Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Почва как возможная среда обитания фитопатогенных микоплазм

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Почва как возможная среда обитания фитопатогенных микоплазм"

СЕРЕБРЕННИКОВА Людмила Александровна

ПОЧВА КАК ВОЗМОЖНАЯ СРЕДА ОБИТАНИЯ ФИТОПАТОГЕННЫХ МИКОПЛАЗМ

Специальность 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена на кафедре микробиологии Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева

Официальные оппоненты:

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, доцент А.А. Ванькова доктор биологических наук, профессор B.C. Гузев кандидат биологических наук, доцент О.О. Белошапкина

Ведущая организация: Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН

Защита диссертации состоитсяв29си<ЖЛ2005 в 1500 часов на заседании диссертационного совета Д-220.043.03 при Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева

Адрес: 127550, Москва, Тимирязевская ул., 49 Ученый совет МСХА им. К.А. Тимирязева

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной Научной библиотеке Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева.

Автореферат разосланАД оиДА 200^г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

В.А. Калинин

&ооб-У

^ ^^KTV!

Актуальность проблемы. Микоплазмы - простейшие лишенные клеточной стенки прокариоты, объединённые в класс Mollicutes. Малый размер генома и ограниченные биосинтетические возможности обусловили их сосуществование с клетками высших эукариот. Все известные микоплазмы, встречающиеся в природе относят к симбионтам животных, насекомых и растений. Фитопатогенные микоплазмы являются возбудителями более 600 заболеваний растений из 96 семейств (Борхсениус и др., 2002). Микоплазмозы растений широко распространены в регионах интенсивного возделывания сельскохозяйственных культур (Волгоградской, Саратовской, Астраханской областях, Краснодарском крае, на Северном Кавказе) и наносят огромный ущерб сельскому хозяйству России, снижая урожай пшеницы на 80-90%, картофеля - на 18-20%, томатов и других пасленовых на 25-38% (Власов и др., 1985,2000; Скрипаль, 1988; Борхсениус и др., 1989; Самсонова, 2000).

Основную роль в распространении микоплазмозов растений отводят насекомым-переносчикам (Власов и др., 1985; Богоутдинов, 2001). Заболевание может передаваться также через паразитическое растение повилику (Яковлева, 1992). Накопителем и источником инфекции являются многолетние растения, поскольку в их корнях микоплазмы способны перезимовывать, а весной мигрировать в вегетативные органы. Фитоплазмы сохраняются зимой в многолетних сорняках, клубнях, корнеплодах, луковицах (Дементьева, 1987; Seemuller et al., 1998а; Приходько, 1999; Davies, 2000). В последние годы (Мидянник, 1995; Чернов и др., 1999) экспериментально в условиях in vitro подтверждена возможность проникновения микоплазмы Acholeplasma laidlawii через неповрежденную корневую систему люцерны и гороха в надземную часть растений. Этот факт позволяет предположить существование совершенно иного механизма передачи инфекции - через корневую систему непосредственно из почвы, которая может играть роль естественного резервуара фитопатогенных микоплазм.

Проведение экологических исследований микоплазм, изучение возможности их обитания в почве и механизмов инфицирования растений своевременно, так как позволит разработать эффективные меры предотвращения заболеваний растений и решить проблемы управления микоплазменными инфекциями.

Цель работы - выяснить пригодность почвы как среды обитания фитопатогенных микоплазм, изучить динамику численности интродуцированной популяции микоплазм в почве и возможность проникновения микоплазм из почвы в растение через корневую систему.

Задачи исследования:

• Разработка эффективных селективных методов выявления и количественного учета микоплазм в почве.

• Применение метода ПЦР для идентификации микоплазм в черноземной почве.

• Определение динамики численности интродуцированной популяции микоплазм в почве.

• Изучение влияния абиотических и биотических факторов среды на численность интродуцированной популяции АсИо1ер1азта ШсЧсмИ в почве.

• Изучение возможности проникновения микоплазм из почвы в растение через корневую систему.

Научная новизна. Разработаны и впервые применены селективные приемы выделения микоплазм из почвы, заключающиеся в механической предварительной обработке почвы, использовании селективной среды и повышенной температуры инкубации посевов. Впервые экспериментально установлено, что почва может играть роль естественного резервуара и источника фитопатогенных микоплазм. Длительность выживания микоплазм в почве зависит от типа почвы. Показано, что Аско1ер1авта ШсИт/и способна проникать непосредственно из почвы в растения через корневую систему, мигрировать в надземные ткани растения и длительно персистировать в них, вызывая специфические морфологические изменения растений.

Практическая значимость. В результате проделанной работы разработаны методические подходы для выявления и количественного учета микоплазм в почве. Использованы метод посева на селективную питательную среду и ПЦР-анализ. Установлено, что для проведения ПЦР в черноземной почве целесообразно использовать непрямой способ выделения ДНК, так как при непосредственном экстрагировании ДНК из почвы происходит ингибирование полимеразной цепной реакции. Рекомендованные методы могут быть использованы в экологических исследованиях микоплазм в почве, что пополнит наши знания об этой малоизученной группе микроорганизмов, а также о биоразнообразии почв; в сельском хозяйстве для диагностики возбудителей болезней растений при разработке мер борьбы с микоплазмозами и предотвращения эпифитотий.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы

доложены на 11-м Международном конгрессе по молекулярным

взаимодействиям между .растениями и микроорганизмами (Санкт-Петербург, . <•»«.*>,«и,.

' 4 * \ I

ч|» < ] -

»♦в ф> ги '

2003); конференции молодых ученых и специалистов МСХА (Москва, 2003); научной конференции МСХА (Москва, 2004).

Публикации. Материалы диссертации изложены в 4 печатных работах.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста и включает в себя следующие разделы: введение, обзор литературы, описание объектов и методов исследования, результаты и обсуждение, выводы и список литературы, включающий 213 наименования, в том числе 107 - зарубежных авторов. В работе представлено 4 таблицы, 30 рисунков.

Автор выражает искреннюю признательность и благодарность научному руководителю к.б.н. A.A. Ваньковой, д.б.н. JI.B. Васильевой (ИНМИ РАН), д.б.н. проф. Шильниковой В.К., к.б.н. П.И. Иванову, д.б.н. И.В. Раковской (НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН), д.б.н. В.М. Чернову, к.б.н. Ю.В. Гоголеву и н.с. Н.Е. Мухаметшиной (КИББ КНЦ РАН, лаборатория молекулярных основ патогенеза), к.б.н. Г.И. Карлову (лаборатория биотехнологии МСХА), а также аспирантам и сотрудникам кафедр биотехнологии и микробиологии за помощь и ценные консультации при выполнении работы.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объектов исследования использовали 2 штамма микоплазмы Acholeplasma laidlawii. Первый (1) получен из НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. Второй (2) штамм предоставлен лабораторией молекулярных основ патогенеза КИББ КНЦ РАН.

В опытах использовали чернозём обыкновенный карбонатный (Воронежская область, Таловский район) и дерново-подзолистую почву (Москва, Полевая опытная станция МСХА им. К.А. Тимирязева), горох посевной (Piston sativum) сорт Тан, предоставленный ТатНИИСХ НПО "Нива" и томат (Lycopersicum esculentum Mill.) 3-х сортов: Морковный (детерминантный), Золотая Капля и Манимейкер (индетерминантные),

A. laidlawii культивировали в жидкой питательной среде Mycoplasma Broth Base (Becton Dickinson, USA). Для накопления биомассы культуру инкубировали при температуре 28°С в течение 4 суток. Для увеличения титра и удаления питательной среды клетки центрифугировали при 12000g 20 мин +4°С. Надосадочную жидкость сливали, осадок осторожно ресуспендировали в небольшом количестве воды. Определение концентрации микоплазм в

суспензии проводили титрованием в полужидкой среде Mycoplasma Agar Base (0,3% агара) и подсчетом КОЕ в толще среды, а также колориметрически на ФЭК с использованием светофильтра с длиной волны 590 нм.

Для изучения динамики численности стрептомицинустойчивый штамм А laidlawii интродуцировали в черноземную почву, равномерно внося водную суспензию культуры в стаканчики с 25г почвы влажностью 60% ПВ при +20°С в 3-кратной повторности. A. laidlawii в почве определяли микробиологическим посевом на плотную среду и методом ПЦР. Из почвенной суспензии A. laidlawii высевали на плотную среду (1,4% агара) со стрептомицином в концентрации 1,4 мг/мл после предварительной десорбции, которую проводили встряхиванием водной почвенной суспензии (10:1) на механической качалке WU-4 при 180 об/мин в течение 10 мин. Посевы инкубировали в термостате при +37°С. Наблюдение и подсчет колоний проводили на 7-10 сутки с помощью бинокулярной лупы МБС-10 при увеличении х32 и х56.

При выделении ДНК для ПЦР анализа использовали непрямой метод, который заключается в предварительной десорбции микробных клеток из субстрата, лизисе клеток, а затем экстракции и очистке ДНК. После проведения десорбции клеток из почвы, почвенную суспензию фильтровали через бумажный фильтр для удаления грубых почвенных частиц. Затем фильтрат центрифугировали при 2500g в течение 1 мин (+4°С) для осаждения мелких почвенных частиц. Процедуру повторяли, если суспензия содержала почвенные частицы. Супернатант отбирали и осаждали микробные клетки центрифугированием при 12000g 20 мин (+4°С). Осадок использовали для выделения ДНК. Очистку ДНК проводили с использованием классической процедуры фенольно-хлороформной экстракции (Маниатис и др., 1984).

Для определения A. laidlawii в растениях методом ПЦР-анализа 100 мг исследуемых тканей после тщательного предварительного отмывания помещали в фарфоровую ступку и гомогенизировали. Гомогенат использовали для выделения ДНК.

Реакцию ПЦР проводили в программируемом амплификаторе "Терцик" (Россия). Для выявления A. laidlawii в качестве праймеров использовали олигонуклеотиды, синтезированные в НПО "Литех". Последовательность праймеров составлена на основе первичной структуры рибосомного оперона A.laidlawii (Kong et al.,2001):AF - 5'GAG АТС TTT GAA AAG TAGATA AAT GAT GTC TGA AAA GAA ATA AGG3'; AR - 5'CTT CGA CCG ATT TTC CCA CAT CGT TCA TC 3', фланкирующие ампликон размером 362 п.о. в области межгенного спейсерного района ДНК 16S-23S рРНК. Программа реакции амплификации: 95°С - 2 сек, 62°С - 2 сек, 72°С - 10 сек 40 циклов; 72°С - 5 мин; хранение 10°С. Для выявления A. laidlawii также были использованы

последовательности праймеров, синтезированные в ЗАО "Синтол". Подбор праймеров проводили с использованием программы Aligo 4.1. на основании сиквенса в базе данных GenBank. Ml-5'GAT GAA/ TG/T AGT AGC CGG TCG TAT CGG GA3', M2-5'CC/T AGG GTA GGC AAT CCT G/AT TAG ATG GGA CT3', фланкирующие ампликон размером 533 п.о. Программа реакции амплификации: 95°С - 1 мин, 55°С - 1 мин, 72°С - 2 мин 30 циклов; 72°С - 5 мин; хранение 10°С. Продукты амплификации выявляли с помощью электрофоретического разделения фрагментов ДНК в 1,5% агарозном геле по свечению в ультрафиолетовом свете в присутствии 10 мкг/мл бромистого этидия.

