Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфофизиологические и генетические особенности взаимодействия ACHOLEPLASMA LAIDLAWII с растениями PISUM SATIVUM

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Морфофизиологические и генетические особенности взаимодействия ACHOLEPLASMA LAIDLAWII с растениями PISUM SATIVUM"

АКАДЕМИЯ НАУК РОССИИ КАЗАНСКИЙ ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ КНЦ РАН

ест" сг:

На правах рукописи

УДК 581.1/4.071:579.252:579.88

ГОГОЛЕВ Юрий Викторович

МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ И ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ACHOLEPLASMA LAIDLAWII С РАСТЕНИЯМИ

PISUM SATIVUM

03.00.12 — физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

КАЗАНЬ - 1997

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики Казанского института биологии КНЦ РАН.

— кандидат биологических наук В.М. Чернов

— доктор биологических наук, профессор Ф.Г. Каримова

— кандидат биологических наук, доцент C.B. Малков

— Казанская сельскохозяйственная академия

Защита состоится " " октября 1997 г. в "_"часов на заседании

специализированного Совета К.002.16.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук (специальность —физиология растений) при Казанском институте биологии КНЦ РАН по адресу: 420503, г. Казань, а/я 30.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке КИБ КНЦ РАН. Автореферат разослан сентября 1997 г.

Научный руководитель

Официальные оппоненты

Ведущее учреждение:

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

Н.Л. Лосева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Микоплазмы являются возбудителями юлее 600 заболеваний растений, широко распространеных в регионах интен-:ивного растениеводства, в том числе в основных районах хлебопашества и >вощеводства. Потери урожая зерна при микоплазмозах иногда составляют ¡0-90%, а овощей - 20-35% (Скрипаль, 1988).

К фитопатогенным микоплазмам относят представителей рода Spiroplasma группу не культивируемых In vitro микоплазмоподобных организмов (МПО), л которых установлено тесное генетическое родство с микоплазмами рода :holeplasma. Патогенность видов рода Acholeplasma и их распространенность 1еди высших растений является темой дискуссий. Не выясненными остаются и злекулярные механизмы взаимодействия микоплазм с клетками растений, ринято считать, что причиной морфологических и физиологических изменений стений при микоплазмозах является закупорка сосудов растений клетками жолаплазм, препятствующая нормальному транспорту веществ по проводящей стеме. Вместе с тем, общая картина патогенеза говорит о глубоких нарушони-регуляции развития растения.

Для сельскохозяйственной практики, важным является вопрос о спосо-ах передачи патогенного микроорганизма растению-хозяину. Предлагаемые ероприятия по борьбе с микоплазмозами основаны на представлении, что за-ажение растений микоплазмами обязательно требует участия насекомого-греносчика, либо паразитического растения (Скрипаль, 1988). В тоже время, эль других способов распространения микоплазм остается невыясненной.

Микоплазмы обладают чрезвычайной скоростью изменчивости, что по-юляет им осваивать новые экологические ниши и приспосабливаться к лю-з1м изменениям окружающей среды, в том числе антропогенного характера, медицинской и хозяйственной практике, это выглядит как экспансия мико-;азм с высокой резистентностью к мерам борьбы с ними. Основой изменчи->сти микоплазм являются уникальные особенности их генома.

Как правило, развитие микоплазмозов, обусловлено нарушением сим-ютического равновесия экосистем. Однако специфические механизмы взаи-эдейсгвия растений с микоплазмами при симбиотических и паразитических ■ношениях еще предстоит выяснить. Таким образом, решение проблемы по-вления микоплазменных инфекций, вероятно, лежит на пути изучения мо-кулярных механизмов взаимодействия в системе паразит-хозяин и экзоген->й регуляции микоплазм с позиции эволюционно закрепленной целесообраз->сти антагонистических отношений в природе.

Цель и задачи исследования. Целью данной' работы является выяснешы роли микоплазмы Acholehlasma laidlawii в развитии патогенеза растений (н< примере гороха посевного Pisum sativum). Поставленная цель достигалась ре шением следующих задач:

1. Разработать методы инфицирования растений P. sativum для созданиз системы "паразит-хозяин";

2. Определить морфологические проявления заболевания у эксперимен тально инфицированных растений;

3. Определить уровень активности пероксидазы у инфицированных рас тений;

4. Провести кариологический анализ хромосом инфицированных расте ний.

Научная новизна работы. Разработана модельная система P. sativum-A. laidlawii, позволяющая изучать адаптивные процессы при взаимодействш организмов. Впервые показано, что клетки A. laidlawii способны проникать i растения через неповрежденную корневую систему. Впервые показано, чтс инфицирование растений A. laidlawii через корневую систему приводит к раз витию морфологических отклонений, характерных для микоплазмозов, возни кающих в природных условиях спонтанно. Впервые обнаружено, что при ми коплазменных инфекциях, в клетках растений возникают хромосомные абер рации, которые выражаются в нарушении расхождения хромосом в анафазе Установлено, что развитие микоплазменной инфекции сопровождается окислительным стрессом растений, который может служить причиной морфофи зиологических и генетических аномалий. Показано, что в процессе взаимодействия A. laidlawii с клетками растений, микоплазмы трансформируются в не-культивируемые формы, изменяясь при этом морфологически, и генетически.

Теоретическое значение работы. Результаты исследований позволяю! расширить представление об участии в фитопатогенезе представителей рода Acholeplasma и о возможных способах распространения фитопатогенных ми-коплазм. Полученные данные об окислительном стрессе инфицированных растений и индукции генетических аномалий в клетках растений и микоплазм являются вкладом в развитие картины биогенного стресса, как адаптивного механизма в системе паразит—хозяин и дестабилизирующем влиянии антропогенных факторов на компоненты системы. Появление некультивируемыз форм A. laidlawii, при взаимодействии с клетками растений, свидетельствует с возможности трансформации клеток видов рода Acholeplasma в МПО, и за-

ставляет более критически относиться к признаку некультивируемости, широко используемому в современной таксономии Molücutes.

Апробапия работы. Материалы диссертации были доложены на: конференции "Карликовость люцерны и меры борьбы с заболеванием" (Саратов, 1990), конференции "Актуальные экологические проблемы Республики Татарстан" (Казань, 1995), 8-м, 10-м и 11-м конгрессах Международного общества микоплазмологов (Стамбул, 1990; Бордо, 1994; Орландо, 1996), конференции "Фитоплазмы" (Пекин, 1996), Международном конгрессе по бактериологии и прикладной микробиологии (Иерусалим, 1996).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы, список литературы. Работа изложена на 121 странице машино-тисного текста, содержит 16 рисунков, 5 таблиц, список литературы включает Ю6 наименований, из них 50 в отечественных изданиях.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследований являлись Acholehlasma laidlawii и горох посев-гай (Pisum sativum). Шт. 118 А. laidlavrii выделен из растений пшеницы, пора-кенных карликовостью, и любезно предоставлен профессором И.Г. Скрипа-LeM (Институт микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотного HAH Ук->аины, г. Киев). Семена гороха (сорт Казанский-38) предоставлены НПО Семеновод" (г. Казань).

Клетки А. laidlawii выращивали на жидкой и агаризованной среде Эд-арда (Борхсениус, Чернова, 1989). Для высева микоплазм из инфицированных астений использовали предложенную И.Г. Скрипалем (1988) методику иноку-яции экстрактом проводящих тканей, с последующим проведением 3—5 слепых" пассажей на свежей среде Эдварда.

Растения выращивали в стерильных условиях, после обработки семян 3 > гипохлоридом Na и 70% этанолом. Стерильность контролировали посевами а среду Эдварда, из которой был исключен пенициллин.

Инфицирование растений осуществляли методом субэпидермальной нъекции Клемента (Скрипаль, 1988) и кратковременной экспозицией кореш-ов в разбавленной суспензии клеток А. laidlawii.

Кариологический анализ проводили на фотоснимках давленных препа-атов корешков, фиксированных в уксусном алкоголе и окрашенных ацетоор-5ИНОМ (Турков и др., 1988).

Активность пероксидазы измеряли спектрофотометрическим методом, по изменению оптической плотности продуктов окисления гваякола (Grison, Pelet, 1985). Для разделения трех форм пероксидазы (цитоплазматической, ионно-связанной и ковалентно-связанной с клеточной стенкой) экстракты растительных клеток подвергали дифференциальному центрифугированию в фосфатном буфере с различным содержанием KCl (Иевиньш-1988).

Выделение и очистку АНК из клеток растений проводили с использованием цетавлона (Гловер и др., 1988). Фракции гомогената проводящих тканей, обогащенной клетками микоплазм, получали методом дифференциального центрифугирования. Для разрушения клеток растений применяли жидкий азот

Все манипуляции с препаратами АНК (гидролиз рестриктазами, электрофорез в агарозном геле, фиксацию на нитроцеллюлозные фильтры, введение радиоактивной метки и ДНК-ДНК гибридизацию) проводили по общепринятым методикам (Маниатис и др., 1984).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка модельной системы паразит—хозяин

Для инфицирования растений были применены метод субэпидермальной инъекции под давлением и заражение через неповрежденную корневую систему при.контакте клеток растений и микоплазм, Чтобы исключить влияние посторонней микрофлоры, эксперименты проводили в стерильных условиях.

Возможность заражения растений микоплазмами через неповрежденную корневую систему до сих пор отрицалась и этот метод применен нами впервые. При подборе условий заражения было установлено, что экспозиция 2-2 дневных корешков гороха в течение 60 минут в суспензии А. laidlawii в физиологическом растворе, пятикратного объема от первоначального объема культуры, не влияет существенно на жизнеспособность и интенсивность деления клеток растения.

Присутствие микоплазм в тканях инфицированных растений определялось методом ДНК-гибридизации со специфичным ДНК-зондом рА17, и с помощью трансмиссивной электронной микроскопии ультратонких срезов. Положительный сигнал на радиоавтографе свидетельствовал о наличии ДНК А. laidlawii в образцах растительного материала, что является доказательством колонизации микоплазмами клеток растений. Методом электронной микроскопии в проводящих тканях стебля и листьев растений Р. sativum, инфициров-ванных А. laidlawii 118, были выявлены типичные по морфологии и ультраструктуре клетки ахолеплазм. Эти клетки имеют округлую или сферическую

форму (350 — 500 нм в диаметре), выраженную ультраструктуру и располагаются преимущественно вдоль цитоплазматических мембран, главным образом, около плазмалеммы (рис. 1а). В то же время, в клетках растений наблюдались клетки микоплазм диаметром до 100 нм, с электронноплотной мембраной и гомогенной цитоплазмой (рис. 16). Часто они находились в фазе коккоидных структур, распадающихся на ряд сферических клеток. Соотношение клеток микоплазм обычной морфологии и клеток меньшего диаметра увеличивалось в сторону последних с развитием инфекции и достигало отношения 1:15 через две недели после инфицирования.

С общепринятой точки зрения, микоплазмы распространяются среди растений с помощью насекомых-переносчиков или паразитических растений. Заражение насекомых, в свою очередь, происходит при кормлении их на инфицированных растениях (Скрипаль, 1988; Lee, Davis, 1992). В последнее время, это представление подвергается сомнению. Показано, что насекомые могут заражаться микоплазмами трансовариально и затем инфицировать здоровые растения (Danielli et al., 1996). Показанная в наших работах способность А. laidlawii проникать в растения через неповрежденную корневую систему так же может расширить наши представления о возможных способах ее распространения в природе. Поскольку, жизнеспособные клетки этого микроорганизма обнаруживаются в почве в естественных условиях (Ivanov et al., 1992), не исключена вероятность заражения ими растений непосредственно через корни, без участия насекомых-переносчиков. При этом может происходить освоение новых экологических ниш и расширение круга растений-хозяев.

Морфологические изменения проростков гороха, инфицированных А.

laidlawii

Колонизация микоплазмами тканей растений сопровождалась появлением у многих из них значительных морфологических изменений. Эти растения отставали в росте от контрольных неинфицированных растений в первое время после заражения. На четвертые—шестые сутки уменьшение средней длины проростков составляло 10% и более. На десятые сутки нормальное развитие растений восстанавливалось и разница в росте между контрольными и опытными (инфицированными) проростками становилась незначительной. Результаты измерения длинны побегов в разные сроки развития инфекции представлены на диаграммах рис. 2.У некоторых растений наблюдались нарушения морфогенеза и другие симптомы микоплазмозов. Эта группа составляла в разных опытах от 10 до 25 % от общего количества растений. Ее доля взрастала с

Рис. 1. Клетки микоплазм обычной морфологии (а) и минимальные тела (б) во флоэме листа гороха посевного (P. sativum), инфицированного А. laidlawii 118. Трансмиссивная электронная микроскопия (5 104Х и 1 105Х соответственно). Снимок выполнен в лаборатории молекулярной генетики КИБ КНЦ РАН, к. б. н. Н.В. Поповой.

I

II

60 50 40 30 20 10

50 40 30 20 10

50 40 30 20 10

A

60 50 40 30 20 10

■ ■111 il

Л

EL

38 40 42 44 46 48 50 52 54 36 38 40 42 44 46 48 50 52

50

40

30

20

10

-ill

1

Ш

id

I

lilt

Д

ДД.

52 56 60 64 68 72 76 80 84 88 52 56 60 64 68 72 76 80 84 88

50

■JU-IJÍ JL

m a

90 100 110 120 130 140 150 160 170 90 100 110 120 130 140 150 160 170

Рис. 2. Диаграммы распределения высоты побегов инфицированных (■) и контрольных (ЕЗ) растений P. sativum через А—4, Б —6, и В —10 суток после инфицирования A. laidlawii. 1, П, —номера опытов. По оси абсцисс отложена длина стебля в мм, по оси ординат— соответствующее количество растений в опыте.

увеличением титра КОЕ А. 1а1с11а\ш в инокуляте. Характерным симптомом заболевания являлось частичное или полное увядание верхней часта побега, некроз апикальной части и края листовой пластины верхних листьев. Кроме того, отмечалось мозаичное пожелтение листьев, засыхание края листовой пластины, либо изменения ее формы, такие как появление волнистого края, частичной рассеченности, мелколистность, округлая форма с вогнутой центральной частью. Встречались так же случаи израстания и желтушности.

Увядание верхушки чаще всего приводило к гибели растения. В случае выздоровления, появлялись один-два или несколько (до 12) дополнительные побегов,которые продолжали расти параллельно на протяжении длительного времени. Дополнительные побеги часто имели уродливые формы в результат« израстания либо наоборот, утолщения. В результате появлялись формы расте ний, которые мы условно назвали "кустистые" (рис. 3) и рассматриваем ка! начальную стадию развития "ведьменых метел", морфологических изменений характерных для микоплазмозов растений, широко распространенных в при родных условиях. Относительная доля этих аномалий была невелика и срав нима с частотой желтушности и деформации листьев. В таблице 1 представле ны результаты подсчета частоты встречаемости некроза (увядания) апекса I других аномалий в нескольких экспериментах с использованием культуры А 1а1с11а\уц с различным титром КОЕ.

Табл. 1. Нарушения морфогенеза проростков Р. ваЦушп инфицированных А. 1а1<31а\ш 118.

№ опыта титр КОЕ А. 1аУ1аууи Количество растений Кол-во растений с деформацией листовой пластины кол-во растаний с отмиранием верхушки побега

опыт контроль опыт контроль опыт контроль

1 3x10' 192 150 3 - 16 2

2 2x10" 121 102 3 - 18 4

3 4x107 104 80 1 - 7 -

4 8x10' 138 140 2 - 13 2

5 2x10" 75 73 3 - 14 2

Рис. 3. Развитие дополнительных побегов у P. sativum, инфицированного

A. laidlawii 118

Таким образом, заражение P. sativum культурой A. laidlawii в лабораторных условиях методом микроинъекции и через неповрежденную корневую систему вызывает патогенные реакции с определенной частотой. При этом у растений развиваются симптомы, характерные для микоплазмозов, возникающих в природных условиях спонтанно. В то же время, большая часть растений адаптируется к инфекции и развивается без морфологических изменений, хотя микоплазмы регистрируются в тканях всех инфицированных растений.

Электронномикроскопические исследования, в большинстве случаев, не выявили значительных патологических изменений тканей растений, заселенных микоплазмами. В то же время., принято считать, что именно усиленное образование дегенеративных клеток флоэмы, в результате заселения микоплазмами проводящей системы растений и выделения ими продуктов жизнедеятельности, является причиной карликовости, желтушности и увядания. Предполагается, при заполнении клеток растения клетками патогена происхо-\ит закупорка сосудов, нарушается отток пластических веществ, что и приводит к паталогическим изменениям растения в целом (Скрипаль, 1988).

Приведенная схема не объясняет все известные аспекты взаимодействия микоплазмам с растениями, например, приобретение последними определенных преимуществ (Mc-Goy, 1979). Часто при микоплазмозах образуются в из-

бытке придаточные почки и побеги, нарушается ■ доминирование верхушки, происходит трансформация тканей генеративных органов в вегетативные и нарушения цикла онтогенеза. Во всех этих случаях, микоплазмозы растений проявляются как системные заболевания с нарушениями процессов регуляции. I. Lee и R. Davis (1992) определяют их как глубокий гормональный дисбаланс, однако экспериментально это предположение до сих пор не подтверждено (Smart, Kirkpatrick, 1996).

Поскольку, наблюдаемые нами аномалии морфогенеза инфицированных проростков, в том числе нарушение апикального доминирования, не сопровождались деградацией проводящей системы, мы также склонны считать, что их появление вызвано изменениями эндогенной регуляции растений.

Механизмом подавления роста потенциальных побегов (апикального доминирования) является синтез ауксина в зоне точки роста побега. Считается, что именно определенное соотношение ауксина и цитокинина в разных ярусах подавляет активность потенциальных точек роста в пазушных почках (Smart, Kirkpatrick, 1996). При удалении активной точки роста, одна из потенциальных точек роста дает начало новому побегу. В наших экспериментах, у части инфицированных растений появление нескольких дополнительных побегов происходило в присутствии основного побега, который, после кратковременного увядания, продолжал нормально развиваться, не подавляя их, что наблюдается при "ведьминых метлах" бобовых. Выяснение причины нарушения апикального доминирования в системе P. sativum—A. laidlawii являлось задачей наших дальнейших экспериментов. Возможно, решения ее поможет понять механизм развития "ведьминых метел" и других микоплазмозов растений.

Хромосомные аберрации в клетках растений

В процессе жизнедеятельности, микоплазмы находятся в тесном контакте с клетками высших организмов. Для некоторых из них получены данные о внутриклеточной локализации, тогда как другие считаются "мембранными" паразитами (Slatlander et al., 1994). И в том и в другом случае, микоплазмы способны активно вмешиваться в метаболизм клеток хозяина, обмениваться с ними любыми макромолекулами, в том числе экстрахромосомными компонентами, и влиять на их генетический аппарат (Полянская, Ефремова, 1993, 1994; Чернова и др., 1996; Stewart et al., 1994). В экспериментах с каллусными культурами было показано, что инфицирование клеток Р. sativum микоплазмами (А. laidlawii 118) вызывает в растительных клетках хромосомные аберрации, частота которых зависит от множественности инфекции (Chernov, et al., 1990).

Разработанная нами модельная система дает возможность изучать влияние микоплазменной инфекции на кариотип клеток меристемы целых растений.

Анализ кариотипа клеток инфицированных и контрольных растений проводили анафазным методом учета аберраций. Результаты анализа показали увеличение частоты "мостов", фрагментов и отставаний хромосом в клетках инфицированных растений по сравнению с контрольными здоровыми растениями (таб. 2). Таким образом, микоплазмы способны влиять на генетический аппарат растительной клетки, индуцируя хромосомные аберрации.

Таблица 2. Встречаемость аномальных анафаз в клетках меристемы корешков проростков P. sativum, инфицированных A. Iaidlawii и контрольных, неифици-рованных.

№ кол-во нор- кол-во ана- кол-во кол-во от- % хромо-

опыта мальных фаз с абер- фрагментов, ставаний сомных

анафаз рациями мостов хромосом аберраций

1 опыт 259 16 10 6 5,8

контр 80 3 3 - 3,6

2 опыт 90 5 4 1 5,3

контр 110 4 3 1 3,5

3 опыт 304 17 9 8 5,3

контр 147 5 3 2 3,3

4 опыт 130 7 5 2 5,1

контр 243 8 4 4 3,2

Ранее было показано увеличение частоты хромосомных аберраций в культурах лейкоцитов человека, при заражении их различными видами мико-плазм (Chernov et al., 1994; Cunha and Takimoto, 1994; Stewart et al., 1994). Обсуждались возможные причины повреждения хромосом инфицированных клеток, которыми могут быть: высокая нуклеазная активность микоплазм, "вымывание" ими пула нуклеотидов и их предшественников в клетках хозяев, в результате конкуренции за субстрат, незаконная рекомбинация по сайтам гомологии ДНК, значительное увеличение концентрации перикисных анионов и перекиси водорода в инфицированных клетках (Борхсениус, Чернова, 1989; Fischer et al., 1992). Последнему фактору придается особое значение. Показано, что при микоплазменной инфекции в организме-хозяине развивается

комплекс реакций окислительного стресса (Kahane, 1986). В то же время, повышение активности супероксидов вызывает модификацию и повреждение биомолекул в клетке (Kordjum, 1992) и влияет на функциональную активность клеток (Гамалей, Клюбин, 1996).

Определение активности пероксидазы в клетках растений.

Перекись водорода (Н2О2) относится к ряду веществ, которые называют собирательным термином "активные метаболиты кислорода" (АМК). Интерес к изучению АМК объясняется широким спектром их физиологического действия (Гамалей, Клюбин, 1996).

Емкость восстановительного буфера клетки (совокупность восстанавливающих агентов и ферментов) находится в балансе с производством АМК (Allen, 1991). Таким образом, увеличение активности этих ферментов, в том числе пероксидазы, является признаком окислительного стресса организма.

В таблице 3 и на рисунке 4 представлены результаты опытов по определению уровня активности трех форм пероксидазы в клетках и тканях контрольных и инфицированных растений на 5, 6, и 7 сутки развития инфекции. Увеличение количества активных форм кислорода у инфицированных растений может свидетельствовать о состоянии окислительного стресса, достигающего максимальной критической точки на шестые сутки инфекции. В это же время наблюдается процесс восстановления нормального морфогенеза проростков, проявляющийся в увеличении скорости роста побегов и выздоровлении части увядающих растений. По-видимому, к седьмым суткам после инфицирования Р. sativum клетками A. laidlawii 118, данная система паразит—хозяин приходит в равновесие и вступает в фазу симбиотических взаимоотношений.

В настоящее время не ясно, являются перекиси орудием агресии мико-плазм или средством защиты организма-хозяина. Показано, что присутствие в питательной среде кислорода и перекисных соединений является для мико-плазм неблагоприятным фактором (Sears, Schewe, 1994; Pollack, 1992). Мико-плазмы, как правило, не встречаются в тканях, находящихся вблизи активно ; фотосинтезирующих клеток. При желтухах (хлорозах), повреждениям, вызываемым микоплазмами, подвергаются в первую очередь зрелые хлоропласты и содержащие их клетки — основные продуценты АМК в растениях (Sears et al., 1994). В то же время, в процессе жизнедеятельности, микоплазмы вырабатывают значительное количество перекисных соединений и способны влиять на активность ферментов их метаболизма (Tryon, Baseman, 1992). Таблица 3. Активность трех форм пероксидазы в тканях P. sativum, при

Таблица 3. Активность трех форм пероксидазы в тканях P. sativum, при янфицировании A, laidlawii, на 5, 6, 7, сутки развития инфекции.

время после инфицирования в сутках Цитоплазматическая фракция Ионно-связанная фракция Ковалентно-с ная фраки вязания

активность % активность % активность %

опыт 76,75 120,6 1,18 207,1 1,55 114,8

контр 63,70 100 0,57 100 1,35 100

опыт 15,80 129,4 0,31 221,4 0,72 378,9

контр 12,20 100 0,14 100 0,19 100

опыт 26,58 127,5 0,26 130,0 0,201 101,0

контр 20,84 100 0,20 100 0,199 100

Рис 4. График изменения активности трех форм пероксидазы P. sativum, при инфицировании его A. laidlawii, на 5, 6, 7, сутки развития инфекции.

Активность пероксидазы %

400

300

200

100

Цитоплазматическая фракция

ионно-связанная фракция

7 время (сутки)

Ковалентно-связанная фракция

контроль

Так или иначе, увеличение количества АМК в клетках растений может служить одной из причин хромосомных аберраций и приводить к физиологическим изменениям. Н2О2, как и Ог~, представляют собой малые, легко диффундирующие окислительно-восстановительные сигнальные молекулы. НгОг в диапозоне концентраций 0,1—50 мкМ активирует K-каналы плазматической мембраны, обратимо сдвигает потенциал плазматической мембраны, вызывает транзиторный подъем внутриклеточного Са2+. В концентрации 10—100 мкМ Н2О2 вызывает гидролиз инозитолфосфолипидов с последующей активацией протеинкиназы и стимулирует фосфорилирование белков по тирозину (Гамалей, Клюбин, 1996). Колонизация тканей растений Р. sativum клетками А. laidlawii 118 в нашей модельной системе, также сопровождалась изменением уровня фосфорилирования белков, снижением уровня АТФ-азной активности плазмалеммы и увеличением цАМФ-зависимой протеинкиназной активности и индукцией синтеза некоторых полипептидов (Tarchevsky et al., 1994, 1996).

Таким образом, наблюдаемые морфофизиологические и генетические изменения растений P. sativum, инфицированных А. laidlawii 118, согласуются с теорией окислительного стресса, предложенной I. Kahane (1984, 1986) для объяснения цитологической картины патологии при микоплазмозах. После стрессовой реакции на инфекцию, данная система паразит-хозяин стремится к стабилизации. В этом процессе, по-видимому, участвуют адаптивные механизмы как растений так и микоплазм.

Микробиологическое тестирование инфицированных растений.

В классической микробиологии принято отождествлять патогенный штамм с вызываемым им заболеванием по результатам микробиологического высева микроорганизма в чистую культуру, в соответствии с правилом триады Коха. Способность к росту и размножению на питательных средах до сих пор является важным критерием в систематике микоплазм, как и патогенные свойства тех или иных видов (Lee, Davis, 1992; Razin, 1992). В то же время, имеются данные о потере патогенности штаммами некоторых видов микоплазм после их культивирования на искусственных питательных средах (Скрипаль, 1988). Многочисленные неудачные попытки микробиологического высева микоплазм (эффект микоплазмоподобных организмов), наводит на мысль о существовании обратного процесса — потери способности к росту микоплазм без клеток-хозяев. Ответ на вопрос— является ли такая способность устойчивым признаком штамма А. laidlawii 118, при его размножении в клетках растений Р. sativum, послужил одной из задач наших исследований. Мы хотели так же показать, что развитие патологических реакций инфицированных растений сопровождается размножением в их тканях клеток A. laid-

lawii штамма 118, который может быть снова выделен в чистую культуру и не является результатом присутствия какой-либо посторонней микрофлоры.

Для выполнения задачи, было проведено более 150 микробиологических высевов из проводящих пучков инфицированных растений с морфологическими отклонениями. О размножении микоплазм в каждом варианте судили по изменению оптической плотности питательной среды и по результатам высева на агаризованные питательные среды. Идентификацию микробиологического материала проводили с помощью световой микроскопии, по морфологии колоний на твердых питательных средах и сравнением электрофоретических спектров рестрикционных фрагментов ДНК клеток микроорганизмов.

После 2 — 4 "слепых" пассажей, в некоторых пробах культуральная жидкость увеличивала оптическую плотность, при посеве на агаризованную среду Эдварда появлялись колонии с морфологией, характерной для колоний микоплазм. Посторонней микрофлоры (бактерий и грибов) обнаружено не было, что показывает отсутствие сочетанных инфекций.

На рисунке 5 представлены элекгрофореграммы спектров рестрикционных фрагментов ДНК клеток A. laidlawii 118 и ДНК микроорганизма, выделенного из инфицированных растений P. sativum. Совпадение спектров подтверждает принадлежность выделенгного нами микроорганизма к исходному штамму, использованному для инфицирования растений.

В таблице 4 отражены результаты микробиологических тестов, проведенных в различное время после инфицирования проростков. Одним из результатов является то, что выделить микоплазмы из растений на искусственные питательные среды удавалось только в течение первых 10 суток развития инфекции. Вместе с тем, методами электронной микроскопии и ДНК—ДНК-гибридизации было показано присутствие микоплазм в клетках инфицированных растений на протяжении всего эксперимента (до 40 суток). По-видимому, клетки микоплазм, находящиеся в тканях растений постепенно теряют способность к размножению в бесклеточной системе. На электронномикроскопиче-ских препаратах тканей инфицированных растений, с течением времени, происходит накопление клеток микоплазм с измененной морфологией, идентифицируемых нами как "минимальные тела".

Подобные изменения отмечались многими авторами, в том числе при исследовании инфицированных растений, выращенных в условиях пониженной освещенности (Скрипаль, 1988). Возможно, процессы трансформации клеток A.laidlawii в некультивируемые формы и изменения их морфологии каким-то образом взаимосвязаны.

Табл. 4. Результаты высева A. laidlawii из инфицированных растений Р. sativum на разных сроках развития инфекции.

N опыта 2 суток 4 суток 6 суток 10 суток 14 суток 21 сутки

П m п m п m п m п m п m

1 4 2 4 2 4 - 6 - 6 - 4

2 6 4 8 4 8 3 8 - 4 4

3 5 2 5 2 6 1 6 1 5 _ 4

4 6 3 6 3 6 2 6 .

5 10 1 10 - 10

итого 21 11 23 11 24 6 36 2 25 - 22

% высе-ваемости 52 48 25 5,6 0 0

п — кол-во проб, m — кол-во результативных высевов

Рис. 5. Электрофор етические спектры фрагментов ДНК, после обработки рестриктазой EcoRV, в 0,8 % агарозном геле: 2 — клеток A. laidlawii (использованных в экспериментах для инфицирования растений P. sativum), 3 — микроорганизма, выделенного из инфицированных растений (5 суток после инфицирования) и 1 — фага Я (маркер молекулярного веса).

Определение гетерогенности ДНК A. laidlawii и иекультнвнруемых форм.

Высказывалось предположение, что процессы адаптации в системе паразит—хозяин сопровождаются реорганизацией геномов в клетках растений и микоплазм (Chernov et al., 1996; Shaw et al., 1992). Предпосылкой этому может служить высокая скорость мутационных процессов у этих микроорганизмов

(Neimark, Carle, 1996). Возможность реорганизации генома AJaidlawii при взаимодействии с растениями изучались нами в опытах по сравниванию кривых термоэлюции гибридных дуплексов ДНК A.Iaidlawii исходного штамма 118 с ДНК некультивируемых форм в инфицированных растениях.

Устойчивость гибридных молекул ДНК к нагреванию определяется совершенством дуплексов. В процессе взаимодействия изучаемых организмов в геноме микоплазм могут происходить изменения, которые при молекулярной гибридизации ДНК приводят к образованию дефектных дуплексов. Подсчитано, что 1% нуклеотидных различий снижает температуру плавления ДНК на 1,5 С0 (McGarthy, Farguhar,1972). Поэтому, критерием изменения нуклеотидного состава может быть различие температуры плавления полученных гибридных молекул. Для определения этого параметра, ДНК культуры A. laidlawii 118 и ДНК фракции инфицированных растений (15 суток развития инфекции), обогащенной микоплазмами фрагментировали, денатурировали кипячением и подвергали совместному отжигу в гибридизационном буфере. Перед этим один из образцов ДНК метили тритием в реакции ник-трансляции, другой образец ДНК наносили на нитроцеллюлозный фильтр. Полученные образцы гибридной ДНК вносили в термостатируемую колонку с оксиапатитом. Повышая температуру каждый раз на 2 С0, смывали 0,12 М фосфатным буфером распавшиеся (несовершенные) дуплексы. Радиоактивность элюата измеряли в диоксановом сцинцилляторе при каждой температуре инкубации. -Каждая серия опытов выполнена в трех параллелях, при этом отклонения в каждом случае укладывались в область допустимых значений.

Построенные нами кривые термоэлюции (рис. 6) имеют изменения в области точки плавления ДНК. Эти различия сохранялись и тогда, когда в качестве зонда использовалась ДНК A. laidlawii. Для количественного определения степени гомологии геномов, мы использовали показатель гетерогенности, предложенный Б.М. Медниковым (1977) и модифицированный для придания большей значимости изменениям в окрестности точки плавления (Чернов, Борхсениус, 1989). Определенная нами величина гетерогенности составляла И условных единиц. Таким образом, можно констатировать, что различия геномов клеток A.laid!awii и не культивируемых форм находятся в пределах 7-10 %, что соответствует 100—150 т.п.н. Повреждение столь значительного участка (или нескольких участков) вероятнее всего и приводит к трансформации клеток A. laidlawii в не культивируемые формы. В настоящее время, мы не располагаем данными о конкретных механизмах, обеспечивающих наблюдаемые перестройки генома в клетках микоплазм. Возможно, адаптивные реакции мико-

%

16 -14 -12 -10 -8 -6 -4 " 2 " 0 ■

60 65 70 75 80 85 90 95

°С

Рис. 6. Графики термоэлюции гибридных дуплексов ДНК А. Ы(11а\га и некультивируемых форм, выделенных из растений. Вертикальная шкала — радиоактивность элюированных дуплексов, % от гомологичной реакции. Пунктирная линия —гомологичная реакция, сплошная - ДНК А. ЫсИауш X ДНК некультивируемой формы.

плазм и растений имеют двунаправленный характер, и микоплазмы так же находятся под воздействием каких-либо стрессовых факторов. В проведенных нами экспериментах было показано, что стрессовые воздействия антропогенной природы на микоплазмы — присутствие в питательной среде ионов металлов и антибиотиков, вызывают в клетках микоплазм накопление экстрахромосомных компонентов ДНК (рис. 7, 8). Относительное количество экстрахромосомной ДНК имеет обратную зависимость от жизнеспособности культуры микоплазм, выраженную в количестве КОЕ, то есть, прямую зависимость от силы стрессового воздействия. В свою очередь, активизация профагов, ин-тегративных плазмид и инсерционных последовательностей может приводить к крупномасштабным перестройкам генома (Хесин, 1984).

КОЕ /мл

Рис. 7. График зависимости количества КОЕ в культуре A. laidlawii от

присутствия ионов металлов и антибиотиков: 2 мМ Zn 2+ (

), 2мМ Ni 24

(— — —), 2мг/мл эритромицина (......), 2мг/мл тетрациклина ( —

и кривая роста контрольной культуры A. laidlawii ( ').

1 2 3 4 5 6

>ис. 8. Электрофореграмма тотальной ДНК клеток A- laidlawii, выращенных I присутствии: 2-2 мМ Ni2+, 3-2 мг/мл тетрациклина, 4-2 мМ Zn2+, 5 -2 мг/мл эритромицина. 1 -ДНК контрольной культуры; 6 —ДНК фага X, >бработанная рестриктазой Hind III.

Реализация комплекса реакций биогенного стресса в известной степени объясняет картину феноменологии микоплазменных инфекций (Тарчевский, 1994, Чернов и др„ 1996). Как показано в наших исследованиях, последствия этих реакций включают в себя хромосомные аберрации в клетках растений и генетическую трансформацию микоплазм. Индукторами стресса могут так же служить факторы антропогенного воздействия: загрязнение окружающей среды и массовое применение антибиотиков. В свою очередь, высокие темпы изменчивости увеличивают вероятность появления микоплазм с измененными антигенными детерминантами, новыми биохимическими характеристиками и устойчивостью к лекарственным препаратам (ЬетазоЬп е1 а1„ 1994) и, таким образом, к нарушения равновесия в системе паразит—хозяин.

ВЫВОДЫ

1. Разработана модельная система для изучения процессов взаимодействия микоплазм (Acholeplasma laidlawii), с клетками растений (Pisum sativum).

2. Установлено, что клетки Acholeplasma. laidlawii способны проникать в растения через неповрежденную корневую систему. Инфицирование микоплазмами в эксперименте (посредством субъэпидермальной инъекции или непосредственно через неповрежденную корневую систему) приводит к развитию у растений морфологических отклонений, характерных для микоплазмозов, возникающих в природных условиях спонтанно.

3. Инфицирование растений микоплазмами приводит к нарушению расхождения в анафазе хромосом растительных клеток.

4. В процессе взаимодействия с клетками растений микоплазмы трансформируются в некультивируемые форкы. При этом изменения ульт-рацитоструктуры клеток сопровождается перестройками в их геномах.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Чернов В.М., Гоголев Ю.В., Попова Н.В., Чернова О.А. Инфицирование гороха посевного Р1зит Баи-тт клетками АсЬо1ер1аБта laidlawii приводит к изменениям морфологических и физиологических признаков растений // ДАН. 1996. Т. 348. N 3. С. 428-430.

. Чернов В.М., Чернова OA, Гоголев Ю.В., Попова Н.В. Адаптивные реакции системе "паразит—хозяин" и их связь с реорганизацией геномов. —Тезисы онференции "Актуальные экологические проблемы Республики Татарстан", '.азань, 1995.-С. 89-90.

. Чернова OA, Хасанова МА, Гоголев Ю.В.,Чернов В.М. Киты для обнаружения и подавления микоплазменных инфекций. — Сб. Статей конференции Карликовость люцерны и меры борьбы с заболеванием". —Саратов, 1990, С. -106.

, Chernov V.M., Chemova О.А., Gogolev Y.V., Markina O.V. Repeated tetra-ecamer nucleotide sequences as elementary structures of genetic regulation in LoUicutes //IOM Lett. -1994. - Vol. 3. - P. 402.

Chernov V.M., Chemova OA, Gogolev Y.V., Popova N.V. Mplecular-genetitic eculiarities of mycoplasma-plant infections.— Thes. of 5th Conference of Fitoplas-las. — 23 —24 October 1996, China.-P. 41. Chernov V.M., Ivanova A.B., Hassanova M.A, Gogolev Y.V., Chemova OA In tro efficiency of compound A agfinst mycoplasmas. —Thes. of the 8th Inter-ational Congress of IOM, Istanbul, Turkey, 1990, P. 411.

Tarchevsky I., Chemova O., Chernov V., Andrianova Y., Gogolev Y., Maksutova ., Yakovleva V., Lasareva L„ Karimova F, The mycoplasma influence on plant etabolism //IOM Lett. -1994.-Vol. 3,- P, 220.

Tarchevsky I., Maksutova V., Yakovleva V., Gogolev Y., Chernov V., Chemova O. [ycoplasma inducted proteins and genome rearrangements in plants //IOM ;tt. -1996. - Vol. 4. - P. 69.

Tarchevsky I., Maksutova V., Yakovleva V., Gogolev Y., Chernov V., Chemova O. ycoplasma—plant system: pathogen inducted proteins and genome rearrange-ents // Thes. of 8th International Congress of Bacteriology and Applied Microbi-ogy Division. — Jerusalem, Israel. —1996. — P. 80.