Динамика внутриклеточной концентрации калия в разных фазах развития раннего эмбриона мыши

Гольдштейн, Дмитрий Вадимович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Динамика внутриклеточной концентрации калия в разных фазах развития раннего эмбриона мыши
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Динамика внутриклеточной концентрации калия в разных фазах развития раннего эмбриона мыши"

На правах рукописи

ГОЛЬДНГГЕЙН ДМИТРИЙ ВАДИМОВИЧ

ДИНАМИКА ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ КАЛИЯ В РАЗНЫХ ФАЗАХ РАЗВИТИЯ РАННЕГО ЭМБРИОНА МЫШИ

03.00.25 — гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва — 2005

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН (г. Пущино)

Научные консультанты:

доктор биологических наук доктор медицинских наук

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН профессор доктор медицинских наук

профессор

доктор медицинских наук профессор

доктор биологических наук

Погорелов Александр Григорьевич Буравков Сергей Валентинович

Корочкин Леонид Иванович Бархина Татьяна Григорьевна Максимов Георгий Владимирович

Ведущая организация:

Институт цитологии РАН (г. Санкт-Петербург)

Защита диссертации состоится 22 декабря 2005 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Ц 001.004.01. ГУ Научно-исследовательский институт'морфологии человека РАМН по адресу: 117418, Москва, ул. Цюрупы, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ морфологии человека РАМН по адресу: 117418, Москва, ул. Цюрупы, д. 3.

Автореферат разослан "_"_2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Л.П.Михайлова

1мпъ

2SL Ъ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Накоплены многочисленные данные, подтверждающие непосредственную связь между активностью ионных каналов и стадиями клеточного цикла. Установлено, что в клетках HeLa ток калия увеличивается в М- и Gj-фазе (Takahashi A. et al., 1993). Такой же эффект показан для эмбрионов рыбы гольца (Bregestovski P. et al., 1992). В М-фазе возрастает активность кальциевого канала у зародышей морского ежа (Yazaki I. et al., 1995) и хлорного — у асцвдий (Block M.L., Moody W.J., 1990; Villaz М. et al., 1995). В регуляции этих каналов принимают участие разные механизмы: отмечают роль цито-скелета (Medina J., Bregestovski P., 1988; Yazaki I. et al., 1995), изменение уровня фосфорилирования (Medina J., Bregestovski P., 1991; Villaz M. et al., 1995) и изменение в комплексообразова-нии белков в цитоплазматической мембране, обусловленное фазами клеточного цикла (Takahashi A. et al., 1993). Так, активность R eag (ether-go-go) К+-канала крысы, экспрессированного в ооците лягушки Xenopus, усиливается в фазе G2/M за счет активации циклинзависимой киназы 1 (Brugemann A et al., 1997).

Для раннего зародыша мыши обнаружен калиевый канал с высокой проводимостью (240 pS), активность которого синхронизирована с первым клеточным циклом (Day M.L. et al., 1993, 1998, 2001). Показано, что активность 240 pS К+-канала не зависит от синтеза белков, а его цикличность сохраняется и в энуклеированной зиготе. Канал функционирует независимо от ядерного цикла, но опосредованно взаимодействует с ним. Например, для работы 240 pS К+-канала требуется присутствие циклинзависимой киназы (cdkl — циклин В), а посредником является митогенактвируемая протеинкиназа (MAP-kinase), которая активна в метафазе второго мейотического деления ооци-та и М-фазе первого клеточного цикла (Moos J. et al., 1995). Снижение активности 240 pS К+-калиевого канала в S/Gj-фазе, по-видимому, обусловлено активацией тирозинкиназы.

Для эмбриона мыши высокий уровень №+/К+-АТФазы регистрируется только на стадии бластоцисты (Powers R.D., Tupper J.T., 1977; Watson A.J., Kidder G.M., 1988; Manjewala F.M. et al., 1989; VanWikle L.J., Campione A.L., 1991). При низком активном транспорте калия 240 pS К+-канал может играть ключевую роль в регуляции внутриклеточного ионного баланса раннего эмбриона, определяя циклический характер его изменений. На фоне редуцированных митохондрий в доимплантационный

РОС. НАЦИОНАЛ--' , (uciiunTMi !

период зародыш развивается в гипоксической среде (Harvey M.B. et al, 2002). Энергетическое обеспечение клетки через анаэробный гликолиз индуцирует образование протонов и лактат-анио-нов (Allen D.G., Orchard С.Н., 1987). В мембране клетки активизируется комплекс ионтранспортирующих систем, направленных на компенсацию цитоплазматического ацидоза и лактоза (Пого-релов А.Г. и др., 2000, 2002, 2004; Pierce G.N., Czubiyt М.Р., 1995).

Для специализированной клетки известна система специфичных механизмов регуляции баланса ионов при гипоксии (в экстремальной ситуации). На ранней стадии развития эмбриона млекопитающих условия гипоксии, по-видимому, являются физиологической нормой, т.е. на стадии зиготы должен проявляться устойчивый эффект интегративной активности эволю-ционно-обусловленных систем ионного транспорта, формирующих специфический внутриклеточный калиевый баланс. Изменения цитоплазматической концентрации иона К+ обусловливают основные молекулярно-генетические преобразования в клетке: рекомбинацию и деградацию ДНК (Parkinson G.N. et al., 2002), экспрессию генов (Taurin S. et al., 2002), полимеризацию/деполимеризацию актина — структурного элемента цитоскелета (Goldmann W.H., 2003).

Таким образом, для понимания особенностей физиологии эмбриона млекопитающих на ранних стадиях доимплантацион-ного развития актуальным является изучение соотношения уровня цитоплазматического калия и фаз первого клеточного цикла. Однако не было установлено, регистрируется ли в ооци-те в метафазе II мейоза низкая концентрация калия, в какой степени цикличность кариокинеза в процессе делений дробления связана с изменением концентрации калия в цитоплазме, возможно ли депонирование калия в клеточных компартментах и какова роль этого явления в регуляции функции эмбриона.

Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в исследовании динамики внутриклеточной концентрации калия в разных фазах развития раннего эмбриона мыши, разработке технологии электронно-зондового микроанализа цитоплазматической концентрации элементов применительно к клеткам раннего эмбриона млекопитающих.

Основные задачи исследования.

1. Разработать методику получения полутонких срезов раннего эмбриона мыши для электронно-зондового микроанализа.

2. Разработать метод расчета концентрации элементов в срезах раннего зародыша мыши по данным электронно-зон-дового микроанализа.

3. Определить концентрацию калия в ооцитах мыши в метафазе II мейоза.

4. Изучить изменение во времени цитоплазматического калия в фазах развития зиготы мыши.

5. Определить концентрацию калия и натрия в бласто-мере двухклеточного эмбриона мыши.

6. Оценить влияние микрохирургических манипуляций, производимых при пересадке ядра специализированной клетки в зиготу мыши, на содержание цитоплазматического калия в клетках эмбриона.

7. Оценить изменение концентрации калия в бластоме-ре двухклеточного эмбриона мыши после эквилибрации в протоколе криоконсервирования.

8. Изучить распределение калия в клеточном клоне, формируемом при культивировании нейральной стволовой клетки.

Научная новизна. Впервые при использовании технологии электронно-зондового микроанализа определена цитоплазма-тическая концентрация элементов (К, Р) в эмбрионе мыши на начальных стадиях доимплантационного развития. Прямым измерением показано, что в цитоплазме ооцита мыши на стадии метафазы II мейоза регистрируется низкая концентрация калия (-60 мМ). Впервые выявлено, что содержание калия в одноклеточном эмбрионе мыши меняется циклически со временем. Изменение цитоплазматической концентрации калия синхронизировано с фазами первого клеточного цикла мыши. В в 1-фазе наблюдается относительно низкий уровень (-70 мМ) элемента, концентрация которого в Б-фазе увеличивается (-160 мМ) и вновь падает (-110 мМ) в С2-фазе. Уменьшение в цитоплазме зиготы содержания калия до -45 мМ продолжается в митозе и только на его заключительной стадии концентрация данного элемента восстанавливается до -80 мМ. Причиной этого может быть цикличность в работе 240 рБ К+-канала, которая не зависит от ядерного цикла.

Впервые показано, что калий в одноклеточном эмбрионе распределен неоднородно и характер его гетерогенного распределения меняется в течение первого клеточного цикла. Дефицит калия, который образуется в примембранной области при активации 240 рБ К+-канала, индуцирует деполимеризацию актина в периферической цитоплазме.

Впервые оценена величина эффективного коэффициента диффузии калия в зиготе мыши в (¿¡/Б-фазе, которая находится в интервале от Ю-13 до Ю-14 м2/с.

Впервые показано, что для двухклеточного эмбриона мыши характерна высокая цитоплазматическая концентрация натрия.

Теоретическая значимость. Представлены новые данные о динамике изменения концентрации калия в зиготе мыши, на фоне которого реализуются основные молекулярно-генетичес-кие события раннего эмбриогенеза.

Сформулирована и обоснована феноменологическая модель калийобусловленной полимеризации актина в зиготе млекопитающих, с помощью которой можно рассматривать образование в клетке гель-актиновой структуры, депонирующей ион К+, что объясняет пространственно-временную гетерогенность распределения калия в эмбрионе.

Предложен оригинальный механизм сближения пронуклеу-сов в зиготе мыши, согласно которому причиной направленной ми фации органелл является перемещение к центру зиготы фронта гель-актиновой структуры, формируемой при ингибиро-вании 240 рБ К+-канала на стадии О/Б-фазы.

Практическая значимость. Разработана технология элект-ронно-зондового микроанализа содержания калия в эмбриональной клетке мыши на ранних стадиях доимплантационно-го периода, которая последовательно включает получение ин-тактного зародыша, подготовку полутонких срезов эмбриона, измерение внутриклеточной концентрации калия. Предложенные методические приемы могут быть применены и к другим одиночным биологическим объектам, малые размеры которых затрудняют использование традиционных в цитологии подходов.

Предложен метод контроля за состоянием зиготы млекопитающих после пересадки в нее ядерного материала по критерию цитоплазматической концентрации калия.

Предложен метод тестирования влияния эквилибрации/от-мывки криопротектора в протоколе криоконсеровирования зародышей млекопитающих по критерию концентрации калия в бластомере.

Предложен метод изучения структурно-функциональной гетерогенности клеточного клона, полученного при культивировании нейральной стволовой клетки, по критерию внутриклеточной концентрации калия.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. В течение первого клеточного цикла в результате интегративной активности ионтранспортирующих систем катиона К+ внутриклеточная концентрация калия в зиготе мыши возрастает на стадии Gj/S-фазы с 60 мМ до 148 мМ и уменьшается до 44 мМ в профазе митоза.

2. Изучено пространственно-временное распределение цитоплазматического калия в разных фазах развития одноклеточного эмбриона мыши, которое характеризуется градиентом концентрации калия между кортикальной и центральной зонами цитоплазмы.

3. Разработана феноменологическая модель калий-обусловленной полимеризации актина в зиготе мыши, которая позволяет объяснить сближение пронуклеусов.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на конференциях «Сохранение генетических ресурсов» (Санкт-Петербург, 2004), «Biological Motility» (Пущино, 2004), «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия» (Санкт-Петербург, 2004), TI International Congress «Biotechnology: state of the art and prospects of development» (Москва, 2004), на XIV Российском симпозиуме по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел (Черноголовка, 2005), V Сибирском физиологическом съезде (Томск, 2005), на П Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2005), на межлабораторной научной конференции в НИИ Морфологии человека (Москва, 2005) и ИТЭБ РАН (Пущино, 2005), на межлабораторном семинаре в Институте цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2005).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, методы и объект исследования, результаты исследований, обсуждение результатов), заключения и основных выводов. Список цитируемой литературы содержит 359 источников. Объем работы составляет 261 страница машинописного текста. Работа содержит 50 рисунков и 21 таблицу.

Публикации. По материалам диссертации опубликована 21 печатная работа, из них 13 статей в реферируемых журналах и 2 патента.

МЕТОДЫ И ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа с экспериментальными животными проводилась в соответствии с приказом Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977.

Для достижения поставленной цели был применен метод прямого определения внутриклеточной концентрации элементов посредством электронно-зондового микроанализа (Погорелов А.Г. и др., 1977, 2005; Pogorelov A.G. etal., 1991, 1994). Данный метод использовали при анализе химических элементов в ооците амфибий (Буровина И.В. и др., 1982; Burovina T.V. et al., 1985) и яйцеклетке насекомых (Przelecka A. et al., 1986; Przelecka А., Pogorelov A.G., 1988).

Изучение ранних стадий развития зародыша млекопитающих было затруднено из-за отсутствия методики, позволяющей получить полутонкие (2 мкм) срезы одиночного объекта столь малых размеров, как ранний эмбрион мыши. Долгое время не удавалось разработать необходимую методику (Biggers J.D. etal, 1993; Baltz J.M. et al, 1997). С использованием метода «freeze-drying» (Ingram M.J. et al., 1972) нами была создана методика получения срезов толщиной 2 мкм с одиночного ооцита, зиготы и двухклеточного эмбриона мыши, позволившая проводить анализ прижизненного распределения элементов в клетке.

Методика подготовки полутонких срезов раннего эмбриона мыши для электронно-зондового микроанализа (ЕРМА). Критическим параметром для раннего эмбриона мыши является его величина (Погорелов А.Г. и др., 2004, 2005). Размер объекта (-80 мкм) ограничивает возможность его визуализации и затрудняет манипуляции с ним, т.е. все препаративные действия проводятся с одиночным микрообъекгом, оптические свойства которого практически не отличаются от характеристик физиологического раствора или заливочной среды (эпоксидная смола). В связи с этим основная методическая проблема заключалась в том, чтобы по завершении многоэтапной подготовки образца обеспечить локализацию раннего эмбриона мыши в идентифицированном объеме заливочного блока.

Выделение эмбриона в заданной фазе проводили по стандартной методике (Манк М., 1989). Все операции контролировали визуально под микроскопом. Для идентификации фазы зиготы использовали морфологические карты, соответствующие стадиям развития эмбриона (Дыбан A.C., 1989). Исследования проводили на эмбрионах мышей линии Swiss. В начале несколько интактных эмбрионов мыши, находившихся на известной стадии развития, в капле физиологического раствора переносили на сеточку-подложку диаметром ~3 мм и толщиной -0.1 мм, которая была перфорирована для обеспечения эффективной фиксации образца при его погружении в жидкий пропан. Нами

предложена модификация метода «1тее2е-с1гу1гщ» и разработана методика локализации эмбриона в идентифицированном объеме заливочного блока (рис. 1).

Рис. 1. Технология электронно-зондового микроанализа (ЕРМА) иито-плазматической концентрации элементов в раннем эмбрионе мыши. *Отмечен разработанный нами этап подготовки полутонкого среза.

После низкотемпературной дегидратации на сеточке-подложке располагался слой пудры солей, полученный в результате дегидратации физиологического раствора, с вкрапленными в него лиофилизированными клетками. Затем эмбрионы вольфрамовой иглой по одному переносили в лунку, заранее подготовленную в блоке заполимеризованной эпоксидной смолы. Далее туда добавляли свежеприготовленную заливочную среду в количестве, необходимом для создания слегка выпуклого мениска. По завершении этого этапа несколько ранних эмбрионов мыши находились в идентифицированном объеме на поверхности пирамидки заливочного блока, из которого на микротоме «Reichert» (Австрия) резали серийные срезы толщиной 2 мкм (рис. 2).

Предложенный методический прием позволил получить полутонкие срезы эмбриона в условиях, когда объект малых размеров не виден при микротомии. На готовых срезах в световом микроскопе идентифицируется сечение эмбриона, попавшее в плоскость препарата, что необходимо при визуальном отборе среза для электронно-зондового микроанализа.

Отбор эмбриона Замораживание Лиофилизация на подложку эмбриона (-188°С) эмбриона

в вакууме

Клетки Физиологический раствор

Исходный Подготовка Заливочный блок смолы заливочного блок с лункой блока

Рис. 2. Последовательность этапов в методе, разработанном для получения полутонких (2 мкм) срезов эмбриона мыши. а — подготовка эмбриона, б — подготовка заливочного блока.

Измерение концентрации элементов в цитоплазме эмбриона мыши с помощью ЕРМА. Для измерения концентрации элементов в цитоплазме эмбриона использовали электронно-зондо-вый микроанализ (Погорелов А.Г. и др., 2005; Ро§оге1оу А.О. & а1., 1991, 1994). Концентрацию элементов определяли с помощью методики расчета, учитывающей интенсивность характеристического рентгеновского излучения, возбуждаемого в образце ускоренными электронами зонда (Р0£0ге10У А.в., А1-1асЬуегс1оу В.Ь., 1984; Ро§оге1оу А.О. & а1, 1991, 1993, 1994, 1997). При этом использовали уравнение:

СА=Кдх1А (1),

где СА — объемная концентрация элемента А в клетке, КА — эмпирический коэффициент пропорциональности, 1А — регистрируемая интенсивность характеристического рентгеновского излучения.

При подготовке по нашей методике полутонкого среза коэффициент КА является постоянной величиной (Погорелов А.Г. и др., 2005; Ро§оге1оу А.О., АНасИуегскэу В.Ь., 1984; Ро§оге1оу А.С. ег а!., 1991, 1994). Значение КА определяли эмпирически, используя тест-объекты, моделирующие мягкие биологические

ткани, содержащие известную концентрацию анализируемого элемента (Roomans G.M., Seveus L.A., 1977; Dorge A. etal., 1978; Pogorelov A.G., 1984). В нашем эксперименте таким стандартом являлся солевой раствор с добавкой 20% декстрана (dextrane sugare, «Sigma»), срезы которого получали так же, как и срезы эмбриона мыши (модифицированным методом «freeze-drying»). Далее с помощью ЕРМА регистрировали интенсивность характеристического рентгеновского излучения образца и, используя формулу (1), рассчитывали коэффициент КА. Анализ элементов проводили в сканирующем электронном микроскопе-микроанализаторе «JSM-U3» («JEOL», Япония), оснащенном кристалл-дифракционным спектрометром рентгеновского излучения. Физико-технические особенности метода электронно-зондового микроанализа представлены на рис. 3.

Рис. 3. Схема, иллюстрирующая физико-технические принципы электронно-зондового микроанализа по J.A.Chandler (1978).

При взаимодействии ускоренных электронов пучка с атомами среза ткани возникает характеристическое рентгеновское излучение, интенсивность которого пропорциональна концентрации анализируемого элемента в исследуемой области. Рентгеновское излучение регистрируется кристалл-дифракционным детектором, встроенным в колонну электронного микроскопа.

Исследуема область

Применение тест-объекта и стандартизация условий анализа позволили предложить простой протокол количественного ЕРМА для прямого определения внутриклеточной концентрации элементов. Найденные коэффициенты могут быть использованы при электронно-зондовом микроанализе других типов клеток, срезы которых подготовлены методом «Ггееге-ёгуп^» (табл. 1).

Таблица 1. Значения параметров количественного ЕРМА, определенных для полутонкого среза декстранового тест-объекта, подготовленного методом 4гееге-с1гутд»

Показатель Калий Фосфор Натрий

Значение эмпирического коэффициента КА 64 270 416

Интенсивность (1д) характеристического

рентгеновского излучения, имп/(нАхс) 1.56 0.37 0.24

Примечание. Числовые значения определены эмпирически в модельном эксперименте в полутонких срезах 20% декстранового стандарта, содержавшего 100 мМ анализируемого элемента. Режим анализа соответствовал экспериментальным условиям для образца эмбриона: ускоряющее напряжение — 25 кВ, время анализа — 20 с, ток зонда электронов ~ 5 нА.

Особенностью ЕРМА является локальность метода, которая позволяет проводить анализ на уровне отдельной клетки и ее органелл. Пространственное разрешение характеризуется поперечным размером области рассеяния электронов и глубиной их проникновения в срез. Показано, что эти параметры рассчитываются из уравнений (2) и (3) (Погорелов А.Г. и др., 2005; Pogorelov A.G., 1987):

г=2.86 Е2 29х104 (2),

R=0.464 E'^xlO4 (3),

где г — поперечное и R — продольное разрешение выражаются в единицах массовой толщины (мкмхг/см3), Е — энергия ускоренного электрона зонда (МэВ).

Для полутонкого среза клетки, который рассматривается как тонкая пленка, морфологическое разрешение ограничивается величиной -0.1 мкм (Burovina I.V. et ai, 1978; Pogorelov A.G. 1987). Создание уникальной методики для получения полутонких срезов одиночного раннего эмбриона млекопитающих позволило разработать технологию электронно-зондового микроанализа цитоплазматической концентрации элементов, соответствующей интактному состоянию клетки.

Методика анализа двухклеточного эмбриона мыши после эк-вилибрации в протоколе криоконсервирования. Замораживание в жидком азоте рассматривается как эффективный метод криоконсервирования ранних эмбрионов млекопитающих (Takeda Т. et al., 1984; Wilson L., Quinn Р., 1994). Перед замораживанием цитоплазма эмбриональной клетки уравновешивается с внеклеточной средой, содержащей смесь криопротекторов. Предварительная эквилибрация снижает вероятность функциональных повреждений, индуцированных последующим погружением зародыша в жидкий азот. От используемого протокола эквили-брации зависит жизнеспособность размороженных эмбрионов (Исаченко В.В. и др., 1994; Смольянинова Е.И. и др., 2001; Eroglu А. et al, 2003). Причиной этого могут быть осмотические явления и обусловленное ими нарушение калиевого баланса в клетке эмбриона. Для создания эффективных способов криоконсервирования необходима информация об изменении внутриклеточного содержания калия в протоколе эквилибрации и последующей отмывки криопротектора. Нами была разработана методика электронно-зондового микроанализа концентрации калия в бластомере двухклеточного эмбриона.

В эксперименте исследовали двухбластомерных зародышей мышей линии SHK. Все манипуляции с эмбрионом проводили при комнатной температуре. Обработка зародыша начиналась с 10-минутной эквилибрации в 10% водном растворе этилен-гликоля (ЭГ). Затем эмбрионы на 1.5 мин переносили в среду замораживания (30% ЭГ на 1 М растворе сахарозы). Далее следовал этап удаления ЭГ в 0.5 М растворе сахарозы (10 мин) с последующей отмывкой в физиологической среде Дульбекко (20 мин), на которой готовились все используемые растворы.

Внутриклеточную концентрацию калия определяли методом электронно-зондового микроанализа на срезе двухклеточного эмбриона. Образец криофиксировали в жидком пропане с последующей вакуумной лиофилизацией при 200°К. Дегидратированный эмбрион помещали в заливочную смолу, которую полимеризовали при 330°К. Полутонкие срезы залитого в смолу образца анализировали в сканирующем электронном микроскопе «JSM-U3» («JEOL», Япония). Элекгронно-зондовый микроанализ концентрации калия в цитоплазме бластомера проводили при ускоряющем напряжении 25 кВ, токе электронов зонда 5 нА (временя анализа — 20 с).

Методика анализа одноклеточного эмбриона мыши после энуклеации. Объектом исследования являлись одноклеточные

эмбрионы мышей линии NMRI. Основные принципы метода энуклеации зиготы описаны ранее (Чайлахян JI.M. и др., 1989; Манк М., 1990). Для выделения зиготы и проведения с ней микрохирургических манипуляций применяли модифицированную среду Витгена (Березовская О.П. и др., 1986). Все этапы эксперимента проходили при комнатной температуре. Морфологический контроль фазы клеточного цикла осуществляли под световым микроскопом. Для сравнения анализировали три вида зигот: интактную клетку, клетку после обратного введения собственного ядерного материала, который перед этим был удален из зиготы, и клетку после удаления собственного ядерного материала и введения ядра соматической клетки.

Концентрацию калия в цитоплазме определяли на срезе клетки. Зиготу, которая находилась в морфологически идентифицированной фазе клеточного цикла (G,/S), замораживали в жидком пропане с последующей вакуумной лиофилизацией при 200°К. Высушенный образец помещали в заливочную среду, приготовленную на основе эпоксидной смолы эпон 812, которую полимеризовали при 330°К. Полутонкие срезы залитой в смолу клетки анализировали в сканирующем электронном микроскопе «JSM-U3» («JEOL»),

Методика анализа клеточного клона, формируемого при культивировании нейральной стволовой клетки. Размеры объекта исследования были близки к таковым раннего эмбриона млекопитающих, поэтому для анализа применяли разработанную нами технологию ЕРМА. Клоногенные нейросферы человека получены на базе НП Институт стволовой клетки и клеточных технологий. Методика подготовки полутонких срезов для элек-тронно-зондового микроанализа полностью совпадала с протоколом, описанным для эмбриона мыши.

Методика культивирования и обработки цитохалазином D зиготы мыши. Зиготы культивировали в 4-луночных планшетах для культивирования эмбрионов «Биомедикал» в 500 мкл среды Витгена при 37°С в инкубаторе, поддерживающем 5% С02 в газовой среде. Маточный раствор представлял собой раствор цитохалазина D («Sigma») с концентрацией 2 мг/мл в ДМСО. Непосредственно перед использованием маточный раствор разводили в 8 раз буфером Дульбекко, а затем добавляли в культуральную среду до конечной концентрации цитохалазина D 5.0, 7.5 и 10.0 мкг/мл. В качестве контроля использовали разведенный в 8 раз ДМСО.

Через 4 ч после добавления цитохалазина D изучали состояние пронуклеусов под микроскопом с использованием

DTC-контраста. После этого зиготы отмывали в нескольких каплях среды Витгена, помещали в лунки со свежей средой и продолжали культивирование. Через 2-3 ч после отмывания от цитохалазина D повторно исследовали расположение пронук-леусов в экспериментальных группах и в контроле.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Колебания цитоплазматической концентрации калия в течение первого клеточного цикла. Баланс калия в клетке является интегративным результатом активного и пассивного транспорта иона К+. Активный транспорт калия, представленный на цитоплазматической мембране Na+/K+-ATOa30ft, в течение первого клеточного цикла мыши имеет примерно постоянный низкий уровень (Watson A.J., Kidder G.M., 1988). По этой причине концентрация калия во всей цитоплазме регулируется посредством калиевых каналов высокой проводимости.

Из всех известных калиевых каналов следует выделить 240 pS К+-канал, обнаруженный на мембране клетки только на ранних стадиях доимплантационного развития эмбриона мыши (Day M.L. et al., 1993, 1998, 2001). Этот канал активен в мета-фазе II ооцита и после оплодотворения в течение фазы Gr В 8/С2-фазе он ингибируется с последующей активацией в митозе. Высокая проводимость 240 pS К+-канала и то, что он синхронизирован с фазами развития зиготы позволяют предположить наличие изменений концентрации цитоплазматического калия в раннем эмбрионе, обусловленные специфической активностью канала. Данные по измерению внутриклеточной концентрации элементов на разных стадиях развития эмбриона мыши представлены в табл. 2. Наблюдаемые значительные различия внутриклеточной концентрации калия в фазах развития, оцененные по критерию Стьюдента (р<0,03), были статистически значимы и достоверны.

Анализ результатов показывает, что данные для групп зигот, находившихся в начале Gj-фазы, и ооцитов отличаются, но незначительно (табл. 2).

Отбор клеток по морфологическим признакам, характеризующим определенную фазу первого клеточного цикла, не исключает существенный разброс измерений по группам (фазам). По-видимому, это объясняется тем, что разделение процесса развития зиготы на временные промежутки по морфологическим признакам достаточно условно: даже внутри определенного временного интервала эмбрион продолжает развиваться,

т.е. происходит непрерывное изменение параметров, характеризующих состояние зиготы.

Если по разбросу данных, полученных для фазы развития зиготы, оценивать функциональную стабильность в анализируемой группе клеток, то относительно «плавное» развитие событий наблюдается в состоянии G,/S (табл. 2). Этот период занимает почти половину длительности (-10 ч) первого клеточного цикла (рис. 4), что позволяет под световым микроскопом достаточно точно идентифицировать G/S-фазу интактной клетки. Для наглядности данные, приведенные в табл. 2. представлены в виде графической зависимости от времени (рис. 4). При построении кривой учитывали длительность каждой фазы зиготы (Дыбан A.C., 1989).

Таблица 2. Цитоплазматические концентрации (мМ) калия и фосфора на последовательных стадиях развития раннего эмбриона мыши, определенные методом электронно-зондового микроанализа (М±т)

Фаза развития Калий Фосфор п

Ооцит в метафазе II мейоза 60±4 103±6 6

Зигота в начале С,-фазы 66±8 105±7 9

Зигота в С/Б-фазе 117±6 114±6 18

Зигота в Э-фазе 148±22 129±22 12

Зигота в С2-фазе 109±16 100±7 9

Зигота в профазе митоза 44±7 81 ± 10 9

Зигота в телофазе митоза 81 ±12 105±21 13

Двухклеточный эмбрион в в/Б-фазе 130±7 73±6 7

Примечание, п — количество анализируемых клеток.

В процессе первого клеточного цикла цитоплазматическая концентрация калия (рис. 4) изменялась с 66 мМ в начале G,-фазы до 148 мМ в S-фазе, что свидетельствовало о наличии активного транспорта калия в этот период развития зиготы. На фоне блокирования 240 pS К+-канала активность Na+/K+-ATO-азы зиготы достаточна для поддержания концентрации внутриклеточного калия на уровне -150 мМ, что соответствовало уровню содержания элемента в дифференцированной клетке. Близкая по величине концентрация характерна для специализированных клеток в культуре, например, в фибробластах (К — 168 мМ, Na — 25 мМ, С1 — 51 мМ) при регистрации методами on mass (Abraham E.H. et al„ 1985).

Концентрация, мМ 180-1 160-

20-

Время наблюдения, ч

Рис. 4. Цитоплазматическая концентрация калия в зиготе мыши. Начальная точка — внутриклеточная концентрация элементов в ооците в метафазе II мейоза, конечная — в G/S-фазе двухклеточного эмбриона. Мпр — профаза митоза, Мтл — телефаза митоза.

В процессе развития зиготы мыши отмечено значительное отличие внутриклеточной концентрации калия между S-фазой (148 мМ) и профазой митоза (44 мМ). Это согласуется со значительным снижением по абсолютной величине мембранного потенциала, наблюдаемым при митозе специализированной клетки (Cone C.D., 1972). Деконденсация ДНК сперматозоида в G j-фазе и начало митоза протекают на фоне очень низкой концентрации калия (рис. 4). Требуются дополнительные исследования, чтобы получить ответ на вопрос, в какой степени низкая концентрация калия является критическим параметром для биохимии нуклеиновых кислот и реализации указанных состояний клетки. Однако выше отмечалось, что присутствие катиона К+ в физиологических концентрациях стабилизирует молекулу ДНК, предотвращая ее деградацию и рекомбинацию.

Временные характеристики колебаний концентрации внутриклеточного калия зиготы мыши (рис. 4) отличаются от параметров известного кальциевого осциллятора (Carroll J., 2000; Marangos P. et al., 2003). Последний активен в первые часы после оплодотворения, когда формируется мужской пронуклеус и завершается метафазы II мейоза. Изменение концентрации калия в зиготе мыши совпадает с фазами 240 pS К+-канала, который активен в M/Gj-фазе и блокируется в начале S-фазы или при S/G2 переходе (Day M.L. et al., 1993, 1998).

В одноклеточном эмбрионе сразу после оплодотворения цитоплазматическая концентрация фосфора была близкой к 100 мМ, величине, характерной для ооцита и многих видов специализированных клеток. Однако имеющиеся в литературе данные о неизменности цитоплазматической концентрации фосфора, основанные на результатах анализа специализированных клеток, не вполне корректны для эмбриональной клетки. Содержание фосфора в раннем эмбрионе меняется не столь значительно как, таковое калия, но статистически значимо (табл. 2). Изменения элемента, по-видимому, характеризуют определенное функциональное состояние зиготы и обусловлены фосфорилированием/дефосфорилированием белков и нуклеиновых кислот, а также, возможно, усилением энергетического метаболизма (Rozell M.D. et al., 1992).

Учитывая результаты наших исследований, можно заключить, что изменение цитоплазматической концентрации калия синхронизировано с фазами первого клеточного цикла мыши. Причиной этого может быть цикличность в работе 240 pS К+-канала, которая не зависит от ядерного цикла. Обнаруженные нами колебания концентрации калия способны оказывать самое разнообразное влияние на зиготу, участвуя в регуляции состояния клетки на молекулярном уровне. Известно, что уменьшение содержания внутриклеточного калия индуцирует экспрессию генов, например, белка GRP75 (морталин) из семейства стресс-белков, который задерживает развитие апоптоза (Taurin S., 2002). Изменение концентрации калия приводит к полимеризации/деполимеризации актинподобных белков, образующих отдельные микро-филаменты и всю структуру цитоскелета (Goldmann W.H., 2003).

Пространственное распределение цитоплазматического калия в разных фазах первого клеточного цикла мыши. Было показано увеличение внутриклеточной концентрация калия почти в 2.5 раза в течение G/S-фазы (рис. 4). Еще более выраженные изменения наблюдаются в течение С2-фазы. Принято считать, что скорость диффузии катиона К+ в цитоплазме незначительно отличается от таковой в водном растворе. Это предполагает отсутствие заметного калиевого градиента в зиготе в связи с быстрой скоростью выравнивания концентрации калия между кортикальной и центральной зонами цитоплазмы при размерах эмбриона порядка 80 мкм. Если внутриклеточную среду рассматривать как водный раствор электролитов, то следует ожидать плавного увеличения содержания калия одновременно во всей цитоплазме зиготы.

Степень гомогенности распределения калия в клетке можно оценить на полутонких срезах, в которых пространственное разрешение ЕРМА составляет около 0.1 мкм (Вигоута ГУ. et а1, 1978; Ро§оге1оу А.О. et а1, 1991). Запись профиля концентрации калия вдоль линии сканирования по зиготе на разных фазах ее развития не подтверждает предположение об однородном распределении элемента в клетке. Особенно выраженная гетерогенность в распределении калия проявляется в С/Б-фазе клеточного цикла (рис. 5), для которой характерно ингибирова-ние 240 рБ К+-канала.

Полученные данные свидетельствуют о том, что распространение калия по мере его поступления в клетку через №+/К+-АТФ-азу, не подчиняется законам диффузии электролита в водном

в^фаза

в/в-фаза

БЮ-фаза

Рис. 5. Интактные зиготы (я) в разных фазах развития, эмбрион на полутонком срезе (б) и распределение калия вдоль линии сканирования (в).

растворе. Этот вывод, сделанный на основе качественного анализа кривых распределения калия вдоль линии сканирования (рис. 5), подтверждают результаты электронно-зондового микроанализа локальной концентрации калия по участкам цитоплазмы зиготы (табл. 3).

Таблица 3. Концентрация (мМ) калия в центральной и периферической зоне цитоплазмы зиготы мыши в С/Э-фазе, определенная методом электронно-зондового микроанализа (М±т)

Цитоплазма зиготы Концентрация п

Центральная зона 117±6 18

Периферическая зона 254±18 4

Примечание, п — количество анализируемых клеток.

Оценка эффективного коэффициента диффузии калия в G/S-фазе зиготы мыши. На основе полученных данных нами была оценена величина эффективного коэффициента диффузии калия в цитоплазме зиготы при G,/S переходе. Для расчета этого параметра использовали теорию решения уравнения диффузии (Тихонов А.Н., Самарский А.А., 1972). Учитывая сферическую форму зиготы, на модели радиального распространения вещества в однородном шаре уравнение диффузии сводится к известной одномерной задаче о распределении в стержне конечной длины, на концах которого поддерживается одинаковая концентрация вещества с начальным равномерным его распределением по длине.

Данная задача допускает аналитическое решение разработанное методами математической физики (Араманович Н.Г., Левин В.И., 1964). Однако с помощью современных компьютерных программ можно получить решение численными методами. Используя возможности среды MathLab, нами оценен эффективный коэффициент диффузии для калия в условиях зиготы. Для этого применили приложение Tool Box Partial Equation (PDE), предназначенное для решения дифференциальных уравнений в частных производных с граничными условиями в двухмерных областях методом конечных элементов.

Предложенная для модели зиготы сферическая симметрия соответствует форме клетки, но не вполне адекватна характеристикам мембраны эмбриона. Это обусловлено тем, что на поверхности одноклеточного зародыша расположено редукционное тельце и область оплодотворения — мембранные компарт-

менты, которые отличаются ионтранспортирующими свойствами и могут внести возмущение в пространственную симметрию.

Учитывая пространственно-временные характеристики распределения калия в зиготе, рассчитанный эффективный коэффициент диффузии для цитоплазмы эмбриона в G/S-фазе составляет Ю-13 м2/с, что на 4-5 порядков меньше величины, которая приводится для водного раствора электролита (2х 10 9 м2/с). Этот факт означает, что свойства цитоплазмы как диффузионной среды на заданных интервалах времени могут значительно отличаться. При этом параметры диффузии иона К+ в клетке не соответствуют движению электролита в водном растворе.

Пространтсвенно-временное распределение локальной концентрации калия свидетельствует о биологической аккумуляции калия в зиготе мыши. Известно, что в специализированной клетке значительное количество калия может быть связано в цитоплазме (Hempling H.G., 1957). Показана возможность аккумуляции данного элемента клеточными органеллами, например, пигментными гранулами (Грибакин Ф.Г. и др., 1976; Burovina I.V. et al., 1978, 1985; Sobota A. et al., 1981, 1984) или гликогеновы-ми глыбками (Sjogaard G., 1990). Калий может связываться с молекулами гликопротеинового комплекса, синтезируемого бокаловидными клетками эпителия тонкой кишки (Погорелов А.Г., 1990; Погорелов А.Г., Матыс Ю.В., 1990; Pogorelov A. et al., 1990). В клетке могут присутствовать депо иона К+, которые обеспечивают гетерогенное распределение данного препарата в цитоплазме с его высокой концентрацией в отдельных морфологических компартментах. Во всех описанных случаях не исключается возможность миграции элемента вместе со структурами, в которые он включается. Однако по проблеме аккумуляции и диффузии калия в одноклеточном эмбрионе экспериментальные и теоретические данные отсутствуют.

Модель калийобусловленной полимеризации актина и механизма аккумуляции калия в цитоплазме зиготы мыши. Прямые наблюдения методом конфокальной микроскопии показали наличие в раннем эмбрионе млекопитающих зон полимеризован-ного актина, расположение которых меняется со временем (Maro В. et al., 1984; Wang F. et al., 2000). Локализация F-ак-тина в разных фазах первого клеточного цикла соответствует распределению калия в зиготе мыши (рис. 6).

Учитывая пространственно-временные характеристики распределения F-актина и калия, можно предположить наличие в цитоплазме зиготы структуры, формируемой актином, которая

способна аккумулировать калий. Причиной формирования такой структуры может быть калийобусловленная полимеризация актина. Наша гипотеза согласуется с рядом экспериментальных данных, свидетельствующих о том, что пул актина — основного «строительного» белка клетки — обладает свойствами, необходимыми для создания такой структуры (Maciver S.R. et al., 1991; Chen M.S. et al., 1999; Goldmann W.H., 2003).

Калий, мМ

230 190 ^ 150 110 70 д 30

G.-фаза

Зигота

60 мкъ

Калий, мМ

230 190 150 110 70 ЗОН

8/02-фаза

мку

Рис. 6. Локализация F-актина в раннем эмбрионе млекопитающих по данным конфокальной микроскопии (я) и распределение калия в зиготе мыши на соответствующих фазах первого клеточного цикла (б). Стрелками обозначен F-актин.

Масса актина и сопутствующих ему белков составляет около 30% сухого остатка клетки (Jones К.Т. et al., 1996) и достаточна для того, чтобы обеспечить биологическую аккумуляцию калия в зиготе. Полимеризация актина возможна только в присутствии катиона. В условиях цитоплазмы индукторами этого

процесса могут быть ионы К+, Са2+ и Mg2+. Кальций- и магний-обусловленную полимеризацию актина в зиготе мыши можно исключить вследствие низкой цитоплазматической концентрации этих катионов. В то же время уровень содержания концентрации иона К+, оптимальный для полимеризации актина in vitro, составляет от 100 мМ до 200 мМ (Pardee J.D. et al., 1982), что соответствует величине локальной концентрации калия, регистрируемой на стадиях развития зиготы.

Анализ данных литературы по конфокальной микроскопии, физико-химических свойств актина и результатов собственных исследований позволил нам предложить феноменологическую модель калийобусловленной полимеризации актина в зиготе мыши (рис. 7).

F-акгин (К)

Мембрана

F-актин (К) К*

, + ft

<= G-актин

\ V

F-актин (К) К.*

G-актин

240 pS К*

F-актин (К) К+

♦ А*

К =>, G-актин

\ II

F-актин (К) К"

Рис. 7. Формирование потока калия через мембрану зиготы и гель-структуры, образованной F-актином.

В G/S-фазе на фоне инактивации 240 pS К+-канала поток калия направлен в клетку, что приводит к увеличению локальной концентрации иона К+ в примембранной области. При повышении концентрации калия динамическое равновесие между G- и F-формами актина сдвигается в сторону полимеризации белка (Pardee J.D., Spudich J.A., 1982; Shu W.R. et al, 1992). В кортикальной зоне всегда присутствует слой F актина, который облегчает полимеризацию G-актина (Wang J. et al, 2000).

В результате цитоплазма переходит в состояние, подобное гелю. Формируемая гель-структура может заметно замедлять диффузию малых молекул (Райп-Ыотще М. et а!., 2004) и препятствует диффузии иона К+.

Калий в Р-актиновой структуре представлен двумя пулами. При полимеризации часть катионов связывается, образуя Р-актин. Однако основной пул элемента находится в форме иона, который локализован в ячейках геля, что поддерживает стабильное состояние полимерной формы белка. В этом случае распространение калия в цитоплазме будет обусловлено диффузией полимера актина. Это вывод косвенно подтверждается тем, что рассчитанная нами величина эффективного коэффициента диффузии для калия в цитоплазме зиготы при О/Б-переходе совпадает со значением этого параметра для Р-акти-на (Ю-13 м2/с).

В 5/02-фазе активируется 240 р8 К+-канал, и в этих условиях поток калия направлен из клетки, что проявлялось в наличии градиента калия по направлению, обратному относительно в ^-перехода. Действительно, на срезах зиготы в С2-фазе в периферической цитоплазме зарегистрирована низкая концентрация калия (табл. 4, рис. 5).

Таблица 4. Концентрация (мМ) калия в центральной и периферической зоне цитоплазмы зиготы мыши в 02-фазе, определенная методом электронно-зондового микроанализа (М±т)

Цитоплазма зиготы Концентрация п

Центральная зона 109±16 9

Периферическая зона 58±5 3

Примечание, п — количество анализируемых клеток.

Дефицит калия, образущегося в примембранной области при активации 240 рБ К+-канала, индуцирует деполимеризацию актина в периферической цитоплазме. С помощью метода конфокальной микроскопии область Р-актина наблюдается в центре зиготы, в которой одновременно регистрируется более высокая концентрация калия. Таким образом, предложенная модель объясняет гетерогенное распределение калия в цитоплазме на разных стадиях развития зиготы мыши.

Гипотеза о механизме сближения пронуклеусов в зиготе мыши. Процесс сближения пронуклеусов играет важную роль в развитии зиготы и дальнейшей последовательности событий раннего

эмбриогенеза. Продемонстрирована роль микротрубочек, предложена и обоснована тубулин-динеиновая модель сближения пронуклеусов (Schatten G. et al., 1985; Navara C.S. et al., 1995; Sutovski P. et al., 1998; Payne С. et al., 2003). Центросома, в строение которой входят тубулиновые микротрубочки, играет основную роль в данном механизме.

Для ряда видов животных показано, что в течение дифферен-цировки ооцит теряет центриоли, при этом у сперматозоида исчезают почти все белки, входящие в состав центросомы (Navara C.S. et al., 1994; Simerly С. et al., 1995; Sathananthan A.H. et al., 1996; Wu G.J. et al., 1996). В зиготе происходит объединение отцовских центриолей с центросомальными белками ооцита (Schatten G., 1994; Manandhar G. et al., 2005). В результате образуется центросома, несущая в себе отцовский и материнский материал, которая формирует тубулиновую «звезду» (Schatten G. etal., 1986; Reinsch S., Gonczy P., 1998; Payne С. et al., 2003). Рассматривается модель движения пронуклеусов, построенная на работе молекулярного мотора — белка динеина, который, используя динактин и комплекс белков в поре женского ядра, позволяет обеспечить сближение пронуклеусов (Payne С. et al., 2003).

В задачи нашего исследования не входила проверка тубу-лин-динеиновой модели и роли микротрубочек в кинетике пронуклеусов. Однако длительные и интенсивные исследования пока не дали прямых экспериментальных данных, подтверждающих участие тубулинового механизма в сближении пронуклеусов. Неясно, почему пронуклеусы движутся к дистальным центрам организации микротрубочек и не движутся к проксимальным. Более того, не установлено, каким образом указанный механизм может быть применим для грызунов, сперматозоид которых теряет центриоли в течение сперматогенеза (Manandhar G. et al., 1998, 1999). В этом случае материал материнской центросомы равномерно распределяется по всей субкортикальной ооплазме, формируя после оплодотворения множество центров сборки тубулиновых микротрубочек (Schatten G. et al., 1985, 1986). В результате сближение пронуклеусов в соответствии с тубулин-диениновой моделью может оказаться невозможным.

Косвенные данные показывают, что направленная полимеризация актина также способна приводить к движениям пронуклеусов. Роль F-актина в кинетике пронуклеусов не ясна, однако важность актиновых филаментов была показана в экспериментах с цитохалазином D (Maro В. et al., 1984).

Предложенная нами модель основывается на том, что по мере диффузии иона К+, которая тормозится актиновым гелем, фронт формируемой структуры перемещается к центру клетки. Различие в механических свойствах на границе фаз, например вязкости или упругости, может быть причиной перемещения пронуклеусов от периферии к центру и их контакта по завершении Б-фазы. Схематично механизм перемещения пронуклеусов фронтом фаз гель-жидкость представлен на рис. 8.

Рис. 8. Изменение положения Р-актиновой структуры в зиготе мыши в течение первого клеточного цикла и обусловленное этим сближение пронуклеусов (Рг).

Для проверки нашей гипотезы о роли Р-актина в сближении пронуклеусов в зиготе мыши были проведены исследования по влиянию обработки одноклеточного эмбриона цитоха-лазином Б, который вызывает деполимеризацию Р-актина. После обработки 36 зигот цитохалазином Б в концентрации 7.5 мкг/мл наблюдали задержку процесса сближения пронуклеусов у 12 (33%) зигот, гибель 5 зигот (14%), сближение пронуклеусов в норме у 19 (53%) зигот. На протяжении всего времени воздействия цитохалазина Б (6 ч) в зиготах, в которых наблюдалась задержка, пронуклеусы располагались в периферической области. После отмывки от цитохалазина О и переноса в свежую культуральную среду процесс сближения пронуклеусов возобновлялся и завершался в течение 2-3 ч. Таким образом, цитохалазин Б в концентрации 7.5 мкг/мл обратимо прекращал процесс сближения пронуклеусов, по-видимому, вследствие деполимеризации Р-актина. Полученные результаты свидетельствуют о возможности участия Р-актина в сближении пронуклеусов мыши.

При рассмотрении причины движения пронуклеусов грызунов следует учитывать совместное действие тубулинового и акгинового механизмов. Направленное движение Р-актинового

в,-фаза

в/в-фаза

8/Огфаза

компартмента в состоянии обеспечить перемещение пронуклеу-сов, а тубулиновые микротрубочки могут создавать необходимую направленность движения пронуклеусов. Таким образом, предложенная нами модель дополняет картину раннего эмбриогенеза грызунов и не исключает участия тубулинового механизма в развитии зиготы мыши.

ЕРМА бластомера двухклеточного эмбриона мыши. Начальная неоднородность поверхности мембраны зиготы рассматривается как причина дальнейшего асимметричного развития блас-томеров, образующихся при последующих делениях дробления (Piotrowska К., Zemicka-Goetz M., 2001; Piusa В. et al., 2002; Wodarz A., 2002). По крайней мере у двух первых дочерних клеток зиготы регистрируется разный уровень цитоплазматического калия в начале Gj-фазы двухклеточнго эмбриона. Возможно, уровень калия уже на стадии раннего эмбриона отражает унифицированный признак асимметричного деления, характерный для эмбриональной (стволовой) клетки (Вермель А.Е., 2004).

По мере развития двухклеточного зародыша форма распределения калия меняется, но остается неоднородной. Внутриклеточная концентрация натрия, изученная методом элект-ронно-зондового микроанализа, составила 116±10 мМ в цитоплазме зрелого бластомера двухклеточного эмбриона мыши в Gj/S-фазе (проанализированы показатели для 7 клеток).

В цитоплазме бластомера двухклеточного эмбриона мыши в Gj/S-фазе регистрировалась концентрация калия (-130 мМ), характерная для специализированной клетки (табл. 2). Такой высокий уровень калия достигнут из-за интенсивного активного транспорта, потребляющего АТФ, в результате чего образуется неорганический фосфат. По-видимому, выходом этого метаболита из клетки обусловлена низкая концентрация фосфора в Gj/S-фазе двухклеточного зародыша. Следует отметить, что еще в профазе митоза зиготы наблюдалось самое низкое внутриклеточное содержание элемента, которое составило -44 мМ (табл. 2).

Менее однозначны для интерпретации данные анализа концентрации натрия в эмбриональной клетке. В цитоплазме бластомера наблюдался высокий уровень концентрации данного элемента, в несколько раз превышавший таковой натрия в специализированной клетке, что свидетельствует о наличии интенсивного транспорта Na+ в бластомер, который не компенсирует низкая активность Na/K-АТФазы (Powers R.D., Tupper J.T., 1977; VanWikle L.J., Campione A.L., 1991; Baltz J.M. et al., 1997).

Еще одной причиной накопления натрия может быть обратный Na+/Ca2+-oÖMeH — механизм, свойственный только эмбриональной клетке (DiPolo R., 1989; Crespo L.M. et al., 1990).

Обнаруженный «натриевый» феномен еще раз подтверждает, что состояние эмбриональной клетки в доимплантаци-онный период развития зародыша значительно отличается от такового специализированной клетки. Возможно, внутриклеточный баланс калия в бластомере формируется в результате работы эволюционно обусловленных механизмов, которые активны в эмбриональной клетке и утрачиваются в процессе диф-ференцировки (Погорелов А.Г. и др., 2005).

Необходимо дальнейшее изучение физиологической значимости натрия для эмбриогенеза млекопитающих. Так, депонирование натрия в эмбриональной клетке амфибий рассматривают как механизм, обеспечивающий на стадии бластоцисты организацию внутренней полости зародыша (бластоцеля). Считается, что в этот период развития зародыша выход иона Na+ из эмбриональной клетки стимулирует образование объема бластоцеля — предшественника тканевой жидкости (Biggers J.D. et al., 1978). Аналогичный механизм может быть реализован у эмбриона млекопитающих.

Анализ двухклеточного эмбриона мыши после эквилибрации в протоколе криоконсервирования. Для создания эффективных способов криоконсервирования ранних эмбрионов млекопитающих требуется изучение механизмов адаптации бластомера в процессе эквилибрации и последующей отмывки кариопротекто-ра. Осмотические эффекты, возникающие при этом, могут быть причиной электролитного дисбаланса эмбриональной клетки. Методом электронно-зондового микроанализа проводили сравнительное исследование внутриклеточной концентрации калия на стадии двухбластомерного зародыша мыши.

Электронно-зондовый микроанализ концентрации калия в цитоплазме бластомера двухклеточного эмбриона показал (табл. 5), что для зрелых двухклеточных эмбрионов мыши цитоплазмати-ческая концентрация калия близка к величине показателя, регистрируемого в специализированных клетках (Погорелов А.Г. и др., 2002, 2005; Pogorelov A.G. et al., 1991, 1994). Феномен высокого уровня внутриклеточного натрия в бластомере обсуждался выше. Маловероятно, что элемент находится в ионизированной форме. По-видимому, его основная масса депонирована в цитоплазматических структурах эмбриональной клетки.

В результате криоконсервирования содержание внутриклеточного калия уменьшилось с 130+6 до 47+3 мМ. Этого

Таблица 5. Концентрация (мМ) калия и натрия в цитоплазме бластомера двухклеточного эмбриона мыши в контроле и после эквилибрации/отмывки этиленгликоля (М±т)

Группа Калий Натрий п

Контроль 130±6 120±6 7

Опыт 47±3 60±5 9

Примечание, п — количество анализируемых эмбрионов.

снижения следовало ожидать, т.к. этиленгликоль, проникая в бластомер, нарушает целостность мембраны и/или ингибирует активный транспорт калия. Протокол эквилибрации/отмывки изменил состояние эмбриональной клетки. При этом цитоплаз-матическая концентрация калия в эмбрионе, который находился на стадии G,/S-<t)a3bi, установилась на уровне, соответствующем митозу.

Цитоплазматическая концентрация натрия снизилась в два раза (табл. 5). Падение уровня элемента идет против градиента, что возможно при наличии активного транспорта. Такой эффект может вызвать активизация Na+/K+-ATOa3bi, которая направлена на компенсацию образовавшегося в бластомере дефицита калия. Нельзя исключить и наличие Na+-AT<Da3bi — активного транспорта иона Na+. Данный механизм может не приводить к высокому уровню интенсивности транспорта иона на клеточной мембране. Однако наличия Na+-ATOa3bi для клетки раннего эмбриона млекопитающих нельзя исключить.

Таким образом, можно заключить, что эквилибрация/от-мывка криопротектора (этиленгликоля) приводит к дисбалансу калий-натриевого отношения в бластомере двухклеточного зародыша. Возможно, одной из причин нарушения в развитии зародыша является дисбаланс калия, внесенный на этапе экви-либрации криопротектором.

Анализ одноклеточного эмбриона мыши после энуклеации. Эмбриональное развитие начинается после оплодотворения яйцеклетки. Основным моментом в раннем эмбриогенезе является первое деление дробления (Цыбан А.С., 1989; Манк М., 1990). На этой стадии в эмбриональной клетке происходят процессы, предопределяющие реализацию генетической программы (Day M.L. et al., 1998, 2001; Wenger R.H., 2000; Hamatani Т. et al., 2004). Индуцированное изменение состояния одноклеточного эмбриона может непредсказуемо модифицировать развитие за-

родыша. В связи с этим при разработке способов микрохирургического удаления ядер необходим контроль влияния разных факторов энуклеации на зиготу (Чайлахян JI.M. и др., 1989). Наиболее чувствительным параметром, характеризующим степень изменения состояния клетки, является уровень цитоплазматического калия. Нами было проведено измерение содержания калия в одноклеточном зародыше мыши и определено изменение концентрации элемента под действием энуклеации. Так, в интактной зиготе в фазе G/S концентрация калия составила 119±6 мМ, при обратном введении собственного ядерного материала в зиготу в фазе G/S — 29+7 мМ, при введении ядра соматической клетки в энуклеированную зиготу в G,/S-фазе — 21+3 мМ.

Таким образом, установлено, что энуклеация вызывает значительное уменьшение концентрации калия в зиготе. По-видимому, отмеченное нарушение обусловлено процедурой отбора пронуклеусов, т.к. регистрируемые изменения практически не зависят от способа введения ядерного материала. В результате микрохирургических манипуляций уровень цитоплазматичес-кой концентрации калия соответствовал концентрации элемента в начале митоза. Указанный сдвиг калиевого баланса может значительно модифицировать дальнейшее развитие химерного эмбриона (Liu Н.С. et al., 2001, 2003).

Эффективный метод оценки травматичности манипуляций в клеточных технологиях, основанный на критерии неизменности внутриклеточной концентрации калия — иона, который наиболее быстро и выраженно реагирует на изменение состояния клетки — позволяет целенаправленно разрабатывать процедуру терапевтического клонирования, при выполнении которой реализуется требование сохранности внутриклеточного баланса элементов.

Анализ клоногенной нейросферы человека. Термином «нейро-сфера» (NSCs) обозначают свободно плавающие структуры, которые образуют в культуре нейральные стволовые клетки. С момента, когда эти структуры были описаны в мозге мышей, они находятся в центре внимания исследователей, т.к. могут быть использованы для коррекции нейродегенеративных процессов (Arsenijevic Y. et al., 2001; Rietze R.L., Valcanis C.R. et al., 2001). Нейросферы чрезвычайно пластичны, что существенно для их миграции и дифференцировки (Morshead С.М. et al., 2002). Анализ данных литературы позволяет предположить, что NSCs гетерогенны по своему строению (Parati ЕА et al., 2002). В нейро-сферах регистрируется экспрессия не только нестина (маркера

нейрональных клеток), но и CD34, CD31, Tie2, что свидетельствует о наличии клеток разного фенотипа (Suslov O.N. et al., 2002).

Нейросферы неоднородны по ультраструктурному строению (Lobo M.V.T. et al., 2003; Bez A. et al., 2003). Выявлены различия в размере клеток, цитоплазматическом содержимом, наличии и распределении активных митохондрий. Клетки, образующие NSCs, не синхронизированы в развитии и демонстрируют все фазы клеточного цикла, митоз, апоптоз в зависимости от их пространственного расположения в нейросфере.

Оценено содержание и распределение калия в клоноген-ной нейросфере. Результаты количественного электронно-зон-дового микроанализа концентрации натрия и калия, полученные на полутонких срезах клоногенной нейросферы человека, характеризуются большим разбросом. Так, при исследовании 6 клоногенных образцов средняя концентрация натрия составила 100+10 мМ, а калия — 130+30 мМ, что отражает вариабельность физиологического состояния в анализируемой группе клонов. Интерес вызывает высокая, даже учитывая влияние внеклеточного пространства, концентрация натрия, нехарактерная для дифференцированной клетки. Этот факт отражает вариабельность физиологического состояния в анализируемой группе клонов. Даже с учетом влияния внеклеточного пространства, интерес вызывает высокая концентрация натрия, нехарактерная для дифференцированной клетки.

При исследовании нейросферы на полутонких срезах в электронном сканирующем микроскопе и при анализе кривой распределения концентрации калия вдоль линии сканирования установлено, что калий в структуре распределен неоднородно (рис. 9).

□□ ш

. /уЛ

Рис. 9. Клоногенная нейросфера человека. Изображение, полученное в сканирующем электронном микроскопе (режим прошедших электронов) при анализе нефиксированного полутонкого среза. а — микрофотография: обозначена линия сканирования; б — кривая распределения калия вдоль линии сканирования.

Наши наблюдения согласуются с данными о гетерогенном строении нейросферы, полученными при ультрастуктурном и морфологическом исследовании (Вег А. а/., 2003). В клоне выявляются морфологические признаки всех фаз клеточного цикла, митоза и апоптоза.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Из феноменологической теории следует, что митотическое деление клетки сопряжено с рядом условий: с повышением внутриклеточной концентрации натрия, уменьшением по абсолютной величине мембранного потенциала и с приобретением клеткой, как правило, сферической формы. Дальнейшие исследования показали, что подготовка к митозу проходит на фоне последовательных событий, определяющих изменение внутриклеточного калиевого баланса.

Клетка раннего эмбриона значительно отличается от специализированной. Вплоть до стадии бластоцисты прогнозируется наличие внутриклеточного дефицита калия, обусловленного низким уровнем №+/К+-АТФазы. В эмбриональной клетке должен накапливаться натрий, что связано не с компенсацией клеточного ацидоза, а с транспортом кальция из цитоплазмы через Ка+/Са2+-обмен. Соответственно, изменение №/К-баланса индуцирует электросоматический эффект, который проявлялся в уменьшении (по абсолютной величине) мембранного потенциала и приобретении клеткой сферической формы.

Уникальность зиготы млекопитающих проявляется не только в особенности самой клетки, но и в условиях ее окружения. На начальной стадии развития раннего зародыша редуцировано окислительное фосфорилирование — эффективная система синтеза АТФ. При этом в полном объеме не функционирует комплекс ферментов, поддерживающий гликолиз — более древний способ обеспечения клетки энергией. Развитие зиготы млекопитающих протекает в гипоксических условиях, которые являются фоном нормального развития эмбриональной клетки. Для специализированной клетки гипоксия представляет экстремальную ситуацию, требующую активизации комплекса адаптивных ионтранспортирующих механизмов. У зиготы отсутствуют или редуцированы такие механизмы, как, например, №+/Н+-обмен или №+/К+-АТФаза, которые обязательно присутствуют на мембране дифференцированной клетки, и активны механизмы, характерные только для раннего эмбриона млекопитающих — обратный Ка+/Са2+-обмен или 240 р8 К+-канал.

Указанные различия позволяют предположить, что регуляция баланса ионов в эмбриональной клетке осуществляется «древними» эволюционно-обусловленными механизмами, которые теряют свою активность после имплантации в процессе «кислородной» дифференцировки. По-видимому, трансформация системы транспорта ионов начинается уже в предымлантанци-онный период развития эмбриона. Первый пик транскрипции ДНК de novo соотносится с активацией генома зиготы. Пока не понятно, на стадии транскрипции, трансляции или модификации белков, встроенных в мембрану клетки, осуществляется комплектация ионтранспортрирующей системы в течение первого клеточного цикла.

Особенность в обеспечении зиготы энергией, отсутствие у нее системы транспорта ионов, характерной для специализированной клетки, наличие специфических ионтранспор-тирующих систем предполагают формирование особого калиевого окружения. Изменение цитоплазматической концентрации калия должно быть синхронизировано с фазами первого клеточного цикла, индуцируя молекулярно-генетические изменения в эмбрионе. Несмотря на интерес к этой проблеме, отсутствовали методы, позволяющие проводить микроанализ элементов в зиготе млекопитающих. Разработанная нами технология электронно-зондового микроанализа с привлечением криогенных подходов электронной микроскопии позволила решить проблему измерения внутриклеточной концентрации элементов в эмбрионе.

ВЫВОДЫ

1. Интегративная активность систем транспорта иона К+ на мембране зиготы индуцирует колебания концентрации цито-плазматического калия от 44 мМ до 148 мМ в течение первого клеточного цикла. G/S-фаза характеризуется накоплением внутриклеточного калия с последующим уменьшением его содержания в 8/С2-фазе, которое достигает минимального значения в профазе митоза.

2. Пространственное распределение калия в зиготе мыши обусловлено фазой клеточного цикла и характеризуется высоким градиентом концентрации данного элемента между кортикальной и центральной зонами цитоплазмы. Эффективный коэффициент диффузии иона К+ в цитоплазме зиготы достигает Ю-13 м2/с, что на несколько порядков меньше значения, принятого для водного раствора электролита (2x10 9 м2/с).

3. Разработана оригинальная технология получения полутонких срезов одиночного биологического объекта, размером не менее 30 мкм, сохраняющая интактное распределение элементов, которая позволила впервые определить внутриклеточную концентрацию элементов в раннем эмбрионе мыши методом электронно-зондового микроанализа.

4. Сформулирована феноменологическая модель калийобус-ловленной полимеризации актина в зиготе мыши, в которой ключевая роль в регуляции кинетики калиевого баланса отводится 240 pS К+-каналу. В рамках модели перемещение фронта гель-актиновой структуры принимает участие в сближении пронуклеусов.

5. Обнаружена высокая концентрация натрия (120 мМ) в цитоплазме двухклеточного эмбриона мыши, что указывает на возможность формирования внутренней полости зародыша у млекопитающих через известный для амфибий механизм транспорта во внеклеточное пространство иона Na+ при активации Na+/K+-ATOa3bi на стадии бластоцисты.

6. Показана эффективность разработанной технологии ЕРМА для оценки травматичности манипуляций с одиночной клеткой по критерию сохранности внутриклеточной концентрации калия при энуклеации зиготы. На примере протоколов крио-консервирования эмбрионов и культивирования нейросфер продемонстрирована возможность контроля биотехнологий методом ЕРМА.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гольдштейн Д.В., Смольянинова Е.И., Погорелов А.Г. Анализ калия в бластомере двухклеточного эмбриона мыши после эквилибрации и отмывки криопротектора // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2004 . Т. 138, № 7. С. 48-49.

2. Гольдштейн Д.В., Вихлянцева Е.Ф., Сахарова Н.Ю., Маевский Е.И., Погорелов А.Г., Учитель MJI. Гистологический метод оценки эффективности препарата «Энерлит-Клима» // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2004 . Т. 138, № 8. С. 233-234.

3. Гольдштейн Д.В., Погорелов А.Г., Чайлахян Т.А., Смирнов А.А. Изменение внутриклеточной концентрации калия в одноклеточном эмбрионе мыши после энуклеации // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2004. Т. 138, № 9. С. 275-276.

4. Гольдштейн Д.В., Маевский Е.И., Погорелова В.Н. Сравнительное изучение препаратов вазапростан и алпростан в тесте на спонтанную агрегацию тромбоцитов мышей // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2004 . Т. 138, № 10. С. 475-476.

I \

5. Миронов H.B., Гольдштейн Д.В., Сабурина И.Н., Ржанинова A.A., Иванов С.А., Архипов СЛ., Шмырев В.И., Миронов М.Н., Свинов М.М., Голобородко Е.В., Репин B.C. Применение трансплантации нейрональ-ных стволовых клеток для лечения ишемического инсульта // Кремлевская медицина (клинический вестник). 2004. № 3. С. 77-79.

6. Погорелов А.Г., Смольянинова Е.И., Гольдштейн Д.В., Смирнов A.A. Влияние криопротекторов на концентрацию калия в цитоплазме бласто-меров ранних эмбрионов мыши // Цитология. 2004. Т. 46. С. 836-837.

7. Погорелов А.Г., Гольдштейн Д.В., Чайлахян Т.А., Смирнов A.A. Анализ влияния энуклеации на концентрацию калия в цитоплазме одноклеточного эмбриона мыши // Цитология. 2004. Т. 46. С. 934-935.

8. Погорелов А.Г., Погорелова В.Н., Хренова Е.В., Кантор Г.М., Гольдштейн Д.В., Аксиров А.М. Количественный рентгеноспектральный микроанализ биоорганических пленок с помощью кристалл-дифракционного спектрометра // Поверхность: Рентгеновские, синхротронные и нейтронные исследования. 2005. № 2. С. 49-54.

9. Гольдштейн Д.В., Аксиров А.М., Кантор Г.М., Смольянинова Е.И., Погорелов А.Г. Циклические изменения цитоплазматической концентрации калия в зиготе мыши // Биологические мембраны. 200. Т. 22, N° 4. С. 321-325.

10. Погорелов А.Г., Смольянинова Е.И., Погорелова В.Н., Гольдштейн Д.В. Элекгронно-зоцдовый микроанализ концентрации калия и фосфора в ооци-тах и одноклеточных эмбрионах мыши // Онтогенез. 2005. Т. 36. С. 123-127.

11. Погорелов А.Г., Смольянинова Е.И., Гольдштейн Д.В., Сахарова Н.Ю. Анализ концентрации калия в клетках раннего эмбриона мыши в доимплантационный период // Доклады Академии наук. 2005. Т. 400, № 2. С. 276-278.

12. Погорелов А.Г., Аксиров А.М., Гольдштейн Д.В., Кантор Г.М., Иваниц-кий Г.Р. Анализ диффузии и накопления калия в зиготу мыши, обусловленных циклической активностью 240 pS К+ канала // Доклады Академии наук. 2005. Т. 400, № 5. С. 705-707.

13. Гольдштейн Д.В., Аксиров А.М., Кантор Г.М., Погорелов А.Г. // Анализ концентрации цитоплазматического калия в одноклеточном эмбрионе мыши // Материалы V Сибирского физиологического съезда. Томск, 2005. С. 112.

14. Гольдштейн Д.В., Аксиров А.М., Кантор Г.М., Погорелов А.Г. Элект-ронно-зондовый микроанализ концентрации калия в цитоплазме одноклеточного эмбриона мыши // Материалы XIV Российского симпозиума по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел. Черноголовка, 2005. С. 243-244.

15. Гольдштейн Д.В., Ржанинова A.A., Погорелов А.Г. Электронно-зондо-вый микроанализ концентрация калия и натрия в ютоногенной культуре нейральных стволовых клеток человека // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2005. Т. 140, № 9. С. 282-285.

16. Гольдштейн Д. В., Ржанинова A.A., Погорелов А. Г.//Оценка пространственной гетерогенности клоногенной нейросферы человека по распределению калия в ней // Материалы II Международной конференции по молекулярной медицине и биобезопасности. М., 2005. С. 111.

РОС. ЫАЦИОЧ» >.' „

БИБЛИОТЫи С.Пт*«у?г \ — т «г

17. Миронов Н.В., Гольдштейн Д.В., Горяйнова И.И., Архипов СЛ., Иванов С.А., Миронов С.И., Шмырев В.И., Репин B.C., Ржанинова А.А., Сабурина И.Н., Шаменков Д.А., Макаров А.В., Фатхудинов Т.Х. Биотрансплантат и способ лечения паркинсонизма. Патент № 2259836. 2004 г.

18. Миронов Н.В., Гольдштейн Д.В., Горяйнова И.И., Архипов СЛ., Иванов СЛ., Миронов С.И., Шмырев В.И., Репин B.C., Ржанинова А.А., Сабурина И.Н., Шаменков Д.А., Макаров А.В., Фатхудинов Т.Х. Биотрансплантат и способ лечения ишемического инсульта. Патент №2258521. 2004 г.

19. MironovN.V., Goldstein D.V., SaburinaI.N., RzhaninovaА.А., Szhmyrev V.I., Mironov I.N., Repin V.S. Transplantation of human neural stem cells (HNSC) to patients with ischemic stroke: effects on the acute and early postischemic stages // II International congress "Biotechnology: state of the art and prospects of development". Moscow, 2003. P. 125-126.

20. Pogorelova V.N., Goldshtein D.V., Khrenova E.V., Kasymov V.A., Pogore-lov A. G. Asay of the perfused ratheart during cardiac ischemia with Rb EPMA // Biological motility. Pushchino, 2004. P. 56-57.

21. Cantor G.M., Sakharova N.Yu., Goldshtein D.V., Chaylachyan L. M., Smirnov A.A. 3D reconstruction of mouse embryos on the early stage of preimplantation development // Biological motility. Pushchino, 2004. P. 187.

Соискатель

Гольдштейн Д.В.

Для заметок

Подписано к печати 20.11.05. Формат 60х84'/16. Тираж 200 экз. Отпечатано в Издательстве РАМН 109240 Москва, ул. Солянка, 14 тел. (095)2982108, 2982048

»23142

РНБ Русский фонд

2006-4 24783

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Гольдштейн, Дмитрий Вадимович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Феноменологическая теория, рассматривающая роль ионного баланса в делении клетки.

1.2. Регуляция калиевого баланса клетки в митозе.

1.3. Регуляция натриевого баланса клетки в митозе.

1.4. Энергетический статус клетки раннего эмбриона млекопитающих.

1.5. Принципы электронно-зондового микроанализа (ЕРМА).

1.5.1. Криофиксация элементного состава клетки.

1.5.2. Метод Агееге-ёгукщ.

1.5.3. Физико-технические основы ЕРМА.

1.5.4. Расчет концентрации элементов на срезе клетки по данным ЕРМА.

1.5.5. ЕРМА цитоплазматической концентрации элементов в одиночной клетке культуры и суспензии.

ГЛАВА 2. МЕТОДЫ И ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Получение ооцитов и ранних эмбрионов мыши.

2.1.1. Суперовуляция мыши.

2.1.2. Выделение яйцеводов мыши.

2.1.3. Вымывание ранних эмбрионов мыши.

2.1.4. Получение ооцитов мыши в метафазе II мейоза.

2.1.5. Получение зигот мыши в фазах первого клеточного цикла.

2.1.6. Получение двухклеточных эмбрионов мыши.

2.2. Методы клеточных биотехнологий.

2.2.1. Эквилибрация и отмывка эмбриона от криопротектора.

2.2.2. Энуклеация зиготы мыши.

2.2.3. Получение культуры нейральных стволовых клеток человека (нейросфер).

2.2.4. Обработка одноклеточного эмбриона мыши цитохалазином Б.

2.2.5. Подготовка одноклеточного эмбриона мыши для конфокальной микроскопии Б-актина.

2.3. Технология ЕРМА для раннего эмбриона мыши.

2.3.1. Получение полутонких срезов раннего эмбриона мыши.

2.3.2. ЕРМА внутриклеточной концентрации элементов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Особенности технологии ЕРМА применительно к раннему эмбриону мыши.

3.1.1. Подготовка 2 мкм срезов раннего эмбриона мыши для ЕРМА.

3.1.2. Эмпирический метод определения поправочного коэффициента в уравнении расчета концентрации элементов.

3.2. Измерение концентрации элементов в клетках раннего эмбриона мыши.

3.2.1. Сравнение групп ооцитов в метафазе II мейоза и зигот мыши по цитоплазматической концентрации калия и фосфора.

3.2.1.1. Результаты ЕРМА цитоплазматической концентрации элементов (К, Р) по группам ооцитов и зигот мыши.

3.2.1.2. Обсуждение баланса калия и фосфора в цитоплазме ооцита мыши.

3.2.1.3. Обсуждение баланса калия и фосфора в цитоплазме зиготы мыши.

3.2.2. Определение цитоплазматической концентрации элементов (К, Р) в течение первого клеточного цикла мыши.

3.2.2.1. Результаты ЕРМА цитоплазматической концентрации элементов (К, Р) на разных стадиях развития зиготы мыши.

Результаты ЕРМА цитоплазматической концентрации элементов (К, Р) в Gj-фазе зиготы мыши.

Результаты ЕРМА цитоплазматической концентрации элементов (К, Р) в Gi/S-фазе зиготы мыши.

Результаты ЕРМА цитоплазматической концентрации элементов(К,-Р).В-8-фазе зиготы мыши.

Результаты ЕРМА цитоплазматической концентрации элементов (К, Р) в вг-фазе зиготы мыши.

Результаты ЕРМА цитоплазматической концентрации элементов (К, Р) в профазе митоза зиготы мыши.

Результаты ЕРМА цитоплазматической концентрации элементов (К, Р) в телофазе митоза зиготы мыши.

3.2.2.2. Обсуждение результатов ЕРМА цитоплазматической концентрации элементов (К, Р) в течение первого клеточного цикла мыши.

Изменения концентрации цитоплазматического калия в течение первого клеточного цикла мыши.

Пространственное распределение цитоплазматического калия в разных фазах первого клеточного цикла.

Оценка эффективного коэффициента диффузии калия в Gi/S-фазе зиготы мыши.

Модель калийобусловленной полимеризации актина и механизма аккумуляции калия в цитоплазме зиготы мышы.

Гипотеза о механизме участия актина в сближении пронуклеусов в зиготе мыши.

3.2.3. Определение концентрации элементов (К, Р, Na) в цитоплазме бластомера двухклеточного эмбриона мыши.

3.2.3.1. Результаты ЕРМА цитоплазматической концентрации элементов (К, Р) в двухклеточном эмбрионе мыши.

3.2.3.2. Обсуждение результатов ЕРМА цитоплазматической концентрации элементов (К, Р, Na) в двухклеточном эмбрионе мыши.

3.3. Применение ЕРМА для контроля клеточных биотехнологий. 185 3.3.1 .Анализ двухклеточного эмбриона мыши после эквилибрации при криоконсервировании.

3.3.1.1. Принципы криоконсервирования ранних эмбрионов млекопитающих.

3.3.1.2. Результаты ЕРМА цитоплазматической концентрации элементов (К, Na) в двухклеточном эмбрионе мыши после эквилибрации/отмывки.

3.3.1.3. Обсуждение результатов ЕРМА в эксперименте эквилибрации/отмывки этиленгликоля в двухклеточном эмбрионе мыши.

3.3.2. Анализ одноклеточного эмбриона мыши после энуклеации.

3.3.3. Анализ клоногенной нейросферы человека.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Динамика внутриклеточной концентрации калия в разных фазах развития раннего эмбриона мыши"

В регуляции указанных каналов принимают участие разные механизмы: отмечают роль цитоскелета (Medina, Bregestovski, 1988; Yazaki et al., 1995), изменение уровня фосфорилирования (Medina, Bregestovski, 1991; Villaz et al., 1995) и изменение в комплексообразовании белков в цитоплазматической мембране, обусловленное фазами клеточного цикла (Takahashi et al., 1993). Так, активность R eag (ether-go-go) К+-канала крысы, экспрессированного в ооците лягушки Xenopus, усиливалась в фазе G2/M за счет активации циклинзависимой киназы 1 (Brugemann et al., 1997).

Для раннего зародыша мыши обнаружен калиевый канал с высокой проводимостью (240 pS), активность которого синхронизирована с первым клеточным циклом (Day et al., 1993, 1998, 2001). Показано, что активность 240 pS К+-канала не зависит от синтеза белков, а его цикличность сохраняется и в энуклеированной зиготе. Канал функционирует независимо от ядерного цикла, но опосредованно взаимодействует с ним. Например, для работы 240 pS К+-канала требуется присутствие циклинзависимой киназы (cdkl -циклин В), а посредником является митогенактвируемая протеинкиназа (MAP-kinase), которая активна в метафазе второго мейотического деления ооцита и М-фазе первого клеточного цикла (Moos et al., 1995). Снижение активности 240 pS К+-калиевого канала в S/02-фазе, по-видимому, обусловлено активацией тирозинкиназы.

Для эмбриона мыши высокий уровень Ыа+/К+-АТФазы регистрируется только на стадии бластоцисты (Powers, Tupper, 1977; Watson, Kidder, 1988; Manjewala et al., 1989; VanWikle, Campione, 1991). При низком активном транспорте калия 240 pS К+-канал может играть ключевую роль в регуляции внутриклеточного ионного баланса раннего эмбриона, определяя циклический характер его изменений. На фоне редуцированных митохондрий в доимплантационный период зародыш развивается в гипоксической среде (Harvey et al., 2002). Энергетическое обеспечение клетки через анаэробный гликолиз индуцирует образование протонов и лактат-анионов (Allen, Orchard, 1987). В мембране клетки активизируется комплекс ионтранспортирующих систем, направленных на компенсацию цитоплазматического ацидоза и лактоза (Погорелов и др., 2000, 2002, 2004; Pierce, Czubryt, 1995).

Для специализированной клетки известна система специфичных механизмов регуляции баланса ионов при гипоксии, когда ситуация рассматривается как экстремальная. На ранней стадии развития эмбриона млекопитающих условия гипоксии, по-видимому, являются физиологической нормой, то есть на стадии зиготы должен проявляться устойчивый эффект интегративной активности эволюционно-обусловленных систем ионного транспорта, формирующих специфический внутриклеточный калиевый баланс. Изменения цитоплазматической концентрации иона К+ обусловливают молекулярно-генетические преобразования в клетке: рекомбинацию и деградацию ДНК (Parkinson et al., 2002), экспрессию генов (Taurin et al., 2002), полимеризацию/деполимеризацию актина -структурного элемента цитоскелета (Goldmann, 2003).

Таким образом, для понимания особенностей физиологии эмбриона млекопитающих на ранних стадиях доимплантационного развития актуальным является изучение соотношения уровня цитоплазматического калия и фаз первого клеточного цикла. Однако не было установлено, регистрируется ли в ооците в метафазе II мейоза низкая концентрация калия, в какой степени цикличность кариокинеза в процессе делений дробления связана с изменением концентрации калия в цитоплазме, возможно ли депонирование калия в клеточных компартментах и какова роль этого явления в регуляции функции эмбриона. Развитие электронно-зондового микроанализа (Вигстпа е1 а1., 1985; Ргае1еска оХ. а1., 1988; Ро§оге1оу ег а1., 1991; 1994) позволяет разработать адекватный подход к решению данных проблем. Этому посвящена настоящая работа.

Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в исследовании динамики внутриклеточной концентрации калия в разных фазах развития раннего эмбриона мыши, в разработке технологии электронно-зондового микроанализа цитоплазматической концентрации элементов применительно к клеткам раннего эмбриона млекопитающих.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие основные задачи:

1) разработать методику получения полутонких срезов раннего эмбриона мыши для электронно-зондового микроанализа;

2) разработать метод расчета концентрации элементов в срезах раннего зародыша мыши по данным электронно-зондового микроанализа;

3) определить концентрацию калия в ооцитах мыши в метафазе II мейоза;

4) изучить изменение во времени цитоплазматического калия в фазах развития зиготы мыши;

5) определить концентрацию калия и натрия в бластомере двухклеточного эмбриона мыши;

6) оценить влияние микрохирургических манипуляций, производимых при пересадке ядра специализированной клетки в зиготу мыши, на содержание цитоплазматического калия в клетках эмбриона;

7) оценить изменение концентрации калия в бластомере двухклеточного эмбриона мыши после эквилибрации в протоколе криоконсервирования;

8) изучить распределение калия в клеточном клоне, формируемом при культивировании нейральной стволовой клетки.

Научная новизна. Впервые при использовании технологии электронно-зондового микроанализа определена цитоплазматическая концентрация элементов (К, Иа, Р) в эмбрионе мыши на начальных стадиях доимплантационного развития. Прямым измерением показано, что в цитоплазме ооцита мыши на стадии метафазы II мейоза регистрируется низкая концентрация калия (~60 мМ). Впервые выявлено, что содержание калия в одноклеточном эмбрионе мыши меняется циклически со временем. Изменение цитоплазматической концентрации калия синхронизировано с фазами первого клеточного цикла мыши. В врфазе наблюдается относительно низкий уровень (~70 мМ) элемента, концентрация которого в Б-фазе увеличивается (~160 мМ) и вновь падает (-110 мМ) в вг-фазе. Уменьшение в цитоплазме зиготы содержания калия до ~45 мМ продолжается в митозе и только на его заключительной стадии концентрация данного элемента восстанавливается до ~80 мМ. Причиной этого может быть цикличность в работе 240 р8 К+-канала, которая не зависит от ядерного цикла.

Впервые показано, что калий в одноклеточном эмбрионе распределен неоднородно и характер его гетерогенного распределения меняется в течение первого клеточного цикла. Дефицит калия, который образуется в примембранной области при активации 240 р8 К+-канала, индуцирует деполимеризацию актина в периферической цитоплазме.

Впервые оценена величина эффективного коэффициента диффузии калия в зиготе мыши в в^Б-фазе, которая находится в интервале от 10'13 до 10*14 м2/с.

Теоретическая значимость. Представлены новые данные о динамике изменения концентрации калия в зиготе мыши, на фоне которого реализуются основные молекулярно-генетические события раннего эмбриогенеза.

Предложен оригинальный механизм сближения пронуклеусов в зиготе мыши, согласно которому причиной направленной миграции органелл является перемещение к центру зиготы фронта гель-актиновой структуры, формируемой при ингибировании 240 рЭ К+-канала на стадии О^Б-фазы.

Практическая значимость. Разработана технология электронно-зондового микроанализа содержания калия в эмбриональной клетке мыши на ранних стадиях доимплантационного периода, которая последовательно включает получение интактного зародыша, подготовку полутонких срезов эмбриона, измерение внутриклеточной концентрации калия. Предложенные методические приемы могут быть применены и к другим одиночным биологическим объектам, малые размеры которых затрудняют использование традиционных в цитологии подходов.

Предложен метод тестирования влияния эквилибрации/отмывки криопротектора в протоколе криоконсервирования зародышей млекопитающих по критерию концентрации калия в бластомере.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В течение первого клеточного цикла, в результате интегративной активности ионтранспортирующих систем катиона К+, внутриклеточная концентрация калия в зиготе мыши возрастает на стадии Gi/S-фазы от 60 мМ до 148 мМ и уменьшается до 44 мМ в профазе митоза.

3. Разработана феноменологическая модель калийобусловленной полимеризации актина в зиготе мыши, которая позволяет объяснить сближение пронуклеусов.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на конференциях «Сохранение генетических ресурсов» (Санкт-Петербург, 2004), «Biological Motility» (Пущино, 2004); «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия» (Санкт-Петербург, 2004), II International Congress «Biotechnology: state of the art and prospects of development» (Москва, 2004), XIV Российском симпозиуме по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел (Черноголовка, 2005), V Сибирском физиологическом съезде (Томск, 2005), на II Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2005), на межлабораторной научной конференции НИИ Морфологии человека (Москва, 2005) и ИТЭБ

РАН (Пущино, 2005), на межлабораторном семинаре Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2005).

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Гольдштейн, Дмитрий Вадимович

выводы

1. Интегративная активность систем транспорта иона К+ на мембране зиготы индуцирует колебания концентрации цитоплазматического калия от 44 мМ до 148 мМ в течение первого клеточного цикла. в^-фаза характеризуется накоплением внутриклеточного калия с последующим уменьшением его содержания в З/Ог-фазе, которое достигает минимального значения в профазе митоза.

2. Пространственное распределение калия в зиготе мыши обусловлено фазой клеточного цикла и характеризуется высоким градиентом концентрации данного элемента между кортикальной и центральной зонами цитоплазмы. Эффективный коэффициент диффузии иона К в цитоплазме зиготы достигает 10' м /с, что на несколько порядков меньше значения, принятого для водного

О О раствора электролита (2 X10" м/с).

4. Сформулирована феноменологическая модель калийобусловленной полимеризации актина в зиготе мыши, в которой ключевая роль в регуляции кинетики калиевого баланса отводится 240 pS К+-каналу. В рамках модели перемещение фронта гель-актиновой структуры принимает участие в сближении пронуклеусов.

6. Показана эффективность разработанной технологии ЕРМА для оценки травматичности манипуляций с одиночной клеткой по критерию сохранности внутриклеточной концентрации калия при энуклеации зиготы. На примере протоколов криоконсервирования эмбрионов и культивирования нейросфер продемонстрирована возможность контроля биотехнологий методом ЕРМА.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Из феноменологической теории следует, что митотическое деление дифференцированной клетки связано с рядом условий: с повышением внутриклеточной концентрации натрия, с уменьшением по абсолютной величине мембранного потенциала, с приобретением клеткой сферической формы. Дальнейшие исследования показали, что подготовка к митозу проходит на фоне последовательных событий, определяющих изменение внутриклеточного калиевого баланса. Термином «баланс» обозначают равновесное состояние клетки, при котором ситуация характеризуется квазистационарными процессами.

Клетка раннего эмбриона отличается от специализированной по ряду критериев. Вплоть до стадии бластоцисты прогнозируется наличие внутриклеточного дефицита калия, обусловленного низким уровнем Ыа+/К+-АТФазы. В эмбриональной клетке должен накапливаться натрий, что связано не с компенсацией клеточного ацидоза, а с транспортом кальция из цитоплазмы через Ыа+/Са2+-обмен. Изменение Ыа/К-баланса индуцирует электроосмотический эффект, который проявится в уменьшении (по абсолютной величине) мембранного потенциала и в приобретении клеткой, как правило, сферической формы.

Особый интерес вызывают механизмы регуляции развития одноклеточного эмбриона. Это уникальное состояние, при котором в пространственных рамках зиготы осуществляется переход от мейотического способа деления к митозу, полностью преобразующий функциональные свойства эмбриональной клетки. В течение первого клеточного цикла одновременно реализуются две клеточные программы - завершение развития ооцита и начало дифференцировки. В этот период раннего эмбриогенеза возникает тотипотентность бластомера, которая, расщепляясь в процессе морфогенеза, трансформируется в функциональную множественность разных типов специализированных клеток.

Уникальность зиготы млекопитающих проявляется не только в особенности самой клетки, но и в условиях ее окружения. На начальной стадии развития раннего зародыша редуцировано окислительное фосфорилирование — эффективная система синтеза АТФ. При этом в полном объеме не сложился комплекс ферментов, поддерживающий гликолиз — более древний способ обеспечения клетки энергией. Развитие зиготы млекопитающих происходит в гипоксических условиях, которые служат фоном нормального развития эмбриональной клетки. Для специализированной клетки гипоксия является экстремальной ситуацией, требующей активизации комплекса адаптивных ионтранспортирующих механизмов. У зиготы отсутствуют или редуцированы механизмы, например, ИаТнГ-обмен или №+/К+-АТФаза, которые обязательно присутствуют на мембране дифференцированной клетки, и в то же время активны механизмы, характерные только для раннего эмбриона млекопитающих -обратный Иа+/Са2+-обмен или 240 pS К+-канал.

Указанные различия позволяют предположить, что регуляция ионного баланса эмбриональной клетки осуществляется эволюционно обусловленными механизмами, которые теряют свою активность после имплантации в процессе «кислородной» дифференцировки. По-видимому, трансформация системы транспорта ионов начинается уже в предымлантанционный период развития эмбриона. Первый пик транскрипции ДНК de novo соотносится с активацией генома зиготы. Пока не понятно, на стадии транскрипции, трансляции или модификации белков, встроенных в мембрану клетки, осуществляется комплектация ионтранспортрирующей системы в течение первого клеточного цикла.

Особенность в обеспечении зиготы энергией, отсутствие у нее системы транспорта ионов, характерной для специализированной клетки, наличие специфических ионтранспортирующих систем предполагает формирование особого калиевого баланса, который должен меняться и быть синхронизирован с фазами первого клеточного цикла, индуцируя молекулярно-генетические изменения в эмбрионе. Несмотря на интерес к этой проблеме, исследование внутриклеточного калия в зиготе млекопитающих было невозможным, так как отсутствовали прямые методы, позволяющие проводить микроанализ элементов в зиготе млекопитающих. Разработанная нами технология электронно-зондового микроанализа с привлечением криогенных подходов электронной микроскопии и приемов микрокультивирования позволила решить проблему измерения внутриклеточной концентрации элементов в эмбрионе.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Гольдштейн, Дмитрий Вадимович, Москва

1. Березовская, О.П. Метод культивирован ранних эмбрионов линейных мышей / О.П. Березовская, Л.М. Межевикина, Б.Н. Вепринцев // Онтогенез .- 1986. Т. 17.- С. 553-555.

2. Божкова, В.П. Специфическая роль ионов в предзародышевом и зародышевом развитии / В.П. Божкова, Л.М. Чайлахян // Проблемы биологии развития. Внешняя среда и развивающийся организм .- М. : Наука, 1977.

3. Буровина, И.В. Распределение натрия, магния и кальция в ооцитах травяной лягушки по данным рентгеновского анализа / И.В. Буровина, И.В. Пивоварова, А.Г. Погорелов // Цитология .- 1982 .- Т. 24 .- С. 569-576.

4. Вермель, А.Е. Стволовые клетки: общая характеристика и перспективы применения в клинической практике / А.Е. Вермель // Клиническая медицина 2004.- № 1.- С. 5-11.

5. Гольдштейн, Д.В. Анализ калия в бластомере двухклеточного эмбриона мыши после эквилибрации и отмывки криопротектора / Д.В. Гольдштейн, Е.И. Смольянинова, А.Г. Погорелов // Бюллетеньэкспериментальной биологии и медицины 2004 (а) .-Т. 138 С. 4849.

6. Изменение внутриклеточной концентрации калия в одноклеточном эмбрионе мыши после энуклеации / Д.В. Гольдштейн и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2004 (б) .- Т. 138 .-С. 275-276.

7. Циклические изменения цитоплазматической концентрации калия в зиготе мыши / Д.В. Гольдштейн и др. // Биологические мембраны .2005 .- Т. 22 . № 4 .- С. 321-325.

8. Грибакин, Ф.Г. Исследование содержания и распределения калия в фоторецепторах сложного глаза сверчка методом рентгеновскогомикроанализа / Ф.Г. Грибакин, А.Г. Погорел ов, И.В. Буровина // Цитология 1976.- Т. 18 .- С. 1176-1179.

9. Клячко, H.J1. Биологическая подвижность и полимеризация актина / H.JI. Клячко // Соросовский образовательный журнал (Биология) .2000 .-Т. 6.-№10.

10. Электронно-зондовый микроанализ концентрации калия и фосфора в ооцитах и одноклеточных эмбрионах мыши / А.Г. Погорелов и др. // Онтогенез .- 2005 (б) .- Т. 36 .- С. 123-127.

11. Репин, B.C. Эмбриональные стволовые клетки: фундаментальная биология и медицина / B.C. Репин, А.А. Ржаникова, Д.А. Шаменков .М.: РеМеТэкс, 2002.

12. Тихонов, А.Н. Уравнения математической физики / А.Н. Тихонов, А.А. Самарский .- М. : Наука , 1972.

13. Чайлахян, JI.M. Эффективность микрохирургического удаления ядер у ранних зародышей мышей в зависимости от времени до деления дробления / JI.M. Чайлахян, Т.А. Свиридова, Б.Н. Вепринцев // Онтогенез .- 1989 .- Т. 20 .- С. 33-39.

14. Preparation of individual human diploid fibroblasts and study of ion transport / E. H. Abraham et al // Am. J. Physiol1985 .- № 248 .- P. 154164.

15. Electron probe X-ray microanalysis of intracellular sodium, potassium and chlorine contents in amphibian motoneorones / B.L. Allakhverdov et al // Neuroscience .- 1980 № 5 P. 2023-2031.

16. Allachverdov, B.L. Some aspects of developing instruments for cryomethods / B.L. Allachverdov, S.B. Kuzminykh // Acta histochem .1981 .- Suppl. XXIIIP. 75-82.

17. Avdonin, V. Dihydropyridine Action on Voltage-dependent Potassium Channels Expressed in Xenopus Oocytes / V. Avdonin, E.F. Shibata, T. Hoshi // Gen. Physiol1997 № 109 .- P. 169-180.

18. Baltz J.M. Apparent absence of Na+/H+ antiport activity in the two-cell mouse embryo / J.M. Baltz, J.D. Biggers, C. Lechene // Dev. Biol.- 1990 .-№ 138 P. 421-429.

19. Baltz, J.M. Two-cell stage mouse embryos appear to lack mechanisms for alleviating intracellular acid loads / J.M. Baltz, J.D. Biggers, C. Lechene // J. Biol. Chem. .-1991 .- № 266 P. 6052-6057.

20. Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization / A. Bez et al // Brain Res. .- 2003 .- № 993 .-P. 18-29.

21. Bezanilla, F. Gating currents / F. Bezanilla, E. Stefani // Methods Enzymol .- 1998 .-№293 .-P. 331-352.

22. Biggers, J.D. Physiological aspects of growth and development of the preimplantation mammalian embryos / J.D. Biggers, R.M. Borland // Annu. Rev. Physiol.- 1976 .- № 38 .- P. 95-119.

23. Biggers, J.D. Comments on the control of meotic maturation in mammals / J.D. Biggers, R. Powers // In: Ovarian follicular development and function

24. NY. : Raven Press , 1978 . Biggers, J.D. Ouabain-sensitive fluid accumukation and ion transport by rabbit blastocysts / J.D. Biggers, R.M. Borland, C.P. Lechene // J. Physiol. .- 1978 .-№280 P. 319-330.

25. Blumenthal, E.M. Modulation by cAMP of a slowly activating potassium channel expressed in Xenopus oocytes / E.M. Blumental, L.K. Kaczmarek // J Neuroscience .- 1992 № 12 P. 290-296.

26. Blumenthal, E.M. The minK potassium channel exists in functional and nonfunctional forms when expressed in the plasma membrane of Xenopusoocytes / E.M. Blumenthal, L.K. Kaczmarek // J Neuroscience .- 1994 № 14 .-P. 3097-3105.

27. Boonstra, J. Monovalent cation transport during the cell cycle / J. Boonstra et al // Anticancer Res.- 1982 № 2 P. 265-274.

28. Bregestovski, P. Regulation of potassium conductance in the cellular membrane at early embryogenesis / P. Bregestovski, J. Medina, E. Goyda // J. Physiol. (Paris) .- 1992 .- № 86 P. 109-115.

29. Alteration of ultrastructure and elemental composition in cultured neonatalrat cardiac myocytes after metabolic inhibition with iodoacetic acid / L.M.

30. Buja et al // Lab. Invest.1995 № 53 .- P. 397-412.

31. Burdon, R.H. Control of cell proliferation by reactive oxygen species /

32. R.H. Burdon // Biochemical Society Transactions .- 1996 .- № 24 .- P.1028-1032.

33. Burovina, I.V Ultrastructural localization of potassium and calcium in an insect ommatidium as demonstrated by X-ray microanalysis / I.V. Burovina et al // J. Comp. Physiology .- 1978 № 127 .- P. 245-253.

34. Camilion de Hurtado, M.C. An electrogenic sodium-bicarbonate cotransport in the regulation of myocardial intracellular pH / M.C. Camilion de Hurtado, N.G. Perez, H.E. Cingolani // J Mol Cell Cardiol. .1985 .-№27 .- P. 231-242.

35. Role of an electrogenic Na(+)-HC03- cotransport in determining myocardial pHi after an increase in heart rate / M.C. Camilion de Hurtado et al // Circ Res.- 1996 .- № 79.- P. 698-704.

36. Cantor, G.M. 3D reconstruction of mouce embryos on the early stages of preimplantation development / G.M. Cantor et al // In: Int. symposium "Biological Motility" Puschino , 2004.

37. Cha, A. Characterizing voltage-dependent conformational changes in the Shaker K channel with fluorescence / A. Cha, F. Bezanilla // Neuron .1997 .-№ 19 .-P. 1127-1140.

38. Chandy, K.G. Voltage-gaited potassium channels are required for humen lymphocytes-T activation / K.G. Chandy et al // J. Exp. Med. .- 1984 .- № 160 .- P. 369-385.

39. Chandler, J.A. A method for preparing absolute standards for quantitative calibration and measurement of section thickness with X-ray microanalysis of biological ultrathin specimens in EPMA / J.A. Chandler // J. Microscopy .- 1976.-№ 106 .-P. 291-302.

40. Chatot, C.L. An improved culture medium supports development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro / C.L. Chatot // J. Reproduction and Fertility .- 1989 .- № 86 .- P. 679-688.

41. Chen, M.S. Evidence that Distinct States of the Integrin a6bl Interact with Laminin and an ADAM / M.S. Chen et al // J. Cell Biology .- 1999 .- № 144 .- P. 549-561.

42. Cone, C.D Jr. Electroosmotic interactions accompanying mitosis initiation in sarcoma cells in vitro / C.D Jr. Cone // Trans.N.Y. : Acad. Sci. 31 .-P. 404-427.

43. Cone, C.D Jr. Variation of the transmembrane potential level as a basic mechanism of mitosis control / C.D. Cone, M. Tongier // Oncology .- 1970 .-№24 .- P. 438-470.

44. Cone, C.DJr. Unified theory on the basic mechanism of normal mitotic control and oncogenesis / C.D.Jr. Cone // J. theor. Biol. .- 1971 .- № 30 .P. 151-182.

45. Cosslet, V.E. Penetration and energy loss of electrons in solid targets / V.E. Cosslet et al // In: Electron microprobe .- NY. : John Wiley, 1966 .- P. 248-268.

46. Crespo, L.M. Kinetics, stoichiometry and role of the Na+-Ca2+ exchangermechanism in isolated cardiac myocytes / L.M. Crespo, C.J. Granham,

47. M.B. Cannell //Nature .- 1990 .- № 345 .- P 618-621.

48. Davis, A.A. A self-renewing multipotential stem cell in embryonic ratcerebral cortex / A.A. Davis, S. Temple // Nature .- 1994 .- № 372 .- P.263.266.

49. Demsey, G.P. A cooper block method for freezing non-cryoprotected tissue to produce ice-crystals free region for electron microscopy / G.P. Demsey, S. Bullivan // J. of Microscopy .- 1976 .- № 106 .- P. 251-260.1. A ,

50. Donnay, I. Embryo metabolism during expansion of the bovine blastocyst / I. Donnay, H.J. Leese // Molecular Reproduction and Development.- 1999 .-№53 .- P. 171-178.

51. Preparation of freeze-dried cryosections for quantitative X-ray microanalysis of electrolytes in biological soft tissues / A. Dorge et al // Pflugers Arch 1978 № 373 P. 85-94.

52. Dowell, L.G. Low-temperature forms of ice as studied by X-ray diffraction /L.G. Dowell, A.P. Rinfret //Nature .- 1960 .- № 188 P. 144-146. The differentiation of preimplantation mouse embryos / M. Drovak et al // Brno: J.E. Purkyne University .- 1985.

53. Echlin, P. Low-temperature microscopy and analysis / P. Echlin // New York.: Plenum Press, 1992 P. 540.

54. Polymeric cryoprotectants in the preservation of biological ultrastructure. II. Physiological effects / P. Echlin et al // J. of Microscopy .- 1977 .- № 110 P. 339-257.

55. Edie, J.W. A routine method for object thickness determination in the transmission electron microscope / J.W. Edie, H.L. Karlsson // J. Microscopie .- 1972 № 13 P. 13-30.

56. Ferguson, E.M. Triglyceride content of bovine oocytes and early embryos / E.M. Ferguson, H.J.B. Leese // J. Reproduction and Fertility .- 1999 .- № 116.- P. 373-378.

57. Eranko, O. Quenching of tissue for freeze-drying / O. Eranko // Acta Anat. .- 1954 .-№22 .-P. 331-336.

58. Practical methods in electron microscopy / A.M. Glauert et al // North-Holland Publishing Company Amsterdam, New York : Oxford .- 1977. Methods of biochemical analysis / D. Glick et al // John Wiley & Sons .New York, London, Sydney , 1969 .- XV.

59. Guerin, P. Oxidative stress and protection against reactive oxygen species in the pre-implantation embryo and its surrounding / P. Guerin, S. El Mouatassim, Y. Menezo // Human Reproduciton Update .- 2001 № 7 P. 175-189.

60. Gurdon, J.B. The cytoplasmic control of nuclear activity in animal development / J.B. Gurdon, H.R. Woodland // Biol. Rev.- 1968 .- № 43 .P. 233-267.

61. Halestrap, A.P. Measurement of membrane transport phenomena / A.P. Halestrap et al // In: Techniques in metabolic research .- Amsterdam. : Elsevier/North Holland , 1979 B 206 .- P. 1-23.

62. Hall, T.A. The microprobe assay of chemical elements / T.A. Hall et al // In: Physical techniques in biological research NY. : Academic Press , 1971 .-P. 157-275.

63. Hall, T.A Microprobe analysis as applied to cells and tissues / T.A. Hall .NY.: Academic Press, 1974 .

64. EDS quantitation and application to biology / T.A. Hall et al // In: Introduction to Analytical Electron Microscopy New York : Plenum Press, 1979 .-P. 169-197.

65. Harvey, A.J. REDOX regulation of early embryo development / A.J. Harvey, K.L. Kind, J.G. Thompson // Reproduction .- 2002 .- № 123 .- P. 479-486.

66. Principles and techniques of scanning electron microscopy / M.A. Hayat et al NY. : Academic Press , 1974 V. 4 .

67. He, Z. Cryopreservation of nuclear material as a potential method of fertility preservation / Z. He, H.C. Liu, Z. Rosenwaks // Fertil Steril. .2003 .- № 79 .- P. 347-354.

68. Heinrich, K.F.I. Electron beam X-ray microanalysis / K.F.I. Heinrich .NY.: Academic Press , 1982.

69. Hempling, H.G. Potassium and sodium movements in the Ehrlich mouse ascites tumor cell / H.G. Hempling // J. Gen. Physiol. 1958 .- № 41 .- P. 565-583.

70. Hodgkin, A.L. The effect of sodium ions on the electrical activity of the giant axon of the squid / A.L. Hodgkin, B. Katz // J. Physiol. 1949 .- № 108 .- P. 37-77.

71. Hodgkin, A.L. Currents carried by sodium and potassium ions through the membrane of the giant axon of LOLIGO / A.L. Hodgkin, A.F. Huxley // J. Physiol.- 1952 .-№116.- P. 449-472.

72. Homa, S.T. The role of calcium in mammalian oocyte maturation and egg activation / S.T. Homa, J. Carroll, K. Swann // Human Reproduction .1993 .-№8.-P. 1274-1281.

73. Johnstone, B.M. Micro-electrode penetration of ascites tumour cells / B.M. Johnstone 11 Nature 1959 .- № 183 P. 411.

74. Kline, D. Repetitive calcium transients and the role of calcium in exocytosis and cell cycle activation in the mouse egg / D. Kline, T.J. Kline // Develop. Biology 1992 .- № 145 .- P. 80-89.

75. Komnick, H. Elektronen mikroskopische lokalization von Na+ und CI" in Zellen und Gevelen / H. Komnick // Protoplasma 1962 .- № 14 P. 414418.

76. Kopen, G.C. Marrow stromal cells migrate throughout forebrain andcerebellum and they differentiate into astrocytes after injection intoneonatal mouse brains / G.C. Kopen, D.J. Prockop, D.G. Phinney // Proc.

77. Natl. Acad. Sei.- 1999 .- № 96 .- P. 10711- 10716.

78. CI- -HC03- exchange in developing neonatal rat cardiac cells. Biochemicalidentification and immunolocalization of band 3-like proteins / I.

79. Korichneva et al // Circ Res.- 1995 .- № 77 .- P. 556-564.

80. Krag, K.T. A Method for Freezing early mourine embryos by plungingdirectly into liquid nitrogen / K.T. Krag, I.M. Koehler, R.W. Wright //

81. Theriogenology .- 1985 .- № 22 .- P. 119-123.

82. Transfection of wild-type CFTR into cystic fibrosis lymphocytes restores chloride conductance at Gj of the cell cycle / R.D. Krauss et al // The EMBO J.- 1992 .-№11 .- P. 875-883.

83. A nestinnegative precursor cell from the adult mouse brain gives rise to neurons and glia / V.G. Kukekov et al // Glia .- 1999 .- № 21 .- P. 399407.

84. Monovalent cations, cell proliferation, and cancer: An overview. Ions, Cell proliferation, and Cancer / H.L. Leffert et al.- NY. : Academic Press , 1982 .- P. 93-103.

85. Selective blockers of voltage-gated K channels depolarize human T lymphocytes: mechanism of the antiproliferation effect charybdotoxin / R.J. Leonard et al // Proc. Natl. Acad. Sci. USA .- 1992 № 89 .- P. 10094-10098.

86. Ooplasmic influence on nuclear function during the metaphase II-interphase transition in mouse oocytes / H. Liu et al // Biol Reprod.- 2001 .-№65 .-P. 1794-1799.

87. Metaphase II nuclei generated by germinal vesicle transfer in mouse oocytes support embryonic development to term / H. Liu et al // Hum Reprod.- 2003 .- № 18 .- P. 1903-1907.

88. Centrosome reduction during mouse spermiogenesis / G. Manandhar et al // Dev. Biol.- 1998 .- № 203 P. 424-440.

89. Manejwala, F.M. Blastocoel expansion in the preimplantation mouse embryo: role of extracellular sodium and chloride and possible apical routes of their entry / F.M. Manejwala, E.J. Cragoe, R.M. Schultz // Dev. Biol.1989 .- № 133 P. 210-220.

90. Mehlman, L.M. Regulation of intracellular calcium in tha mouse egg: calcium release in response to sperm or inositol triphosphate is enhanced after meiotic maturation / L.M. Mehlman, D. Kline // Biology of Reproduction .- 1994 № 51 .- P. 1088-1098.

91. Meryman, H.T. Principles of freeze-drying / H.T. Meryman // Annals NY Acad. Sciences .- 1966 .- № 85 .- P. 630-640.

92. Turning blood into brain: cells bearing neuronal antigens generated in vivo from bone marrow / E. Mezey et al // Science .- 2000 .- № 290 .- P. 17791782.

93. Minami, N. Early embryonic-development under oviductal influence in vitro /N. Minami // Animal reproduction science .- 1996 .- № 42 .- P. 361369.

94. Misell, D.L. Determination of the mass thickness of biological sections from electron micrographs / D.L. Misell, I.D.J. Burdett // J. of Microscopy .- 1977 .-№109 .-P. 171-182.

95. Pyruvate prevents peroxide-induced injury of in vitro preimplantation bovine embryos / H. Morales et al // Molecular Reproduction and Development1999 № 52 .- P. 149-157.

96. Hematopoietic competence is a rare property of neural stem cells that may depend on genetic and epigenetic alterations / C.M. Morshead et al // Nat. Med.- 2002 .- № 8 .- P. 268-273.

97. Mroz, E.A. Electron probe analysis of isolated golffish hair cells: implications for preparing healthy cells / E.A. Mroz, K.R. Nissim, C. Lechene // Hearing Res.- 1993 .- № 70 .- P. 9-21.

98. Mysels, K.J. Introduction to Colloid Chemistry / K.L. Mysels .- New York : Interscience, 1959.

99. Navara, C.S. Microtubule organization in the cow during fertilization, polyspermy, parthenogenesis, and nuclear transfer: the role of the sperm aster / C.S. Navara, N.L. First, G. Schatten // Dev. Biol.- 1994 .- № 162 .P. 29-40.

100. Concentrations of energy substrates in oviduct fluid in unilaterally ovariectomised pigs / R. Nichol et al // Research in Veterinary Science .1998 .-№65 .- P. 263-264.

101. Noma, A. ATP-regulated K channels in cardiac muscle / A. Noma // Nature .- 1983 .- № 305 .- P. 147-148.

102. Nose, K. Role of reactive oxygen species in the regulation of physiological functions / K. Nose // Biological Pharmacology Bulletin .- 2000 .- № 23 .P. 897-903.

103. Human neural stem cells express extra-neural markers / E.A. Parati et al // Brain Res.- 2002 .- № 925 P. 213- 221.

104. Pierce, G.N. The contribution of ionic imbalance to ischemia/reperfiision-induced injury / G.N. Pierce, M.P. Czubryt // J.Mol.Cell.Cardiol.- 1995 .№27 .-P. 53-63.

105. Piotrowska, K. Role for sperm in spatial patterning of the early mouse embryo / K. Piotrowska, M. Zernicka-Goetz // Nature . 2001 . - № 409: -P. 517-521.

106. Plusa, B. Sperm entry position provides a surface marker for the first cleavage plane of the mouse zygote / B. Plusa, K. Piotrowska, M. Zernicka-Goetz// Genesis .- 2002 .- № 32 .- P. 193-198.

107. Pogorelov, A.G. Microprobe quantitation procedure that calculates concentrations of chemical elements in soft biological tissue sections / A.G.

108. Pogorelov, B.L. Allachverdov // Micron & Microsc. Acta 1984 № 15 .P. 177-180.

109. Pogorelov, A. Quantitation procedure for calculating the sensitivity of X-ray microanalysis of biological thin sections / A. Pogorelov // Micron Microsc. Acta .- 1987 .- № 18 .- P. 159-163.

110. Pogorelov, A. Rat small intestine epithelium mucus as a depot of potassium and chlorine / A. Pogorelov, G. Mazay, V. Pogorelova // Proc. 12 .- 1990 .- № ICXOM .- P. 600-603.

111. Study of potassium deficiency in cardiac muscle: quantitative X-ray microanalysis and cryotechniques / A. Pogorelov et al // J. of Microscopy/Oxford .- 1991 № 12 .- P. 24-38.

112. EPMA of dried biological substances / A. Pogorelov et al // Mikrokimica Acta .- 1994 .- № 115/116 .- P. 405-411.

113. The assay of elemental contents (K, Na) of cardiac myocyte in tissue and in suspension with EPMA / A. Pogorelov et al // Royal Microscopical Society Journal1996 № 31 P. 147.

114. Assay of acetylcholinesterase activity and elemental composition in brain compartments by electronprobe microanalysis / A. Pogorelov et al // Brain Research Protocols .- 1997 .- № 1 .- P. 44-48.

115. Powers, R.D. Developmental changes in membrane transport and permeability in the early mouse embryo / R.D. Powers, J.T. Tupper // Dev. Biol.- 1977 .-№56 .-P. 306-315.

116. Ultracytochemical localization and microprobe quantitation of calcium stores on the insect oocyte / A. Przelecka et al // Histochemistry .- 1986 .№85 .-P. 163-168.

117. Rasmussen, H. Ice formation in aqueous systems / H. Rasmussen // J. of Microscopy 1982 .- № 128 .- P. 167-174.

118. Reinsch, S. Mechanisms of nuclear positioning / S. Reinsch, P. Gonczy // J Cell Sci.1998 .-№111.- P. 2283-2295.

119. Rietze, R.L. Mitotically active cells that generate neurons and astrocytes are present in multiple regions of the adult mouse hippocampus / R.L. Rietze, P. Poulin, S. Weiss // J. Comp. Neurol. 2000 .- № 424 .- P. 397408.

120. Rozell, M.D. Changes in concentration of adenosine triphosphate and adenosine diphosphate in individual preimplantation sheep embryos / M.D. Rozell, J.E. Williams, J.E. Butler // Biology of Reproduction 1992 .- № 47 .- P. 866-870.

121. Disruption of actin microfilaments by cytochalasin D leads to activation of p53 / S.N. Rubtsova et al // FEBS Lett.1998 № 430 .- P. 353-357.

122. The direct element ratio model for quantitative analysis of thin sections / J.S. Russ et al // In: Microprobe analysis as applied to Cells and Tissues .NY.: Academic Press , 1974 P. 264-270.

123. The sperm centriole: its inheritance, replication and perpetuation in early human embryos / A.H. Sathananthan et al // Hum. Rerod.- 1996 .- № 11 .P. 345-356.

124. Schaefer, H. Memdranpotentiale von Einzelzellen in Gewebekulturen / H. Schaefer, O. Schanne // Naturwissenschafften .- 1956 .- № 43 .- S. 296297.

125. Schatten, G. The centrosome and its mode of inherence: the reduction of the centrosome during gametogenesis and its restoration during fertilization / G. Schatten // Dev. Biol.- 1994 .- № 165 .- P. 299-335.

126. Seshagiri, P.B. Glucose inhibits development of hamster 8-cell embryos in vitro / P.B. Seshagiri, B.D. Bavister // Biology of Reproduction 1989 .-№ 40 .- P. 599-606.

127. Shuman, H. Quantitative electron probe microanalysis of biological thin section: methods and validity / H. Shuman, A.V. Somlyo, A.P. Somlyo // Ultrmicroscopy .- 1976 № 1 P. 317-339.

128. The paternal inheritance of the centrosome, the cell's microtubule-organizing center, in humans, and the implications for infertility / C. Simerly et al // Nat. Med.1995 .- № 1 .- P. 47-52.

129. Sjogaard, G. Exercise-induced muscle fatigue: the significance of potassium / G. Sjogaard // Acta Physiol. Scandinavica, Supl. .- 1990 № 593 .- P. 3-63.

130. Correlation between potassium and phosphorus content and their nonuniform distribution in Acanthamoeba castellanii / A. Sobota et al // Histochemistry .- 1984 .- № 81 P. 201-204.

131. Stumpf, W.E. High-resolution autoradiography with dry-mounted, freeze-dried frozen sections / W.E. Stumpf, L.J. Roth // J. Histochem. Cytochem. .- 1966 .-№ 13 .-P. 274-281.

132. Sturmey, R.G. Energy metabolism in pig oocytes and early embryos / R.G. Sturmey, H.J. Leese // Reproduction .- 2003 № 126 .- P. 197-204.

133. Dynamic events are differently mediated by microfilaments, microtubules, and mitogen-activated protein kinase during porcine oocyte maturation and fertilization in vitro / Q.Y. Sun et al // Biol. Reprod. .- 2001 .- № 64 .- P. 879-889.

134. Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurospheres / O.N. Suslov et al // Proc. Natl. Acad. Sci. .- 2002 .№99 .-P. 14506-14511.

135. Proteome analysis and functional expression identify mortalin as an antiapoptotic gene induced by elevation of Na+.i/[K+]i ratio in culturedvascular smooth muscle cells / S. Taurin et al // Cire. Res.- 2002 .- № 91 .P. 915-922.

136. Thouas, G.A. The 'GO' system—a novel method of microculture for in vitro development of mouse zygotes to the blastocyst stage / G.A. Thouas, G.M. Jones, A.O. Trounson // Reproduction. 2003 .- № 126 P. 161169.

137. Meiosis, egg activation, and nuclear envelope breakdown are differentially reliant on Ca2+, whereas germinal vesicle breakdown is Ca2+ independent in the mouse oocyte / R.M. Tombes et al // J. Cell Biol.- 1992 .- № 117.-P. 799-811.

138. Trounson, A.O. Ultrrapid freezing: A new low-cost and effective method of embryo cryopreservation / A.O. Trounson, A. Peora, C. Kirby // Fertil.Steril.- 1987 .- № 48 P. 843-850.

139. Tvedt, K.E. A section press and low elemental support for enhanced preparation of freeze-dried cryosections / K.E. Tvedt, G. Kopstad, O.A. Haugen // J. Microsc.- 1984 .- № 133 .- P. 285-290.

140. Quick sampling and perpendicular cryosectioning of cell monolyers for the X-ray microanalysis of diffusible elements / K.E. Tvedt et al // J. Microscopy 1987 .- № 151 P. 49-59.

141. VanWikle, LJ. Ouabain-sensitive Rb+ uptake in mouse eggs and preimplantation conceptuses / L.J. Van Wikle, A.L. Campione // Dev. Biol. .- 1991 .-№ 146 .- P. 158-166.

142. Warburg, O. Verbesserte methode zur messung der autmung und glykolyse / O. Warburg // Biochem. Zeitschrift .- 1924 .- № 152 .- S. 51-63.

143. X-ray microanalysis of HeLa S3 cells. I. Instrumental calibration and analysis of randomly growing cultures / A. Warley et al // J. Cell. Sci. .1983 .-№60 .-P. 217-229.

144. Warley, A. Elemental concentrations in isolated rat thymocytes prepared for cryofixation in the presence of different media / A. Warley // J. Microscopy .- 1986 .- № 144 .- P. 183-191.

145. Warley, A. X-ray microanalysis of cells in suspension and the application of this technique to the study of the thymus gland / A. Warley // Scanning Microsc.- 1987 (a) .- V. I.- P. 1759-1770.

146. Wenger, R.H. Mammalian oxygen sensing, signalling and gene regulation / R.H. Wenger // Journal of Experimental Biology .- 2000 .- № 203 .- P. 1253-1263.

147. HIF-1 and the molecular response to hypoxia in mammals / R.H. Wenger et al // In: Environmental Stress and Gene Regulation .- Oxford : BIOS Scientific Publishers Ltd , 1999 .- P. 25-45.

148. Whitaker, M. Lighting he fuse at fertilization / M. Whitaker, K. Swann // Development.- 1993 .- № 11 .- P. 71-112.

149. Wildhaber, I. The control of freeze-drying with deuterium oxide (3D20) / I. Wildhaber, H. Gross, H. Moor // J. Ultrastruct. Res. .- 1982.- № 80 .- P. 367-373.

150. Wilson, L. Development of mouse embryos cryopreserved by an ultrarapid method of freezing / L. Wilson, P. Quinn // Hum. Reprod. .- 1989 № 4 .- P. 86-90.

151. Wodarz, A. Establishing cell polarity in development / A. Wodarz // Nature Cell Biol.- 2002 .- № 4 E. 39-44.

152. Wonderlin, W.F. Potassium channels, proliferation and Gi progression / W.F. Wonderlin, J.S. Strobl // J. Membr. Biol. .- 1996 .- № 154.- P. 91107.

153. Wroblewski, J. X-ray microanalysis of single and cultured cells / J. Wroblewski, G.M. Roomans // Scanning Electron Microsc.r 1984.- № IV .P. 1875-1882.

154. X-ray microanalysis of cultured mammalian cells / J. Wroblewski et al // In: X-ray microanalysis in biology: Experimental techniques and applications .- Cambridge : Cambridge University Press , 1993 .- P. 317329.

155. Microtubule and chromatin dynamics during fertilization and early development in rhesus monkeys, and 425 regulation by intracellular calcium ions / G.J. Wu et al // Biol. Reprod.- 1996 .- № 55 .- P. 260-270.

156. Xu, B. Induction of human myeloblastic ML-1 cell Gj arrest by suppression of K+ channel activity / B. Xu, B.A. Wilson, L.Lu // Am. J. Physiol.- 1996.- № 271.- P. 2037-2044.

157. Yazaki, I. Cytoskeletal elements link calcium-channel activity and the cell-cycle in early sea-urchin embryos / I. Yazaki, E. Tosti, B. Dale // Development.- 1995 .-№ 121 P. 1827-1831.

158. Correlation of malignancy with the intracellular Na+:K+ ratio in human thyroid tumors /1. Zs-Nagy et al. // Cancer Res.1983 .- № 43 .- P. 53955402.

Информация о работе

Гольдштейн, Дмитрий Вадимович
доктора биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.25

Диссертация

Динамика внутриклеточной концентрации калия в разных фазах развития раннего эмбриона мыши - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы