Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Действие промоторов канцерогенеза на межклеточную адгезию и структурную лабильность биологических мембран

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Действие промоторов канцерогенеза на межклеточную адгезию и структурную лабильность биологических мембран"

АКАДЕМИЯ НАУК БССР ШСТШТ ФОТОБИОЛОГИИ

На правах рукописи

КОЛОТЫГИНА Ирина Михайловна

УДК 576.5+577.552.336+616.006.04

ДЕЙСТВИЕ ПРОМОТОРОВ КАНЦЕРОГЕНЕЗА НА МЕШЕГОЧНУЮ АДГЕЗИЮ И СТРУКТУРНУЮ ЛАБИЛЬНОСТЬ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН

03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск - 1988

АКАДЕМИЯ НАУК БССР ИНСТИТУТ ФОТОБИОЛОГИИ

На правах рукописи

КОШШГИНА Ирина Михайловна

УДК 576.5+577.552.336+616.006.04

ДЕЙСТВИЕ ПРОМОТОРОВ КАНЦЕРОГЕНЕЗА НА МЕШЕТОЧНУЮ АДГЕЗИЮ И СТРУКТУРНУЮ ЛАБИЛЬНОСТЬ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН

03.00.02 - биофизика

Автореферат

диссертапии на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск - 128ь

Работа выполнена в НИИ технологии и безопасности лекарственных средств, пос.ртарая Купавна Московской области.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор - А.Г.Маленков

Официальные оппоненты - доктор физико-математических наук,

профессор Д.С.Чернавсшш; кандидат биологических паук А.Н.Руденок

Ведущая организация - Институт биологической физики АН CCGI

Защита состоится " QО " 1988 г. в . час.

на заседании специализированного совета Д.006.05.01 по защите докторских диссертаций по специальности "биофизика" при Институте фотобиологии AFI БССР (220733, г.Шнек, ул.Аяадемическая, 27),

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института фотобиологии АН БССР.

Автореферат разослан

(МЯЛ^ЪЯ 1988 г.

Ученый секретарь

специализирова/шого совета , jЛ.Ы.Шейко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. 3 самых разных разделах биологии накапливается материал, свидетельствуиций о ведущей роли структурных перестроек мембран в регуляции процессов деления, дифферен-цировки, функционирования клеток. Впервые гипотеза о структурно-мембранном механизме регуляции жизнедеятельности клетки была высказана С.В.Коневым в 1965 году и в дальнейшем развита его школой (Конев, 1965; 1987). Значительный вклад в развитие сходных представлений внесли и другие исследователи ( changeих et al. [967; Чернавский и др., 1977; Sackman , 1978; Намеот , 1984).

Обширный фактический материал свидетельствует о том, что 5иологические мембраны обладают свойством кооперативной системы i способны претерпевать генерализованные структурные переходы гаяду несколькими дискретными физическими состояниями. Коопера-жвность структурных переходов в значительной мере обусловлена саличием в мембране твердо-упругого каркаса (Конев, Мажуль, .977; Волков, Чернавснай, 1381).

Пре1фасным подтверждением этих представлений являются дан-ые о том, что в мембранах опухолевых клеток значительно снижена нутримолекулярная динамика белков (Лажуль и др., 1985). 3 то же ремя показано, что структурно-динамическое состояние мембранно-о каркаса клетки в значительной степени зависит от состояния ежклеточных контактов, а адгезионные свойства клеток модифици-уштся структурным состоянием мембран (Мажуль, 1985).

По-видимому, взаимообусловленное изменение структурно-дина-етеского состояния мембран л межклеточных контактов монет опре-элять основные особенности поведения опухолевой ткани. Т.е., эрошо экспериментально аргументированное представление о роли зменений адгезионных свойств клеток для явлений бластоглогенеза Прогрессии опухоли ( Coman , 1944; Abercromtie et al. , i53; Маленков, Модянова, I97I-I987; Лобанов, 1987) получает 1Нкретяое молекулярно-биологическое обоснование.

Результаты многочисленных экспериментов по индукции опухо-!Й у животных показывает, что развитие большинства опухолей яв-ется двухстадийным процессом. На первой стадии канцерогенеза, торая называется инициацией, возникают генетические, как прави-, необратимые изменения в небольшом числе клеток, на второй адаи - цромоциц - происходит длительное нарушение регуляции олифератпвных процессов и избирательное размнокение пнщииро-

ванных клеток. Вещества, реализующие каждую из этих стадий, выступают в роли инициаторов и промоторов канцерогенеза.

Выяснение механизмов и закономерностей действия промоторов необходимо для создания современной теории канцерогенеза. Чрезвычайно важно и своевременное выявление веществ, обладающих промоторной активностью.

Большинство исследователей, занимающихся изучением механизма действия промоторов канцерогенеза, считают, что наиболее вероятной мишенью для промоторов канцерогенеза являются клеточные мембраны и примембранные компоненты ( Borzsonyi et al. , 1984).

Отличительным свойством промоторов является пороговый характер и органоспецифичность действия. В моделях in vitro , которые обычно используются для изучения первичного эффекта промоторов на клетки, эти особенности действия не улавливаются.

Учитывая вышеприведенные факты, кажется, что одним из плодотворных подходов к выяснению механизма и закономерностей действия промоторов канцерогенеза может явиться изучение структурно-динамического состояния мембран и адгезии клеток при действии промоторов in vivo .

Пель и задачи работы. Целью настоящей работы являлось изучение действия промоторов канцерогенеза на адгезию клеток и структурную динамику мембранных белков органов-мишеней, а также разработка теоретических основ для создания экспрессного метода определения промоторной активности химических соединений различной природы.

Поставленную цель предполагалось достигнуть в результате решения следующих задач:

1. Исследовать действие промоторов канцерогенеза и их неактивных аналогов на адгезию клеток и структурно-динамическое состояние мембранных белков.

2. Изучить действие соединений, обладающих антипромоторной и антибластомогенной активностью на межклеточную адгезию и структурно-динамическое состояние мембранных белков.

3. Разработать экспресс-метод скрининга химических соединений, обладающих промоторной активностью.

Научная новизна работы. Показано, что в механизмах адгезии клеток в ткани in vivo ванную роль играет милдисекундная равновесная динамика мембранных белков. Впервые установлено, что промоторы канцерогенеза in vivo обладают способностью снижать

силу межклеточной адгезии низе порога устойчивости ткани к спонтанному бластомогенезу.

С помощью метода ТФКТ показано, что промоторы канцерогенеза изменяют структурно-динамическое состояние мембранных белков в клетках-мишенях.

Установлено, что сверхмалые концентрации ЦСГ^ы) промотора канцерогенеза печени фенобарбитала, проявляющие антипромоторный эффект, в противоположность высоким концентрация:/!, усиливают адгезию клеток и увеличивают уровень внутримолекулярной динамики структурных мембранных белков.

Селен и контактин, обладающие антибластомогенной активностью, также способны компенсировать снижение межклеточной адгезпи, вызванное промоторами канцерогенеза, и "растормаживать" динамику структуры мембранных белков гепатоцитов.

Практическое значение работы. Обнаруженное явление изменения межклеточной адгезии при действии промотора канцерогенеза позволило разработать экспресс-способ определения промоторной активности различных химических соединений, защищенный авторским свидетельством.. Способ позволяет определить пороговую дозу промотора, его органотропность и условия реализации промотирующего действия.

Показано, что при одновременном действии различных промоторов канцерогенеза суммарный эпуект на адгезию клеток оргала-:.!;-шени равен сумме эффектом по-отдельности.

Апробация работы. .'Материалы диссертации доложены на симпозиуме "Молекулярные и клеточные механизмы старения" (Киев, 1931); Всесоюзной конференции "Актуальные проблемы оценки уармакологп-ческой активности химических соединений" (Ногинск, 1581); конференции отдела химического канцерогенеза НИИ канцерогенеза ВОЩ ММ СССР (Ыосква, 1984); заседании Канцерогенного комитета (¡Москва, 1985); Г/ Рабочем совещании по ускоренному выявлению химических канцерогенов (Москва, 1586); секции Ученого совета ШЫ по БЙХС "Молекулярные основы биологических испытаний" (Ст.Купавна, Е986); 4-м Всесоюзном съезде онкологов (Ленинград, 1530); I шко-ие-семинаре "Регуляция тканевого гомеостаза. Нетоксическая профилактика и терапия хронических патологий (Кобулети, 1537).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных ра-5от (в том числе I признана изобретением).

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, об-

зора литературы, раздела: Материалы и методы исследования, 5 глав с изложением и обсуждение:.: результатов, заключения, выводов и списка цитированной литературы.

íviáTZPHAjLi и жтода ИССЛЩШАШЯ

/

Ьивотные. Исследования проводились на беспородных крысах-самцах весом 150-300 г и мышах-самцах линий С57В1/6У, СВЛ, Л/sn весом 20-30 г. Крыс содеркали в пластиковых клетках по 5 штук, мышеи по 10 штук на стандартной сбалансированной диете вивария ВОЩ Л СССР. Линейные мыш были получены из питомника "Столбовая".

Объекты исследования. Исследования проводили на печени, легких и щитовидной гюлезе крыс и мышей иябредных линий, отличающихся по генетической предрасполоаинности к возникновению опухолей в этих органах.

Используемые матет>иалц. В работе использовали ряд отечественных и зарубежных химически чистых препаратов: фенобарбитал Na (" Merk ", ФРГ), барбитал Na ( ЪКВ, Швеция), пентабарбитал Na

СССР), гексенал (г.Ш, СССР), амобарбитал (Ш, СССР), тио-барбитуровая кислота ( LKB, Швеция), 3-метилколантрен (" Fluka ", ¡Швейцария), Арохлор 1254 (" Geily США), 7,12-даЗА (" Пика ", Швейцария), В а Р (" Швейцария), ЭДТ (" ", CU),

цито:с£лазин В (" Aidrich", Бельгия), ццтохалазин а (" Merk ", wPD, колхицин С" Мегк "» винбластин сульфат («Ш, СССР),

уаллоидин (" Merk ФРГ), холестерин ("Спофа", ЧССР), твин 60 í; твин 80 ("спофа", ЧССР), конканавалин А (" sigma ", США), трипсин ("Спофа", ЧССР), SDS (" SiSraa ". США), Na -соль дез-оксихолиевой кислоты (" Serva ". ФИ"), бутилгидрокситолуол и буталгидроксианизол (ХП1, СССР), проназа (" Sigma », США), коллагена за (" Sigma Сил).

Способы введения, концентрации и дозы веществ указаны в результатах работы.

¡Летод измерения адгезионных взаимодействий клеток. Измерение величины ме;;скле точной адгезии производили путем определения силы, необходимой для отрыва клетки с помощью микроманипулятора по методу Конана ( Coman . 1344).

животных забивали путем дислокации шейных позвонков. Кусочки вырезали из края органа сразу же после забоя животного. Осто-ронно срезали плевру или капсулу, зацепляли кусочек неподвижно на стекле с помощью яелатина и погружали в каплю раствора Хенкса.

Величину адгезии клеток измеряли стеклянными иглам, изготовленными на специальной микрокузнице по метод/ Фонбрюна (йон-брюн, 1951). Они имели толщину кончика менее I мкм и были предварительно прокалиброваны на изгиб с помощью михфогрузиков.

Под микроскопическим контролем с помощью пневматического микроманипулятора Фонбрюна стеклянной иглой протыкали крайнюю клетку и осторожно оттягивали ее от кусочка ткани, всо время фиксируя положение измерительной иглы с помощью ризок окуляр-микрометра. При отрыве клетки изогнувшаяся игла резко выпрямляется. Измеряя расстояние между положением ее кончика до и после отрыва клетки, по калибровочным кривым рассчитывали величину межклеточной адгезии в динах па клетку. 3 каждой экспериментальной точке измеряли силу сцепления клеток у 2-3 зевотных. В каадом кусочке, в зависимости от разброса результатов измерений, адгезию определяли у 10-30 клеток.

Метод измерения мембранного потенциала клеток печени. Величину мембранного потенциала клеток печени измеряли общепринятым методом с помощью стеклянных микроэлектродов (3-20 Ыом), заполненных 31/1 КС1, подсоединенных через блок коммутации к высокооы-ному входу регистрирующего прибора (ЭД-05ГЛ). Микроэлектроды вводили в ткань печени микроманппуляторов и измеряли мембранный потенциал, регистрируя максимальные его значения.

Оценка ртр>ктгрной лабильности ¿.собранных белков гепатоиитов. Структурно-динамическое состояние мембранных белков определяли по изменению кинетики затухания триптофановой фосфоресценции при комнатной температуре (ТФКГ). Измерения проводили на высокочувствительной тау-фосфориметре с монохроматическим возбуждением, позволяющем регистрировать послесвечение с квантовым выходом

Установка для измерения Т<51СГ белков была создана в Институте фотобиологии АН БССР (¡.¡ажуль с соавт., 1975, 1980). Предварительными исследованиями, проведенными на изолированных плаз-латических мембранах и интактных клетках, показана высокая чувствительность параметров ТФКГ к функциональным и денатураиионным херестройкам мембран. Существенно, что мшишсекундкая ТйлТ кле-:ок определяется в основном белками мембранных структур, а не >астворимыми белками цитоплазмы и матриксов органелл (Мглуль,Т985).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЩЕЫИЕ

I. Структурное состояние мембран и адгезионные взаимодействия гепатоцитов у мышей с разной предрасположенностью к спонтанному бластомогенезу печени

В работах Ыодановой и соавторов было установлено четкое различие в адгезш клэток органов-мишеней у опдозитных по устойчивости к спонтанному бластомогенезу линии мышей: чем меньше величина межклеточной адгезии в данном органе, тем выше вероятность возникновения опухоли в нем (Мадянова и др., 1&83).

В соответствии с нашими представлениями следовало ожвдагь, что струкдурно-динамическое состояние мембранных белков будет отличаться / мышей с различной предрасположенностью к спонтанному бластомогенезу печени.

;<1ы исследовали параметры Т4?КТ клеток печени мышей-самцов трех линий: С5731 , А/Эп и СВА.

лак показали эксперименты, кинетические параметры ТФКТ клеток печени этих мышей существенно различаются. Наблюдается высокое соответствие между предрасположенностью к бластомогенезу, величиной адгезии и кинетическими параметрами ТФКТ гепатоцитов для всех линий (рис.1). Важно заметить, что различия в параметрах

V ,а -ы'

-0,5 гЬ 0,5-

-0,4 0,4"

-0,3 гН 0,3-

Г+-1

-0,2 0,2-

гП-

|-С-

"0,1 0,1-

—

12 ,12 12 А Б В

Рис.1 Кинетические параметры Т5КТ гепатоцитов мышей С57В1 (А), А/ (Б) СВА (В). I и 2 - время жизни быстрого и медленного компонентов соотвеэ

ств8нн0.

ТФКТ гепатоцитов наблюдаются.у швей с разной предрасположенностью к бластомогенезу узе в возрасте 1-2 месяцев, т.к. ото хорошо согласуется с данными по адгезии гепатоцитов.

Кроме того, нами были проведены эксперименты по выявлению различий в устойчивости мембранного потенциала этих линий мшей в молодом и зрелом воьрасге. Устойчивость мембранного потенциала оценивалась следующим образом: у мыши под наркозом вскрывали брюшину, перевязывали печеночную артерию и in vivo в течение 30 мин стандартным методом регистрировали мембранный потенциал гепатоцитов. Как показали эксперименты, различия в устойчивости мембранного потенциала мышей линии С57В1 и СБА возникают только в возрасте 5-6 месяцев.

П. Действие промоторов канцерогенеза на межклеточную адгезию и структурно-динамическое состояние мембранных белков

а) Дозово-временные зависимости действия промоторов на межклеточные адгезионные взаимодействия.

Для изучения промоторной активности веществ используются различные схемы введения промоторов: непрерывное в диете или питье, внутрибрюшинная инъекция или пероральное введение через зонд с интервалом от одного до нескольких дней. В классических опытах по индукции опухолей промотор канцерогенеза печени фенобарбитал (ОБ) добавляют в диету или в питье животным в определенной концентрации ( Peraino et al. , 1975). Ш исследовали, как изменяется величина адгезии гепатоцитов в разные сроки после введения трех различных концентраций шБ.

Мышам линии С57В1 , у которых частота возникновения спонтанных гепатом очень низкая (P<I/í) и соответственно высокая адгезия клеток (0,143 дин/кл), в питьевую воду добавляли §Б в концентрации 0,004%, 0,02% и 0,1%. В разные сроки измеряли величину адгезии гепатоцитов. Данные этого эксперимента представлены в таблице I.

Величина адгезии гепатоцитов уменьшалась уже на 2 сутки и в дальнейшем изменилась только для самой малой концентрации. ФБ не оказывал никакого влияния на адгезию клеток легких мышеи С57В1 , где он по данным Malninson et Beer (1984) не проявляет промоторной активности.

Таблица I.

Величина адгезии клеток печени мышей С57В1 при непрерывном потреблении фенобарбитала

Концентрация ФБ в питьевой воде Сила адгезии (дин/клетку)

2 сутки i j 4 сутки j 20 сутки

0 (контроль) 0,148 ± 0,005

0,004$ 0,125±0,005 0,127±0,006 0,035+0,005

0,02% 0,087±0,007 0,085±0,005 0,089±0,006

№ 0,069x0,008 0,054£й,С^7 Ü,C,S4±M,wüS

В следующем эксперименте мы изучали 7-дневную динамику изменения адгезии клеток печени и легких мышей при однократной инъекции бутилгидрокситолуола (EFT). По данным Витчи ЕГТ в дозе 100 мг/кг является промотором канцерогенеза легких у мышей линии A/Sn , если его вводить один раз в 5 дней внутрибрюшинно (Witschi et el. , 1983).

Мишам линии A/Sn вводили внутрибрюшинно 0,8; 5,0; 20; 50; 100 мг/кг веса тела Ш*Г в 0,2 мл оливкового масла. В контроле только масло. Как в печени, так и в легких величина адгезии клеток после введения ЕГТ в концентрации 50 и 100 мг/кг резко снижается уже в первые сутки и возвращается к исходному уровню лишь к 6-м суткам. При введении БГТ в дозе 10 мг/кг снижение силы межклеточной адгезии происходит лишь в первые сутки, а на вторые возвращается к норме. Дозы БГТ 0,8 и 4,0 мг/кг не изменяли адгезию клеток ни в печени, ни в легких.

Таким образом, в двух различных исследованных наш схемах введения промотора обеспечивается значительное снижение межклеточной адгезии в течение всого периода промоции.

б) Пороговое значение межклеточной адгезии и определение пороговой дозы промотора.

Установлено, что у половозрелых шшей низкораковых линий по печени величина адгезии клеток в этом органе всегда выше 0,100 дин/кл, в то время как у высокораковых линий всегда меньше этой величины. Такие же результаты были получены для легких мышей низко- и высокораковых линий, а пограничная сила сцепления для легких была 0,300 дин/кл (Модянова и др., 1980). Эти величины мы называем далее пороговыми или критическими силами адгезии кле-

ток печени и легких мшен.

В настоящее время для ряда промоторов канцерогенеза доказана пороговая зависимость эффекта от дозы. Пороговые концентрации определены для ФБ, ДДТ, ЕГТ, диэлдрина ( Goldsworthy et al. » 1984; Kitagawa et al.,1984} Maeura,Williams,1984; Tennekea,1982). Мы предположили, что наличие пороговой концентрации у промотора можно о6ъясещть тем, что именно сверхпороговые дозы сникают величину адгезии клеток органа-мишени ниже критической силы адгезии.

В нашем эксперименте крысы получали в питье разные дозы &Б: 0,002/»'; 0,01$; 0,05$ и 0,25$. Через 2-3 суток после начала введения измеряли величину адгезии гепатоцитов. Из данных, представленных на рис.2, видно, что адгезия клеток печени изменялась в зависимости от концентрации ФБ в питье. Снижение величины адгезии ниже порога устойчивости наблюдалось при концентрациях ФБ более 0,002$. Как раз эта доза, по данным, полученным двумя группами исследователей, является пороговой для этого вещества ( Peraino et al. , 1980; Goldsworthy et al. , 1984).

Таким образом, ш установили, что имеется полное совпадение порога устойчивости ткани печени к спонтанному бластомогенезу и величины адгезии гепатоцитов при введении пороговой дозы промото-

ра &Б.

05150

0,100

0,050

F диц/кл.

О оТШ 07ÍÜ 0715 Ü72Ü 0725 "питье

Рис.2 Изменение адгезии гепатоцитов беспородных крыс при потреблении разных концентраций в питье. По оси абсцисс - концентрация ФБ в воде,по оси ординат - величина адгезии.

в) Действие промотота канцерогенеза печеци ФБ на адгезию и структурно-динамическое состояние мембран гепатоштов мышей с разной предрасположенностью к возникновению опухолей.

Как отмечалось ранее, у мышей с разной предрасположенностью к возникновению спонтанных опухолей печени различаются по величине адгезии гепатопитов и структурно-динашческтг характеристикам мембран. Согласно нашим представлениям следовало ожидать, что при действии на печени этих мышей разных доз промотора гепатокан-церогенеза ФБ мы получим отличия в поведении вышеприведенных параметров.

Мыши линий С57В1 (низкораковая линия по печени), А/Бп (сред-нераковая), и СМ (высокораковая) были разделенн на 4 группы, и каждой из этих групп добавляли в питье разную концентрацию ¿Б, а через 2-3 дня измеряли адгезию гепатоиитов. Как показали исследования, при одних и тех не дозах йБ снижение адгезии тем больше, чем больше она у интактного животного, причем даже больше концентрации промотора вызывали небольшое снижение адгезии у мышей низкораковой лшлш.

Опираясь на данные этого эксперимента, можно сделать некоторые выводы об общности механизмов снижения адгезии клеток органа-:,гашени при действии промотора и недостаточного увеличения адгезии клеток органа в онтогенезе у мышей с высокой вероятностью возникновения опухолей в этом органо. По-видимому, эти два механизма жестко связаны, т.к. промотор почти не может изменить адгезию гепатоцитов у низкораковой печени линии мышей СЗА, у которых она и так низкая. При изучении микроструктурных особенностей межклеточных контактов печени у ыышей разных линий, отличающихся по адгезии клеток этого органа, было показано, что высокораковые линии имеют приблизительно в 3 раза меньше высокоадгезивных участков в зоне простого соединения и что величина адгезии прямо зазц-сит от числа этих участков (Модянова и др., 1980). Поэтому естественно было предположить, что промотор разрушает прежде всего именно высокоадгезивные участки простых соединений межклеточного контакта, не влияя на остальные ультраструктуры. Зто было подтверждено Ушаковым (1988).

методом ТФКТ также было показано, что ФБ в большей мере уменьшает структурно-динамическую подвижность мембранных белков у ыышей С57В1 , чем у А/эп , у которых она и так снижена (рис.3).

г) Суммашш действия промоторов канцерогенеза на межклеточную адгезию.

Для теоретических, а главное для практических целей было важно установить, суммируются ли эффекты двух различных промоторов на орган-мишень, мы исследовали вопрос о суммации эффектов двух различных промоторов канцерогенеза печени и БГТ на адгезию гепатоцитов мышей. Было показано, что при одновременном действии двух промоторов на орган-мишень происходит точная суммация их эффектов на адгезию клеток печени, т.е. снижение величины адгезии при одновременном введении БГТ и ФБ равно сукме изменений величин адгезии, когда эти вещества вводят по-отдельности.

д) Сравнение действия на межклеточную адгезию и структурную лабильность мембран промоторов и их неактивных аналогов, инициаторов канцерогенеза и полных канцерогенов.

Сейчас хорошо известно, что вещества, относящиеся к одному химическому классу и отличающиеся по химическому строению и своим' свойствам незначительно, совсем не обязательно обладают одинаковой промоторной активностью. £тот вопрос изучен детально в отношении форболовых эфиров - промоторов коаного канцерогенеза. Для печени единственным химическим классом, для которого проведен сравнительный анализ промоторной активности, является класс барбитуратов.

Представлялось интересным исследовать влияние различных барбитуратов на адгезию клеток печени, легких и щитовидной железы, а такие структурное состояние мембран гепатоцитов.

Мышам С а 731 и беспородным крысам вместо питьевой воды давали растворы различных барбитуратов в дозах, реализующих промотор-ный эффект. Через 1-3 суток определяли величину адгезии клеток. Из данных, приведенных в таблице 2, видно, что существует очень хорошая корреляция между способностью вещества снижать адгезию клеток печени нияе порога и его промоторной активностью. Фенобарбитал, барбитал и пентабарбитал снижают адгезию клеток печени значительно ниже порога, и, как известно, фенобарбитал и барбитал оказывают сильное проыоторное действие на опухоли печени и щитовидной железы крыс, а пентабарбитал - на опухоли печеци (см.табл.). Амобарбитал не снижает адгезию гепатоцитов крыс, что хорошо согласуется с отсутствием у него промоторной активности.

Интересным представляется тот факт, что барбитал значительно снижает адгезию гепатоцитов крыс, но не мышой С57В1 . Следует

Таблица 2.

Влияние различных веществ на силу адгезии клеток печени и щитовидной железы б/н крыс сУо*' и наличие у них дромоторного эффекта

т

Вещество

Доза

Способ ! введения! !

Печень т

Щитовидная железа

сила адгезии;промот. [сила адгезии ¡проглот, дин/кл ¡эффект ;

Ссылка

• , 1«. -дин/кл , эффект

Контроль 0.1Х4±0,004 0,ПЗ±0,002

I. Фенобарбитал 0,05$ в питье 0,053±0,002 © 0,066*0,004

2. Барбитал 0,05$ в питье 0,066±0,002 © 0,062±0,002

3. Амобарбитал 0,05$ в питье 0,П7±0,003 ©+ -

4. Пентабарбитал 0,05$ в питье 0,065±0,004 + -

5. ДЦТ 112 иг/кг в/бр в масле 0,058^0,003 ©

6. Метилхолантрен 50 мг/кг п/кож в масле 0,079+0,003 ©

7. Бутилгидрокси-толуол I г/кг в/кел в масле 0,079±0,004 © _

8. Бутилгидрокси-анизол 3 г/кг в/жел в масле 0,140±.0,005 © _

9. Бенз(а)пирен 80 мг/кг в/бр в масле 0,120±0,006

10. 7,12-ДША 30 мг/кг в/бр в масле 0,П7±0,004 - -

Условные обозначения: наличие дромоторного эффекта © на индукцию опухолей;

© ©

Рега1по et а^.,1975 Н1ааа е^. а1.,1982 Мог! вt а1.,1981 Рега1по et а1.,1975 вЫпогика а1.,1982 ЭЫпогика et аХ.,1982

Perai.no в* а1.,1975

ОаавЫта et а1.,1959

Маеига,Ш.11ата, 1984

Твийа вt а1.,1984

Tatematau вt а1.,1983 Tatematsu et а1.,1983

ю I

на индукцию предопухолевых изменений появление фокусов измененных клеток.

предположить, что он является промотором опухолей только для печени крыс. По нашим данным следует ожидать умеренную промоторную активность гексабарбитала для печени мышей и отсутствии ее у тио-барбит^ззой кислоты.

Бшхо также показано, что ФБ и пентабарбитал в активных дозах уменьшают время жизни медленного и быстрого компонента ТйО! в 1,5-2 раза (рис.3).

Другим интересным примером различной промоторной активности двух близких по химическому строению веществ является наличие промоторной активности у бутилгидрокситолуола и отсутствие ее у бу-тилгидроксианизола при действии на легкие мышей линии А/эп . «Ьд исследовали влияние этих двух веществ на адгезию клеток печени и легких мышей линии А/зп . Оказалось, что бутилгидрокситолуол, который является промотором опухолей легкого ( тшвсМ , 1977-1983), в дозах, соответствующее промоторным, снижает адгезию клеток легкого ниже порога, в то время как его неактивный аналог - бутил- ■ гидроксианизол ( ВД^зсМ. , 1381) - не изменяет величину адгезии клеток этого органа.

Рис.3 Изменение кинетических параметров ®КТ гепа-тоцитов мышей С57В1 при введении в питье £Б. I и 2 - вредя жизни быстрого и медленного компонента соответственно. К и 0 - параметры 'ККТ контрольных и опытных животных (пили 0,1% раствор «Б).

Гм»°

-0,4 1*1 0,4-

-0,3 0,3-

.0,2 0,2.

•од Г**" 0,1-

г«1-

12 12 К а

Таким образом, можно сделать вывод, что существует высокая корреляция между величиной снижения адгезии клеток органа-мишени в результате действия вещества и его промоторной активностью.

3 ускоренных тестах по определению промоторной и инициирующей активности веществ было показано, что 3,4,бенз(а)пирен (БП) и 7,12-диметилбензантрацен ($.1БА) являются инициаторами канцерогенеза и не обладают промоторной активностью для печени in vivo ( Tatematsu et al. , 1983). Оказалось, что ни БП, ни ДМБА не изменяют сцепления клеток печени (табл.2), что подтвердило наши предположения о том, что инициаторы, по крайней мере в ранние сроки канцерогенеза, не способны изменять адгезию клеток в органе-мишени.

Как уже говорилось ранее, вещества, являющиеся полными канцерогенами, должны обладать как инициирующей, так и промоторной активностью. По данным некоторых авторов ДЦТ и арохлор 1254 являются канцерогенами для печени ыышей. Они проявляют канцерогенное действие только при длительном введении, т.е. являются канцерогенами "поздних стадий".

исследовали влияние ДЦТ и арохлора 1254 на адгезию гепа-тошнов мышей C573L . Оба эти вещества сникают величину адгезии клеток печени ниже порогового уровня. Кроме того, било показано, что дЦТ значительно увеличивает и ts ТФКТ гепатоштов мьшш. Таким образом, канцерогены оказывают на мембраны и контакты такое же действие, как промоторы канцерогенеза.

Ш. Роль различных компонент белково-мем^ранного каркаса клеток в адгезионных взаимодействиях

«¡ихфотрубочки, ..тжиосуилалюнгы, мембрал:. ;; цементы экзоске-лета образуют единую систему - бежово-кембраяшй каркас ткани, который обладает способностью существовать в нескольких дискретных структурных состояниях. 1.'ы поставили своей задачей изучить влияние каздого из компонент мембранного каркаса на межклеточную адгезию.

Для избирательного действия на отдельные компоненты белково-меыбраняого каркаса ткани мы использовали цитохалазины В и Д (ДВ, дд), фаллоидин, колхицин, винбластин, винкристин, твин 60 и 8U, конканавалин А (КонА), холестерин, sds , трипсин, проназу и коллагеназу.

Кусочки печени и легких мышей ¡JSn, линейный размер которых

не превышал 0,5-1 см, инкубировали в 2 мл раствора этих веществ (в 199 среде) при t = 37°С в течение I часа. Диапазон исследуемых концентраций подбирали в соответствии с известными дозовыми зависимостями биологических эффектов этих веществ.

Б наших экспериментах ЦБ и ДД - агенты, избирательно разрушающие систему мшфофиламентов, в активных концентрациях значительно снижали величину адгезии клеток. Фаллоидин в концентрациях 1,0 и 10 мкг/мл увеличивает силу адгезии клеток до 0,130 дин/кл, а в концентрации 50 мкг/мл не изненяет ее. Известно, что именно в этой концентрации (50 мкг/мл) фаллоидин вызывает утечку красителей, введенных в клетки (Чайлахян и др., 1983), что, по-видимому, обусловлено его токсичностью.

В группе шажуля было показано, что ЦВ в концентрации 30 мкг/мл вызывает выраженное нарушение процесса переноса малых неорганических ионов и молекул органических веществ из клетки в клетку, а фаллоидин в концентрации 10 мкг/ш увеличивает межклеточную диффузионную связь у исходно слабо связанных клеток сланной железы дрозофилы (Мажуль и др., 1980). Эти факты свидетельствуют о влиянии систем микрофиламентов на структурное состояние мембран клеток и организацию щелевых контактов. Известно также, что под действием ЦВ клетки разъединяются в участках плотных соединений, а фаллоидин вызывает разрастание линий слипания плотных соединений (Фултон, 1987).

В следующей серии опытов было показано, что хорошо известные антитубулкны колхицин и впябластин в активных концентрациях (1-10 мкг/мл) значительно снижают величину адгезии клеток.

В качестве веществ, изменяющих структурное состояние мембран, мы использовали твия 60 и твин 80, конконавалин А, холестерин, sds t трипсин и проназу.

Известно, что твины увеличивают проницаемость мембраны для ионов и для белков. На модельных опытах показано, что твины вызывают структурную перестройку мембран, обусловленную изменением соотношений гидрофобных и гидрофильных групп при встраивании ;ix в мембрану ( Malenkov et al. , 1967). 3 наших опытах твин 30 в высоких концентрациях 5 V/V> уменьшал силу спеплеяия клеток на 13'/о, а более мягкий детергент твин 80 вообще не изменял 5е. КонА, который связываясь с рецептором увеличивает подвижность юмбранных белков и уменьшает шкровязкость липидного бислоя мембраны, в активных концентрациях (2 и 20 мкг/мл) вызывал уменыце-ше адгезии клеток на 17 и 28%.

Холестерин, как известно, стабилизирует лилидную часть мембраны, образуя прочные комплексы с гидрофобными хвостами фосфоли-пидов и тем самым уменьшая подвижность белков. В наших экспериментах холестерин в концентрации 0,2 мг/мл увеличивал адгезию клеток на 15$, а выше 2 ыг/мл на 50$.

Трипсин и проназа, которые вызывают ограниченный протеолиз белков, расположенных на внешней стороне мембраны, вызывали уменьшение адгезии клеток на 15-20$, причем в широком диапазоне концентраций эти изменения были одинаковы (10-100 мкг/мл).

Коллагеназа, которая разрушает межклеточный коллаген, оказывала действие, сходное с трипсином и пролазой, т.е. в широком интервале концентраций вызывала уменьшение адгезии на 15-18$.

Сопоставляя различные воздействия на отдельные компоненты твердо-упругого каркаса клетки, можно сказать, что агенты, непосредственно влияющие на цдтоскелет, оказывают более сильный эффект на адгезию клеток, чем агенты, избирательно изменяющие структурное состояние мембран. Важно отметить, что разрушение и мшерофиламентов и микротрубочек снижает адгезию клеток примерно в 2 раза, в то время как диффузионная связь между клетками изменяется только при изменении состояния шетемы микрогаиламентов.

Вышеприведенные данные обнарузеивают большой параллелизм изменений адгезионных и структурно-динамических свойств мембран при действии агентов, влияющих на элементы цитоскелета и мембраны. В обоих случаях имеет место ступенчатая зависимость измеряемых параметров от дозы, переход аз одного состояния в другое осуществляется в узком диапазоне концентраций. Саш концентрации, вызывающие такие переходы, близки или совпадают в разных группах опытов.

17. действие веществ, обладающих антибластомо-генной и антнпромоторной активностью, на межклеточную адгезию и структурное состояние мембран

В литературе показано, что при бластомогенезе происходит закономерное уменьшение адгезии клеток и уменьшение внутримолекулярной подвижности интегральных белков мембран. Нами было установлено, что промоторы канцерогенеза в эффективных дозах имен-

но в органах-ышенйх вызывают изменение адгезионных и структур-но-динаыических свойств мембран. Адгезионные свойства определяют взаимодействие клеток, а динамическая подвижность белков мембраны очень существенна для их реактивности. Поэтому вполне обоснованно считать, что характерные черты опухолевого процесса -утеря контроля деления и снижение реактивности клеток - коренятся в изменении адгезионных и динамических свойств мембраны. Исходя из этих соображений, можно считать, что по крайней мере некоторые вещества, обладающие антибластомогенными и ангилромотор-ными активности:,®, будут нормализовать свойства мембран, т.е. повышать адгезию и увеличивать подвижность основных структурных белков мембран.

Для проверки этого предположения мы выбрали 3 вещества, различающихся по химической природе - селен (se ), контакткн и фенобарбитал (сверхмаяые дозы).

Многочисленные эксперименты свидетельствуют о том, что является антибластомогеном широкого спектра действия. В частности показано, что если его добавлять в ищу крыса:«; в дозе 4 кг/кг, то снижается количество опухолей печени, индуикрованяыз азокра-ситолем ( Griffin, Jacobs , IS77).

3 нашх экспериментах Se значительно увеличивал адгезии а "растормаживал" динамику мембранных белков гепатопитов мышей высокораковой линии СВА. Уже через 1-2 суток величина адгезии увеличивалась в 3-4 раза, а '¡¿д и % g Т<Ш уменьшались на 22% и 4Гр соответственно.

Эндогенный тканеспецифический адгезионный фактор контакткн

7 о

в очень низких дозах (10 - 10 мг белка/шшь) увеличивает адгезию гепатооитов мышей высокораковой линии СЗЛ и способен значительно подавлять спонтанный и индуцированный бластомогенез (;>1о-дянова, Маленков, 1983). Показано, что контакты! увеличивает количество высокоадгезивны:с участков контактов между клетками печени мышей СВА (Ушаков, I960). В нашем эксперименте 4 группы :ли-шей лишш С57В1 в питье получали разные дозы ¿В. '1ерсз 2 дня каждую из этих групп подразделяли на подгруппы и внутрибрюшшно вводили по 0,2 мл препарата контактина, содержащего I0~J,

ГО мг/мл белка по Лоури. Зерез 24-36 часов измеряли величину адгезии клеток печени. Данные этого эксперамо^а ц^&дстьгкэш на зис. ^ . Таким образом, контактин в активных дозах частично или юлностью компенсирует нарушение межклеточной адгезии, вызванное

Р дан/кл д

мг/мл

Рис.4 Действие разных доз контактина на адгезию гепатоцитов предварительно ослабленную 5ББ. По оси абсцисс - концентрация контактина, по оси ординат - величина адгезии клеток. А - 0,004$, Б - 0,02$, В - 0,1&аБ в питье. П - порог адгезии.

промотором ¿Б, причем сохраняется колоколообразная зависимость активности препарата от дозы.

3 экспериментах по исследованию действия контактина на структурно-динамическое состояние гепатоцитов было показано, что он вызывает 2-3-кратное уменьшение времени затухания фосфоресценция триптофана (¿¡аауль, 1988).

В следующем эксперименте мышам А/Бп вводили внутрибрюшшно 10 мг/кг веса тела Б1"Г, а через сутки активную дозу контактина. Зде через сутки измеряли адгезию клеток печени и легких. Как оказалось, и в этом случае контактин компенсирует нарушение межклеточной адгезии, вызванной промотором БГТ.

При тщательном анализе литературных данных мы обнаружили, что Голдсворти с соавторами при исследовании дозовой зависимости промоторного эффекта <5Б проверили действие очень малой дозы ФБ -5*10"^ в диете - на частоту возникновения ПТ*" фокусов, предшественников опухолей. Оказалось, что при этой концентрации ФБ

- IS -

число фокусов достоверно меньше - в 3 раза по сравнению с числом опухолей при введении одного лишь инициатора ( Goldsworthy et al., IS84).

Ш изучили влияние малых доз ФБ на адгезию и ТФКГ гепатоци-тов мышей СБА. Как оказалось, если мыши СВА потребляли малые дозы ФБ в питье (от до 0,25'Ю-4$), уже на 2-3 сутки величина

адгезии генатоцитов значительно превышала пороговую (0,150 и 0,138 дин/кл). Малые дозы барбитала, не проявляющего цромоторно-го эффекта на печени мышей, такого эффекта не вызывали. Не изменяли они и адгезии клеток легких мышей A/sn (у которых она снижена), а ФБ, как известно, не промотор канцерогенеза легких. Аналогичные данные были получены по Т&КГ гепатонитов мышей СМ. На 2-3 сутки после введения ФБ наблюдалось уменьшение кривой затухания ТФКТ гепатоцитов на 10$, а на 14$.

ВЖОДЫ

1. На клетках тканей-мишеней Л1ший мышей, различающихся по устойчивости к спонтанному бластомогенезу, показано, что промоторы канцерогенеза и соединения с антипромоторной пли антибластогдо-генной активностью вызывают разнонаправленные изменения силы межклеточной адгезии, сопряженные с снмбатными сдвига\;и миллисекунд-аой равновесной динамики структуры мембранных белков.

2. В реализации эффектов, вызываемых соединениями с промотор-юй,антипромоторной а аитибластомогенной активностью, могут при-■шдать участие микрофпламекты и микротрубочкя.

3. Установлено, что промоторы канцерогенеза (но не их неактивные аналоги) при действии на клетки ткани-мишени устойчивых к ¡понтанному бластомогенезу линий шшей снижают силу межклеточной ¡дгезии до уровня, соответствующего тканям высокоракових линий. Сривая зависимости декремента силы адгезионных взаимодействий от концентрации промотора тлеет s-образннй вид, что указывает на ^оперативную природу процесса, Индуцированные промотором адгезионные эффекты хорошо коррелируют с затормаживанием миллисекундой внутримолекулярной динамики стр.,ктуры мембранных белков.

4. Обнаружено, что соединения, обладающие антипромоторной ктивностью, снижают индуцированные промоторами изменения силы цепления клеток и структурно-динамического состояния мембранных елков.

5. На примере фенобарбитала показано, что одно и то же со-

еданание в зависимости от используемой концентрации может обладать как промоторной, так и антипромоторной активностью, разнонаправленно изменяя как адгезивность, так и структурно-динамические свойства мембранных белков.

6. Предложен экспрессный способ С1финияга химических соединений, обладающих промоторной активностью, основанный на измерении величины адгезии клеток ткани-мишени.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Радкевич Л.А., Колотыгина И.М. Возрастные изменения устойчивости электрогенеза печехш мышей к ишемии.//В сб.: "Молекулярные и клеточные механизмы старения". Штериалы всесоюзного симпозиума, 1981.- Киев.- С.151.

2. Радкевич Л.А., Колотыгина И.Ы., Кабаков А.Ю. Мембранный потенциал клеток печени высокораковой и низкораковой линий мышей.// Онтогенез. 1982,- т.13.- С.545-547.

3. Колотыгина И.М., Маленков А.Г., ¡Жданова З.А. Экспрессное определение пороговых доз промоторов канцерогенеза.//А.с. - 1362266, 1987,4. Ыодянова Е.А., Колотыгина Й.ГЛ., Маленков А.Г. Порог устойчивости к спонтанному и индуцированному каяцерогонезу.//Тоз.докл. 4 Всесоюзного съезда онкологов.- 1986.-Ленинград.- С.545.

5. Колотыгина И.;Л., Маленков А.Г., ¡Жданова Е.А. Закономерности влияния промоторов канцерогенеза на систему механической интеграции ткани.//Биофизика, 1988,- 1» 5,- С.905.