Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функциональная геномика микоплазм при адаптации к стрессовым условиям внешней среды

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Функциональная геномика микоплазм при адаптации к стрессовым условиям внешней среды"

На правах рукописи

Фисунов Глеб Юрьевич

Функциональная геномика микоплазм при адаптации к стрессовым условиям

внешней среды

03.01.04 - Биохимия 03.01.03 - Молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

21 АВГ 2014

Москва-2014

005551817

005551817

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки «Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор,

член-корреспондент РАМН Говорун Вадим Маркович Официальные оппоненты: Северинов Константин Викторович

доктор биологических наук, профессор, ФГБУН Институт молекулярной генетики РАН, лаборатория регуляции экспрессии генов мобильных элементов прокариот, зав. лабораторией

Сергиев Пётр Владимирович доктор химических наук, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, химический факультет, кафедра химии природных соединений, профессор

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта Российской академии наук

Защита состоится «25» сентября 2014 г. в 13 часов на заседании диссертационного

совета Д 001.010.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении

«Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича»

РАМН по адресу: 119121, Москва, ул. Погодинская, д. 10, стр. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБУ «ИБМХ» РАМН

Автореферат разослан 4 * ^ ^^_2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, О/

кандидат химических наук Карпова Е.А.

Введение

Актуальность исследования

Микоплазмы — представители класса Молликут {Mollicutes). Термины микоплазмы и молликуты в настоящее время стали, в значительной степени, синонимами, хотя традиционная классификация выделяет в классе молликут род Mycoplasma. В настоящей работе эти термины будут употребляться как эквивалентные. Молликуты - специализированная ветвь микроорганизмов, родственная грамм-положительным бактериям и, в частности, Lactobacillus. Микоплазмы являются, как правило, облигатными паразитами, но среди них встречаются комменсалы, а также свободноживущие виды, которые могут быть факультативными паразитами. Важной особенностью микоплазм является редукция генома и связанная с ней общая редукция молекулярных систем клетки, что, по-видимому, обусловлено паразитическим образом жизни. Молликуты, за редким исключением, обладают сильно редуцированным метаболизмом, основным компонентом которого, чаще всего, является гликолиз. Mycoplasma genitalium с геномом в 580 тысяч п.о. является бактерией с наименьшим геномом, способной расти на искусственной питательной среде. Помимо общей редукции генома для микоплазм характерна редукция известных систем регуляции экспрессии генов. До настоящего времени единственным регулятором экспрессии генов, для которого известен механизм работы, для большинства молликут является репрессор белков теплового шока НгсА. Обнаружить регуляторные мотивы кроме CIRCE (сайт связывания НгсА) в геноме М. gallisepticum и геномах большинства других видов микоплазм пока не удалось и вряд ли удастся без привлечения дополнительных экспериментальных подходов. Другими особенностями Молликут является отсутствие клеточной стенки, низкий (около 30%) ГЦ-состав геномной ДНК, нестандартный генетический код, в котором кодон UGA кодирует триптофан, небольшой размер клеток (порядка 500-600 нм по длинной оси) и наличие у ряда видов уникальных механизмов подвижности, ассоциированных со специализированной структурой - терминальной органеллой.

Класс Молликут делится на несколько филогенетических ветвей. Они включают группу Pneumonia, группу Hominis, группу Spiroplasma/Phytoplasma и группу Hemoplasma. Mycoplasma gallisepticum, исследованная в данной работе -патоген птиц, принадлежит к группе Pneumonia. Она может заражать широкий репертуар хозяев, в том числе домашнюю птицу - кур и индюшек, а также диких птиц. Ближайшими родственниками Mycoplasma gallisepticum являются бактерии Mycoplasma pneumoniae и Mycoplasma genitalium, а также представители рода Ureaplasma, которые являются патогенами человека. Mycoplasma pneumoniae вызывает атипичную пневмонию, а другие виды - урогенитальные инфекции. Также в группу Pneumonia входит Mycoplasma penetrans, для которой показана способност проникать внутрь клеток хозяина. В связи с этим, Mycoplasma gallisepticum является важной моделью для изучения микоплазм, патогенных для человека, при этом оставаясь неопасной для исследователя. Другое важное свойство М. gallisepticum -она может расти в суспензионной культуре, что существенно упрощает стандартизацию проводимых экспериментов. Кроме того, М. gallisepticum в суспензионной культуре растёт значительно быстрее других видов группы Pneumonia.

Несмотря на разнообразие регуляторных систем у бактерий вообще, набор известных систем регуляции экспрессии у молликут является крайне ограниченным. В геноме М. gallisepticum можно обнаружить ряд потенциальных транскрипционных факторов, ряд глобальных транскрипционных регуляторов, а также несколько протеин-киназ и фосфатаз. При этом следует отметить, что несмотря на общую редукцию и наблюдаемую простоту организации, микоплазмы обладают высокими адаптивными возможностями и способны, в частности, успешно противостоять как антибиотикотерапии, так и защитным системам хозяина.

Большой объём работ по изучению ответа микоплазм на стресс был проделан международным консорциумом под руководством L. Serrano. В качестве модельного объекта была использована М. pneumoniae. Несмотря на проделанную работу, механизмы регуляции транскрипции остались невыясненными. Авторы делают вывод, что даже CIRCE-зависимые гены регулируются сложнее, чем только с

помощью НгсА. При этом, большинство регуляторных событий не могут быть объяснены.

С одной стороны, данные геномной аннотации микоплазм говорят в пользу ограниченных адаптивных возможностей. С другой стороны, на практике микоплазмы демонстрируют развитые способности к адаптации. В связи с этим, исследование адаптации микоплазм к стрессу представляет как теоретический, так и практический интерес. Небольшой размер генома также делает микоплазм удобным объектом для системных исследований, так как организация различных метаболических систем таких клеток лучше поддаётся описанию вследствие небольшого числа компонентов. Цели и задачи

Цель настоящей работы — описать молекулярные события, происходящие в клетках М. gallisepticum при адаптации к стрессовым воздействиям. В задачи настоящей работы входило:

1) Определение полной последовательности генома М. gallisepticum Бб для использования в качестве референсного в транскриптомных и протеомных исследованиях.

2) Создание биологических моделей стрессов.

3) Транскрипционное профилирование М. заШзерйсит с использованием высокопроизводительного секвенирования в тепловом, окислительном и осмотическом стрессах, а также в логарифмической и стационарной фазах роста. Валидация полученных данных с помощью количественной ПЦР. Создание карты транскрипционных единиц М. gallisepticum.

4) Протеомное профилирование М. gaШsepticum при адаптации к тепловом стрессе. Личный вклад автора

1. Дизайн и проведение биологических экспериментов, микробиологические работы (культивирование М. gallisepticum, отработка и создание стрессовых условий, определение кинетики роста, определение выживаемости, проведение реакции гемагглютинации).

2. Подготовка образцов для высокопроизводительного секвенирования, создание

технологии нормализации библиотек кДНК, полногеномное картирование

5

промоторов методом высокопроизводительного секвенирования. Постановка ОТ-ПЦР в реальном времени.

3. Сборка генома М. gallisepticum Б6.

4. Постановка одномерного и двумерного электрофореза, проведение трипсинолиза.

5. Обработка данных транскриптомного анализа.

6. Обработка данных протеомного анализа. Научная новизна и практическая значимость

Впервые проведено комплексное исследование адаптации бактерии к стрессовым условиям внешней среды на уровне транскриптомики и на уровн протеомики. Секвенирован геном М. gallisepticum Я6. Определена структур промоторов и сайтов связывания рибосомы М. gallisepticum Бб. Создана карта функциональных единиц в геноме М. gallisepticum Бб (промоторы, опероны, сайты связывания рибосомы, регуляторные последовательности). Идентифицированы гены, меняющие уровень экспрессии при стрессовых воздействиях (тепловой, окислительный, осмотический стресс, воздействие новобиоцина, карбонил-цианид 3-хлорфенилгидразона, резерпина, тетрациклина, ципрофлоксацина). Определены минимальные компоненты среды, необходимые для выживания М. gallisepticum в стрессовых условиях. Показано снижение представленности поверхностных антигенов М. gallisepticum при тепловом стрессе. Предложены механизмы стрессовой адаптации М. gallisepticum.

Настоящая работа является теоретической и экспериментальной базой для последующих прикладных исследований в области взаимодействия патогенных микоплазм с хозяевами. Работа может служить основой для последующих исследований образования антибиотикоустойчивости у микоплазм и механизмов ухода микоплазм от иммунного ответа. Разработанные методы нормализации библиотек кДНК для высокопроизводительного секвенирования и полногеномного картирования промоторов могут быть использованы в дальнейшем в любых научных проектах.

Апробация работы

Результаты диссертационной работы были доложены на расширенном заседании

Отдела Молекулярной Биологии и Генетики ФГБУН «НИИ ФХМ ФМБА России» 20

6

декабря 2013 года. Результаты работы были доложены на четырёх международных конференциях (Fisunov G. Y., Alexeev D. G., Demina I. A., Kondratov I. G., Serebryakova M. V., Govorun V. M. Reconstruction of the minimal cell proteome by comparative analysis of proteomes from three mycoplasma species. // Systems Biology of Microorganisms (Париж, Франция, 22-24 марта 2010), p. 98; Фисунов Г. Ю., Горбачёв А. Ю., Дёмина И. А., Говорун В. М. Регуляция экспрессии генов у Mycoplasma gallisepticum - бактерии с редуцированным геномом. // Acta Naturae. 2013. спецвыпуск №1 С. 45-46 (Тезисы конференции «Постгеномные методы исследования в биологии и медицине», Казань, 22-24 ноября 2012); Gorbachev A., Fisunov G., Govorun V. Regulation of gene expression in Mycoplasma gallisepticum: heat-stress model // EMBO Conference From Functional Genomics to Systems Biology (Гейдельберг, 17-20 ноября 2012), p. 156; Gorbachev A., Fisunov G., Govorun V. Regulation of gene expression in Mycoplasma gallisepticum-. heat-stress model // 38th FEBS Congress (Санкт-Петербург, 6-11 июля 2013), p. 56 Публикации

По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ в российских и иностранных журналах из перечня, рекомендованного ВАК Минобрнауки России. Структура и объём работы

Работа состоит из следующих разделов: введение, материалы и методы, результаты, заключение, выводы, список литературы (содержит 83 источника) и приложение. Работа изложена на 159 страницах, содержит 35 рисунков и 2 таблицы. Приложение содержит 12 таблиц.

Методы

Подбор условиИ стрессовых и иигибиторных воздействии

Аликвоты клеток М. gallisepticum подвергались различным дозам воздействия с определённым шагом. Например, для теплового стресса шаг дозы воздействия составлял 1°С, для антибиотиков - 1 мкг/мл, для NaCl 0,1 М. После воздействия определялся титр жизнеспособных клеток с помощью цветового теста. Также для теплового стресса проводился высев на колонии в полужидкую среду. В качестве

рабочей дозы воздействия выбиралась наибольшая, при которой ещё сохранялс исходный титр клеток (сублетальные дозы). Стандартным временем воздействия дл определения дозы воздействия был 1 час. Выделение РНК для высокопроизводительного секвенирования

Клетки напрямую лизировались с помощью реагента Trizol LS (Invitrogen) соотношении 1:3 клетки:Тпго1 LS. Далее проводилась экстракция хлороформом Затем к водной фазе добавлялся этанол до 35% об., и РНК выделялась с помощь колонки PureLink (Invitrogen). Концентрация РНК измерялась с помощь флуориметра Qubit (Invitrogen) и набора для измерения концентрации РН (Invitrogen).

Выделение и солюбилизаиия белка для 2Р-электрофореза

Клетки осаждались центрифугированием и промывались дважды с добавлением

ингибитора протеаз для удаления сывороточных белков. Клеточный осадок

лизировался с помощью CHAPS с добавлением смеси нуклеаз. Лизат подвергался

метанол-хлороформенной экстракции. Осадок белка растворялся в смеси 8М

мочевины, 2М тиомочевины, ЮМ Tris, 4% CHAPS. Концентрация белка

определялась с помощью набора Bicinchoninic acid protein assay kit (Sigma).

Секвенирование генома M. sallisepticum S6

Секвенирование генома M. gallisepticum S6 проводилось с помощью

секвенатора GS FLX (Roche) по протоколу компании производителя. Среднее

покрытие составило 300 прочтений на нуклеотид. Сборка контигов из прочтений,

полученных с помощью секвенатора GS FLX осуществлялась с помощью программы

MIRA 3 (http://sourceforge.net/projects/mira-assembler/files/). Контиги объединялись с

помощью ПЦР с последующим секвенированием ампликонов по Сэнгеру.

Секвенирование по Сэнгеру проводилось с помощью набора BigDye Terminator v3.1

Sequencing Kit (Invitrogen) и секвенатора ABI 3730XL (Applied Biosystems).

Полученные данные анализировались с помощью программы BioEdit.

Приготовление библиотек для высокопроизводительного направленного

секвенирования РНК

Для приготовления библиотек для высокопроизводительного секвенирования

использовались препараты тотальной РНК или РНК, обеднённой рРНК. Препарат

8

РНК подвергался фрагментации с использованием сульфата цинка или РНКазы III. В случае фрагментации сульфатом цинка РНК далее обрабатывалась полинуклеотидкиназой фага Т4 (Thermo). Затем происходило лигирование адаптеров и синтез кДНК. Для приготовления библиотек использовались наборы Total RNA-Seq Kit и SOLiD RNA Barcoding Kit (Life Technologies). Распределение длин фрагментов РНК измерялось с помощью капиллярного электрофореза на приборе BioAnalyzer 2100 (Agilent). Затем библиотека кДНК дважды подвергалась нормализации с помощью дуплекс-специфической нуклеазы ДСН (Евроген) с последующей амплификацией. Далее проводилась процедура секвенирования по протоколу компании производителя.

Приготовление библиотек для высокопроизводительного направленного секвенирования РНК, обогащенных 5 -концевыми последовательностями

РНК подвергалась фрагментации с помощью ZnSC>4 как описано выше. Затем РНК подвергалась обработке полинуклеотидкиназой Т4, как описано выше. Далее РНК обрабатывалась нуклеазой Terminator (Epicentre). После этого РНК обрабатывалась кислой фосфатазой табака (Epicentre). Далее проводилось лигирование адаптеров и синтез кДНК с последующей нормализацией ДСН однократно и секвенирование по стандартному протоколу. Анализ данных высокопроизводительного секвенирования

Прочтения картировались с помощью программы bowtie. Количественная обработка результатов проводилась с помощью пакета R с пакетами EdgeR и SAJR. Двумерный электрофорез

Препарат тотального белка М. gallisepticum подвергался окраске цианинами СуЗ или Су5 (GE Healthcare). Выравнивание по суммарной интесивности флуоресценции каждого из цианинов в паре проводилось с помощью одномерного электрофореза по Лэмли. Гель сканировался с помощью инструмента Typhoon. Затем измерялась суммарная флуоресценция для каждого образца с помощью программы ImageQuant. В результате вычислялся поправочный коэффициент для смешивания образцов перед нанесением образца на первое направление (изоэлектрическое фокусирование). Изоэлектрическое фокусирование проводили в трубочках в

градиенте pH 3-10. Второе направление проводили в денатурирующем полиакриламидном геле.

Трипсинолиз для проведения хромато-масс-спектрометрического анализа

Полиакриламидный гель нарезался на фрагменты 1x1 мм. Белки подвергались алкилированию с помощью йодоацетамида. Трипсинолиз проводился так же как в предыдущем случае. Пептиды экстрагировались 5% муравьиной кислотой и затем дважды 50% ацетонитрилом с 5% муравьиной кислоты. Экстракты объединялись и высушивались при 45°С на вакуумной центрифуге. Осадки растворялись в 50 мкл 5% ацетонитрила с 0,1% муравьиной кислоты. Хромато-масс-спектрометрическая идентификаиия пептидов

Идентификация пептидов проводилась с помощью масс-спектрометра TripleTOF 5600+ (ABSciex) с ионным источником NanoSpray III и хроматографической системой NanoLC Ultra 2D+ (Eksigent). Хроматографическое разделение проводилось в градиенте ацетонитрила в водном растворе (от 5 до 40% ацетонитрила за 120 мин.) с добавлением 0,1% муравьиной кислоты. Для хроматографического разделения использовались 75x150 мкм колонки с 3 мкм сорбентом Phenomenex Luna CI8 и потоком 300 nL/min. Для анализа пептидов использовался режим IDA, диапазон масс для анализа и последующего отбора родительских ионов составлял 300-1250 m/z, время аккумуляции сигнала составляло 250 мс. На основании MS1 спектра производился отбор 50 родительских ионов с максимальной интенсивностью в данном спектре для последующего MS/MS анализа. Разрешение квадруполя составляло 0,7 Да, диапазон измерения масс составлял 2001800 m/z, ионный пучок был оптимизирован для получения сигнала максимальной интенсивности. Время аккумуляции сигнала для каждого родительского иона составляло 50 мс. Для получения фрагментных ионов использовался механизм диссоциации с помощью соударения с молекулами азота. В процессе накопления сигнала энергия соударения линейно увеличивалась от 25 до 55 В. Уже проанализированные родительские ионы исключались из анализа на 15 с. Анализ хромато-масс-спектрометрических данных

Сырые данные анализировались с помощью программы ProteinPilot 4.5 revision

1656 (ABSciex). Для поиска пептидов использовалась база данных по всем белкам М.

10

gallisepticum S6. Поиск проводился с учётом триптического гидролиза и апкилирования остатков цистеина йодоацетамидом. Спектры группировались с помощью встроенного в ProteinPilot алгоритма ProGroup. Статистический анализ результатов проводился с помощью алгоритма ProteomicS Performance Evaluation Pipeline Software (PSPEP), встроенного в ProteinPilot. Измерение представленности белков с помощью MRM

Список родительских и фрагментных ионов был подобран на основе данных IDA. Для MRM использовались ионы, представленные во всех анализируемых состояниях. Для каждого белка было выбрано не менее трёх переходов. Результаты MRM анализировались с помощью программного пакета R. Для каждого состояния использовалось три биологических и три технических повтора.

Результаты

Была установлена нуклеотидная последовательность генома M. gallisepticum S6 (идентификатор в базе данных NCBI ASM21154v4). Трудность определения полной нуклеотидной последовательности M. gallisepticum состоит в том, что у данного (и некоторых родственных) вида микоплазм в геноме присутствуют протяжённые кассеты генов гемагглютининов vlhA. Гены гемагглютининов вместе с промоторами составляют более 2000 п.о. при длине кассет порядка 20000 п.о. Более того, гены vlhA являются высоко гомологичными с одной стороны и «мозаичными» с другой. Для решения этой проблемы была использована комбинация методов высокопроизводительного секвенирования и секвенирования по Сэнгеру. Далее нуклеотидная последовательность генома была использована в дальнейшем при проведении транскриптомных и протеомных исследований.

Для исследования адаптации M. gallisepticum к стрессу были созданы

соответствующие биологические модели. При их создании были поставлены две цели

- максимизация силы воздействия при сохранении жизнеспособности большинства

клеток. Первое условие было необходимо для обеспечения высокой амплитуды

ответа, регистрируемого в виде изменения уровней экспрессии генов.

Соответствующие дозы воздействий были названы нами «сублетальными дозами»

(Табл. 1). В опытах время воздействия составляло 30 мин, за исключением теплового

11

стресса, для которого была получена кинетика ответа, включавшая точки 5, 15 и 30 минут.

Воздействие Доза

Тепловой стресс 46°С

Окислительный стресс Н2Ог 0,02%

Осмотический стресс №С1 1,2М

Карбонил-цианид 3-хлорфенилгидразон 50 мкг/мл

Новобиоцин 50 мкг/мл

Резерпин 8 пмоль/мл

Таблица 1. Сублетапьные дозы воздействий на М. galUsepticum, определённые в данной работе.

Анализ транскрипционной активности генома М. gallisepticnm проводился с помощью высокопроизводительного секвенирования. Данные валидировались с' помощью количественной ПЦР в реальном времени (коэффициент корреляции порядка 0,8 для всех состояний). Для транскриптомных исследований использовалось направленное секвенирование нормализованной тотальной РНК, а также секвенирование библиотек, обогащенных 5'-концевыми участками мРНК. Процедура нормализации направленных библиотек кДНК и обогащения библиотек 5'-концевыми участками мРНК (см. рис. 1) были разработаны при выполнении диссертации. Процедура нормализации позволила увеличить представленность мРНК с 1% до 40% без искажения количественного соотношения кодирующих транскриптов, что было определено в дополнительных экспериментах.

ООО мрнк

о_рРНК + ТРНК

Химическая фрагментация ООО—

Починка концов ООО полинуклеотид-киназой

Обработка 5'-фосфат- «ууъ зависимой экзонуклеазой

°х°х

Обработка пирофосфатазой

Лигирование адапторов

Рисунок 1. Схема получения библиотеки, обогащенной -концевыми последовательностями.

Рисунок 2. Пример покрытия, получаемого в ходе транскриптомного анализа. Сверху идёт разметка генома (красным). Красным и синим обозначено покрытие в стандартных библиотеках по плюс и минус цепям соответственно. Зелёным обозначено покрытие в 5'-обогащённых библиотеках. Вверх направлены пики по плюс цепи, вниз - по минус. Видны пики, соответствующие сайтам инициации транскрипции (обозначены стрелками). Также виден антисмысловой транскрипт в гене GCW_00320 и его сайт инициации транскрипции. Покрытие по каждой цепи (верикальная шкала) нормализовано к максимальному покрытию по данной цепи, шкала двоичная логарифмическая, цена деления горизонтальной шкалы - 2,5 КБ.

Секвенирование библиотек, обогащённых 5'-концевыми последовательностями позволило нам установить строение промоторов М. gallisepticum. Промоторы М. gallisepticum включают консервативный ТАТА-бокс, который имеет последовательность TAWAAT и ряд сильных промоторов также имеет EXT (extended -10) элемент с последовательностью TRTG на расстоянии -1 п.о. от ТАТА-бокса. Присутствие -35 элемента обнаружено не было. Оптимальный спейсер между сайтом инициации транскрипции и ТАТА-боксом - 6 п.о., при этом спейсер также может иметь длину 5 или 7 п.о. Инициирующим нуклеотидом транскриптов М. gallisepticum может быть А или G, но не U или С. При этом, если U или С стоит на позиции -6, точка инициации транскрипции смещается на одну п.о., что обуславливает наличие промоторов со спейсером в 7 п.о. Для промоторов М. gallisepticum важно нуклеотидное окружение, которое должно быть АТ-богатым. Всего было картировано 828 сайтов инициации транскрипции, из них 324 были идентифицированы как основные, т.е. находились вблизи кодирующей области и имели максимальное локальное покрытие.

о

5'

3

-35

EXT -10

Рисунок 3. Строение сильного промотора М. gallisepticum.

Мы обнаружили, что длина 50% 5'-нетранслируемых областей мРНК М. gallisepticum находится в диапазоне 0-50 нуклеотидов. Максимум представленности 5- н стране л и ру е м ы х областей приходится на длину в 14 нуклеотидов. Сайт связывания рибосомы у М. gallisepticum имеет последовательность GAAAGGAG и гомологичен последовательности Шайна-Дальгарно у Е. coli. Диапазон оптимальных длин спейсера между сайтом связывания рибосомы и старт-кодоном у М. gallisepticum составляет 5-12 нуклеотидов.

В транскриптоме М. gallisepticum было обнаружено 32 антисмысловых РНК локализованных целиком внутри кодирующих последовательностей и составляющих не менее 100 нуклеотидов в длину. Мы определили, что наибольшие изменения в антисмысловой транскрипции происходят в тепловом стрессе. В этом состоянии увеличивают транскрипцию 15 антисмысловых РНК и 7 её снижают.

Транскриптомный анализ М gallisepticum был проведён в следующих состояниях: логарифмическая фаза, стационарная фаза, тепловой стресс в логарифмической фазе, окислительный стресс, осмотический стресс и тепловой стресс в стационарной фазе. В качестве критериев изменения экспрессии был использован порог достоверности q-value<0,05 и амплитуда изменения больше двух

Среди всех типов стресса наиболее сильный транскрипционный ответ, как по амплитуде, так и по числу задействованных генов наблюдался при тепловом стрессе в логарифмической фазе. В связи с этим для теплового стресса также была измерена

кинетика ответа в точках 5, 15 и 30 минут. Гены были кластеризованы на основе характера их ответа на тепловой стресс. В целом, можно выделить четыре основных типа ответа: быстрое увеличение транскрипции (максимум в точке 5 мин, 33 гена) с последующим выходом на плато или некоторым падением, постепенное увеличение транскрипции (максимум в точке 30 мин, 158 генов), быстрое падение транскрипции (минимум в точке 5 мин, 63 гена) и постепенное падение (минимум в точке 30 мин, 178 генов). Существует также некоторое число генов, не попадающих в один из этих типов. Можно предположить, что быстрые изменения связаны с регуляцией с помощью транскрипционных факторов, предсуществующих в клетке, в то время как постепенные изменения могут иметь в своей основе механизм глобальной регуляции или зависеть от синтеза транскрипционных факторов de novo.

В геноме М. gallisepticum аннотирован регулятор ответа на тепловой стресс НгсА, являющийся единственным транскрипционным фактором с известным механизмом действия и сайтом связывания (CIRCE). Поиск CIRCE по геному М. gallisepticum выявляет 5 таких сайтов в промоторах генов шаперонов clpB, Ion, dnaK, dnaJ_2, dnaJ_3a (GCW 01625). Гены, увеличивающие транскрипцию в ходе теплового стресса, относятся к разным функциональным группам. Среди них можно выделить гены шаперонов, субтилизиновых протеаз (не относимые к шаперонам), каналов и транспортёров, белков репарации ДНК, ферритиновых белков, белков кластера деления, метаболических ферментов, рибосомальных белков и факторов трансляции, а также большое количество генов белков с неизвестной функцией (65 в 30 минутном стрессе). Для генов с CIRCE в промоторах происходит увеличение транскрипции clpB, Ion, dnaK и dnaJ_3b. Среди генов уменьшающих уровень транскрипции в тепловом стрессе следует выделить гены гемагглютининов vlhA.

Для теплового стресса было проведено дополнительное картирование сайтов

инициации транскрипции. В результате было обнаружено, что при тепловом стрессе

начинают проявляют активность дополнительные «спящие» промоторы. Всего было

обнаружено 85 таких промоторов. Из них только 9 стоят около генов (не более 200

п.о.). Можно сделать вывод, что при тепловом стрессе происходит общая активация

транскрипции и, вероятно, это процесс носит, в основном, неспецифический или

«глобальный» характер. Это также согласуется с вышеописанными данными по

15

транскрипции генов. Генетической детерминантой увеличения транскрипции при этом может быть не сайт связывания транскрипционного фактора, а сама структура промотора. Для проверки этой гипотезы было проведено исследование влияния известных структурных элементов промотора М. gallisepticum на изменение транскрипции соответствующих генов. Мы обнаружили, что у промоторов с низким базовым уровнем транскрипции, которая при этом увеличивается при стрессе, в среднем, окружение является неоптимальным и реже встречается спейсер оптимальной длины. Среди промоторов с высокой базовой транскрипцией чаще встречается ЕХТ-элемент, причём доля таких промоторов выше среди тех, транскрипция которых возрастает при стрессе. Также у них преимущественно встречается оптимальный -10-бокс. Среди промоторов, транскрипция которых растёт (с низкой и высокой базовой транскрипцией), чаще встречается -10-бокс ТААААТ, а не ТАТААТ, и наоборот, среди тех, транскрипция которых падает, чаще встречается ТАТААТ.

Окислительный стресс задействует существенно меньше генов, нежели тепловой стресс, что, по-видимому, предполагает более специфичную регуляцию. Из тех генов, транскрипция которых растёт в окислительном стрессе, 10 непосредственно связано с защитой от него, а функция 7 неизвестна. В группу генов защиты от окислительного стресса входят гены, связанные с метаболизмом FeS-кластеров (организованы в один оперон): 2 гомолога sufB, sufC, niflj, csdA (цистеин-десульфураза) и шаперон dnaJ_4. По-видимому, М. gallisepticum аналогично Е. coli имеет специализированный шаперон dnaJ_4, ассоциированный с комплексом сборки FeS кластеров. В отличие от Е. coli у М. gallisepticum нет соответствующего гомолога DnaK. Также увеличивают транскрипцию гены метионин-сульфоксид редуктазы msrB (транскрипция msrA растёт, но ниже порогового значения), флаводоксина, азоредуктазы azoR и пероксиредоксина osmC.

Солевой стресс М. gallisepticum был нам интересен в связи с тем, что этот вид микроорганизмов может оставаться жизнеспособным в 1,2 М растворе NaCl (в два раза больше, чем в морской воде) в течение часа. Солевой стресс вызывает изменение транскрипции 91 гена (50 увеличивают транскрипцию, Приложение, Таблица 5). Из

них увеличивают транскрипцию 19 генов с неизвестной функцией.

16

В стационарной фазе транскрипционный профиль М. '¿аШхерИсит претерпевает драматические изменения. Прежде всего, они связаны с тотальным падением транскрипции большей части генов (636 гена, 88% белок-кодирующих генов). Среди генов, увеличивающих транскрипцию в стационарной фазе, преимущественно гены стрессового ответа, причём среди них есть гены ответа как на тепловой, так и окислительный стресс. Индукция ответа на тепловой стресс в стационарной фазе не происходит.

Рисунок 4. Количество генов, увеличивающих (А) и уменьшающих (В) транскрипцию в разных типах стресса. Синий - тепловой стресс, жёлтый - окислительный стресс, зелёный — солевой стресс, красный - стационарная фаза.

На основе транскриптомных данных было сделано предположение, что общая репрессия транскрипции в стационарной фазе может быть результатом снижения суперскрученности геномной ДНК. Влияние топологии геномной ДНК на транскрипцию было показано в ряде работ, причём отмнчалось, что релаксация ДНК, как правило, ведёт к снижению транскрипции. При этом существуют промоторы как, нечувствительные к суперскрученности ДНК, так и чувствительные. Для проверки этой гипотезы был использован ингибитор ДНК-гиразы новобиоцин. Для исследования влияния новобиоцина была измерена транскрипция 98 генов. В результате общая картина изменений на уровне транскрипции при обработке новобиоцином и в стационарной фазе оказалась схожей.

На основе данных по транскриптомике и протеомике было сделано предположение, что в ответе М. gallisepticum на тепловой стресс участвует клеточная мембрана. Для проверки этой гипотезы мы использовали ингибиторы АВС-транспортёров - резерпин и протонный ионофор СССР (карбонил-цианид 3-хлорфенилгидразон). Концентрации ингибиторов были подобраны как сублетальные.

Влияние этих соединений существенно отличалось. Резерпин почти не вызывал ответа на транскрипционном уровне. Обработка СССР вызывала сильный стрессовый ответ (наиболее сильный по амплитуде из всех, которые наблюдались). В целом, ответ на обработку СССР включал гены, участвующие в ответе как на тепловой стресс — группа СЖСЕ-зависимых генов и окислительный стресс, что позволяет предположить некий общий механизм индукции транскрипции соответствующих генов.

Можно предположить, что обработка СССР может вызывать истощение клеточного пула АТФ. Для проверки этой гипотезы был измерен уровень АТФ в клетках М. gaШsepticum в норме, в тепловом стрессе и при обработке СССР. Было показано, что уровень АТФ при обработке СССР не только не падает, но и незначительно растёт.

Протеомный анализ ответа М. gallisepticnm на стресс проводился на модели

теплового стресса. В тепловом стрессе в логарифмической фазе было обнаружено

изменение представленности 23 белков, а в стационарной фазе - 6 белков. В

тепловом стрессе в логарифмической фазе происходило увеличение

представленности шаперонов С1рВ, ЭпаК, и СгоЕЬ, Ре8-шаперона БиГС,

пероксиредоксина ОбшС, тиоредоксина, транспортёров На1А и Ро10, факторов

элонгации трансляции ЕР-Ти и ЕИ-Тв, НАДН-оксидазы, фактора созревания рибосом,

5-субъединицы РНК-полимеразы, трёх поверхностных антигенов семейства У1ЬА и

двух белков с неизвестной функцией. При этом происходило снижение

представленности фосфолипид-связывающего белка, а- и р-субъединиц пируват

дегидрогеназы, триозо-фосфат изомеразы и одного белка с неизвестной функцией.

Корреляция между изменением транскрипции и изменением трансляции наблюдалась

для небольшого количества генов, для которых характерно, во-первых, сильное

увеличение уровня транскрипции, порядка 10 раз и, во-вторых, наличие сильного

сайта связывания рибосомы. К таким генам относятся с1рВ и ИшА. Индукция РНК

гена с/паК незначительна, но, по-видимому, это компенсируется сильным сайтом

связывания рибосомы. Характер протеомного ответа на тепловой стресс позволяет

предположить, что тепловой стресс может быть связан с окислительным. Наиболее

сильной реакцией М gaШsepticum на тепловой стресс на белковом уровне является

18

уменьшение количества гемагглютининов VlhA. В популяции М. gallisepticum экспрессируется репертуар из нескольких белков VlhA. Для ряда гемагглютининов VlhA в тепловом стрессе 30 минут наблюдалось снижение представленности в 2-4 раза. Уменьшение количества гемагглютининов VlhA, зафиксированное с помощью протеомных технологий на физиологическом уровне должно приводить к снижению клеточной адгезии. Для проверки этой гипотезы нами был проведён тест на гемагглютинацию куриных эритроцитов. В результате было установлено, что после прогрева клетки действительно снижают способность к гемагглютинации. Снижение составляло порядка 4-6 раз, что соответствовало наблюдаемому снижению представленности гемагглютининов.

Обработка М. gallisepticum резерпином (ингибитором АВС-транспортёров) снижала сублетальную температуру до 43°С. Важность мембранного транспорта в тепловом стрессе была проверена экспериментально. Для этого тепловой стресс проводился в неполной среде, без глюкозы, сыворотки и дрожжевого диализата, но с добавлением триптозы. В результате было установлено, что минимальный состав среды, в которой выживаемость М. gallisepticum не ниже, чем в полной среде, включает неполную среду с добавлением цистеина и глюкозы.

Заключение

Настоящая работа является первым системным исследованием стрессового ответа, охватывающим все уровни адаптации, включая транскрипцию, трансляцию, и физиологию клетки. В данном исследовании изучение стрессовой адаптации проводилось на примере Mycoplasma gallisepticum — бактерии с ограниченным геномом, близким по своей организации к минимальному. В настоящей работе было проведено секвенирование генома М. gallisepticum S6, и полногеномное картирование транскрипционных единиц, включая промоторы и опероны. Были разработаны технологии подготовки библиотек кДНК, обогащенных 5'-концевыми последовательностями РНК и нормализации библиотек кДНК. Было проведено транскрипционное профилирование М. gallisepticum в разных стрессовых состояниях, включая логарифмическую и стационарную фазу роста, а также тепловой,

окислительный и осмотический стресс. В результате картирования сайтов инициации транскрипции была построена модель промотора М. gallisepticum. Были обнаружены новые гены, задействованные в ответе на стрессовые условия. Было проведено исследнование ответа М. gallisepticum на тепловой стресс на протеомном уровне. Некоторые протеомные данные (см. ниже) были верифицированы с помощью реакции гемагглютинации. Был проведён ингибиторный анализ с использованием ингибиторов ДНК-гиразы, ABC-транспортёров и протонного ионофора. Был установлен ряд питательных веществ, необходимых для выживания М. gallisepticum в тепловом стрессе.

В результате были обнаружены гены, участвующие в ответе на соответствующие типы стресса. Было обнаружено, что в тепловом стрессе происходит множественная активация дополнительных промоторов и возрастание антисмысловой транскрипции. Таким образом, глобальное изменение транскрипционного профиля, наблюдаемое в тепловом стрессе, объясняется, по-видимому, изменением физико-химических свойств промоторов при повышенной температуре и последующей конкуренцией между промоторами. Ингибиторный анализ показал, что глобальное изменение транскрипционного профиля в стационарной фазе вызвано, по-видимому, релаксацией геномной ДНК. Было показано, что тепловой стресс вызывает уменьшение представленности поверхностных антигенов (гемагглютининов), а также увеличение представленности белков не только теплового, но и окислительного стресса. Таким образом, можно заключить, что тепловой стресс является сигналом, с помощью которого М. gallisepticum воспринимает начало воспалительного процесса и запускает соответствующие адаптивные механизмы. Также было показано, что для выживания М. gallisepticum в тепловом стрессе нужен мембранный транспорт. В частности, клеткам требуются пептиды, глюкоза и цистеин. Было показано, что М. gallisepticum обладает механизмом межклеточного сигналинга, работающего при тепловом стрессе.

Работа поддержана грантом РФФИ 12-04-31696 «Поиск новых систем

регуляции экспрессии генов бактерий на модели Mycoplasma gallisepticum».

20

Выводы

1) Определена последовательность генома М. gallisepticum S6 (Идентификатор в геномной базе данных NCBI ASM21154v4).

2) Созданы in vitro биологические модели теплового, окислительного и осмотического стресса.

3) Идентифицированы гены, меняющие уровень транскрипции в стрессовых условиях и в разных фазах роста культуры. Проведены измерения уровня изменения транскрипции генов М. gallisepticum в стрессовых условиях. Показано, что в ответе на тепловой стресс активируется транскрипция генов, кодирующих белки защиты от окислительного стресса. Построена карта функциональных единиц в геноме М gallisepticum, включающая промоторы, терминаторы, опероны и антисмысловые РНК.

4) Идентифицированы белки М. gallisepticum, меняющие представленность в тепловом стрессе. Показано, что в тепловом стрессе у М. gallisepticum снижается представленность поверхностных антигенов и способность к гемагглютинации.

Публикации по теме работы

1. Fisunov G. Y., Alexeev D. G., Bazaleev N. A., Ladygina V. G., Galyamina M. A., Kondratov I. G„ Zhukova N. A., Serebryakova M. V., Demina I. A., Govorun V. M. Core proteome of the minimal cell: comparative proteomics of three mollicute species. // PLoS One. 2011. V. 6. № 7. P. 1-10 (e21964).

2. Gorbachev A. Y., Fisunov G. Y., Izraelson M., Evsyutina D. V., Mazin P. V., Alexeev D. G., Pobeguts О. V., Gorshkova T. N., Kovalchuk S. I., Kamashev D. E., Govorun V. M. DNA repair in Mycoplasma gallisepticum. // BMC Genomics. 2013. V. 14. № 1. p. 726737.

3. Vanyushkina A. A., Fisunov G. Y., Gorbachev A. Y., Kamashev D. E., Govorun V. M. Metabolomic Analysis of Three Mollicute Species. // PLoS One. 2014. V. 9. № 3. P. 1-16 (e89312)

4. Дёмина И. А., Серебрякова М. В., Ладыгина В. Г., Галямина М. А., Жукова Н. А., Алексеев Д. Г., Фисунов Г. Ю., Говорун В. М. Сравнительная протеомная характеристика микоплазм (молликут). // Биоорг. химия. 2011. Т. 37 № 1 С. 70-80.

5. Fisunov G. Y., Alexeev D. G., Demina I. A., Kondratov I. G., Serebryakova M. V., Govorun V. M. Reconstruction of the minimal cell proteome by comparative analysis of proteomes from three mycoplasma species. // Systems Biology of Microorganisms (Париж, Франция, 22-24 марта 2010), p. 98

6. Фисунов Г. Ю., Горбачёв А. Ю., Дёмина И. А., Говорун В. М. Регуляция экспрессии генов у Mycoplasma gallisepticum - бактерии с редуцированным геномом. // Acta Naturae. 2013. спецвыпуск №1 С. 45-46 (Тезисы конференции «Постгеномные методы исследования в биологии и медицине», Казань, 22-24 ноября 2012)

7. Gorbachev A., Fisunov G., Govorun V. Regulation of gene expression in Mycoplasma gallisepticum: heat-stress model // EMBO Conference From Functional Genomics to Systems Biology (Гейдельберг, 17-20 ноября 2012), p. 156

8. Gorbachev A., Fisunov G., Govorun V. Regulation of gene expression in Mycoplasma gallisepticum: heat-stress model // 38th FEBS Congress (Санкт-Петербург, 6-11 июля 2013), p. 560

Заказ № 28-Р/07/2014 Подписано в печать 11.07.14 Тираж 50 экз. Усл. п.л. 1,0

ООО "Цифровичок", г. Москва, Большой Чудов пер., д.5

тел. (495)649-83-30 (С^'А' www.cfr.ru ; e-mail: zakpark@cfr.ru