Фитопатогенность и адаптация к неблагоприятным условиям роста

Мухаметшина, Наталья Евгеньевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Фитопатогенность и адаптация к неблагоприятным условиям роста
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Фитопатогенность и адаптация к неблагоприятным условиям роста"

На правах рукописи

МУХАМЕТШИНА Наталья Евгеньевна

ФИТОПАТОГЕННОСТЬ И АДАПТАЦИЯ К НЕБЛАГОПРИЯТНЫМ УСЛОВИЯМ РОСТА АСНОЬЕРЬАБМА ЬАЮЬА Ш1РС8

03.00.12 - физиология и биохимия растений, 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань 2006

Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ патогенеза Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук

Научные руководители: доктор биологических наук

Владислав Моисеевич Чернов

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук Юрий Викторович Гоголев

доктор биологических наук, профессор Людмила Петровна Хохлова

доктор биологических наук, профессор Вадим Маркович Говорун

Ведущая организация: Институт биохимии

им. А.Н. Баха РАН (г.Москва)

Защита состоится 2006 г. в Мзасов на заседании диссертаци-

онного совета К 002.005.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при Казанском институте биохимии и биофизики КазНЦ РАН (420111, Казань, а/я 30, ул. Лобачевского 2/31).

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке Казанского научного центра РАН.

Автореферат разослан 2006г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

А.Б. Иванова

Актуальность проблемы. Значительный интерес к микоплазмам (класс Мо1-Исшез) обусловливается, с одной стороны, уникальностью биологии мельчайших прокариот, а с другой - диктуется практической необходимостью. Микоплазмы - основные контаминанты клеточных культур, широко используемых в биотехнологии, паразиты человека, животных, растений.

По вредоносности микоплазменные инфекции растений относят к катастрофическим заболеваниям, часто принимающим характер эпифитотий. Развитие этих инфекций, как правило, обусловлено нарушением симбиотического равновесия экосистем. Микоплазмозы растений широко распространены в регионах интенсивного растениеводства, в том числе в основных районах хлебопашества и овощеводства. Потери урожая зерна вследствие фитомикоплазмозов иногда составляют 80-90%, а овощей- 20-30% (Скрипаль, 1988).

Возбудителями микоплазменных инфекций растений являются представители родов АсИо!ер1азта, БрггорШта, а также группы Ph.ytopla.sma - ближайших родственников АсИокрЫта 1акИсги>И. ^

Подавление и контроль микоплазменных инфекций растений представляют проблему, разрешение которой связывают с выяснением молекулярных механизмов адаптации микоплазм, обеспечивающих персистенцию этих микроорганизмов и связанный с нею фитопатогенез. Отсутствие клеточной стенки, редукция генома и ограниченные биосинтетические возможности не являются для микоплазм существенным препятствием в преодолении разнообразных защитных систем высших организмов и выживании в неблагоприятных для роста условиях. Однако механизмы, обеспечивающие адаптацию и циркуляцию в природе мельчайших неспорообразующих прокариот, пока неизвестны. Уникальным видом микоплазм с точки зрения адаптивных способностей является А Шс11смИ - «вездесущая» микопдазма, обнаруживаемая в почве, компосте, сточных водах, клеточных культурах, тканях человека, животных и растений. При этом у растений, зараженных А 1аМ1т>п, развитие инфекций связано с колонизацией тканей мини-телами микоплазм - ультрамикроформами, размеры которых (менее 0,2 мкм) характерны для наноклеток бактерий. Феномен нанотрансформа-ции обнаружен у ряда бактерий, в том числе как адаптация микроорганизмов к неблагоприятным условиям роста. У некоторых фитопатогенных микроорганизмов соответствующие процессы сопровождаются изменениями вирулентных свойств. Од-

нако в отношении мельчайших неспорообразующих ^гйШ^ййШШйЛАЯгЬМАЯсЬедения

БИБЛИОТЕКА | о проведении подобных исследований отсутствуют. С0етев«*»г4в л

09 ш^аЖу';

Цель и задачи исследования. Выяснение особенностей фитопатогенности и адаптации к неблагоприятным условиям роста Acholeplasma laidlawii PG8 составило цель данной работы.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Оценить фитопатогенность штамма A.laidlawii PG8 в отношении Vinca minor L. и Pisum sativum L.- специфичного и неспецифичного индикаторов фитомикоплазмозов.

2. Выявить особенности окислительного стресса в фотосинтезирующих и нефотосин-тезирующих тканях растений, инфицированных микоплазмой.

3. Выяснить влияние неблагоприятных условий роста - ограничения субстрата, а также воздействия теплового шока и перекиси водорода на жизнеспособность клеток культуры A.laidlawii PG8.

4. Определить ультраструктурные и молекулярно-генетические особенности клеток A.laidlawii PG8 в неблагоприятных условиях роста (ограничение субстрата).

5. Оценить фитопатогенность адаптированной к неблагоприятным условиям роста культуры A. laidlawii PG8.

Научная новизна. Впервые показана фитопатогенность A.laidlawii PG8 в отношении как специфичного, так и неспецифичного индикаторов микоплазмозов растений - Vinca minor L. и Pisum sativum L. Установлено, что морфофизиологические, ультрацитоструктурные изменения, возникающие у растений в ответ на инфицирование A laidlawii PG8, связаны с трансформацией вегетативных клеток микоплазмы в мини-тела (ультрамикроформы). При этом инфицирование проростков Р sativum L. микоплазмой сопровождается реакциями ингибиции супероксиддисмутазы (СОД), активации нитрогенеза и перекисного окисления липидов (ПОЛ), динамика которых различается в фотосинтезирующих и нефотосинтезирующих тканях растений.

Впервые установлено, что адаптация A.laidlawii PG8 к неблагоприятным условиям роста (ограничение субстрата) in vitro связана с трансформацией вегетативных клеток микоплазмы в ультрамикроформы (наноклетки). Обнаружено, что в культуре клеток A.laidlawii PG8 присутствует два клеточных морфотипа микоплазмы - типичные (вегетативные) клетки (0,6 мкм) микоплазмы и ультрамикроформы (< 0,2 мкм), количественное соотношение которых зависит от условий роста. Обнаружено, что в средах с ограниченным субстратом наноклетки являются преобладающим морфоти-пом A laidlawii PG8. Ультрамикроформы образуют на агаризованных питательных средах нетипичные для микоплазм микроколонии; сохраняют потенциальную способность к пролиферации, реверсии и проявляют устойчивость к стрессорным воз-

действиям. Показано, что трансформация вегетативных клеток микоплазм в ультра-микроформы связана с существенной реорганизацией экспрессии генома.

Впервые установлено, что ДНК-связывающие белки наноклеток A laidlawii PG8 могут обусловливать аттенуацию амплификации оперона рРНК, содержащего гены тРНК микоплазмы. Предложены специфичные молекулярно-генетические зонды для дифференциальной диагностики вегетативных клеток и ультрамикроформ A, laidlawii PG8.

Впервые показано, что клетки адаптированной к неблагоприятным условиям роста культуры A laidlawii PG8 обладают более высокой фитопатогенностью по сравнению с клетками неадаптированной культуры микоплазмы.

Научно-практическая значимость.^ Полученные данные вносят вклад в понимание адаптивных реакций к неблагоприятным условиям роста A. laidlawii PG8 и особенностей фитопатогенности этой микоплазмы. Результаты работы могут служить основой для развития новых подходов к решению проблемы контроля микоплазмен-ных инфекций у растений.

Разработаны методы для исследования процессов адаптации к неблагоприятным условиям роста A laidlawii PG8 in vitro, а также способ (на основе метода ПЦР) дифференциальной диагностики вегетативных клеток и ультрамикроформ (наноклеток) A laidlawii PG8 - микоплазмы, вызывающей инфекции у растений, а также кон-таминирующей клетки высших эукариот, культивируемые in vitro.

Экспериментальные данные и методические приемы, изложенные в работе, могут быть использованы в медицинских, ветеринарных, сельскохозяйственных, биологических и биотехнологических учреждениях, занимающихся разработкой способов диагностики персистентных инфекций, а также в учебном процессе при чтении курсов лекций по микробиологии, стрессологии, биохимии и физиологии растений в ВУЗах.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа с 1999 - 2005 гт. проводилась в соответствии с планом научных исследований КИББ КазНЦ РАН по теме «Взаимодействие микоплазм с высшими организмами на молекулярно-генетическом уровне». Исследования автора, как исполнителя данной тематики поддержаны грантами РФФИ 98-04-48972, 01-04-49011, 0504-49435, а также грантом ведущей научной школы акад. И.А.Тарчевского. Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследованиях автора. Синтез праймеров, секвенирование нуклеотидных последовательно-

стей ДНК, а также двумерный электрофорез полипептидов проводились на базе Института физико-химической медицины МЗ РФ (г. Москва). Положения, выносимые на защиту.

1. Штамм A laidlawii PG8 является фитопатогенным в отношении как специфичного (V.minor L.), так и неспецифичного (P.sativum L.) индикаторов микоплазмозов растений.

2. Морфофизиологические, ультрацитоструктурные и биохимические изменения, возникающие у растений в ответ на инфицирование A.laidlawii PG8, связаны с трансформацией вегетативных клеток микоплазмы в мини-тела (ультрамикроформы).

3. Неблагоприятные условия роста A laidlawii PG8 in vitro обусловливают реорганизацию экспрессии генома и трансформацию вегетативных клеток микоплазмы в ультрамикроформы, которые устойчивы к стрессовым факторам и способны к реверсии.

4. Адаптированная к неблагоприятным условиям роста in vitro культура A laidlawii PG8 является более фитопатогенной, чем неадаптированная культура микоплазмы.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены на 4'й школе-конференции «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, 2000), Российских научных конференциях «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2000, 2003); 8'й международной школе - конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века» (Пущино, 2004), 2'й региональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Саратов,

2004), XIII международной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение» (Казань, 2005), Международной конференции «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия» (Вологда,

2005), Международной научной конференции, посвященной 200-летию Казанской ботанической школы (Казань, 2006), а также на итоговых конференциях Казанского Института биохимии и биофизики КазНЦ РАН (2003,2004,2006).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 13 научных работ, в том числе 2 статьи в центральных российских научных журналах.

Благодарности: Автор выражает глубокую признательность научному руководителю д.б.н. В.М. Чернову за всестороннюю поддержку; благодарит научного руководителя к.б.н. Ю.В. Гоголева за внимательное отношение к работе; д.б.н. O.A. Чернову за неоценимый вклад в обсуждение результатов и помощь в редакции диссертации; к.б.н. Ф.А. Абдрахимова за помощь в проведении электронно-микроскопических исследований; к.б.н. Т.Н. Нестерову и В.Ю. Горшкова за помощь в проведе-

нии экспериментов; д.б.н., профессора Г.И. Эль-Регистан и к.б.н. Ю.А. Николаева за предоставление алкилоскибензолов и консультации; к.б.н. Т.А. Акопиан за секвени-рование нуклеотидной последовательности ДНК, В.А. Карпова за синтез праймеров.

Структура я объем работы. Диссертация изложена на 157 страницах машинописного текста; состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы и приложения. В работе представлено 3 таблицы и 23 рисунка. Список цитируемой литературы содержит 246 наименований, из них 74 отечественных.

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Штамм Acholeplasma laidlawii PG8 был получен из коллекции микроорганизмов Института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи (РАМН, Москва). Штамм Acholeplasma sp. 118 был любезно предоставлен д.б.н. И.Г. Скрипалем (Институт микробиологии-и вирусологии им. Заболотного HAH Украины, Киев). Клетки А. laidlawii PG8 выращивали на модифицированной жидкой питательной среде Эдварда (Борхсениус, Чернова, 1989).

Оценку жизнеспособности культур микоплаЗм проводили по количеству коло-ниеобразующих единиц (КОЕ) в миллилитре культуры стандартным методом. Серии разведений в жидкой среде Эдварда использовали для определения количества жизнеспособных клеток методом конечных разведений (МКР) (Шлеева и др., 2003). О гомогенности и чистоте культуры судили по морфологии колоний на агаризованной среде Эдварда, а также с помощью ПЦР-тестов. Для получения культуры A laidlawii PG8, адаптированной íc неблагоприятным условиям, использовали метод индукции некультивируемого состояния у Salmonella typhimurium (Романова и др., 1995), который был модифицирован в соответствии с особенностями культивирования мико-плазм (Борхсениус, Чернова, 1989).

Семена гороха посевного (Pisum sativum L. сорт "ТАН") были получены из НПО "Нива Татарстана" (г. Казань). Инфицирование проростков гороха клетками А.laidlawii PG8 проводили спонтанным заражением через корневую систему, а также методом субэпидермальной инъекции Клемента (Чернов и др., 1996). Растения барвинка малого (Vinca minor L.) размножали вегетативно (черенкованием); инфицировали клетками A laidlawii PG8 методом Клемента.

Электронно-микроскопические исследования клеток микоплазм, культивируемых in vitro, а также тканей растений проводили на электронном микроскопе Hitachi-110 (Япония). Ультратонкие срезы получали на микротоме LKB-III (Швеция). Материал фиксировали глутаровым альдегидом (2,5%), приготовленным на фосфатном буфере (0,1М, рН 7.2), в течение 12 часов. Затем материал обезвоживали ацетоном и выдерживали в 0,1% OsOí, приготовленном на том же буфере, с добавлением 34 мг/мл сахарозы.

Активность супероксиддисмутазы (СОД) в тканях растений определяли согласно Gioannopolitis (1977). Концентрацию конъюгированных диенов в тканях растений измеряли по (Владимиров, Арчаков, 1972). Нитриты в тканях растений определяли по Х.Н. Починку (Починок, 1976).

Для выделения ДНК из клеток микоплазм и тканей растений использовали метод фенольной экстракции (Георгиев, 1959). Дополнительную очистку проводили с обработкой препаратов РНК-азой (Serva, ФРГ) и протеиназой К (Sigma, США) Выделение и очистку тотальной ДНК из клеток растений проводили с использованием СТАВ (Гловер и др., 1988). Электрофоретическое разделение ДНК проводили в агарозных гелях (0,6 - 2%) в горизонтальных блоках (Маниатис и др., 1984).

Секвенирование фрагментов ДНК осуществляли с помощью автоматического секвенатора ABI 3130 (Applied Biosystems, США) на базе лаборатории генной инженерии и иммуногенетики НИИ физико-химической медицины Минздрава РФ (г.Москва). Анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью пакета программ Informax Vector NT! Suite 9.

Для амплификации фрагмента ДНК A laidlawii PG8 были синтезированы прай-меры (НПО «ЛИТЕХ», Москва), комплементарные фрагментам генов 16S рРНК и 23S рРНК A laidlawii PG8, фланкирующим спейсерную область рибосомного оперона, по опубликованным последовательностям этих генов (Weisburg et al., 1989, Kong et al., 2001). Алкилоксибензолы с протяженностью алкильной цепи 7 и 12 атомов углерода (С7-АОБ, С12-АОБ) были любезно предоставлены д.б.н., проф. Г.И. Эль-Регистан (Институт микробиологии РАН, г. Москва).

Устойчивость клеток A laidlawii PG8 к стрессовым воздействиям оценивали по выживаемости клеток при инкубации их в растворе перекиси водорода (0,1% и 0,2%, 20 минут) и при термостатировании в течение 10 ~ 60 минут при 48°С.

Для сравнения белковых спектров ультрамикроформ и вегетативных клеток A ladlawii PG8 использовали метод двумерного электрофореза. Клетки предваритель-

но разделяли в градиенте перкола (15-40 %). Подготовку препаратов белков и электрофорез проводили на базе лаборатории генной инженерии и иммуногенетики НИИ физико-химической медицины Минздрава РФ (г. Москва).

Статистический анализ данных проводили с применением стандартных математических методов (расчет среднеквадратического отклонения, сравнение средних по критерию Стьюдента) средствами программ Microsoft Excel-2000. Критерий вероятности Р<0,05 принимали достаточным для достоверной разницы опытной и контрольной групп данных. Сравнение нескольких выборок, полученных в экспериментах, анализировали с помощью метода дисперсионного анализа (ANOVA) (Брандт, 2003). Сравнение частоты выявления морфологических отклонений у контрольных и опытных растений V. minor L. проводили с учетом требований, предъявляемых для анализа малочисленных выборок (Лакин, 1990).

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 2.1. Фитопатогенность штамма/i. laidlayvii PG8

Для оценки фитопатогенности штамма A laidlawii PG8 нами были проведены опыты по инфицированию проростков гороха посевного (Р sativum L.), а также черенков барвинка малого {V minor L.) - растений, являющихся, соответственно, неспецифичным и специфичным индикаторами фитомикоплазмозов. Растения инфицировали посредством субэпидермальной инъекции, а также (в случае гороха) и через неповрежденную корневую систему проростков.

В тканях всех инфицированных образцов Vminor L. (22 растения) на протяжении всего срока наблюдений (45 суток) микоплазмы удавалось выявить методом ПЦР со специфичными праймерами. При этом морфологические отклонения, характерные для фитомикоплазмозов, обнаруживались у 40% растений.

В результате анализа инфицированных образцов P. sativum L. (400 растений) было выявлено, что у 20% опытных растений возникало отставание в росте на 1015%, тогда как значительные морфологические аномалии у инфицированных растений не обнаружены.

Результаты контроля инфицируемости растений Р sativum L. микоплазмами с помощью ПЦР представлены в табл. 1.

Таблица 1.

Иифицируемость растений P.sativum L. клетками A laidlawii PG8 по результатам ПЦР

Исследованные растения

Время после инфици- Инфицированные (опыт)

рования Наличие Неинфицированные методом через корни

(в сутках) мико- (контроль) Клемента спонтанно

плазм корень побег побег корень побег

4 + 0 0 8 2 2

_ 12 16 ^ 10 7 7

8 + 0 0 0 1 2

_ 8 12 18 8 8

12 + 0 0 0 0 0

- 8 12 12 9 8

Полученные нами результаты по фитопатогенности A laidlawii PG8 с точки зрения критериев инфекционности и инвазивности подтверждают полученные ранее данные (Чернов и др., 1996) о способности микоплазмы инфицировать растения посредством проникновения в растения через неповрежденную корневую систему и мигрировать по проводящим тканям растений. Вместе с тем, данные таблицы 1 позволяют предполагать, что метод ПЦР с использованием праймеров SPACHS-АСН23А (Kong et al., 2001) для амплификации фрагмента оперона рРНК, который содержит спейсер, включающий гены тРНК A laidlawii PG8, неэффективен для выявления в тканях растений через 12 суток после инфицирования микоплазм, о персистен-ции которых свидетельствуют результаты трансмиссивной микроскопии.

При исследовании трансмикрографий ультраструктуры тканей высечек листовых пластинок растений Р sativum L., инфицированных A laidlawii PG8, было обнаружено, что клетки микоплазм способны связываться с клеточной стенкой растительных клеток. В месте контакта плазмалемма приобретала сильно извилистый контур в результате слияния с ней многочисленных везикул. При этом происходила деформация клеточной стенки, связанная с инвагинациями, направленными к центру клетки, что может свидетельствовать о пенетрации бактерий. Клетки A. laidlawii PG8 с морфологией, характерной для этих микроорганизмов при культивировании их in vitro, в клетках растений практически не выявлялись, но обнаруживались многочисленные, часто электронно-прозрачные везикулы диаметром 100 - 300 нм, имеющие характер-

ную толстую пограничную мембрану. Полученные данные свидетельствовали о том, что заселение клеток P.sativum L. микоплазмами сопряжено с трансформацией микроорганизмов, - преобразованием их в «мини-тела» (ультрамикроформы).

При исследовании трансмикрографий листовых пластинок растений на свету на четвертые сутки после инфицирования нами было обнаружено, что в пластидах формировались одна или две макрограны, в та время Уак в темноте сохранялись многочисленные индивидуальные граны. Тилакоидная система в последнем случае оказалась сильно деформированной. Крахмал присутствовал'в пластидах как на свету, так и в темноте. Полученные результаты согласуются с данными, полученными И.Г. Скрипалем (Skripal, 1997), - микоплазмы, попадая в клетки с хлоропластами, вызывают деструкцию пластид, дезорганизацию фотосинтеза во время световой фазы. При этом происходит неконтролируемый синтез фруктозо - 1,6 - бифосфотазы микоплазмы, который обусловливает накопление крахмала в хлоропластах и разрушение последних.

В клетках растений Р sativum L., инфицированных A.laidlawii PG8, наблюдались повреждения пероксисом. Пероксисомы содержат подавляющую часть клеточного пула катал азы и супероксиддисмутазы, принимающих участие в метаболизации активных форм кислорода и поддерживающих окислительное равновесие в клетке (Игамбердиев, 1991).

2.2. Особенности реакций окислительного стресса в тканях растений,

инфицированных A.laidlawii PG8: ПОЛ, активность СОД и нитрогенез

Микоплазменные инфекции индуцируют включение сигнальных систем растений, определяющих неспецифичную фитореакгавность, направленную на подавление патогенных микроорганизмов (Тарчевский, Чернов, 2000). Эта реактивность связана с повышением содержания активных метаболитов кислорода (АМК), интенсификацией деградации липидов и биополимеров (Тарчевский, 1994), увеличением содержания конъюгированных диенов (КД) - одного из основных показателей активации ПОЛ. На рис. 1 представлены данные содержания КД в клетках стеблей и корней в различные сроки после инфицирования растений микоплазмами. Уровень КД в корнях и стеблях опытных растений был повышенным по сравнению с контрольными значениями на протяжении 5-8 суток после инфицирования растений микроорганизмами, что свидетельствует о превалировании в исследуемых образцах процессов ПОЛ.

Опыт/контроль, %

уровень конъюгированных диенов в корнях инфицированных растений ■ контроль

п| уровень конъюгированных диенов в стеблях инфицированных растений

Рис. 1. Уровень конъюгированных диенов в фотосинте-зирующих и нефотосинтези-рующих тканях растений {P.sativum L ), инфицированных микоплазмами (A.laidlawi PG8) методом Клемента.

К десятым суткам уровень ПОЛ оказывался равным соответствующим показателям в контроле. Отклонения в количественных показателях параметров ПОЛ в различных частях растений (корнях, стебле) свидетельствуют о дифференциальной реактивности разных тканей растений в отношении инфекционных агентов. Более высокий уровень КД в стеблях инфицированных растений (по сравнению с уровнем КД в корнях) может быть связан с распространением вегетативных форм микоплазм (ВФМ) по растению. Снижение уровня КД к двенадцатым суткам развития инфекции коррелирует с трансформацией ВФМ в «мини-тела» (Чернов и др., 1996) Повышение уровня перекисного окисления липидов в тканях растений, инфицированных А \aidlawi РС8, может быть обусловлено реактивностью супероксидгенерирующей системы растений и/или выделением микоплазмами Н2О2 - неспецифического фактора токсикогенности микроорганизмов, ингибирующего активность СОД.

Результаты двенадцати экспериментов по определению активности СОД и содержания нитритов в тканях инфицированных растений представлены на рис. 2.

Полученные данные свидетельствуют об обратной зависимости активности СОД и образования нитритов в клетках растений, инфицированных А \aidlawii РС8. Снижение активности СОД способствует преобразованию 02~ в другие АМК в реакциях с N0 (Каюпова и др., 1983) и накоплению в соответствующих тканях растений нитритов и нитратов. Результаты этих экспериментов позволяют предполагать, что в фотосинтезирующих тканях растений, инфицированных микоплазмами, метаболиза-ция 02~ в значительной степени обеспечивается активностью ЫО-синтазы (конкури-

рующей с СОД за 02~) в начальный период после инфицирования. Таким образом, окислительный стресс в клетках растений, обусловливающий высокий поражающий эффект в отношении разных микроорганизмов, оказывается неэффективным средством фитозащиты против микоплазм. Растения не освобождаются от этих микроорганизмов, - клетки А.ШсИсмп Рв8 не погибают, но преобразуются в «мини-тела» (ультрамикроформы). В связи с этим адаптивные реакции микоплазмы в отношении неблагоприятных условий роста - воздействия биотических и абиотических стрессовых факторов представляют особый интерес.

опыт/контроль, % 250т

200 150 100 50

сутки

опыт/контроль, % б

200г

160 120 80 40

Л,

■ I _У 1

сутки

10 12

— - активность СОД - контроль --уровень нитритов

Рис. 2. Динамика активности СОД и уровня нитритов (NaN02) в фотосинтезирующих и нефотосинтезирующих тканях растений Р sativum L , инфицированных клетками A.laidlawii PG8: в корнях (а) и в стеблях (б).

3.3. Влияние неблагоприятных условий роста - ограничения субстрата, воздействия теплового шока и перекиси водорода на жизнеспособность клеток AJaidlawii PG8

Размеры персистирующих в тканях P. sativum L. «мини-тел» A laidlawii PG8, составляющие менее 0,2 мкм, соответствуют таковым для наноформ бактерий. Феномен нанотрансформации обнаружен у ряда бактерий, в том числе как ответная реакция микроорганизмов на стрессорные воздействия in vitro (Kajander et al., 1997; Вайн-штейн, Кудряшова, 2000). Однако в отношении микоплазм данные о проведении подобных исследований в литературе отсутствуют.

Для выяснения особенностей адаптивных реакций микоплазм к неблагоприятным условиям роста мы использовали способ ограничения субстрата (голодание), определяющего нанотрансформацию у ряда бактерий. Для этого клетки A laidlawii PG8

от длительно пассируемых активно пролиферирующих культур (АПК) помещались в обедненные среды, из которых были исключены глюкоза, дрожжевой экстракт и сыворотка крови, а температура культивирования была снижена с 37°С до 30°С. Перед помещением в обедненную среду клетки подвергались воздействию низких температур (1час при +8°С). Через различные промежутки времени культивирования в обедненной среде жизнеспособность клеточной популяции оценивалась стандартными способами (КОЕ, МКР).

В результате проведенных исследований нами было установлено, что клетки А.ЫсИсти Р08, попадая в обедненную среду, приобретают способность к длительному сохранению жизнеспособности (рис. 3). Такие культуры, адаптированные к неблагоприятным для роста условиям, длительно сохраняющие титр жизнеспособных клеток в условиях ограничения субстрата (голодание), названы нами непролиферирующими голодающими культурами (НПГК). Большая часть клеток НПГК А ЫсПажи Р08, как оказалось, утрачивает способность образовывать колонии В результате использования МКР для оценки жизнеспособности культуры были получены значения, превышающие десятичный логарифм КОЕ (рис. 3). Это позволяет предполагать, что в культуре А.Шс11ами РС8, находящейся в условиях голодания, с течением времени возрастает доля популяции клеток, для которых характерно не-культивируемое состояние.

Выживаемость,

% количества клеток от начального значения

Рис. 3. Зависимость выживаемости клеток А.Ыс11аи>Н Р08 от времени культивирования на богатых (м, □) и обедненных (•, о) средах, определенной методами КОЕ (и, •) и МКР (□, о).

При анализе суспензионных культур, получаемых на полноценной среде при максимальных десятикратных разведениях опытных культур (НПГК), нами было обнаружено, что эти культуры обладают сниженной скоростью роста, как в первом пассаже, так и в нескольких последующих (рис. 4)

Рис. 4. Количество клеток в опытной (о) - "оживленной" (второй пассаж после 480 суток культивирования на обедненной среде) и контрольной (•) - пролиферирующей культуре А.ШсНаки Р08 в зависимости от времени роста на полноценной среде Эдварда.

Максимальное значение КОЕ, достигаемое на стационарной фазе в полноценной среде, не превышало 6x106. После трех или более пассажей на полноценной среде эти культуры проявляли способность к реверсии. Такие культуры, адаптированные к неблагоприятным для роста условиям, находящиеся в процессе реверсии к исходному активно пролиферирующему типу, названы нами реверсирующими культурами (РК).

Нами обнаружено, что клетки длительно (более 90 суток) голодающих культур А.ШсИажи РС8 образуют вместо типичных колоний «яичница глазунья» микроколонии диаметром 50 - 300 мкм, а также аморфные колонии. Такие колонии образуют микоплазмы и при выделении их из почвенных образцов (Серебренникова, 2005). Вероятно, соответствующий тип клеток А.1а1сНан>И Рв8 распространен в естественных популяциях микоплазм, циркулирующих в природе.

Результаты исследований воздействия теплового шока и перекиси водорода на клетки опытной и контрольной культуры представлены на рис. 5.

При экстремальных концентрациях перекиси водорода, а также при длительном воздействии на них повышенных температур было обнаружено замедление скорости гибели микроорганизмов НПГК.

^ КОЕ/мл

Выживаемость, % 100 50

Выживаемость, %

10 5

0,01

Концентрация перекиси водорода, %

0,1

0,2

0 15 30 45 60 Время воздействия, минуты

Рис.5. Зависимость выживаемости клеток НПГК от концентрации перекиси водорода

(ЦПГК) (□) культуры A.laidlawii PG8.

Полученные данные позволяют предположить, что голодание культуры A.laidlawii PG8 может приводить к появлению более жизнеспособной популяции клеток микоплазм, образующих адаптированную к воздействию неблагоприятных условий роста культуру.

2.4. Ультраструктурные, биохимические и молекулярно-генетические особенности клеток культуры A. laidlawii PG8, адаптированной к неблагоприятным условиям роста

При анализе размеров клеток A laidlawii PG8 в опытных и контрольных культурах микоплазмы нами было обнаружено два класса клеток - «типичные» клетки микоплазмы с линейными размерами 0,5 - 0,8 мкм и ультрамикроформы с размерами менее- 0,2 мкм, которые соответствуют бактериальным наноформам. Данные, представленные на рис. 6, позволяют предполагать, что в неблагоприятных для роста условиях ультрамикроформы A laidlawii PG8 являются преобладающим морфотипом. Уменьшение размеров клеток микоплазмы происходит в результате неравного деления, чему предшествует интенсивная конденсация нуклеоида.

На ультратонких срезах микроколоний было обнаружено активное деление ультрамикроформ и появление «типичных» клеток микоплазмы (0.5 - 0.8 мкм). Это позволяет полагать, что размеры бактерий, способных к пролиферации и реверсии, могут быть меньше, чем у N sanguineum, - нанобактерий, выделенных из крови человека, которые считаются наименьшими ультрамикроформами бактерий.

(а) и от времени воздействия теплового шока (48°С, б); контрольная (■) и опытная

Рис. 6. Распределение размеров клеток A laidlawii PG8, выращенных на полноценной питательной среде (ш) и находящихся 21 сутки в условиях голодания (а).

