Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка новых подходов к исследованию клеточной адгезии в печени

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Разработка новых подходов к исследованию клеточной адгезии в печени"

. ^ , 0 л"**5-

«лЧ? РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

V

ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Е К КОЛЬЦОВА

На правах рукописи УДК 591.

ТУМАНОВА Наталия Борисовна разработка новых подходов к исследованию

клеточной адгезии в печени

03.00.11 - эмбриология, гистология и цитология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1995

Работа выполнена в Лаборатории клеточной дифференцировки Института биологии развития им. Е К Кольцова РАН

Научный руководитель - кандидат биологических наук

Официальные оппоненты: - академик Российской АЕН,

доктор биологических наук, профессор А. Г. МАЛЕНКОВ . - доктор биологических наук, профессор К Г. ГАЛАКТИОНОВ

Ведущая организация - Российский Государственный Медицинский

на заседании специализированного совета Д. 002.85. 01 при Институте биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН по адресу: Москва, ул. Вавилова, д. 26

В. П. ЯМСКОВА

Университет

Защита диссертации состоится ' 1995.г. в^Уч

часов

*) Г\ „ - /!

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

Е. М. Протопопова

введение

АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ В настоящее время в мировой литературе обозначилась актуальность изучения комплекса клеточной поверхности и межклеточного пространства как единой системы, которая обусловливает пространственно-функциональную организацию клеток в тканях и является важнейшим регулятором основных процессов тканевого гомеостаза САрхипенко, Маленков, 1982; Edelman, Thiery, 1985). Эта система включает в себя эк-страцеллюлярный матрикс , плазматическую мембрану (ПМ) клетки, ультраструктуры межклеточных контактов (МК). Эти структурные компоненты системы являются предметом исследований последних 20 лет, в результате чего были выявлены их строение, функциональная и пространственная взаимозависимость. Прогресс в этих исследованиях был связан с развитием экспериментальных подходов, основанных на электронно-микроскопических (Ольшевская, 1971; Overton, 1974; Gilula, 1978; Ушаков, 1982) и иммунохимических (Gallin et al. , 1983; Geiger et al. , 1983; Hertzberg, Skibbens, 1984; Hatta et al. , 1985) методах исследования. Данные методы позволили определить молекулярную организацию и' ультраструктуру отдельных компонентов интегральной системы. Однако, значительная по площади зона клеточной поверхности, участвующая в межклеточных взаимодействиях, выявляемая электронномикроскопическими методами как пространство, заполненное слабоэлектронноплотным материалом, осталась малоизученной. По мнению ряда авторов, именно эта, наиболее протяженная и лабильная структура Ш, называемая зоной простого соединения (ПС), является весьма важной для осуществления молекулярных механизмов межклеточных взаимодействий, опосредующих регуляцию тканевого гомеостаза (Ушаков, Черненко, 1978; Маленков и др. , 1979; Модянова и др. , 1980). Ранее было показано, что нарушения адгезионных взаимодействий клеток печени между собой и с экстрацеллюлярным матриксом, наблюдаемые в системах in vitro и in vivo, лежат в основе изменения нормальных морфологических реакций клеток, приводящего к их малигнизации (Маленков, Штамм, 1965; Васильев, Маленков, 1968; Модянова и др., 1980; Takeichi et al.., 1981; Архипенко, Рогова, 1982; Бочарова, Модянова, 1982;. Gleiberman et al., 1989). Поэтому, чрезвычайный интерес представляло сравнительное исследование молекулярных механизмов клеточной адгезии в печени животных с^генетической предрасположенностью к спонтанному бластомогенезу и в печени животных, устойчивых по этому признаку, задолго до возникновения бластом.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ. Целью работы являлась разработка нового подхода к изучению адгезионных свойств гепатоцитов с различным состоянием межклеточных контактов у взрослых особей.

Для этого предполагалось решить следующие задачи:

1. Разработать комплекс адгезиометрических методов, поз-

болящих количественно оценивать изменения некоторых адгезионных характеристик гепатоцитов взрослых животных при различных состояниях межклеточных контактов.

2. Разработать способ выделения и очистки макромолеку-лярных адгезионных факторов (МАФ), локализованных на периферии клеточной поверхности гепатоцитов.

3. Исследовать молекулярную природу полученных МАФ и их влияние на адгезионные свойства гепатоцитов.

4'. Исследовать с помощью разработанных методов адгезионные взаимодействия клеток печени человека при ее хронических диффузных заболеваниях.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Разработанные нами экспериментальные подходы к исследованию клеточной адгезии в печени взрослых особей млекопитающих, принципиально отличаются от существующих ныне традиционных методов исследования и являются оригинальным исследованием.

В данной работе впервые исследованы ранее не идентифицированные МАФ из печени взрослых особей млекопитающих.

Впервые показано, что в печени имеют место два различных молекулярных' механизма клеточной адгезии, опосредуемых идентифицированными нами МАФ (20-40 кДа-фосфогликопептидами. и гликозаминогликанами) и 12 кДа-гликопептидом из сыворотки крови млекопитающих.

впервые установлено, что у особей, генетически предрасположенных к спонтанному гепатобластомогенезу, на поздних стадиях эмбриогенеза и в раннем постнатальном периоде происходит нарушение этих двух механизмов клеточной адгезии, связанное с изменением процессов биосинтеза МАФ и рецепторов к ним.

Наиболее существенным результатом работы является впервые сформулированная на основании полученных данных гипотеза пространственно-функциональной организации межклеточного пространства самой протяженной структуры МК гепатоцитов - зоны простого соединения. Предполагается также, что идентифицированные нами МАФ участвуют в образовании надмолекулярной структуры, выполняющей межклеточное пространство этой зоны.

Благодаря разработке комплекса цитологических и биохимических методов исследования, позволящего охарактеризовать адгезионные свойства гепатоцитов взрослых особей млекопитающих, оказалось возможным приблизиться к пониманию молекулярных механизмов, лежащих в основе ряда патологических процессов в печени, а также способствовать развитию методов диагностики. Исследование биопсийного материала, взятого у больных с различными диффузными заболеваниями печени, с помощью разработанного нами метода оценки адгезионных свойств гепато-

цитов способствовало созданию экспресс-метода диагностики синдрома холестаза у человека (хронический холестатический гепатит, первичный билиарный цирроз печени), получено авторское свидетельство.

АПРОБАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ. Материалы диссертации были представлены на 15 Научной сессии Центрального НИИ гастроэнтерологии (Шсква, 1988), на совместном заседании Отдела эмбриологии и лаборатории цитологии ИБР им. Н. К. Кольцова РАН (Москва, 1994).

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 133 стр. и-состоит из разделов: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы исследования, Результаты и обсуждение, Общее обсуждение, Выеоды. Список литературы состоит из 183 наименований. Работа содержит 6 таблиц и 19 рисунков и графиков.

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 10 работ, получено 1 авторское свидетельство.

материалы и методы исследования.