В опыте по изучению влияния pH почвы на динамику численности А. laidlawii использовали естественную дерново-подзолистую почву (pHKci 5,1) и ту же почву с внесением CaO для нейтрализации кислотности (рНка 8,0).

Опыты с растениями проводили в фитотроне при 18-часовом световом дне, температуре +20°С (горох), +22-24°С (томаты) и освещенности 5 тыс. лк. Способность проникать A laidlcrwii через корневую систему в растение из водной бактериальной суспензии определяли, помещая проросшие семена в бактериальную суспензию, из почвы - выращивая растения с интродуцированной в почву популяцией микоплазм. Детекцию A laidlcrwii в растениях проводили ПЦР анализом в корнях, стеблях и листьях.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Методические приемы работы с микоплазмами 1. Разработка эффективных селективных методов для выделения Acholeplasma laidlawii из почвы

Проводили сравнительные исследования эффективности селективных приемов для наиболее полного выявления микоплазм из почвы: влияние состава питательных сред, различных способов предварительной обработки почвы, температуры инкубации посевов. С этой целью использовали следующие агаризованные среды: среду на основе гидролизата бычьего сердца (ГБС) (НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН) и Mycoplasma Broth Base (MB) (Becton Dickinson, USA). Обе среды используются для культивирования патогенных видов микоплазм в медицинских лабораториях. Чистую культуру A. laidlawii выращивали на среде ГБС (pH 6,5) с добавлением сыворотки и без неё, так как ахолеплазмы хорошо размножаются и на бессывороточной среде (Борхсениус и др., 2002). Рост культуры в полужидкой среде с добавлением сыворотки заметно интенсивней, чем рост без этого компонента: характерное разрастание A. laidlawii в виде "облака" наблюдали на 5 сутки по всему

столбику среды. В среде без сыворотки рост культуры значительно более ограничен.

Для визуального наблюдения за ростом А. 1аиИсми испытывали ГБС разной плотности - с содержанием 0,4; 0,6; 0,8 и 2% агара. В полужидких средах с разным содержанием агара наблюдали отличающиеся по плотности и величине колонии. В среде с 0,4% агара на 3 сутки культивирования отмечали рыхлые полупрозрачные с нечетко очерченным краем колонии. В средах с 0,6 и 0,8% агара колонии вырастали на 5 сутки и они были более компактные и имели четкий край. Темно-коричневый цвет и слабая прозрачность среды ГБС в целом затрудняли визуальное определение роста А 1тс11апл>И в полужидкой среде. А. МсПами на плотной (2% агара) среде образует точечные колонии, диаметр которых не превышает 1 мм. При высеве из почвы, большую часть поверхности питательной среды в чашке занимали быстрорастущие почвенные микроорганизмы, в первую очередь микромицеты, и подсчет колоний микоплазм был не возможен. Для подавления почвенных грибов в плотную среду добавляли нистатин в концентрации 1000 и 50 Ед/мл среды. Первая концентрация применяется в почвенной микробиологии, вторая в медицине (Раковская, 1999). При концентрации 1000 Ед/мл подавлялся рост не только грибов, но и микоплазм. При концентрации антибиотика в среде 50 Ед/мл микогогазмы развивались, а рост грибов подавлялся. Однако, нистатин не полностью растворялся в среде, и его частицы мешали учету мелких колоний микоплазм по размеру равных частичкам нистатина.

Визуальное наблюдение за развитием колоний микоплазм на среде МВ (рН 8,0) осуществлялось значительно проще, так как она имеет бледно-желтый цвет и хорошую прозрачность. Рост А. Шс11смИ изучали в среде различной плотности. В жидкой среде наблюдалось слабое равномерное опалесцирующее помутнение среды. В толще полужидкой среды (0,3% агара) колонии вырастают на 3-4 сутки после посева разведений и имеют вид беловатых полупрозрачных сфер в диаметре 0,5... 1,5 мм. На плотной среде (1,4% агара) вырастают округлые, точечные колонии (0,1... 1,0 мм) в виде яичницы-глазуньи с приподнятым центром и плоским ободком. Содержание агара в плотной среде (1,4%) ниже, чем в обычных плотных питательных средах, что позволяет ахолеплазмам, которые относятся к факультативным анаэробам, легче проникать в толщу агара. При высевах на плотную среду МВ из почвы резко снижалась численность почвенных микроорганизмов, особенно грибов, по сравнению с численностью их при высеве на ГБС, что можно объяснить щелочной реакцией среды МВ. Для культивирования и учета А. Ысйсмп в почве была использована среда МВ.

Для изучения поведения фитопатогенных микоплазм в почве антибиотикоустойчивый штамм А. ЫсПт/и интродуцировали в почву и реверсировали его вновь на питательную среду с антибиотиками. Антибиотикоустойчивые штаммы А. ШсЯстп получали методом "приучения" исходной культуры к возрастающей концентрации антибиотиков путем постепенного отбора резистентных форм. Были получены штаммы А. 1шс11ат1 устойчивые к стрептомицину и рифампицину. В процессе культивирования антибиотикоустойчивых штаммов А. ЫсИсмН на среде с антибиотиками отказались от рифампицина, так он окрашивал среду в темно-бордовый цвет, что затрудняло видимость колоний микоплазмы. Стрептомицин не менял цвета среды, поэтому для высева микоплазм из почвы использовали питательную среду со стрептомицином. При посеве чистой культуры и высеве из почвы на плотную питательную среду стрептомицинустойчивого штамма А. Ы<йсми выявлен полиморфизм колоний. Кроме классических колоний в виде яичницы-глазуньи наблюдались атипичные колонии двух видов: без плоского периферического ободка "пузырчатые" и шероховатые. Размер атипичных колоний был меньше, чем классических колоний. Методом ПЦР подтверждено, что типичные и атипичные по форме и размерам колонии стрептомицинустойчивого штамма А. \aidlawii в чистой культуре и выделяемые из почвы идентичны исходному штамму.

Клетки почвенных микроорганизмов располагаются преимущественно на поверхности твердой фазы почвы и адсорбируются на почвенных частицах. Для учета интродуцированной стрептомицинустойчивой популяции микоплазм А. ЫсИсмН в почве необходимо было разработать наиболее эффективный метод десорбции. Обработку почвы с целью десорбции клеток проводили через сутки после интродукции А. ЫШстН в черноземную почву. Учет численности А. 1аийсмИ, десорбированной из почвы разными способами, проводили методом посева на плотную среду со стрептомицином.

Результаты опыта (табл. 1) показали, что наибольшее количество клеток десорбировалось при встряхивании почвенной суспензии в колбе на механической качалке в течение 10 мин - 1,7*108 КОЕ/г почвы при исходном титре клеток 109 КОЕ/г почвы. При обработке почвенной суспензии ультразвуком (УЗ) с добавлением ПАВ и без них численность десорбированных клеток на порядок и более ниже, чем при встряхивании. Негативное влияние УЗ обработки на клетки микоплазм, видимо, связано с отсутствием у них клеточной стенки. Сочетание ПАВ с различными способами механической обработки не привела к увеличению изолированных клеток микоплазм из почвы. Малоэффективно также растирание в ступке. Оптимальный вариант десорбции микоплазм из почвы - встряхивание почвенной суспензии, который

использовали при подготовке почвы к микробиологическому посеву и ПЦР анализу.

Таблица 1

Влияние различных способов десорбции на численность интродуцированной в почву популяции АсИо1ер!ахта Шс11ам>п, определяемую чашечным методом_

№ Варианты опыта Численность,

КОЕ/г воздушно-сухой почвы

1 Встряхивание в колбе 10 мин. 1,7* 108

2 Встряхивание в колбе с 0,01% Т\уееп-60 10 мин. 1,2*10®

3 Обработка УЗ 0,5 мин. 1,8* 107

4 Обработка УЗ 1 мин. 4,2* 107

5 Обработка УЗ 2 мин. 4,8*106

6 Обработка УЗ 3 мин. 4,5* 106

7 Обработка УЗ с 0,01% вБв 0,5 мин. <1,0*106

8 Обработка УЗ с 0,01% вБв 1 мин. <1,0*106

9 Обработка УЗ с 0,01% Ти-ееп-бО 0,5 мин 3,2* 107

10 Растирание в ступке 5 мин. 1,4* 106

11 Растирание в ступке с 0,01% вОв 5 мин. <1,0*106

Наблюдения посевов из почвы при инкубации в различных температурных условиях показали, что при 28°С на чашках быстро вырастают колонии почвенных бактерий, которые не подавляются антибиотиком, добавленным в среду, и мешают подсчету колоний микоплазм. При 37°С колонии микоплазм вырастают быстрей, чем при 28°С, а рост большинства других почвенных микроорганизмов угнетается относительно высокой температурой. Температуру 37°С использовали как "элективную" для А. ШсИан/п при учете её численности в почве.

2. Метод ПЦР для детекции Аско1ер1<кта Ыийаюи в почве

Оценивали 2 способа выделения ДНК из почвы с помощью прямого и непрямого метода. Прямой метод позволяет выделять тотальную ДНК с минимальными потерями и считается более точным, поэтому ему отдается предпочтение. Однако, в литературе нам не удалось найти методики для черноземной почвы. Поэтому испытывали различные модификации прямого метода, применяемые для других почв: 1. Замораживание-оттаивание почвенного образца с использованием жидкого азота для лизиса клеток в почве. 2. Ультразвуковая обработка (22 кГц, 0,4А, 2 мин, 4 раза) почвенной суспензии

для лизиса клеток. 3. Экспресс-набор для выделения ДНК из биопроб (НПФ "Литех"). 4. Низкосолевой буфер (TESP: 50mM Tris, 20тМ EDTA, ЮОтМ NaCl, 1%PVP) для десорбции микробных клеток из почвенных частиц в раствор с дальнейшим лизисом клеток в нем. 5. Высокосолевой буфер (TESAP с добавлением О.ЗМ CH3COONa и 0.6М NaCl) для десорбции микробных клеток из почвенных частиц. 6. Сочетание разных методик.

Проверка контрольных проб почвы с разными титрами внесения клеток A. laidlawii 103; 105; 107; 109 КОЕ/г показала, что продукты амплификации регистрируются только при высоком содержании микробных клеток в почве 108-109 КОЕ/г почвы на момент вьщеления ДНК. Отсутствие результатов при низких титрах можно объяснить адсорбцией ДНК лизированных клеток на почвенных частицах и (или) ингибированием полимеразной цепной реакции посторонними веществами из почвы, например, гуминовыми кислотами, которые в большом количестве присутствуют в черноземных почвах.

Для очистки ДНК от примесей, ингибирующих ПЦР, были испытаны следующие приемы: 1. Использование носителей ДНК, которые одновременно являются ингибиторами её неспецифической адсорбции: ДНК лосося, тРНК. 2. Гельфильтрация через колонки с Sephadex G 50, G 100. 3. Использование цетавлона (цетил этидиумбромид, СТАВ). 4. Отделение ДНК от примесей с помощью электрофореза в легкоплавкой агарозе. 5. Классическая фенольно-хлороформная методика (Маниатис и др.,1984). 6. Совместное применение нескольких способов очистки ДНК.

Все испытанные методики по очистке ДНК от ингибиторов оказались не эффективны. Выделенная ДНК содержала примеси коричневого цвета, которые имели свойства схожие с нуклеиновыми кислотами, поэтому отделить их не удалось. Использование прямого метода выделения ДНК из черноземной почвы, содержащей большое количество гуминовых кислот, не дало положительного результата.

Для идентификации микоплазм в почве методом ПЦР использовали непрямой метод выделения ДНК из микроорганизмов, который давал положительные результаты при низких титрах A. laidlawii в почве.

Динамика численности и идентификация Acholeplasma laidlawii в почве

Изучена динамика численности интродуцированной популяции А. laidlawii (штамм 1) в различных по физико-химическим свойствам почвах -чернозёме обыкновенном и дерново-подзолистой почве.

г а* 2-

\

«рнпёя >6&1хшмх]П1&

1-

О-

\

\

О

V 1

I

сутки

2

3

4

Рис.1 Динамика интродуцированной популяции АсИокрЫта ЫсИсми в черноземе обыкновенном и дерново-подзолистой почве

Результаты исследования показали (рис.1), что в дерново-подзолистой почве внесенная популяция А. \aidlcMii через сутки после интродукции в почву не определяется на питательной среде. В черноземе популяция уменьшается постепенно и через сутки сохраняет довольно высокую численность - 107 КОЕ/г почвы по сравнению с дерново-подзолистой почвой. Высев почвенной суспензии на 4 сутки также показал высокий уровень популяции микоплазм в почве - 106 КОЕ/г почвы. Быстрая гибель популяции в дерново-подзолистой почве, вероятно, связана с неблагоприятной для ахолеплазм кислотностью. Таким образом, черноземная почва более благоприятна для ахолеплазм, чем дерново-подзолистая почва.

Оценка длительности выживания интродуцированной популяции А. 1аШстп в черноземной почве ПЦР анализом и микробиологическим посевом показала, что популяция сохранялась в почве в течение 15 суток (рис.2,3).

1 2 3 4 5 6 7

Рис.2 Электрофореграмма результатов ПЦР по срокам идентификации АсЪо1ер1азта 1аШ1см>Н в черноземе

1. 2. 3.4. 5. - 1,5,10,15,17 суток после интродукции А. 1аШ1амН в почву соответственно. 6. - положительный контроль (чистая культура А ШШамИ) 7 - отрицательный контроль.

Рис.3 Динамика численности интродуцированной популяции АсИокрЫта ШсЧстИ в черноземе

Изучена динамика численности А. \aidlawii в почве при интродукции на разных исходных уровнях популяционнои плотности: 108 КОЕ/г; 109 КОЕ/г; 1011 КОЕ/г почвы (рис.4). Численность интродуцированной популяции снижалась во всех вариантах независимо от количества внесенной культуры. Популяция, внесенная в титре 108 КОЕ/г почвы постепенно сокращалась и достоверно микоплазмы определялись в почве методом посева в течение 6 суток (7*103 КОЕ/г почвы), на 8 сутки микоплазмы не обнаружены. В варианте с титром внесения А. Ш1смп 109 КОЕ/г почвы регистрировали плавное снижение численности и идентифицировали А. \aidlawii в почве методом посева в течение 15 суток.

Рис.4 Динамика численности интродуцированных популяций АсИо!ерЫта ШЛстИ в почве в зависимости от начального титра

При исходном титре внесения A. laidlawii 10п КОЕ/г почвы численность популяции в ходе опыта менялась с тенденцией к убыванию. Микоплазмы достоверно выделялись в течение 19 суток (1,2*102 КОЕ/г почвы). Посев пробы на 26 сутки показал, что микоплазмы не изолируются из почвы на плотную питательную среду. Известно, что при интродукции микробной популяции в естественную среду действуют механизмы антибиоза со стороны почвенных микроорганизмов (Звягинцев, 1987; Кожевин, 2000). По мере снижения популяционной плотности микроорганизмов наблюдается ослабление отрицательных механизмов, но это не всегда ведет к стабилизации популяции. Популяции, характеризующиеся высоким уровнем трат на поддержание в результате внутрипопуляционной конкуренции, могут быстро погибнуть в условиях голодания (Кожевин, 2000) или перейти в некультивируемое состояние.

Влияние температуры и кислотности почвы на динамику численности Acholeplasma laidlawii

Изучена динамика численности интродуцированной популяции А. laidlawii в черноземной почве при разных температурных режимах и значениях кислотности. Исследования показали, что при всех изучаемых температурных условиях +4°С, +20°С и +28°С происходит снижение численности A. laidlawii (штамм 1) в почве, но динамика процесса различна (рис.5).

АсИокрЫта laidlawii при различных температурных режимах

Наиболее резкое сокращение численности наблюдалось при +28°С - в течение 2 суток она уменьшилась почти на 3 порядка (начальный титр 8x107

КОЕ/г почвы). На 6-й день микоплазмы на питательной среде не выявлялись. Падение численности микоплазм наблюдается и в вариантах при температурах +4°С и +20°С, но оно не такое резкое. Достоверно А. 1мс!1<тП выявляются на 6 сутки в количестве 2,1x10 и 6,7x103 КОЕ/г почвы. Однако, на 8-е сутки микоплазма в почве не выявлена в обоих вариантах. Таким образом, высокая температура неблагоприятна для ахолеплазм и сокращает время существования их в почве.

Наблюдения за динамикой численности популяции А. 1аШ1т>и в почве при разной кислотности показали, что в естественной дерново-подзолистой почве (рНКа 5,1) через 1 сутки микоплазмы не обнаруживались, в дерново-подзолистой с внесением СаО (рНКС18,0) их уровень снижался до 103 КОЕ/г и микоплазмы не выявлялись на 5 сутки (рис.6). Высокая кислотность почвы негативно влияет на развитие микоплазм в почве. Следует отметить, что при одинаковых титрах инокулюма и рН черноземной и дерново-подзолистой почв период выявления А. Ыс11стН в черноземе составил 15 дней, а в дерново-подзолистой не более 5 суток. Следовательно, жизнеспособность микоплазм зависит не только от рН, но и от других физико-химических свойств почв.

Рис.6 Динамика численности интродуцированной популяции АсШер1азта ШсИетп в дерново-подзолистой почве с внесением СаО и без внесения

Влияние растений гороха посевного на длительность выживания АсИоЫрШта 1аШанН в почве

В модельном опыте изучено влияние растений гороха посевного на поведение интродуцированной популяции А. Ы<Ясмп в черноземную почву. Установлено, что популяция сокращается в варианте с растениями и без них

(рис.7). Существенных различий между вариантами на 10 сутки посева проб не обнаружено. В следующие 5 дней в обоих вариантах снижение численности популяции незначительно. На 15 сутки выявлена существенная разница между вариантами с растениями и без растений. Вероятно, корневые выделения гороха посевного влияют на развитие микоплазм в почве в этот период. Возможно, это связано с интенсивностью корневых выделений и их составом в это время (20-дневные растения). В последующие 2 дня опыта популяция в обоих вариантах уменьшается на порядок. На 17 сутки после инокуляции микоплазм в почву различий в их численности не выявлено. Через 20 суток микоплазм в обоих вариантах не обнаружено.

10 -I

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18Чч» 20

сутки |

Рис.7 Влияние растений гороха посевного на длительность выживания АсЪо1ерШта ШсНстп в почве

Таким образом, растения гороха не оказывали существенного влияния на срок выживания А. ЫсЯстИ в почве.

Проникновение АсИоЫрШта 1шс11ан'и через корневую систему в растение гороха

Корневые эксудаты растений "привлекают" почвенные микроорганизмы к корням и способствуют более интенсивному росту микроорганизмов в

ризосфере (Звягинцев, 1987). На разных стадиях развития растений выделяются различные по составу и количеству эксудаты.

Исследовали способность А. \aidlawii проникать в растения гороха на разных стадиях развития через корни из почвы. Результаты ПЦР анализа растений гороха показали отсутствие микоплазм в листьях, стеблях и корнях растений во всех вариантах опытах.

Известно, что А laidlawii является распространенным фитопатогеном (Власов и др., 1985). В природных условиях поражаемость растения в значительной степени зависит от вида, сорта и стадии развития растения во время поражения, экологических условий, времени поражения, вида насекомого-переносчика и многих других как природных, так и антропогенных факторов (Скрипаль, 1988). По литературным данным известно, что 6-дневные проростки люцерны, зараженные А laid1стИ, через месяц погибали, а подращенные до 2-3 недель -сохраняли жизнеспособность длительное время (до 8 мес) (Мидянник, 1995). Чернов (1998) установил, что развитие заболевания, а также характер его симптомов у растений гороха, инфицированных А. laidlawii, зависят от конкретных растений и их индивидуального генотипа. Поражаемость растения зависит и от вирулентности штамма микроорганизма, т.е. его способности проникать в растение.

При изучении способности стрептомицинустойчивого штамма А. 1а 'Мсти (штамм 1) проникать через корни гороха из водной суспензии с различными титрами признаки микоплазмоза у растений визуально не наблюдали. Данные ПЦР показали, что в корнях и стеблях растений А. laidlawii отсутствует.

Известно, что потеря вирулентности для многих патогенов может произойти вследствие длительного пассирования на питательных средах (Борхсениус и др., 2002). На вирулентность фитопатогена также может влиять генетическая маркировка популяции с помощью антибиотика, так как устойчивость к антибиотику приобретается вследствие изменений генов в плазмидах. Вирулентность фитопатогенов также определяется генами в плазмиде (Шлегель, 1987). Изменение одного или группы генов может привести к мутации других.

Таким образом, стрептомицинустойчивый штамм АЛаШстИ не проявляет вирулентности по отношению к растениям гороха. Потеря вирулентности может быть связана с приобретенной антибиотикоустойчивостью штамма и его длительным пассированием на питательных средах.

Проникновение АсЪокрШта Шйкти через корневую систему в растение томата

Изучали способность А. \aidlawii (штамм 2) проникать в растение томата через корневую систему из водной суспензии (3 сорта томата) и непосредственно из почвы (сорт Манимейкер).

При изучении способности проникновения А. \aidlawii (штамм 2) из водной суспензии в растения томата результаты ПНР анализа показали присутствие А. ШЯсми во всех исследованных сортах томата, что видно на электрофореграмме (рис.8) первого срока отбора образцов через 10 дней после инфицирования растений.

947 831 564

533

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Рис.8 Электрофореграмма продуктов амплификации опытных вариантов 1 - 4 - растения томата сорта "Золотая Капля", инфицированные А \aidlawu 5 -неинфицированные растения томата сорта "Золотая Капля" (контроль). 6 - 9 - растения томата сорта "Морковный", инфицированные А ШсИами. 10 - неинфицированные растения томата сорта "Морковный" (контроль). 11 - 14 - растения томата сорта "Манимейкер", инфицированные А. 1аШ1ац>И. 15 - неинфицированные растения томата сорта "Манимейкер" (контроль). 16 - чистая культура А. ¡тЛсти (положительный контроль). 17 - маркер размеров ДНК.

В инфицированных растениях сортов Морковный и Манимейкер А. ЫсИт/п идентифицировали в течение всего срока проведения опыта - 2,5 месяца (табл.2). В растениях сорта Золотая Капля положительный ответ зарегистрирован только в первый срок - на 10-й день после инфицирования. Это, по-видимому, связано с тем, что сорт Золотая Капля обладает устойчивостью к А. ШШсмИ, подавляя дальнейшее развитие инфекционного агента с помощью механизмов активной иммунной защиты, которые включаются в ответ на проникновение фитопатогена. Полученные данные по идентификации А. 1аШ<тн в растениях разных сортов томата по срокам отбора проб представлены в таблице 2.

Таблица 2

Идентификация АсЬо1ер1а$та ШсПстИ в различных сортах томата методом лолимеразной цепной реакции (ПЦР)

Сорт томата Вариант опыта Срок отбора (дни)

10 14 | 18 22 75

Морковный инфицир. контроль + + + + +

Золотая Капля инфицир. контроль + - - - -

Манимейкер инфицир. контроль + + + + +

Таким образом, при инфицировании томата из бактериальной суспензии А. \aidlawii проникает через корневую систему в растения, мигрирует в надземные органы и длительно персистирует в них. Это показано ПЦР анализом образцов надземной части растений, которые не контактировали с микоплазмами. Штамм (2) А. Ый1см>п является вирулентным по отношению к исследованным сортам томата, которые показали различную устойчивость к инфекционному агенту.

Результаты биометрических измерений растений показали, что длина эпикотиля и площадь листовой поверхности сортов Морковный и Манимейкер больше по сравнению с контрольными растениями на 14, 18, 22 день отбора образцов. У сорта Золотая Капля достоверных различий между инфицированными и контрольными растениями по длине эпикотиля и площади листовой поверхности не выявлено (рис.9, 10). Внедрение А. laidlawii и её длительная персистенция в вегетирующих растениях томата сортов Манимейкер и Морковный оказало воздействие на их развитие, проявляющееся в более интенсивном росте. Интенсивный рост инфицированных растений свидетельствует о том, что метаболические процессы проходили активнее, что, в свою очередь, является иммунным ответом макроорганизма на присутствие микроорганизма. В течение всего срока проведения опыта инфицированные растения не обнаруживали таких симптомов как пожелтение, увядание, скручивание листьев, мелколистность, кроме более интенсивного роста растений. Колонизация тканей растений микоплазмами, как известно, может вызывать или не вызывать патологических реакций у разных индивидуумов. Это объясняется высоким естественным иммунитетом растений и благоприятными условиями для их развития.

7 6 6 4

3 2 1 О

14

18 22 дни отбора

Рис.9. Влияние инфицирования А. Ш(11т>п на длину эпикотиля растений томата

■ сорт Морковный

■ сорт Золотая капля □ сорт Манимейкер □Контроль

45,

40 ■

36.

30-

ч 26-

и 20'

16-

10 ■

5-

0'

i

14 18

дни отбора

Рис.10. Влияние инфицирования A. laidlawii на площадь листовой поверхности растений томата

Известно, что A. laidlawii способна проникать в растения люцерны и гороха из питательной среды через неповрежденную корневую систему в условиях in vitro (Иванов и др., 1992; Мидянник, 1995; Чернов, 1997; Чернов и др., 1999). Нами установлено, что A. laidlawii способна проникать в растения томата и сохраняться в почве в течение 15 дней. Это позволяет предположить, что микоплазмы могут проникать в растения через корневую систему непосредственно из почвы.

По результатам ПЦР анализа растений томата, выращенных в почве с интродуцированной популяцией A. laidlawii (Ю9КОЕ/г почвы) установлено присутствие в растениях фитоплазм во все сроки отбора образцов (10, 14, 18, 22,30 дней). A. laidlawii может проникать непосредственно из почвы в растение томата и мигрировать в надземные части растения. Проникновение микоплазмы происходит через корневую систему томата непосредственно из почвы, так как это единственное место контакта микоплазм и растений. ДНК A. laidlawii обнаружена как в подземной, так и в надземной частях томата.

Таким образом, результаты исследований показали, что A. laidlawii одинаково хорошо проникает в корневую систему растений томата, как из водной суспензии, так и непосредственно из почвы и мигрирует в надземные органы растения. A. laidlawii способна персистировать в растении, способствуя интенсивному росту растений, что обусловлено ответными реакциями организма-хозяина на инфекционный агент. Установленная способность А laidlawii проникать из почвы через корневую систему при искусственном инфицировании дает основание полагать, что фитоплазмы и в природных условиях могут проникать в растения через почву, которая может играть роль естественного резервуара и источника фитопатогенных микоплазм.

ВЫВОДЫ

1. В условиях модельных опытов разработаны методические приемы интродукции, выделения и количественного учета ахолеплазм в почве на основе проверки и сравнения ранее известных методов, заключающиеся в предварительной обработке почвенной суспензии встряхиванием в течение 10 мин, использовании питательной среды Mycoplasma Agar Base (Becton Dickinson, USA) с антибиотиком и температуры инкубации посевов 37°С.

2. Установлено, что для проведения ПЦР анализа в черноземе обыкновенном при непосредственном экстрагировании ДНК из почвы происходит ингибирование полимеразной цепной реакции, поэтому целесообразно использовать непрямой способ выделения тотальной ДНК, который заключается в предварительной десорбции клеток микроорганизмов из почвы. Метод ПЦР анализа может служить для оценки почвы как возможного источника микоплазмозного заражения.

3. Показано двумя параллельными методами (микробиологическим посевом и ПЦР), что интродуцированная популяция Acholeplasma laidlawii сохраняется в черноземе обыкновенном в течение 15 суток, а в дерново-подзолистой почве погибает в течение первых суток. Наблюдения за динамикой популяции показали, что численность интродуцированной популяции Acholeplasma laidlawii не стабилизируется. Время выживания определяется уровнем внесения популяции и факторами окружающей среды.

4. В результате исследований показано, что повышение кислотности почвы (до pH 5,1) и температуры (до 28°С) неблагоприятно влияли на развитие ахолеплазм в почве. Растения гороха посевного не оказывали существенного влияния на длительность выживания Acholeplasma laidlawii в почве.

5. Установлена способность АсЪо1ер1азта 1тй]смп проникать через корневую систему, как из водной суспензии, так и непосредственно из почвы в растения томата, а также мигрировать в надземные части растений и длительно персистировать в них (75 суток). Таким образом, почва может служить естественным резервуаром и источником фитоплазм.

6. Выявлено, что колонии стрептомицинустойчивого штамма Аско1ер1азта Шс11смИ проявляют полиморфизм, как в чистой культуре, так и при высеве из почвы. Установлена потеря вирулентности стрептомицинустойчивого штамма Аско1ер1азта ЫсИсюп, которая возможно является следствием приобретенной антибиотикоустойчивости и длительного пассирования на питательных средах.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Серебренникова J1.A. Почва как возможная среда обитания фитопатогенных микоплазм. Материалы научной конференции молодых ученых и специалистов МСХА, 2003,- С.311-319.

2. Серебренникова Л.А., Ванькова A.A., Васильева Л.В., Иванов П.И. Почва как среда обитания для фитопатогенных микоплазм (Soil as the habitat for pathogenic mycoplasmas) //11-th International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions, 2003 in Saint-Petersburg, P. 164.

3. Ванькова A.A., Серебренникова Л.А. Динамика популяции Acholeplasma laidlawii в почве. //Доклады ТСХА.- 2004. вып.276-С.288-291.

4. Ванькова A.A., Серебренникова Л.А., Карлов Г.И., Тараканов И.Г., Чергейко Г.М., Куприянов A.A. Проникновение микоплазмы Acholeplasma laidlawii из почвы в растения томата через корневую систему. В сб: Актуальные проблемы почвоведения, агрохимии и экологии.- МСХА.- 2004.-С.368-374.

Объем 1,25 п. л.

Зак. 357

Тираж 100 экз.

Центр оперативной полиграфии ФГОУ ВПО МСХА им. К. А. Тимирязева 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44

HS 1 1 3 4 о

РНБ Русский фонд

2006-4 8407

J*

i ,

t

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Серебренникова, Людмила Александровна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. УЛЬТРАФОРМЫ И НЕКУЛЬТИВИРУЕМЫЕ ФОРМЫ БАКТЕРИЙ

1.1.1. Ультраформы бактерий

1.1.2. Некультивируемые формы бактерий

1.2. СИСТЕМАТИКА МИКОПЛАЗМ

1.3. БИОЛОГИЯ МИКОПЛАЗМ

1.3.1. Морфология и ультраструктура микоплазм

1.3.2. Физиологические особенности микоплазм

1.3.3. Распространение микоплазм в природе

1.4. МИКОПЛАЗМЫ - ПАТОГЕНЫ РАСТЕНИЙ

1.4.1. Распространение микоплазмозов растений

1.4.2. Пути передачи инфекции и её сохранение

1.4.3.Микоплазмоподобные организмы (МПО) и связь их с фитоплазмами

1.5. ПОЧВА КАК СРЕДА ОБИТАНИЯ ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

1.5.1. Почва - универсальная среда обитания микроорганизмов

1.5.2. Фитопатогеные бактерии в почве

1.5.3. Патогенные бактерии в почве

1.6. МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКОПЛАЗМ

1.6.1. Микробиологический метод

1.6.2. Серологические методы

1.6.3. Молекулярно-биологические методы

1.6.4. Методы микроскопирования

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования

2.2. Методы исследования

2.3. Проведение лабораторных опытов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Методические приемы работы с микоплазмами.

3.1.1. Разработка эффективных селективных методов для выделения Acholeplasma laidlawii из почвы

3.1.2. Десорбция Acholeplasma laidlawii из почвы

3.1.3. Метод ПЦР для детекции Acholeplasma laidlawii в почве

3.2. Динамика численности и идентификация Acholeplasma laidlawii в почве

3.3. Влияние температуры и кислотности почвы на динамику численности Acholeplasma laidlawii

3.4. Влияние растений гороха посевного на длительность выживания Acholeplasma laidlawii в почве

3.5. Проникновение Acholeplasma laidlawii через корневую систему в растение гороха

3.6. Проникновение Acholeplasma laidlawii через корневую систему в растение томата

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Почва как возможная среда обитания фитопатогенных микоплазм"

Микоплазмы - простейшие лишенные клеточной стенки прокариоты, объединённые в класс Mollicutes. Малый размер генома и ограниченные биосинтетические возможности обусловили их сосуществование с клетками высших эукариот. Все известные микоплазмы, встречающиеся в природе относят к симбионтам животных, насекомых и растений. Фитопатогенные микоплазмы являются возбудителями более 600 заболеваний растений из 96 семейств (Борхсениус и др., 2002). Микоплазмозы растений широко распространены в регионах интенсивного возделывания сельскохозяйственных культур (Волгоградской, Саратовской, Астраханской областях, Краснодарском крае, на Северном Кавказе) и наносят огромный ущерб сельскому хозяйству России, снижая урожай пшеницы на 80-90%, картофеля - на 18-20%, томатов и других пасленовых на 25-38% (Власов и др., 1985, 2000; Скрипаль, 1988; Борхсениус и др., 1989; Самсонова, 2000).

Основную роль в распространении микоплазмозов растений отводят насекомым-переносчикам (Власов и др., 1985; Богоутдинов, 2001). Заболевание может передаваться также через паразитические растения, например, повилику (Яковлева, 1992). Накопителем и источником инфекции являются многолетние растения, поскольку в их корнях микоплазмы способны перезимовывать, а весной мигрировать в вегетативные органы. Фитоплазмы сохраняются зимой в многолетних сорняках, клубнях, корнеплодах, луковицах (Дементьева, 1987; Seemuller et al., 1998а; Приходько, 1999; Davies, 2000). В последние годы (Мидянник, 1995; Чернов и др., 1999) экспериментально в условиях in vitro подтверждена возможность проникновения микоплазмы Acholeplasma laidlawii через неповрежденную корневую систему люцерны и гороха в надземную часть растений. Этот факт позволяет предположить существование совершенно иного механизма передачи инфекции - через корневую систему непосредственно из почвы, которая может играть роль естественного резервуара фитопатогенных микоплазм.

Проведение экологических исследований микоплазм, изучение возможности их обитания в почве и механизмов инфицирования растений своевременно, так как позволит разработать эффективные меры предотвращения заболеваний растений и решить проблемы управления микоплазменными инфекциями.

Цель работы - выяснить пригодность почвы как среды обитания фитопатогенных микоплазм, изучить динамику численности интродуцированной популяции микоплазм в почве и возможность проникновения микоплазм из почвы в растение через корневую систему.

Задачи исследования:

• Разработка эффективных селективных методов выявления и количественного учета микоплазм в почве.

• Применение метода ПЦР для идентификации микоплазм в черноземной почве.

• Определение динамики численности интродуцированной популяции микоплазм в почве.

• Изучение влияния абиотических и биотических факторов среды на численность интродуцированной популяции Acholeplasma laidlawii в почве.

• Изучение возможности проникновения микоплазм из почвы в растение через корневую систему.

Научная новизна. Разработаны и впервые применены селективные приемы выделения микоплазм из почвы, заключающиеся в механической предварительной обработке почвы, использовании селективной среды и повышенной температуры инкубации посевов. Впервые экспериментально установлено, что почва может играть роль естественного резервуара и источника фитопатогенных микоплазм. Длительность выживания микоплазм в почве зависит от типа почвы. Показано, что Acholeplasma laidlawii способна проникать непосредственно из почвы в растения через корневую систему, мигрировать в надземные ткани растения и длительно персистировать в них, вызывая специфические морфологические изменения растений.

Практическая значимость. В результате проделанной работы разработаны методические подходы для выявления и количественного учета микоплазм в почве. Использованы метод посева на селективную питательную среду и ПЦР-анализ. Установлено, что для проведения ПЦР в черноземной почве целесообразно использовать непрямой способ выделения ДНК, так как при непосредственном экстрагировании ДНК из почвы происходит ингибирование полимеразной цепной реакции. Рекомендованные методы могут быть использованы в экологических исследованиях микоплазм в почве, что пополнит наши знания об этой малоизученной группе микроорганизмов, а также о биоразнообразии почв; в сельском хозяйстве для диагностики возбудителей болезней растений при разработке мер борьбы с микоплазмозами и предотвращения эпифитотий.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на 11-м Международном конгрессе по молекулярным взаимодействиям между растениями и микроорганизмами (Санкт-Петербург, 2003); конференции молодых ученых и специалистов МСХА (Москва, 2003); научной конференции МСХА (Москва, 2004).

Публикации. Материалы диссертации изложены в 4 печатных работах.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Серебренникова, Людмила Александровна

ВЫВОДЫ

1. В условиях модельных опытов разработаны методические приемы интродукции, выделения и количественного учета ахолеплазм в почве на основе проверки и сравнения ранее известных методов, заключающиеся в предварительной обработке почвенной суспензии встряхиванием в течение 10 мин, использовании питательной среды Mycoplasma Agar Base (Becton Dickinson, USA) с антибиотиком и температуры инкубации посевов 37°С.

2. Установлено, что для проведения ПЦР анализа в черноземе обыкновенном при непосредственном экстрагировании ДНК из почвы происходит ингибирование полимеразной цепной реакции, поэтому целесообразно использовать непрямой способ выделения тотальной ДНК, который заключается в предварительной десорбции клеток микроорганизмов из почвы. Метод ПЦР анализа может служить для оценки почвы как возможного источника микоплазмозного заражения.

3. Показано двумя параллельными методами (микробиологическим посевом и ПЦР), что интродуцированная популяция Acholeplasma laidlawii сохраняется в черноземе обыкновенном в течение 15 суток, а в дерново-подзолистой почве погибает в течение первых суток. Наблюдения за динамикой популяции показали, что численность интродуцированной популяции Acholeplasma laidlawii не стабилизируется. Время выживания определяется уровнем внесения популяции и факторами окружающей среды.

4. В результате исследований показано, что повышение кислотности почвы (до рН 5,1) и температуры (до 28°С) неблагоприятно влияли на развитие ахолеплазм в почве. Растения гороха посевного не оказывали существенного влияния на длительность выживания Acholeplasma laidlawii в почве.

5. Установлена способность Acholeplasma laidlawii проникать через корневую систему, как из водной суспензии, так и непосредственно из почвы в растения томата, а также мигрировать в надземные части растений и длительно персистировать в них (75 суток). Таким образом, почва может служить естественным резервуаром и источником фитоплазм.

6. Выявлено, что колонии стрептомицинустойчивого штамма Acholeplasma laidlawii проявляют полиморфизм, как в чистой культуре, так и при высеве из почвы. Установлена потеря вирулентности стрептомицинустойчивого штамма Acholeplasma laidlawii, которая возможно является следствием приобретенной антибиотикоустойчивости и длительного пассирования на питательных средах.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Серебренникова, Людмила Александровна, Москва

1. Агарков В.А., Кияшко А.В., Олейник А.Н. Вирусные болезни сельскохозяйственных растений и меры борьбы с ними.-Киев: Наукова Думка, 1966.- 364с.

2. Аксенов М.Ю., Гаровникова Ю.С., Левина Г.А., Романова Ю.М.,

3. Гинсбург А.Л., Прозоровский С.В. Некультивируемые формы Salmonella typhimurium: применение метода ПЦР для изучения процесса их формирования в сапрофической фазе. В сборнике: Патогенные бактерии в сообществах. М.,1994(б).-С. 142-149.

4. Ананьина Н.Д., Никитин Д.И. Размер клеток бактерий в некоторых почвах// Почвоведение.-1979.-JN24.-C. 132-135.

5. Асфур А.З. Сравнительный анализ численности мелких и крупных форм ^ бактерий в дерново-подзолистой почве: Автореф .канд. биологич. наук.1. М.,1992.-24с.

6. Балашова В.В. Микоплазмы и железобактерии. -М.: Наука,1974.- 64с.

7. Балашова В.В., Заварзин Г.А. Окисление железа Mycoplasma laidlawii// Микробиология.-1972.№41 .-С.909.

8. Беляков В.Д., Голубев Д.Б., Каминский Г.Д., Тец В.В. Саморегуляция паразитарных систем. -Л.:Медицина, 1987.-240 с.

9. Беляков В.Д., Литвин В.Ю., Емельяненко Е.Н., Пушкарева В.И. Патогенные бактерии, общие для человека и растений. Сб.: Патогенные бактерии в сообществах. М.,Росагросервис,1994.-С.11-24.

10. Ю.Беляков В.Д., Ряпис Л.А.//Экология возбудителей сапроценозов.-М., НИИЭМ, 1988.-С.7-20.

11. Богоутдинов Д.З. К вопросу о переносчиках фитоплазмозов картофеля. В сборнике: Проблемы сел. хоз-ва и пути их решения.-Самара, 2000.-С.141-143.

12. Богоутдинов Д.З. Фитоплазмозы картофеля// Агро ХХ1.-2001.-№7.-СЛ0.

13. Борхсениус С.Н., Чернова О.А., Чернов В.М., Вонский М.С. Микоплазмы. -С.-Пб:Наука,2002.-320с.

14. Борхсениус С.Н., Чернова О.А. Микоплазмы. -Л.:Наука, 1989.-170с.

15. Бызов Б.А. Трофо-динамические взаимодействия микроорганизмов и животных в почве. В сборнике: Перспективы развития почвенной биологии.М.,2001, С.108-133.

16. Вайнштейн М.Б.,Кудряшова Е.Б. О наннобактериях// Микробиология.-2000.-Т.69.№2.-С. 163-174.

17. Вельков В.В. О генетической стратегии выживаемости микроорганизмов в окружающей среде. В сборнике: Интродукция микроорганизмов в окружающую среду. М.Д994.-С.23.

18. Власов Ю.И. Микоплазменные болезни картофеля и томатов. В сборнике: Бактериальные болезни картофеля и овощных культур и методы борьбы с ними. М., НИИФ, 1994.-С.24-26.

19. Власов Ю.И., Гените Л.П., Самсонова JI.H. Ахолеплазмы-патогены растений. Вильнюс: Мин-во сельского хозяйства Литовской ССР, 1985.-76с.

20. Власов Ю.И., Самсонова Л.Н. Об устойчивости томатов к фитоплазменному заболеванию столбуру// Вестник защиты растений.-2000.№2.-С.26-28.

21. Вовк A.M., Никифорова Г.С. Исследование вируса столбура в электронном микроскопе: Докл. АН СССР.-1955.-Тю 102. №4.-0.839-840.

22. Гинсбург А.Л., Романова Ю.М., Алексеева Н.В. и др. Механизм действия и природа факторов, индуцирующих образование некультивируюмых форм у

23. Salmonella typhimuriumhОКурн. микробиол. эпидемиол. и иммуноб.-1999.№6.-СЗ-8.

24. Гиоргидзе Д., Алексидзе Г. Прогноз оправдался//3ащита и карантин растений.-2003.№1.-С.ЗЗ.

25. Головлев Е.Л. Другое состояние неспорулирующих бактерий//Микробиология.- 1998. Том.67.№6.-С.725-735.

26. Госманов Р.Г. Некультивируемые формы микроорганизмы и их роль в сохранении инфекции во внешней среде. В Трудах Второго съезда ветеринарных вврачей респ. Татарстан.-Казань, 2000.-С.271-276.

27. Гузев B.C., Звягинцев Д.Г. Биометрический анализ клеток бактерий в почве//Микробиология.-2003 .-Т.72.№2.-С.221 -227.

28. Дементьева М.И. Фитопатология.-М.:Агропромиздат.-1985.-397с.

29. Добровольская Т.Г. Структура бактериальных сообществ почв.-М.:Академкнига,2002.-282с.

30. Добровольская Т.Г., Лысак Л.В., Звягинцев Д.Г. Почвы и микробное разнообразие/ЯТочвоведение ,-1996.№6.-С.699-704.

31. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках.-М.: Изд-во МГУ, 1994.-512с.

32. Емельяненко Е.Н. Некультивируемые формы иерсиний и листерий впочве и при взаимодействии с растениями: автореф.канд.биол.наук.1. М.,1997.-23с.

33. Емельяненко Е.Н., Аксенов М.Ю., Гинсбург А.Л., Литвин В.Ю. Полимеразная цепная реакция как метод изучения некультивируемых форм иерсиний в окружающей среде. В сборнике: Патогенные бактерии в сообществах. М.,1994 (а).-С. 135-139.

34. Звягинцев Д.Г. Анабиоз у микроорганизмов как регулятор скорости микробиологических процессов в почве. Тез. докл. 3 съезда докучаевского общества почвоведов.-Суздаль,2000.-кн.2.-С. 19-20.(3 81с.)

35. Звягинцев Д.Г. Почва и микроорганизмы. М.: Изд-во Моск. Универ., 1987.-256с.

36. Звягинцев Д.Г. Почва и микроорганизмы.-М.:МГУ,1987.-256с.

37. Звягинцев Д.Г. Теоретические аспекты проблемы интродукции микроорганизмов в окружающую среду. В сборнике: Интродукция микроорганизмов в окружающую среду. М.,1994.-С.37-39.

38. Звягинцев Д.Г., Гиличинский Д.А., Благодатский С.А., Воробьева Е.А. и др. Длительность сохранения микроорганизмов в постоянно мерзлых осадочных породах и погребенных почвах// Микробиология.-1985.-Т.54.№1.-С.155-161.

39. Звягинцев Д.Г., Добровольская Т.Г., Лысак Л.В. Растения как центры формирования бактериальных сообществ// Журн. общей биологии.-1993 .-Т.54.№2.-С. 182-200.

40. Зизангирова Н.А., Раковская И.В., Гинсбург А.Л., Прозоровский С.В. Влияние изменений условий культивирования на амплификацию различных генов Mycoplasma pneumoniaeII Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиолог.-1994.-прилож.(авг-сент.).-С.40-44.

41. Каменева Т.Г., Мишустина И.Е., Калюжная Т.В. Ультраструктура фильтрующихся форм морской сапрофитной азотфиксирующей спирохеты Treponema hyponeustonicumll Изв.АН СССР, сер. биол.-1985.-С.614-615.

42. Кауричев И.С., Панов Н.П., Розов Н.Н. и др. Почвоведение.-М.:Агропромиздат, 1989.-720с.

43. Ковалев Н.А., Ботлак В.М. Этиологическая роль микоплазм при респираторных заболеваниях телят. Материалы международной научно-практической конференции.-Минск: Белор. НИИ эксперим. ветерин., 2000.-С.287-288.

44. Кожевин П.А. Популяционная экология почвенных микроорганизмов: Автореф. . докт.биол.наук. М.,2000.-55с.

45. Кожевин П.А. Микробные популяции в природе.М.:Изд.МГУ,1989.-175с.

46. Куличева Н.Н., Лысак Л.В., Кожевин П.А., Звягинцев Д.Г. Бактерии в почве, опаде и филлоплане городской экосистемы// Микробиол.-1996.-Т.65.ЖЗ.-С.416-420.

47. Лазарев A.M., Базлеева Т.В. Черная ножка картофеля. В сборнике: Бактериальные болезни картофеля и овощных культур и методы борьбы с ними. М., НИИФД994.-С.5-16.

48. Литвин В.Ю. Экосистемный пусковой механизм. Эпидемиологические проявления сапронозов (на примере холеры эльтор)// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиолог.-1996.-№3.-С.11-15.

49. Литвин В.Ю., Гинсбург А. Л., Пушкарева В.И., Романова Ю.М. Обратимый переход патогенных бактерий в покоящееся (некультивируемое) состояние: экологические и генетические механизмы// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиолог.-2000.- С.7-13.

50. Литвин В.Ю., Пушкарева В.И. Факторы патогенности бактерий: функции в окружающей среде// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиолог.-1994.прилож.(авг.-сент.).-С.83-87.

51. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. -М.: Изд. "Мир", 1984.-480с.

52. Матвеева Е.В. Бурая гниль картофеля. В сборнике: Бактериальные болезни картофеля и овощных культур и методы борьбы с ними. М., НИИФ, 1994.-С. 17-23.

53. Мельников В.А., Раковская И.В. Фракционирование популяции M.laidlawii в градиенте плотности урографина // Микробиология.-1971.№3.-С.567.

54. Мидянник Г.А. Пути инфицирования микоплазмами растений люцерны и их влияние на образование и эффективность бобово-ризобиального симбиоза: Диссертация .канд.биолог.наук. М.,1995.-235с.

55. Микоплазмы в патологии животных/ Под ред. Г.Ф. Коромыслова, Я. Месароша, JL Штипковича.- М.: Агропромиздат,1987.-255с.

56. Микрофлора почв северной и средней части СССР/Отв.ред. Мишустин Е.Н.-М.:Изд-во «Наука», 1966.-400с.

57. Мишустина И. Е., Калюжная Т. В. Ультрамикроформы бактерий в почве и море//Изв. АН СССР, сер. биол.-1987. №5.-С.686-700.

58. Мишустина И.Е., Россова Э.Я., Батурина М.В. Электронная микроскопия и изучение бактериального населения и ультрамикроскопических форм в морской воде// Изв.АН СССР, сер. биол.-1976.№6.-С.840-848.

59. Мишустина И.Е., Батурина М.В. Ультрамикроорганизмы и органическое вещество океана.-М.:Изд. Наука, 1984.-94с.

60. Мишустина И.Е., Широколобова Т.И. Бактерии субмикронных размеров в воде, илах литоральной отмели и на поверхности макрофитов в Баренцевом море//Доклады АН РАН.-1999.-Т.365.-С.157-159.

61. Муромцев С.Н. Фильтрующиеся формы микроорганизмов и ультравирусы //Ж. общей биологии.-1951 .-Т. 12.№3 .-С. 161 -175.

62. Никитин Д.И., Васильева JI.B., Лохмачева Р.А. Новые и редкие формы почвенных микроорганизмов. М.: Наука, 1966.

63. Новогрудский Д.М. О фильтрующихся формах азотобактера// Микробиология.-1935 .-Т.4.вып.2.-С. 176-192.

64. Определитель бактерий Берджи /Под ред. Дж.Хоулта, Н.Крига, П.Снита, Дж.Стейли и С.Уилльямса.-М.: Мир, 1997.Т.2.-С.710-722.

65. Приходько Ю.Н. Вирусные и фитоплазменные болезни малины//3ащита и карантин растений.-1999.-№ 1 .-С.З 8-39.

66. Прозоровский С.В. Медицинская микоплазмология.- М.: Медицина, 1995.-225с.

67. Прозоровский С.В. Руководство по эпидемиологии инфекционных болезней.-М. :Медицина, 1993.-35 6с.

68. Прозоровский С.В., Вульфович Ю.В., Раковская И.В., Горина Л.Г. Некоторые механизмы персистенции in vivo микоплазм и L-форм бактерий// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиолог.-1994.-прилож.(авг-сент.).-С. 14-18.

69. Прозоровский С.В., Кац Л.Н., Каган Г.Я. L-формы бактерий. Механизм образования, структура, роль в патологии. -М.:Медицина, 1981.-327 с.

70. Прозоровский С.В., Раковская И.В., Вульфович Ю.В. Медицинская микоплазмология.-М.,1995.-288с.

71. Пушкарева В.И. , Емельяненко Е.Н., Диденко Л.В. и др.//Журн. микробиол.-1998.№5 .-С.9-13.

72. Пушкарева В.И., Литвин В.Ю., Шустрова Н.М. Гидробионты как хозяева псевдотуберкулезного микроба: экспериментальное исследование. В Сборнике: Патогенные бактерии в сообществах.М.-1994(а).-С.74-84.

73. Пушкарева В.И., Емельяненко Е.Н., Литвин В.Ю. и др. Патогенные листерии в почве и в ассоциации с водорослями: обратимый переход в некультивируемое состояние//Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.-1997.№3.-C.3-6.

74. Пушкарева В.И., Константинова Н.Д., Тартаковский И.С., Бархатова О.И., Литвин В.Ю. Численность и изменчивость листерий в сообществе с инфузориями. В сборнике: Патогенные бактерии в сообществах.М.-1994(a).-С.48-55.

75. Пушкарева В.И., Троицкая В.В. Спонтанная зараженность некоторых гидробионтов потенциально патогенными бактериями. В сборнике: Патогенные бактерии в сообществах.М.- 1994(б).-С.70-74.

76. Раковская И.В. Микоплазмы и микоплазмозы человека. Руководство для врачей.- М.:ЗАО "Ниармедик-плюс", 1999.-51с.

77. Романова Ю.М, Гинсбург А.Л. Генетический контроль индукции некультивируемого состояния у патогенных бактерий// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиолог.-1996.-№3.-С.16-18.

78. Самсонова А.П., Ананьина Ю.В., Аксенов М.Ю. и др. Метод Полимеразной цепной реакции в изучении гостальной персистенции патогенных лептоспир//Молек.генетика микробиология и вирусология.-1994.-№ 1 .-С. 19-23.

79. Самсонова Л.Н. Вредоностность и распространение фитоплазмозов// Агро ХХ1.-2000.-№5.-С.4-5.

80. Самсонова JI.H., Цыпленков А.Е., Якуткина Т.А. Диагностика вирусных и фитоплазменных болезней овощных культур и картофеля.-СПб.: ВИЗР, ООО «Инновационный центр защиты растений», 2001.-48с.

81. Скрипаль И.Г. Микроорганизмы возбудители болезней растений. В: Микоплазмы Киев: Наукова Думка, 1988.-С.326-372.

82. Стачева И. Атлас болезней сельскохозяйственных культур.-Болгария. София: Пенсофт, 2002.-196с.

83. Сучков Ю.Г., Худяков И.В., Емельяненко Е.Н. и др.// Журн. микробиол.-1997.№4.-С.42-46.

84. Тарчевский И.А., Чернов В.М. Молекулярные аспекты фитоиммунитета //Микол.и фитопатол.-2000.-Т.34.№3 .-С. 1-10.

85. Третьякова Е.Б., Добровольская Т.Г., Бызов Б.А., Звягинцев Д.Г. Сообщества бактерий, ассоциированные с почвенными беспозвоночными// Микробиол.-1996.-Т.65 .№ 1 .-С. 102-110.

86. Турова Г.П. Попытки идентификации некоторых щелочеобразующих бактерий с помощью метода молекулярной гибридизации ДНК-ДНК,, Науч.докл.высш.школы. Биол. науки.-1978.-Т.1.-С.35-37.

87. Уикли Б.Электронная микроскопия для начинающих.-М.:Мир,1975.-325с.

88. Федотина В.Л. Микоплазмоподобные организмы в плодах столбурных томатов// Сельск. Биол.-1973ю-Том.8.№5.-С.701-703.

89. Чернов В.М., Гоголев Ю.В., Попова Н.В., Чернова О.А. Генетическая изменчивость микоплазм (Acholeplasma laidlawii) при взаимодействии их с эукариотами ('Pisum ^/умш)//ДАН.-1999.Т.369.-С.275-277.

90. Чернов В.М. Морфофизиологические и молекулярные аспекты взаимодействия микоплазм (Acholeplasma laidlawii) и растений: Дисс. . докт. биол. наук. М., 1998.-186 с.

91. Чернов В.М., Мухаметшина Н.Е., Гоголев Ю.В., Абдрахимов Ф.А., Чернова О.А. Адаптивные реакции микоплазм in vitro: "жизнеспособные, нонекультивируемые формы" и нанноклетки Acholeplasma laidlawii// Микробиология.-2005.Т.75.- №2.-С.

92. Чернов В.М., Чернова О.А. Микоплазменные инфекции как возможный фактор генетических изменений в клетках высших эукариот// Цитология.-1996. Т.38. №2.- С.107-114.

93. Чернова О.А., Борхсениус С.Н., Меркулов Н.А. Рибосомные гены -единственные гомологичные участки ДНК у некоторых микоплазм/ТМолекляр. генетика, вирусология и микробиология.-1986.-Т.9.-С. 16-22.

94. Чернова О.А. Биохимические и молекулярно-генетические аспекты персистенции микоплазм у человека //Успехи биологической химии. 1999. Т.39- С. 103-140

95. Ю1.Чулаков Ш.А., Тхань Т.Ф. Электронно-микроскопические формы микроорганизмов в почвах вертикальных зон Катменского хребта. Сб.: Плодородие почв Казахстана, 1989.-Т.5.-С.117-122.

96. Чхаидзе Н. М., Степанишвили Н. А., Алпаидзе JI. Ш., Метревели Д. К. Некоторые физиологические механизмы устойчивости шелковицы (Morus) к карликовости: Тез. докл. Т.1. Междунар. конф. "Физиол. раст.- наука 3-го тысячелетия" .-М., 1999.-С.247.

97. Шестобоев Н.К. Микоплазмоподобные структуры в подзолистых почвах южнотаежного Прииртышья // Микробиология.-1975.вып.З.-T.XLIV.№44.-С.476-480.

98. Шлегель Г. Общая микробиология. -М.: Мир, 1987.-566с. Ю5.Шпаар Д., Эллмер Ф., Постников А.Н. и др. Зернобобовые культуры.-Минск: "ФУА информ", 2000.-264с.

99. Яковлева Н.П. Фитопатология.-М.: Колос, 1992.-3 84с.

100. Abou-Jawdah Y., Karakashian A., Sobh H., Martini M., Lee I.M. An epidemic of almond witches'-broom in Lebanon: classification and phylogeneticrelationships of the associated phytoplasma//Plant Disease.-2002.-Vol.86.№5.-P.477-484.

101. Adams M.W.W. The influence of environment and metabolic capacity on the size of a microorganism: In «Size Limit of Very Small microorganisms// National Academy of Sciences. Washington.- 2001. DC.

102. Albanese G., Polizzi G., Grimaldi V., Collodoro S. et al. Detection and molecular identificatio of a Phytoplasma in diseased tomato plants in Calabia (Italy)// Phytopathol. mediferr.-1998.-Vol.37.№2.-P.83-87.

103. Angeline E., Clair D., Borgo M., Bertaccini A., Boudon-Padieu E. Flavescence doree in France and Italy — Occurrence of closely related phytoplasma isolates and yellows and an alder yellows phytoplasma//Vitis.-2001.-Vol.40.№2.P. 79-86.

104. Avila F.J., Bruton B.D., Fletcher J. et al. Polymerase chain reaction detection and phylogenetic characterization of an agent associated with yellow vine disease of cucurbits//Phytopathol.-1998.-Vol.88.-P.428-436.

105. Avinent L., Llacer G., Almacellas J., Tora R. Pear decline in Spain// Plant Pathol.-1997.-Vol.46.№5 .-P.694-698.

106. ПЗ.Вае H.C., Cota-Robles E.H., Casida L.E. Microflora of soil as viewed by transmission electron microcopy// Appl. Microbiol.-1972.-Vol.23.-P.637-648.

107. Baseman J.B., Tully J.G. Mycoplasmas: Sophisticated, Reemerging and Burdened by their Notoriety// Emerging Infect. Dis.- 1997.- Vol.3. №l.-p.21-32.

108. Bertaccini A., Franova J., Paltrinieri S. et al.//Leek proliferation: a new phytoplasma disease in the Czech Republic and Italy//// Europ. J. Plant Pathol.-1999.-Vol. 105 .№5.-P.487-493.

109. Bjorklund M., Ciftcioglu N., Kajander E.O. Extraordinary survival of nanobacteria under extrime conditions// Instruments, Methods and Missions for Astrobiology.-1998.-Vol.3441 .-P. 123-129.

110. Bojnansky V., Kosljavora V.The influence of stolbur on the yield of potato crop// Sbod. CSAZV-Rost. Vyr.- 1959.-Vol.5№l.-P.125-140.

111. Bowyer J.W., Atherton J.G. Mycoplasma-like bodies in French Bean, Dodder, and the leafhopper vector of the Legume little leaf agent// Aust. J. Biol. Scien.-197 l.-Vol.24.-P.717-729.

112. Bradfute, О. E., Tsai, J. H., and Gordon, D. T. Corn stunt spiroplasma and viruses associated with a maize disease epidemic in southern Florida//Plant Dis.-1981.-Vol.65.-P.837-841.

113. Casida L.E. Small cells in pure cultures of Agromyces ramosus and in natural soil// Can. J.Microbiol.-1977.-Vol.23 .-P.214-216.

114. Chen M.F., Lin C. DNA probes and PCR primers for the detection of a /0 phytoplasma associated with peanut witches'-broom// Europ. J. Plant Pathol.1997.-Vol. 103 .№2.-P. 137-145.

115. Ciftcioglu N., Bjorklund M., Kajander E.O. Stone formation and calcification by Nanobacteria in human body// Instruments, Methods and Missions for Astrobiology.-1998.-Vol.3441.-P. 105-11 l.(a)

116. Ciftcioglu N., Ciftcioglu V., Vali H., Turcott E., Kajander E.O. Sedimentary rocks in our mouth: dental pulp stones made by nanobacteria// Instruments, Methods and Missions for Astrobiology.-1998.-Vol.3441.-P.130-136.(b)

117. Clark T.B., Whitcomb R.F. Pathogenicity of Mollicutes for insects: possible use in biological control// Ann. Microbiol. -1984.-Vol.135.-P. 141-150.

118. Csillery G., Szarka J., Rusko S., Sulee S. et al. Yellowing of pepper// Zoldssegtermeszt. Kut. Int. Bull., Kecskemet.-1995.-Vol.27.-P.19-25.

119. Davies D.L. The occurrence of two phytoplasmas associated with stunted Rubus species in the UK// Plant Pathol.-2000.-Vol.49.№l.-P.86-88.

120. DelSerone P., Bianchi E., Liberatoro A. Outbreak of apricot chlorotic leaf roll ^ in apricot or chards of Latium Italy// Phytopathol. mediferr.-1998.-Vol.37.№3.1. P.133-139.

121. Deng S., Hiruki C. Genetic relatedness between two nonculturable mycoplasmal ike organisms revealed by nucleic acid hybridization and polymerase chain reaction//Phytopathology.-1991 .-Vol.81 .№ 12.-P. 1475-1479.

122. Dienes L. Morphologic elements in the halo of subtilis colonies// Soc. Exper. Biol. And Med.-1933.-Vol.31.-P.1211. ^ 130. Dienes L., Weinberger H. The L-forms of bacteria //Bacterid. Rev.-1951.1. Vol. 15.-P.245-288.

123. Dojka M. A., Harris J. K., Pace N. L. Expanding the known diversity and environmental distribution of an uncultured phylogenetic division of bacteria//Appl. and Environ. Microbiol.-2000.-Vol.66.№4.-P.1617-1621.

124. Edward D.G., Freundt E.A. Amended nomenclature for strains related to M.laidlawii//J.Gen.Microbiol.-1970.-Vol.62.-P.l-2.

125. Elton R.A. The relationship of DNA base composition and individual protein compositions in microorganisms //J. Mol. Evol.-1973.-Vol.2.- P.263-276.

126. Folk R.L. Nanobacteria: surely not figments, but what under heaven are they? //Nat. Sci.-1997. №l(3).-P.l-4.

127. Folk R.L. SEM imaging of bacteria and nannobacteria in carbonate sediments and rocks// J.Sediment. Petrol.-1993. №63.- P.990-999.

128. Folk R.L., Lynch F.L. Carbonaceous objects resembling nannobacteria in the Allende meteorite // Instruments, Methods and Missions for Astrobiology.-1998.-Vol.3441.-P.112-116.

129. Folk R.L., Lynch F.L. The possible role of nannobacteria (dwarf bacteria) in clay mineral diagenesis and the importance of careful sample preparation //J. Sed.m Res.-1997.-Vol.67.-P.597-603.

130. Freitag J.H., Aldrich T.M., Drake R.M. The control of the spread of aster yellows virus to selery // Mededelinger van de Landbouwhogeschool en de orzvekings van de Staat te Gent.- 1962.-Deel.27.№3.-P.1047-1052.

131. Gamier M., Foissac X., Gaurivaud P., Laigret F. et al. Mycoplasmas, plants, insect vectors: a matrimonial triangle//Life Sciences.-2001.-Vol.324.-P.923-928.

132. Gatineau F., Jacob N., Vautrin S. et al. Associated with the syndrome "basses richesses" of sugar beet of a phytoplasma and a bacterium-like organism transmitted by a Pentastiridius sp.// Phytopathol.-2002.-Vol.92.№4.-P.384-392.

133. Hildebrand M., Tebbe C.C., Geider К.// J. Phytopathology.-2001/-Vol.l49.№l 1/12.-P.635-639.

134. Himmelreich R., Hilbert H., Plagens H., Pirkl E., Li B.C., Herrmann R. Complete sequence analysis of the genome of the bacterium mycoplasma pneumoniae//Nucleic Acid Res.- 1996.-Vol.24.-P.4420-4449.

135. Hjelm E. Meningitis in a newborn infant caused by Mycoplasma hominis//Acta paediat.scand.-1980.-Vol.69.-P.415-418.

136. Hutchinson III C.A., Peterson S.N., Gill S.R., Cline R.T. et al. Global transposon mutagenesis and a minimal Mycoplasma genome// Science.-1999.-Vol.286.-P2165-2169.

137. Ibekwe AM, Grieve CM, Lyon SR. Characterization of microbial communities and composition in constructed dairy wetland wastewater effluent// Appl. Environ. Microbiol.-2003.-Vol.69.№9.-P.5060-5069.

138. Jagouix S., Bove J.M., Gamier M. The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the ^-subdivision of the Proteobacteria//Int.J.Syst. Bact.-1994.-Vol.44.P.379-386.

139. Jung H., Sawayanagi Т., Wongkaew P. et al., "Candidatus phytoplasma oryzae", a novel phytoplasma taxon associated with rice yellow dwarf disease//Inter. J. System. Evolution. Microbiol.-2003.-Vol.53.-P. 1925-1929.

140. Kahn M.C. A developmental cycle of the tubercle bacillus as revealed by single-cell studies //Am. Rev. Tuberc.-1929. Vol.20.-P. 150-200.

141. Kajander E.O., Bjorklund M., Ciftcioglu N. Mineralization by Nanobacteria// Instruments, Methods and Missions for Astrobiology.-1998.-Vol.3441.-P.95-99.(b)

142. Kajander E.O., Ciftcioglu N. Nanobacteria: an alternative mechanism for pathogenic intra- and extracellular calcification and stone formation// Proc. Natl. Acad. Sci.-1998.Vol.95.-P.8274-8279.(a)

143. Kajander E.O., Kuronen I., Akerman K., Pelttari A., Ciftcioglu N. Nanobacteria from blood, the smallest cultivable autonomously replicating agent on Earth// SPIE Proceedings 311 l.-1997.-p.420-428.

144. Kaminska M., Sliwa H., Rudzinska-Langwald A.P. The association of phytoplasma with stunting, leaf necrosis and witches' broom symptoms in Magnolia plants//J. ofPhytopathol.-2001.-Vol. 149.(1 l-12).-P.719-724.

145. Khan A.J., Botti S., Al-Subhi A.M. et al. Molecular identification of a new phytoplasma associated with alfalfa witches'-broom in Oman//Phytopathology.-2002.-Vol.92.№10.-P. 1038-1047.

146. Kita M., Ohmoto Y., Hirai Y. et al. Induction of cytokines in human peripheral blood mononuclear cells by mycoplasmas// Microbiol.Immunol.-1992.-Vol.36.-P.507-516.

147. Klieneberger-Nobel E. Filtrable forms of bacteria // Bacteriol. Rev.-1951.-Vol.l5.-P.73-103.

148. Koch A.L. Annu. Rev. Microbiol.- 1996.-Vol.50.-P.317-319.

149. Kocks C.G., Ruissen M.A., Zadoks S.C., Duijkers M.G. Survival and extinction of Xanthomonas campestris pv. campestris in soiI//Europ. J. of Plant Pathology.-1998.-Vol. 104.№9.-P.911 -923.

150. Kong F., James G., Gordon S., Zelenski A., Gilbert L.G. Species specific PCR for identification of common contaminant Mollicutes in cell culture// Appl. and Environm. Microbiol.-2001 .-Vol.67.-№7.-P.3195-3200.

151. Kong F., James G.,Gordon S., Zelynski A., Gilbert G.L. Species-Specific PCR for Identification of Common Contaminant Mollicutes in Cell Culture//Applied and Environm. Microbiol.-2001.-Vol.67.№7.-P.3195-3200.

152. Kuske C.R., KirkpatrickB.C. Phylogenetic relationships between the western aster yellows mycoplasmalike organisms and other prokaryotes established by 16S r RNA gene sequence//Int.J.Syst.Bacteriol.-1992.-Vol.42.-P.226-233.

153. Laidlaw P.P.F.R.S., Elford W. J. A new group of filterable organisms// Proc. Roy. Soc.-1936.-Vol.120.-P.292.

154. Lee I., Pastore M., Vibio M., Danielli A., et al. Detection and characterization of a phytoplasma associated with annual grass (Poa annua) white leaf disease in southern Italy//Europ. J. Plant Pathol.-1997.-Vol.l03.№3.-P.251-254.

155. Lim P.O., Sears B.B. Evolutionary relationships of a plant-pathogenic mycoplasmalike organism and Acholeplasma laidlawii deduced from two ribosomal protein gene sequences//J.Bact.-2002.-Vol.l74.№8.-P.2606.

156. MacDonell M.T., Hood M.A. Isolation and characterization of ultramicrobacteria from a Gulf Coast estuary // Appl. Environ. Microbiol.-1982. Vol.43.-P.566-571.

157. Maixner M., Rudel M., Daire X., Boudon-Padien E. Diversity of grapevine yellows in Germany//Vitis.-1995.-Bd.34H.4.-S.235-236.

158. Maniloff J. Molecular biology and pathogenesis. In: Mycoplasmas.-Washington: ASM,1992.-P.549-559.

159. Maniloff J., Nealson K.H., Psenner R., Loferer M., Folk R.L. Nannobacteria: Size Limits and Evidence// The American Association for the Advancement of Science.- 1997.- Vol.276. №5320.-P. 1773-1776.

160. Maramorosch K.Spiroplasmas: agents of animal and plant diseases // Bioscience.-1981 .-Vol.31 .-P.374-380.

161. Marcone C., Netmark H., Ragozzino A., Layer U., Seemuller E. Chromosome sizes of phytoplasmas composing major phylogenetic groups and subgroups// Phytopathology.-1999.-Vol.89.№9.-P.805-810.

162. McCoy R.E., Caudwell A., Chang C.J. et al. Plant diseases associated with mycoplasma-like organisms//The Mycoplasmas/ Eds R.F. Whitcomb, J.G. Tully.-New York:Acad.Press,1989.-Vol.5.-P.545-622.

163. Melcher U., Fletcher J. Genetic variation in Spiroplasma citri // Europ. J. Plant Pathol.-1999.-Vol. 105.№6.-P.519-533.

164. Mishustina I.E., Baitaz O.I. et al. Microorganisms and nanoorganisms in the ocean on the example of the Barents Sea// Instruments, methods and missions for Astrobiology.-2003.-Vol.4939.-P. 182-190.

165. Musetti R., Favali M.A., Pressacco L. Histopathology and polyphenol content in plants infected by phytoplasmas// Cytobios.-2000.-Vol.l02.№401.-P.133-147.

166. Mushegian A.R., Koonin Т. V. A minimal gene set for cellular life derived by comparison of complete bacterial genomes // Proc. Natl. Acad. Sci.USA.-1996.-Vol.93.-P. 10268-10273.

167. Nagatomo H., Takegahara Y., Sonoda T. et al. Comparative studies of the persistence of animal mycoplasmas under different environmental conditions//Vet. Microbiol.-2001.-Vol.82.№3.-P.223-232.

168. Namba S., Jyaizu H., Kato S., Iwanami S., Tsuchizaki T. Phylogenetic diversity of phytopathogenic Mycoplasmalike Organisms//International Journal of Systematic Bacteriology.-1993 .-Vol.43 .№3 .-P.461-467.

169. Nocard E., Roux E. Le microbe de la peripneumonie//Ann.Inst.Pauster.-1898.-№ 12.-P.240-262.

170. Oshima K., Siomi Т., Kuboyama Т., Sawaynagi T. et al. Isolation and characterization of derivative lines of the onion yellows phytoplasma that do not cause stunting or phloem hyperplasia//Phytopathology.-2001.-Vol.91.№ 11.-P.1024-1029.

171. Padovan A., Gibb K., Persley D. Association of "Candidatus Phytoplasma australiense" with green petal and lethal yellows diseases in strawberry//Plant Pathology.-2000.-Vol.49.№3.-P.362-369.

172. Pradhanang P.M., Momol M.T. Survival of Ralstonia solanacearum in soil under irrigated rice culture and aquatic weeds//J.of Phytopath.-2001.-Vol.49 (11-12).-P.707-711.

173. Prescott L.V., Harley J.P., Klein D.A. Microbiology. Inc. Boston, New York, San-Francisco: McGrew-Hill, 2004.

174. Psenner R., Loferer M. Nannobacteria: size limits and evidence // Science.-1997. Vol.276 (5320).- P.1776-1777.

175. Razin S. Mycoplasma taxonomy and ecology. In Maniloff J., McElhaney R.N., Finch L.R., Baserman J.B. Mycoplasmas: molecular biology and pathogenesis.- Washington: American Society for Microbiology, 1992.-P.3-22.

176. Razin S., Yogev D., Naot Y. Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas// Microbiol, and Molecular Biol. Rev.-1998.-Vol.62.№4.-P. 10941156.

177. Razin S. Isolation and characterization of mycoplasma membranes// The mycoplasmas.-New York, 1979.-Vol.2.-P.213-229.

178. Robinson J.P., Hungate R.E. Acholeplasma bactoclasticum and anaerobic Mycoplasma from the bovine rumen// Internat. J. Syst. Bacterid.- 1973.-Vol.23.№2.-P.171.

179. Roose-Amsaleg C.L., Garnier-Sillam E., Harry M. Extraction and purification of microbial DNA from soil and sediment samples //Applied Soil Ecology.- 2001.-Vol.18.- P.47-60.

180. Rose DL, Kocka JP, Somerson NL, Tully JG, Whitcomb RF, Carle P, