Морфофизиологические и молекулярные аспекты взаимодействия микоплазм (Acholeplasma laidlawii) и растений

Чернов, Владислав Моисеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Морфофизиологические и молекулярные аспекты взаимодействия микоплазм (Acholeplasma laidlawii) и растений
ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Морфофизиологические и молекулярные аспекты взаимодействия микоплазм (Acholeplasma laidlawii) и растений"

r- r\

'А

1 о CÖEB 1998 На правах рукописи

ЧЕРНОВ Владислав Моисеевич

МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНЫЕ АСПЕКТЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МИКОПЛАЗМ (ACHOLEPLASMA LAIDLAWII)

И РАСТЕНИЙ

06.01.11 - защита растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва -1998

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики Казанского института биологии Казанского научного центра Российской академии наук

Научный консультант: академик РАН

И .А.ТАРЧЕВСКИЙ

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Р.Н.ИВАНОВСКИИ

доктор биологических наук, профессор О. Л .ОЗЕРЕЦКОВСКАЯ

доктор биологических наук, профессор В.К.ШИЛЬНИКОВА

Ведущая организация: Казанский государственный университет

Защита состоится 25 февраля 1998 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 120.35.09 при Московской сельскохозяйственной академии им.КА.Тимирязева по адресу: 127550, г.Москва, ул.Тимирязевская, 49, сектор защиты диссертаций.

С диссертацией можно ознакомится в ЦНБ ТСХА. Автореферат разослан января 1998 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук

В.А.Шкаликов

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. К настоящему времени известно более 100 видов микоплазм, простейших лишенных клеточной стенки прокариот, способных к самостоятельному воспроизведению. Будучи объединенными в общий таксон - класс Mollicutes, микоплазмы представляют по уровню ДНК-гомологии чрезвычайно гетерогенную группу организмов (опероны генов рРНК являются единственными протяженными гомологичными участками ДНК ряда микоплазм). Этот факт исследователи связывают с высокой скоростью мутационного процесса микоплазм, нестабильностью их генома вследствие частых событий реорганизации ДНК по типу "выщепления-встраивания", в том числе в процессе взаимодействия с клетками высших эукариот (Чернова и др., 1986; Woese et al., 1984; Harasawa et al., 1992). Значительная часть представителей класса Mollicutes "скрыта" в группе некультивируемых на бесклеточных питательных средах микоплазм,

- микоплазмоподобных организмов (МПО). Вопрос о происхождении МПО

- широкого спектра "штаммов" некультивируемых микоплазм остается пока открытым. В самое последнее время установлено тесное генетическое родство МПО с микоплазмами рода Acholeplasnia (Namba et al., 1993). Это позволяет предполагать, что МПО являются потомками представителей рода Acholeplasma.

Многие виды МПО являются возбудителями более 300 различных заболеваний растений (McCoy et al., 1989). Микоплазмозы растений широко распространены в регионах интенсивного растениеводства, в том числе в основных районах хлебопашества и овощеводства, при этом потери урожая зерна иногда составляют 80-90%, а овощей - 20-30% (Скрипаль, 1988). По вредоносности микоплазменные инфекции растений относят к катастрофическим заболеваниям, часто принимающим характер эпифитотий. Развитие этих инфекций, как правило, обусловлено нарушением симбиотического равновесия экосистем.

Специфичные факторы патогенности микоплазм до сих пор не установлены. Весьма вероятно, что в основе фитопатогенеза в случае микоплаз-менных инфекций лежат механизмы, обеспечивающие длительную перси-стенцию микоплазм в организме хозяина. Принимая во внимание феноменально высокий уровень гетерогенности ДНК представителей класса

Mollicutes, можно предположить, что эти процессы связаны с геномной изменчивостью микоплазм, обуславливающей ускользание этих микроорганизмов от защитных механизмов растений и их персистенцию (длительное сохранение) в новых экосистемах.

Решение проблемы управления микоплазменными инфекциями лежит на пути изучения молекулярных механизмов взаимодействия в системе "паразит-хозяин", В этой связи разработка, постановка и исследование модельных (микоплазмы - растительные клетки) систем, могущих отражать природные процессы взаимоотношения паразита и хозяина, представляются весьма целесообразными. Однако в этом направлении сделаны лишь первые шаги. Развитие подобных исследований в значительной мере сдерживается отсутствием эффективных диагностических средств для обнаружения, идентификации микоплазм, инфицирующих растения.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было выяснение морфофизиологических и молекулярных аспектов взаимодействия клеток микоплазм и растений.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать высокочувствительные диагностические зонды для обнаружения микоплазм в клетках растений на основе ДНК-гибридизации и полимеразной цепной реакции;

2. Определить особенности влияния Acholeplasma laidlawii на морфологию, физиологию, геном, а также ультраструктуру клеток растений

■ (Pisum sativum);

3. Выяснить молекулярные особенности взаимодействия в системе "паразит-хозяин".

Научная новизна работы. В настоящей работе показано, что ахоле-плазмы (в частности, Acoleplasma laidlawii) могут быть возбудителями заболеваний растений: эти микроорганизмы способны проникать в ткани растений непосредственно через корневую систему и вызывать специфичные изменения морфогенеза, характерные для микоплазмозов, возникающих у растений в природных условиях спонтанно. Впервые установлено, что колонизация растительных тканей клетками микоплазм (Acholeplasma laidlawii) сопровождается изменением ряда физиологических параметров, связанных с биосинтезом полипептидов, системой вторичных мессенджеров и фосфори-

лированием белков растений. Впервые показано, что микоплазменные инфекции вызывают изменения как ультраструктуры, так и генома клеток растений. Впервые установлено, что при взаимодействии A.laidlawii с клетками растений.. (Pisum sativum) происходит реорганизация генома мико-плазм, сопровождающаяся трансформацией этих микроорганизмов в не-кулътивируемые формы. Впервые показано, что ответные реакции растений на микоплазменные инфекции связаны с включением классических сигнальных механизмов подавления патогенов. Предполагается, что реорганизация геномов взаимодействующих организмов может играть ключевую роль в специфичных процессах адаптации в системе "паразит-хозяин". На основе полученных в настоящей работе данных выдвинута гипотеза о происхождении микоплазмоподобных организмов (МПО).

Научно-практическая значимость работы заключается в создании высокочувствительных диагностических проб для обнаружения микоплазменных инфекций с помощью ДНК-ДНК-гибридизации и полимеразной цепной реакции, которые могут быть использованы для выявления возбудителей заболеваний растений, в сельском хозяйстве для проверки семенного материала, а также в научных лабораториях, где проводятся исследования на растительных культурах и целых растениях.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Создание высокочувствительных диагностических систем для обнаружения микоплазм в клетках растений;

2. Разработка методов искусственного инфицирования микоплазмами растений;

3. Характеристика морфологических, ультраструктурных, физиологических и кариологических параметров растений P.sativum, инфицированных A.laidlawii.

4. Молекулярные особенности взаимодействия в системе "микоплазма-растение".

5. Трансформация клеток A.laidlawii в некультивируемые формы в процессе их взаимодействия с клетками растений.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были доложены на Всесоюзной конференции "Генная и клеточная инженерии для решения биотехнологических проблем" (Тарту, 1988), 9-ой Всесоюзной конференции "Нуклеазы" (Казань, 1991), Международной конференции по

быстрой диагностике микоплазм (Иерусалим, Израиль, 1991), 4-ой конференции "Микроорганизмы в сельском хозяйстве" (Пущино, 1992), 6-ом Международном Симпозиуме по микробной экологии (Барселона, Испания, 1993), 15-ом Международном ботаническом конгрессе (Токио, Япония,

1993), 3-ем Съезде Всероссийского общества физиологов растений (Санкт-Петербург, 1993), Международной конференции "Молекулярная биология на рубеже 21 века" (Москва, 1994), 1-ом Евразийском конгрессе по генной терапии (Анкара, Турция, 1995), 8-ом Международном конгрессе по бактериологии и прикладной микробиологии (Иерусалим, Израиль, 1996), 2-ой Республиканской конференции "Актуальные экологические проблемы Республики Татарстан" (Казань, 1996), 5-ой конференции по фитоплазмам (Пекин, Китай, 1996), Конгрессе "От молекулярных механизмов к растениям" (Италия, 1996), Международной конференции по фитопатологии (Познань, Польша, 1997), а также на 7-ом (Вена, Австрия, 1988), 8-ом (Стамбул, Турция, 1990), 9-ом (Эймс, США, 1992), 10-ом (Бордо, Франция,

1994), 11-ом (Орландо, США, 1996) Конгрессах Международного общества микоплазмологов.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 68 работ, включая 24 статьи в центральных отечественных и зарубежных изданиях, а также 5 авторских свидетельств на изобретения.

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики Казанского института биологии КНЦ РАН. Экспериментальные результаты, изложенные в диссертации, получены автором лично, а также совместно с сотрудниками и аспирантами лаборатории молекулярной генетики, работавшими под руководством диссертанта. Соискателю принадлежит разработка программы исследования, теоретическое обобщение получаемых результатов и выводы из работы.

Часть работы по определению физиологических параметров у инфицированных микоплазмами растений выполнена в соавторстве с сотрудниками лаборатории метаболизма белков КИБ КНЦ РАН. Автор приносит благодарность всем коллегам, способствовавшим осуществлению данной работы.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 186 страницах машинописного текста (включая иллюстрации и список цитируемой литературы) и состоит из следующих разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Экспериментальная часть", "Заключение",

"Выводы" и "Список литературы". В работе представлено 5 таблиц и 33 рисунка. Список литературы включает 265 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Штамм Acholeplasma laidlawii (повсеместно распространенной мико-плазмы, изолированной из почвы и сточных вод, а также от больных и здоровых людей и животных) был любезно предоставлен д.б.н. И.Г.Скрипалем (Институт микробиологии и вирусологии им. Заболотного HAH Украины, г. Киев).

В качестве объекта исследований был выбран горох посевной ([Pisum sativum), поскольку эти растения удобны как для анализа морфологических проявлений микоплазмозов, так ц для проведения кариотипических исследований структуры их хромосом (так как кариотип гороха представлен 14 довольно крупными хромосомами).

Семена гороха посезного Р.sativum (сорт Казанский 38) были получены из НПО "Семеновод" (г.Казань).

Культивирование клеток А.laidlawii проводили на среде Эдварда (Edward, 1974).

Семена гороха перед проращиванием обрабатывали 2%-ным гипохло-ридом натрия. На 4-е и 6-е сутки проростки заражали клетками ахолеплаз-мы посредством инъекции методом Клемента (KJement, 1963) в нижнюю часть стебля и/или выращивали растения в среде, содержащей клетки A.laidlami с различным начальным титром. Определение титра микоплазм проводили стандартным методом на агаризованной среде (Methods in mycoplasmology, 1983). Для увеличения титра КОЕ клетки собирали центрифугированием при 10 тыс. об/мин. и суспендировали в 0.01 первоначального объема питательной среды.

Высев микоплазм из зараженных растений проводили по методу Скри-паля (Скрипаль, Малиновская, 1984).

Выделение и гидролиз ДНК ферментами нуклеинового обмена (Pstl, BatnHI, Hindlll, EcoRV, Mspl, Mlul, BspRI, PvuII, Kpnl (НПО "Фермент", Вильнюс), SV-нуклеазой, Bal31 (Pharmacia, Швеция)), электрофоретическое разделение фрагментов ДНК в 0.8% агарозных гелях, элюцию ДНК из гелей (на "Whatman DE-81", Англия), клонирование фрагментов ДНК в бактери-

альных плазмидах pBR322, pUC19 (Pharmacia, Швеция), ДНК-ДНК-гибридизацию на нитроцеллюлозных фильтрах (Schleicher & Schull, Германия) проводили по общепринятым методикам (Маниатис и др., 1984).

Выделение фракции, обогащенной ДНК некультивируемых форм, проводили по R.Davis et al (1990). Для этого из молодых листьев инфицированных растений вырезали центральную часть, ткани обрабатывали мацеразой и размельчали в ступке с жидким азотом. Полученный порошок гомогенизировали в буфере HEPES (Sigma, США) с 0.1% поливинилпирралидоном (Serva, Германия) и центрифугировали при 500 об/мин (10 мин). Отбирали супернатант и центрифугировали при 15 тыс. об/мин в течение 40 мин. Из осадка выделяли ДНК по стандартной методике (Маниатис и др., 1984).

Введение радиоактивной метки (меченые дезоксинуклеотидтрифосфаты производстваХОП-радиопрепарат, Ташкент) и bio-dUTP, (НПО "Фермент", Вильнюс) осуществляли по P.Rigby et al. (1977), используя ник-трансляционный набор фирмы "Amersham" (Англия). Удельная активность зондов составляла 108 имп/мин/мкг.

Определение первичной нуклеотидной последовательности проводили по А.Максам и У.Гилберт (1986) твердофазным методом на приборе "Minifold", LKB (Швеция).

Перенос фрагментов ДНК с агарозного геля на нитроцеллюлозный фильтр осуществляли согласно Т.Маниатису и соавт. (1984).. Амплификацию участков ДНК проводили в приборе производства НПО "Биоприбор" (г.Пущино). Реакционная смесь содержала 1 мкл 10-ти кратного реакционного буфера (Amersham, Англия), 20 нмоль каждого из 4-х дезоксинуклео-тидов и амплифицируемого образца ДНК. Смесь инкубировали при 94°С 5 мин., добавляли 0.5 ед Год-полимеразы (Pharmacia, Швеция) и проводили 30 циклов амплификации (денатурацию 30 сек. при 94°С, а ренатурацию 2 мин. при 55°С). В случае "гнездового" варианта ПЦР после прохождения 30 циклов амплификации в смесь добавляли "внутренние" праймеры и по 20 нмоль дезоксинуклеотидов, 7ас/-полимеразу и проводили еще 30 циклов. Продукты амплификации участков ДНК анализировали в 5% ПААГ.

Протеинкиназную активность определяли по методу U.Kikkawa с сотр. (1983) с модификациями (Каримова и др., 1991).

Проведение цитогенетического анализа образцов каллусных культур P.sativum; а также корешков и листьев проростков гороха осуществляли по З.П.Паушевой (1974).

Для определения активности пероксидаз 200 мг листьев гороха растирали в фарфоровой ступке в 6 мл 0.1 М фосфатного буфера (рН 7.3) при 4°С. Через 30 мин настаивания экстракт центрифугировали при 10000 g 20 мин. и отбирали супернатант для определения активности растворимой фракции пероксидаз. Оставшуюся часть тканей отмывали 2 раза в трехкратном объеме экстракционного буфера, затем экстрагировали тем же буфером с добавлением КС1 до 1 М в течение 2-х часов при комнатной температуре. Гомоге-нат центрифугировали при 10000 g 30 мин. Супернатант использовали для определения активности ионо-связанной фракции пероксидаз. Оставшийся гомогенат промывали третий раз тем же буфером и экстрагировали 0.1 М фосфатным буфером в течение 15 часов. Экстракт центрифугировали при 1000 g 30 мин. Супернатант использовали для определения активности.ко-валентно-связашюй фракции пероксидаз. Активность пероксидаз определяли измерением оптической плотности продуктов реакции, образовавшихся при окислении гваякола за определенный промежуток времени (Grison, Pelet, 1985). Для этого в кювету спектрофотометра вносили 0.5 мл раствора гваякола (183 мг на 25 мл воды), 1.5 мл 0.1 М фосфатного буфера (рН 7.4), 0.5 мл супернатанта и 0.5 мл 0.15% раствора перекиси водорода. С внесением в смесь перекиси водорода включали секундомер. Измерения проводили через каждые 10 сек. в течение 2 мин. Оптическую плотность раствора измеряли при 470 нм против аналогичной смеси, где вместо перекиси водорода добавлялось такое же количество воды.

Электронно-микроскопические исследования клеток микоплазм, культивируемых in vitro, а также клеток растений, инфицированных микоплаз-мами, проводили на электронном микроскопе JEM-100X (Jeol, Япония). Материал фиксировали в 2.5% растворе глутарового альдегида на фосфатном буфере (рН 7.2), постфиксировали 4 часа 1%-ным раствором четырехо-киси осмия с добавлением 2.5 мМ сахарозы. После дегидратации в спирте восходящей концентрации, 100% ацетоне и окиси пропилена материал заливали в эпон-812. Тонкие срезы получали на ультрамикротоме LKB-III

(Швеция). Срезы контрастировали насыщенным водным раствором урани-лацетата, а затем цитратом свинца.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Диагностика микоплазменных инфекций растений

К настоящему времени известно более 20 способов выявления мико-плазм в биологическом материале (в том числе, микробиологический посев на специальные питательные среды, электронная микроскопия, люминис-центная микроскопия в сочетании с окраской ДНК интеркалирующими флюорохромами, обычная световая микроскопия с авторадиографией, введение 6-метилпурин-дезоксирибозида, иммунологические, с использованием нефракционированных антисывороток, поли- и моноклональных антител, гибридизационные, с использованием РНК и ДНК-зондов и т.д.). Такое многообразие отражает разногласия авторов в оценке эффективности этих способов. Наиболее близкими к идеальным диагностическим тестам для выявления микоплазменных инфекций в любом биологическом материале считаются методы, основанные на выявлении специфичных последовательностей ДНК (Борхсениус, Чернова, 1989; Жуланова и др., 1993).

Обнаружение микоплазменных инфекций с помощью сконструированного ДНК-зонда методом ДНК-ДНК-гибридизации

Для решения поставленных задач по изучению механизмов взаимодействия микоплазм с клетками растений необходимо проводить постоянный контроль за развитием инфекционного процесса в растениях. С этой целью нами был сконструирован ДНК-зонд рА17 (Чернов и др., 1990, A.C. N 1835851), представляющий собой рекомбинантную молекулу ДНК, состоящую из плазмиды pBR322 и специфичного фрагмента геномной ДНК Acholeplastm laidlawii.

Специфичность сконструированного ДНК-зонда рА17 неоднократно была проверена методами блот- и дот-гибридизации на нитроцеллюлозных фильтрах с тотальными препаратами ДНК, выделенной из различных видов микоплазм и растений (рис.1).

Рис. 1. Специфичность ДНК-зонда рА17.

Радиоавтограф - результат дот® гибридизации тотальных препа-ль ратов ДНК, выделенной из растений и микоплазм, с ДНК-зондом рА17, меченным 32Р.

д д пт___ а: ДНК А.ШЬжИ (10 нг) - 1,

$ А.Ыррхкоп (I мкг) - 2, А.ахашкит (1

мкг) - 3, А.осиИ (1 мкг) -4, А.%гапи1агит 12 3 4 5 6 78 (1 мкг) - 5, коммерческий препарат

ДНК эукариот в качестве отрицательного контроля (6 мкг) - 6, Л.ЫсНан'И (50

нг) + Р.шЬит (6 мкг) - 7;

б: ДНК А.1шсИач>И (5 нг) - 1, ММоттз (1 мкг) - 2, М./егтеШаю (1 мкг) - 3, М^аШзерНсит (1 мкг) - 4, М.рпеитотае (1 мкг) - 5, М.ЬоуЬ (1 мкг) - 6, А.ШсИам/и (50 иг) + коммерческий препарат ДНК эукариот (6 мкг) - 7;

в: ДНК А.ШсИатЧ (5 нг) - 1, гороха посевного (6 мкг) - 2, пшеницы (6 мкг) - 3, люцерны (6 мкг) - 4, каллусной культуры гороха (6 мкг) - 5, плазмиды рА17 ( 10 нг) в качестве положительного контроля -6;

г: ДНК А.ШсИаки (5 нг) - 1, гороха посевного, инфицированного методом субэпидермальной инъекции (6 мкг) - 2 (из верхних листьев), - 3 (из стебля), - 4 (из нижней части стебля), гороха посевного, инфицированного через неповрежденную корневую систему (6 мкг) - 5 (из верхних листьев), - 6 (из стебля), - 7 (из нижней части стебля), - 8 (из корня).

При использовании гибридизационного метода в наших экспериментах ДНК-зонд рА17, меченный тритием, позволяет обнаружить приблизительно 1 нг ДНК А.ЫсНапИ, что соответствует 105 КОЕ микоплазм. Такой же уровень чувствительности гибридизационного метода был достигнут при дот-гибридизации, когда на нитроцеллюлозный фильтр наносилась нефракцио-нированная ДНК в виде "капли", что заметно упрощало процедуру анализа биологического материала. Кроме того, в опытах по дот-гибридизации со специфичным зондом рА17 возможна оценка множественности инфекции. Для этого на нитроцеллюлозный фильтр необходимо нанести определенное количество ДНК, выделенной из тестируемого образца, и контрольные пробы, содержащие известные количества ДНК А.ШсИати В этом случае по относительной радиоактивности гибридных дуплексов и сравнении с таковой контрольных проб можно подсчитать множественность инфекции.

Чувствительность и надежность гибридизационного метода обнаружения и идентификации микоплазм представляются вполне достаточными для того, чтобы рекомендовать применение его в лабораторной работе, особен-

но в тех случаях, когда изучаются биохимические и генетические аспекты клеток растений. Метод позволяет обнаружить наличие микоплазм как в различных органах и тканях растений, так и в каллусных культурах. По времени исполнения процедура обнаружения микоплазменных инфекций с помощью ДНК-зонда рА17 занимает при наличии низкотемпературной морозильной камеры до 24 часов.

Выявление микоплазменных инфекций методом полимеразной цепной реакции

В тех случаях, когда необходимо более оперативно оценить наличие инфекции можно использовать метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), в основе которого лежит возможность избирательного "размножения" тех или иных последовательностей ДНК в исследуемых образцах. Этот метод, будучи достаточно быстрым по времени исполнения, является также и высокочувствительным: уникальная последовательность ДНК может быть размножена до биллиона копий в течение 2-3-х часов.

В целях получения специфичных праймеров для обнаружения микоплазм в растительных клетках методом ПЦР нами была определена первичная нуклеотидная последовательность ЕсоЯ (•'-фрагмента, выделенного из ДНК-зонда рА17. В этой последовательности были отобраны участки, которые можно использовать в качестве "внешних" и "внутренних" праймеров. Использование этих праймеров в двух-шаговой реакции ПЦР позволяет обнаружить 1 фг ДНК микоплазмы в биологическом материале, что соответствует приблизительно одной микоплазменной частице (в процессе деления микоплазмы способны образовывать мультинуклеарные тяжи, когда цитокинез отстает от деления хромосомного материала, поэтому понятие "клетка микоплазмы" имеет относительный характер; в данном случае под микоплазменной частицей мы подразумеваем клетку микоплазмы, имеющую одну хромосому).

Проведение двух-шаговой полимеразной цепной реакции заключается в следующем: сначала проводится амплификация участка ДНК между "внешними" праймерами, затем к продуктам первой реакции добавляются "внутренние" праймеры. Результаты подобного тестирования могут быть получены через 3-4 часа (рис. 2). Однако метод ПЦР не позволяет оценить

множественности инфекции. К тому же некоторые трудности данного способа, могущие приводить к артефактам, а также высокая стоимость теста делают использование ПЦР целесообразным лишь в определенных случаях, причем обязательно в сочетании с другими методами обнаружения мико-плазменных инфекций.

Рис. 2. Выявление А.Шс11а\\И в различных растительных образцах методом шВ^^НВ^^^^^^^^^^^^В^Н двух-шаговой ПЦР.

Электр офореграмма (5% ПААГ) -ШИШИИИЕДНИ^ИМИ результат амплификации ДНК.

ЕВтая^В^ВНЯ^^^^^^^^НВ 1-6 - продукты первого шага амли-РШВМИДИИНИВНД^Я^Д фикации;

8-13 - продукты второго шага ам-ННИДИИ^ИИИ^И^ИНИ плификации;

ИНШИЯИИМ^ЮИ^ИИДИЖМИИЯЯ 7 . \lHindIlI в качестве маркера мо-1 2 3 4- 5 С 7 8 9 10 11 12 13 лекулярной массы.

Использование синтезированных праймеров в полимеразной цепной реакции, а также сконструированного нами ДНК-зонда рА17 для обнаружения и идентификации микоплазменных инфекций А.Шс11а\\>и методом ДНК-ДНК-гибридизации в сочетании с электронной микроскопией и микробиологическим культивированием позволяет решать задачи, связанные с контролем развития микоплазменных инфекций в растениях, при изучении влияния патогена на морфологию, ультраструктуру, физиологию и геном растительной клетки.

Пути инфицирования растений микоплазмамн

В природе основную роль в распространении микоплазмозов растений играют насекомые-переносчики: цикадки и псиллиды (вертикальный способ распространения микоплазмозов от родителей к потомству у растений пока не доказан). Считают, что почвенные микоплазмы являются симбионтами насекомых, цикл развития которых частично или полностью проходит в почве (Ти11у е1 а1., 1988). Прямых доказательств функционирования мико-плазм непосредственно в почве нет, что может быть связано либо с непригодностью этого природного субстрата для развития микоплазм, либо с не-

удачным выбором питательных сред для их выделения, а также неэффективностью использованных диагностических средств для выявления микоплазм в биологическом маиериале.

Проникновение микоплазм через неповрежденную корневую систему

В наших экспериментах часть образцов P.sativum была инфицирована выращиванием растений на среде, содержащей клетки микоплазм (A.laidlawii). Для этого в стерильных условиях проращивали семена растений на полужидкой среде, инокулированной клетками A.laidlawii. Через 5-7 суток у растений развивались признаки микоплазмозов. Методами ДНК-ДНК-гибридизации с ДНК-зондом рА17 и электронной микроскопии в различных органах и тканях гороха P.sativum были идентифицированы клетки A.laidlawii. Поскольку корни растения были единственным местом соприкосновения с клетками микоплазм, а микоплазмы впоследствии обнаруживались в различных органах растения, можно сделать заключение о возможности микоплазм проникать в растения через неповрежденную корневую систему в природных условиях. При трении корешков о частицы почвы могут возникать повреждения тканей корней, что лишь облегчает проникновение микоплазм в растения. Однако в модельных опытах использовалась гомогенная полужидкая среда, которая не причиняет травмирующего действия на корешки при их росте. Полученные нами результаты свидетельствуют о способности микоплазм проникать в ткани растений через корневую систему и дополняют существующие представления о распространении фитопатогенных микоплазм с помощью насекомых-переносчиков.

Кроме спонтанного инфицирования растений через корни мы также заражали растительные образцы микоплазмами методом субэпидермальной инъекции, используя микрошприцы фирмы "Hamilton". В этом случае суспензия, содержащая клетки микоплазм, проникает под давлением в растения без грубого повреждения тканей, Зона инфицирования тканей растения, как оказалось, не ограничивается местом проникновения иглы, а охватывает значительную часть близлежащих тканей. Этот способ инфицирования, напоминающий впрыскивание микоплазм через жало насекомых, представ-

ляется наиболее близким к природному, "горизонтальному", способу переноса этих микроорганизмов.

Характеристика некоторых морфологических и физиологических признаков растений (Pisum sativum), инфицированных клетками Acholeplasma laidlawii

До настоящего времени роль Acholeplasma laidlawii в развитии патологических процессов у растений вызывает споры среди фитопатологов. Существуют две противоположные точки зрения. Согласно первой, A. laidlawii является возбудителем таких заболеваний растений как филлоидия клевера, круглолистность и "ведьмины метлы" картофеля, столбур пасленовых и т.д. (Власов и др., 1985; Скрипаль, 1988). Сторонники второй точки зрения (Bove, 1981) считают, что возбудителями заболеваний растений среди представителей класса Mollicutes являются лишь некоторые виды семейства Spiroplasmatacea, а также значительная группа некультивируемых in vitro микоплазмоподобных организмов (МПО), которые оказались генетически чрезвычайно близкими (> 90% гомологии по ДНК) к представителям рода Acholeplasma.

По-видимому, ясность в понимании роли ахолеплазм в развитии патологических процессов у растений могли бы внести результаты сравнительного анализа исследований экспериментального инфицирования растений клетками A.laidlawii и имеющихся данных о фитомикоплазмозах, возникающих в природных условиях спонтанно.

Изменения морфологических признаков у инфицированных растений

В результате наших экспериментов установлено, что инфицирование 4-х суточных проростков Pisum sativum клетками A. laidlawii приводит к нарушению морфогенеза у растений, появлению у них симптомов, характерных для микоплазмозов, возникающих у растений в природных условиях спонтанно (табл. 1).

Таблица 1

Морфологические изменения проростков Р.5а1пит, инфицированных АЛакИсмИ, а также свободных от микоплазм

Количество Растения с

№ титр КОЕ растений в опыте отмиранием вер- деформацией лис-

опыта АЛаШами хушки побега товой пластинки

опыт контроль опыт контроль опыт контроль

1 3x107 192 150 16 2 3 . -

2 2x10» 121 102 18 4 3 -

3 4x107 104 80 7 - 1 -

4 8x107 138 140 13 2 2 -

5 2x10" 75 73 14 2 3 -

У части инфицированных проростков наблюдался некроз апикальной части и края листовой пластины верхних листьев. Практически одновременно с началом отмирания верхушки из пазухи нижних листьев появлялись 1-2 дополнительных побега. В этом случае единственный вторичный побег выгонялся через 4-5 суток. У ряда растений функции роста основного побега восстанавливались, при этом два или три стебля продолжали расти параллельно (как в случае образования "ведьминых метел" - морфологических изменений, проявляющихся у представителей ряда семейств, в том числе бобовых, при спонтанном развитии у них микоплазмозов в природных условиях). У некоторых из зараженных растений РлаИхит микоплазменные инфекции приводили к мозаичному пожелтению листьев, засыханию края листовой пластины, либо к изменению ее формы (появлению волнистого края, а также частично или даже полностью рассеченной формы листа) (рис. 3). В течение первых 4-6 суток после инфекции эти растения значительно отставали в росте от контрольных образцов (табл. 2), однако к 10 суткам разница в росте практически исчезала (Чернов и др., 1996а, 19966).

В природных условиях на проявление тех или иных признаков поражения растения значительное влияние оказывают стадия его развития во время поражения, а также вид и сорт растения, экологические условия, время поражения, вид переносчика и многие другие как природные, так и антропогенные факторы (Скрипаль, 1988). Отсутствие признаков инфекционного процесса у части инфицированных микоплазмами растений в наших экспериментах позволяет предположить, что существенное значение для реализа-

ции микоплазмоза имеет генотип растений. В этой связи особый интерес представляют генетически детерминированные факторы, определяющие невосприимчивость растений к микоплазменным инфекциям, которые еще предстоит идентифицировать.

Таблица 2.

Влияние инфицирования растений P.sativum клетками A.laidlawii на высоту побегов

4 сутки 6 сутки 10 сутки

№ опыта кол-во растений- средняя высота побега О "к кол-во растений- средняя высота побега О К кол-во растений- средняя высота побега О К

О 167 45 141 71 125 134

1 К 144 52 0.86 135 80 0.89 109 138 0.97

О 101 44 91 68 76 126

2 к 98 50 0.88 83 со 0.87 78 127 0.99

О 92 46 85 74' 67 143

3 к 78 54 0.86 73 86 0.86 59 147 0.97

О 118 43 105 68 90 132

4 к 130 52 0.83 117 79 0.86 95 135 0.98

О - опыт, К - контроль

А Б

Рис. 3. Морфологические изменения листовой пластины растений Pisum sativum, инфицированных Acholeplasma laidlami (А; Б - лист неинфицированного ми-коплазмами растения).

Возраст проростков при инфицировании составлял 3 суток. Исходный титр культуры A.laidlawii соответствовал 105 КОЕ/мл; 7-е сутки развития инфекции.

Представляется вероятным, что характер морфологических изменений у растений, инфицированных микоплазмами, обуславливается особенностями локализации этих паразитов в организме хозяина.

Методом электронной микроскопии в сосудах флоэмы растений Р.заШит, инфицированных А.ЫсИамИ, были выявлены типичные по морфологии и ультраструктуре клетки ахолеплазм (рис.4). Эти клетки имели округлую или сферическую форму (300-1000 нм в диаметре) и располагались преимущественно вдоль цитоплазматических мембран (главным образом, около плазмалеммы). В то же время в клетках растений встречались ветвящиеся тяжи, образуемые микоплазмами, которые, проходя фазу коккоидных структур, распадались на ряд сферических клеток. Эти превращения, как уже указывалось, являются следствием того, что цитокинез сферических клеток микоплазм может отставать от репликации генома: тяжи и коккоид-н-------------------—---------------

Рис. 4. Трансмиссивная электронная микроскопия клеток Acholeplasma laidlawii, культивируемых на искусственной питательной среде (I) (4 104х) и во флоэме листа растений P.sativum (II) (2.5 104х)

А - отдельные клетки;

Б - коккоидные структуры, образующиеся при отставании цитокинеза от репликации генома.

Поперечный срез листа. М - клетки микоплазм; КС - клеточная стенка растения; ДМ - деструктивный материал. Возраст проростков при инфицировании составлял 3 суток. Исходный титр культуры A.laidlawii соответствовал 10s КОЕ/мл.

Особенности ультраструктуры клеток растений и микоплазм при их взаимодействии

Микоплазмы обнаруживаются главным образом в ситовидных элементах флоэмы больных растений. Количество клеток микоплазм в клетках флоэмы колеблется весьма значительно - от нескольких клеток до полного заполнения ими растительной клетки (Скрипаль, 1988). Это было характерно и в случае инфицирования растений A.laidlawii в наших экспериментах. В клетках растений микоплазмы располагались в основном вдоль цитоплаз-матических мембран, преимущественно около плазмалеммы. Предполагают, что взаимодействие микоплазмы с клеткой хозяина проходит в три этапа (Скрипаль, 1988). На первом этапе проникновения в молодые паренхиматозные клетки флоэмы микоплазмы взаимодействуют с мембранными элементами клеток (рис.5). При этом реакция клетки растения проявляется в образовании выростов мембраны, направленных в сторону клеток микоплазм. Такие изменения особенно заметны на плазмалемме. Одновременно отдельные клетки микоплазм вытягиваются в сторону мембранных элементов растительной клетки. В результате мембраны клеток микоплазм сливаются в одно целое с мембранными элементами растительной клетки.

Рис. 5. Трансмиссивная электронная микроскопия тканей растений (Pisum sativum), инфицированных микоплазмами (Acholeplas-та laidlawiC). (6 104х).

Возраст побега при инфицировании составлял 4 суток. Исходный титр культуры A.laidlawii соответствовал 105 КОЕ/мл;

Стрелкой отмечен контакт между клеткой микоплазмы и клеточной стенки растительной клетки.

Второй этап развития инфекции характеризуется значительными изменениями ультраструктуры растительных клеток, которые могут свидетельствовать и о нарушении их метаболизма. При электронно-микроскопическом исследовании обнаружено, что на 3-4 сутки цитоплазма молодых паренхимных клеток флоэмы, инфицированных микоплазмами, "темнеет" от насыщения рибосомами и полисомами. Рибосомы инфицированных клеток локализуются в области плазмалеммы или других мем-

бранных элементов, при этом количество рибосом в пораженных клетках значительно возрастает по сравнению с соседними неинфицированными клетками, что, вероятно, обусловлено интенсификацией белкового синтеза в растительных клетках. Ядра инфицированных клеток содержат 6 основном конденсированный хроматин. Единичные хлоропласты пораженных растений имеют слаборазвитые граны и тилакоиды стромы, а также небольшое число пластоглобул; структура митохондрий варьирует от практически нормальной до чрезвычайно плотной с пузыревидными кристами и признаками деструкции.

Полясонармды

urrnmu

сге*«к

Нуклмненые

КЯСЛОШ

, k ,

|Пумдео1ндц|

Рис.6. Схема возможного влияния микоплазм' (О) на метаболизм растений составле-на на основании данных о взаимосвязи метаболических процессов в растительных клетках (Полевой, 1989).

В геноме микоплазм имеется значительное количество генов, кодирующих. белки, связанные с катаболизмом в транспортом метаболитов. В то же время генов, кодирующих белки анаболических путей, напротив, немного. Ограниченность метаболиче-ипяшмн ских возможностей ми-коллазм и зависимость их от экзогенного поступления ряда соединений определяет присутствие в их геномах большого числа генов транспортной системы, обеспечивающей включение в клетки этих микроорганизмов существенных для их жизнедеятельности соединений (например, аминокислот, предшественников нуклеиновых кислот).

Глюкоза, фруктоза и маннитол, вероятно, транспортируются в клетки микоплазм (через систему PTS), а затем мегабодизируются по пути Эмбден-Мейергоф-Парнас (все ферменты которого у исследованных микоплазм обнаружены), либо" через пентозо-фосфатный путь, который у этих микроорганизмов представлен не в полной мере.

В мембранах разных микоплазм присутствуют фосфо- и гликолипиды, для биосинтеза которых требуется приблизительно 10 генов. Однако в результате анализа нуклеотадной последовательности геномов микоплазм идентифицированы только 3 гена этого семейства. Предполагают (Himmelreich et а!., 1996), что гликолипидный синтез у микоплазм может запускаться с фосфатадной кислоты (посредством фосфатидной кислоты, фосфа-тазы, а также УДФ-гликозил или галактозилтрансфераз). Однако ни один из этих ферментов (и соответствующих генов) у микоплазм не обнаружен, как впрочем не выявлены и гены, связанные с биосинтезом жирных кислот или холестерина. Эти соединения мкко-плазмы извлекают из инфицированных клеток, нарушая их метаболизм.

На третьем этапе паренхиматозные клетки разрушаются - постепенно исчезают их мембранные элементы, митохондрии, хлоропласта. Причем хлоропласты разрушающихся клеток содержат значительно больше зерен крахмала, чем хлоропласта здоровых клеток. Подобный факт отмечен при исследовании срезов тканей астры, пораженной МПО, относящихся к группе инфекционных агентов, возбудителей желтух (Chen, Hiruki, 1977), а также шелковицы, пораженной возбудителями курчавой мелколистности (Закарашвили и др., 1983). При этом увеличение количества зерен крахмала в хлоропластах, приводящее к их разрушению, может быть следствием глубоких нарушений метаболизма растения (Robards, 1970). Поскольку мико-плазмы локализуются в основном во флоэме, они могут нарушать нормальную транслокацию в пораженных растениях и, таким образом, отрицательно воздействовать не только на пораженную систему сосудов, но и на ткани, непосредственно связанные с этой системой, и практически на все основные функции растительного организма (рис.6).

Изменения физиологических признаков у инфицированных растений

Колонизация тканей P.sativum клетками A.laidlawii, естественно, сопровождалась изменением ряда физиологических параметров растений, которые свидетельствовали о реактивном включении механизмов защиты растений и развитии адаптивных процессов в системе "паразит-хозяин".

Изменение содержания и набора полипептидов в клетках растений, инфицированных микоплазмами

Известно, что у растений имеется как минимум три сигнальные сети, воспринимающие внешние импульсы от патогенов: 1) липазолипоксигеназы с жасмонатом как основная ступень; 2) классические вторичные мессендже-ры, в том числе цАМФ, Са2+, протеинкиназы, протеинфосфатазы; 3) Н2О2-зависимая система (включая мембраносвязанные гидрогеназы, каталазы и салициловую кислоту, являющуюся сильным ингибитором каталаз) (Тарчевский, 1994).

Одним из следствий инфицирования растений различными патогенами является активация липоксигеназного пути. Известно, что липоксигеназное

превращение линолената приводит к появлению бактерицидных и фунги-цидных гидроперокси-, гидрокси-, эпокси- и кетопроизводных линолената, летучих гексаналей и гекеанолов, 12-углеродных соединений, а также фито-гормона жасмоната, играющего важную роль в экспрессии генов устойчивости растений (Creelman, Mullet, 1995; Blechert et al., 1995). Сопоставление особенностей синтеза белков растений при инфицировании микоплазмами, а также при обработке экзогенным жасмонатом могло бы дать дополнительную информацию о механизме формирования ответа растений на мико-плазменную инфекцию.

В результате электрофоретического разделения белков в ПААГ в спектре полипептидов инфицированных микоплазмами (A.laidlawii) растений (P.sativum) было обнаружено увеличение содержания полипептидов 83 и 19 кДа, а также появление полипептида 38 кДа.

Согласно данным литературы (Zhong, Hiruki, 1993), полипептид 38 кДа соответствует хитиназам. Известно, что реализация механизмов иммунного ответа растений связана с индукцией ряда ферментов, способствующих разрушению клеточной стенки патогенов. Прямое свидетельство об ингиби-торной роли хитиназы по отношению к патогенной инвазии было получено главным образом из исследований растений, инфицированных некоторыми грибами (Дьяков и др., 1976)). Однако и другие патогены, такие как вирусы и бактерии, как выяснилось, также вызывают увеличение продукции хитиназы у инфицированных растений (Zhong, Hiruki, 1993). Учитывая, что ми-коплазмы являются бесклеточными патогенами, можно предположить, что хитиназы являются интегральным компонентом общих механизмов резистентности растений по отношению к патогенам. Сигнальная система растений на микоплазменные инфекции может быть связана с запуском механизмов, контролируемых единым блоком генов (что энергетически более выгодно, чем регуляция работы диспергированных по хромосоме генов, находящихся под контролем различных промоторов). В блок этих генов входит, вероятно, и ген хитиназы, участвующей в разрушении клеточной стенки патогенов (бактерий, грибов).

Учитывая, что образование нового, индуцированного жасмонатом белка 38 кДа наблюдается и при инфицировании A.laidlawii, можно сделать вывод, что заражение растений микоплазмами включает классический, характерный для биогенного стресса катаболический липидный сигнальный

путь: активация фосфолипазы Аг -> освобождение линолената из фосфоли-пидов мембран - липоксигеназное превращение его в 13-пероксилиноленат -►образование жасмоновой кислоты в результате гидропероксидциклазной и сопутствующих реакций активация генов устойчивости образование жасмонат-индуцированных белков -> формирование местной и системной устойчивости к патогенам (рис. 7).

Рис.7. Схема возможного каскада защитных реакций у растений, инфицированных микоплазмами.

- стимуляция —< -ингибиция

Неэффективность защитных механизмов растений в случае микоплазменных инфекций может приводить к развитию хронического окислительного стресса и связанных с ним патологических процессов.

Изменение уровня фосфорилирования белков

Важным звеном в ответной реакции живых клеток на изменение условий окружающей среды являются обратимые процессы фосфорилирования-дефосфорилирования белков (Тарчевский, 1994).

В наших экспериментах (проведенных совместно с сотрудниками группы профессора Ф.Г.Каримовой лаборатории метаболизма белков Казанского института биологии КНЦ РАН) было установлено, что инфицирование растении микоплазмами также приводит к изменению системы вторичных

Рис.8. Изменение удельной цАМФ (1) и Са2+ (2) зависимой протеинки-назной активности в растворимой фракции гомогената у растений (Pisum sativum) в течение 1 часа после инфицирования микоплазмами (Acholeplasma laidlawii).

Возраст проростков при инфицировании составлял 7 суток;

Исходный титр культуры A.laidlawii соответствовал 105 КОЕ/мл

В результате исследования влияния инфицирования растений P.sativum клетками A.laidlawii на синтез и фосфорилирование белков в разные промежутки времени от начала инфицирования (рис. 9) были установлены значительные изменения поглощения ортофосфата и включения 32РН в белки фракций супернатанта и осадка гомогената листьев за разное время инкубации. Степень изменения фосфорилирования белков растений, индуцируемых микоплазмами, зависела от освещенности растений и была выше у растений, помещенных после инфицирования в темноту. Свет ослаблял ингибирова-ние включения 32PU в белки супернатанта, вызванное инфицированием растений микоплазмами. При этом обращает на себя внимание факт более быстрой реакции системы фосфорилирования-дефосфорилирования белков по сравнению с влиянием инфицирования на спектр белков, Так, уже через 60 мин. после инфицирования поступление фосфора в листья растений резко возрастало (в 3 раза в сравнении с контролем), включение 32РН в белки уси-

мессенджеров растений (рис. 8).

ю-I 70'

1 *

г? «•

ю о

— i/f

- 1 {•/////

I 2

ИКГЖШЬЕ

раяашя

1 2 инфицированные расгапя

лилось в 2 раза в супернатанте, но было понижено во фракции осадка. Спустя 2 часа после инфицирования растений мйкоплазмами количество поступившего 32Р» в листья растений было также повышенным в сравнении с контролем. При этом уровень включения 32РИ в белки снизился в осадочной фракции в 2 раза, но оставался повышенным во фракции супернатанта.

83т

1 -< 17--:0> -

!•♦

н о 4 --

о.

8 о

X X 1)

3 -• 2 --

3 1 -

ш о

12 12 осадок С/Н 30 мин.

а.

12 12 осадок С/Н 60 мин.

12 12 осадок С/Н 120 мин.

Рис.9. Влияние инфицирования микоплазмами Ас)ю1ер!сита ШсИаки на фосфорилирование белков фракций гомогената (20000 ц) 3-х дневных этиолированных проростков растений Р.хаНгит через 30, 60, 120 минут после инфицирования.

Цифрами обозначены препараты, полученные из растений, неинфицирован-ных (1) и инфицированных (2) микоплазмами.

Исходный титр культуры А.ЫЛам/И соответствовал 105 КОБ.

Реактивные изменения фосфорилирования белков у растений в ответ на инфицирование микоплазмами представляются закономерными, так как известно, что фосфорилирование белков, например, ферментов приводит к значительному изменению их активности и интенсивности катализируемых ими реакций (Тарчевский, 1993).

Полученные нами данные о влиянии микоплазменной инфекции на биосинтез новых, полипептидов и на фосфорилирование растворимых белков растений позволяют считать, что микоплазмы включают классическую сигнальную систему неспецифической защиты растений от патогенов

(Чернов и др., 1995; Тарчевский и др., 1996; Чернов и др., 1996) (рис.7). В то же время развитие тех или иных признаков заболеваний у инфицированных растений, по-видимому, определяется индивидуальным генотипом растений.

Реорганизация геномов в клетках растений в процессе их взаимодействия с микоплазмами

Возможно, специфичность реакций растений на микоплазмы связана с индукцией в растительных клетках синтеза полипептидов фракций 83 и 19 кДа, природа которых нам пока неизвестна. Но только ли этим исчерпывается специфичность реакций растений на микоплазменные инфекции? Принимая во внимание тахителичность микоплазм с их высоким темпом мутирования и уникальными механизмами реорганизации геномов (Fox, 1985; Dybvig, Voelker, 1996), нельзя исключить того, что адаптивные процессы в клетках растений, инфицированных микоплазмами, могут сопровождаться генетическими перестройками в системе "паразит-хозяин".

Хромосомные аберрации в клетках растений, инфицированных клетками AJaMawü

В процессе эволюции микоплазмы приспособились к сосуществованию с клетками высших организмов в тесном контакте, что способствует активному вмешательству этих микроорганизмов в метаболизм клеток хозяина, а также делает возможным обмен с ними любыми макромолекулами, в том числе экстрахромосомными компонентами, включая и передачу вирусов (Борхсениус, Чернова, 1989; Barile et al., 1979). В принципе, микоплазмы могут влиять практически на любой параметр, в том числе на геном инфицированной клетки. Однако данные об изучении влияния микоплазм на генетический аппарат растительных клеток в литературе отсутствуют.

Для выяснения возможного воздействия микоплазм на генетическую систему растительных клеток нами был выполнен кариологический анализ клеток инфицированных и контрольных растений P.sativum при использовании анафазного метода учета аберраций. На цитологических препаратах подсчитывалось количество анафаз с аномалиями - мостами, фрагментами, отставаниями и определялось их доля от общего количества анафаз. В ре-

зультате выполненного нами цитогенетйческого анализа в клетках инфицированных микоплазмами растений по сравнению с контрольными, неинфи-цированными растениями, было обнаружено увеличение частоты 'хромосомных аберраций. В контрольных образцах доля анафаз с различными отклонениями составляла 3.2-3.6%, что соответствует пределам нормы для растительных клеток (Паушева, 1974). Однако в клетках растений, зараженных A.laidlami, количество хромосомных аберраций возрастало до 5.15.8% (табл.3).

Таблица 3

Встречаемость хромосомных аберраций в анафазах клеток меристемы корешков проростков P.sativum, инфицированных AJaidlawii, а также контрольных (неинфицированных) растений.

№ опыта кол-во нормальных анафаз кол-во анафаз с аберрациями кол-во фрагменте в мостов кол-во отставании хромосом Уо хромосомных аберрации

опыт 259 16 10 6 5.8

1 контр 80 3 3 _ 3.6

опыт 90 5 4 1 5.3

2 контр 110 4 3 1 3.5

опыт 304 17 9 8 5.3

3 контр 147 5 3 2 3.3

опыт 130 7 5 2 5.1

4 контр 243 8 4 4 3.2

Значения критерия Стьюдента (1=9.2) указывают на достоверность различий между контролем и опытом.

Значительное увеличение хромосомных аберраций нами было также установлено в клетках каллуса P.sativwn в случае спонтанного инфицирования растительной культуры микоплазмами (A.laidlawii) (Chernov et al., 1990). Множественность микоплазменной инфекции, определенная с помощью ДНК-зонда методом дот-гибридизации, в этих случаях составляла до 150 микоплазменных частиц на гаплоидный геном растительной клетки. При этом число клеток с хромосомными аберрациями находилось в прямой зависимости от множественности инфекции (Chernov et al., 1990). Каллус, инфицированный микоплазмами, по сравнению с контрольной культурой выглядел желтым, более плотным и медленно растущим, однако на протяжении всего опыта оставался вполне жизнеспособным.

Причины возникновения хромосомных аномалий в клетках растений, инфицированных микоплазмами, могут быть связаны как с непосредственным воздействием инфекционного агента на хромосомный аппарат растительных клеток (в связи с интеграцией участков генома патогена в хромосомы клеток хозяина), так и с косвенным - посредством изменения метаболизма в системе "паразит-хозяин" в связи с вмешательством паразита в обмен нуклеиновых кислот, а также образованием значительного количества активных форм кислорода вследствие окислительного взрыва (одним из основных неспецифических защитных механизмов реакций растений на инфекционный процесс), повреждающих биомолекулы. При этом персистен-ция микоплазм у растений может обеспечивать серьезные нарушения в генетическом аппарате инфицированных клеток вследствие вероятного развития хронического окислительного стресса и, соответственно, угнетения факторов системы антиоксидантной защиты (например, пероксидаз).

Определение активности пероксидаз в растениях P.sativum, инфицированных A.laidlawii

Перекись водорода относится к ряду веществ, которые называют собирательным термином "активные метаболиты кислорода" (АМК). Интерес к изучению АМК, наблюдающийся в последнее время, объясняется широким спектром их физиологического действия (Гамалей, Клюбин, 1996). Емкость восстановительного буфера клетки (совокупность восстанавливающих агентов и ферментов, в частности, пероксидаз) находится в балансе с производством АМК. Резкое возрастание количества АМК, образующегося при окислительном взрыве в клетках организма, сопровождается увеличением активности пероксидаз (Allen, 1991).

В литературе есть данные о реактивном изменении активности пероксидаз в тканях растений при некоторых инфекционных процессах (Levine et al., 1994). Однако в случае микоплазменных инфекций и персистенции (длительном сохранении) микоплазм у растений подобные исследования не проводились.

В клетках, инфицированных A.laidlawii, а также контрольных растений P.sativum нами была определена активность трех форм пероксидаз, различающихся локализацией в клетке: цитоплазматической, ионо-связанной и

ковалентно-связанной с клеточной стенкой. Для этого был использован спектрофотометрический метод, основанный на измерении оптической плотности продуктов реакции, образующихся при окислении гваякола за определенный промежуток времени (Опбоп, Ре1е1, 1985).

Таблица 4

Изменение активности трех форм пероксидаз у растений (Р.заП'уит) при инфицировании их Л.ЫсНачи, на 5,6 и 7 сутки развития инфекции.

Время после инфицирования в сутках Ковалентно-свя-занная фракция Ионо-связанная фракция Цитоплазматическая фракция

активность % активность % активность %

5 опыт 76.75 120.6 1.18 207.1 1.55 114.8

контроль 63.70 100 0.57 100 1.35 100

6 опыт 15.80 129.4 0.31 221.4 0.72 378.9

контроль 12.20 100 0.14 100 0.19 100

7 опыт 26.58 127.5 0.26 130.0 0.201 101.0

контроль 20.84 100 0.20 100 0.199 100

В таблице 4, а также на рис. 10 приведены результаты определения уровня пероксидазной активности контрольных и инфицированных растений на 5, 6 и 7 сутки развития инфекции.

400

300-

«I

е£

о И

о а и в

•в Н

п 200-

к «

100-

—■—ковалентно-связаняая фракция —•— ионо-свяэанная фракция —*—цитоплаэматпческая фракция —т— контроль

8 10 12 14

время, сутки после инфицирования

Рис. 10. Изменение активности трех форм пероксидаз у инфицированных Лс]ю1ер1ата ШсНакп растений Риклг ¡аИтт на 5, 6, 7 и 15 сутки развития инфекции.

Полученные нами результаты могут свидетельствовать о том, что в клетках и тканях инфицированных микоплазмами растений происходит резкое увеличение количества перекиси, что может обеспечивать образование других форм активных метаболитов кислорода (ОН*, Ю2, ЯО'ДОг' и др.), приводить к окислительному стрессу и активации перекисного окисления липидов. Как следует из представленных данных, активность перокси-даз в инфицированных растениях в цитоплазматической фракции возрастает незначительно. В то же время в ионо-связанной фракции она превышает контрольную более чем в двое и имеет тенденцию к снижению на седьмые сутки после инфекции. Перед этим наблюдается всплеск пероксидазной активности в ковалентно-связанной фракции. У большей части растений на этом этапе наблюдается процесс восстановления нормального морфогенеза проростков, проявляющийся в увеличении скорости роста побегов и выздо-равлении части увядающих растений. Однако нами установлено, что даже на 15 сутки развития инфекции в растениях сохраняется повышенный уровень активности пероксидаз, что представляется естественной реакцией организма на присутствие в клетках инфекционных агентов.

Аккумуляция перекиси водорода в растительной клетке может приводить к сверхчувствительности клеток и последующему некрозу, а также к специфическим сшивкам полимеров клеточной стенки и связанному с этим повышению прочности этого механического барьера растительных клеток, препятствующего инфицированию. С повышением концентрации перекиси водорода связывают и формирование системной устойчивости к патогенам (Dangl et al., 1996). Однако хронический окислительный стресс имеет значительные последствия для организма (Гамалей, Клюбин, 1996). Так, повышение активности супероксидов в результате действия искусственных индукторов окислительного стресса вызывает модификацию и повреждение биомолекул в клетке (Гамалей, Клюбин, 1996). Причиной тому могут быть реактивные соединения, образующиеся при взаимодействии клетки с окислителем (Beckman, Crow, 1993), а также подавление синтеза белков, особенно ключевых ферментов, ответственных за репликацию ДНК (Allen, 1991). Известно, что свободные радикалы, образуемые перекисью водорода, разрушают сахаро-фосфатные или гликозидные связи, что приводит к одиночным разрывам ДНК (Гамалей, Клюбин, 1996).

Окислительный стресс, вероятно, является основной причиной появления хромосомных аномалий в клетках, инфицируемых микоплазмами. В то же время, исходя из данных о метаболических возможностях микоплазм, нельзя исключить того, что процессы, связанные с конкурентным уничтожением микоплазмами метаболитов клетки, в том числе предшественников нуклеиновых кислот (рис.6), также способны приводить к повреждению хромосом инфицированных клеток. Наконец, хромосомные аберрации в инфицированных микоплазмами клетках растений могут быть следствием непосредственного взаимодействия геномов клеток хозяина и паразита на основе гомо- или гетерологичной рекомбинации.

Гомологичные участки ДНК микоплазм, вирусов и клеток эукариот

Материальной основой непосредственного взаимодействия геномов микоплазм с клетками хозяина могут быть гомологичные участки, обнаруженные в ДНК микоплазм, вирусов и клеток эукариот (Борхсениус, Чернова, 1989), а также подвижные элементы типа Тп и IS, играющие значительную роль в мутационных процессах организмов (Хесин, 1985). В геноме ряда микоплазм (включая, A.laidlawii) нами (Чернов, Чернова, 1996а; Чернова, Чернов, 1995) идентифицированы повторяющиеся фрагменты размером 221 н.п., содержащие по нескольку копий последовательности TCTTTA/GAAAACT/AG/AA. Нуклеотидные последовательности, гомологичные указанной, также присутствуют в спейсерных и промоторных зонах генов рРНК всех изученных микоплазм (Glaser et al., 1992; Harasawa et al., 1992). Эти зоны генома микоплазм связаны с интенсивными перестройками по типу "выщепления-встраивания" (Harasawa et al., 1994).

Известно, что в спейсерных и промоторных зонах генов рРНК некоторых высших и низших эукариот, также как и в подвижных элементах геномов организмов и вирусов, в том числе длинных концевых повторов вирусов, присутствуют 14-мерные последовательности, являющиеся "горячими точками" рекомбинации, в том числе в связи с интеграцией в ДНК генома инфекционного агента. Эти последовательности гомологичны сайтам узнавания эукариотической топоизомеразы I (регулирующей процессы транскрипции, репликации, рекомбинации) и, как оказалось, повторяющимся трактам TCTTTA/GAAAACT/AG/AA, присутствующим в геномах мико-

плазм. Наличие подобных последовательностей в геномах микоплазм, вирусов и эукариот может быть аргументом в пользу существования общих механизмов регуляции фолдинга ДНК, реакций транскрипции, репликации, а также незаконной рекомбинации. Так ли это, еще предстоит выяснить. Однако в любом случае наличие последовательностей, гомологичных в геномах микоплазм, вирусов и эукариот может быть материальной базой для взаимодействия их геномов на основе гомологичной (законной) рекомбинации. Результатом подобных процессов может быть не только возникновение генетических изменений в клетках хозяина, но и реорганизация ДНК микоплазм.

Реорганизация геномов микоплазм и трансформация клеток микоплазм в некультивируемые формы

В литературе есть данные об изменении экспрессии генов микоплазм в процессе взаимодействия их с клетками эукариот. В процессе наших исследований установлено, что клетки A.laidlawii при культивировании in vitro способны быстро реагировать на некоторые внешние факторы изменением структуры генома. Так, нами было обнаружено, что введение в культураль-ную среду, содержащую клетки A.laidlawii, антибиотиков и некоторых металлов вызывает амплификацию экстрахромосомных компонентов мико-плазмы, а также и изменение их копийности в геноме (магнификацию) (Chernov et al, 1992). Однако примеры исследования структурной организации генома микоплазм в динамике роста, а также при взаимодействии этих микроорганизмов с клетками растений в литературе отсутствуют.

При электронно-микроскопическом изучении ультратонких срезов растений, инфицированных A.laidlawii, нами было обнаружено, что мико-плазмы присутствуют в клетках растений на протяжении всего срока эксперимента (20 суток). Однако выделить микоплазмы на искусственные питательные среды удавалось только в первые 5-6 суток после заражения ими растений (табл. 5).

При электронно-микроскопическом исследовании ультратонких срезов растений в ситовидных элементах флоэмы P.sativum одновременно обнаруживались клетки микоплазм, находящиеся на разных стадиях развития - мо-

лодые (600-800 нм), зрелые (800-1200 нм) и старые (больше 1200 нм в диаметре). Большинство клеток популяции A.laidlawii в растениях составляли "минимальные тела", размер которых оказывался приблизительно в 4-5 раз меньше нормальных клеток микоплазм, культивируемых in vitro. Подобные формы микоплазм были описаны при изучениии ультраструктуры клеток МПО (Chen et al., 1989).

Таблица 5

Результаты высева А.ШЛамН из инфицированных растений Р. ¡а! пит на разных сроках развития инфекции

№ 2 суток 4 суток 6 суток 10 суток 14 суток 21 сутки

опыта п m п ш п m п ш п m п ш

1 4 2 4 2 4 - 6 - 6 - 4 -

2 6 4 8 4 8 3 8 - 4 - 4 -

3 5 2 5 2 6 1 6 1 5 - 4 ■

4 6 3 6 3 6 2 6 -

5 10 1 10 - 1 -

итого 21 11 23 11 24 б 36 2 25 • 22 -

% высе-ваемости 52 48 25 5.6 0 0

Примечания: п - количество растений, взятых в опыт;

ш - количество растений, из которых были высеяны на искусственные питательные среды клетки А.шгЛа-ми

Установлено, что неспорообразующие бактерии способны переходить в "некультавируемое состояние", которое обеспечивает им выживание в течение длительного времени в условиях неблагоприятных для активного роста и размножения (Романова, Гинцбург, 1993; Oliver, 1993). При этом клетки не образуют колоний на средах, используемых для культивирования этих микроорганизмов, и обнаружить их можно лишь с помощью микроскопических методов и/или ДНК-проб. Подобные процессы, по-видимому, характерны и для микоплазм. Представляется вероятным, что взаимодействие клеток A.laidlawii с различными видами растений, приводящее к трансформации их в некультивируемые МПО, может быть связано с реорганизацией генома микоплазм.

В результате проведения рестрикционного анализа ДНК, выделенной из клеток A.laidlawii в первые 6 суток после инфицирования растений (то есть когда клетки микоплазм еще могут быть выделены на искусственные среды, а количество ДНК микоплазм можно регулировать наращиванием

ные клетки микоплазм, так и минимальные тела (рис.11). Однако их соотношение (приблизительно 1:15) позволяет считать вклад ДНК типичных клеток микоплазм за фоновые значения при ДНК-ДНК-гибридизации.

Для количественного определения степени гомологии геномов мы использовали показатель гетерогенности (ПГ) -величину, определяемую как сумму квадратов отклонений (d) профиля кривой термоэлюции исследуемой формы от ре-перной. Этот предложенный нами (Борхсениус, Чернов, 1988; Чернов, Борхсениус, 1987) показатель аналогичен коэффициенту дивергенции, предложенному ранее Б.М.Медниковым и сотрудниками (1977). Отличие состоит в том, что мы придаем "наибольшее значение" разнице в профилях кривых гомологичной и гетерологичной реакций в окрестностях точки плавления (Т50) исследуемых ДНК. Это достигается введением множителя Rt, где Rt - значения температур от 62° до 92°С, ранжированные как 1, 2, 3.....10(Т5о),...,3, 2, 1.

Таким образом,

ПГ = Id2lgRT.

Определенная нами величина гетерогенности геномов A.laidlawii и некуль-тивируемых форм, выделенных из инфицированных растений через 15 суток развития инфекционного процесса, составляла 11 условных единиц. Смысл критерия гетерогенности состоит в том, что снижение температуры плавления гибридных молекул прямо пропорционально числу нуклеотидных различий. Таким образом, можно констатировать, что различия геномов клеток A.laidlawii и некультивируемых форм находятся в пределах 7-10%, что соответствует приблизительно 100-150 тыс.н.п. Изменение на столь значительном по размеру участке (или нескольких участках) сопровождает таким образом (и вероятнее всего обеспечивает) трансформацию клеток A.laidlawii в некультивируемые формы.

Рис. 11. Трансмиссивная электронная микроскопия флоэмных элементов листьев растений (Pisum sativum), инфицированных микоплазмами (Acholep-lasma laidlawii) (6 104х).

М - минимальные тела, КС - клеточная стенка.

Микоплазмы, попадая в условия более благоприятные для своего существования и, имея возможность включать в свой метаболизм уже синтезированные растительными клетками продукты, в силу малой информационной емкости своего генома, а также повышенной скорости мутационных процессов, вероятно, могут даже редуцировать фрагменты генома, которые в данной системе "паразит-хозяин" оказываются нецелесообразными. Структуры и функции участков ДНК, а также механизмы, определяющие их реорганизацию еще предстоит выяснить.

" ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Со времени открытия фитоплазм (микоплазм, вызывающих заболевания растений) прошло почти 40 лет, однако до сих пор механизмы патогенеза микоплазмозов у растений остаются невыясненными. Изучение роли фитоплазм в развитии того или иного заболевания сводится к описанию морфологических признаков и установлению видо/штаммо принадлежности патогена (Lee, Davis, 1992).

К настоящему времени известно более 100 видов микоплазм, при этом значительная часть представителей этого класса "скрыта" в группе некуль-тивируемых на бесклеточных питательных средах микоплазм, - микоплаз-моподобных организмов (МПО). Именно с МПО связывают развитие более 300 различных заболеваний у широкого спектра растений, тогда как роль других представителей класса Mullicutes - в частности, ахолеплазм (род Acholeplasma), остается неясной.

Исследования механизмов взаимодействия микоплазм с растениями сдерживаются уникальностью биологии микоплазм, обладающих феноменально высокой скоростью генетической изменчивости (что определяет естественные трудности экспериментальной работы с этими микроорганизмами), а также отсутствием до недавнего времени эффективных диагностических систем, позволяющих достоверно обнаруживать микоплазмы в любом биологическом материале.

- Создание эффективных диагностических зондов, позволяющих при использовании ДНК-гибридизации или полимеразной цепной реакции обнаружить микоплазмы в любом биологическом материале, а также разрабо-

тайная модельная система микоплазмы (A.lailawii) - растения гороха посевного (P.sativum) и многолетний опыт исследований молекулярной генетики микоплазм позволили нам ставить и решать задачи, связанные с выяснением морфофизиологических и молекулярных аспектов взаимодействия микоплазм и растений.

В результате проведенных нами исследований показано, что ахоле-плазмы могут быть возбудителями заболеваний растений: эти микроорганизмы способны проникать в ткани растений непосредственно через корневую систему и вызывать специфичные изменения морфогенеза, характерные для микоплазмозов, возникающих у растений в природных условиях спонтанно. Колонизация растительных тканей клетками A.laidlawii, как установлено нами, сопровождается изменением ряда физиологических параметров, связанных с биосинтезом полипептидов, системой вторичных мессенджеров и фосфорилированием белков растений. При этом оказалось, что микоплазменные инфекции вызывают специфичные изменения не только в ультраструктуре, но и в геноме клеток растений.

В литературе есть данные, свидетельствующие о том, что некоторые растения, инфицированные микоплазмами, могут не проявлять симптомов заболевания годами, даже если эти микроорганизмы в значительном (до 150 инфекционных частиц на клетку) количестве находятся в их тканях (Chen et al., 1989). В других случаях даже присутствие единичных клеток микоплазм в растении приводит к их быстрой гибели.

В процессе наших исследований было установлено, что развитие заболевания, а также характер его симптомов у растений P.sativum, инфицированных микоплазмами (A.laidlawii), зависит от конкретных растений, и, таким образом, их индивидуального генотипа. В этой связи особый интерес представляют факторы устойчивости растений к микоплазменным инфекциям, идентификация которых может определить пути решения проблемы контроля и подавления фитоплазмозов у сельскохозяйственных растений.

Известно, что реализация механизмов иммунного ответа растений связана с индукцией ряда ферментов, способствующих разрушению клеточной стенки патогенов. Микоплазмы в отличие от прочих патогенов не имеют клеточной стенки, но, как установлено в наших экспериментах, в ответ на инфицирование этими микроорганизмами растения тем не менее "выбрасывают" весь арсенал защитных средств. Это может быть объяснено

эволюционно-закрепленным блоком генов, участвующих в механизме резиденции растений к патогенной инвазии, а также тем, что микоплазменные инфекции, как известно, могут "открывать ворота" для других патогенов, обладающих клеточной стенкой. Так или иначе, очевидно, что микоплазмы, также как и вирусы, бактерии, грибы (Билай и др., 1988), способны активировать общие механизмы устойчивости растений. Ответные реакции растений на микоплазменные инфекции, как следует из наших экспериментов, связаны с включением классических сигнальных механизмов подавления патогенов.

Одним из основных механизмов неспецифической защиты растений от патогенов является окислительный взрыв (Тарчевский, 1994). Однако как было установлено в нашей работе, этот неспецифический способ защиты растений оказывается неэффективным в случае микоплазменных инфекций. Растения не уничтожают микоплазм; эти патогены трансформируются в минимальные тела и персистируюг в клетках растений на протяжении всего срока эксперимента - 20 суток. В этой связи возникает предположение, что окислительный стресс может благоприятствовать микоплазмам. Нами установлено, что в процессе взаимодействия клеток ахолеплазм с растениями, трансформация этих микроорганизмов в некультивируемые формы сопровождается перестройками в их геноме. Не исключено, что реорганизация геномов взаимодействующих организмов играет ключевую роль в процессах адаптации в соответствующей системе "паразит-хозяин". Известно, что именно окислительный стресс в клетках эу- и прокариот активирует вирусы, бактериофаги, а также подвижные генетические элементы, что может обуславливать реорганизацию геномов и, таким образом генетическую изменчивость в системе "паразит-хозяин". Реактивная генетическая изменчивость может способствовать появлению в популяции трансформантов, - сублиний с фенотипической мимикрией и обеспечить персистенцию соответствующей генерации клеток паразита в организме хозяина. Однако микоплазмы, бу-дучитахителичными микроорганизмами, имеют очень высокий темп мутирования: приблизительно 10% клеток в каждой генерации популяции оказываются мутантными (и, таким образом, фенотипически отличными) (ОуЬу1§, Уое1кег, 1996). В этой связи персистенция в растительных клетках даже успешно мимикрировавших ("мини-клеток") микоплазм может обуславливать постоянный "всплеск" защитных реакций растения

(окислительный взрыв и синтез физиологически высокоактивных соединений), приводя к истощению и угнетению ферментативных систем и, соответственно, дисфункциям в организме хозяина. Представляется вероятным, что подобные процессы лежат в основе обнаруженных нами морфофизиологи-ческих изменений, в том числе нарушения генетического аппарата растений, инфицированных А.ЫЛамИ(уис.\2). В этой связи особый интерес представляют системы антиоксидантной защиты микоплазм, которые до сих пор в клетках этих микроорганизмов не удалось обнаружить. По-видимому, ми-коплазмы используют нетрадиционные способы антиоксидантной защиты, обнаруженные у некоторых бактерий, способных к длительной персистен-ции у высших эукариот (Островский, 1997). Расшифровка механизмов антиоксидантной защиты микоплазм может определить принципиально новые пути решения контроля и подавления микоплазменных инфекций.

В самое последнее время в литературе появились данные о тесном генетическом родстве некоторых представителей МПО с единственным родом класса МоШшеь - Ас1ю1ер1сшпа (КатЬа е1 а1., 1994). Исходя из данных, полученных в наших исследованиях, можно предположить, что по крайней мере некоторые МПО являются результатом трансформации штаммов ахоле-плазм в процессе их сложных взаимодействий с клетками различных видов насекомых и растений.

Не исключено, что процессы реорганизации геномов в клетках растений, инфицированных микоплазмами, постоянно имеют место в природе. При этом экстремальные ситуации могут значительно активировать эти события (Чернов, Чернова, 1996). Целесообразность подобных процессов может быть связана с возможностью образования новых генетических систем, в том числе резистентных по отношению к индуцирующим их факторам, развитием более жизнестойких биосистем. В этой связи нестабильность геномов в системе "паразит-хозяин" может быть средством достижения стабильности биосистемы в целом.

Триггерные механизмы феномена трансформации микоплазм, по-видимому, зависят от генотипа растений и определяются эволюционной целесообразностью адаптивных реакций в соответствующей системе "паразит-хозяин". Микоплазмы, попадая в условия более благоприятные для своего существования, и имея возможность включать в свой метаболизм уже синтезированные растительными клетками продукты, в силу малой информаци-

Комментарии к рис.12

Гидролиз фосфолнпидов мембраны фосфолипазами является одним из первых этапов в формировании биологически активных, медиаторов, в том числе активных метаболитов кислорода при биогенном стрессе. В активации оксидазных комплексов могут участвовать 3 фосфолипазы: фосфолипаза Лг, фосфолипаза С и фосфолипаза D. Фосфатиди-линозитол-специфичная (Са2+-зависимая) фосфолипаза С гидролизует фосфатидилинози-тол-4,5-дифоофат с образованием диацил-глицерола и инозитол-4,5-трифосфата (Meldrum et al., 1991). Последний инициирует выброс кальция из внутриклеточных депо (Clapham, 1995). Диадил-глицерол и кальций индуцируют перемещение к мембране протеинкиназы С (Thelen, Wirthmueller, 1994).

Фосфолипаза Аг, имеющая Са2*-зависимый сайт связывания фосфолипидов (Krause et al., 1991; Wijkander, Sundler, 1992), в присутствии Ca1* также перемещается к мембране и гидролизует фосфолипиды с образованием яинолената, который способен активировать оксидазный комплекс непосредственно или опосредованно, - через протеинкиназу С.

Фосфолипаза D катализирует образование фосфатидной кислоты, которая, как полагают (Bellavite et al., 1988; Agwu et al., 1991; Bauldry et al., 1992; Mitsujama et al., 1993), является важным мессенджером в активации оксидазных комплексов. Фосфатидная кислота расщепляется до диацил-глицерола, активирующего протеинкиназу С (Huang, Cabot, . 1990; Perry et al., 1992).

Большинство процессов, обуславливающих окислительный взрыв в клетке, являются Са2+-зависимыми, хотя не исключено, что существуют два пути активации оксидазных комплексов • Са2*-зависимый и Сан-независимый (Baggiolini, Wymann, 1990).

Микоплазмы, обладающие фосфолипазами Аг, С и D, способны акгавно вмешиваться в метаболизм фосфолипидов клеток хозяина и, таким образом, в свою очередь, активировать каскад реакций, обуславливающих окислительный взрыв. Перманентное протекание подобных процессов, индуцируемых персистенцией паразита, обуславливает развитие хронического окислительного стресса и истощение защитных систем (в том числе антиоксидантных), что может приводить к повреждениям ДНК, активации экстрахромосомных компонентов и реорганизации геномов в системе "паразит-хозяин".

PK -растительная клетка

М -микоплазмы

ФЛМ -фосфолипиды мембран

ФЛ0 -фосфолипаза D

ФЛА2 -фосфолИпаза Аг

ФЛС -фосфолипаза С

ФК -фосфатидная кислота

Л -липоленат

ДАГ -диацилглицерол

ИФ-3 -инозитол-1,4,5-трифос-

ПКС -протеинкиназа С OK -оксидазный комплекс АМК -активные метаболиты

фат

кислорода АОЗр/м -системы антиоксидант-ной защиты растений/ микоплазм РГ -реорганизация геномов

линии соответствуют активации или образованию соединений

Рис. 12. Схема возможного каскада реакций, обуславливающих развитие хронического окислительного стресса в растительных клетках, инфицированных ми-коплазмами, и реорганизацию геномов в системе "паразит-хозяин".

онной емкости своего генома и повышенной скорости мутационных процессов могут "выбрасывать" ту часть генома, которая в данной системе "паразит-хозяин" оказывается нецелесообразной. Однако представляется вероятным, что реорганизация геномов у микоплазм в очень короткие временные промежутки (5-6 суток, как это было обнаружено в наших экспериментах), в большей мере связана с процессами, имеющими жизненно важное значение для паразитов (подобными ускользанию от иммунного надзора хозяина с помощью реактивной генетически опосредованной антигенной вариабельности, установленной у этих микроорганизмов при их вертикальном переносе у человека (Чернова, 1997)).

В этой связи система микоплазма-клетка растений может быть блестящей моделью для выявления специфичных белков растений, ответственных за узнавание внутриклеточного патогена. Изучение этой системы может определить новые возможности идентификации механизмов иммунной защиты растений.

ВЫВОДЫ

1. Ахолеплазмы (АсШеркыта 1шй1и\т) могут быть возбудителями заболеваний растений. Эти микроорганизмы способны проникать в ткани растений непосредственно через неповрежденную корневую систему и вызывать специфичные изменения морфогенеза, характерные для микоплаз-мозов, возникающих у растений в природных условиях при инфицировании их микоплазмами посредством насекомых-переносчиков.

2. Колонизация растительных тканей клетками микоплазм (микроорганизмов, не имеющих клеточной стенки) сопровождается неспецифическим изменением ряда физиологических параметров, связанных с биосинтезом полипептидов, системой вторичных месенджеров и фосфорили-рованием белков растений, а также антиоксидантной защитой. Эти изме-

нения свидетельствуют о развитии "адаптивных" процессов в системе "паразит-хозяин", характерных и для патогенов, имеющих клеточную стенку.

3. Микоплазменные инфекции вызывают специфичные изменения в ультраструктуре, а также в геноме растений. В клетках всех исследованных тканей растений, инфицированных Achuleplasma laidlawii, были обнаружены специфичные хромосомные аберрации (мосты, фрагменты и отставания), возникновение которых может быть обусловлено изменением метаболизма в системе "паразит-хозяин", а также непосредственным взаимодействием микоплазм и растений на уровне геномов.

4. При взаимодействии Achuleplasma laidlawii с клетками растений (Pisum sativum) происходит реорганизация генома микоплазм. Процесс генетической реорганизации микоплазм сопровождается трансформацией этих микроорганизмов в некультивируемые формы. Предполагается, что белки, регулирующие генетическую трансформацию микоплазм, являются существенным фактором персистенции микоплазм у растений.

5. В геноме Acholeplasma laidlawii идентифицированы повторяющиеся фрагменты, содержащие 14-мерные последовательности, гомологичные сайтам узнавания эукариотической Tono I. Эти последовательности могут участвовать в процессе реорганизации геномов микоплазм при взаимодействии их с клетками растений по типу "выщепления-встраивания".

6. Ответные реакции растений на микоплазменные инфекции связаны с включением классических сигнальных механизмов подавления патогенов. Предполагается, что реорганизация геномов взаимодействующих организмов может играть ключевую роль в неспецифичных процессах адаптации в системе "паразит-хозяин".

7. На основе полученных данных предложена гипотетическая модель происхождения микоплазмоподобных организмов. Предполагается, что процесс реорганизации геномов микоплазм, инфицирующих растения, происходит в природе постоянно и способствует образованию новых форм

МПО, при этом нестабильность геномов в системе "паразит- хозяин" может быть средством достижения стабильности биосистемы в целом.

8. На основе рекомбинантных молекул, содержащих фрагменты генома Acholeplasnui luidlawii и олигонуклеотидных последовательностей этих микроорганизмов разработаны высокочувствительные пробы для обнаружения микоплазменных инфекций в растениях с помощью ДНК-гибридизации и полимеразной цепной реакции.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Борхсениус С.Н., Меркулова H.A., Шаги-Мухаметова Ф.Ф., Чернова O.A., Чернов В.М., Скамров A.B., Крылова С.Ю. Комплект плазмид для обнаружения и идентификации микоплазменных инфекций в клеточных культурах // Сб. трудов Всесоюзной конференции "Генная и клеточная инженерии для решения биотехнологических проблем", Тарту. 1989. С. 3-9.

2. Чернов В.М., Борхсениус С.Н. Определение филогенетических отношений между видами тихоокеанских лососей рода Oncorhynchus методом молекулярной гибридизации ДНК//Биология моря. 1989. N 2. С. 23-29.

3. Borhsenius S.N., Merkulova N.A., Chemova O.A., Chernov V.M. Detection and identification of mycoplasma infections by DNA- hybridization with complect of DNA probes // In: Recent Advances in Mycoplasmology, Gustav Fisher Verlag: Stuttgart, New York, 1990. P. 411-413.

4. Chernov V.M., Chernova O.A., Kijamova R.G., Ivanova A.B., Borchsenius S.N. Mycoplasma infection of plant cell culture II In: Recent Advances in Mycoplasmology, Gustav Fisher Verlag: Stuttgart, New York, 1990. P. 937-938.

5. Chemova O.A., Hassanova M.A., Chernov V.M. DNA-probes for detection of mycoplasmas in plants // Proceedings of the 8th Intern. Congress of the IOM, Istanbul, Turky. 1990. IOM Lett. V. 1. P. 560.

6. Chernov V.M., Ivanova A.B., Hassanova M.A., Gogolev Y.V., Chernova O.A. In vitro efficiency of compound A against mycoplasmas // Proceedings of the 8th Intern. Congress of the IOM, Istanbul, Turky. 1990. IOM Lett. V. 1. P. 411.

7. Черной B.M., Хасанова M.A., Гоголев Ю.В., Чернова O.A. Киты для обнаружения и подавления микоплазменных инфекций // В кн.: Карликовость люцерны и меры борьбы с заболеванием, Саратов, 1990. С. 8-10.

8. Чернова O.A., Черно» В.М. Экстрахромосомные компоненты микоплазм - новый класс векторных систем в генетической инженерии // Тезисы 9-ой Всесоюзной конференции "Нуклеазы", Казань, 1991. С. 11.

9. Yankova A.A,, Ivanov P.I., Chemova O.A., Chernov V.M. Mycoplasma-like organisms isolated from soil // Proceedings of the 9th Congress of the IOM, Iowa, USA. 1992. IOM Lett. V. 2. P. 144.

10. Chernov V.M., Markina O.S., Chemova O.A. Repeated DNA sequences shared by mycoplasmas II Proceedings of the 9th Congress of the IOM, Iowa, USA, 1992. IOM Lett. V. 2. P. 256.

11. Ванькова А.Б., Иванов П.И., Чернова O.A., Чернов В.М. Сапрофитные мико-, плазмы почв // Тезисы 4-ой конференции "Микроорганизмы в сельском хозяйстве", Пущино. 1992. С. 26.

12. Иванов П.И., Хайдарова Г.А., Баранова Е.Н., Чернова О.А., Чернов В.М. Проникновение микоплазм в растения через корневую систему // Тезисы 4-ой конференции "Микроорганизмы в сельском хозяйстве", Пущино. 1992. С. 69.

13. Чернова О.А., Хасанова М.А., Чернов В.М. Рекомбинантная плазмидная ДНК рА17, используемая в качестве ДНК зонда для обнаружения Acholeplasma laidlawii 118 в клетках растений // А.С. 1835851.1992.

14. Чернов В.М., Хасанова М.А., Ситникова С.Н., Чернова О.А. Рекомбинантная плазмидная ДНК pAlS6, используемая в качестве ДНК зонда для обнаружения Acholeplasma laidlawii 185 в клетках растений // А.С. 1835852. 1992.

15. Лезина JI.E., Бабужина Д.И., Андрианова Ю.Е., Чернов В.М. Влияние инфицирования микоплазмами на рост и АТФазную активность проростков гороха при стрессе П Тезисы 3-го съезда Всероссийского общества физиологов растений. Санкт-Петербург, 1993. С. 652.

16. Ivanov P.I., Haydarova G.A., Baranova K.N., Chernov V.M., Chernova O.A. Mycoplasmas appear to penetrate into plants through roots // Proceedings of the 6th Int. Symp. Microbiol. Ecol., Barcelona, Spania, 1993. P. 170.

17. Andrianova Y.E., Maksutova N.N., Tarchevsky I.A., Chernov V.M., Chernova O.A. The mycoplasma influence on plant metabolism // Proceedings of the XV Intern. Botanical Congress, Tokyo, Japan, 1993. P. 353.

18. Chernova O.A., Skvortsov V.V., Danilevsky A.N., Chernov V.M. Exogenic regulators of mycoplasmas // Proceedings of the 10th Intern. Congress of IOM, Bordeuaux, France, 1994. IOM Lett. V. 3. P. 205.

19. Chernov V.M., Chernova O.A., Gogolev Y.V., Markina O.S. Repeated tetradecamer nucleotide sequences as elementary structures of genetic regulation in Mollicutes // Proceedings of the 10th Intern. Congress of IOM, Bordeuaux, France, 1994. IOM Lett. V. 3.P. 402.

20. Chernov V.M., Chernova O.A. The phenomenon of mycoplasma infections and anthropogenic overloads//Biomedical Lett., 1995. V. 50. P. 275-277.

21. Чернова O.A., Чернов В.М, Повторяющиеся тетрадекамерные последователь-0 но'сти нуклеотидов в геномах микоплазм //ДАН, 1995. Т. 344. N 2. С. 278-281.

22. Maksyutova N.N., Yakovleva V.G., Tarchevsky I.A., Chernov V.M., Chernova O.A. Synthesis of new polypeptide induced by pathogen and some organic acids II Karadeniz J. of Medical Sciences, 1995. V. 8. N 4. P. 189.

23. Chernov V.M., Chernova O.A. Methods for diagnostics and suppression of mycoplasmas II Karadeniz J. of Medical Sciences, 1995. V. 8. N 4. P. 235.

24. Chernova O.A., Chernov V.M. Mycoplasmas as a factor of genetic mutability for cells II Karadeniz J. of Medical Sciences, 1995. V. 8. N 4. P. 235.

25. Чернов B.M., Чернова O.A. Последовательности, гомологичные сайтам узнавания эукариотической топоизомеразы I в геномах микоплазм // Молекулярная биология, 1996. Т. 30. N 2. С. 286-292.

26. Чернов В.М., Чернова О.А. Микоплазменные инфекции как возможный фактор генетических изменений в клетках высших эукариот // Цитология, 1996. Т, 38. N2. С. 107-114.

27. Чернов В.М., Гоголев Ю.В., Попова Н.В., Чернова О.А. Инфицирование гороха посевного Pisum sativum клетками Acholeplasma laidlawii приводит к изменениям морфологических и физиологических признаков растений // ДАН. 1995. Т. 348. N3. С. 428-430.

28. Чернов В.М., Чернова О.А., Тарчевский И.А. Феноменология микоплазменных инфекций растений // Физиология растений, 1996. Т. 43. N 5. С. 694-701.

29. Chernov V.M., Markina O.S., Chernova О.А. Topoisomerase I recognition like sites in mycoplasma genomes II Microbios, 1996. V. 86. P. 19-22.

30. Тарчевский И.А., Максютова H.H., Яковлева В.Г., Чернов В.М. Микоплазма-индуцированные и жасмонат-индуцированиые белки растений гороха // ДАН. 1996. Т. 350. N 4. С. 544-545.

31. Чернов В.М., Чернова О.А., Гоголев Ю.В., Попова Н.В. Адаптивные реакции в системе "паразит-хозяин" и их связь с реорганизацией геномов // Тезисы 2-ой Республиканской конференции "Актуальные экологические проблемы Республики Татарстан", Казань, 1996. С. 89-90.

32. Каримова Ф.Г., Чернов В.М., Максютова Н.Н., Яковлева В.Г., Мурсалнмова Н.Х., Мухаметчин А.Т. Фосфорилирование и синтез белков гороха при его инфицировании микоплазмами Acholeplasma laidlawii II Тезисы 2-ой Республиканской конференции "Актуальные, экологические проблемы Республики Татарстан", Казань, 1996. С. 72.

33. Leshchinskaya I.B., Chernov V.M., íCuprianova-Ashina F.G., Hassanova M.A., Chernova O.A. Mycoplasma membrane as a target for RNase of Bacillus intermedius II Proceedings of the 8th Intern. Congress of Bacteriology and Applied Microbiology Division. Jerusalem, Israel, 1996. P. 78.

34. Tarchevsky I.A., Maksyutova N.N., Yakovleva V.G., Gogolev Y.V., Chernov V.M., Chernova O.A. Mycoplasma-plant system: pathogen induced proteins and genome rearrangements // Proceedings of the 8th Intern. Congress of Bacteriology and Applied Microbiology Division. Jerusalem, Israel, 1996. P. 80.

35. Chemova O.A., Chernov V.M. Repeated nucleotide sequences and rearrangements in genomes of mycoplasmas // Proceedings of the 11th Congress of IOM, Florida, USA, 1996. IOM Lett. V. 4. P. 67.

36. Tarchevsky I.A., Maksyutova N.N., Yakovleva V.G., Gogolev Y.V., Chernov V.M., Chemova O.A. Mycoplasma induced proteins and genome rearrangements in plants // Proceedings of the 11th Congress of IOM, Florida, USA, 1996. IOM Lett. V. 4. P. 69.

37. Tarchevsky I.A., Maksyutova N.N., Yakovleva V.G., Chernov V.M., Chernova O.A. Mycoplasma infections and biogenic stress in plants II Proceedings of the 5th Conference of Fitoplasmas, China, 1996. P. 18.

38. Chernov V.M., Chernova O.A., Gogolev Y.V., Popova N.V. Molecular-genetic peculiarities of mycoplasma-plant infections II Proceedings of the 5th Conference of Fitoplasmas, China, 1996. P. 41.

39. Chernov V.M., Tarchevsky I.A., Karimova F.G., Lazoreva L.V., Mursalimova N.U., Belogub A.V. The effect of infection of pea seedlings by Acholeplasma laidlawii on some aspects of metabolism in host cells // Proceedings of the Simposium Physical-chemical basis of plant physiology, Penza, Russia, 1996. P. 19.

40. Tarchevsky I.A., Maksyutova N.N., Yakovleva V.G., Chernov V.M. The influence of mycoplasma infecting and the action of exogenous salicylic and jasmonic acids on set and protein synthesis of pea plants // Proceedings of the 10th FESPP Congress "From Molecular Mechanisms to the Plant: an Integrated Approach", Firenxe, Italy, 1996. P. 289.

41. Максютова H.H., Яковлева В.Г., Чернов B.M., Тарчевский И.А. Образование микоплазмаиндуцированных белков в растениях II Тез. 2 съезда биохимического общества РАН. Москва. 1997. Ч. 1. С. 275.

42. Белогуб A.B., Мурсалимова Н.У., Бунтукова Е.К., Чернов В.М. Инфицирование клеток Dunaliella maritima микоплазмами Acholeplasma laidlawii II Тезисы 2 съезда биохимического общества РАН. Москва. 1997, Ч. 1. С. 172.

43. Максютова H.H., Яковлева В.Г., Тарчевский И.А., Чернов В.М. Образование индуцированных белков в растениях гороха при действии микоплазм и органических кислот // Тезисы 3 Симпозиума "Физико- химические основы физиологии растений и биотехнологии". Москва. 1997. С. 11.

44. Chernov V.M., Gogolev Y.V., Popova N.V., Chernova O.A. Mycoplasma-induced genome rearrangements in plants // Biol. Bull. Poznan. 1997.34 (Suppl.). P. 97-98.

45. Chernova O.A., Gogolev Y.V., Chernov V.M. Genetic rearrangements and chronicity of mycoplasma infections in plants // Biol. Bull. Poznan. 1997. 34 (Suppl.). P. 98.

46. Tarchevsky I.A., Grechkin A.N., Karimova F.G., Maksyutova N.N., Chernov V.M., Chemova O.A., Yakovleva V.G. On the molecular mechanisms of interaction between plants and mycoplasmas // Biol. Bull. Poznan. 1997.34 (Suppl.). P.

Информация о работе

Чернов, Владислав Моисеевич
доктора биологических наук
Москва, 1998
ВАК 06.01.11

Автореферат

Похожие работы