В результате сравнительного анализа данных двумерного электрофореза полипептидов клеток двух морфотипов были обнаружены существенные различия в поли-пепидных спектрах двух субпопуляций A laidlawii PG8. По сравнению с типичными (вегетативными) клетками у ультрамикроформ не выявлено 42 полипептида, но обнаружено не менее 26 полипептидов, не регистрируемых у клеток A laidlawii PG8 с обычной морфологией. Полученные данные могут свидетельствовать о существенной реорганизации экспрессии генома микоплазмы при переходе вегетативных клеток в ультрамикроформы.

Реорганизация экспрессии генома при нанотрансформации у бактерий связана с изменением топологии ДНК (Салахетдинова и др., 2000). При этом может наблюдаться обратимый эффект аттенуации сигнала в отношении некоторых амплифицируемых участков генома. Подобный эффект обнаружен нами при выяснении особенностей амплификации двух различающихся по первичной структуре оперонов рРНК A laidlawii PG8 в случае диссоциации в популяции клеток культуры микоплазмы (рис. 7).

В геноме A laidlawii гены рРНК представлены двумя неидентичными оперона-ми - ггпА и ггпВ. В спейсерной области 16S-23S оперона ггпА присутствует вставка (210 пар нуклеотидных оснований), содержащая два гена тРНК микоплазмы. Размеры 16S - 23S спейсеров оперонов ггпА и ггпВ составляют 426 и 296 п.н.о. соответственно. Нами были синтезированы праймеры, комплементарные областям генов 16S и 23S, которые позволяют амплифицировать нуклеотидные последовательности спейсеров, а также примыкающих к ним фрагментов кодирующих зон генов 16S и 23 S рРНК.

Рис 7 Э шкфофореграмма амп.тиконов оперонов рРНК клегок A laidlawii PG8 На лорожках 2-6 преде 1авлены продукты амплификации ДНК к [еток контрольной (2) и опытной (3 4 - НПГК. <5 - РК 6 АПК) культур микоплазмы.

В результате ПЦР лизатов клеточных фракций, разделенных в градиенте плотности с соответствующими праймерами нами бы го установлено, что лля ДНК улъг-рамикроформ микоп тзмы характерна избирательная амплификация фрагмента «малого» оперона рРНК (гтВ).

Результаты определения первичной структуры ачплифипируемых участков двух оперонов рРНК A laidlawu PG8 свидетельствуют об отсугавии отклонений в соответствующих нуклеотидных последовательностях ДНК вегетативных клеток и ультрачикроформ Это позволяет предположить, что изменение доступности ДНК-матрицы в ПЦР у ультрамикроформ A laidlawii PG8 может быть обусловлено изменениями топологии ДНК Показано, что феномен обратимой апенуации ультрамикроформ ряда бактерий связан с присутствием белковых молеку л. имеющих высокое сродсгао к ДНК (Warner. Oliver. 1998) Ну клеопролеиновый комп гекс образуемый этими белками, не разрушается при фенольной экстракции и чувствителен к обработке протеиназой К Иигангирова и лр . 2003) Действительно, в наших экспериментах было обнаружено, чго ферментативная депротеинизация ДНК отменяет эффект атте-нуации амплификации фрагмента «большего» оперона рРНК (гтА) ультрамикроформ A laidlawu PG8. В результате электрофорстического разделения в 11ААГ белков, полученных из спиртовых осадков ДНК. нами были выявлены ДНК-связывающие белки ультрамикроформ (80, 37 кДа) и вегетативных клеток (48. 34, 25 кДа)

Дифференциальная амплификация спейсерной области 16S - 23S оперонов рРНК A laidlawu PG8 при использовании подобранных нами праймеров для ПЦР в клеточных лизатах может быть маркером диссоциации в популяции, связанной с переходом вегетативных клеток микоплазмы в ультрамикроформы.

1 2 3 4 5 6

2.5. Фитопатогениость клеток культуры A. laidlawii PG8, адаптированной к неблагоприятным условиям роста

Для ряда бактерий было установлено, что адаптация к неблагоприятным условиям роста может сопровождаться изменением их патогенности (Grey, Steck, 2001). Результаты сравнительного анализа фитопатогенности неадаптированной и адаптированной к неблагоприятным условиям роста культуры А. laidlawii PG8, исследованной на растениях, являющихся специфичным индикатором фитомикоплазмоза - барвинка малого (V.minor L.), представлены на рис.8.

Количество растений, %

□ — неинфИцированные растения (1)

растения, инфицированные клетками неадаптированной культуры (2) растения, инфицированные клетками адаптированной культуры (3)

ЗРП - задержка развития побега (в течение 45 суток), X - хлороз, Н -некроз, УЛ - увядание листьев, АРП - аномалии развития побега.

Рис. 8. Количество растений У.ттог Ь. с различными морфологическими отклонениями в контрольной и опытных группах *, ** - разница достоверна между группами 1 и 2; 2 и 3 соответственно.

Полученные данные позволяют заключить, что растения У.ттог Ь., инфицированные клетками адаптированной к неблагоприятным условиям роста A.laidlawii Р08, с высокой степенью достоверности отличаются по частоте проявления исследуемых отклонений в росте и развитии побегов как от контрольных неинфицированных растений, так и от растений, зараженных клетками неадаптированной к неблагоприятным условиям роста культуры микоплазмы. Адаптированная к неблагоприятным условиям роста культура A.laidlawii Рй8 является более фитопатогенной, чем неадаптированная культура микоплазмы. Наибольшие различия наблюдались в отно-

шении отклонений, специфичных для фитомикоплазмоза-хлороза и аномалий развития побега.

По данным ПЦР, клетки микоплазм присутствовали в тканях всех инфицированных растений. Вместе с тем, преимущественная амплификация «малого» ампли-кона оперона рРНК A laidlawii PG8, выявляемого на электрофореграммах ПЦР-продуктов, может свидетельствовать о преобладании в тканях всех инфицированных растений ультрамикроформ микоплазмы. В этой связи сравнительный анализ молеку-лярйо-генетических особенностей адаптации микоплазмы к неблагоприятным условиям роста in vivo и in vitro представляет значительный интерес с точки зрения возможностей формирования и эволюции системы "паразит-хозяин".

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Микоплазмозы растений широко распространены в зонах интенсивного растениеводства. Подавление микоплазменных инфекций представляет серьезную проблему, разрешение которой связывают с выяснением механизмов взаимодействия в системе "паразит-хозяин", определяющих адаптацию этих микроорганизмов к неблагоприятным условиям роста, обеспечивающую их персистенцию в клетках высших эукариот и циркуляцию в природе. Однако в этом направлении сделаны лишь первые шаги. Исследования соответствующих процессов сдерживаются отсутствием модельных систем "паразит-хозяин", эффективных средств диагностического контроля, а также трудностями культивирования этих микроорганизмов in vitro.

Разработанные нами модельные системы взаимодействия микоплазмы с растениями (A laidlawii PG8 - P.sativum L., A.laidlawii PG8 - Vminor L.), а также молеку-лярно-генетические зонды для выявления A laidlawii PG8 в любом биологическом материале, в значительной мере определили возможность проведения исследований, связанных с выяснением особенностей фитопатогенности и адаптации к неблагоприятным условиям роста A.laidlawii PG8.

В результате наших исследований впервые с точки зрения критериев вирулентности (инфекционностъ, инвазивность, персистенция, токсикогенность, агрессивность) показано, что A.laidlawii PG8 проявляет фитопатогенность как в отношении специфичного, так и неспецифичного индикаторов микоплазменных инфекций растений. У растений {P.sativum L.), инфицированных A.laidlawii PG8, возникают улыра-цитоструктурные и биохимические изменения, обусловленные реактивностью неспецифических сигнальных систем. Развитие микоплазменных инфекций связано с

трансформацией вегетативных клеток микоплазмы в мини-тела (ультрамикроформы) и сопровождается реакциями ингибиции супероксиддисмутазы, активации нитрогене-за, перекисного окисления липидов, динамика которых различается в фотосинтези-рующих и нефотосинтезирующих тканях растений. Размеры мини-тел (0.2 мкм) A laidlawii PG8, персистирующих в клетках растений, соответствуют таковым у нано-бактерий.

Феномен нанотрансформации обнаружен у ряда бактерий, в том числе как ответная реакция микроорганизмов на неблагоприятные условия роста in vitro. В наших исследованиях впервые показано, что адаптивные реакции A. laidlawii PG8 в отношении неблагоприятных факторов роста in vitro тоже связаны с трансформацией вегетативных клеток микоплазмы в ультрамикроформы (наноклетки). Ультрамикроформы A laidlawii PG8 проявляют высокую устойчивость к стрессорным воздействиям in vitro и сохраняют потенциальную способность к пролиферации, а также реверсии. Трансформация клеток A laidlawii PG8 в ультрамикроформы, как выяснилось, связана с существенной реорганизацией экспрессии генома, что может определять изменения метаболизма и, соответственно, патогенности микроорганизмов.

Действительно, в результате сравнительного анализа было обнаружено, что адаптированная к неблагоприятным условиям роста культура A laidlawii PG8 является более фитопатогенной в отношении специфичного индикатора фитомикоплазмоза -V minor L , чем неадаптированная культура микоплазмы.

Наличие в жизненном цикле A laidlawii PG8 адаптивных к неблагоприятным факторам роста бактериальных форм - наноклеток, обладающих отличной от вегетативных клеток молекулярной и клеточной биологией, а также патогенностью, определяет необходимость разработки нового подхода к решению проблемы взаимодействия микоплазм с высшими организмами и контроля микоплазменных инфекций.

Известно, что микоплазмы (A laidlawii) способны проникать в растения через неповрежденную корневую систему из почвы. На твердых питательных средах почвенные изоляты A laidlawii формируют микроколонии, образуемые ультрамикрофор-мами микоплазмы (Серебренникова, 2005). Обнаружение ультрамикроформ микоплазмы представляет проблему. В этой связи предложенный нами вариант ПЦР со специфичными праймерами для амплификации фрагментов оперонов гтА и rrriB A laidlawii PG8 может быть эффективным способом обнаружения в природных источниках вегетативных клеток и ультрамикроформ A.laidlawii, а также выявления процессов диссоциации в популяции клеток культуры микоплазмы.

ВЫВОДЫ

1. Штамм Acholeplasma laidlawii PG8 является фитопатогенным в отношении как специфичного (Vinca minor L.), так и неспецифичного (Pisum sativum L.) индикаторов микоплазмозов растений. Заражение растений клетками культуры микоплазмы методом Клемента (инъецированием), а также через неповрежденную корневую систему (спонтанно) вызывает микоплазменные инфекции у 40% образцов Vinca minor L. и у 15 - 20 % Pisum sativum L.

2. У растений (Pisum sativum L.), инфицированных Acholeplasma laidlawii PG8, возникают ультрацитоструктурные и биохимические изменения, обусловленные реактивностью неспецифических сигнальных систем. Развитие микоплазменных инфекций связано с трансформацией вегетативных клеток микоплазмы в мини-тела (ультрамикроформы) и сопровождается реакциями ингибиции супероксиддисмутазы, активации нитрогенеза, перекисного окисления липидов, динамика которых различается в фотосинтезирующих и нефотосинтезирующих тканях растений.

3. В культуре клеток Acholeplasma laidlawii PG8 (in vitro) присутствуют два клеточных морфотипа - типичные клетки микоплазм (0.5-0.8 мкм), и ультрамикроформы (0.2 мкм). Количественное соотношение клеток двух морфотипов в культуре Acholeplasma laidlawii PG8 изменяется в зависимости от условий роста культуры. Ограничение субстрата приводит к преобладанию ультрамикроформ.

4. Наноклетки Acholeplasma laidlawii PG8 проявляют высокую устойчивость к стрессовым воздействиям (повышенная температура и обработка Н202) in vitro, образуют на авизованных питательных средах нетипичные для микоплазм микроколонии и сохраняют потенциальную способность к пролиферации и реверсии.

5. Полипептидные спектры клеток разных морфотипов Acholeplasma laidlawii PG8 имеют существенные различия. У ультрамикроформ присутствуют 26 специфичных полипептидов (в том числе ДНК-связывающие белки - 37 кДа и 80 кДа), но отсутствуют 42 полипептида (в том числе ДНК-связывающие белки - 25 кДа, 34 кДа и 48 кДа), которые характерны для вегетативных клеток Acholeplasma laidlawii PG8.

6. ДНК-связывающие белки наноклеток обусловливают аттенуацию амплификации оперона рРНК, содержащего гены тРНК Acholeplasma laidlawii PG8, при ис-

пользовании в ПЦР со специфичными праймерами для выявления оперонов рРНК микоплазмы клеточных лизатов.

7. Адаптированная к неблагоприятным условиям роста культура Acholeplasma laidlawii PG8 является более фитопатогенной, чем неадаптированная культура микоплазмы. Инфицирование растений (Vinca minor L.) клетками (Ю5 клеток/растение) адаптированной культуры Acholeplasma laidlawii PG8 (2-й пассаж на полноценной среде после 400 суток культивирования на среде с ограничением субстрата) вызывает характерные для фитомикоплазмозов морфофизиологические изменения у 85% растений через 12 суток после инфицирования, тогда как инфицирование растений Vinca minor L. клетками (107 клеток/растение) пролиферирующей культуры (стационарная фаза роста на полноценной среде Эдварда) вызывает соответствующие морфофизиологические изменения у 40% растений через 30 суток после инфицирования.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Влияние инфицирования растений Pisum sativum клетками Acholeplasma laidlawii на перекисное окисление липидов и активность супероксиддисмутазы / Н.Е. Мухаметшина, Т.Н. Нестерова, Ю.М. Тихонова и др. HIV школа-конференция «Горизонты физико-химической биологии»: Сб. тез. -Пущино, 2000. - Т. 1. - С. 316-317.

2. Инфицирование растений (Pisum sativum) микоплазмами (Achopleplasma laidlawii): ультрацитоструктурные, биохимические и молекулярно-генетические особенности взаимодействия в системе «паразит-хозяин» / В.М Чернов, O.A. Чернова, Ф.А. Абдрахимов и др. //1 Всероссийская конференция по иммунитету растений к болезням и вредителям: Сб. тез. - СПб, 2002. - С. 83 - 84.

3. Interplay between plants and mycoplasmas cellular-molecular peculiarities of the * host responses to the parasite / V.M. Chernov, F.A. Abdrakhimov, N.E. Moukhametshina et

al. // 14th International Congress of IOM: Ann. abstr. - Vienna, 2002. -P. 150.

4. Адаптация микоплазм к биогенным и абиогенным стрессорам: наннотранс-формация и мини-тела / В.М. Чернов, Ю.В. Гоголев, Н.Е. Мухаметшина и др. // ДАН. - 2004. - T. 396.-N3.-C. 1-4.

5. Мухаметшина Н.Е. Адаптация микоплазм к биогенным и абиогенным стрессорам: наннотрансформация и мини-тела Acholeplasma laidlawii / Н.Е. Мухаметшина, Ю.В. Гоголев, В.М. Чернов // VIII международная школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века»: Сб. тез. - Пущино, 2004. - С. 155 - 156

6. Горшков В.Ю. Модификация рибосомного оперона Acholeplasma taidlawii при адаптивных стрессовых реакциях / В.Ю Горшков, Н.Е. Мухаметшина, Ю.В. Гоголев // II региональная конференция молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой»: Сб. тез. - Саратов, 2004. - С. 16.

7. Адаптивные реакции микоплазм in vitro: трансформация клеток Acholeplasma laidlawii в нанноформы / Н.Е. Мухаметшина, Ю.В. Гоголев, Ф.А. Абдрахимов и др. // II региональная конференция молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой»: Сб. тез. - Саратов, 2004. - С. 46 - 47.

8. Горшков В.Ю. Дифференциальная амплификация в ПЦР области рибосомного оперона вегетативных и гипометаболических форм Acholeplasma laidlawii / В.Ю Горшков, Н.Е. Мухаметшина, Ю.В. Гоголев // Итоговая научно-образовательная конференция студентов КГУ: Сб. тез. - Казань, 2005. - С. 5 - 6.

9. Адаптация микоплазм к неблагоприятным условиям: ультрамикроформы и мини-тела / Н.Е. Мухаметшина, Ю.В. Гоголев, В.Ю. Горшков и др. // XIII Международная конференция «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение»: Сб. тез. - Казань, 2005. - С. 68 - 69.

10. Сравнительные характеристики взаимодействия растений (Vinca minor) с вегетативными клетками микоплазм (.Acholeplasma laidlawii) / Ю.В. Гоголев, В.Ю. Горшков, Т.Н. Нестерова и др. // Международная конференция «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия»: Сб. тез. - Вологда, 2005.-С. 46.

11. Ультраструктурные и биохимические особенности взаимодействия растений (Pisum sativum) и микоплазм {Acholeplasma laidlawii) / Н.Е. Мухаметшина, Ю.В. Гоголев, Ф.А. Абдрахимов и др. // Международная конференция «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия»: Сб. тез. - Вологда, 2005.-С. 120.

12. Адаптивные реакции микоплазм in vitro: «жизнеспособные, но некультиви-руемые формы» и нанноклетки Acholeplasma laidlawii / В.М. Чернов, Ю.В Гоголев, Н.Е. Мухаметшина и др. // Микробиология. - 2005. - Т. 74. - N 4. - С. 498 - 504.

13 Горшков В.Ю. Адаптивные и фитопатогенные свойства ультрамикроформ микоплазм (Acholeplasma laidlawii) / В.Ю. Горшков, Н.Е. Мухаметшина, Ю.В. Гоголев // Международная научная конференция, посвященная 200-летию Казанской ботанической школы «Вопросы общей ботаники: традиции и перспективы»: Сб. тез. -Казань, 2006. - С. 144 - 146.

Отпечатано в ООО «Печатный двор», г. Казань, ул. Журналистов, 1/16, оф.207

Тел: 272-74-59, 541-76-41, 541-76-51. Лицензия ПДМ7-0215 от 01.11.2001 г. Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ. Подписано в печать 10.04.2006 г. Усл. п.л 1,5. Заказ № К-4379. Тираж 100 зю. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать - ризография.

3,006 fi

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мухаметшина, Наталья Евгеньевна

ВВЕДЕНИЕ.

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общая характеристика микоплазм.

1.1.1. Таксономия, филогения и эволюция.

1.1.2. Клеточная и молекулярная биология.

1.1.2.1. Морфология и ультраструктура.

1.1.2.2. Среда и условия обитания микоплазм. щ 1.1.2.3. Геном и его экспрессия.

1.2. Микоплазмы и микоплазмозы: взаимодействие микоплазм с растениями.

1.2.1. Особенности морфозов при инфицировании растений микоплазмами.

1.2.2. Микоплазменные инфекции растений: молекуляр-* но-генетические, биохимические и ультрацитоструктурные особенности.

1.3. Патогенность, диагностика и подавление микоплаз-менных инфекций: проблемы и перспективы.

1.4. Адаптация бактерий к неблагоприятным условиям роста: морфология, биохимия, ультрацитоструктура и патоген* ность.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Культивирование микоплазм {Acholeplasma laidlawii PG8)

2.2. Оценка количества жизнеспособных клеток

A.laidlawii PG8.

2.3. Инфицирование растений {Pisum sativum L., Vinca minor L. ) клетками A.laidlawii PG8.

2.4. Приготовление проб для электронной микроскопии. \

2.5. Определение активности СОД в тканях растений.

2.6. Определение концентрации конъюгированных диенов в тканях растений.

• 2.7. Определение концентрации нитритов в тканях растений

2.8. Выделение ДНК из клеток микоплазм, очистка и секве-нирование.

2.9. Выделение и очистка тотальной ДНК из клеток растений

2.10. Электрофорез ДНК в агарозном геле.

2.11. Амплификация фрагментов ДНК A.laidlawii PG8 с по* мощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).

2.12. Получение культур A.laidlawii PG8, адаптированных к неблагоприятным условиям роста.

2.13. Определение устойчивости клеток A.laidlawii к стрессовым воздействиям.

2.13.1. Определение устойчивости к воздействию пере* киси водорода.

2.13.2. Определение термоустойчивости.

2.14. Разделение белков клеток A.laidlawii PG8 методом двумерного электрофореза.

2.15. Электрофорез ДНК-связанных белков в ПААГ.

2.16. Статистическая обработка данных.

2.17. Сравнение частоты выявления морфологических отклонений у контрольных и опытных растений V.minor L.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Фитопатогенность штамма^ laidlawiiPG8.

3.1.1. Инфицирование растений A.laidlawii PG8: способы и контроль заражения.

3.1.2. Контроль инфицируемости растений A.laidlawii PG с помощью ПЦР.

3.1.3. Морфологические особенности растений

P.sativum L.J, инфицированных A.laidlawii PG

3.1.4. Особенности ультраструктуры тканей растений, инфицированных A.laidlawii

• 3.1.5. Реактивность неспецифических сигнальных систем у растений, инфицированных A.laidlawii PG8.

3.1.5.1. Содержание коньюгированных диенов в тканях исследуемых растений.

3.1.5.2. Активность СОД и содержание нитритов в тканях инфицированных растений.

3.2. Адаптация A.laidlawii PG8 к неблагоприятным условиям роста.

3.2.1. Жизнеспособность A.laidlawii PG8 в условиях голодания

3.2.2. Влияние воздействия теплового шока и перекиси водорода на жизнеспособность контрольных и опытных культур A.laidlawii PG8.

3.3. Морфологические, ультраструктурные, биохимические и молекулярно-генетические особенности клеток культуры A.laidlawii PG8, адаптированной к неблагоприятным условиям роста.

3.4. Фитопатогенность клеток культуры A.laidlawii PG8, адаптированной к неблагоприятным условиям роста.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Фитопатогенность и адаптация к неблагоприятным условиям роста"

Значительный интерес к микоплазмам (класс Mollicutes) обусловливается, с одной стороны, уникальностью биологии мельчайших прокариот, а с другой -диктуется практической необходимостью. Микоплазмы - основные контами-нанты клеточных культур, широко используемых в биотехнологии, паразиты человека, животных, растений.

Возбудителями микоплазменных инфекций растений являются представители родов Acholeplasma, Spiroplasma, а также группы Phytoplasma - ближайших родственников Acholeplasma laidlawii.

Подавление и контроль микоплазменных инфекций растений представляют проблему, разрешение которой связывают с выяснением молекулярных механизмов адаптации микоплазм, обеспечивающей персистенцию этих микроорганизмов и связанный с нею фитопатогенез. Отсутствие клеточной стенки, редукция генома и ограниченные биосинтетические возможности не являются для микоплазм существенным препятствием в преодолении разнообразных защитных систем высших организмов и выживании в неблагоприятных для роста условиях. Однако механизмы, обеспечивающие адаптацию и циркуляцию в природе мельчайших неспорообразующих прокариот, пока неизвестны. Уникальным видом микоплазм с точки зрения адаптивных способностей является A.laidlawii - «вездесущая» микоплазма, обнаруживаемая в почве, компосте, сточных водах, клеточных культурах, тканях человека, животных и растений. При этом у растений, зараженных A.laidlawii, развитие инфекций связано с колонизацией тканей мини-телами микоплазмы - ультрамикроформами, размеры которых (менее 0,2 мкм) характерны для наноклеток бактерий. Феномен на-нотрансформации обнаружен у ряда бактерий, в том числе как адаптация микроорганизмов к неблагоприятным условиям роста. У некоторых фитопатогенных микроорганизмов соответствующие процессы сопровождаются изменениями вирулентных свойств. Однако в отношении мельчайших не-спорообразующих бактерий - микоплазм - сведения о проведении подобных исследований отсутствуют.

Цель и задачи исследования. Выяснение особенностей фитопатогенно-сти и адаптации к неблагоприятным условиям роста Acholeplasma laidlawii PG8 составило цель данной работы.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Оценить фитопатогенность штамма A. laidlawii PG8 в отношении Vinca minor L. и Pisum sativum L - специфичного и неспецифичного индикаторов фитоми-коплазмозов.

2. Выявить особенности окислительного стресса в фотосинтезирующих и нефо-тосинтезирующих тканях растений, инфицированных микоплазмой.

5. Оценить фитопатогенность адаптированной к неблагоприятным условиям роста культуры A.laidlawii PG8.

Научная новизна. Впервые показана фитопатогенность A.laidlawii PG8 в отношении как специфичного, так и неспецифичного индикаторов микоплазмо-зов растений — Vinca minor L. и Pisum sativum L. Установлено, что морфофи-зиологические, ультрацитоструктурные изменения, возникающие у растений в ответ на инфицирование A.laidlawii PG8, связаны с трансформацией вегетативных клеток микоплазмы в мини-тела (ультрамикроформы). При этом инфицирование проростков P.sativum L. микоплазмой сопровождается реакциями ин-гибиции супероксиддисмутазы (СОД), активации нитрогенеза и перекисного окисления липидов (ПОЛ), динамика которых различается в фотосинтезирую-щих и нефотосинтезирующих тканях растений.

Впервые установлено, что адаптация A.laidlawii PG8 к неблагоприятным условиям роста (ограничение субстрата) in vitro связана с трансформацией вегетативных клеток микоплазмы в ультрамикроформы (наноклетки). Обнаружено, что в культуре клеток A.laidlawii PG8 присутствует два клеточных морфотипа микоплазмы - типичные (вегетативные) клетки (0,6 мкм) микоплазмы и ультрамикроформы (< 0,2 мкм), количественное соотношение которых зависит от условий роста. Обнаружено, что в средах с ограниченным субстратом наноклетки являются преобладающим морфотипом A.laidlawii PG8. Ультрамикроформы образуют на агаризованных питательных средах нетипичные для микоплазм микроколонии; сохраняют потенциальную способность к пролиферации, реверсии и проявляют устойчивость к стрессорным воздействиям. Показано, что трансформация вегетативных клеток микоплазмы в ультрамикроформы связана с существенной реорганизацией экспрессии генома.

Впервые установлено, что ДНК-связывающие белки наноклеток A.laidlawii PG8 могут обусловливать аттенуацию амплификации оперона рРНК, содержащего гены тРНК микоплазмы. Предложены специфичные молекулярно-генетические зонды для дифференциальной диагностики вегетативных клеток и ультрамикроформ A.laidlawii PG8.

Впервые установлено, что клетки адаптированной к неблагоприятным условиям роста культуры A.laidlawii PG8 обладают более высокой фитопато-генностью по сравнению с клетками неадаптированной культуры микоплазмы.

Научно-практическая значимость. Полученные данные вносят вклад в понимание адаптации к неблагоприятным условиям роста A.laidlawii PG8 и особенностей фитопатогенности этой микоплазмы. Результаты работы могут служить основой для развития новых подходов к решению проблемы контроля ми-коплазменных инфекций у растений.

Разработаны методы для исследования процессов адаптации к неблагоприятным условиям роста A.laidlawii PG8 in vitro, а также способ (на основе метода ПЦР) дифференциальной диагностики вегетативных клеток и ультрамикроформ (наноклеток) A.laidlawii PG8 - микоплазмы, вызывающей инфекции у растений, а также контаминирующей клетки высших эукариот, культивируемые in vitro.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа с 1999 - 2005 гг. проводилась в соответствии с планом научных исследований КИББ КазНЦ РАН по теме «Взаимодействие микоплазм с высшими организмами на молекулярно-генетическом уровне». Исследования автора, как исполнителя данной тематики поддержаны грантами РФФИ 98-0448972, 01-04-49011, 05-04-49435, а также грантом ведущей научной школы акад. И.А.Тарчевского. Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследованиях автора. Синтез праймеров, секвени-рование нуклеотидных последовательностей ДНК, а также двумерный электрофорез полипептидов проводились на базе Института физико-химической медицины МЗ РФ (г. Москва).

Положения, выносимые на защиту. 1. Штамм A.laidlawii PG8 является фитопатогенным в отношении как специфичного (V.minor L.), так и неспецифичного {P.sativum L.) индикаторов мико-плазмозов растений.

3. Неблагоприятные условия роста A.laidlawii PG8 in vitro обусловливают реорганизацию экспрессии генома и трансформацию вегетативных клеток микоплазмы в ультрамикроформы, которые устойчивы к стрессовым факторам и способны к реверсии.

4. Адаптированная к неблагоприятным условиям роста in vitro культура A.laidlawii PG8 является более фитопатогенной, чем неадаптированная культура микоплазмы.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены на IV школе-конференции «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, 2000), Российских научных конференциях «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2000, 2003); VIII международной школе - конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2004), II региональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Саратов, 2004), XIII международной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение» (Казань, 2005), Международной конференции «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия» (Вологда, 2005), Международной научной конференции, посвященной 200-летию Казанской ботанической школы (Казань, 2006), а также на итоговых конференциях Казанского Института биохимии и биофизики КазНЦ РАН (2003, 2004, 2006).

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АМК - активные метаболиты кислорода

АОБ - алкилоксибензолы

АПК - активно пролиферирующая культура

АРП - аномалии развития побега

БТШ - белки теплового шока

ВФМ - вегетативные формы микоплазм

ГР - граны

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДПС - ДНК-связывающий протеин стационарной фазы

ЖННК - жизнеспособные, но некультивируемые клетки

ЗРП задержка роста побега

К - катал аза

КД - конъюгированные диены

КЗ - крахмальные зерна

КОЕ - колониеобразующая единица

КС - клеточная стенка

МДА - малоновый д и альдегид

МК - микоплазмы

МКР - метод конечных разведений

МПО - микоплазмоподобные организмы

НАДФН О - NADPH-оксидаза

НПГК - непролиферирующая голодающая культура

НПК - нуклеопротеиновый комплекс

НС - некультивируемое состояние

НФ - некультивируемые формы

ОРС - открытая рамка считывания

ОС - окислительный стресс

ПААГ - полиакриламидный гель

ПКФ - паренхимные клетки флоэмы ПО - пероксидаза

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ПС - пероксисомы

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РК - реверсирующая культура рРНК - рибосомная рибонуклеиновая кислота

СОД - супероксиддисмутаза

ТПС - триптический перевар бычьего сердца тРНК - транспортная рибонуклеиновая кислота

УЛ - увядание листьев

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

ЦВ - цитоплазматические включения

ЦРК - цистоподобные рефрактерные тела

ЭДТА - этилендиаминтетроацетат

AAA - Asteroplasma, Anaeroplasma, Acholeplasma

H2O2 - перекись водорода

SEM - Spiroplasma, Entomoplasma, Mycoplasma

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Мухаметшина, Наталья Евгеньевна

выводы

1. Штамм Acholeplasma laidlawii PG8 является фитопатогенным в отношении как специфичного (Vinca minor L.), так и неспецифичного {Pisum sativum L.) индикаторов микоплазмозов растений. Заражение растений клетками культуры микоплазмы методом Клемента (инъецированием), а также через неповрежденную корневую систему (спонтанно) вызывает микоплазменные инфекции у 40% образцов Vinca minor L. и у 15 — 20 % Pisum sativum L.

2. У растений {Pisum sativum L.), инфицированных Acholeplasma laidlawii PG8, возникают ультрацитоструктурные и биохимические изменения, обусловленные реактивностью неспецифических сигнальных систем. Развитие микоплазменных инфекций связано с трансформацией вегетативных клеток микоплазмы в мини-тела (ультрамикроформы) и сопровождается реакциями ингибиции супероксиддисмутазы, активации нитрогенеза, перекисного окисления липидов, динамика которых различается в фотосинтезирующих и нефото-синтезирующих тканях растений.

3. В культуре клеток Acholeplasma laidlawii PG8 (in vitro) присутствуют два клеточных морфотипа - типичные клетки микоплазмы (0.5 - 0.8 мкм), и ультрамикроформы (0.2 мкм). Количественное соотношение клеток двух морфотипов в культуре Acholeplasma laidlawii PG8 изменяется в зависимости от условий роста культуры. Ограничение субстрата приводит к преобладанию ультрамикроформ.

4. Наноклетки Acholeplasma laidlawii PG8 проявляют высокую устойчивость к стрессовым воздействиям (повышенная температура и обработка Н2О2) in vitro, образуют на агаризованных питательных средах нетипичные для микоплазм микроколонии и сохраняют потенциальную способность к пролиферации и реверсии.

6. ДНК-связывающие белки наноклеток обусловливают аттенуацию амплификации оперона рРНК, содержащего гены тРНК Acholeplasma laidlawii PG8, при использовании в ПЦР со специфичными праймерами для выявления оперонов рРНК микоплазмы клеточных лизатов.

7. Адаптированная к неблагоприятным условиям роста культура Acholeplasma laidlawii PG8 является более фитопатогенной, чем неадаптированная культура микоплазмы. Инфицирование растений (Vinca minor L.) клетками (105 клеток/растение) адаптированной культуры Acholeplasma laidlawii PG8 (2-й пассаж на полноценной среде после 400 суток культивирования на среде с ограничением субстрата) вызывает характерные для фитомикоплазмо-зов морфофизиологические изменения у 85% растений через 12 суток после инфицирования, тогда как инфицирование растений Vinca minor L. клетками (107 клеток/растение) пролиферирующей культуры (стационарная фаза роста на полноценной среде Эдварда) вызывает соответствующие морфофизиологические изменения у 40% растений через 30 суток после инфицирования.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Прошло более 200 лет со времени открытия микоплазм, но природа этих микроорганизмов все еще в значительной мере остается загадкой. Интерес исследователей к микоплазмам определяется, с одной стороны, уникальностью биологии этих мельчайших прокариот, в структурной организации которых присутствуют черты, характерные для клеток высших эукариот, а с другой -связан с практической необходимостью. Микоплазмы - паразиты человека, животных, растений, контаминанты клеточных культур. При этом один и тот же вид микоплазм может колонизировать клетки тканей и человека, и животных, и растений. Такова микоплазма Acholeplasma laidlawii, которую выделяют из почвы и компоста, тканей человека, животных, насекомых, а также растений, и называют в связи с этим вездесущей.

Микоплазмозы растений широко распространены в зонах интенсивного растениеводства. Подавление микоплазменных инфекций представляет серьезную проблему, разрешение которой связывают с выяснением механизмов взаимодействия в системе "паразит-хозяин", которые определяют адаптацию этих микроорганизмов к неблагоприятным условиям роста, обеспечивающую их персистенцию в клетках высших эукариот и циркуляцию в природе. Однако в этом направлении сделаны лишь первые шаги. Исследования соответствующих процессов сдерживаются отсутствием модельных систем "паразит-хозяин", эффективных средств диагностического контроля, а также трудностями культивирования микоплазм in vitro.

Значительный прогресс исследований механизмов взаимодействия микоплазм с высшими организмами связан с разработкой эффективных способов выявления этих микроорганизмов - ДНК-ДНК-гибридизации и ПЦР. Разработка модельной системы взаимодействия микоплазмы с растениями {A.laidlawii PG8 - P.sativum L., A.laidlawii PG8 - V.minor L.), а также соответствующих мо-лекулярно-генетических зондов для выявления A.laidlawii PG8 в любом биологическом материале в значительной мере определили возможность проведения исследований, связанных с выяснением особенностей фитопатогенности и адаптации к неблагоприятным условиям роста A.laidlawii PG8.

В результате наших исследований впервые показано с точки зрения критериев вирулентности (инфекционность, инвазивность, персистенция, токсико-генность, агрессивность), что A.laidlawii PG8 проявляет фитопатогенность в отношении как специфического, так и неспецифического индикаторов фитоми-коплазмозов - P.sativum L. и V.minor L. соответственно.

У растений, инфицированных A.laidlawii PG8, возникают ультрацитост-руктурные и биохимические изменения, обусловленные реактивностью неспецифических сигнальных систем. Развитие инфекций связано с трансформацией вегетативных клеток микоплазмы в мини-тела (ультрамикроформы) и сопровождается реакциями ингибиции супероксиддисмутазы, активации нитрогенеза, перекисного окисления липидов, динамика которых различается в фотосинте-зирующих и нефотосинтезирующих тканях растений.

Окислительный взрыв, являющийся одним из основных механизмов неспецифической защиты растений от патогенов, не определяет в случае микоплазменных инфекций элиминацию микроорганизмов - микоплазмы не погибают, но трансформируются в мини-тела. Размеры этих мини-тел (0.2 мкм) A.laidlawii PG8 соответствуют таковым у нанобактерий.

Феномен нанотрансформации обнаружен у ряда бактерий, в том числе как ответная реакция микроорганизмов на неблагоприятные условия роста in vitro. В нашей работе впервые показано, что адаптивные реакции A.laidlawii PG8 в отношении неблагоприятных факторов роста in vitro тоже связаны с трансформацией вегетативных клеток микоплазмы в ультрамикроформы (на-ноклетки). Ультрамикроформы A.laidlawii PG8 проявляют высокую устойчивость к стрессорным воздействиям in vitro и сохраняют потенциальную способность к пролиферации, а также реверсии. Трансформация вегетативных клеток A.laidlawii PG8 в ультрамикроформы связана с существенной реорганизацией экспрессии генома микоплазмы. По данным двумерного электрофореза белков вегетативных клеток и ультрамикроформ, клетки субпопуляций A.laidlawii PG8 различаются по 86 полипептидам.

Реорганизация генома микоплазмы возникает при изменениях топологии ДНК, индуцируемых ДНК-связывающими белками. ДНК-связывающие белки (37 кДа, 80 кДа) ультрамикроформ, как выяснилось в нашей работе, могут обусловливать аттенуацию амплификации оперона рРНК, содержащего гены тРНК A.laidlawii PG8. Электрофореграммы продуктов амплификации нуклеотидных последовательностей генов рРНК A.laidlawii PG8, полученные в результате ПЦР ДНК лизатов вегетативных клеток и ультрамикроформ микоплазмы, различаются.

Реорганизация экспрессии генома A.laidlawii PG8 при нанотрансформа-ции микоплазм может определять существенные изменения метаболизма. Известно, что у некоторых бактерий адаптация к неблагоприятным условиям роста сопровождается изменениями патогенности (Baffone et al., 2003; Geby, Steck, 2001; Hussong et al., 1987). В нашей работе впервые показано, что адаптация A.laidlawii PG8 к неблагоприятным условиям роста (ограничение субстрата) тоже сопровождается изменением фитопатогенности микоплазмы. Клетки адаптированной к неблагоприятным условиям роста культуры A.laidlawii PG8 по сравнению с клетками неадаптированной культуры микоплазмы проявляют более высокую фитопатогенность. п

У растений, инфицированных клетками (10 КОЕ) неадаптированной к неблагоприятным условиям роста культуры A.laidlawii PG8, признаки фитомикоплазмоза проявлялись реже (у 40%) и позднее (через 30 суток), чем в случае адаптированной культуры микоплазмы (у 85% через 12 суток после введения 105 КОЕ). В результате тестирования образцов V.minor L. на наличие микоплазм с помощью ПЦР со специфичными праймерами для амплификации нуклеотидных последовательностей генов рРНК A.laidlawii PG8 было установлено, что в тканях всех инфицированных растений V.minor L. присутствуют микоплазмы. При этом на электрофореграммах обнаруживалась преимущественная амплификация ггпВ оперона рРНК, спейсерная зона которого не содержит гены тРНК микоплазмы (рис. 3), что свидетельствует о преобладании в тканях всех инфицированных растений ультрамикроформ A.laidlawii PG8. Полученные данные позволяют предположить, что более позднее проявление признаков фи-томикоплазмозов у растений, инфицированных клетками неадаптированной культуры A.laidlawii PG8, обусловлено периодом, необходимым для перехода вегетативных клеток микоплазмы в ультрамикроформы, колонизирующие клетки растений (Чернов и др., 1999). Однако молекулярные основы более выраженной фитопатогенности (с учетом критериев вирулентности) ультрамикроформ адаптированной культуры A.laidlawii PG8 еще предстоит выяснить. В этой связи сравнительный анализ молекулярно-генетических особенностей адаптации микоплазм к неблагоприятным условиям роста in vivo и in vitro представляет особенный интерес с точки зрения спектра возможностей формирования и эволюции системы "паразит-хозяин".

Наличие в жизненном цикле A.laidlawii PG8 адаптивных к неблагоприятным факторам роста бактериальных форм - наноклеток, обладающих отличной от вегетативных клеток молекулярной и клеточной биологией, а также патоген-ностью, определяет необходимость разработки нового подхода к решению проблемы взаимодействия микоплазм с высшими организмами и контроля микоплазменных инфекций.

Известно, что микоплазмы (A.laidlawii PG8) способны проникать в растения из почвы через неповрежденную корневую систему. На твердых питательных средах почвенные изоляты A.laidlawii формируют микроколонии, образуемыми ультрамикроформами микоплазмы (Серебренникова, 2005). Обнаружение ультрамикроформ A.laidlawii PG8 представляет проблему. В этой связи предложенный нами вариант ПЦР со специфичными праймерами для амплификации фрагментов оперонов ггпА и rrnB A.laidlawii PG8 может быть эффективным способом обнаружения в природных источниках вегетативных клеток и ультрамикроформ A.laidlawii, а также выявления процессов диссоциации в популяции клеток культуры микоплазмы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мухаметшина, Наталья Евгеньевна, Казань

1. Аверьянов, А А. Активные формы кислорода и иммунитет растений / А. А. Аверьянов // Успехи соврем, биологии. 1991. - Т. 111. - С. 722-737.

2. Борхсениус, С.Н. Микоплазмы: молекулярная и клеточная биология, пато-генность, диагностика / С.Н. Борхсениус, О.А. Чернова. Л.: Наука, 1989. -156с.

3. Брандт, 3. Анализ данных / 3. Брандт. М.: Мир, 2003. - 686 с.

4. Бухарин, О.В. Патогенные бактерии в природных экосистемах / О.В. Бухарин, В.Ю. Литвин. Екатеринбург: УрО РАН, 1997.-271 с.

5. Вайнштейн, М.Б. О наннобактериях / М.Б. Вайнштейн, Е.Б. Кудряшова // Микробиология. 2000. - Т. 69. - С. 163-174.

6. Владимиров, Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков. М.: Наука, 1972. - 217 с.

7. Власов, Ю. И. Микоплазменные болезни сельскохозяйственных растений / Ю.И. Власов, З.Г. Геворкян. Ереван: Изд-во АН АрмССР, 1981 - 126 с.

8. Власов, Ю.И. Ахолеплазмы патогены растений / Ю.И. Власов, Л.П. Гени-те, Л.Н. Самсонова. - Вильнюс: Изд-во Минсельхоза ЛитССР, 1985. - 80 с.

9. Влияние аутоиндукторов анабиоза бактерий на геном микробной клетки / О.Н. Ильинская, А.И. Колпаков, П.В. Зеленихин и др. // Микробиология. -2002. Т. 71. - N 2. - С. 194-199.

10. Влияние факторов внешней среды на экспрессию гена Mycoplasma pneumonia, детерминирующего синтез белка PI / Н.А. Зигангирова, О.И. Бархатова, И.В.Раковская, А.Л. Гинцбург // ЖМЭИ. 2003. - N 4. - С. 17-22.

11. Вонский, М.С. Экспрессия белков теплового шока у микоплазм / М.С. Вонский, Г.В. Аствацатурянц, С.Н. Борхсениус // ДАН. 1993. - Т. 331. - С. 112-115.

12. Гамалей, И.А. Перекись водорода как сигнальная молекула / И.А. Гамалей, И.В. Клюбин//Цитология. 1996. -Т. 38.-N 12.-С. 1233-1247.

13. Гвоздяк, Р.И. Об особенностях патогенности Pseudomonas aeruginosa / Р.И. Гвоздяк, Л.М. Яковлева // ЖМЭИ. 1987. - N 3. - С. 3-5.

14. Генетическая изменчивость микоплазм {Acholeplasma laidlawii) при взаимодействии их с эукариотами (Pisum sativum) / В.М. Чернов, Ю.В. Гоголев, Н.В. Попова, О.А. Чернова // ДАН. 1999. - Т. 369. - С. 275-277.

15. Георгиев, Г.П. Метод быстрого выделения высокополимерной дезоксири-бонуклеиновой кислоты / Г.П. Георгиев // Биохимия. 1959. - Т. 24. - N 3. - С. 472-480.

16. Гловер, Д. Клонирование ДНК. Методы / Д. Гловер. М: Мир, 1988. -538с.

17. Гоголев, Ю.В. Морфофизиологические и генетические особенности взаимодействия Acholeplasma laidlawii с растениями Pisum sativum: Дис. . канд. биол. наук: 03.00.12 / Ю.В. Гоголев; Институт биологии КазНЦ РАН. Казань, 1997.- 121 с.

18. Головлев, E.JI. Другое состояние несопрулирующих бактерий / E.J1. Голов-лев // Микробиология. 1998. - Т. 67. -N 3. - С. 725-735.

19. Головлев, E.JI. Физиология микробной клетки и метаболическая инженерия / E.JI. Головлев, JI.A. Головлева // Микробиология. 2000. - Т. 69. - N 2. -С.149-162.

20. Демкина, Е.В. Образование покоящихся форм Arthrobacter globiformis в ав-толизирующихся суспензиях / Е.В. Демкина, B.C. Соина, Г.И. Эль-Регистан // Микробиология. 2000. - Т. 69. - N 3. - С. 383-388.

21. Игамбердиев, А.У. Пероксисомальное окисление в растениях / А.У. Игам-бердиев // Физиол. раст. 1991. - Т. 38. - С. 774-786.

22. Иевиньш, Г.В. Пероксидазы растений: проблемы изучения в связи с участием в регуляции роста и развития / Г.В. Иевиньш // Изв. АН Латв. ССР. -1988.-N 6.-С. 65-74.

23. Инфицирование гороха посевного Pisum sativum клетками Acholeplasma laidlawii приводит к изменениям морфологических и физиологических признаков растений / В.М. Чернов, Ю.В. Гоголев, Н.В. Попова, О.А. Чернова // ДАН. -1996. Т. 348. - N 3. - С. 428^130.

24. Использование полимеразной цепной реакции для изучения перехода клеток Salmonella typhimurium в некультивируемое состояние / М.Ю. Аксенов, Ю.С. Гаворникова, Г.А. Левина и др. //Мол. Генетика. 1994. -N 2. - С. 17-21.

25. Каюпова, Г.А. Роль супероксиддисмутазы в образовании нитритов в корнях гороха при засолении среды / Г.А. Каюпова, Л.К. Клышев, Н.М. Ракова // Физиол. раст. — 1983. Т. 30.-N 1.-С. 146-150.

26. Клюбин, И.В. НАДФН-оксидаза специлизированный ферментативный комплекс для образования активных метаболитов кислорода / И.В. Клюбин, И.А. Гамалей // Цитология. - 1997. - Т. 39. - С. 320-340.

27. Крылов, В.И. Роль горизонтального переноса генов бактериофагами в возникновении патогенных бактерий / В.И. Крылов // Генетика. 2003. - Т. 39. - N 5.-С. 595-620.

28. Лакин, Г.Ф. Биометрия: Учеб. пособие для биол. спец. вузов / Г.Ф. Лакин. -М.: Высш. шк., 1990. 352 с.

29. Литвин, В.Ю. Патогенные бактерии, общие для человека и растений: проблема и факты / В.Ю. Литвин, Е.Н. Емельяненко, В.И. Пушкарева // ЖМЭИ. -1996.-N2.-С. 101-104.

30. Маниатис, Т. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Д. Сэм-брук. М.: Мир, 1984. - 480 с.

31. Мельников, В.А. Морфология и ультраструктура клеток Mycoplasma (Acholeplasma) laidlawii / В.А. Мельников, Н.В. Клицунова // Микробология. -1973. Т. XLII. - N 4. - С. 677-681.

32. Мидянник, Г.А. Пути инфицирования микоплазмами растений люцерны и их влияние на образование и эффективность бобово ризобиального симбиоза: Дис. . канд.биол.наук: 03.00.07 / Г.А. Мидянник; Моск. гос. сельхоз. акад. -М., 1995.-235 с.

33. Микоплазма-индуцированные и жасмонат-индуцированные белки растений гороха / И.А. Тарчевский, Н.Н. Максютова, В.Г. Яковлева, В.М. Чернов // ДАН. 1996. - Т. 350. - N 4. - С. 544-545.

34. Микоплазмы: молекулярная и клеточная биология, взаимодействие с иммунной системой млекопитающих, патогенность, диагностика / С.Н. Борхсени-ус, О.А. Чернова, В.М. Чернова и др. СПб.: Наука, 2002. - 319 с.

35. Николаев, Ю.А. Адгезивные и ростовые свойства R- и S-диссоциантов Pseudomonas fluorescens / Ю.А. Николаев, Е.С. Милько // Микробиология.2000. Т. 69. - N 2. - С. 293-294.

36. О химической природе ауторегуляторного фактора d Pseudomonas carboxydoflava / Г.А. Осипов, Г.И. Эль-Регистан, В.А. Светличный и др. // Микробиология. 1985. - Т. 54. - Вып. 2. - С. 184-190.

37. Образование «некультивируемых» клеток Mycobacterium tuberculosis и их оживление / М.О. Шлеева, Г.В. Мукамолова, М.В. Телков и др. // Микробиология. 2003. - Т. 72. - N 1. - С. 76-83.

38. Образование покоящихся форм Bacillus cereus и Micrococcus luteus / А.Л. Мулюкин, К.А. Луста, М.Н. Грязнова и др. // Микробиология. 1996. - Т. 65. -N6.-С. 782-789.

39. Общая и молекулярная фитопатология: Учеб. пособ. / Ю.Т. Дьяков, О.Л. Озерцковская, Джавахия В.Г. и др. М.: Изд-во Общество фитопатологов,2001.-302 с.

40. Онищенко, А.И. Диагностика новых микроорганизмов растений на основе изучения ультратонких срезов их тканей / А.И. Онищенко, В.В. Слабодянник, Т.А. Христофорова // Микробиол. журн 1988. - Т.50. - N 5 - С. 46-49.

41. Остерман, Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие) / Л.А. Остерман. -М.: Наука, 1981.-288 с.

42. Патогенные листерии в почве и в ассоциации с водорослями: обратимый переход в некультивируемое состояние / В.И. Пушкарева, Е.Н. Емельяненко, В.Ю. Литвин и др. // ЖМЭИ. 1997. - N 3. - С. 3-6.

43. Патогенные свойства микоплазмы возбудителя бледно-зеленой карликовости зерновых / А.И. Онищенко, И.Г. Скрипаль, Н.В. Торяник, Л.П. Малиновская // Микробиол. журн.- 1977.- Т.39. -N 5. - С. 621-626.

44. Полевой, В.В. Физиология растений: Учеб. / В.В. Полевой. М.: Высшая школа, 1989.-484 с.

45. Починок, Х.Н. Методы биохимического анализа растений / Х.Н. Починок. -Киев: Наукова думка, 1976. 334 с.

46. Прозоровский, С.В. Медицинская микоплазмология / С.В. Прозоровский, И.В. Раковская, Ю.В. Вульфович. М.:1995. - 288 с.

47. Проникновение микоплазм в растения через корневую систему / П.И. Иванов, Г.А. Хайдарова, Е.Б. Баранова и др.// «Микроорганизмы в сельском хозяйстве»: Сб. тез. / Пущино. 1992. - С. 69-70.

48. Разин, Ш. Методы выделения мембран микоплазм / Ш. Разин, Ш. Роттем // Биохимическое исследование мембран. М.: Мир, 1979. - С. 9-29.

49. Роль бактериальных ауторегуляторов роста группы алкилоксибензолов в ответе стафилококков на стрессовые воздействия / О.Н. Ильинская, А.И. Копа-ков, М.А. Шмидт и др.//Микробиология. 2002. - Т. 71.-N 1.-С. 23-29.

50. Романова, Ю.М. Выделение и характеристика мутантов Salmonella typhy-murium с нарушенным процессом образования некультивируемых форм / Ю.М. Романова, А.А. Терехов, А.Л. Гинцбург // Генетика. 1995. - N 6. - С. 34-37.

51. Романова, Ю.М. Есть ли сходство в механизмах образования «некультивируемых форм» у грамотрицательных бактерий и спор у бацилл? / Ю.М. Романова, А.Л. Гинцбург // Мол. генетика, микробиол., вирусол. 1993. - N 6. - С. 34-37.

52. Серебренникова JI.А. Почва как возможная среда обитания фитопатоген-ных микоплазм: Дисс. . канд. биол. наук: 03.00.07 / Л.А. Серебренникова; Моск. сель-хоз. акад. М., 2005. - 139 с.

53. Скрипаль, И.Г. Биология микоплазм возбудителей желтух растений: Дис. . докт.биол.наук / И.Г. Скрипаль; Институт микробиологии и вирусологии им.Заболотного НАН Украины, - Киев, 1983.-256 с.

54. Скрипаль, И.Г. Биология микоплазм (молликутов) / И.Г. Скрипаль // Успехи микробиол. 1986. - Т. 19. - С. 74-106.

55. Скрипаль, И.Г. Динамика и культурально-физиологические основы образования фитопатогенными микоплазмами колоний типа "яичница-глазунья" / И.Г. Скрипаль, Л.П. Малиновская, А.Н. Онищенко // Микробиол. журн. 1984. -T.46-N2.-С. 52-57.

56. Скрипаль, И.Г. Микоплазмы / И.Г. Скрипаль // Микроорганизмы возбудители растений: Сб. ст. / Киев: «Наукова Думка», 1988. С. 326-372.

57. Скрипаль, И.Г. Модель взаимодействия клеток молликутов возбудителей «желтух» растений - с клетками поражаемых растений / И.Г. Скрипаль, А.Н. Онищенко, Л.А. Гаврилко //Мжробиол. журн. - 1994.-Т. 56.-N2.-С. 17-24.

58. Сравнительное изучение элементного состава вегетативных и покоящихся клеток микроорганизмов / А.Л. Мулюкин, В.В. Сорокин, И.Г. Лойко и др. // Микробиология.-2002.-Т. 71.-N 1.-С. 37-48.

59. Стабилизация ферментов актоиндукторами анабиоза как один из механизмов устойчивости покоящихся форм микроорганизмов / А.И. Колпаков, О.Н. Ильинская, М.М. Беспалов и др. // Микробиология. 2000. - Т. 69. - N 2. - С. 224-230.

60. Тарчевский, И.А. Биогенный стресс у растений / И.А. Тарчевский // Казанский мед. журн. 1994. - Т.75. - N 1. - С. 3-9.

61. Тарчевский, И.А. Молекулярные аспекты фитоиммунитета / И.А. Тарчевский, В.М.Чернов // Микология и фитопатология. 2000. - Т. 34.-N 3. - С. 1-10.

62. Тарчевский, И.А. Элиситор индуцируемые сигнальные системы и их взаимодействие / И.А Тарчевский // Физиол. раст. - 2000. - Т. 47. - N 2. - С. 321-331.

63. Тимаков, В.Д. Семейство Mycoplasmataceae и L-формы бактерий / В.Д. Тимаков, Г.Я. Каган.- М.: 1973. 392 с.

64. Тонкое строение покоящихся клеток некоторых неспорообразующих бактерий / Н.Е. Сузина, A.J1. Мулюкин, А.Н. Козлова и др. // Микробиология. -2004. Т. 73. - N 4. - С. 516-529.

65. Ультраструктура растительных микоплазм и их взаимодействие с клетками специфичных и неспецифичных хозяев / И.Г. Скрипаль, А.Н. Онищенко, И.П. Алексеенко и др. //Микробиол. журн. 1978. - Т. 40. -N 1. - С. 58-63.

66. Чернов, В.М. Микоплазменные инфекции как возможный фактор генетических изменений в клетках высших эукариот / В.М. Чернов, О.А. Чернова // Цитология. 1996. - Т. 38. - N 2. - С. 107-114.

67. Чернов, В.М. Морфофизиологические и молекулярные аспекты взаимодействия микоплазм (Acholeplasma laidlawii) и растений: Дисс. . докт. биол. наук: 06.01.11 / В.М. Чернов; Моск. сель-хоз. акад.-М., 1998.- 186 с.

68. Чернова, О.А. Биохимические и молекулярно-генетические аспекты перси-стенции микоплазм у человека/ О.А. Чернова // Усп. биол. химии. 1999. - Т. 39.-С. 103-149.

69. Чернова, О.А. Рибосомные гены единственные гомологичные участки ДНК у некоторых микоплазм / О.А. Чернова, Н.А. Меркулова, С.Н. Борхсениус // Мол. генетика, микробиол., вирусол. - 1986. - Т. 9. - С. 16-22.

70. Чумаков, В.Н. Количественный метод определения активности цинк-, медь зависимой супероксиддисмутазы в биологическом материале / В.Н. Чумаков, Л.Ф. Осинская // Вопросы мед.химии. - 1977. - Т. 23. - С. 712-716.

71. Шлегель, Г. Общая микробиология: Учеб. / Г Шлегель. М.: Мир, 1987 -566 с.

72. Эпидемиологические аспекты экологии бактерий / В.Ю. Литвин, Ф.Л. А Гинцбург, В.И. Пушкарева и др. М.: Фармарус-принт, 1997. - 256 с.

73. A bacterial cytokine / G.V. Mukamolova, A.S. Kaprelyants, D.I. Young et al. // Microbiology. 1998. - V. 95. - P. 8916-8892.

74. A novel DNA-binding protein with regulatory and protective roles in starved Escherichia coli / M. Almiron, A.J. Link, D. Furlong, R. Kolter // Genes Dev. 1992. -Vol. 6. - P. 2646-2654.

75. A phylogenetic analysis of the mycoplasmas: Basis for their classification / W.G. Weisburg, J.G. Tully, D.L. Rose et al. // J. Bacteriol. 1989. - Vol.171. - P. 6455-6467.

76. Acholeplasma laidlawii has tRNA genes in the 16S-23S spacer of the rRNA op-eron / T. Nakagawa, T. Uemori, K. Asada et al. // J. Bacteriol. 1992. - Vol. 174. -N24.-P. 8163-8165.

77. Allen, R.G. Oxygen-reactive species and antioxidant responses during development: the metabolic paradox of cellular differentiation / R.G.Allen // Proc. Soc. Exp. Biol. Med.-1991.-Vol. 196.-P. 117-129.

78. Alscher, R.G. Role of superoxide dismutases (SODs) in controlling oxidative stress in plants / R.G. Alscher, N. Erturk, L.S. Heath // J. Exper. Botany. 2002. -Vol. 53. - N 372. - P. 1331-1341.

79. Bacterial Ohr and OsmC paralogues define two protein families with distinct functions and patterns of expression / S. Atichartpongkul, S. Loprasert, P. Vattanavi-boonet al.//Microbiology.-2001.-Vol. 147.-P. 1775-1782.

80. Bannister, J.V. Cell-free synthesis of human Cu/Zn-superoxide dismutase / J.V. Bannister, H.A. Hill, W.H. Bannister// FEBS Lett. 1980. - Vol. 121. - P. 215-218.

81. Barcina, J. Survival strategy of Escherichia coli and Enterococcus fecalis in illuminated fresh and marine systems / J. Barcina, J.M. Gonszales, J. Iriberri // J.Appl.Bacteriol. 1990. - Vol. 68. - P. 189-198.

82. Beckman, J.S. Pathological implication of nitric oxide, superoxide and peroxyni-trite formation / J.S. Beckman, J.P. Crow // Biochem. Soc. Trans. 1993. - Vol. 21. -P. 330-334.

83. Biochemical changes accompanying the long-term starvation of Micrococcus lu-teus cells in spent growth medium / G.V. Mukamolova, N.D.Yanopolskaya, T.V. Votyakova et al. // Arch. Microbiol. 1995. - Vol. 163. - P. 373-379

84. Black, F.T. Morphology and ultrastructure of Ureaplasma urealyticum in agar growth / F.T. Black, O. Vinther // Acta Pathol. Microbiol. Scand. 1977. - Vol. 85. -N4.-P. 281-285.

85. Bove, J.M. Mycoplasma infections of plants / J.M. Bove // Isr. J. Med. Sci. -1981.- Vol. 17. N 7. - P. 572-585.

86. Bradbury, J.M. Abnormalities in turkey poults following infection with Mycoplasma iowae / J.M. Bradbury, A. Ideris // Vet Rec. 1982. - Vol. 110. - N 24. -P. 559-560.

87. Bradbury, J.M. Gordon memorial lecture. Poultry mycoplasmas: sophisticated pathogens in simple guise / J.M. Bradbury // Br. Poult. Sci. 2005. - Vol. 46. - P. 125-136.

88. Bredt, W. Motility / W. Bredt // The Mycoplasmas. New York. - 1979. - Vol.1.-P. 141-156.

89. Capsule- like structure of Acholeplasma laidlawii / A.M. Ishov, S.N. Borchsen-ius, Y.Y. Komissartchik et al. // IOM Lett.-1994. Vol. 3. - P. 127.

90. Carson, G.I Cell structural and fanctional elements / G.I. Carson, H. Ping-Chuan, A.M. Collier. // Mycoplasmas. Molecular biology and pathogenesis. Washington: Amer. Soc. Microbiol, 1992. - P. 63-76.

91. Catharanthus roseus genes regulated differentially by mollicute infections / S. Jagoueix-Eveillard, F. Tarendeau, K. Guolter et al. // MPMI. 2001. - Vol. 14. - N2.-P. 225-233.

92. Catharanthus roseus L. plants and explants infected with phytoplasmas: alkaloid production and structural observations /М.А. Favalil, R. Musetti, S. Benvenuti et al. // Protoplasma. 2004. - Vol. 223. - P. 45-51.

93. Chen, M.M. Effects of dark treatment on the ultractructure of the aster yellows agent in situ / M.M. Chen, C. Hiruki // Phytopathology. 1977. - Vol. 67. - N 3. - P. 321-324.1. A

94. Chernov, V.M. The phenomenon of mycoplasma infections and anthropogenic overloads / V.M. Chernov, O.A. Chernova // Biomed. Lett. 1995. - Vol. 50. - P. 275-277.

95. Clark, T.B. Pathogenecity of Mollicutes for insects: possible use in biological control / T.B. Clark, R.F. Whitcomb // Ann. Microbiol. 1984. - Vol. 135A. - P.141.150.

96. Comparative analysis of the genom of the bacteria Mycoplasma pneumonia and Mycoplasma genitalium / Himmelreich R., Plagens H., Hilbert H et al. // Nucl. Acids Res. 1997. - Vol. 25. - P. 701-712.

97. Comparetive genomics identifies genes shared by distantly related insect-transmitted plant pathogenic mollicutes / X. Bai, J. Zhang, I.R. Holford, S.A. Hogen-hout // FEMS Microbiol. Lett. 2004. - Vol. 235. - N 2. - P. 249-258.

98. Complete sequence analysis of the genome of the bacterium Mycoplasma pneumoniae / R. Himmelreich, H. Hilbert, H. Plagens et al. // Nucleic acids research. 1996. - Vol. 24. - N 22. - P. 4420^449.

99. Construction of the mycoplasma evolutionary tree from 5S rRNA sequence data / M.J. Rogers, J. Simmons, R.T. Walker et al. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. -1985. -Vol. 82.- P.l 160-1164.

100. Cousin, M.T. Electron microscopy and plant mycoplasma like agents (MLA) / M.T. Cousin, K.K. Kartha // Proc. Indian Acad. Sci. B. 1975. - Vol.41. - P. 343354.

101. Daniels, M.J. The pathogenicity of mycoplasmas for plants / Daniels M.J.// Zentralbl. Bacteriol. 1979. -Vol. 245.-P. 184-199.

102. Davis, R.E. Genome analysis / R.E. Davis. Oxford: IRL Press. 1988. - 192p.

103. Davis, R.E. Revised subgroup classification of group 16SrV phytoplasmas and placement of flavescence doree-associated phytoplasmas in two distinct subgroups / R.E. Davis, E.L. Dally // Plant Disease. 2001. - Vol. 85. - N 7. - P. 790-797.

104. Day, A.P. Changes in membrane fatty acid composition during entry of Vibrio vulnificus into the viable but nonculturable state / A.P. Day, J.O. Oliver // J. Microbiology. 2004. - Vol. 42. - N 2. - P. 69-73.

105. Dormancy as a survival strategy of the fish pathogen Streptococcus parauberis in the marine environment / M. Curras, B. Magarinos, A.F. Toranzo, J.L. Romalde // Dis Aquat Organ. -2002. -Vol. 52.-P. 129-136.

106. Dybvig, K. Molecular biology of mycoplasmas: where do we stand? / K. Dybvig // IOM Lett. 1996. - Vol. 4. - P. 16-17.

107. Dybvig, K. Mycoplasmal genetics / K. Dybvig // Annu. Rev. Microbiol.1990.-Vol. 44.-P. 81-104.

108. Edward, D.G. Amended nomenclature for strains related to M.laidlawii / D.G. Edward, E.A. Freundt // J. Gen. Microbiol. 1970. - Vol. 62. - P. 1-2.

109. Effects of plant growth regulatore and phenolic compounds on paulownia culture in witro infected with mycoplasma-like organisms / T. Guonghong, Y. Qiaoping,

110. A. Qincal et al. // Ind. I. Tropical Plant Disease. 1994. - Vol. 12. - P. 43-52.

111. Evidence of intermolecular recombination between extrachromosomal DNAs in phytoplasma: a trigger for the biological diversity of phytoplasma? / H. Nashigawa, К. Oshima, S. Kakisawa et al. // Microbiology. 2002. - Vol. 148. - P. 13891396.

112. Extreme genom reduction in Buchnera spp.: Toward the minimal genome needed for symbiotic life / R. Gil, B. Sabater-Munoz, A. Latorre et al. // PNAS. -2002. Vol. 99. -N 7. - P. 4454-4458.

113. Fischer, R.S. Sources of amino acids / R.S. Fischer, B.E. Fischer, R.A. Jensen // Mycoplasmas. Molecular biology and pathogenesis. Washington: Amer. Soc. Microbiol, 1992.-P. 201-209.

114. Formation and resuscitation of "non-culturable" cells of Rhodococcus rhodo-chrous and Mycobacterium tuberculosis in prolonged stationary phase / M.O. Shleeva, K. Bagramyan, M. Telkov et al. // Microbiology. 2002. - Vol. 148. - P. 1581-1591.

115. Foster, J.M. How Salmonella survive against the odds / J.M. Foster, M. P. Spector// Annu Rev. Microbiol. 1995. - Vol. 49. - P. 145-174.

116. Fridovich, I. Overview: biological sources of O2 / I. Fridovich // Methods En-zymol.- 1984. -Vol. 105.-P. 59-61.

117. Fridovich, I. Superoxide dismutases: studies of structure and mechanism / I. Fridovich //Adv Exp Med Biol. 1976. - Vol. 74. - P. 530-539.

118. Fructose utilization and phytopathogenicity of Spiroplasma citri / P. Gaurivaud, J-L. Danet, F. Laigret et al. // Mol. Plant-Microb. Interact. 2000. - Vol. 13.-P. 1145-1155.

119. Fudi-Allah, A.A. Cellular morphology and reproduction of mycoplasma-like organisms associated with citrus stubborn disease / A.A. Fudi-Allah, E.C. Galavan // Phytopathology. 1974. -Vol. 61. -N 10. -P. 1309-1313.

120. Gioannopolitis, C.N. Superoxide Dismutases / C.N. Gioannopolitis, S.K. Ries // Plant Physiol. 1977. - Vol. 59. - P. 309-311.

121. Gourlay, R.N. Mycoplasmatales virus laidlawii 2, a new virus isolated from Acholeplasma laidlawii / R.N. Gourlay // J. Gen. Virol. 1971. - Vol. 12. - P. 6567.

122. A 127. Gourlay, R.N. Some characteristics of mycoplasma virus Hrl isolated fromand infecting Mycoplasma hyorhinis / R.N. Gourlay, S.G. Wyld, M.E. Poulton // Arch. Virol.- 1983.-Vol. 77.-P. 81-85.

123. Grey, B.E. The viable but nonculturable state of Ralstonia solanacearum may be involved in long term survival and plant infection / B.E. Grey, T.R. Steck //Appl. and Environ.Microbiol. - 2001. - Vol. 7. - N 9. - P. 3886-3872.

124. Herbert, K.C. Starvation survival in Listeria monocytogenes: characterisationof response and the role of known and novel components / K.C. Herbert, S.J. Foster // Microbiology. 2001. - Vol. 147. - P. 2275-2284.

125. Hermann, R. Mycoplasma pneumoniae and Mycoplasma genitalium: a comparison of two closely related bacterial species / R. Herrmann, В Reiner // Curr. Opin. Microbiol. 1998.-Vol. l.-P. 572-579.

126. Herrman, R. Genome structure and organization. / R. Herrman // Mycoplasmas. Molecular biology and pathogenesis. Washington: Amer. Soc. Microbiol, 1992.-P. 157-168.

127. Huang, A.H. Localization of enzymes within microbodies / A.H. Huang, H. Beevars // J. Cell Biol. 1973. - Vol. 58. - P. 379-389.

128. Identification of a plant-derived mollicute as a strain of an avian pathogen, Mycoplasma iowae, and its implications for mollicute taxonomy / O. Grau, F. Laigret, P. Carle et al. // Int J Syst Bacteriol. 1991. - Vol. 41. - N 4. - P. 473^78.

129. Identification of copper-zinc superoxide dismutase activity in Mycoplasma hyopneumoniae / J.R. Chen, C.N. Weng, T.Y. Ho et al. // Vet.Microbiol. 2000. -Vol. 73.-P. 301 -310.

130. Impact of oxygen on the abandance of phytoplasmas in plants / B.B. Sears, G. Schewe, J.I. Wood, K.L. Klomparens // IOM Lett. 1994. - Vol. 3. - P. 293-294.

131. Influence of infected cell growth state on bacteriophag reactivation levels / D.R. Kadavy, J.J. Shaffer, S.E. Lott et al. // Appl. Envir. Microbiol. 2000. - Vol. 66. -N 12. - P. 5206-5212.

132. Kahane, I. In vitro studies on the mechanism of adherence and pathogenecity of mycoplasmas /1. Kahane //Isr. J. Med. Sci.- 1984.- Vol. 20.- P. 874-877.

133. Kahane, I. Pathogenic mycoplasmas cause oxidative stress in the host cells / I. Kahane //The VI Intern. Congr. of the IOM. Birmingham. Alabama, 1986. - P. 70.

134. Kenri, T. Identification and characterization of HU protein from Mycoplasma gallisepticum / T. Kenri, T. Sasaki, Y. Kano // Bioch. Boiph. Res. Comm. 1998. -Vol. 249.-P. 48-52.

135. Kondo, K. Morphology of the viable but nonculturable Vibrio cholerae as determined by the freeze fixation technique / K. Kondo, A. Takade, K. Amako // FEMS Microbiol. Lett. 1994. - Vol. 123. - P. 179-184.

136. Labarere, J. DNA replication and repair / J. Labarere // Mycoplasmas. Molecular biology and pathogenesis. Washington: Amer. Soc. Microbiol, 1992. - P. 309324.

137. Laidlaw, P.P. A new group of filterable organisms / Laidlaw P.P., Elford W.J., Proc. Roy. Soc. London B. 1936. - Vol. 120. - P. 292-303.

138. Lee, I.-M. Mycoplasma which infect plants and insects / I.-M. Lee, R.E. Davis // Mycoplasmas. Molecular biology and pathogenesis. Washington: Amer. Soc. Microbiol, 1992.-P. 379-383.

139. Lim, P.O. 16S rRNA sequence indicates plant pathogenic mycoplasmalike organism are evolutionarily distant from animal mycoplasmas / P.O. Lim, B.B. Sears // J. Bacteriol. 1989.-Vol. 171.-N 11.-P. 1233-1235.

140. Maniloff, J. Evolution of wall less prokaryotes / J. Maniloff // Annu. Rev. Microbiol. - 1983. - Vol. 37. - P. 477-499.

141. McGarrity, G.J. Cytogenetic effects of mycoplasmal infection of cell cultures / G.J. McGarrity, V. Vanaman, J. Sarama // In Vitro.-1984.-Vol. 20.- P. 1-19.

142. Mc-Goy, R.E. Mycoplasmas and yellows diseases / R.E. Mc-Goy // The Mycoplasmas. -New York: Acad Press, 1979. Vol. 3. - P. 229-264.

143. Meier, B. Evidence for superoxide dismutase and catalase in mollicutes and release of reactive oxygen species / B. Meier, G.G. Habermehl // Free Radic Res Commun.-1991.-Vol. 12-P. 451^154.

144. Morgan, J.A. Survival of nonculturable Aeromonas salmonicida in lake water / J.A. Morgan, W. Rhodes, R.W. Pickup // Appl. Environ. Microbiol. 1993. - Vol. 59.-P. 874-880.

145. Moyer, C.L. Effect of growth rate and starvation-survival on cellular DNA,

146. Mycoplasmas, plants insect vectors: a matrimonial triangle / M. Gamier, X. « Foissac, P. Gaurivaud et al. // C.R. Acad. Sci. Paris, Sciences de la vie/ Life Sciences.- 2001. Vol. 324. - P. 923-928.

147. Nanobacteria from blood, the smallest culturable autonomously replicating agent on Earth / E.O. Kajander, I. Kuronen, K. Akerman et al. // Proc Soc Opt Eng (SPIE). 1997. - Vol. 3111. - P. 420^28.

148. Neimark, H.C. Evolution of chromosome size in Mollicutes: chromo-some size >; heterogeneity, genomic deletions, and disabled pathways / H.C. Neimark, P. Carle //

149. M Lett. 1996. - Vol. 4. - P. 10-11.

150. New group 16SrIII phytoplasma lineages in Lithuania exhibit rRNA interop-eron sequence heterogeneity / R. Jomantiene, R.E. Davis, D. Valiunas, A. Alminaite // Europ. Joum. Plant Pathol. 2002. - Vol. 108. - P. 507-517.

151. Nishino, T. Density-dependent sorting of physiologically different cells of Vi-• brio parahaemolyticus / T. Nishino, B.B. Nayak, K. Kogure I I Applied and environmental microbiol. 2003. - Vol. 69. - N 6. - P. 3569-3572.

152. Nonculturability: adaptation or debilitation? / D. McDougald, S.A. Rice, D. Weichart, S. Kjelleberg // FEMS Microbioplogy Ecology. 1998. - Vol. 25. - P. 19.

153. Novitsky, J.A. Morphological characterization of small cells resulting from nutrient starvation of a psychrophilic marine vibrio / J.A. Novitsky, R.Y. Morita // Appl. Environ. Microbiol. 1976. - Vol. 32. - P. 617-622.

154. Nucleic acid relationships among Acholeplasma species / G.S. Aulakh, E.B. Stephens., D.L. Rose et al. // J. Bacteriol. 1983. -V. 153.-N3.- P. 1338-1341.

155. Oliver, J.D. Formation of nonculturable Vibrio vulnificus cells and its relationship to the starvation state / J.D. Oliver // Appl. Environ. Microbiol. 1991. - Vol. 57.-P. 2640-2644.

156. Oliver, J.D. The viable but non culturable state in the human pathogen Vibrio vulnificus / J.D. Oliver // FEMS Microbiol. Lett. - 1995. - Vol. 133. - P. 203-208.

157. One of two OsmC homologs in Bacillus subtilis is part of the sigmaB dependent general stress regulon / U. Volker, K.K. Andersen, H. Antelmann et al. // Journal of bacteriology. - 1998. - Vol. 180. -N 16. - P. 4212-4218.

158. Organic hydroperoxide resistance gene encodes a thiol dependent peroxidase / J.R. Cussiol, S.V. Alves, M.A. Oliveira, L.E. Netto // Journal of biological chemistry. - 2003. - Vol. 278. - N 28. - P. 11570-11575.

159. Pachas, W. N. Evidence for the bacterial origin of Acholeplasma laidlawii A / W.N. Pachas, M. Schor, G.S. Aulakh // Diagn Microbiol Infect Dis. 1985. - Vol. 3. -N4.-P. 295-309.

160. Parthasarathy, M.V. Mycoplasma-like organisms associated with lethal yellowing disease of plants / M.V. Parthasarathy // Phytopathology. 1974. - Vol. 64. - N 5.- P. 667-674.

161. Peptide methionine sulfoxide reductase (MsrA) is a virulence determinant in Mycoplasma genitalium / S.D. Yuhapani, M.W. Blaylock, C.M. Bebear et al. // Journ. of Bacteriol. 2001. - Vol. 183. - N 19. - P. 5645-5650.

162. Peterson, J.E. Occurence and ultrastructure of a variant (rho) form of mycoplasma / J.E. Peterson, A.W. Rodwell, E.S. Rodwell // J. Bacteriol. 1973. -Vol. 115.-P. 411-425.

163. Phylogeny of mycoplasmalike organisms (.Phytoplasmas): a basis for their classification / D.E. Gundersen, I.M. Lee, S.A. Rehner et al. // Journal of Bacteriol. -1994 (a). Vol. 176. - N 17. - P. 5244-5254.

164. Phylogeny of mycoplasmalike organisms: a bases for establishing their taxonomy / D.E. Gundersen, I.-M. Lee, S.A. Rehner et al. // IOM Lett.- 1994.- Vol. 3. P. 222-223.

165. Physiological characterization of viable-but-nonculturable Campylobacter jejuni cells / J.L. Tholozan, J.M Cappelier, J.P. Tissier et al. //Appl. Environ. Microbiol. 1999. - Vol. 65. - N 3. - P. 1110-1116.

166. Plant diseases associated with mycoplasma-like organisms / R.E. Mc-Coy, A. Caudwell, C.J. Chang et al. // The Mycoplasmas. New York: Acad. Press, 1989, -Vol. 5.-P. 545-560.

167. Podder, S.K. Effect of novobiocin on mycoplasma virus L2 replication / S.K. Podder, J. Maniloff // J. Virol. 1984. - Vol. 49. - P. 283-286.

168. Pollack, J.D. Carbohydrate metabolism and energy conservation / J.D. Pollack // Mycoplasmas. Molecular biology and pathogenesis. Washington: Amer. Soc. Microbiol, 1992.-P. 181-200.

169. Promoters of Mycoplasma capricolum ribosomal RNA operons: indentical activities but different regulation nin gomologous and heterologous cells / R. Gafny, H.C. Hyman, S. Razin, G. Glaser//Nucl. Ac. Res. 1988. - Vol. 16. -N 1. - P. 76.

170. Properties of dormant cells in stationary-phase cultures of Micrococcus luteus during prolonged incubation / G.V. Mukamolova, S.S. Kormer, N.D. Yanopolskaya, A.S. Kaprelyants //Microbiology. 1995. - Vol. 64. - P. 284-288.

171. Razin, Sh. Mycoplasma taxonomy and ecology / Sh. Razin // Mycoplasmas. Molecular biology and pathogenesis. Washington: Amer. Soc. Microbiol, 1992. -P. 3-21.

172. Recomendations on nomenclature of the order Mycoplasmatales / D.G. Edward, E.A. Freundt, R.M. Chanock et al. // Science. 1967. - Vol. 155. - P. 19641966.

173. Reductive evolution suggested from the complete genome sequence of a plant- pathogenic phytoplasma / K. Oshima, S. Kakizava, H. Nishigava et al. // Nature Genetics. 2003. - Vol. 36. - N 1. - P. 27-29.

174. Reinards, R. Purification and properties of a manganese-containing superoxide dismutase from Acholeplasma laidlawii / R. Reinards, R. Altdorf, H.D Olenbusch // Hoppe Seylers Z Physiol Chem. 1984. -Vol. 365. -N 5. - P. 577-585.

175. Renaudin, J. Complete nucleotide sequence of the genome of Spiroplasma citri virus SpVl-R8A2 / J. Renaudin, P. Aullo, J.C. Vignault, J.M. Bove // Nucl. Acids Res.-1990.-Vol. 18.-P. 1293-1297.

176. Retention of virulence in viable but non culturable halophilic Vibrio spp. / W. Baffone, B. Citterio, E. Vittoria et al. // Int J Food Microbiol. - 2003. - Vol. 89. -N 1.-P. 31-39.

177. Reynolds, E.S. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy / E.S. Reynolds // J. Cell. Biol. 1963. - Vol. 17. - N 1. - P. 208-212.

178. Robertson, J. Mycoplasma hominis: growth, reproduction, and isolation of small viable cells / J. Robertson, M. Gomersall, P. Gill // J. Bacteriol. 1975. - Vol. 124. -N 2. - P. 1007-1018.

179. Roszak, D.B. Viable but nonrecoverable stage of Salmonella enteritidis in aquatic systems / D.B. Roszak, D.J. Grimes, R.R. Colwell // Can J.Microbiol. 1984. -Vol. 30.-P. 334-338.

180. Rottem, S. Bewar of mycoplasmas / S. Rottem, M. Barile // Trends Biotechnol.- 1993.-Vol. 11.-P. 143-151.

181. Rottem, S. Interaction of mycoplasmas with host cells / S. Rottem // Phisiol.Rev. 2003. - Vol. 83. - P. 417-433.

182. Samerson, N.L. Hemolisin of Mycoplasma pneumoniae: tentative identificatio-nas a peroxide / N.L. Samerson, B.E. Walls, R.M. Chanock // Science. 1965. - Vol. 150.-P. 226-228.

183. Sarmientos, P. Carbon starvation and growth rate-dependent regulation of the Escherichia coli ribosomal RNA promoters: differential control of dual promoters / P. Sarmientos, M. Cashel // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1983. - Vol. 80. - P. 7010-7013.

184. Sarov, J. Trachoma agent DNA / J. Sarov, Y. Becker // J. Mol. Biol 1969. -Vol. 42.-P. 581-589.

185. Schneider, B. Presence of two sets of ribosomal genes in phytopathogenic mol-licutes / B. Schneider, E. Seemuller // Appl. Environ. Microbiol. 1994. - Vol. 60. -P. 3409-3412.

186. Sears, B.B. Optimization of growth conditions for Acholeplasma strain j233 as a strategy for culturing phytoplasma in vitro / B.B. Sears, G. Schewe // IOM Lett. -1994.-Vol.3.-P. 291-292.

187. Seigele, D.A. Approaches to the study of survival and death in stationary-phase Escherichia coli / D.A. Seigele, M. Almiron, R. Kolter // Starvation in bacteria. Plenum Press. New York, 1993.-P. 151-167.

188. Sequence heterogenetyin the two 16S rRNA genes of Phormium yellow leaf phytoplasma / L.W. Liefting, M.T. Andersen, R.E. Beever et al. // IOM Lett-1996-Vol. 4.- P. 223-224.

189. Seto, S. Cell reproduction and morphological changes in Mycoplasma capri-colum / S. Seto, M. Miyata // J Bacteriol. 1998. - Vol. 180. - N 2. - P. 256-264.

190. Shaw, M.E. Plasmid multiplication and gene expression in plants and insects hosts infected with the aster yellows and BLTVA-MLOs / M.E. Shaw, C.R. Kuske, B.C. Kirkpatrick // IOM Lett. 1994. - Vol. 3. - P. 57.

191. Sies, H. Oxidative stress: damage to intact cells and organs / H. Sies, E. Cade-nas // Philos.Trans.R.Soc.Lond.B.Biol.Sci. 1985. - Vol. 311. - P. 617-631.

192. Skripal, I.G. More precise definition of pathogenicity mechanism of mol-licutes, agents of plant "yellow" diseases / I.G. Skripal // Мжробюл журн. 1997. -Т. 59.-N6.-С. 54-57.

193. Smart, С. D. Identification of host plant whose expression is altered upon aster yellows phytoplasma infection / C.D. Smart, B.C. Kirkpatric //IOM Lett. 1996. -Vol. 4. - P. 274-275.

194. Smith, P.F. The biology of mycoplasmas / P.F. Smith. New York, 1971. -423p.

195. Species-specific PCR for identification of common contaminant mollicutes in cell culture / F. Kong, G. James, S. Gordon et al. // Appl. Environ. Microbiol. 2001. - Vol. 67. - N 7. - P. 3195-3200.

196. Spector, M.P. Starvation-inducible loci of Salmonella typhimurium— regulation and roles in starvation-survival / M.P. Spector, C.L. Cubitt // Mol. Microbiol. 1992. - Vol. 6. - P. 1467-1476.

197. SpV4, a new spiroplasma virus with circular, single-stranded DNA / J. Renaudin, M. Pascarel, M. Gamier et al. // Ann. Virol.- 1984.- Vol. 135E.- P. 343361.

198. Stress induces peroxisome biogenesis genes / E. Lopez-Huertas, W.L. Charlton, B. Johnson et al. // EMBO Journal. 2000. - Vol. 19. - N 24. - P. 6770-6777.

199. Stuart, M.R. Influence of carbohydrate starvation and arginine on culturability and amino acid utilization of Lactococcus lactis subsp. lactis / M.R. Stuart, L.S. Chou, B.C. Weimer // Appl. Environ. Microbiology. 1999. - Vol. 65. - N 2. - P. 665-673.

200. Tandler, B. Improved uranyl acetate staining for electron microscopy / B. Tandler // J. Electron. Microsc. Thechn. 1990. - Vol. 16. - P. 1505 -1517.

201. Thannickal, V.J. Reactive oxygen species in cell signaling / V.J. Thannickal,1. A,

202. B.L. Fanburg //Am. J. Physiol.Lung Cell Mol. Physiol. 2000. - Vol. 279. - P. 1005 - 1028.

203. The current state of two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients / A. Gorg, C. Obermaier, G. Bogus et al. // Electrophoresis. 2000. - Vol. 21. -P.1037-1053.

204. The ferritin-like Dps protein is required for Salmonella enterica serovar Ty-phimurium oxidative stress resistance and virulence / T. Halsey, A. Vazquez-Torres,

205. D.J. Gravdahl et al. // Infection and Immunity. 2004. - Vol. 72. - N 2. - P. 11551158.

206. The nitric oxide/superoxide assay. Insights into the biological chemistry of the N0/02~. interaction / M. Kelm, R. Dahmann, D. Wink, M. Feelisch // J. Biol. Chem. 1997. - Vol. 272. - P. 9922-9932.

207. The rpf gene of Micrococcus luteus encodes an essential secreted growth factor * / G.V. Mukamolova, O.A. Turapov, K. Kazarian et al. // Molecular Microbiol.2002. Vol. 46. - N 3. - P. 611-621.

208. The thioredoxin reductase system of mycoplasmas / G. Ben-Menachem, R. Himmelreich, R. Herrmann et al. // Microbiology. 1997. - Vol. 143. - P. 19331940.

209. The viable but nonculturable state and starvation are different stress responses of Enterococcus faecalis, as determined by proteome analysis / S. Heim, M.M. Lleo, B. Bonato et al. // Journal of Bacteriol. 2002. - Vol. 184. - N 23. - P. 6739-6745.

210. Toth, K.F. Phylogenetic relationships among members of the class Mollicutes deduced from rps3 gene sequences / K.F. Toth, N. Harrison, B.B. Sears // Int. J. Syst. Bacteriol.- 1994.-Vol. 44.-N l.-P. 119-124.

211. Transcription and translation / A. Muto, Y. Andachi, F. Yamao et al. // Mycoplasmas. Molecular biology and pathogenesis. Washington: Amer. Soc. Microbiol, 1992.-P.331-348.

212. Tryon, V.V. Pathogenic determinants and mechanisms / V.V. Tryon, J.B. Baseman. // Mycoplasmas. Molecular biology and pathogenesis. Washington: Amer. Soc. Microbiol, 1992. - P. 457-470.

213. Two-step control of basic and acidic peroxidases and its significance for growth and development / T. Gaspar, C. Penel, F.G. Castillo, H.F. Grephin // Physiol. Plant. 1985. - Vol. 64. - N 3. - P. 418-423.

214. UGA is read as tryptophan in Mycoplasma capricolum / F. Yamao, A. Muto, Y. Kawauchi et al. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.-1985.- Vol. 82.- P. 2306-2309.

215. Ulrychova, N. Elimination of mycoplasma in tobacco callos tissue (Nicotiana glauca Grab.), cultured in vitro in the presence of 2,4-D in nutrient medium / N. Ulrychova, E. Petru // Biol, plant. Acad. sci. bohemosl. 1975. - Vol. 17. - P. 103-108.

216. Ultrastructures of a mycoplasma-like organism causing mulberry dwarf disease / J. Xu, M. Feng, J. Zhu, H. Shang // Wei Sheng Wu Xue Bao. 1998. - Vol. 38. - P. 386-389.

217. Viable but non-culturable Vibrio cholerae and related pathogens in the environment: Implications for release of genetically engineered microorganisms / R.R. Colwell, P.R. Brayton, D.J. Grimes et al. // BioTechnology. 1985. - Vol. 3. - P. 817-820.

218. Viable Legionella pneumophila not detectable by culture on agar medium / D. Hussong, R.R. Colwell, M. O'Brien et al. // BioTecnology. 1987. - Vol. 5. - P. 947-950.

219. Voelker, L.L. Characterization and sequencing of Mycoplasma artritidis bacteriophage MAV1 / L.L. Voelker, L.R. Washburn, K. Dybvig // IOM Lett.-1996.-Vol. 4.- P. 352.

220. Warner, J.M. Randomly amplified polymorphic DNA analysis of starved and viable but nonculturable Vibrio vulnificus cells / J.M. Warner, J.D. Oliver // Appl. Envir.Microbiology. 1998. -Vol. 64.-N 8.-P. 3025-3028.

221. Watson, S.P. Isolation and characterisation of Staphylococcus aureus starvation induced, stationary phase mutants defective in survival or recovery / S.P. Watson, M. Antonio, S.J. Foster// Microbiolgy. - 1998. - Vol. 144. - P. 3159-3169.

222. Whitcomb, R.F. Systematics of prokaryotes and eukaryotes: a search for a synthesis / R.F. Whitcomb // IOM Lett 1994 - Vol.3 - P. 1-5.

223. Whitcomb, R.F. The infection of leaf-hoppers by western X-disease virus. VI. cytopathological interrelationships / R.F. Whitcomb, D.D. Jensen, J. Richardson // J. Invertebr. Pathol. 1968. - Vol. 12. -N2. - P. 202-221.

224. Woese, C.R. Phylogenetic analysis of the mycoplasmas / C.R. Woese, J. Maniloff, L.B. Zoblen // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1980. - Vol.77. - P. 494-498.

225. Wolf, P.W. Temperature effects on the viable but nonculturable state of Vibrio vulnificus / P.W. Wolf, J.D. Oliver // FEMS Microbiol. Ecol. 1992. - Vol. 101. - P. 33-39.

226. Wong, H.C. Induction of viable but nonculturable state in Vibrio parahaemo-lyticus and its susceptibility to environmental stresses / H.C. Wong, P. Wang // J. Appl. Microbiol. 2004. - Vol. 96. - N 2 - P. 359-366.

227. Yamamoto, H. Study of nonculturable Legionella pneumophila cells during multiple-nutrient starvation / H. Yamamoto, Y. Hashimoto, T. Ezaki // FEMS Microbiol. Ecol. 1996. - Vol. 20. - P. 149-155

228. Yildiz, F.H. Role of RpoS in stress survival and virulence of Vibrio cholerae / F.H. Yildiz, G.K. Schoolnik // Journal of Bacteriol. 1998. - Vol. 180. - N 4. - P. 773-784.

Информация о работе

Мухаметшина, Наталья Евгеньевна
кандидата биологических наук
Казань, 2006
ВАК 03.00.12

Диссертация

Фитопатогенность и адаптация к неблагоприятным условиям роста - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы