Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние микроинъекции на выживаемость зародышей мыши и получение первичных колоний эмбриональных клеток

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Влияние микроинъекции на выживаемость зародышей мыши и получение первичных колоний эмбриональных клеток"

На правах рукописи

КАПРАЛОВА ИРИНА ВЛАДИМИРОВНА

ВЛИЯНИЕ МИКРОИНЪЕКЦИИ НА ВЫЖИВАЕМОСТЬ ЗАРОДЫШЕЙ МЫШИ И ПОЛУЧЕНИЕ ПЕРВИЧНЫХ КОЛОНИЙ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ КЛЕТОК

03.00.02.-биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

□034Б0442

Пущино - 2009

003460442

Работа выполнена в лаборатории механизмов рецепции Института биофизики клетки РАН

Научные руководители: чл.-корр. РАН, доктор биологических наук,

профессор

Фесенко Евгений Евгеньевич

кандидат биологических наук Межевикина Людмила Михайловна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Гордон Рита Яковлевна

кандидат биологических наук Сахарова Наталья Юрьевна

Ведущая организация: Институт биоорганической химии

им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, г. Пущино

Защита состоится « 19 » февраля 2009 г. в 15.30 ч

на заседании диссертационного совета Д 002.038.01 в Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290, г. Пущино, Московская область, ул. Институтская д. 3

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, г. Пущино, Московская обл., ул. Институтская д. 3

Автореферат разослан « 19 » января 2009 года.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Т.И. Смолихина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Проблема терапевтического и репродуктивного клонирования стала одной из самых популярных проблем современной клеточной биологии и медицины (Kuhholzer, Prather, 2000; Solter, 2000; Kawase et al, 2000; Wolf et al, 2001; Illmensee, 2002; Wakayama et al, 2005; Hochedlinger, Jaenisch, 2003, 2006). Одним из подходов для ее решения является микроиньекция (МИ) в ооциты или ранние зародыши чужеродных ядер, ДНК и эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), которые обладают уникальной способностью встраиваться в развитие зародыша и передавать свои признаки по наследству (Bradley et al, 1984; Robertson, 1986; Perry et al., 1999; Baguishi et al., 1999; Nagy et al., 1987; Nagy, Rossant, 2001; Nagy et al, 2003).

В последние годы методы МИ нашли практическое применение в работах по лечению бесплодия человека с помощью экстракорпорального оплодотворения - ЭКО, когда отдельный сперматозоид водится в цитоплазму ооцита (Галат, 2000; Lundin et al, 2001; Yoshida, 2007; Jones et al, 2008). Другая область применения МИ связана с решением проблем клонирования ЭСК животных и человека с генетически измененными свойствами (Wakayama et al, 2001; Hochedlinger, Jaenisch, 2003, Hwang et al, 2005; Hochedlinger, Jaenisch, 2006). После замены ядра ооцита на ядро таких клеток получают зародыши, генетический материал которых соответствует геному донора.

Подавляющее большинство исследований с применением техники МИ выполнено на экспериментальных моделях лабораторных мышей. Из этих работ следует, что выживаемость мышиных ооцитов после замены ядер не превышает 1-2 % из-за низкой способности соматических и эмбриональных ядер к репрограммированию в цитоплазме зрелого ооцита (Illmensee, Hoppe, 1981; Wilmut et al, 1997; McLaren, 2000; Hochedlinger, Jaenisch, 2003; Hwang et al, 2004). По данным литературы более высокий процент выживаемости реконструированных зародышей достигается на стадии бластоцисты, если в качестве источника чужеродного генетического материала в полость бластоцисты инъецированы ЭСК (Bradley et al, 1984; Robertson, 1986; Nagy et al., 1987; Nagy, Rossant, 2001; Rossant, 2001; Nagy et al., 2003). В этом случае из реконструированных бластоцист можно получить более 20 % генеративных химерных животных. Этот метод находит применение в различных трансгенных и ген-таргетированных технологиях с использованием в качестве векторных систем ЭСК.

В современной литературе господствуют представления о том, что способность инъецированных клеток встраиваться в развитие целого зародыша и его гаметогенез зависит от плюрипотентных свойств ЭСК (Robertson, 1986; Robertson et al, 1987; Bradley et al., 1992; Brown et al., 1992; Papaioannou, 1993; Yagi, 1993; Ueda et al., 1995; Longo et al, 1997; Rossant, Spence, 1998; Prelle et al, 1999; Rossant, 2001). При этом остаются в стороне и не рас аются

вопросы влияния процедуры МИ на последующее развитие и выживаемость химерных зародышей и их способность продуцировать первичные колонии эмбриональных клеток.

Кроме того, не достаточно внимания уделяется вопросам влияния генома зародыша на свойства и межклеточные взаимодействия ЭСК на начальных этапах развития в составе бластоцисты, а также факторам, индуцирующим эти процессы in vitro. Плюрипотентные ЭСК мыши с одинаковой вероятностью включаются как экстраэмбриональные ткани, так и ткани самого зародыша. Выбор направления развития инъецированных клеток во многом носит случайный характер и остается неизвестным. В связи с этим изучение характера распределения ЭСК в составе бластоцисты и выяснение регуляторных возможностей клеток зародыша восстанавливать свою морфологию и жизнеспособность после повреждений, вызванных МИ, является чрезвычайно важной фундаментальной проблемой. Результаты этих исследований имеют прямой выход в медицинскую практику.

Цель работы

Получение с помощью метода МИ химерных бластоцист мыши и выявление характера распределения инъецированных эмбриональных и соматических клеток в химерном зародыше на начальных этапах его развития.

Задачи исследования:

• Оценка жизнеспособности бластоцист различных линий мышей in vitro после МИ в полость растворов витальных красителей, среды культивирования, эмбриональных и соматических клеток.

• Исследование межлинейных различий в реакции бластоцист на МИ. Оценка характера повреждений бластоцист.

• Разработка методических приемов для повышения эффективности культивирования мышиных бластоцист in vitro.

• Оценка влияния цитокина LIF на развитие бластоцист в зависимости от способа его действия: опосредованно через среду культивирования или путем введения в полость бластоцисты.

• Подбор генетических маркеров и флуоресцентных красителей для идентификации инъецированных соматических и эмбриональных клеток в составе бластоцисты. Оценка характера их встраивания в бластоцисту.

• Получение химерных бластоцист и выявление различий в эффективности их культивирования в зависимости от генома инъецированных клеток.

Научная новизна и практическая ценность работы

Показано, что процедура МИ в полость бластоцисты растворов витальных красителей и среды для культивирования зародышей мыши, не вызывает значительных осмотических эффектов и снижения выживаемости бластоцист in vitro. После МИ бластоцисты линейных мышей восстанавливают морфологию в течение 3 ч инкубирования. В их составе обнаруживается не более 4-5 % поврежденных нежизнеспособных клеток с нарушенными барьерными свойствами плазматических мембран, локализованных в основном по направлению проникновения иглы в полость бластоцисты. Со временем поврежденные клетки исторгаются в перивителлиновое пространство и не влияют на последующее развитие бластоцист и формирование колоний первичных эмбриональных клеток (ЭК) - предшественников плюрипотентных линий ЭСК.

Впервые показано, что процедура МИ стимулирует у разных линий мышей выход бластоцист из блестящей оболочки (zona pellucida) и образование первичных колоний ЭК. Прием стимулирования бластоцист с помощью МИ в сочетании с пролонгированным культивированием их до 7 суток in vitro может использоваться для более эффективного выделения первичных колоний и, соответственно, линий ЭСК животных и человека.

Выявлены регуляторные свойства и избирательность действия цитокина LIF на пролиферативную активность клеток трофобласта (ТБ) на стадии поздней бластоцисты и показано, что LIF регулирует рост первичных колоний ЭК, а также соотношение в колониях дифференцированных и недифференцированных плюрипотентных клеток, составляющих единую клеточную популяцию, развившуюся из бластоцисты.

С помощью методов флуоресцентной и конфокальной микроскопии установлено, что инъецированные в бластоцисту ЭСК и соматические клетки (эмбриональные фибробласгы мыши и клетки линии Cos-1) встраиваются преимущественно в ТБ и меняют свои свойства под влиянием клеток зародыша. Эти результаты могут быть использованы в дальнейшем для получения стабильных линий эмбриональных клеток с генетически измененными свойствами, в частности, с помощью трансфекции плазмидным вектором pEGFP, экспрессия которого сопровождается флуоресцентным свечением, и по этой интенсивности можно судить о месте локализации и функциональной активности клеток в составе бластоцисты.

Апробация работы.

Материалы диссертации представлены в виде стендовых докладов на 6 и 9 Международных школах - конференциях молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2002, 2005); Всеукраинской конференции молодых ученых (Киев, 2002); II конференции «От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям» (Пущино, 2002); Всероссийский симпозиум «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург,

2006); П съезде Общества клеточной биологии совместно с юбилейной конференцией, посвященной 50 летию Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2007), а также на ЕМВО Practical Course on Microinjection and Detection of Probes in Cell (Heidelberg, 2005) и Spetses International Summer School «Molecular Mechanisms of Regeneration, From Stem Cells to Organ Development, Function and Regeneration» (Spetses, 2007).

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на_страницах машинописного текста и состоит

из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материал и методы исследования», «Результаты и их обсуждение», «Выводы», «Список литературы». Работа включает 4 таблицы и 25 рисунков, список литературы содержит_источников.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Материал и методы исследования

Объекты исследования. Для экспериментов использовали инбредных мышей 129/Sv (коллекция лаборатории генетики НЦ биомедицинских технологий РАМН, питомник Светлые горы), NMRI (питомник филиала Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, Пущино), SHK (питомник Центральный, ст. Крюково), а также трансгенных мышей С57В1/6 TgN(ACTbEGFP)10sb (Jackson Laboratory, с разрешения A.B. Червонского, avc@jak.org).

Выделение зародышей на стадии бластоцисты. Для выделения большого количества зародышей на стадии бластоцисты использовали стимуляцию самок фолликулостимулирующим (Фоллимаг®, Мосагроген) и хорионическим гонадотропными гормонами (ХГЧ, Московский эндокринный завод). Гормоны вводили подкожно по 10 ед. на самку с интервалом 52 ч. После введения второго гормона, ХГЧ, самок подсаживали к самцами из расчета 1:1 и утром следующего дня определяли наличие копулятивных пробок. День обнаружения пробки считали первым днем беременности. Бластоцисты выделяли из рогов матки на 4 день беременности. В экспериментах использовали средние и поздние бластоцисты с отсутствием видимых нарушений морфологии. Оценку морфологического состояния бластоцист проводили под инвертированным микроскопом IX-70 (Olympus). Для выделения бластоцист и их последующего культивирования использовали модифицированную среду Виттена (МСВ) с добавлением органического буфера HEPES (Березовская и др., 1986).

Выделение первичных эмбриональных фибробластов (ПЭФ). Первичные клетки ПЭФ выделяли из 12-14 дневных эмбрионов мышей линии С57В1/6 TgN(ACTbEGFP)10sb с постоянной экспрессией зеленого флуоресцентного белка GFP. Из области спины эмбрионов

вырезали небольшие кусочки ткани, измельчали их механическим путем и дезагрегировали в трипсин-ЭДТА (ПанЭко, ICN) в течение 5-10 мин при 37°С. Суспензию клеток ПЭФ осаждали центрифугированием, промывали 2-3 раза в PBS, после чего использовали в опытах по МИ.

Культивирование клеток и ранних зародышей. Первичные клетки ПЭФ и клетки перевиваемой линии Cos-1 культивировали в среде ДМЕМ (БиолоТ, Sigma) с добавлением 2 мМ L-глутамина, 50 мкг/мл антибиотиков-антимикотиков (Sigma) и 10 % фетальной сыворотки коров (Sigma). Для ЭСК мыши линии R1 использовали среду ДМЕМ (Sigma) с более высоким содержанием (15-20 %) фетальной сыворотки коров. В среду культивирования ЭСК дополнительно вносили 0.1 мМ меркаптоэтанола (Sigma), 1 % заменимых аминокислот (Gibco), 1 мМ нуклеозидов (Sigma) и 10 нг/мл цитокина LIF (Leukemia inhibitory factor, PeproTech.inc.).

Клеточные культуры высевали в концентрации 105 клеток на 35 мм чашках Петри (Nunc) и культивировали при 37°С в 5% ССЬ-инкубаторе (Sanyo) в течение 2-3 суток. Для роста ЭСК чашки Петри предварительно обрабатывали 0.1 % раствором желатины (ICN) или же культивировали эти клетки на митомициновом фидерном слое ПЭФ мыши, приготовленном по стандартной методике.

Культивирование мышиных бластоцист проводили в эмбриологических 4-х луночных чашках Петри (Nunc) в среде МСВ, куда через 48 ч вносили 10 % фетальной сыворотки коров (Sigma) для улучшения развития бластоцист после выхода из оболочки. Цитокин LIF (Рерго Tech.inc., Sigma) использовали в концентрации 10 нг/мл, как и в случае культивирования ЭСК мыши.

Микроинъекция (МИ) в бластоцисты растворов и клеток. МИ проводили на микроманипуляторе TransferMan NK (Eppendorf) под инвертированным микроскопом IX-70 (Olympus), оснащенным дополнительным объективом в модификации Хоффмана. Для МИ клеток и растворов в полость бластоцисты использовали стандартные инструменты фирмы Eppendorf, предназначенные для работы на изолированных зародышах и клеточных культурах: вакуумную присоску типа VacuTip и иглы для инъекции клеток TransferTip(ES).

Для поддержания тургора бластоцисты процедуру МИ проводили в МСВ, разбавленной дистиллированной водой (10 %). В полость бластоцисты вводили 7-10 ил МСВ или такой же объем растворов витальных красителей: 0.03% трипанового синего (Fluka) и 0.1 % фенолового красного (Sigma) для визуального контроля эффективности МИ и расчета скорости диффузии красителей из полости бластоцисты. Для оценки биологических эффектов «эндогенного» цитокина LIF мыши (Sigma) в бластоцисты инъецировали белок в концентрациях 0.65, 0.33, 0.16 и 0.07 пг/нл.

В опытах по МИ использовали мышиные клетки ЭСК линии R1 и ПЭФ с постоянной экспрессией гена gfp, а также клетки перевиваемой линии Cos-1, трансфицированные

плазмидным вектором pEGFP. ЭСК перед МИ предварительно обрабатывали доксорубицином-Ферейн (ЗАО Брынцалов-A). Для этого ЭСК переводили в суспензию и инкубировали в течение 1 ч в растворе 1 мкг/мл доксорубицина, после чего дважды промывали в PBS и переносили в МСВ для МИ. В полость каждой бластоцисты инъецировали в среднем по 7 эмбриональных и соматических клеток. Их распределение и встраивание в состав бластоцисты оценивали на флуоресцентном микроскопе Axiovert 40 CFL (Zeiss) и конфокальном лазерном сканирующем микроскопе LSM510 МЕТА (Zeiss).

Трансфекция клеток линии Cos-1. Для трансфекции использовали плазмидный вектор pEGFP-Cl (Invitrogen), экспрессирующий ген gfp и селективный ген neo, обеспечивающий устойчивость трансфицированных клеток к антибиотику генетицину (G418, Sigma). Перед трансфекцией клетки культивировали в среде ДМЕМ до 70 % монослоя, после чего их трансфицировали 1 мкг/мл плазмидной ДНК pEGFP-Cl с помощью агента липофектамина 2000 (Invitrogen) по методу, предложенному Invitrogen (http://wvvw.invitrogen.com). Селекцию трансфицированных Cos-1 проводили в течение 2-х недель в среде с 300 мкг/мл G418. Устойчивые к антибиотику флуоресцирующие клетки отбирали под инвертированным микроскопом Axiovert 40CFL (Zeiss) при длине волны 488 нм.

Оценка жизнеспособности бластоцист. Жизнеспособность бластоцист оценивали по морфологии и эффективности развития в течение 7 суток in vitro. При этом обращали внимание на способность бластоцист выходить из z. pellucida, адгезию и способность формировать колонии ЭК. В бластоцистах и колониях ЭК определяли количество клеток внутренней клеточной массы (ВКМ) и трофобласта (ТБ), а также выявляли с помощью 0,5 % витального красителя трипанового синего (Fluka) поврежденные клетки с нарушенными барьерными свойствами плазматических мембран. Подсчет площади и количества клеток в бластоцисте проводили с использованием компьютерной программы анализа изображения для цитофотометрии (PhotoM).

Цитохимический тест на выявление эндогенной щелочной фосфатазы (ЭЩФ). Плюрипотентные клетки в первичных колониях, сформированных из бластоцист in vitro, оценивали по активности ЭЩФ (Лойд, 1982). Колонии быстро фиксировали охлажденным ацетоном и инкубировали с цитохимическим реагентом а-нафтол-А8-фосфатом (ICN) и красителем ВВ синим прочным (ICN) в течение 1 ч при 37°С в ССЬ-инкубаторс. Раствор для цитохимического тестирования готовили перед началом фиксации клеток, фильтровали через нитроцеллюлозные фильтры с диаметром пор 0.6 мкм и сразу же использовали для выявления активности ЭЩФ. Плюрипотентные клетки после инкубирования с цитохимическими реагентами окрашиваются в синий цвет. Принцип окрашивания сводится к тому, что а-нафтол-AS-BI-фосфат под влиянием ЭЩФ превращается в нафтол-AS-BI, который после

взаимодействии с солью азокрасителя ВВ синего прочного выпадает в осадок и дает нерастворимый пигмент темно-синего цвета.

Илмуноцитохимическое определение фактора транскрипции плюрипотентных клеток - Nanog. Плюрипотентные клетки в прикрепленных к поверхности чашки Петри колониях выявляли с помощью первичных моноклональных антител мыши (Sigma) против белка-маркера Nanog в разведении 1:500 в течение ночи при 4°С, затем после отмывки в PBS инкубировали 2 ч при комнатной температуре с вторичными козьими антителами против Ig мыши, конъюгированными с флуоресцентным красителем FITC (ИМТЭК, разведение 1:300). Препараты заключали под покровное стекло в раствор глицерина и PBS (1:1) и анализировали под инвертированным микроскопом Axiovert 40CFL (Zeiss) при длине волны 488 нм. При микроскопировании плюрипотентные клетки, продуцирующие Nanog, дают зеленое свечение.

Статистическая обработка результатов.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью ¿-критерия Стьюденга (Гланц, 1998) и компьютерной программы SigmaPlot.

Результаты и обсуждение

1. Морфофунщиональные особенности бластоцист после МИ.

Поскольку процедура МИ связана с проколом зародыша и, следовательно, нарушением целостности его блестящей оболочки (zona pellucida) и плазматических мембран, мы исследовали характер и обратимость таких повреждений на многоклеточной стадии бластоцисты, характеризующейся четкой структурной организацией и расположением клеток ВКМ и ТБ. На этой стадии происходит естественный разрыв z. pellucida и выход зародыша из оболочки для его более тесного взаимодействия с клетками люминального эпителия матки и последующей имплантации (Cross et al., 1994; Aplin, Kimber, 2004; Kimber, 2005; Fouladi-Nashta et a!., 2005).

Оценку повреждений мышиных зародышей проводили после МИ в полость бластоцисты МСВ, которая использовалась нами для культивирования, и витальных красителей с целью визуального контроля проникновения растворов в полость бластоцисты (рис. 1). Было установлено, что при введении иглы через z. pellucida и слой клеток ТБ оба красителя (трипановый синий и феноловый красный) попадают в полость бластоцисты (рис. 1 а-г). При этом бластоциста набухает и увеличивается в размерах. Аналогичные изменения происходят с бластоцистами при введении МСВ.

Рис. 1. Микроинъекция в полость бластоцисты витальных красителей: а, б - 0.03 % трипанового синего, в, г - 0.1 % фенолового красного и д, е - модифицированной среды Виттена. Стрелками показаны поврежденные нежизнеспособные клетки сразу после ' микроинъекции (д) и через 24 ч культивирования бластоцист (е).

Однако после извлечения иглы и снятия бластоцисты с фиксирующей присоски ее размеры сокращаются в результате выхода избыточного количества жидкости в перивителлиновое пространство, наблюдаются видимые структурные изменения, сопровождающиеся исчезновением полости бластоцисты и перераспределением клеток ВКМ и ' ТБ (рис. 1 д). Сразу после МИ бластоцисты по своей морфологии больше напоминают зародышей на стадии начала компактизации: у них отсутствует полость, хорошо обозначено ' перивителлиновое пространство, отчетливо видны отдельные достаточно крупные клетки округлой формы - бластомеры. Видимые нарушения морфологии бластоцист после МИ нивелируют в течение 3 ч инкубирования в МСВ, через 24 ч «компактные морулы» достигают стадии средней и поздней бластоцисты, что подтверждается соответствующей морфологией расположения клеток ВКМ и ТБ и наличием полости (рис. 1 е).

Следует отметить, что в результате МИ в бластоцисту растворов повреждаются клетки, расположенные по ходу прокола (рис. 1 д, обозначены стрелками). Поврежденные клетки окрашиваются витальным красителем трипановым синим, что свидетельствует об отсутствии барьерных свойств плазматических мембран и гибели. Через сутки культивирования нежизнеспособные клетки, исходно находящиеся в составе бластоцисты, смещаются в направлении трофобдаста и выходят в перивителлиновое пространство (рис. 1, е).

Динамика восстановления бластоцист после МИ раствора трипанового синего свидетельствует о выходе красителя из полости в течение первых 3 ч инкубирования

зародышей (рис. 2). К этому времени в инъецированных бластоцистах обнаруживается не более 10 % окрашенных клеток, число которых прогрессивно снижается до уровня 4-5 % при увеличении времени культивирования до 24 ч, как и случае инъекции в полость бластоцисты МСВ (рис. 2, табл. 1).

Рис. 2. Изменение количества поврежденных клеток после микроинъекции в полость бластоцисты среды Виттена (_ .) и 0.03 % трипанового синего (_).

Таблица 1

Количество поврежденных бластоцист мышей линии БНК в результате микроинъекции модифицированной среды Виттена (МСВ).

врет инкубации бластоцист перед тестированием, ч число бластоцист после МИ % поврежденных бластоцист % окрашенных клеток в бластоцисте

0 70 92.9±4.9 11.6±1.5

0.25 14 79.5±5.8 9.9±1.9

0.5 16 72.7±7.6 6.9±1.6

1 18 58.6±9.9 5.9±0.8

2 13 42.4±6.2 5.2±0.6

3 13 32.2±6.6 6.8±1.8

24 11 31.0±6.9 4.7±1.9

Примечание. Поврежденными считали бластоцисты с нарушенными барьерными свойствами плазматических мембран, пропускающие витальный краситель 0.5 % трипановый синий.

Таким образом, было установлено, что зародыши мыши на стадии бластоцисты обладают высокой пластичностью и репарационной способностью. После МИ они сравнительно быстро восстанавливают морфологию (рис. 1, е) и барьерные свойства плазматических мембран (рис. 2, табл. 1). По нашим данным только 1/3 бластоцист через 3 ч инкубирования после МИ несет в своем составе поврежденные клетки, численность которых не влияет на последующее развитие.

2. Развитие зародышей на стадии бластоцисты in vitro.

В наших исследованиях установлено, что в условиях пролонгированного культивирования с цитокином LIF зародыши инбредных линий мышей на стадии бластоцисты развиваются в виде сложных по своей морфологии колоний, представленных как дифференцированными клетками ТБ, так и недифференцированными плюрипотентными клетками ВКМ, составляющими единую клеточную популяцию, развившуюся из бластоцисты (рис. 3). Изменения морфологии бластоцисты, выход из z. pellucida и прикрепление к поверхности субстрата предшествуют формированию колоний, центральная часть которых состоит из более плотной, четко ограниченной и компактной группы клеток ВКМ, окруженной по периферии более крупными клетками ТБ (рис. 3). Формирование колоний из бластоцист у различных линий мышей происходит в течение 5-7 суток культивирования. В этот период обращает на себя внимание активность клеток ТБ, которые первыми прикрепляются к субстрату, распластываются и образуют монослой в виде подложки для последующего развития центральной группы клеток ВКМ - основного источника для выделения линий ЭСК.

Активность ЭЩФ и транскрипционного фактора плюрипотентносги Nanog обнаруживается только в этой группе клеток, что указывает на их происхождение из клеток ВКМ (рис. 4 б, г). Известно, что клетки экспрессирующие Nanog обладают высоким плюрипотентным потенциалом и эффективно встраиваются в развитие химерного зародыша (Chambers et al., 2003; Mitsui et al., 2003; Guo et al., 2005). Усиление продукции Nanog в трансгенных конструкциях используют как прием для получения генетически стабильных линий ЭСК мыши и человека (Chambers et al., 2003; Mitsui et al., 2003).

В наших исследованиях выявлена неоднородность центральной клеточной массы в первичных колониях по активности факторов плюрипотентности ЭЩФ и Nanog (рис. 4 б, г), что свидетельствует о ранней детерминации клеток ВКМ либо в ЭСК, либо в трофобластные линии стволовых клеток (Nichols et al., 1998; Rossant, 2001). Известно, что на стадии бластоцисты обнаруживается мозаика клеток ВКМ, зависящая как от места их расположения в зародыше, так и экспрессии ряда транскрипционных факторов, одни из которых типичны для плюринотентных клеток эпибласта, другие — для примитивной эндодермы (Chazaud et al., 2006).

ТБ___ ? Ц г 1 1 сутки 1Ьомш ЗП \ ВКМ ч I л • О / щ \Ш 16 . V- 2 сутки 100 мщ. X ТБ ВШ \ 3 сутки 100 мкм

ТБ ВКМ \ / 4 сутки , ЮОмкм пЭК ТБ У 5 сутки , ЮОмкм пЭК i j У -6 сутки 100 мкм

Рис. 3. Динамика изменения морфологии зародышей мыши линии NMRI на стадии бластоцисты в течение 6 суток культивирования in vitro. ВКМ - клетки внутренней клеточной массы, ЗП - зона пеллюциды, ТБ - клетки трофобласта, пЭК - первичные эмбриональные клетки.

9. пЭК / ЭЩФ /

ТБ / юУЭГ т

\ f

а 100 мкм 6 100 мкм

щ-

'тек, ''

•

ЩШ! Н

05> | -*.- - fiiibffb...''

4- ; * - г

Лк

е 100 мкм и » — 100 мкм

Рис. 4. Первичные колонии эмбриональных клеток мыши линии на 7 сутки

культивирования: а, в - морфология колонии, б - активность эндогенной щелочной фосфатазы (ЭЩФ), в - иммуноцитохимический анализ с использованием моноклональных антител к фактору транскрипции Nanog. ТБ - клетки трофобласта, пЭК - первичные эмбриональные клетки.

3. Межлинейные различия в эффективности культивирования бластоцист после МИ.

Подавляющее большинство линий ЭСК мыши выделено из бластоцист мышей 129/Sv или их потомков от скрещивания 129/Sv х 129/Sv-CP (Nagy et al., 1993; Kawase et al., 1994; Suzuki et al., 1997, 1999; Ко et al., 2000; Gao et al., 2003). Причины такой избирательности остаются неизвестными, однако есть сообщения о том, что способность бластоцист мыши продуцировать ЭСК напрямую зависит от генотипа зародыша (Wells et al., 1991; Миталипов, 1994; Baharvand, Matthaei, 2004). Мы сравнили результаты культивирования бластоцист трех линий мышей и обнаружили, что межлинейные различия не затрагивают способности на этой стадии выходить из z. pellucida и прикрепляться к поверхности субстрата, однако дальнейшее развитие до образования первичных колоний ЭК протекает с разной эффективностью в зависимости от генотипа зародыша (рис. 5, А).

Время культивирования, сутки Время культивирования, сутки

Рис. 5. Количество адгезивных бластоцист и колоний ЭК на 2 и 7 сутки культивирования соответственно. ® - 129 линия, I - линия NMRI, □ - линия SHK. А - эффективность образование колоний из интактных бластоцист, Б - после микроинъекции.

На 7 сутки культивирования максимальное количество колоний формируется из бластоцист мышей 129/Sv (80.2±7.9 %), что в 2 раза выше, чем у мышей линий NMR1 и SHK (pcO.Ol). После МИ эти показатели существенно меняются у всех трех линий в сторону увеличения количества адгезивных бластоцист после выхода из z. pellucida и первичных колоний (рис. 5, Б), что однозначно свидетельствует о стимулирующем влиянии процедуры МИ на процессы раннего развития in vitro.

Таким образом, в результате наших исследований установлено, что нарушение целостности блестящей оболочки и плазматических мембран зародыша на стации бластоцисты, а также повреждение небольшого числа клеток (5-7 %) по ходу прокола не оказывают негативного влияния на его последующую судьбу in vitro. МИ стимулирует выход бластоцист

из оболочек и формирование первичных колоний ЭК у всех трех использованных нами линий мышей (рис. 3, рис. 5, Б), что делает их более доступными в качестве продуцентов ЭСК.

4. Влияние цитокина LIF на развитие первичных колоний ЭК.

Участие цитокина LIF в раннем эмбриогенезе впервые продемонстрировано на мутантных по гену lif мышах (Stewart et al., 1992). Этот цитокин играет важную роль в регуляции взаимодействия зародыша на стадии бластоцисты с эндометрием во время имплантации (Stewart et al., 1992; Vogiagis, Salamonsen, 1999; Пенков и др., 2003; Kimber, 2005; Fouladi-Nasbta et al, 2005). Бластоцисты мышей после выхода из г. pellucida и прикрепления к поверхности чашки Петри с последующим формированием сложных по морфологии колоний, состоящих из плюрипотентных и дифференцированных клеток, дублируют процессы имплантации in vitro и служат моделями для изучения функций LIF в этот период развития. Установлено, что цитокин LIF в 2 раза повышает эффективность выхода бластоцист из z. pellucida, повышает количество адгезивных бластоцист, а также стимулирует пролиферативную активность клеток в колониях (табл. 2).

Таблица 2

Количество клеток в бластоцистах мышей линии ММ[II в зависимости от длительности культивирования в среде с цитокином 1Ж

среда МСВ число бластоцист из них адгезивных через 48 ч in vitro, % число клеток в одной бластоцисте в ходе развития

2 сутки 5 суток 7 суток

LIF (10 нг/мл) 111 35.3 139.6±6.3 302.4±32.5* 412.2±56.4**

без LIF (контроль) 241 17.1 138.2±5.8 237.1±13.0* 294.7±18.4"

Примечание. МСВ - модифицированная среда Виггена.

Различия между двумя группами сравнения достоверны: р=0.03; р=0.01.

Согласно нашим данным, положительная динамика увеличения общего числа клеток в колониях, развившихся из бластоцист, происходит в основном за счет Ш-'-активации пролиферативной активности ТБ (рис. 6). В то же время количество клеток ВКМ в присутствии ЬШ остается на относительно высоком и практически постоянном уровне в течение всего периода культивирования (рис. 6), что свидетельствует об избирательности действия этого цитокина на клетки ТБ.

Клетки ТБ

Клетки В КМ

234667 234567

Время культивирования, сутки Время культивирования, сутки

Рис. 6. Динамика увеличения количества клеток трофобласта - (О) и внутренней клеточной массы - (□) при культивировании бластоцист с цитокином ЬШ и без ЫБ - (И). ТБ -клетки трофобласта, ВКМ - клетки внутренней клеточной массы.

Было также показано, что МИ цитокина ЬГБ в полость бластоцисты в концентрациях 0.070.65 пг/нл не приводит к заметному улучшению эффективности культивирования в течение 7 суток до стадии формирования колоний (рис. 7). В диапазоне этих концентраций Ь1Б не стимулирует выход бластоцист из оболочки, адгезию и рост колоний (табл. 3). Достоверных различий между зародышами, в полость которых была инъецирована среда, и зародышами после МИ цитокина 1ЛБ не обнаруживается. В обоих случаях эффективность развития колоний после МИ была выше, чем в контроле без МИ (табл. 3), что подтверждает возможность использования этого метода для получения первичных колоний ЭК из бластоцист различных линий мышей.

Среда Виттена без ИР Среда Виттена с цитокином ИР

Время культивирования, сутки Время культивирования, сутки

Рис. 7. Эффективность развития зародышей мыши in vitro после микроинъекции в полость бластоцисты (О)-^)^, (О)-0.33, (A)-0.15 и (•)—0.07 пг/нл рекомбинантного белка LIF с последующим культивированием в среде Виттена с LIF и без LIF.

Таблица 3

Эффективность развития бластоцист мышей после МИ.

Инъекция число бластоцист Количество развившихся бластоцист, %

2 суток 3 суток 4 суток 5 суток 7 суток

Контроль 82 69.1±12.2 51.5±18.4 47.3±21.3 47.3±21.3 47.3±21.3

МСВ 38 97.6±2.4* 90.1±5.7* 83.0±6.4* 88.7±7* 88.7±7*

MCB+LIF 109 86.5±6.1** 86.5±6.1** 91.3±5.2** 92.5±5.1** 92.5±5.1**

Примечание. В полость каждой бластоцисты вводили по 10 нл модифицированной среды Виттена (МСВ) или МСВ с 0.3 пг/нл цитокина LIF.

* достоверность различий между группой МСВ и контролем (ts = 2, р<0.07), ** то же между группой MCB+LIF и контролем (ts = 2.6, р<0.04), достоверность между группами МСВ и MCB+LIF ((, = 0.1,/»0.6).

Таким образом, нами установлено, что регуляторное действие цитокина LIF на бластоцисты мыши осуществляется опосредованно через среду культивирования, и основными мишенями LIF на этой стадии развития являются клетки ТБ, повышение функциональной активности которых имеет значение для установления тесных межклеточных взаимодействий с эпителием матки во время имплантации. Наши данные позволяют объяснить факт, что после экспозиции бластоцист с цитокином LIF повышается эффективность их трансплантации приемным матерям (Stewart et al., 1992; Stewart, Cullinan, 1997; Vogiagis, Salamonsen, 1999; Mitchell etal., 2002).

5. Получение химерных бластоцист.

Для получения химерных бластоцист были использованы как соматические, так и плюрипотентные ЭСК мыши линии R1, предварительно обработанные флуоресцентным маркером доксорубицином с целью их идентификации и определения места расположения в составе бластоцисты (рис.8, а, б). С помощью конфокальной микроскопии было установлено, что ЭСК после МИ в полость бластоцисты сосредотачиваются в области ТБ и через сутки культивирования встраиваются преимущественно в ТБ (рис. 8, б, рис. 9, А). Аналогичный характер встраивания на начальных этапах развития инъецированных клеток в составе бластоцисты выявлялся при МИ дифференцированных клеток эпителиального типа Cos-1, трансфицированных геном gfp (рис. 9, Б).

0 100 мкм

Рис. 8. Конфокальная микроскопия эмбриональной стволовой клетки мыши (Ш) после 60 мин экспозиции с 1 мкг/мл флуоресцирующего антибиотика доксорубицина (а) и химерного зародыша мыши ММИ на стадии бластоцисты со встроенными в трофобласт флуоресцирующими клетками Ю (б).

А Б

10.4 мкм >" \ ^ Ш • 9 15.6 мкм > * 1 ■ * 3 £ ' Ч . 20.8 мкм 14 4 мкм I ' * 18.4 мкм 20 4 мкм *

36.4 мкм 45.7 мкм • 50.9 мкм • 22.4 мкм 24 4 мкм Ф 26 4 мкм

54.1 мкм • » 58.2 мкм * 61.3 мкм 28 4 мкм ф 30 4 мкм 34 4 мкм Ф

Рис. 9. Оптические срезы химерных бластоцист мыши линии NN1111 с инъецированными в полость клетками линии Ш, предварительно маркированными флуоресцирующим антибиотиком доксорубицином (красная флуоресценция слева, X 514 нм) и клетками линии Соз-1, трансфицированными плазмидным вектором рЕвРР (зеленая флуоресценция справа, X 488 нм).

Однако в этом случае только 1/3 (28.6 %) от общего количества инъецированных эпителиальных клеток оставалась в полости бластоцисты, остальные - выходили в перивителлиновое пространство в течение первых суток культивирования химерных зародышей (рис. 10 в, г). Динамика развития Соз-1 в составе бластоцисты свидетельствует о том, что эти клетки сохраняют жизнеспособность и взаимодействуют с ТБ. После выхода бластоцисты из г. ре11ис1с1а они участвуют в формировании колонии вместе с клетками ТБ (рис. 10 д, е), под влиянием которых значительная их часть (61.5 %) теряет способность экспрессировать плазмидный ген (рис. 10 ж, з).

! * f ■ 1 ^^J*" * * я 100 мкм ■ V W / * * К . . V" ' , « ft t 5» в Eu< 100 мим fl ■ 100 мкм V 100 мкм

• • • % n В

Рис. 10. Распределение трансфицированных клеток линии Cos-1 с экспрессией флуоресцентного белка GFP в бластоцистах мыши: (а, б) - сразу после микроинъекции, (в, г) -через 24 ч, (<Э, е) через 48 ч и (ж, з) - 72 ч культивирования iv vitro.

Снижение флуоресценции белка GFP под влиянием окружения клеток зародыша выявлялось также в ПЭФ с постоянной экспрессией гена gfp (рис. 11 ж, з). Такие клетки с большей эффективностью (91.7 %) встраиваются в ТБ, чем Cos-1, но через 72 ч культивирования на стадии формирования колоний интенсивность их свечения падает (с 57.2 до 18.1 %).

a g' . ?! 100 шм ffv|| Щу в 100 мкм - jj 100 мкм ТГИ 100 мкм

г ш - Ф ш п а

Рис. 11. Распределение первичных эмбриональных фибробластов мыши линии С57В1/6 х C57Bl/6TgN (ACTbEGFP)lOsb в бластоцистах мыши: {а, б) - сразу после микроинъекции, (в, г) - через 24 ч, (d, г) через 48 ч и (ж, з) - 72 ч культивирования iv vitro.

Резкое снижение интенсивности свечения ПЭФ наблюдается только после выхода химерного зародыша из зоны, когда клетки ТБ обладают более высокой функциональной активностью по сравнению с клетками ВКМ, что также подтверждается нашими данными по культивированию интактных бластоцист трансгенных мышей линии С57В1/6 TgN(ACTbEGFP)10sb с постоянной экспрессией гена gfp в эмбриогенезе. Установлено, что

значительная часть таких зародышей (78.1%) в условиях in vitro теряет способность продуцировать флуоресцентный белок GFP на 3-6 сутки культивирования.

Согласно нашим данным, эффективность развития химерных бластоцист мышей линии NMRI после МИ клеток с постоянной (ПЭФ) и временной (Cos-1) экспрессией гена gfp в течение первых суток культивирования выше, чем у интактных зародышей, не подвергавшихся процедуре МИ (рис. 13). Прокол блестящей оболочки и клеточных мембран стимулирует выход зародышей на стадии бластоцист и их последующее развитие в культуре, о чем свидетельствуют результаты успешного культивирования бластоцист после МИ в полость среды Виттена.

1 2 3 4 5 6 7

Время культивирования, сутки

Рис. 13. Эффективность развития бластоцист мышей линии NMRI в условиях пролонгированного культивирования в среде Виттена без цитокина LIF. (■) - интактные бластоцисты (контроль 1) и химерные бластоцисты со встроенными в трофобласт клетками: (□) - Cos-1 и (И) - ПЭФ, экспрессирующими ген gfp; (□) - бластоцисты после МИ в полость среды Виттена (контроль 2).

В наших исследованиях показано, что разные типы дифференцированных клеток (Cos-1 и ПЭФ) с разной долей вероятности встраиваются в ТБ и сохраняют способность продуцировать флуоресцентный белок GFP в течение 3 суток культивирования, что свидетельствует о функциональной активности в составе химерного зародыша. Дифференцированные клетки под влиянием бластоцисты могут приобретать плюрипотентный фенотип, что продемонстрировано в опытах по МИ в бластоцисту нейрональных клеток (Clarke et al, 2000; Kirchhof et al., 2002; Greco et al., 2004). В настоящее время химерные зародыши мышей представляют интерес как экспериментальные моделями для исследования взаимодействий плюрипотентных и дифференцированных клеток в период раннего эмбриогенеза.

выводы

Показано, что после МИ в бластоцисты мышей среды Виттена и витальных красителей зародыши восстанавливают морфологию в течение 3 ч инкубирования in vitro. В результате прокола повреждается не более 4-5 %клеток, расположенных в области проникновения иглы. У поврежденных клеток нарушены барьерные свойства плазматических мембран, что является свидетельством нежизнеспособности. Через сутки культивирования такие клетки смещаются в направлении трофобласта, выходят в перивителлиновое пространство и не влияют на развитие зародыша после МИ.

Установлено, что МИ стимулирует выход бластоцист из zona pellucida и образование сложных по морфологии первичных колоний из клеток ВКМ и ТБ. Выявлена неоднородность клеток ВКМ по активности факторов плюрипотентности ЭЩФ и Nanog на этом этапе развития, что свидетельствует о ранней детерминации ВКМ в плюрипотентные клетки, либо в клетки ТБ.

Выявлены межлинейные различия в эффективности культивирования бластоцист в виде первичных колоний ЭК в зависимости от генотипа зародыша. После МИ различия между зародышами 129/Sv, NMRI и SHK нивелируют, что позволят использовать прием МИ для мышей линии NMRI и SHK с целью получения первичных колоний ЭК - источников ЭСК.

Установлено, что регуляторная способность цитокина LIF, направленная на стимулирование процессов развития in vitro, реализуется на стадии бластоцисты опосредованно через среду культивирования. LIF повышает эффективность выхода бластоцист из г. pellucida и адгезию, стимулирует пролиферативную активность клеток и рост первичных колоний. В этот период основными мишенями LIF являются клетки ТБ. После введения цитокина LIF в полость бластоцисты положительных эффектов не выявляется.

С помощью метода МИ получены химерные бластоцисты мыши и показано, что ЭСК линии R1, также как и соматические клетки ПЭФ и Cos-1 на начальных этапах развития в составе зародыша встраиваются преимущественно в ТБ. Эффективность культивирования химерных бластоцист in vitro зависит от генома инъецированных клеток. Выявлена доминирующая роль клеток ТБ на этапе формирования химерных колоний.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Межевикина JI.M., Серышева В.В., Капралова И.В., Петрова P.P. Влияние цитокина LIF (Leukemia Inhibitory Factor) на развитие доимплантационных зародышей мыши в условиях in vitro. В сб.: Горизонты биофизики. От теории к практике, ОНТИ ПНЦ РАН, 2003, с. 240244.

Межевикина Л.М., Федорова В.В., Капралова ИВ. Повышение выживаемости доимплантационных зародышей мыши in vitro под влиянием лейкемия ингибирующего фактора. Онтогенез, 2006, т. 37, № 1, с. 55-62

Mezhevikina L.M., Fedorova V.V., Kapralova I.V., Fesenko E.E. Increased survival of preimplantation mouse embryos in medium with recombinant cytokine LIF. J. Dev. Biol., 2006, v. 37, № l,p. 47-53.

Mezhevikina L.M., Kapralova I.V., Fesenko E.E. The Stimulating effect of recombinant cytokine LIF on the mouse blastocysts during implantation. Biochemistry (Supp., Series B), 2007, v. 1, №. 2, p. 164-167.

Межевикина Л.М., Капралова И.В., Храмцова E.A., Федюкин B.C. О возможности использования рекомбинантного белка LIF (Leukemia Inhibitory Factor) для повышения выживаемости зародышей млекопитающих в период имплантации в матку. Russian J. Immunology, 2007, v. 9, supp. 4, p. 146-147.

Тезисы конференций:

Капралова И.В., B.B. Серышева, P.P. Петрова, Л.М. Межевикина. Действие цитокина LIF на развитие доимплантационных зародышей мыши in vitro. В сб.: Основы современного развития в аграрной области знания, Институт агроэкологии и биотехнологии УААН, Киев, 2002, с. 67-68.

Серышева В.В., Костенко С.Г., Капралова И.В., Межевикина Л.М., Глазко Т.Т. Цитогенетические изменения эмбриональных стволовых клеток в культуре. В сб.: Основы современного развития в аграрной области знания, Институт агроэкологии и биотехнологии УААН, Киев, 2002, с. 88-89.

Капралова И.В., Петрова P.P., Серышева В В., Межевикина Л.М. Роль цитокина LIF в процессах раннего эмбриогенеза млекопитающих. В сб.: От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям, ГУП Мин. печати и информации, Московской обл., 2002, с. 78.

Петрова P.P., Калошин А.А., Капралова ИВ. Получение продуцента рекомбинантного цитокина LIF. 6-я Пущинская школа-конференция молодых ученых. В сб.: Биология -наука 21 века, ОНТИ ПНЦ РАН, 2002, т. 1, с. 28-29.

Капралова И.В., В В. Серышева, Л.М. Межевикина. Особенности LIF-регуляции при действии на эмбриональные стволовые клетки и доимплантационные зародыши мыши в культуре in vitro. Цитология, 2003. В Санкт-Петербург, тезисы на конференцию 2003 г., Цитология 2003, т. 45, с. 882-883.

Капралова И.В., Межевикина Л.М., Федорова В В., Смолихина Т.И., Фесенко ЕЕ. Первичные культуры эмбриональных стволовых клеток мыши и их морфофункциональные характеристики. В сб.: III съезд биофизиков России. Тезисы докладов. Воронеж, 2004, т. 1, с. 221-222.

Капралова И.В., Межевикина Л.М., Фесенко Е.Е. Выживаемость зародышей мыши на стадии бластоцисты in vitro после микроинъекции. 9-я Международная Пущинская школа-

• Капралова И.В., Межевикина Л.М. Функциональное значение трофобласта для получения колоний плюрипотентных эмбриональных клеток из бластоцист мыши. Цитология, 2006, т.48, № 9, с. 766-767.

• Храмцова Е.А., Капралова И.В., Межевикина Л.М. Морфологические изменения и выживаемость бластоцист мыши ш vitro после микроинъекций. Цитология, 2007, т. 49, № 9, с. 804.

• Шевченко A.B., Капралова И.В., Петрова P.P., Межевикина Л.М. Морфология и функциональные свойства бластоцист мыши после микроинъекции трансфицированных клеток линии Cos-1 с экспрессией гена gfp. В сб.: Биосисте.мы: организация, поведение, управление. ИНГУ, 2008, с. 39-40.

Подписано в печать:

19.01.2009

Заказ № 1457 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Капралова, Ирина Владимировна

Список сокращений.

Введение.

ГЛАВАI 9 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Методы микроинъекции (МИ).

1. 2. Выживаемость зародышей животных и человека после МИ.

1.3. Ранний эмбриогенез мыши, стадия бластоцисты.

1. 4. Ростовые факторы и цитокины в раннем развитии зародышей.

1.5. Роль цитокина LIF в эмбриогенезе и имплантации.

1. 6. Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) мыши.

1. 7. Методы получения ЭСК.

1. 8. Химерные зародыши и животные.

ГЛАВА II

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ.

2. 1. Биологический материал.

2. 2. Ранние зародыши мыши.

2.2.1. Выделение зародышей на стадии бластоцисты.

2.2.2. Культивирование бластоцист in vitro.

2.2.3. Выявление биологических эффектов цитокина LIF на стадии бластоцисты.

2. 3. Клеточные культуры.

2.3.1. Выделение первичных эмбриональных фибробластов (ПЭФ) мыши.

2.3.2. Культивирование клеток ПЭФ.

2.3.3. Приготовление митомицинового фидера ПЭФ.

2.3.4. Культивирование ЭСК мыши.

2.3.5. Культивирование и трансфекция клеток линии Cos-1.

2. 4. Микроинъекция (МИ).

2.4.1. Оборудования для проведения МИ.

2.4.1. МИ в бластоцисты растворов и целых клеток.

2. 5. Оценка жизнеспособности бластоцист мыши в условиях культуры in vitro.

2.5.1. Цитохимический тест на выявление эндогенной щелочной фосфатазы (ЭЩФ).

2.5.2. Иммуноцитохимическое определение фактора транскрипции плюрипотентных клеток - Nanog.

2. 6. Криоконсервация клеточных культур.

2.6.1. Замораживание и хранение ЭСК,

ПЭФ и Cos-1 в жидком азоте.

2.6.2. Режимы замораживания и размораживания клеточных культур.

2. 7. Состав сред и растворов, используемых для культивирования клеток и ранних зародышей.

2.7.1. Модифицированная среда Виттена (МСВ).

2.7.2. Фосфатно-солевой буфер PBS.

2.7.3. Раствор Версен-ЭДТА.

2.7.4. Трипсин-ЭДТА.

2. 8. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА III

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. МИ в полость бластоцисты среды Виттена и витальных красителей.

3.1.1. Морфофункциональные особенности бластоцист после МИ.

3.1.2. Развитие зародышей мыши со стадии бластоцисты in vitro.

3.1.3. Межлинейные различия в эффективности культивирования бластоцист после МИ.

3.1.4. Влияние цитохалазина Б на эффективность культивирования мышиных бластоцист.

3.1.5. Повышение эффективности культивирования бластоцист мышей в среде с цитокином LIF.

3.1.6. МИ цитокина LIF в полость бластоцисты.

3. 2. Получение химерных бластоцист мыши.

3.2.1. Распределение эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) в полости бластоцисты после МИ.

3.2.2. МИ в полость бластоцисты трансфицированных клеток линии Cos-1.

3.2.3. Оценка флуоресценции зеленого белка GFP в первичных эмбриональных фибробластах (ПЭФ) мыши после МИ в бластоцисту.

3.2.4. Эффективность развития химерных бластоцист мыши в культуре.

ГЛАВА IV 97 ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние микроинъекции на выживаемость зародышей мыши и получение первичных колоний эмбриональных клеток"

Проблема терапевтического и репродуктивного клонирования стала одной из самых популярных проблем современной клеточной биологии и медицины (Kuhholzer, Prather, 2000; Solter, 2000; Kawase et al., 2000; Wolf ef al., 2001; Illmensee, 2002; Wakayama et al., 2005; Hochedlinger, Jaenisch, 2003, 2006). Одним из подходов для ее решения является микроинъекция (МИ) в ооциты или ранние зародыши чужеродных ядер, ДНК и эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), которые обладают уникальной способностью встраиваться в развитие зародыша и передавать свои признаки по наследству (Bradley et al., 1984; Robertson, 1986; Perry et al., 1999; Baguishi et al., 1999; Nagy et al., 1987; Nagy, Rossant, 2001; Nagy et al., 2003).

В последние годы методы МИ нашли практическое применение в работах по лечению бесплодия человека с помощью экстракорпорального оплодотворения - ЭКО, когда отдельный сперматозоид водится в цитоплазму ооцита (Галат, 2000; Lundin et al., 2001; Yoshida, 2007; Jones et al., 2008). Другая область применения МИ связана с решением проблем клонирования ЭСК животных и человека с генетически измененными свойствами (Wakayama et al., 2001; Hochedlinger, Jaenisch, 2003, Hwang et al, 2005; Hochedlinger, Jaenisch, 2006). После замены ядра ооцита на ядро таких клеток получают зародыши, генетический материал которых соответствует геному донора.

Подавляющее большинство исследований с применением техники МИ выполнено на экспериментальных моделях, в качестве которых использовали лабораторных мышей. Из этих работ следует, что выживаемость мышиных ооцитов после замены ядер не превышает 1-2 % из-за низкой способности соматических и эмбриональных ядер к репрограмированию в цитоплазме зрелого ооцита (Illmensee, Норре, 1981; Wilmut et al., 1997; McLaren, 2000; Hochedlinger, Jaenisch, 2003; Hwang et al., 2004). По данным литературы более высокий процент выживаемости реконструированных зародышей достигается при инъекции ЭСК в полость бластоцисты, как источника чужеродного генетического материала (Bradley et al., 1984; Robertson, 1986; Nagy et al., 1987;

Nagy, Rossant, 2001; Rossant, 2001; Nagy et al., 2003). В этом случае из реконструированных бластоцист можно получить более 20 % генеративных химерных животных. Этот метод находит применение в различных трансгенных и ген-таргетированных технологиях с использованием в качестве векторных систем ЭСК.

В современной литературе господствуют представления о том, что способность инъецированных клеток встраиваться в развитие зародыша и его гаметогенез зависит от плюрипотентных свойств ЭСК (Robertson, 1986; Robertson et al, 1987; Bradley et al., 1992; Brown et al., 1992; Papaioannou, 1993; Yagi, 1993; Ueda et al., 1995; Longo et al., 1997; Rossant, Spence, 1998; Prelle et al, 1999; Rossant, 2001). При этом остаются в стороне и не рассматриваются вопросы влияния самой процедуры МИ на последующее развитие и выживаемость химерных зародышей и их способность продуцировать первичные колонии эмбриональных клеток в условиях in vitro.

Кроме того, недостаточно внимания уделяется вопросам влияния генома зародыша на свойства и межклеточные взаимодействия ЭСК на начальных этапах развития в составе бластоцисты, а также факторам, индуцирующим эти процессы in vitro. Плюрипотентные ЭСК мыши с одинаковой вероятностью включаются как в экстраэмбриональные ткани, так и в ткани самого зародыша. Выбор направления развития инъецированных клеток во многом носит случайный характер, и причины выбора остаются неизвестными. В связи с этим нам представлялось весьма интересным изучить характер распределения инъецированных клеток в составе бластоцисты и выяснить регуляторные возможности самих зародышей, оценить их способность к восстановлению морфологии и жизнеспособности после повреждений, вызванных МИ. Результаты таких исследований могут представлять большой интерес в медицинской практике.

Основной целью настоящей работы было получение с помощью метода МИ химерных бластоцист мыши и выявление характера распределения инъецированных эмбриональных и соматических клеток в химерном зародыше на начальных этапах его развития. Решали следующие задачи:

• Оценка жизнеспособности бластоцист различных линий мышей in vitro после МИ в полость растворов витальных красителей, среды культивирования, эмбриональных и соматических клеток.

• Исследование межлинейных различий в реакции бластоцист на МИ. Оценка характера повреждений бластоцист.

• Разработка методических приемов для повышения эффективности культивирования мышиных бластоцист in vitro.

• Оценка влияния цитокина LIF на развитие бластоцист в зависимости от способа его действия: опосредованно через среду культивирования или путем введения в полость бластоцисты.

• Подбор генетических маркеров и флуоресцентных красителей для идентификации инъецированных соматических и эмбриональных клеток в составе бластоцисты. Оценка характера их встраивания в бластоцисту.

• Получение химерных бластоцист и выявление различий в эффективности их культивирования в зависимости от генома инъецированных клеток.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Капралова, Ирина Владимировна

ГЛАВА IV ВЫВОДЫ

1. Показано, что после МИ в бластоцисты мышей среды Виттена и витальных красителей зародыши восстанавливают морфологию в течение 3 ч инкубирования in vitro. В результате прокола повреждается не более 4-5 %клеток, расположенных в области проникновения иглы. У поврежденных клеток нарушены барьерные свойства плазматических мембран, что является свидетельством нежизнеспособности. Через сутки культивирования такие клетки смещаются в направлении трофобласта, выходят в перивителлиновое пространство и не влияют на развитие зародыша после МИ.

2. Установлено, что МИ стимулирует выход бластоцист из zona pellucida и образование сложных по морфологии первичных колоний из клеток ВКМ и ТБ. Выявлена неоднородность клеток ВКМ по активности факторов плюрипотентности ЭЩФ и Nanog на этом этапе развития, что свидетельствует о ранней детерминации ВКМ в плюрипотентные клетки, либо в клетки ТБ.

3. Выявлены межлинейные различия в эффективности культивирования бластоцист в виде первичных колоний ЭК в зависимости от генотипа зародыша. После МИ различия между зародышами 129/Sv, NMRI и SHK нивелируют, что позволят использовать прием МИ для мышей линии NMRI и SHK с целью получения первичных колоний ЭК - источников ЭСК.

4. Установлено, что регуляторная способность цитокина LIF, направленная на стимулирование процессов развития in vitro, реализуется на стадии бластоцисты опосредованно через среду культивирования. LIF повышает эффективность выхода бластоцист из z. pellucida и адгезию, стимулирует пролиферативную активность клеток и рост первичных колоний. В этот период основными мишенями LIF являются клетки ТБ. После введения цитокина LIF в полость бластоцисты положительных эффектов не выявляется.

5. С помощью метода МИ получены химерные бластоцисты мыши и показано, что ЭСК линии R1, также как и соматические клетки ПЭФ и Cos-1 на начальных этапах развития в составе зародыша встраиваются преимущественно в ТБ. Эффективность культивирования химерных бластоцист in vitro зависит от генома инъецированных клеток. Выявлена доминирующая роль клеток ТБ на этапе формирования химерных колоний.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Капралова, Ирина Владимировна, Пущино

1. Березовская О.П., Межевикина Л.М., Вепринцев Б.Н. Метод культивирования ранних эмбрионов линейных мышей. // Онтогенез, 1986, т. 17, №5, с. 553-55.

2. Боголюбова И.О., Парфенов В.Н. Динамика организации ядра двухклеточных эмбрионов мышей; распределение факторов сплайсинга пре-мРНК и некоторых ядерных белков. // Цитология, 2000, № 1, с. 268

3. Галат В.В. Методы микроинъекции спермиев как инструмент вспомогательной репродукции и изучения биологии оплодотворения. Онтогенез, 2000, т. 31, №1, с. 5-13.

4. Гилберт С. // Биология развития, т. 1, Москва, Мир, 1993.

5. Глазко Т.Т., Межевикина JI.M., Бойко А.А., Фесенко Е.Е. Цепная кариотипическая эволюция эмбриональных стволовых клеток линии R1 in vitro. //Цитология, 2005, т. 47, № 12, с. 679-685.

6. Гланц С. Медико-биологическая статистика. // Москва, Практика, 1998, 464 с.

7. Гольдштейн Д.В.,. Погорелова В.Н, Погорелов А.Г. Изменение цитоплазматического Na+/K+ баланса у двухклеточного эмбриона мыши под действием цитохалазина Б. // Цитология, 2007, п. 49, № 8, с. 680-84.

8. Дыбан А.П. Раннее развитие млекопитающих.// Ленинград, Наука, 1988, 228 с.

9. Дыбан А.П., Секирина Г.Г. Изучение доимплантационного развития однояйцовых близнецов: опыты на зародышах мышей. // Онтогенез, 1981, т. 12, № 2, с. 130-39.

10. Евсиков А.В., Соломко А.П. Уровни и характер транскрипции у доимплантационных зародышей мыши с подавленным цитокинезом. // Онтогенез, 1999, т. 30, № 2, с. 103-109.

11. Капралова И.В., Межевикина JI.M. Функциональное значение трофобласта для получения колоний плюрипотентных эмбриональных клеток из бластоцист мыши. // Цитология, 2006, т. 48, № 9, с. 766-67.

12. Капралова И.В., Серышева В.В., Межевикина JI.M. Особенности LIF— регуляции при действии на эмбриональные стволовые клетки и доимплантационные зародыши мыши в культуре in vitro. И Цитология, 2003, т. 45, №9, с. 882-83.

13. Лойд 3., Госсрау 3., Шиблер Т. Гистохимия ферментов. Лабораторные методы. // Москва, Мир, 1982, с. 64-67.

14. Максимовский Л.Ф., Микичур Н.И. Методы микроманипуляции и ультрамикроанализа в биологии и медицине. // Новосибирск, Наука, Сиб. отд., 1989, 239 с.

15. Манк М. Биология развития млекопитающих. Методы. // Москва, Мир, 1990, 406 с.

16. Межевикина Л.М., Федорова В.В., Капралова И.В., Фесенко Е.Е Повышение выживаемости доимплантационных зародышей мыши в среде с рекомбинантным цитокином LIF. // Онтогенез, 2006 а, том 37, № 1, с. 55— 62.

17. Межевикина Л.М., Капралова И.В., Фесенко Е.Е. Стимулирующее действие рекомбинантного цитокина LIF на бластоцисты мыши в период имплантации. Биомедицинская химия, 2006 б, том 52, № 1 (6), с. 620-26.

18. Миталипов Ш.М., Миталипова М.М., Иванов В.И. Влияние длительности культивирования на плюрипотентность эмбриональных стволовых (ES) клеток мыши in vitro и in vivo. II Онтогенез, 1994, т. 25, № 6, с. 19-27.

19. Никитин В.А. Микроинъекция. Введение веществ и органелл в клетку. // Пущино, ОНТИ ПНЦ РАН, 2002.

20. Пенков Л.И., Платонов Е.С., Кондрахина М.С., Конюхов Б.В. Фактор ингибирования лейкемии (LIF) улучшает и пролонгирует развитие партеногенетических зародышей мыши. // Онтогенез, 2003, т. 34, № 4, с. 301-305.

21. Попов Л.С., Языков А.А. Трансгенные животные как модели изучения репродукции, эмбрионального развития и заболевания человека. // Успехи современной биологии, 1999, т. 119, № 1, с. 30-41.

22. Попов Л.С., Языков А.А. Трансгенные животные как модели опухолевых заболеваний человека. // Успехи современной биологии, 2000, т. 120, № 4, с. 329-39.

23. Репин B.C. Критические факторы химической регуляции развития. // Москва, Медицина, 1980.

24. Савченкова И.П., Фляйшманн З.М., Булла И., Брем Г. Использование плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток мыши для получения химерных животных. // Цитология, 1996, т. 38, № 10, с. 1118-23.

25. Adamson E.D. Activities of growth factors in preimplantation embryos. // J. Cell. Biochem., 1993, v. 53, p. 280-87.

26. Bhatnagar P., Pappaioannou V.E., Biggers J.D. CSF-1 and mouse preimplantation development in vitro. II Development, 1995, v. 121, p. 1333-39.

27. Bhatt H., Brunet L.J., Stewart C.L. Uterine expression of leukemia inhibitory factor coincides with the onset of blastocyst implantation. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991, v. 88, n. 24, p. 11408-12.

28. Bradley A. Production and analysis of chimeric mice. // Teratocarcinoma and embryonic stem cells: a practical approach / Ad. Robertson E.J., 1987, Oxford, Washington, DS: IRL Press, p. 113-52.

29. Bradley A., Hasty P., Davis A., Ramirez-Solis R. Modifying the mouse: design and desire. //BioTechnology, 1992, v. 10, p. 534-39.

30. Brandon E.P., Idzerda R.L., McKnight G.S. Targeting the mouse genome: a compendium of knoc-knouts. // Curr. Biol., 1995, v. 5, p. 625-34.

31. Brison D.R., Schultz R.M. Apoptosis during mouse blastocyst formation: evidence for a role for survival factors including transforming growth factor alpha. // Biol. Reprod., 1997, v. 56, n. 5, p. 1088-96.

32. Brook F.A., Gardner R.L. The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, v. 94, p. 5709-12.

33. Brown D.G., Willington M.A., Findlay I., Muggleton-Harris A.L. Criteria, that optimize the potential of murine embryonic stem cells for in vitro and in vivo developmental studies. // In vitro Cell Dev. Biol., 1992, v. 28, p. 773-78.

34. Burruel V.R., Yanagimachi R., Whitten W.K. Normal mice develop from oocytes injected with spermatozoa with grossly misshapen heads. // Biol. Reprod., 1996, v. 55, n. 3, p. 709-14.

35. Carson D.D., Bagchi I., Dey S.K., Enders A.C., Fazleabas A.T., Lessey B.A., Yoshinaga K. Embryo implantation. // Dev. Biol., 2000, v. 223, p. 217-37.

36. Chambers I., Colby D., Robertson M., Nichols J., Lee S., Tweedie S., Smith A. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. // Cell, 2003, v. 113, p. 643-55.

37. Chang I.K., Jeong D.K., Hong Y.H., Park T.S., Moon Y.K., Ohno Т., Han J.Y. Production of germline chimeric chickens by transfer of cultured primordial germ cells. // Cell Biol. Int., 1997, v. 21, p. 495-99.

38. Chazaud С., Ymanaka Y., Rossant T. Early lineage segregation between epiblast and primitive endoderm in muse blastocyst through the Crb2-MAPK pathway. // Dev. Cell, 2006, v. 10, n. 5, p. 615-24.

39. Chung Y., Klimanskaya I., Becker S., Marh J., Lu S.-J., Johnos J, Meisner L., Lanza R. Embryonic and extraembryonic stem cell lines derived from single mouse blastomeres. //Nature, 2006, v. 439, p. 216-19.

40. Clarke D.L., Johansson C.B., Wilbertz J., Veress В., Nilsson E., Karlstrom H., Lendahl U., Frisen J. Generalized potential of adult neural stem cells. // Science, 2000, v. 288, p. 16060-63.

41. Cohen P.E., Pollard J.W. Cytokines and growth factors in reproduction. // In: Reproductive Immunology / Ads. Bronson R.A., Alexander N.J., Anderson D., Branch D.W., Kutteh W.H, Oxford, Blackwell Science, 1996, p. 52-104.

42. Cross J.C., Werb Z., Fisher S.J. Implantation and the placenta: Key pieces of the developmental puzzle. // Science, 1994, v. 266, p. 1508-18.

43. Cummins J.M. Controversies in science; ICSI may foster birth defects. // J. NIH Res., 1997, v. 9, p. 36-40.

44. Davidson E.H. Haw embryos work: a comparative view of diverse models of cell fate specification. //Development, 1990, v. 108, p. 365-89.

45. Delhaise F., Bralion V., Schuurbiers, Dessy F. Establishment of an embryonic stem cell line from 8-cell stage mouse embryos. // Eur. J. Morph., 1996, v. 34, n. 4, p. 237-43.

46. DeVos A. Intracytoplasmic sperm injection (ICSI). // Hum. Reprod., 2000, v. 15, n. 4, p. 59-64.

47. Dieddrich K., Fauser B.C.J.M., Devroey P., Griesinger G. The role of the endometrium and embryo in human implantation. // Hum. Reprod., 2007, v. 4, p. 1-13.

48. Dimitriadis E., White C.A., Jones R.L., Salamonsen L.A. Cytokines, chemokines and growth factors in endometrium related to implantation. // Hum. Reprod. Update, 2005, v. 11, n. 6, p. 613-30.

49. Doetchmann T. Gene transfer in embryonic stem cells. // Trans. Anim. technol., 1994, p. 115-46.

50. Doetschmann Т., Eistetter H., Katz M., Schmidt W., Kemler R. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: Formation of visceral yolk sac, blood, islands and myocardium. // J. Embryol. Exp. Morphol., 1985, v. 87, p. 27-45.

51. Escary J.L., Perreau J., Dumenil D., Ezine S., Brulet P. Leukemia inhibitory factor is necessary for maintenance of haematopoietic stem cells and thymocyte stimulation. //Nature, 1993, v. 363, n. 6427, p. 361-64.

52. Evans M.J., Kaufman M.H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. //Nature, 1981, v. 292, p. 154-58.

53. Evans M.J., Kaufman M.H. Pluripotential cells grown directly from normal mouse embryos. // Cancer Surveys, 1983, v. 2, n. 1, p. 185-207.

54. Evsikov S.V., Morozova L.M., Solomko A.P. The role of the nucleocytoplasmic ratio in development regulation of the early mouse embryo. // Development, 1990, v. 109, n. 2, p. 323-28.

55. Fedorov L.M., Haegel-Kronenberger H., Hirchenhain J. A comparison of the germline potential of differently aged ES cell lines and their transfected descendans. //Trans. Res., 1997, v. 6, p.223-31.

56. Fischbach G.D., Fischbach R.L. Stem cells: science, policy, and ethics. // J. Clin. Invest. 2004. v. 114. n. 10. p. 1364-70.

57. Fouladin—Nashta A.A., Andreu C.V., Nijjar N., Heath J.K., Kimber S.J. Role of leukemia inhibitory factor (LIF) in decasualization of murine stromal cells. // J. Endocrinology, 2004, v. 181, p. 477-92.

58. Fry R.C. The effect of Leukemia inhibitory factor (LIF) on embryogenesis. // Reprod. Fertil. Dev., 1992, v. 4, n. 4, p. 449-58.

59. Fujii J.T., Martin G.R. Incorporation of teratocarcinoma stem cells into the blastocyst by aggregation with cleavage stage mouse embryos. // Dev. Biol., 1980, v. 74, p. 239-44.

60. Hambartsoumian E. Endometrial leukemia inhibitory factor (LIF) as a possible cause of unexplained infertility and multiple failures of implantation. // Am. J. Reprod. Immunol., 1998, v. 39, n. 2, p. 137-43.

61. Hanaoka K., Kato Y., Noguchi T. Comparative study of the ability of various teratocarcinomas to form chimeric mouse embryos. // Dev. Growth Differ., 1986, v. 28, n. 3, p. 223-31.

62. Hewitson L., Takahashi D., Dominko Т., Simerly C., Schatten G. Fertilization and embryo development to blastocysts after intracytoplasmic sperm injection in the rhesus monkey. // Human Reprod., 1998, v. 13, n. 12, p. 3449-55.

63. Hochedlinger K., Jaenisch R. Monoclonal mice generated by nuclear transfer from mature В and T donor cells. //Nature, 2002, v. 415, p. 1035-38.

64. Hochedlinger K., Jaenisch R. Nuclear transplantation, embryonic stem cells, and the potential for cell therapy. // N. Engl. J. Medicine, 2003, v. 349, p. 275-86.

65. Hochedlinger K., Jaenisch R. Nuclear reprogramming and pluripotency. // Nature, 2006, v. 441, p. 1061-67.

66. Hogan B.L., Blessing M., Winnier G.E., Suzuki N., Jones C.M. Growth factors in development: the role of TGF-beta related polypeptide signaling molecules in embryogenesis. // Development, 1994, Suppl., p. 53-60.

67. Hsu L.W., Heath J.K. Identification of two elements involved in regulating expression of murine leukemia inhibitory factor gene. // Biochem. J., 1994, v. 302, p. 103-10.

68. Ни X., Shang K. Establishment and characterization of Six ES cell lines from mouse 129/ter strain. // Acta Scient. Nat., 1996, v. 32, n. 2, 248-53.

69. Gardner R.L. Clonally analysis of growth of the polar trophectoderm in the mouse. // Hum. Reprod., 1996, v. 11, n. 9, p. 1979-84.

70. Gardner R.L. Contribution of blastocyst micromanipulation to the study of mammalian development. // BioEssays, 1998, v. 20, p. 168-80.

71. Gardner R.L. The relationship between cell lineage and differentiation in the early mouse embryo. // Genetic mosaics and cell differentiation. / Ed. W.J. Gehring. Berlin, 1978, p. 205^12.

72. Gearing D.P., Gough N.M., King J.A., Hilton D.J., Nikola N.A., Simpson R.J., Nice E.C., Kelso A., Metcalf D. Molecular cloning and expression of cDNA encoding a murine myeloid leukemia inhibitory factor (LIF). // EMBO J., 1987, v. 6, p. 3995-4002.

73. Geiger H., Sick S., Bonifer C., Muller A.M. Globin gene expression is reprogrammed in chimeras generated by injecting adult hematopoietic stem cells into mouse blastocysts. // Cell, 1998, v. 93, p. 1055-65.

74. Giles J.L., Yang X., et al. Production of chimeric rabbit fetuses using cultured rabbit ICM cells. // Biol. Reprod., 1992, v. 46, n. 51, p. 161-64.

75. Gossler A., Doetschman Т., Korn R., Serfling E., Kemler R. Transgenesis by mean of blastocyst—derived embiyonic stem cell line. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, v. 83, n. 23, p. 9065-69.

76. Greco В., Low H.P., Johnson E.C., Salmosen R.A., Gallant J., Jones S., Ross A.H., Recht L.D. Differentiation prevents assessment of neural stem cell pluripotency after blastocyst injection. // Stem cells, 2004, v. 22, p. 600-608.

77. Guo J., Jauch A., Holtgreve-Grez H., Schoell В., Erz D., Schrank M., Janssen J.W.G. Multicolor karyotipe analyses of mouse embryonic stem cells. // In vitro Cell. Dev. Biol. Animal., 2005, v. 41, p. 278-83.

78. Johnson M.H., McConnell G., Van Blerkom J. Reprogrammed development in the mouse embryo. //j. Embryol. Exp. Morphol., 1984, v. 83, Suppl., p. 197— 231.

79. Keltz M.D., Attar E., Buradagunta S., Olive D.L., Kliman H.J., Arici A. Modulation of leukemia inhibitory factor gene expression and protein biosynthesis in the human fallopian tube. // Am. J. Obstet. Gynecol., 1996, v. 175, n. 6, p. 1611-19.

80. Martin G.R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. // Proc.Natl. Acad.Sci. USA, 1981, v. 78, p. 7634-38.

81. McLaren A. Mammalian chimaeras. // Cambridge, 1976, 180 p.

82. McLaren A. Sex determination in mammals. // Trends Genet., 1988, v. 4. p. 153-57.

83. McLaren A. The decade of the sheep. How a discredited technique led to the potential for creating new species. // Nature, 2000, v. 403, p. 479-80.

84. McMahon A.P., Bradley A. The Wnt- (int-1) protooncogene is required for development of a large region of the mouse brain. // Cell, 1990, v. 62, p. 107385.

85. Melton D.W. Gene targeting in the mouse. //Bioessays, 1994, v. 16, n. 9, p. 63338.

86. Menasche P. Embryonic stem cells pace the heart. // Nat. Biotech., 2004, v. 22, n. 10, p. 1237-38.

87. Mintz B. Gene control of mammalian differentiation. // Ann. Rev. Genet., 1974, v. 8, p. 411-70.

88. Munsie M.J., Michalska A.E., O'Brien C.M., Trounson A.O., Pera M.F., Mountford P.S. Isolation of pluripotent embryonic stem cells from reprogrammed adult mouse somatic cell nuclei. // Curr. Biol., 2000, v. 10, p. 989-92.

89. Nachtigall M.J., Kliman H.J., Feinberg R.F., Olive D.L., Engin O., Arici A. The effect of leukemia inhibitory factor (LIF) on trophoblast differentiation: a potential role in human implantation. // J. Clin. Endocr. Metab., 1996, v. 81, n. 2, p. 801-6.

90. Nagy A., Paldi A., Dezso L., Varga L., Magyar A. Prenatal fate of parthenogenetic cells in mouse aggregation chimaeras. // Development, 1987, v. 101, p. 67-71.

91. Nagy A., Rossant J. Chimaeras and mosaics for dissecting complex mutant phenotypes. //Int. J. Dev. Biol., 2001, v. 45, p. 577-82.

92. Nagy A., Rossant J., Nagy R., Abramow-Newerly W., Roder J.C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, v. 90, p. 8424-28.

93. Nagy A., Gertsenstein M., Vintersten K., Behringer R. Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. //Third edition. CSHL Press U.S., 2003.

94. Nagy A., Gocza E., Diaz E.M., Prideaux V.R., Ivanyi E., Markkula M., Rossant J. Embryonic stem cells alone are able to support fetal development in the mouse. //Development, 1990, v. 110, p. 815-22.

95. Nichols J., Evans E.P. Smith A.G. Establishment of germ-line-competent embryonic stem (ES) cell using differentiation inhibiting activity. // Development, 1990, v. 110, n. 4, p. 1341-48.

96. Nichols J., Zevnik В., Anastassiadis K., Niwa H., Klewe-Nebenius D., Chambers I., Scholer H., Smith A. Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4. // Cell, 1998, v. 95, n. 30, p. 379-91.

97. Nijs M., Vanderzwalmen P., Vandamme В., Segal-Bertin G., Lejeune В., Segal L., van Roosendaal E., Schoysman R. Fertilizing ability of immotilespermatozoa after intracytoplasmic sperm injection. // Hum. Reprod., 1996, v. 11, n. 10, p. 2180-85.

98. Niwa H., Miyazaki J., Smith A.G. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. // Nat. Genet., 2000, v. 24, n. 4, p. 372-76.

99. Oback В., Wells D.N. Cloning cattle. // Cloning Stem Cells, 2003, v. 5, n. 4, p. 243-56.

100. Piedrahita J.A., Anderson G.B., Bon Durant R.H. On the isolation of embryonic stem cells: comparative behavior of murine, porcine and ovine embryos. // Theriogenology, 1990, v. 34, n. 5, p. 879-902.

101. Plachot M. Genetic risks associated with intracytoplasmic sperm injection. // Contracept. Fertil. Sex., 1996, v. 24, n. 7-8, p. 577-80.

102. Plachot M. The blastocyst. // Hum. Reprod., 2000, v. 15, suppl. 4, p. 49-58.

103. Pogorelov A.G., Goldshtein D.V., Pogorelova V.N. Effects of cytotoxins on intracellular Na/K balance in mouse embryonic cell. // Bull. Exp. Biol. Med., 2008, v. 145, n. 4, p. 531-34.

104. Prelle K., Vassiliev I.M., Vassilieva S.G., Wolf E., Wobus A.M. Establishment of pluripotent cell lines from vertebrate species — present status and future prospects. // Cells Tissues Organs, 1999, v. 165, n. 3-4, p. 220-36.

105. Ramirez-Solis R., Davis A.C., Bradley A. Gene targeting in embryonic stem cells. // Methods Enzymol., 1993, v. 225, p. 855-78.

106. Rappolee D.A., Sturm K.S., Behrendtsen O., Schultz G.A., Pedersen R.A., Werb Z. Insulin-like growth factor II acts through an endogenous growth pathway regulated by imprinting in early mouse embryos. // Genes Dev., 1992, v. 6, n. 6, p. 939-52.

107. Rappolee D.A., Sturm K.S., Schultz G.A., Pedersen R.A., Werb Z. Early embryo development and paracrine relationships. // Eds. Heyner S., Wiley L., Liss A.R, NY, 1990, p. 11-25.

108. Rappolee D.A., Werb Z. The role of growth factors in the mammalian pregastrulation development. // Advances in Developmental Biology / Ed. P.M. Wassarman, Greenwich, JAI Press, 1994, v. 3, p. 41—71.

109. Reya Т., Morrison S.R., Clarke M.F., Weissman I.L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. //Nature, 2001, v. 414, p. 105-11.

110. Reubinoff B.E., Pera M.F., Fong C.-Y., Trounson A., Bongso A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. II Nat. Biotech., 2000, v. 18, p. 399-404.

111. Roberts R.M., Ealy A.D., Alexenko A.P., Han C.S., Ezashi T. Trophoblast interferons. // Placenta, 1999, v. 20, n. 4, p. 259-64.

112. Robertson E.J. Pluripotent stem cell lines as a route into the mouse germ line. // Trends Genet., 1986, v.2, p. 9-13.

113. Robertson E.J. Teratocarcinoma and Embryo-Derived Stem Cells: A Practical Approach. // IRL Press, Oxford, 1987, p. 71-112.

114. Robertson J.A. Human embryonic stem cell research: ethical and legal issues. // Nat. Rev. Genet. 2001, v. 2, n. 1, p. 74-8.

115. Rosenberger R.F. The initiation of senescence and its relationship to embryonic cell differentiation. // Bioassays, 1995, v. 17, n. 3, p. 257-60.

116. Rossant J. Immortal germ cells? // Curr. Biol., 1993, v. 3, n. 1, p. 47-9.

117. Rossant J. Stem cells from the mammalian blastocyst. // Stem cells, 2001, v. 19, p. 477-82.

118. Rossant J., Spence A. Chimeras and mosaic in mouse mutant analysis. // Trends Genet., 1998, v. 14, n. 9, p. 358-63.

119. Salamonsen L.A., Young R.J., Garcia S., Findlay J.K. Mitogenic actions of endothelia and other growth factors in ovine endometrium. // J. Endocrinology, 1997, v. 152, p. 283-90.

120. Sawai K., Matsuzaki N., Okada Т., Shimoya K., Koyama M., Azuma C., Saji F., Murata Y. Human decidual cell biosynthesis of leukemia inhibitory factor: regulation by decidual cytokines and steroid hormones. // Biol. Reprod., 1997, v. 56, n. 5, p. 1274-80.

121. Smith A.G., Heath J.K., Donaldson D.D, Wong G.G., Moreau J., Stahl M., Rogers D. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. //Nature, 1988, v. 336, p. 688-90.

122. Smith A., Metcalf D., Nicola N.A. Differentiation inhibiting activity (DIA/LIF) and mouse development. // EMBO J, 1997, v. 16, p. 451-64.

123. Snow M.H. Gastrulation in the mouse: growth and regionalization of the epiblast. // J. Embryol. Exp. Morphol., 1977, v. 42, p. 293-303.

124. Snow M.H. Autonomous development of parts isolated from primitive-streak-stage mouse embryos. Is development clonal? // J. Embryol. Exp. Morphol., 1981, v. 65, p. 269-87.

125. Snow M.H.L. Aitken J., Anselt J.D. Role of the inner ell mass in controlling implantation in the mouse. // J. Reprod. Fertil., 1976, v. 48, p. 403-4.

126. Solter D. Mammalian cloning: advances and limitations. // Nature, 2000, v. 1, p. 199-207.

127. Soriano P. Abnormal kidney development and hematological disorders in PDGF beta-receptor mutant mice. // Genes Dev., 1994, v. 8, p. 1888-96.

128. Soriano P., Montgomery C., Geske R., Bradley A. Targeted disruption of the c-src proto-oncogene leads to osteopetrosis in mice. // Cell, 1991, v. 4, p. 693702.

129. Stewart C.L. Leukemia inhibitory factor and the regulation of pre-implantation development of the mammalian embryo. // Mol. Reprod. Devel., 1994, v. 39, p. 233-38.

130. Stewart C.L. Production of chimeras between embryonic stem cells and embryos. // Meth. Enzymol., 1993, v. 225, p. 823-55.

131. Stewart C.L., Cullinan E.B. Preimplantation development of the mammalian embryo and its regulation by growth factors. // Dev. Genet., 1997, v. 21, p. 91— 101.

132. Stewart C.L., Kaspar P., Brunet L J., Bhatt H., Gadi I., Kontgen F., Abbondanzo S.J. Blastocyst implantation depends on maternal expression of leukaemia inhibitory factor. //Nature, 1992, v. 359, n. 6390, p. 76-9.

133. Stewart C.L., Mintz B. Successive generations of mice produced from an established culture line of emploid teratocarcinoma cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, v. 78, p. 6314-18.

134. Sugawara A., Gato K., Satomaru Y., Sofuni Т., Ito T. Current status of chromosomal abnormalities in mouse embryonic stem cell lines used in Japan. // Сотр. Med., 2006, v. 56, n. 1, p. 33-36.

135. Suzuki O., Matsuda J., Takano K., Yamamoto Y., Asano Т., Naiki M., Kusanagi M. Effect of genetic background on establishment of mouse embryonic stem cells. // Exp. Anim., 1999, v. 48, n. 3, p. 213-16.

136. Tam P.P., Snow M.N.L. Proliferation and migration of primordial germ cell during compensatory growth in mouse embryos. // J. Embryol. Exp. Morphol., 1981, v. 64, p. 133-47.

137. Tam P.P., Zhou S.X. The allocation of epiblast cells to ectodermal and germ-line lineages are influenced by the position of the cells in the gastrulating mouse embryo. // Dev. Biol., 1996, v. 178, n. 1, p. 124-32.

138. Tanaka S., Kunath Т., Hadjantonakis A.K., Nagy A, Rossant J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4. // Science, 1998, v. 282, n. 5396, p. 2072-75.

139. Tanos V., Schenker J.G. Is human cloning justified? // J. Assist. Reprod. Genet., 1998, v. 15, p. 1-9.

140. Tarkowsky В., Ben-Yair E. // Dev. Biol., 1991, v. 146, p. 345-52.

141. Tesar P.J. Derivation of germ-line-competent embryonic stem cell lines from preblastocyst mouse embryos. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2005, v. 102, n. 23, p. 8239-44.

142. Thomson J.A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S.S. et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. // Science, 1998, v. 38, p. 133-65.

143. Thomson J.A., Marshall V.S. Primate embryonic stem cells. // Curr. Top. Dev. Biol., 1998, v. 38, p. 133-65.

144. Tomida M., Yamamoto-Yamaguchi Y., Hozumi M. Purification of a factor inducing differentiation of mouse myeloid leukemia Ml cells from conditioned of mouse fibroblast L929 cells. // J. Biol. Chem., 1984, v. 259, p. 10978-82.

145. Wells D.N., Misica P.M., Day A.M., Peterson A.J., Tervit H.R. Cloning sheep from cultured embryonic cells. //Reprod. Fertil. Dev., 1998, v. 10, p. 615-26.

146. Whitten W.K. // Advan. Biosc., 1971, v. 6, p. 129-41.

147. Williams R., Hilton D., Pease S., Willson Т., Stewart C., Gearing D., Wagner E., Metcalf D., Nicola N., Gough N. Mieloid leukemia inhibitory factor maintains the developmental potentional of embryonic stem cells. // Nature, 1988, v. 336, p. 684-87.

148. Wilmut I., Schnieke A.E., McWhir J., Kind A.J., Campbell K.H. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. // Nature, 1997, v. 385, n. 6619, p. 810-13.

149. Winslow T. The embryonic stem cell. // Stem Cells. Scientific Progress and Future Research Direction, National Inst. Health, 2001, p. 5-10.

150. Wobus A.M. Potential of embryonic stem cells. // Mol. Aspects Med., 2001, v. 22, p. 149-64.

151. Wobus A.M., Boheler K.R. Embryonic Stem Cells: Prospects for Developmental Biology and Cell Therapy. // Physiol. Rev., 2005, v. 85, p. 63578.

152. Wobus A.M., Kiessling U., Strauss M., Holzhausen H., Schoneich J. DNA transformation of the pluripotent mouse embryonic stem cell line with a dominant selective marker. // Cell. Differ., 1984, v. 15, p. 93-97.

153. Wolf D.P., Mitalipov S., Norgen R.B. Nuclear transfer technology in mammalian cloning. // Med. Res., 2001, v. 32, p. 609-13.

154. Wood S.A., Allen N.D., Rossant J., Auerbach A., Nagy A. Non-injection methods for the production of embryonic stem cell-embryo chimaeras. // Nature, 1993, v. 365, p. 87-89.

155. В первую очередь хотелось бы поблагодарить моих научных руководителей:

156. Особую благодарность хотелось бы выразить:

157. Яшину Валерию Александровичу, Яшиной Александре Валериевне, а также Смирнову Андрею Александровичу за помощь при выполнении практической части диссертации;

158. Сотрудникам лаборатории механизмов рецепции Института биофизики клетки РАН за создание не только профессиональной научной, но и благоприятной моральной атмосферы в лаборатории.

159. Хотелось бы также сердечно поблагодарить моих родных и близких:

160. Маму, Капралову Алевтину Юрьевну и папу, Капралова Владимира Васильевича бабушку, Капралову Любовь Артемьеву и дедушку, Капралова Юрия Степановича мою сестру, Капралову Марину Владимировну и ее мужа,

161. Симонова Владимира Михайловича, а также близкого друга, Капралова Алексея Вячеславовича за их огромную моральную и финансовую поддержку, благодаря которой мне представилась возможность выполнения диссертационной работы.

162. Работа была выполнена при поддержке грантов РФФИ № 00-04-48 135а, № 0004-55017-и ЦКП, № 05-04-49521, а также научных школ № 1842.2003.4, № 2741.2008.4.1. Февраль, 2009 г.