Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Временные факторы в процессах доимплантационного морфогенеза мыши

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Временные факторы в процессах доимплантационного морфогенеза мыши"

Национальная Академия наук Украины Институт молекулярной биологии и генетики

РГЗ од 2 4 НОЯ '007

Евсиков Алексей Вадимович

УДК 575.16 591

Временные факторы в процессах доимплантационного

морфогенеза мыши

03.00.26 — молекулярная генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Киев - 1997

Диссертацией является рукопись

Работа выполнена • в Институте молекулярной биологии и генетики HAH Украины, г.Киев

Научный руководитель: доктор биологических наук

A.n. Соломко

заведующий отдела биохимической генетики Института молекулярной биологии и генетики HAH Украины, г.Киев

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук

профессор И.Р.Бариляк директор Украинского научного гигиенического центра МОЗ Украины, г.Киев

кандидат биологических наук

B.Е.Кузнецов

заместитель директора по научной работе Института разведения и генетики животных УААН, г. Б. Апександровка

Ведущее учреждение: Институт биологии развития

им. Н.К.Кольцова РАН, г.Москва

Защита диссертации состоится_1997 г. на _

заседании специализированного ученого совета Д.01.86.01 Института молекулярной биологии и генетики HAH Украины по адресу: 252143, г.Киев-143, ул. Академика Заболотного, 150.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии и генетики HAH Украины.

Автореферат разослан_1997 г.

Ученый секретарь

специализированного ученого совета кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теми. Индивидуальное развитие млекопитающих, в отличие от других классов, подчиняется только регуляторным принципам начиная с самых перЕых стадий (Davidson, 1990, 1991). Если у большинства животных раннние этапы морфогенеза проходят под жестким контролем материнских факторов ооплазмы, то у млекопитающих накапливающиеся в течение оогенеза продукты обеспечивают лишь нормальный ход оплодотворения и последующего дробления зиготы вплоть до момента включения эмбрионального генома. Его активация запускает процессы развертывания морфогенетической программы дальнейшего развития.

Нормальное течение онтогенеза обеспечивается, в первую очередь, механизмами дифференциальной,— во времени и пространстве,- экспрессии генов. Регуляция активности генов "во времени", наызваемая также "биологическими часами" эмбриона, до сих пор остается одной из основных нерешенных проблем раннего морфогенеза млекопитающих. Было показано, что механизм "билогических часов" не зависит ни от абсолютного времени, прошедшего с момента оплодотворения (Smith, McLaren, 1977), ни от числа циклов репликации (Alexandre, 1962) или числа цитокинезов (Surani et al., 1980), ни от межклеточных взаимодействий (Prather, First, 1986), ни от ядерно/цитоплазматического соотношения (Evsikov et al., 1990). В настоящий момент все большее подтверждение находит теория, согласно которой работа "биологических часов" доимплантационного развития осуществляется по принципу "go when ready" (Dardik, Schultz, 1991): согласно этому воззрении, запуск очередной стадии морфогенеза происходит после того, как был достигнут определенный "критический" урозень концентрации продуктов предшествующего этапа. В настоящеее время данная гипотеза является одним из фундаментов, на котором базируются исследования механизмов регуляции раннего развития млекопитающих.

Связь работы с научными программами, планами, темами. Исследования проводились в рамках тематических планов ИМБиГ НАНУ № 2.34.1.3 "Изучение регуляции экспрессии генома на ранних стадиях эмбриогенеза мышей" (1991-1995) и № 2.28.7.2 "Изучение ядерно-цитоплазматических взаимодействий в доимплантационном развитии мыши" (1996-2000), а также поддержаны грантами Государственного Фонда Фундаментальных Исследований Украины № 5.2/3, № 5.4/172 и грантом МНФ № Ü47000.

Дель и задачи исследования. Основной целью наших исследований явилось изучение фактора времени в раннем развитии мыши. На этих стадиях он имеет два аспекта. При созревании ооцита и в зиготе основную роль играет абсолютное время, прошедшее с момента поступления

гормонального сигнала или оплодотворения; начиная же с момента включения генома на первый план выходят собственные "биологические часы" эмбриона, во многом не зависящие от "абсолютного" времени.

Сообразно поставленной цели, мы начали искать возможные подходы к их решений. В раннем развитии мыши существенную роль играют четыре фактора: ядерно-цитоплазматические взаимодействия; "ауторегуляционные" функции цитоплазмы; межклеточные взаимодействия; и в меньшей степени, геномный импринтинг. Каждый из этих факторов, так или иначе, способен влиять на временные параметры развития. Вследствие этого мы искали разные подходы к достижению цели, что привело нас к постановке конкретных задач исследования:

1) провести исследования полярных телец, которые являются результатом двух мейотических делений, проходящих на завершающих стадиях созревания ооцита;

2) на модели "временной задержки" ядра по сравнению с цитоплазмой выявить принципиальные причины плохого развития эмбрионов после микрохирургических пересадок ядер;

3) на этой же модели изучить механизмы, отвечающие за прохождение первого клеточного цикла эмбрионом мыши;

4) вычленить, как отдельные "регуляторные факторы" развития влияют на "биологические часы" эмбриона мыши.

Научная новизна. Впервые проведен комплексный морфологический, цитогенетический и . экспериментально-эмбриологический анализ двух клеток, образующихся в результате оогенеза,— первого и второго полярных телец. Это дало возможность сделать важные выводы о механизмах созревания ооцита и регуляции первого клеточного цикла эмбриона мыши. Впервые продемонстрирован эффект так называемого "химерного гетерозиса" на самых ранних стадиях развития мыши. Проведен комплексный анализ трансляционной активности доимплантационных зародышей мыши, цитокинез которых был подавлен цитохалазином р, что позволило сделать некоторые выводы о механизмах работы "биологических часов" раннего эмбриона.

Практическая ценность■ Разработанные методики анализа полярных телец позволяют использовать их при анализе ооцитов и эмбрионов человека в семьях, где высок риск передачи по наследству тяжелых заболеваний. Дальнейшая разработка полученных результатов по гетерозису у химерных эмбрионов в перспективе открывает возможность использования данных методов в животноводстве.

Личвый вклад соискателя. Основные результаты, изложенные в работе, получены соискателем самостоятельно. Автор выносит благодарность к.б.н. С.В.Евсикову за проведение микроманипуляций эмбрионов.

Апробация работы. Результаты исследований представлялись на 27-м Ежегодном конгрессе Общества по изучению репродукции (июль 1994, США), международной конференции "Механизмы развития: онтогенетические и филогенетические аспекты" (август 1994, Москва), межлабораторном семинаре отделов биологии развития и молекулярной и клеточной биологии в Национальном институте сельскохозяйственных исследований (МИА, Франция; ноябрь 1994) и межлабораторном семинаре ИМБиГ НАНУ (июнь 1997) .

Публикации. По теме диссертации опубликовано три статьи в отечественном и зарубежных журналах и тезисы конференции.

Струкутура и объем работ«■ Работа изложена на 110 стр. машинописного текста, состоит из введения, 4 глаз основной части, выводов, проиллюстрирована 25 рисунками и 3 таблицами. Список литературы включает 239 работ отечественных и зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследований. В работе использовали мышей линий С57В1/6, ВАЬВ/с, а также гибридных В602П (СЕ7В1/б х ОВА/2) и СВ6Г1 (ВАЬВ/с х С5тВ1/6) . Самок в возрасте от пяти недель до трех месяцев суперовулировали по стандартной методике (Нодап еЬ а1., 1986). Время иньекции ЪСС принимали за "час ноль". Зиготы, ооциты и двуклеточные эмбрионы вымывали из яйцеводов и культивировали по стандартным методикам (Нодап е! а1., 1986).

Для получения "одноклеточных" и "двуклеточных" эмбрионов их культивировали до 75 часа после иньекции ЬСС в присутствии цитохалазина О (0.6 ут/мл), начиная со стадии зиготы или двух клеток. Химеры получали, агрегируя по два отдельные бластмеры зародышей двуклеточной стадии, по методике Шх^г et а1., 1973.

Микроманипуляции- В работе использовали стандартные методы манипуляции (Тэипойа et а1., 1986) с небольшими модификациями.

Электрослияние. Зародыши уравновешивали в течение 10-15 минут в среде для электрослияния (0.5 М маннитол + 0.5% поли-винилпирролидон + 0.1 мМ МдЭО, + 50 уМ СаС12) при 21-23°С, после чего помещали между платиновыми электродами, расположенными на расстоянии 330 цм друг от друга. Электростимуляция состояла из двух фаз: 7 с переменного тока (500 кГц, 7 В) ориентировали зародыши в поле, после чего следовал один прямоугольный импульс (35 В, 400 рс) . Эмбрионы тщательно отмывали в среде М16 и переносили в культуральные чашки Петри.

Микроскопия. Для сканирующей электронной микроскопии препараты готовили по стандартной методике (Пратт, 1988) . Исследования проводились на микроскопе 131-3540. Для световой микроскопии препараты ооцитов и зародышей готовили по методу Дыбана (БуЬап, 1983).

Анализ уровней трансляции у эмбрионов и двумерный электрофорез белков. Зародыши, культивировали в течение 1 или 3 часов при 37°С в среде Ml6, содержавшей 55 МБк/мл [55S]-метионина (Amersham) , затем отмывали и переносили в 20 рл лизирующего буфера (O'Farrell, 1975). 1 рл лизата отбирали для рассчета поглощенной радиоактивности. Пробу смешивали с 200 ил 0.2% БСА, добавляли 200 ил 30% ТХУ и центрифугировали при 12000 об./мин. Осадок промывали ацетоном, растворяли в 200 цл муравьиной кислоты, и смешивали с 2 мл сцинтиллята. Двумерный электрофорез проводили в камере BioRad Mini Protean II 2D cell. Изофокусирование проводили при 500 В до 6000 В-ч и соотношении амфолитов BioLyte3.5-10/BioLyte5-7 1:4. Разделение по второму направлению проводили в 12.5% разделяющем геле. Флюорографию проводили при -80°С. Компьютерный анализ осуществляли с помошью программы ImageMaster 1.0 (Pharmacia).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Морфологические исследования созревания и оплодотворения ооцита мыши Смысл гаметогенеза заключается в формировании гаплоидных гамет из начально диплоидной клетки. С этой точки зрения оогенез отличается от сперматогенеза механизмом распределения генетического материала, присутствующего в оогониях. При созревании ооцитов два деления мейоза служат не для того, чтобы образовались четыре одинаковые гаплоидные клетки, а для элиминации трех наборов хромосом, причем с минимальными потерями цитоплазмы. В результате этого процесса формируются две небольшие клетки,- первое и второе полярные тельца (1ПТ и 2ПТ). Анализ ПТ может служить источником информации о механизмах созревания ооцита и оплодотворения (Modlinski, McLaren, 1980; Dyban et al., 1992). Кроме того, современные методы дают возможность использования полярных телец для анализа ооцитов и эмбрионов человека в семьях, где высок риск передачи по наследству тяжелых заболеваний (Verlinsky et al., 1992).

Рис.1. Первое и второе полярные тельца на доимплантационных стадиях развития мыши. ( 1А) 1ПТ (слева) и 2ПТ у зиготы; (1Б) 2ПТ, связанное с зиготой "серединным тельцем"; 2ПТ на двуклеточной (1В) и восьмиклеточной (1Г) стадиях. Увел. 1А, 1В, 1Г - xl,500; 1Б - х2,500.

Наши исследования с помощью сканирующего электронного микроскопа выявили, что морфология первого и второго полярных телец различна: во-первых, 2ПТ, в отличие от 1ПТ, остается соединенным с зиготой (рис 1А,

1Б); во-вторых, на поверхности 2ПТ к двуклеточной стадии появляются микроворсинки (рис 1В, 1Г) , тогда как мембрана 1ПТ остается "гладкой". Эти наблюдения находятся в сответствии с другими гистологическими работами, посвященными созреванию ооцита (Johnson et al., 1975; Calarco, 1975; Maro et al., 19S6).

"Запрограммирована" ли гибель первого полярного тельпа в оогенезе мыши?

После завершения первого мейотического деления хромосомы как 1ПТ, так и ооцита остаются сконденсированными. Обнаружено, что "хроматинконденсирующие" свойства цитоплазмы 1ПТ, как и у ооцита, вызваны высоким уровнем фактора созревания (MPF; Szollosi et al., 1991). Поэтому в 1ПТ никогда не формируется иитерфазное ядро; самое же удивительное заключается в том, что эта клетка начинает дегенрировать буквально с момента выделения.

По нашим наблюдениям, ко времени овуляции 1ПТ выделяется у 80% морфологически нормальных ооцитов мыши, находящихся к этому моменту на стадии МП, остальные 20% находятся на разных фазах мейотического деления. Через 3 ч после овуляции, когда уже все ооциты находятся на стадии MII, лишь у половины из них 1ПТ еще не распадаются. Через 24 ч после овуляции 1ПТ остаются только у 7% MII-ооцитов (рис. 2).

Часы после овуляцми/экукпезции

Рис.2. Скорость дегенерации первого полярного тельца и кариопластов MII-ооцитов in vitro. Обозначения: -о- Первое полярное тельце —о— MII-кариопласты в М16 -л- MII-кариопласты в М16 с нокодазолом

-V- MII-кариопласты в М16 с нокодазолом и цитохалазином D о Контроль: цитопласты

Дегенерация 1ПТ ооцита мыши идет по пути, напоминающем гибель клеток при некрозе. Происходит "размывание" хроматина (рис. 3) и фрагментация (рис. 4), сопровождающиеся полным разрушением клетки.

&

Распад 1П7 не зависел от каких-либо 5Лияний со сторонь: ооцита, также его не предотвращали ни ингибиторы иитоскелета цитохалазин D к нокодазол, ни ингибитор синтеза белка циклогексимид, ни ингибиторы протеаз; как in vivo, так и in vitro первые полярные тельца распадались с одинаковой скоростью.

Рис.3. Хромосомы ооцита и Рис.4. Ооцит на стадии МП и

первого полярного тельца(^) . фрагментирующееся первое

3 часа после овуляции. Окраска полярное тельце. Увеличение —

по Гимза. Увеличение — х900 х750

Попытки понять механизмы, лежащие в основе столь быстрой гибели этой клетки, привели к идее изучения не непосредственно 1ПТ, а структуры, которая могла бы отражать по крайней, мере некоторые из его свойств. Энуклеируя MII-ооциты, мы получали кариопласты, по объему примерно равные 1ПТ и содержавшие веретено метафазы II. Они и служили "моделью" 1ПТ. Контролем к кариопластам служили цитопласты, полученные микрохирургически из MII-ооцитов и также имевшие размер, равный 1ПТ.

Хромосомы 1ПТ не собраны, как у ооцита, в веретене, а распологаютсн по всему обьему цитоплазмы; поэтому мы изучали влияние ингибиторов иитоскелета на скорость дегенерации MII-кариопластов. Ски культивировались в присутствии цитохалазина D (0.5 цг/мл) — ингибитора полимеризации актина - и нокодазола (10 дМ) — ингибитора полимеризации тубулина. Темпы распада кариопластов оказались наиболее высокими при культивировании в присутствии нокодазола: в чистой среде М16, М16 с цитохалазином D и нокодазолом кариопласты дегенерировали с примерно одинаковыми скоростями и достоверно медленнее (р<0.05), чем в случае культивирования только с нокодазолом (рис. 2). За 50 ч наблюдений ни один из цитопластов не разрушился. Таким образом, быстрее всего распад кариопластоз происходил при разрушении веретена МП нокодазолом, другими словами, в случае диспергирования хромосом по всему объему цитоплазмы кариопласта. Разрушение же актиновых микрофиламектов цитохалазиком D, видимо, даже "нормализовывало" эффект, вызываемый нокодазолом. Таким образом, причиной гибели кариопластов, по-видимому, являлась нестабильность во взаимодействии актинового цитоскелета, хроматина и плазматической мембраны.

Выбранная нами модель 1ПТ — кариопласты ооцитов — все же недостаточно точно отражает процесс гибели этой клетки (рис. 2) . Это может быть связано с меньшими энергетическими ресурсами 1Г;Т по

сравнению с кариолластами из-за практически полного отсутствия у 1ПТ митохондрий (Calarco, 1995) . Подтверждением данному предположению служит то, что при общем подавлении метаболизма 5мМ азидом натрия скорость распада кариопластов была гораздо выше, чем у контрольных цитопластов и ооцитов, и приближалась к скорости гибели 1ПТ (наше наблюдение). Мы считаем, что принципиальные механизмы гибели 1ПТ обусловлены теми же причинами, что и разрушение кариопластов ооцитов.

Не исключая той возможности, что 1ПТ быстро разрушается просто потому, что в нем слишком много хроматина и слишком мало цитоплазмы, хочется заметить, что быстрая деградация 1ПТ исключает возможность его случайного оплодотворения, и таким образом, может являться своеобразным механизмом, закипающим ооцит от возможных последствий такого события.

цитогееетический анализ доикплантационного развития зигот после ИХ слияния со вторыми полярными ТЕЛЬЦАМИ

Одним из вопросов, который нас интересовал при изучении полярных те.-.ец, это способность их хромосом к поддержанию нормального развития. Как мы увидели в предыдущем разделе, хроматин 1ПТ очень быстро начинает деградировать. Однако имеются достаточно веские доводы полагать, что хромосомы второго полярного тельца имеют такой же "потенциал развития", как и их сестринские хроматиды, остающиеся в яйцеклетке и формирующие женский пронуклеус. Так, нормальное прохождение доимплантационных стадий развития диплоидными гиногенотаки и партеногенотами, а также триплокдами, полученными Б результате подавления выделения 2ПТ (Дыбан, Баранов, 1978; Cuthbertson, 1953; Surani, Barton, 1983; Speirs, Kaufman, 1989! свидетельствуют з пользу такого заключения. Второе полярное тельце интересовало нас еще по двум причинам. Во-первых, цитогенетический анализ 2ПТ может выявить практически любую возможную анеуплоидию в женском пронуклеусе. Во-вторых, слияние 2ПТ с зиготой дает возможность изучить эффект "задержки развития" ядра по сравнению с цитоплазмой, а также его последствия.

Результаты наших исследований представлены в таблице 1. К 97-му часу после введения hCG 95% контрольных зигот развилось in vitro до морфологически нормальных морул и бластоцист, а к 120-му часу более 70% эмбрионов вылуплялись из zona pallucida. Развитие зигот после их слияния на 21-м-24-м часу после введения hCG со вторыми полярными тельцами заметно ухудшалось(таблица 1). К 97-му часу лишь 51% таких триплоидов (МПН + ЖПН + 2ПТ; МПК - мужской пронуклеус; ЖПН - женский пронуклеус; 2ПТ - ядро второго полярного тельца) достигали стадии морулы и бластоцисть:, кроме того, скорость их морфогенеза была понижена (2 Э % бластоцист по сравнению с 59; у нормальных эмбрионов). Чтобы

выяснить, не связано ли ухудшение развития зтих эмбрионов с изменением плоидности, нами были получены триплоиды с двумя женскими пронуклеусами (кариотип МПН + ЖПН + ЖПН). Все такие зародыши достигли стадии морулы и бластоцисты, однако у них наблюдалась такая же задержка развития, как и у зародышей с кариотипом МПН + ЖПН + 2ПТ (таблица 1). Эти результаты находятся в полном соответствии с данными по развитию триплоидных эмбрионов, полученными другими исследователями (Дыбан, Баранов, 1978; Witkowska, 1981; Henery, Kaufman, 1992а, 1993). Таким образом, низкая жизнеспособность зигот после слияния с 2ПТ была вызвана не триплоидностью эмбрионов, а какими-то другими факторами.

Таблица 1

Доимплантационное развитие зародышей мыши in vitro

Плоиц-ность эмбрионов Кариотип эмбрионов 24 ч. 1-кл. 36 ч. 2-кл. 54 ч. 4-кл. 97 ч.

Морулы и бластоцисты Из них блэстоцист Среднее число клеток в зародышах

ди- плоиды МПН+ ЖПН 1031 1003 (97») - 984 (95%) 679 (69±1)% 33.5+0.5

МПН+ 2ПТ 81 78 (96%) 37 (46%) 26 (32%) 9 (35±9%) 21±2

триплоиды МПН+ ЖПН+ ЖПН 38 38 (100%) 38 (100%) 38 (100%) 12 (32±8 %) 22±1

МПН+ КПН+ 2ПТ 111 97 (87%) 79 (71%) 57 (51%) 16 (28+6%) 22±2

гаплоиды МПН 110 108 (98%) 44 (40%) 32 (29%) 0 (0%) 12±2

2ПТ 28 27 (96%) 0 (0%) 0 (0%) - -

Время указано в часах после введения ЬСв. Обозначения: МПН - мужской пронуклеус; ЖПН — женский лронуклеус; 2ПТ — ядро второго полярного тельца. Серым фоном обозначен контроль.

Цитогенетический анализ зародышей с кариотипом МПН + ЖПН + 2ПТ выявил причины плохого их развития. Оплодотворение и выделение 2ПТ запускают процессы формирования мужского и женского пронуклеусов. Ядро же 2ПТ никогда не увеличивается во размеров пронуклеусов, а репликация в нем полностью не проходит (Howlett, Bolton, 1985) . Следовательно, начиная с момента выделения 2ПТ, его ядро начинает неуклонно "отставать" от пронуклеусов. Таким образом, чем больше времени проходит после оплодотворения, тем меньше шансов того, что ядро 2ПТ после попадания в зиготу "догонит" МПН и ЖПН. В нашем исследовании вторые полярные тельца сливались с зиготами спустя 4-7 часов после выделения

(рис. 5А) . Следовательно, репликация в г.ронуклеусах завершалась раньше, чем в инкорпорированном ядре 2ПТ. Поэтому ко времени вступления зиготы в М-фазу происходила преждевременная конденсация хромосом 2ПТ (рис. 5Б, 5В) . Преждевременно сконденсированный хроматин 2ПГ, видимо, случайным образом распределялся между бластомерами двуклеточкых зародышей (рис. 5Г), что приводило к дисбалансу числа хромосом. В 13% случаев преждевременная конденсация хромосом вела к тому, что зиготы вообсе не делились (таблица 1).

т.

■г^с--

5Б 5В 5Г

Рис.5. Аномальное развитие зигот после их слияния со вторыми полярными тельцами. (5А) Пронуклеусы и ядро 2ПТ после его слияния с зиготой. Увел. х125. (5Б) Пронуклеусы в профазе, ядро 2ПТ в интерфазе. Увел. х250 (5В) Пронуклеусы в метафазе, преждевременная конденсация хроматина ядра 2ПТ. Увел. х250. (5Г) Остановка развития, аномальный 4-клеточный змйрисн с множественными микроядрами и анеуплондной метафазой. Увел. х125. Окраска: (5А) - Hoechst 33258, (5Б-5Г) - по Гимза.

Предположение о том, что именно асинхронность между ядром 2ПТ и цитоплазмой зиготы является причиной остановки развития триплоидов "МПН+ ЖПН + 2ПТ" подтвердилось в следующем эксперименте. После электрослияния зигот с их собственными полярными тельцами на 27-й—29-й час после введения hCG нами не было получено ни одной триплоидной морулы или бластоцисты. В основном такие зародыши на двуклеточкой стадии были анеуплсидными, а их развитие останавливалось. Те же эмбрионы, которые достигали стадий морулы и бластоцисты, были диплоидными и к 97-му часу содержали 14.2±1.4 клеток. Это говорит о том, что во время первого деления весь хроматин 2ПТ попадал только в один бластомер, развитие которого блокировалось; второй же дробился дальше.

После слияния 2ПТ с интактными зиготами 51% триплоидных зародышей достигли стадии морулы и бластоцисты. Однако при этом хромосомы второго полярного тельца вполне могли оставаться транскрипционно пассивными. Чтобы проверить, способно ли ядро 2I1T поддерживать раннее развитие, мы удаляли у зигот женские пронуклеусы и сливали их затем с собственными полярными тельцами. К 97-му часу 32% таких эмбрионов достигло стадии мсрулы и бластоцисты, из них бластоцистами было около трети (таблица 1). Гаплоидные же андрогенетические эмбрионы, полученные удалением ЖПН, развивались очень плохо: ни один из них не пошел дальше стадии морулы (таблица 1). Следовательно, ядро 2П7 способно активно поддерживать доимплантационное развитие. Почти двуксагясз различие по числу клеток у

ГО

гаплоидных андрогекотов к реконструированных диплоидов (МПН + 2ПТ; служит доплнительным тому подтверждением (таблица 1).

После слияния 2ПТ с энуклеированными зиготами развитие не шло дальше двуклеточной стадии (таблица 1); причинами такой остановки развития мы полагаем, во-первых, гаплоидность получаемых эмбрионов ¡Дыбан, Баранов, 1578), во-вторых, обсужденное выше временное несоответствие ядра цитоплазме, и в-третьих, некоторую травматичность процедуры энуклеации. Тем не менее, этот способ является оптимальным для иитогенетического анализа 2ПТ: при отсутствии собственных хромосом зиготы цитоплазма зиготы каким-то образом "подстраивается" под "отставшее" ядро 2ПТ, и вероятность преждевременной конденсации хроматина, видимо, сводится к нулю; нам удалось получить метафазные пластинки для 14 из 15 полярных телец (рис. 6А, 6Б), слитых с энуклеированной зиготой.

Г' """

\ «Ч?

6А 1бБ .

Рис.6. Метафазные пластинки 2ПТ после их слияния с энуклеироБанными зиготами.

Увел. хб25. Окраска по Гимза.

Полученные нами данные по развитию триплоидных зародышей, полученных слиянием женского пронуклеопласта или 2ПТ с зиготой, свидетельствуют о том, что между пересаживаемым ядром и реципиентной цитоплазмой должка существовать некая "синхронность". Необходимость в этом признавалась и другими исследователями (Mann, Lowell-Badge, 1987; Smith et al.r 1988, 1990; Soltcr, 1996). В целом, наши данные находятся е полном согласии с другими экспериментами по пересадкам ядер. При замене одного из пронуклеусов на ядра 4—8-клеточных гаплоидных андро-или гиногенотов развитие может проходить полностью (Surani et al., 1986); пересадки ядер бластомеров морулы или ВКМ в зиготы также давали высокий процент тетраплоидных бластоцист (Modlinski, 1978, 1981). Кроме того, наши результаты косвенно поддерживают наблюдение, что пересадки ядер более эффективны, если реципиентным цитопластом является энуклеированный ооцит, а не зигота (Solter, 1996), что, видимо, связано с тем, что "привести в соответствие" пересаживаемое ядро с "заблокированной" в М-фазе цитоплазмой ооцита является более легкой задачей, чем синхронизировать фазы клеточных циклов зиготы и донорного ядра.

11 -ИЗМЕНЕНИЕ БРЕМЕНИ ЗАПУСКА КАВИТАЦИИ У ХИМЕРНЫХ ЗАРОДЫШЕЙ [СВ6 ] B€F2<->BALB/C

Важную роль в доимплантационном развитии млекопитающих играют межклеточные взаимодействия. В моруле и ранней бластоцисте месторасположение клеток является ключевым регулятором направления дифференцировки бластомеров в трофэктодерму или недифференцированную ЗКК {Tarkowski, Krcblewska, 1967) . Одной из лучших моделей для выяснения того, как межклеточные взаимодействия влияют на ранний онтогенез млекопитающих, являются химерные зародыши, поскольку с их помощью можно, например, легко проследить судьбу отдельных клеток (Pedersen et al., 1S86), изучать взаимодействия "гетерсхроничных" бластомеров (Prather, First, 1986, 1987, 1988), бластомеров разной ллоидности (Everett, West, 1996) или различающихся генетически (West е£ al., 1995). Наша работа преследовала цель исследовать доимплантационную жизнеспособность "смешанных" химерных эмбрионов [СВб] B6F2-<->BALB/c по сравнению с интактными зародышами. Критерием оценки в нашем эксперименте служило время начала образования блассоцеля; в целом, по нему можно судить о взаимном влиянии генетически различных бластомеров.

Химерные зародыши [СВ6] B6F2<-»BA13/c ([CE6]B6F2 = [BALB/c х С5-В1/б] х Cj-Bl/c, в дальнейшем,- F2) мы получали путем агрегации отдельных бластомеров двуклеточных зародышей. Для данного эксперимента необходимо было найти адекватный контроль: уже операция по снятию zona pellvciaa значительно влияла на премя запуска кавитации. Кроме того, вероятность, что агрегируемые бластомерь: находятся на одной и той же стадии клеточного цикла, практически равна нулю, и, их асинхронность может влиять на развитие химерных эмбрионов. Поэтому контролем к химерам F2<->3ALB/c служили не интактные, э в некотором роде "химерные" эмбрионы, которые получали, агрегируя по два бластомерь: одного типа. Другими словами, мы проводили сравнение развития трех типов химер,— F2<r->3ALB/c, F2<->F2 и 3ALB/c<->BALB/c.

К 90-му часу после введения hCG зародыши представляли собой морфологически нормальные моруль:. К этому моменту среди эмбрионов F2«-+3ALB/c 8%, а среди 3ALB/c<-»3ALB/c 7% деградировали полностью или наполовину (т.е. один из бластомеров развивался, а другой - нет). Такие зародыши рассматривались как мертвые и в дальнейшем не учитывались. Образовывать бластоцель первыми начали зародыши F2<->BAL3/c, к 95-му часу после hCG 8% из них были ранними бластоцистами. Среди эмбрионов F20F2 бластоиисты начали появляться между 95-м и 100-м часом, а среди BAL3/c<->3ALB/c,— уже после 100-го (рис.7). Предполагая средним временем начала кавитации тот момент, когда половина всех ставших бластоцистами

зародышей уже имели или начинали образовывать бластоцель, а также используя процедуру оптимизации функции программы ВхдтаРХоЬ, мы выяснили, что зародыши Г2<-»ВАЬВ начали кавитацию на 8±2 часа раньше, чем контрольные и ВАЬВ<-»ВАЬВ (рис.8).

_ 100 -i

/

/ / ' /

/

V/

И

I

Á

65 100 105 110 115 Время после иньекции hCG (часы) Рис.7 Время запуска кавитации у эмбрионов F2*->BALB/c, F2<->F2 и BALB/ cOBALB/c. Обозначения:

химеры BALBOBALB химеры F2oF2 химеры F2<->BALB

85

90

95 100 105 110 115 Время после иньекции hCG (часы)

Рис.8 Рассчетные кривые времени запуска кавитации у эмбрионов F2<->BALB/c, F2<->F2 и BALB/coBALB/c. Обозначения: --химеры BALBOBALB

- - - химеры F20F2

— - - химеры F2<-»BALB

Этот факт оказался достаточно неожиданным: скорее можно было бы предположить, что "F2-4acTb" химеры, как более жизнеспособная in vitro по сравнению с "BALB/с-частыо", Судет благоприятно влиять на развитие последней, а по темпам морфогенеза химеры F2oBALB/c займут промежуточное положение между F2- и BALB/c-контролями. Косвенно в пользу такого предположения говорили и результаты о том, что зародыши от матерей BALB/c вносят относительно малый вклад в органы и ткани развивающихся химер после агрегации с эмбрионами (С51В1 х СБА) F2 (West et al., 1995). Полученные нами результаты свидетельствуют о наличии "химерного" гетерозиса, предсказанного еще МакЛарен (1979) и впоследствиии подтверждавшегося в работах по изучению репродуктивных функций и массе тела химерных мышей C57BI/60BALB/C (Micami, Onishi, 1985; Onishi, Micami, 1986). Для ранних стадий онтогенеза подобный "гетерозис" показан впервые нами. В будущем необходимо будет провести более детальное изучение данного феномена уже на молекулярно-генетическом уровне. В настоящий момент мы можем только предложить гипотезу, что какие-то (ростовые?) факторы, обеспечивающие "взаимоотношения" бластомеров эмбриона, в химерных зародышах, включают

"положительную обратную связь" во взаимодействиях генетически различных частей химеры.

Уровни и характер трансляции у доимплантационных зародышей мыяи с подавленньм

ЦИТОКИНЕЗОМ

Важное значение для понимания механизма работы "биологических часов" эмбриона мыши имеют исследования изменений, происходящих в зародыше на транскрипционном и трансляционном уровнях и являющихся отражением развертывающейся во времени и в пространстве программы развития. В раннем эмбрионе транскрипция часто идет "на шаг вперед", тогда как изменения характера трасляции связаны непосредственно с морфогенетическими переходами (Kidder, 1992).

Мы изучали трансляционную активность у доимплантационных зародышей мыши, цитокинез которых был подавлен цитохалазином D. Такие зародыши оставались одно- и двуклеточными на протяжении всего доимплантационного периода. Запуск кавитации, и затем вьшупление из zona pellucida у них начинались одновременно с контрольными.

120 ООО

40

50

Стадии контрольных 2-клетшная зародыши

"с

40 100 110 120

часы после ваеде(«я hCG

(t-WeiWHcW

РЭЖЯЯ

бпэсттх^ста

вылуплякыряся бластгх*ста

Рис. 9. Уровень включения ' Б-метионина в новосинтезирующиеся белки контрольных

эмбрионов и зародышей с подавленным цитокинезом. Обозначения:

—о- контрольные »мбрионм

"одноклеточные" »мбрионы

Мы провели количественный анализ общего белкового синтеза у этих

эмбрионов (рис.9). Начиная с двуклеточной стадии, включение ["э]-

метионина "одноклеточными" зародышами, культивировавшимися в

присутствии цитохалазина О, были заметно ниже, чем у контрольных

эмбрионов. После формирования бластоцист у контрольных зародышей

40 000

наблюдался резкий всплеск уровня включения [З53]-метионина, а у "одноклеточных" продолжалось медленное, почти линейное возрастание трансляционной активности.

Нами не было обнаружено различий в наборах синтезируемых белков у контрольных и экспериментальных зародышей ни на одной стадии, что согласуется с другими работами (Petzolclt et а!., 1983) .Для проведения количественного измерения различий в синтезе отдельных белков мы сравнивали электрофореграммы контрольных и экспериментальных вылупляющихся бластоцист (рис. 10, 11) .

Рис. 10. Белки, синтезирующиеся контрольными бластоцистами.

Рис. 11. Белки, синтезирующиеся "двуклеточныии" бластоцистами.

На этой стадии спектр транслируемых белков максимален, и нам удалось провести сравнение сразу по нескольким десяткам пятен. Мы использовали "двуклеточные" бластоцисты, так как "одноклеточные" эмбрионы гибли вскоре после образования бластоцеля. Компьютерный анализ двумерных электрофореграмм позволил выявить 98 совпадающих пятен, для 85 из которых были вычислены значения ррт (частей на миллион) . Из 13 остальных 10 не были учтены вследствие их малой интенсивности, а 3 дали 100% насыщение и не могли быть оценены.

ю ООО -

Возрастание значения ррт Белков контрольных Бластоцист

Рис. 12. Значения ррт для совпадающих пятен на электрофореграымах контрольных и "двуклеточных" бластоцист.

На рис. 12 представлены совпадающие пары полипептидов в порядке возрастания значения ррт контрольных бластоцист. Из этого рисунка видно, что у "двуклеточных" и "одноклеточных" зародышей происходит не только снижение общего уровня трансляционной активности, но и резко преображается ее характер: для многих белков наблюдается 3-х и более кратное изменение ррт по сравнению с контролем. На рисунке такие белки отмечены номерами, присвоенными им программой.

Способность "одноклеточных" зародышей к формированию бластоцеля позволяет предположить, что первые морфогенетические трансформации в онтогенезе мыши во многом подчиняются принципу "автономной специализации" (Davidson, 1991), иными словами, в эмбрионе изначально существует некий "механизм развертывания программы раннего морфогенеза", не зависящая от взаимодействия бластомеров и механизмов "условной специализации". Однако у млекопитающих "ауторегуляция" раннего развития не может осуществляться за счет прелокализации неких материнских факторов (Evsikov et al. , 1994); по всей видимости, "автоматизм" раннего морфогенеза заложен в механизме "до when ready", то есть факторы ооплазмы определяют набор генов, экспрессирующихся в момент включения эмбрионального генома, которые, в свою очередь, будут определять экспрессию следующего набора генов, и так далее.

С одной стороны, полученные данные можно объяснить тем, что регуляция синтеза белка "подстраивается" под одноклеточное состояние доимплантационного зародыша. Б этом случае уменьшение общего уровня трансляции было бы вызвано тем, что для функционирования и регуляции "одноклеточного" эмбриона необходимо синтезировать существенно меньшее количество белков, которые в нормальном зародыше должны присутствовать в каждом бластомере. Другими словами, нормальный эмбрион, по сравнению с "одноклеточным", является более сложной системой, и для своего жизнеобеспечения требует большего количества элементов. С другой стороны, возможно, что обработка цитохалазином, разрушая актиновый цитоскелет и нарушая ультраструктуру клетки, негативно влияет на непосредственные механизмы, обеспечивающие трансляцию, и в результате наблюдается относительное снижение уровня белкового синтеза. В целом же оба приведенные соображения позволяют нам сделать вывод о том, что время морфогенетических переходов в доимплантационном зародыше мыши определяется не столько достижением определенной концентрации продуктов каждого этапа , сколько определенным набором стадийспецифических факторов, который и служит сигналом к дальнейшему развитию.

выводы

1. Быстрое разрушение первого полярного тельца после выделения возможно являющееся своеобразным механизмом, защищающим яйцеклетк от нежелательных последствий его оплодотворения, вызван нестабильностью во взаимодействиях сконденсированного хроматина актинового цитоскелета и плазматической мембраны.

2. Развитие in -vitro зигот после замены женского пронуклеуса на ядр второго полярного тельца подтверждает, что хромосомы последнег способны участвовать в доимплантационном морфогенезе мыши.

3. Пересадки ядер вторых полярных телец в зиготы свидетельствуют о том что асинхронность между пересаживаемым ядром и реципиентно цитоплазмой является главной причиной ранней остановки развита реконструированных эмбрионов.

4. Успешное прохождение первого деления дробления энуклеированньм зиготами, слитыми со вторыми полярными тельцами свидетельствует i том/ что работа "цитоплазматических часов" первого клеточного цикл; частично регулируется состоянием присутствующего в зиготе хроматина Кроме того, такое слияние дает возможность проводит] цитогенетический анализ хромосом второго полярного тельца.

5. Сдвиг во времени образования бластоцеля у химерных зародыше; [СВ6] B6F2«-»BALB/c по сравнению с контрольными является примерог проявления "химерного гетерозиса", реализующегося npi взаимодействиях гетерологичных бластомеров химер.

6. Время морфогенетических переходов в доимплантационном зародыше мьша определяется не столько достижением определенной концентраци> продуктов каждого этапа, сколько определенным наборо». стадийспецифических факторов, который и служит сигналом к дальнейшему развитию.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Evsikov S.V., Evsikov A.V. Preimplantation development of manipulated mouse zygotes fused with the second polar bodies: a cytogenetic study// Int J Dev Biol.- 1994,- V.38.- P.725-730.

2. Евсиков A.B., Евсиков C.B. Изучение первого и второго полярных телец в оогенезе мыши// Онтогенез.— 1995.- Т.26, № 3.- С.196-200.

3. Евсиков A.B. Регуляторные механизмы доимплантационного морфогенеза мыши// Биополимеры и клетка.- 1997,- Т.13, № 2,- С.93-99.

iciKOB О. В. 4acoBi фактори в процесах до1мплантац1йного морфогенезу [mi.- Рукопис.

icepTauin на здобуття наукового ступеня кандидата (Нологхчних наук за 1еи1альн1стю 03.00.26 - молекулярна генетика.- 1нститут молекулярной .onorii i генетики НАН Укра1ни, Ки1в, 1997.

lcepTauiio присвячено проблемам регуляцИ завершальних стад1й оогенезу раннього ембр1огенеэу миш1. Виявлено причини гавидко! деградацИ гршого полярного т1льця. Продемонстровано принципозу можлив!сть 1користання других полярних т!лець для виявлення анеупло1дхй жхночого зонуклеусу, а також зд1бн!'сть 1х хромосом до п1дтримки розвитку. ^одемонстровано феномен "химерного гетерозису" на до!мплантац1йних гад1ях. На ochobI вивчення ембр10Н1в, якх розвиваються в умовах гримання цитокинезу, розроблено гипотезу про механ1зми регуляцЦ з1мплантац1йного морфогенезу миш1.

iKMOBi слова: ооиит, полярн1 тхльця, ембр1он, до1мплантац1йний зрфогенез, химера, регуляц1я розвитку, миша.

зсиков А.В. Временные факторы в процессах доимплантационного эрфогенеза мыши,— Рукопись.

юсертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по тециальности 03.00.26 - молекулярная генетика.- Институт молекулярной юлогии и генетики НАН Украины, Киев, 1997.

1ссертация посвящена проблемам регуляции завершающих стадий оогенеза и аннего эмбриогенеза мыши. Выявлены причины быстрой деградации первого элярного тельца. Показана принципиальная возможность использования горых полярных телец для выявления анеуплоидий женского пронуклеуса, а зкже способность их хромосом к поддержанию развития. Продемонстрирован ?номен "химерного гетерозиса" на доимплантационных стадиях. На основе зучения эмбрионов, развивающихся в условиях подавления цитокинеза, ззработана гипотеза о механизмах регуляции доимплантационного эрфогенеза мыши.

иючевые слова: ооцит, полярные тельца, эмбрион, доимплантацчонный эрфогенез, химера, регуляция развития, мышь.

isikov A.V. Timing Factors In The Processes Of Mouse Preimplantation Drphogenesis.- Manuscript.

lesis for a candidate's degree on speciality 03.00.26 - molecular ^netics.- Institute of Molecular Biology and Genetics, Ukrainian NAS, iev, 1997.

issertation is devoted to the problems of regulation of oocyte aturation and early embryogenesis in mice. The causes of first pclar 3dy degradation were uncovered. Possibility of second polar bodies use эг aneuploidy assay of female pronuclei, and the ability of their iromosomes to support early development were demonstrated. Phenomenon f "chimeric heterosis" on preimplantation stages was discovered. On те basis of the study of embryos which developed in the conditions of /tokinesis repression, hypothesis on the mechanisms of regulation of Duse preimplantation morphogenesis was elaborated.

эу Words: Oocyte, Polar Bodies, Embryo, Preimplantation Morphogenesis, -limera, Regulation Of Development, Mouse.

Пщписано до друку 14.10.97р. Формат 60x90/16. Ум. друк. арк.1,0 Обл.-вид. арк. 0,8. Наклад 100. Зам. 266.

В1дц1л оперативно! полграфЛ Центру М1жнародно? осв1ти 227-12-75, 227-37-86