кривой завораживания, затем зародыш!! быстро отогревались, жизнеспособность их определялась по способности развиваться в культуре.

Результаты эксперимента представлень: в табл. 4. Проведенные исследования показали, что ни един лз трех первых перечисленных факторов: резкое охлаждение и начальное переохлаждение до момента кристаллизации внеклеточной среды: выделение скрытой теплоты кристалли

г

зации: изменение режима замораживания после плато кристаллизации 1 уменьшает сохранность зародышей в течение криоконсервации. Резке уменьшение выживаемости происходит после замораживания до температ} ры внутриклеточной кристаллизации. С нашей точки зрения, наиболе вероятным повреждающим началом переохлаждения является изменен!: процесса дегидратации, о чем говорит сравнение полученных данных контролем, когда эмбрионы замораживали с посевом льда при -6°С.

Таблица 4

Влияние различных этапов замораживания на выживаемость эмбрионов крупного рогатого скота

Изучаемый фактор Температура до которой проводилось замораживание, QQ Количество эмбрионов Жизнеспособность , %

в опыте кизнеспо собных

Начальное

переохлаждение -7...-15 20 17

Выделение скры-

той теплоты

кристаллизации -о 16 13 8 Vх

Изменение режи-

ма заморажива- -15...23

ния 19 15 79й

Изменение -30 14 12 85^

обезвоживания -40 18 0 0"

Контроль -30 -40 15 . 12 12 10 %

Для выяснения механизма этого явления рассмотрим замораживание биообъектов с одинаковой скоростью при различных температурах инициации кристаллизации ( рис.7 ). Время выхода воды из клетки увеличивается по мере возрастания температуры посева льда. Снижение температуры инициации кристаллизации среды приводит к тому, ч?о эмбрионы не успевают полностью обезводиться в течение замораживания, происходит их внутриклеточное замерзание, что и приводит к гибели эмбрионов. Следовательно, температура инициации кристаллизации наряду со скоростью замораживания определяет вероятность внутриклеточного замерзания. Для каждой температуры инициации кристаллизации имеется своя критическая скорость охлаждения и, наоборот, каждой скорости

яаадения соответствует своя критическая температура инициация кри-аллизадаш.

прджацяи кристаллизации

Посев льда был эмпирически найден зклериментагорами как средст-з упрощения режимов замораживания и является необходимым условием спешкой криокансервации эмбрионов клекзпитавздах. Как было показано шее, эмбрионы млекопитающих нужно замораживать со скоростями по-?дка десятых долей градуса в минуту. Это приводит к двум следствн-■,и во-первых, возможно сильное переохлаждение среды, во-зторых, шге скорости требует длительного времени; замораживания. Первое *ачктеяьно понижает температуру спонтанней кристаллизации,, уменьшая земя выхода' воды из клетки,' второе заставляет экспериментаторов зеличивать скорость снижения температуры для уменьшения длительного процесса криоконсерваодш. Посев льда- позволяет максимально уве~ агеять скорость замораживания за счет.повышения температуры иниаиа-т лр.ис?злля2з.ц№ и увеличить время обезвоживания клеток.

К началу наших исследований были предложена слодумие споссс.'.: г,сева льда*, внесение мелких и з небольшом количестве кристаллов ьда в среду для замораживания. прикосновение охлаяденного пинцета к аружной стенке контейнера, использование з качестве инициатора ьдсюбразования йодистого серебра, автоматическое проведение искусственной 'инициации кристаллизации. Но .ранее предложенные способы роведения посева льда имеют ряд недостатков:

-необходимость вмешательства оператора ь работу установки: —необходимость открывания камеры установки, что может изменить

\

режим замораживания, привести к гибели эмбрионов и усложш технологический процесс;

— необходимость проверки наличия кристаллов льда в среде пос проведения посева льда.

Нами был предложен метод самопроизвольной инициации кристалл! зации замораживаемой среды, названный нами "самопосевом" льда. Спс соб заключается в прорастании кристаллов льда через воздушный пузь рек, разделяющий нижнюю и среднюю части контейнера. Это обеспечивается при замораживании в вертикальном градиенте температуры. Обвд вид контейнера и физические процессы, происходящие в нем в момеь посева льда изображены на рис.8.

жидкая среда—

- 5°С

прорастание, льда

- 20°С-

U

О-•.о

-контейнер

_среда для выведения криопротектора

-воздушный пузырек

среда для замораживания

.эмбрион

воздушный пузырек

среда для выведения ^ криопротектсра

пробка

Рис.8. Физические процессы е. контейнере для замораживания момент посева льда.

Положительный эффект достигается в результате того, что воздуш ный пузырек набирают таким образом, что стенкк контейнера смачивают ся жидкостью и это позволяет кристаллам льда из нижней части контей нера прорастать в верхнюю при температуре, когда такая кристаллиза ция может произойти. На предлагаемый способ инициации кристаллизаци получено авторское свидетельство. Нами разработан способ заполнени контейнера, который может быть использован при замораживании эмбрио нов крупного рогатого скота.

Сравнение режимов замораживания, когда происходит самопроиз вольная кристаллизацияС 2) со спонтанной кристаллизациейС!) и с клас

ичеекнм режимомСЗ), когда посев льда производятся оператором аок?~ ан на рис.9.

Рис.9. Различные режимы замораживания эмбрионов круаного зогатого скота.

Самопосев льда по предлагаемому каш методу происходит также, •сак и инициация кристаллизации, проводимая оператором, однако наш <етод вмешательства извне не требует. При замораживании же по рс-таму зо спонтанной кристаллизацией see клетки погибали.

4. Разработка установки для замораживания эмбрионов.

Одной из отличительных особенностей замораживания эмбрионов является использование постоянной скорости снижения температуры CWilladsen-S.L. ,1976. Lehrr Jensen Н. .1580, Сергеев И.И. ,'Шихов 3 И. . 1979, Безуглый Н. Д. , ISS4 3. К моменту чачаг.а наших исследований для криоконсервации эмбрионов большинство зарубежных и отечественных специалистов применяли установки, позволяющие производить замэр&ст-вание эмбрионов с постоянней скоростью з широких пределах ее ггуеяе-ния. Однако, для поддержания постоянной скорости заморят"- -ня и предварительного программирования режимов эти установки -.одержат сложный и дорогостояще электромеханические узка, что значительно повышает их стоимость и делает невозможным частые транспортировки к работу в полевых условиях. Влияние же непостоянных скоростей замораживания, которые значительно легче реализовать, на жизнеспособность зародышей изучено не было, Наиболее простым в осуществлении переменных скоростей замораживания является режим снижения температуры по закону пассивного остывания. В зтем случае режим снижения, тешерату

ры пассивно остывающего термоблока и будет режимом для замораживан зародышей. Скорость замораживания будет описываться уравнением

где:То - начальная температура, ^ - характерное время остывания термоблока, которое определяется свойствами охлаждаемого образца, нашем случае это форма термоблока, его размеры, вид материала, которого он сделан.

Для описания реакции эмбрионов на воздействие низких температ; при использовании режима замораживания с переменными скоростями 61 проведен анализ обезвоживания зародышей при охлаждении по таш режиму. Изменение клеточного объема при замораживании с разными з» чениями характерного времени представлено на рис.10.

по режимам с характерными временами 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 мин.

Обезвоживание эмбрионов при замораживании с переменными скорос тями происходит аналогично обезвоживанию при замораживании с посто янной скорстью. Замораживание эмбрионов с переменной скоростью п экспоненциальному закону может обеспечить необходимую степень обез воживания и поможет предотвратить образование внутриклеточных крис таллов льда. Оптимальным значением характерного времени заморажива ния 7-дневных эмбрионов коровы являетсяТ= 20мин.

Для реализации предлагаемого нами режима снижения температуры и способа самопосева льда <3ыяа разработана установка, схема которо!

Представляет она собой термоблок, помещенный в горловину сосуда 5ьюара. Замораживание происходит путем пассивного остывания термоб-тока. Параметры термоблока были определены, исходя из формы горловины сосуда Дьюара и значения характерного времени. Материал и размеры гермблок.а были подобраны таким образом, чтобы храктерное время было эавным 20мин. Определены были также необходимая глубина погружения гермоблока в горловине сосуда Дьюара, тип сосуда и место расположе-ия эмбриона в контейнере для замораживания.

Испытания разработанной ' установки показали, что сохранность замороженных на ней эмбрионов после оттаивания составила 33'--., при-швляемость после пересадок - 40%. Приживляемссть свежепо.тученных эмбрионов составляла 41%. Таким образом, уровень приживляемссти де-сонсервированных эмбрионов находился на уровне приживляемости свеже-галученных.

На предлагаемую установку было получено авторское свидетельство m изобретение.

Замораживание эмбрионов крупного рогатого скота по предлагаемо-«у способу и их пересадки производились в институте животноводства 'ААН, г.Харьков! колхозе им.Кирова, Золочевского района Харьковской )бласти; на ПНО "Прогресс", г.Барнаул; пункте трансплантации, г.Це-ганоград, в лаборатории трансплантации АПО "Св1танок", г.Ахтырка.

Всего было заморожено 334 эмбриона, получено 100 телят трансплантатов после трансплантации дековсервированных зародышей.

ВЫВОДЫ

1. Необходимая степень обезвоживания эмбрионов крупного рогатс го скота! может быть достигнута как при замораживании с постояннс скоростью, так и с использованием режима переменной скорости по з; кону пассивного остывания.

2. Определение вероятности внутриклеточной кристаллизации I отношению величин переохлаждения цитоплазмы и внеклеточной среды I отражает реальных физических процессов, происходящих в системе кле1 ка-окружашая среда при замораживании. Реальные физико-химхчесю процессы отражает вероятность внутриклеточной кристаллизации кг отношение остаточного объема внутриклеточной воды и количества вод1 которое должно было выйти из клетки при равновесном замораживании.

3. Анализ сохранности эмбрионов после быстрого охлаждения ^ низких температур и медленного оттаивания служит методом определен температуры внутриклеточной кристаллизаии.

4. Температура внутриклеточной кристаллизации эмбрионов коро! равна -34,7°С * 0,3°С.

5. Начальное переохлаждение, выделение скрытой теплоты кристаз лизацни, изменение режима снижения температуры после плато криста,' яизации не влияют на сохранность эмбринов крупного рогатого скот после оттаивания.

6. Наиболе вероятным повреждающим началом переохлаждения явл) ется изменение процесса дегидратации. Понижение температуры инициг ции кристаллизации уменьшает время дегидратации и, с^&дсвательнс увеличивает вероятность внутриклеточной кристаллизации, а искусст венная инициация кристаллизации необходима для увеличения време; обезвоживания эмбрионов.

7. Температура инициации кристаллизации и скорость заморахиза* взаимосвязаны: чем выше температура посева льда, тем выи оптимальная скорость охлаждения, и, наоборот, чек ниже температур посева льда, тек медленнее оптимальная скорость охлаждения.

8. Искусственная инициация кристаллизации может проходить сам? произвольно путем прорастания кристаллов льда из одной части контег нера в другую по градиенту температуры.

- 21 - •

.. 9. Необходимый ре'хим снижения температуры для замораживания эмбрионов крупного рогатого скота может быть достигнут путем пассивного остывания термоблока в горловине сасука. Дьюара.

10. Использование разработанной нами установки позволяет полу-■теть сохранность деконсервированннх эмбрионов в пределах 39%, а при-кивгяемссть после их трансплантации - 404.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Результаты физико-математического анализа процесса дегидратации эмбрионов крупного рогатого скота при охлаждении с постоянными

? переменными скоростями, а также полученные результаты для вычисления =ерояткости внутриклеточной кристаллизации могут быть использованы в сриобиологическкх- лабораториях для совершенствования режимов кркокон-¡ервацяи клеточных суспензий.

2. 'Режим снижения температуры по экспоненциальному закону и :яособ. искусственней инициации кристаллизации путем самопосева можно ¡екомекдовать для замораживания эмбрионов сельскохозяйственных жи-ютных.

3. Разработанную нами установку для замораживания эмбрионе» я ¡йцеклеток млекопитающих можно рекомендовать для использования ее в роизводствекных лабораториях, а также в научных организациях.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Обоснование инициации кристаллизации при замораживании эмб-иоков крупного рогатого скота// Тезисы докл с-й республиканской аучно-производственной конференции, - 1985 г., г. Харьков

2. Анализ режимов замораживания змбрионоЕ млекопитающих// Те-кса докл. всесоюзного симпозиума "Трансплантация эмбрионов крупного огатого скота", - 1£Э6 г. , г. Тарту, ; в ссавт. }

3. Волюмометрия как метод изучения проницаемости цитоплазмати-еских мембран яйцеклеток и эмбрионов млекопитающих// Научно-ехнический бюллетень N34,- 1985 г. , г. Харьков. { в соавт. )

4. Замораживание эмбрионов крупного рогатого скота с переменной корсстыэ// Тезисы доклада республиканской научно-практической кон-еренции "0 широком использовании метода трансплантации эмбрионов в скореяии качественного совершенствования с-х .тавотных", - 1687 г.,

г. Львов, (в соавт.)

5. Харьковская технология асептического получения, криоюнс вадии и трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота/1/ Тези докл. республиканской научно-практической конференции "О а изо использовании метода трансплантации зыбриово» в ускорении качесгь ного совершенствования с-х животных",- 1987 г., г. Львов

6. Заморожування зарояк!в ссавШв при спонтаннХй iHiulauil кристал1зацЦ// Тези лоповШ респубя1кансько! науково! кояфере

Б1отехнолог1чн1, дослиження i перспектива 1х роэвитку",- 1990 м.ЛьЫв, (в спхвавт. )

7. Initial Supercooling As Cryoinjury Factor During Mammal Embryo Freezing/' 25th Annual Meeting- Aachen, W.-Gerira 198S,Cwith other authors)

8. The Kharkov Technology of Cattle Embryo Cryoconservatio 25th Annual Meeting- Aachen, 1988, (with other authors^.

9. The Technological Method For Cryoconseryation of Cattle E ryos// 11 th International Congress on AniBai Reproduction and Ar fical Insemination- 1S88, Dublin, Ireland, Cwith other authors).

10. Theoretical Prerequisites For the Freezing of Cattle Mouse Embryos By Plunging In Liquind Nitrogen/"/ 11th Internatio Congress on Animal Reproduction and Artifical Insemination,- 1 Dublin, Ireland, (with other authors).

11. Способ заморакивания эмбрионов или яйцеклеток// патент 1.4 2568,приоритет от 30.С7.90.

12. Установка для замораживания эмбрионов// патент N 1SC27 приоритет от 23.0S.19S1.