В работе были использованы мыши линий C57BL и СВА, самцы весом 18 - 20 г в возрасте 3-4 мес. и в позднем плодном периоде развития (перед рождением). Две линии мышей были выбраны нами в качестве объектов исследования как генетически пред-, расположенная к спонтанному образованию гепатом (СВА) и как устойчивая по этому признаку линия (C57BL).

1. ПОЛУЧЕНИЕ ЭКСТРАКТОВ ПЕЧЕНИ. Предварительно перфузи-рованную печень нарезали на фрагменты весом 1 - 1,5 г и экстрагировали физиологическим раствором, содержащим или не содержащим ионы Са при температуре 4вС или 20°С в течение 2 часов. Экстракты центрифугировали и далее исследовали.

2. ОЧИСТКА ПОЛУЧЕННЫХ ЭКСТРАКТОВ . Изозлектрофокусирова-ние (ИЭФ) проводили в градиенте сахарозы, используя колонку LKB-440 (LKB, Швеция) и сервалиты (Serva, Швеция) диапазона рН 3,5 - 10,0, при температуре 4°С в течение 48 часов и при напряжении 200 - 400 В. Гельфильтрацию осуществляли на Sepharose 6В (Pharmacia, Швеция) или Toyopearl HW-50 (Япония) в колонках К 16/100 (Pharmacia, Швеция). Детекцию белковых фракций, полученных после. ИЭФ осуществляли спектрофотометри-чески при 280 нм, а после гельфильтрации - при 226 нм (Uvicord, Hitachi, Япония). В качестве маркеров для определения молекулярного веса исследуемых•фракций были использованы декстран голубой с мол. весом 2000 кДа, бычий сывороточный альбумин с мол. весом 67 кДа и бычий инсулин с мол. весом 12 кДа. Определение белка проводили калориметрическим методом (Lowry et al., 1951). Электрофорез проводили в 7,5% полиакри-ламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия

(SDS) стандартным методом с последующим окрашиванием гелей Кумасси S-25Q или Шифф-реагентом (Fairbanks et al., 1971).

3. УГЛЕВОДНЫЙ АНАЛИЗ МАФ. Углеводный анализ проводили по специально разработанным методикам для определения нейтральных углеводов, уроновых кислот, гликозаминов и сиаловых кислот (Warren, 1959), используя анализатор Biotronic.

4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СЕРЫ И ФОСФОРА В МАФ. Серу и фосфор определяли полуколичественно методом рентгено-флюоресцентного анализа на приборе VRA - 30 (Carl Zeiss, Jena), с использованием кристаллоанализатора РЕ и проточно-пропорционального счетчика. Для возбуждения использовали рентгеновскую трубку с Cr-анодом, в качестве аналитических линий использовали SK^ и PliC-

5. ИССЛЕДОВАНИЕ АДГЕЗИОННЫХ СВОЙСТВ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ. Исследование адгезионных свойств клеток печени проводили с помощью адгезиометрических методов (Ямскова и др. , 1977; Ямс-кова, Резникова, 1984), в основе которых лежит экспериментальная оценка параметра, характеризующего вязко-упругие свойства ткани, при стандартном деформационном воздействии, оказываемом на фрагмент ткани.

Изучение адгезионных свойств клеток печени проводили на следующих модельных системах:

1. интактная печень (после декапитирования животного);

2. печень, перфузированная физиологическим раствором, содержащим ионы Ca в концентрации 103М;

3. печень с предварительно ослабленными контактами, после перфузии физиологическим раствором, не содержащим ионы Ca;

4. суспензия гепатоцитов.

Для количественной оценки адгезионных взаимодействий клеток печени взрослых мышей наш был введен определенный показатель, названный коэффициентом разобщенности Кр, который рассчитывается по следующей формуле:

Ыкл

Кр =----------

Nim + Мя

где №кл - количество целых одиночных клеток, выделившихся из фрагмента ткани печени после механического диспергирования; Ня - количество клеточных ядер, выделившихся в тех же условиях. Для сравнительного изучения вязко-упругих свойств клеток печени мышей линий C57EL и СБА и для выявления биологического смысла предложенного нами коэффициента разобщенности Кр проводили исследование зависимости значений Кр от концентрации ионов Ca и от температуры перфузирующего раствора -37°С,' 20°С, 4°С.

6. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ТЕСТИРОВАНИЕ ИССЛЕДУЕМЫХ МАФ. Биологическое тестирование исследуемых МАФ проводили на следующих модельных системах:

1 - кратковременная органная культура ткани печени мышей обеих линий, инкубируемая в среде 199 с 20% СКРС при 37°С, в течение 1,5-2 часов,

2 - кратковременная органная культура ткани печени мышей обеих линий, перфузированной физраствором, не содержащим ионы Са , инкубируемая в среде 199 с 20% СКРС при 37°С, в течение 1,5-2 часов,

3 - суспензия одиночных гепатоцитов мышей обеих линий, инкубируемая в 199 среде с 20% СКРС при 37°С, в течение 2-4 часов.

Биологический эффект МАФ рассчитывали по формуле:

Non

Эа = 200% - ------ х 100%

Nk

где: Эа - биологический эффект, вызываемый МАФ, Non и Nk - количество.клеточных ядер, выделившихся из 1 мг ткани соответственно в опыте (органные культуры в присутствии МАФ) и в контроле (органные культуры без добавления МАФ). Подсчет клеточных ядер проводили в определенном объеме камеры Горяева.

Влияние МАФ на пролиферативную активность эмбриональных гепатоцитов в органных культурах осуществляли по ранее разработанному методу ( Колесниченко, 1966). Культивирование проводили к течение 24 часов, МАФ добавляли в начале культивирования. Фиксацию эксплантатов осуществляли через 1, 4, 10 и 24 часа. SH -тимидин добавляли в культуратьную среду за 1 час до фиксации. Для каждого эксплантата просчитывали около 1000 клеток и определяли процент меченых ядер.

7. ЭКСПРЕСС - МЕТОД ДИАГНОСТИКИ СИНДРОМА ХОЛЕОТАЗА. Были обследованы больные хроническими диффузными заболеваниями печени. Биопсию печени проводили по методу Менгини иглой диаметром 1,8 мм (Подымова, 1984). Ткань гепатобиоптата разрезали на фрагменты размером около 1 мм , диспергировали в 0,1 мл 0,1% трипанового синего в растворе Рингера и определяли коэффициент разобщенности (Кр) по вышеприведенной формуле. Изменение размера клеток фиксировали с помощью окулярмикрометра.

- результаты и обсуждение.

1. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВЯЗКОУПРУГИХ СВОЙСТВ ТКАНИ ПЕЧЕНИ МЫШЕЯ ДВУХ ЛИНИЙ : С57В1 и СБА.

При сравнительном исследовании вязко-упругих свойств ткани печени мышей двух линий был выбран метод полной дезин-

теграции ткани при стандартном деформационном воздействии. Условия диспергирования ткани в дезинтеграторе (зазор 50 мкм соответствует размеру генатоцита) позволяют выявить различия в контактном состоянии клеток: при стандартном деформирующем воздействии целыми остаются клетки с ослабленной адгезией, в случае же сохранения адгезионных взаимодействий клеток происходит разрыв ПМ и наблюдается высвобождение клеточных ядер.

При сравнительном изучении вязко-упругих" свойств ткани интактяой печени мышей двух линий СБА и С57В1 в условиях стандартного деформационного воздействия на ткань было установлено, что значение параметра Ия, отражающего вязко-упругие свойства ткани и представляющего собой количество выделившихся клеточных ■ядер на 1 мг диспергированного образца, было стабильно у мышей линии С57В1 и широко варьировало у мышей линии СБА. Показания параметров Ыя для одной особи (линия СБА) значительно различаются между собой (в 1,5 - 2 раза), и в несколько раз отличаются от значений Ыя, определенных для мышей линии С57В1. Кроме того, во многих экспериментах при деформационном воздействии из ткани печени мышей СБА отмечался выход свободных гепатоцитов, что свидетельствует об уменьшении их адгезивности. Эти результаты полностью согласуются с данными других авторов, которые показали, что сила сцеплен-ности клеток в печени мышей СБА в 3 раза меньше таковой в печени мышей С57В1 на всем протяжении постнатального развития, что связано с меньшим количеством высокоадгезивных участков -ВАУ в зоне простого соединения гепатоцитов мышей СБА (Модяно-ва и др., 1980).

Нами была предпринята попытка провести сравнительную оценку адгезионных свойств гепатоцитов' мышей двух исследуемых линий в зависимости от различных условий внеклеточной среды, воздействующих на состояние МК и Ш, а именно:

1. при нарушении - зависимого и Са2+- независимого механизмов адгезии (после перфузии печени соответствующей средой);

2. при изменении температуры окружающей среды (4° С, 20°С, 37°С);

3. при полном нарушении Ш (суспензия гепатоцитов).

При исследовании вязко-упругих свойств ткани печени мышей двух линий в условиях нарушения Са-зависимого или Са"-не-зависимого механизмов адгезии, после перфузии печени соответствующей средой, отличий в значениях параметров Мя и Кр обнаружено не было; изменение температуры перфузирующего раствора также не выявило отличий в изучаемых свойствах тканей печени мышей обеих линий; показания параметров Мя и Кр для суспензии одиночных гепатоцитов, в условиях полного нарушения межклеточных контактов, были одинаковы для мышей СБА и С57В1.

Проведенное нами сравнительное исследование вязко-упругих свойств ткани печени мышей двух исследуемых линий показало, что при стандартном деформационном воздействии на ткань с различным состоянием МК только в интактной ткани, в условиях ненарушенных межклеточных взаимодействий, были обнаружены различия в адгезии гепатоцитов мышей СБА и С57В1.

Поскольку наиболее лабильным соединением МК гепатоцитов является самая протяженная структура - зона простого соединения, а полученные нами данные показывают, что вязко-упругие свойства ПМ гепатоцитов и остальных ультраструктур МК у мышей обеих линий не отличаются, можно предположить, что обнаруженные различия при исследовании нативной ткани печени, связаны именно с зоной ПС. Различия в адгезионных свойствах зоны ПС у мышей СБА и С57В1 были обнаружены электронномикроскопическим методом другими исследователями, показавшими уменьшение количества и изменение свойств ВАУ у мышей СБА по сравнению с таковыми у мышей С57В1 (Модянова и др. , 1980) и установившими, что количество ВАУ в зоне простого соединения гепатоцитов мышей СБА возрастает после воздействия 70 кДа-гликопротеина -МАФ, локализованного на периферии клеточной поверхности и участвующего в Се?41 зависимом механизме адгезии (Маленков и др., 1979). На основании суммирования этих данных можно высказать предположение о том, что генетическая предрасположенность мышей линии СБА к спонтанному гепатобластомогенезу связана с нарушением молекулярных механизмов клеточной адгезии в зоне простого соединения.

2. ПОЛУЧЕНИЕ МАФ ИЗ ТКАНИ ПЕЧЕНИ И ИХ БИОЛОГИЧЕСКОЕ ТЕСТИРОВАНИЕ.

В данной работе были получены и исследованы .следующие экстракты печени:

Экстракт 1 - экстракция при 20_3 С в физиологическом растворе с концетрацией ионов Са - 10 М (СаР).

Экстракт 2 - экстракция при 20° С в физиологическом растворе, не содержащем ионы Са (бСаР).

Экстракт 3 - экстракция при 4° С в физиологическом растворе с концентрацией ионов Са - 10 М'(СаР).

Экстракт 4 - экстракция при 4 С в физиологическом растворе, не содержащем ионы Са (бСаР).

В качестве моделей для биологического тестирования МАФ нами были использованы следующие:

1. кратковременная множественная органная культура ткани печени мышей обеих линий, инкубируемая в среде 199 с 20 % СКРС;

2. кратковременная множественная органная культура ткани пече-

ни мышей обеих линий, предварительно перфузированной физраствором, не содержащим ионы Са (печень с предварительно ослабленными контактами);

3. суспензия одиночных гепатоцитов мышей обеих линий.

Полученные нами данные указывают на значительные различия в биологической активности 4 типов исследуемых экстрактов, полученных из печени мышей обеих линий, на трех модельных системах.

При исследовании биологического действия всех полученных экстрактов на суспензию гепатоцитов эффект не был обнаружен. По-видимому, при получении суспензии гепатоцитов, в процессе ферментативной обработки, были утрачены рецепторы исследуемых МАФ на поверхности клеток.

На модели печени с предварительно ослабленными контактами было показано, что адгезионной активностью обладал только экстракт 2, полученный из печени мышей С57В1, причем он вызывал статистически достоверное (р< О, 01), по сравнению с контролем, уменьшение значений ^р как для печени мышей С57В1 (на 24 - 37%, в концентрации 10" -10" мг белка/мл), так и для печени мышей СБА (на 30 ^,33%, в концентрации 10"6, 10~8 мг белка/мл). Поскольку экстракция и перфузия печени проводилась в одинаковых условиях, то можно предположить, что адгезионная активность опосредована теми МАФ экстракта, которые удаляются с клеточной поверхности при перфузии печени. Однако, экстракт 2, полученный из печени мышей СБА, не оказывал влияния на значения Кр для печени мышей обеих линий.

Результаты, полученные на модели печени с предварительно ослабленными контактами, хорошо согласуются с результатами исследований других авторов. 70 кДа-гликопротеин, полученный в условиях, аналогичных условиям получения экстракта 2-, оказывал мембранотропное действие на гепатоциты мышей обеих линий и способствовал увеличению количества ВАУ в зоне ПС у мышей линии СВА, доводя их количество до соответствующего у мышей линии С57В1 (Маленков и др. , 1979).

Полученные нами результаты сравнительного исследования указывают на значительные различия в Са -.зависимом механизме адгезии гепатоцитов мышей обеих линий, а именно: поверхность гепатоцитов мышей линии СВА сохраняет способность к восприятию действия МАФ, полученных из печени мышей С57В1, но МАФ в экстракте 2, полученном из печени мышей СВА, неактивны. Отсюда следует, что биосинтез МАФ, участвующих в Са^зависидам механизме адгезии нарушен у мышей высокораковой линии СВА.

При исследовании экстрактов печени мышей обеих линий на модели кратковременной органной культуры ткани интактной пе-

чени было показано, что все 4 экстракта, выделенные из печени мышей линии С57В1, проявляли адгезионную активность при действии на ткань печени мышей этой же линии. Из 4-х исследованных экстрактов печени мышей СБА активность проявляли экстракты, полученные при 20°С, как в Са^содержащей среде, так и при дефиците ионов Са . Однако, оба экстракта все же значительно отличались по биологической активности. Экстракт 2 проявлял адгезионную активность при воздействии на ткань печени мышей обеих линий, в то время как экстракт 1 - только на печени мышей линии СБА, т. е. проявлял "линейную" специфичность биологического действия. Интересно отметить, что экстракт 1, выделенный из печени мышей С57В1, проявлял адгезионную активность также только на ткани печени мышей линии С57В1.

Таким образом, оба экстракта, выделенные из печени мышей двух линий в присутствии ионов Са при 20 С, проявляли "линейную" специфичность биологического действия. Учитывая, что условия получения экстрактов 1 и условия инкубации органной •культуры интактной печени были одинаковы, можно предположить, что "линейная" специфичность биологической активности экстрактов 1 обусловлена теми МАФ, которые удаляются с поверхности клеток печени в процессе экстракции. Эти данные указывают на присутствие Са-независимого механизма адгезии в печени мышей линии СБА, отличного от такового у мышей линии С57В1. .

При исследовании биологического действия экстрактов 3 и 4 адгезионно-активными оказались только экстракты печени мышей С57В1 и только при воздействии на ткань печени мышей этой же линии. Экстракты 3 и 4 печени мышей линии СБА не проявляли биологической активности при действии их как на ткань печени мышей СБА, так и на ткань печени мышей С57В1 (рис. 1).

Очевидно, что наиболее значимым фактором, обусловливающим 'тип МАФ в экстрактах 3 и 4, является температура экстрагирующего раствора, а не концентрация ионов Са . Эти результаты согласуются с данными электронномикроскопического исследования, показывающими, что, при прочих равных условиях, воздействие в течение 1 минуты пониженной температуры (4°С) приводит к нарушению структуры зоны ПС, чего не наблюдается при более длительном воздействии раствором, не содержащим ионы Са, и при температуре 37°С (Ушаков, Черненко, 1978; Ушаков, 1982). Можно предположить, что в условиях минимальной текучести плазматической мембраны и сниженной латеральной подвижности ее интегральных компонентов, взаимодействие периферически расположенных МАФ с клеточной поверхностью резко ослабевает, и они свободно могут выходить во внешнюю среду. Следовательно, и способ экстракции МАФ из ткани печени, и резуль-

Экстракт 4

печень С57В1 печень СБА

Штриховка - контроль;

точки - есть биологический эффект, (различия

статистически достоверны, р < 0, 01); белый цвет - нег биологического эффекта, (различия статистически незначиш).

Рис. 1. Адгезионный эффект За X , оказываемый экстрактом 4 (4°С, бСаР) на кратковременную органную культуру ткани печени половозрелых мышей линий "С57В1 и СБА. Абсцисса: К - контроль; 1,2,3 и т. Д. - номера последовательного десятикратного разведения (отрицательный логарифм концентрации); ордината: адгезионный эффект Эа, %.

таты исследования адгезионной активности МАФ, указывают на достаточно слабое взаимодействие МАФ с поверхностью гепатоци-тов. Однако, это взаимодействие скорее всего относится к ли-гандно-рецепторному типу, поскольку была выявлена колоко-лообразная зависимость величины биологического эффекта, оказываемого МАФ на вязко-упругие свойства ткани, от концентрации МАФ в растворе.

В плане дальнейшего сравнительного изучения МАФ периферии клеточной поверхности на наш взгляд наибольший интерес представляли МАФ, присутствующие в экстрактах, полученных при 4° С. Согласно данным исследования биологической активности экстрактов, состав экстрактов 3 и 4 должен быть схожим, и представлялось актуальным провести сравнительное исследование свойств МАФ экстракта 4 печени мышей двух линий СБА и С57В1.

3. ОЧИСТКА ЭКСТРАКТОВ ТКАНИ ПЕЧЕНИ МЫШЕЯ ЛИНИИ С57В1 И СБА.

Разделение МАФ, содержащихся в полученных экстрактах 4 проводили методом изоэлектрофокусирования (ИЭФ). Картина разделения представлена на рис. 2 (а,б). Биотестирование каждой фракции осуществляли методом оценки вязко-упругих свойств ин-тактной ткани печени, так как только с помощью этого метода была выявлена биологическая активность экстрактов 4.

Рис. 2. Изозлектрофокуеировакие экстракта 4 печени мышей линии С57В1 (а) и СБА (б)в градиенте сахарозы в интервале рН 3,5 - 1о, 0. Абсцисса: номера фракций; ордината левая: поглощение при 280 нм; ордината правая: значения рЕ

Исследование, проведенное на печени мышей обеих линий показало, что только фракция А, полученная из экстракта печени мышей С57В1, проявляла биологическую активность на ткань пече_ни мышей этой" же линии в концентрации, соответствующей 10~-- 10 мг белка/мл, что выражалось в статистически достоверном (р< 0,01) увеличении параметра За на 25-30 Ж в опыте по сравнению с контролем (рис. 3). Аналогично полученная фракция А' из экстракта печени мышей СБА в соответствующих экспериментах была неактивна. Таким образом, биологическая активность фракции А проявляла свойства полной линейной специфичности, аналогично экстракту 4, из которого она была выделена.

Фракция А, выделенная из аналогично полученного экстракта 4 печени крыс по биологической активности была сходна с фракцией А из экстракта печени мышей С57В1: она оказывала действие на вязко-упругие свойства ткани печени мышей С57В1, но не СБА. Фракция А - С57В1 не оказывала действия на вязко-упругие свойства ткани легкого мышей С57В1, проявляя, таким образом, тканевую специфичность.

Дальнейшее исследование молекулярной природы фракции А

Фракция А-С57В1

* + * г* ♦ 4 ♦ * + * I «

1

1 _ ¡1

' к _ » * _ * 6 7 • * 10 ■ ЙЙЙ

«ракция р1 3,82-3,85. 2ЦХ,

Килкп»»««»!"»

К» * »4 *«

и

«ракция К-С57В1

К« • к иг«гпмякнв

печень С57В1

печень СВА

Пгриховка - контроль;

точки - есть биологический эффект, (различия

статистически достоверны, р < о, 01); белый цвет - нег биологического з(йекта, (различия статистически неаначюш).

Рис. 3. Адгезионный эффект За % , оказываемый МАФ фракций, полученных после разделения методом изо. электрофокусирования экстракта 4 печени мышей линии С57В1, на кратковременную органную культуру ткани печени половозрелых мышей линий С57В1 и СБА. Абсцисса: К - контроль; 1,2,3 и т. д. - номера последовательного десятикратного разведения (отрицательный логарифм концентрации); ордината: адгезионный эффект ЭаД.

из печени мышей двух линий проводили с помощью метода хроматографии на БерЬагозе 6В и Тоуереаг! НУ-65 и №50, электрофореза в присутствии натрия додецил-сульфата, и углеводного анализа.

Хроматографию на БерЬагозе 6В осуществляли в СаР и в де-ионизованной среде (ЭДТА) : На рис. 4 и 5 представлены карти-

Рис. 4. ■ Гель-фильтрация фракции А-С57В1 на 5ер|1агозе 6В при 4°С (а) и при 20°С (б). Абсцисса: номера фракций, стрелками отмечены фракции, полученные при хроматографии декстрана голубого (Д), бычьего сывороточного альбумина (БСА), инсулина быка (И); ордината: поглощение при 226 нм.

Г д:

{

бса

Рис. 5. Гель-фильтрация фракции А-СБА на БерИат-озе 6В при 4° С. Абсцисса: номера фракций, стрелками отмечены фракции, полученные при хроматографии декстрана голубого (Д), бычьего сывороточного альбумина (БСА), инсулина быка (И); ордината: поглощение при 226 нм.

ны разделения фракций: А из экстрактов печени мышей С57В1 и СВА соответственно. При хроматографии на Зер1тагозе 6В фракции А -С57ВЬ было идентифицировано не менее 5 фракций. При элюции СаР (или водой) наблюдали, высокомолекулярную фракцию с мол.

весом 1000 кДа, количество которой зависело от температуры и степени разбавления исследуемого препарата. В условиях дефицита двухвалентных катионов (10 М ЭДТА) эта фракция полностью отсутствовала. Мажорная фракция соответствует мол. весу 20-40 кДа и состоит не менее чем из 4 компонентов (рис. 4). В отличие от фракции А-С57В1 при хроматографии фракции А - СБА было отмечено значительно меньшее количество высокомолекулярной фракции, соответствующей свободному объему колонки, независимо от условий проведения гельфильтрации. Мажорная фракция также была представлена несколькими компонентами с мол. весом 20 - 40 кДа (рис. 5). Таким образом, фракция А - С57В1 отличается от аналогичной фракции А - СБА по картине разделения на БерЬагозе 6В. Полученные результаты позволяют высказать предположение о том, что в состав фракций А-С57В1 и А-СВА входят белки, способные образовывать высокомолекулярные агрегаты в зависимости от температуры и степени разбавления исследуемого препарата, но для компонентов фракции А-СВА эта потенция менее выражена. Это предположение подтверждают также результаты разделения этих фракций методом БОБ-электрофореза в 7,5 % полиакриламидном геле: было показано ' отсутствие дискретных белковых зон для обеих фракций и диффузное окрашивание гелей красителем Кумасси и Шифф-реаген-том, что указывает на способность гликоконьюгатов этой фракции образовывать высокомолекулярные агрегаты. Однако, различия в агрегационной способности исследуемых фракций А-С57В1 и А-СВА были обнаружены только с помощью метода гель-фильтрации.

Исследование углеводного состава фракций А из печени мышей обеих линий позволило выявить значительные отличия фракции А - С57В1 от фракции А - СБА (табл.1).

Полуколичественный анализ на серу и фосфор в исходных экстрактах печени мышей обеих линий показал, что компоненты экстрактов содержат оба элемента. Фосфор содержится в значительных количествах, соответствующих не менее 5 остаткам на одну молекулу гликопептида с мол. весом 40 кДа. Сера присутствует в экстрактах в меньшем количестве и может входить как в состав серусодержащих аминокислот, так и в состав сульфатиро-ванных форм уроновых кислот.

На основании полученных результатов, можно заключить," что в состав фракции А входят кислые, низкомолекулярные, уг-леводсодержащие белки, 'заряд которых определяется наличием фосфатных групп в их составе, а также сульфатированные глика-ны, содержащие уроновые кислоты.

Таким образом, существенные отличия в углеводном составе

МАФ печени мышей двух исследуемых линий делают обоснованным предположение о нарушении биосинтеза этих фосфогликопептидов в печени мышей СВА. Выявленные нами различия в функциональных свойствах МАФ печени мышей линий С57В1 и СВА, возможно, связаны с измененным составом гликозаминогликановых цепей МАФ периферии клеточной поверхности мышей линии СВА. Наличие нескольких компонентов во фракции А, определяющееся методом гельфильтрации, может быть объяснено как присутствием в ней различных гликопептидов, так и различной степенью гликозили-рования и фосфорилирования одного гликопептида. Последнее предположение представляется весьма вероятным, поскольку для природных гликоконьюгатов известно явление микрогетерогенности углеводных цепей (ЗшюпеБси, КеГаП(Зез, 1991; Зимина и др., 1992).

Таблица 1.

Углеводный состав фракций А из печени мышей линий С57В1 и СВА

! Количество ! углеводных ! остатков, nm Фракция A-C57B1 Фракция А-СВА ! 1 ■ ■ 1

! toi 60,8 56,7 1

! Gal - 3,3 !

! Xyl 200,1 304,3 1

! Glc 61,2 65,7 1

! GlcNAc 1,5 1,9 !

! GalNAc - следы !

! GalUA 30,0 i

! GlcUA - 8,7 :

! SA - следы 1

Необходимо отметить, что большинство обнаруженных в различных тканях МАФ являются кислыми гликопротеинами, в состав которых входят остатки фосфорной кислоты (Cup.ningham, 1983; 1984; 1985). Однако, по молекулярным свойствам полученные нами МАФ отличаются от МАФ, идентифицированных в печени ранее другими авторами (Ямскова и др., 1977; - Nielsen et al., 1981; Gallin et al., 1983; Ocklind et al. , 1983). Способ получения и метод биотестирования исследуемых нами МАФ указывают на их слабое взаимодействие с другими компонентами плазматической мембраны гепатоцитов и предполагают их локализацию на периферии клеточной поверхности в зоне простого соединения. Возможно, что биологическое действие этих МАФ обусловлено их свойством образовывать сложные надмолекулярные структуры благодаря

- 16 -

их способности агрегировать между собой.

Вторая адгезионно-активная фракция К-С57В1, полученная после ИЭФ экстракта печени мышей С57В1 в интервале рН 6,8 -7,2, представляет собой ранее идентифицированный полуинтегральный МАФ гепатоцитов, 70 кДа-гликопротеин, который был обнаружен в экстрактах печени, получаемых при 20°С ь условиях дефицита ионов Са (Ямскова и др., 1977). Как было установлено ранее, pl нативной формы этого МАФ находится в области рН 6,8 - 6,9 (Ямскова, 1978). Полученная нами фракция К-С57В1 проявляла адгезионную активность в интервале концентраций, соответствующих 10"- 10 мг белка/мл (рис.3), что совпадает с интервалом активных концентраций, в котором проявлял биологическую активность 70 кДа-гликопротеин. Идентификация этого МАФ в исследуемых нами экстрактах печени мышей, полученных при 4 С, свидетельствует в.пользу предположения о том, что все эти МАФ являются компонентами некоего адгезионного сайта на периферии клеточной поверхности гепатоцитов в зоне ПС. Такие мультимолекулярные ансамбли определенным образом располагаются в межклеточном пространстве, осуществляя многоцентровое взаимодействие с компонентами клеточной поверхности по лигандно-рецепторному механизму. В их состав могут входить несколько типов МАФ, молекулы которых имеют тенденцию к образованию надмолекулярных структур, описываемых в термина« теории жидких кристаллов (Браун, Уолкен, 1982; Минц, Кононенко, 1982; СкОроходоЕ, 1988). Обнаруженные нами различия в углеводном составе МАФ высокораковой линии мышей СВА и низкораковой линии мышей С57В1 могут являться причиной изменения пространственной организации адгезионного сайта у мышей, предрасположенных к спонтанному гепатобластомогенезу. Такие нарушения молекулярных механизмов клеточной адгезии проявляются в уменьшении силы сцепленности гепатоцитов у мышей линии СВА, определяемом экспериментально (Бочарова, Модянова, 1982)'. Учитывая, что 70 кДа-гликопротеин способствовал увеличению количества ВАУ в зоне ПС гепатоцитов мышей линии СВА в экспериментах in vivo в концентрации, соответствующей 10~-10~?мг белка/мл (Маленков и др., 1979), можно предположить, что ВАУ и являются теми адгезионными сайтами, в формировании которых могут участвовать исследуемые нами МАФ. Возможно, что arpera-, ция молекул МАФ между собой является . началом образования сложной упорядоченной структуры адгезионного сайта

Полученные нами данные ^показывают," что при экстракции ткани печени при 4<>С во внешнюю среду переходят МАФ, оказывающие влияние на вязко-упругие свойства ткани в сверхмалых концентрациях, соответствующих Io'-IOÍmt белка/мл в экспери-

ментах in vitro только в условиях сохранения целостности тканевой структуры. Этот вывод подтверждается результатами, полученными группой исследователей, которые показали, что идентифицированные нами МАФ печени крыс, вызывали изменение интенсивности синтеза белка в гепатоцитах и проницаемости их плазматических мембран только при условии сохранения тканевой структуры печени (Ямскова и др., 1994). Тем самым было показано мембранотропное действие этих МАФ и способность этих гликоконьюгатов в сверхмалых концентрациях оказывать влияние на внутрисинтетические процессы в гепатоцитах. Складывается впечатление, что исследуемые нами МАФ, участвуя в формировании некоторой надмолекулярной структуры, выполняющей межклеточное пространство зоны простого соединения, и, опосредуя механизмы межклеточного взаимодействия, таким образом, участвуют в процессах тканевого гомеостаза.

4. ИССЛЕДОВАНИЕ АДГЕЗИВНЫХ СВОЙСТВ КЛЕТОЧНОЙ ПОВЕРХНОСТИ В ТКАНЯХ-МИШЕНЯХ ПРИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К СПОНТАННОМУ БЛАСТОМОГЕНЕЗУ.

Полученные нами данные показывают, что МАФ, выделенные из печени мышей линии С57В1, не оказывают влияния на вязкоуп-ругие свойства ткани печени мышей линии СВА (рис. 1,3). Это свидетельствует об изменении адгезивных сеойств клеточной поверхности гепатоцитов высокораковой линии мышей, которое может быть связано с нарушением в биосинтезе как самих МАФ периферии клеточной поверхности, так и рецепторов к ним. Поскольку известно, что в раннем постнатальном периоде ' развития в печени происходят значительные мсрфогенетические события, сопровождающиеся изменением антигенного состава ПМ гепатоцитов (Абелев, 1979; Энгельгардт, 1984; Tyneret'al., 1990) и модификацией ряда МАФ (Rutishauser, 1988), представлялось актуальным провести исследование влияния МАФ на адгезионные свойства гепатоцитов мышей обеих линий в позднем плодном периоде развития. В этом периоде происходит "переключение" молекулярных механизмов адгезии с имеющих место в пренатальном периоде на существующие в постнатальном состоянии организма. Действительно, для мышей линии С57В1 в раннем постнатальном периоде было отмечено значительное изменение механической сцепленности клеток печени. В печени мышей линии СВА таких изменений не наблюдали в течение всего постнатального периода (Бочарова, Модянова, 1982). Эти данные нашли подтверждение при изучении адгезивных свойств клеток печени мышей СВА и С57В1 с помощью другого МАФ - сывороточного 12 кДа гликопеп-тида (С-МАФ), использованного нами в качестве молекулярного

инструмента исследований. С-МАФ в низких концентрациях, соответствующих 10"- ю"*мг белка/мл,оказывал влияние на вязко-упругие свойства ткани печени мышей линии СБА или гибридов СБА х С57В1 (И) (Ямскова, Резникова, 1984; 1991). ;Проведенное нами исследование влияния С-МАФ на адгезионные Свойства гепа-тоцитов взрослых особей мышей линий СБА и С57В1 показало, что С-МАФ проявлял биологическзпр активность в исследуемой концентрации, соответствующей 10 мг белка/мл, только в- отношении ткани печени мышей линии СБА и не оказывал влияния на клетки печени мышей С57В1 (рис. 6 (1)). При изучении биологического эффекта, оказываемого исследуемыми МАФ на гепатоциты мышей обеих линий в позднем плодном периоде, была получена принципиально другая картина воздействия этих веществ на клеточную адгезию. МАФ, выделенные из ткани печени мышей обеих линий -фракции А-С57В1 и А-СВА - оказывали влияние на адгезионные свойства гепатоцитов как мышей линии С57В1^ так и СБА, в исследуемой концентрации, соответствующей 10 мг белка/мл. В отличие от тканевых МАФ, С-МАФ проявлял такую же биологическую активность на гепатоциты мышей позднего плодного периода, как и на клетки печени половозрелых животных, а именно, С-МАФ в исследуемой концентрации был адгезионно активен только в отношении клеток печени мышей линии СБА, ко не линии С57В1 (рис. 6(2)). Полученные нами результаты показывают, что тканевые МАФ и С-МАФ опосредуют различные механизмы клеточной адгезии гепатоцитов. Формирование молекулярного механизма клеточной адгезии, опосредуемого С-МАФ, очевидно, заканчивается на поздних этапах плодного периода развития и далее, во всем постнатальном периоде развития, этот механизм клеточной адгезии остается неизменным. В пользу этого предположения свидетельствуют также ранее полученные данные о взаимодействии С-МАФ с транспортным белком и образовании "неактивного" комплекса на поздних стадиях плодного периода, существующего в течение всего постнатального периода (Ямскова, Резникова, 1985).

Различие молекулярных механизмов клеточной адгезии, опосредуемых тканевыми МАФ, обнаруженное нами для ткани печени половозрелых мышей двух линий, в пренатальном периоде не было выявлено, вероятно, в связи с незавершенным процессом формирования этой адгезионной системы в печени, становление" которой заканчивается в раннем постнатальном периоде.

На основании полученных данных можно -предположить, что в печени мышей линии СБА не происходит установления новых механизмов клеточной адгезии, свойственных ткани, близкой к дефинитивному состоянию, а сохраняются механизмы клеточной адге-

За.Х

Эа.1

А

а)

в)

в)

ш

А-С57В1 С-ЫАФ А-СВА

А-С57В1 С-ЫАФ А-СВА

Шгриювка - контроль;

черный цвет - есть биологический эффект, С различия статистически достоверны, р < 0,01); " 1 точки - нет Апологического эффекта, (различия

статичстически яезначимы).

Рис. 6. Адгезионный эффект Эа, % , оказываемый исследуемыми МАФ в концентрации 10~ мг белка/мл на кратковременную органную культуру ткани печени 1) - половозрелых мышей линии С57В1 (а) и линии СВА (б); 2) - мышей позднего плодного периода развития, линии С57В1 (а) и линии СВА (б). Абсцисса: К -контроль (инкубация ткани печени без добавления МАФ); А-С57В1, А-СВА, С-МАФ - исследуемые МАФ (инкубация в присутствии МАФ); ордината: биологический эффект, вызываемый МАФ, За в %.

зии, присущие ткани печени пренатального периода развития. Одним из таких механизмов может быть молекулярный механизм адгезии, опосредуемый С-МАФ.

5. ИССЛЕДОВАНИЕ ДЕЙСТВИЯ МАФ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ПЕЧЕНИ МЫШЕЙ И СЫВОРОТКИ КРОВИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ ГЕПАТОЦИТОВ МЫШЕЙ ЛИНИЯ С57В1 И СВА. Ранее было показано влияние некоторых МАФ на пролифера-тивную активность клеток (Маленков и др. , 1978; Буеверова и др., 1985; Дольникова и др., 1987; Евстратов и др., 1988). МАФ, выделенные из тканей животных, оказывали ингибирующэе действие на клеточную пролиферацию, в то время как С-МАФ оказывал стимулирующее действие.

При исследовании влияния МАФ на пролиферативную . активность гепатоцитов мышей двух линий в позднем плодном периоде было установлено, что МАФ печени мышей обеих линий - как фракция А-С57В1, так и фракция А-СВА, оказывали влияние на пролиферацию гепатоцитов мышей обеих линий in vitro. Обе фракции ингибировали пролиферацию гепатоцитов (биологический эффект составлял'4050 %) в течение 24 часов культивирования органной культуры печени. Таким образом, различий в действии исследуемых МАФ на пролиферацию гепатоцитов мышей обеих линий выявлено не было.

Напротив, С-МАФ оказывал различное действие на пролиферацию гепатоцитов мышей линий СВА и С57В1. С-МАФ стимулировал клеточную пролиферацию у мьппей линии СВА и не оказывал влияния на пролиферацию гепатоцитов мышей линии С57В1.

Полученные нами результаты указывают на корреляцию биологического эффекта, производимого исследуемыми МАФ на адгезию гепатоцитов при действии на органные культуры ткани печени мышей позднего плодного периода, с их влиянием на пролиферативную активность гепатоцитов мышей двух линий. Интересно отметить, что С-МАФ не оказывал влияния на адгезионные свойства гепатоцитов мышей низкораковой линии С57В1, в то время как влиял не только на адгезионные свойства клеток печени мышей высокораковой линии СВА на разных этапах онтогенеза, но и был способен оказывать при этом стимулирующее действие на клеточную пролиферацию. Таким образом, данные настоящего исследования подтверждают, что С-МАФ и МАФ, присутствующие во фракциях А-С57В1 и А-СВА, опосредуют различные механизмы клеточной адгезии, которые формируются на разных этапах онтогенеза. .

6. ИССЛЕДОВАНИЕ АДГЕЗИИ ГЕПАТОЦИТОВ ПРИ ХРОНИЧЕСКИХ ДИФФУЗНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ПЕЧЕНИ.

Электронно-микроскопическими исследованиями установлено, что при синдроме холестаза (в эксперименте и у больных) происходит частичное или полное расхождение гепатоцитов, которое приводит к увеличению межгепатоцитарного пространства (Логинов, Чебанов, 1982; Воуег, 1983).

В связи с этим количественная оценка адгезионных свойств гепатоцитов при хронических диффузных заболеваниях печени с использованием адгезиометрического метода, основанного, на оп-" ределении параметра Кр, характеризующего вязко-упругие свойства ткани печени в условиях стандартного деформационного воздействия на фрагмент ткани (в данном случае - гепатобиоптата) представлялась важной.

.Объектом исследования послужил биопсийный материал пече-

ни 72 больных, которые, согласно заключительному клиническому диагнозу, были разделены на 8 групп:

1-е первичным билиарным циррозом -ПБЦ, включая хронический холестатический гепатит - ХХГ

как начальную стадию ПБЦ;

2-е хроническим гепатитом - ХГ с умеренной активностью;

3-е хроническим активным гепатитом -ХАТ;

4-е хроническим перекстирутовдш гепатитом - ХПГ;

5-е неконъюгированной гипербилирубинемией Жильбера -НГ;

6-е жировой дистрофией печени - ВД;

7-е циррозом печени - ЦП;

8 - контрольная, с гастроэнтерологическими заболеваниями без гистологических изменений в печени: язвенной болезнью желудка и (или) двенадцатиперстной кишки, хроническим гастритом, хроническим панкреатитом, хроническим холециститом и др..

Полученные нами данные показали безусловное статистически достоверное отличие адгезионных свойств гепатоцитов больных ПБЦ от таковых во всех остальных исследованных группах больных, которые между собой не различались, при этом во всех случаях р < 0,001 (табл. 2).

__ Таблица 2.

Среднеарифметические (X) значения коэффициента разобщенности (Кр) при различных нозологических формах хронических диффузных поражений печени.

N группы Форма хронического диффузного поражения печени Число больных Кр( X ± 3) Интервал показателей Кр

1 ПБЦ, ХХР 11 0,61 ± 0,03 0,41 - 0,84

2 ХГ 5 0,11 ± 0,02 0,06 - 0,15

3 ХАТ 4 0,18 ± 0,04 . 0,08 - 0,24

4 ХПГ 11 0,10 ± 0,02 0,00 - 0,20

5 НГ 8 0,11 ± 0,02 0,00 - 0,16

6 ВД 11 0,07 ± 0,02 0,00 - 0,14

7 ЦП 3 0,18 + 0,03 0,14 - 0,24

8 Контроль 16 0,09 ± 0,02 0,00 - 0,18

У больных с холестазом после диспергирования ткани печени наблюдалось значительное выделение свободных гепатоцитов, Кр = 0,41 - 0,84, что в 3-8 раз превосходило значение Ер для контрольной группы. По площади выделившиеся гепатоциты

были I; 1,5 -2 раза меньше, чем клетки больных контрольной группы. Для группы больных с ПБЦ увеличение выхода гепатоцитов при диспергировании ткани, очевидно, связано с ослаблением Ж за счет повышения давления в желчных капиллярах, возникающего при холестазе. Этими же причинами, по-видимому, можно объяснить и меньшие размеры гепатоцитов у больных этой группы. Полученные нами данные согласуются с результатами электронно- микроскопичеких исследований, показывающих, что при холестазе в печени происходит нарушение МК ( Логинов, Чебанов, 1982), в частности, в зоне плотного соединения (Воуег, 1983). Таким образом, у больных с ПБЦ и с ХХГ обнаружено нарушение адгезионных свойств клеток печени, которое впервые было количественно оценено с применением коэффициента разобщенности Кр. При других нозологических формах хронических диффузных заболеваний печени нарушения адгезионных свойств клеток печени не выявлено. Полученные нами результаты позволяют рассматривать нарушение адгезионных взаимодействий гепатоцитов как следствие и характерный признак синдрома холестаза и впервые предложить использовать этот признак для экспресс - диагностики синдрома у больных (Авторское свидетельство N 1597666).

выводи

1. Разработаны новые экспериментальные подходы к изучению молекулярных основ клеточной адгезии в печени, а именно: метод выделения МАФ и комплекс методов их биотестирования, позволяющие получать МАФ, локализованные на периферии клеточной поверхности.

2. Выделены новые, ранее не идентифицированные МАФ из печени мышей-и крыс. Изучена молекулярная природа МАФ, которые представляют собой комплекс фосфогликопептидов с мол. весом 20 - 40'кДа и гликозаминогликанов.

3. Показано, что в печени мышей имеет место два различных молекулярных механизма клеточной адгезии, опосредуемых идентифицированными нами МАФ (20 - 40 кДа- фосфогликопептида-ми и гликозаминогликанами и 12 кДа-гликопептидом из сыворотки крови млекопитающих).

4. Установлено, что у мышей линии СВА, генетически предрасположенной к спонтанному гепатобластомогенезу, на . поздних стадиях эмбриогенеза и в раннем постнатальном периоде проис- ' ходит нарушение как минимум двух механизмов клеточной адгезии в печени, опосредованных МАФ периферии клеточной поверхности и 12кДа-гликопептидом сыворотки'крови млекопитающих.

5. Показано, что нарушение механизма клеточной адгезии, опосредованного идентифицированными нами МАФ периферии кле-

точной поверхности, связано с изменением процесса их гликози- ' лирования.

6. Выявлена корреляция биологического эффекта, производимого полученными МАФ печени мышей линий С57В1 и СБА на адгезию клеток эмбриональной печени, с влиянием МАФ на пролифе-ративную активность эмбриональных гепатоцитов.

7. На основе метода механического диспергирования ткани разработан экспресс - метод диагностики синдрома холестаза у человека (хронический холестатический гепатит, первичный би-лиарный цирроз печени), получено авторское свидетельство.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ямскова В.П., Туманова Н.Б. Исследование макромолекуляр-ных факторов Са-зависимой адгезионной системы клеток печени мышей линии С57В1.//Онтогенез. 1988. т. 19. N. 5. с. 556.

2. Логинов А. С. , Ямскова В. П., Туманова Н. Б., Ткачев В. Д., Решетняк В. И.' Исследование адгезии гепатоцитов при хронических диффузных заболеваниях печени. //Бюлл. экспер. биол. и мед. 1989. N. 8. с. 160-162.

3. Туманова Е Б., Ямскова В. П., Решетняк В. И., Логинов A.C. , Ткаченв В. Д. Адгезионные свойства клеток печени при ее хронических заболеваниях.//Сборник трудов ЦНИИ гастроэнтерологии. 1990. с. 148-153. ;

4. Ямскова В. П., Туманова Е Б., Логинов А. С. Сравнительное исследование действия экстрактов печени мышей линии С57В1 и СБА на адгезию гепатоцитов. //Бюлл. экспер. биол. и мед. 1990. N. 3. с. 303-306.

5. Логинов A.C., Ямскова В. П., Туманова Е Б., Ткачев В. Д., Решетняк В. И. Способ определения синдрома холестаза. //Авторское свидетельство SU 1597666 от 08.06.1990. Бкш. N.37.

6. Yamskova V. Р., Tumanova N. В. The comparative investigation of hepatocyte surface adhesion site of C57B1 and CBA mice.//In: Abstract book of the sixth International conference "Differentiation of normal and neoplastic cells". Vancouver. British Columbia. Canada 1990. p. 54.

7. Ямскова R П., Нечаева E В., Туманова E Б., Юровицкий Ю. Г., Новикова Т. Е., Фатеева К И., Гвазава И. Г. Исследование влияния макромолекулярных адгезионных факторов, выделенных из сыворотки крови и печени млекопитающих на интенсивность синтеза белка и содержание АТФ в гепатоцитах in vitro.//Известия Акад. наук, серия биол. 1994. N. 2. с. 190-196.

8. Ямскова В. П., Туманова Е Б. Макромолекулярные факторы Са-зависимой адгезии клеток печени. //Известия Акад. наук. Серия биол. 1994. N. 5. с. 732-737.

9. Ямскова В. П. , Туманова Е Б., Решетник К И. Роль клеточной адгезии в возникновении патологических состояний печени. //Вестник РАМН. 1994. N. 5. с. 18-20.

10. Туманова Е Б., Ямскова Е П. Нарушение молекулярных механизмов клеточной адгезии в печени мышей при' генетической предрасположенности к спонтанному бластомогенезу. //Известия Акад. наук, серия биол. 1995. N. 1. в печати.

11. Туманова Е Б., Попова Е В. , Ямскова В. Е Влияние макро-молекулярных адгезионных факторов на пролиферацию гепатоцитов в органнных культурах эмбриональной печени мышей. //Известия Акад. наук, серия биол. 1995. N. 2. в печати.

Заказ V Тираж %0

Подписано к печати Z8.tt.9i

ОбъемV, б п.л. " Формат 60x84 1/16

ТОО "Нерей". ВНИРО. 107140, Москва, В. Красносельская, 17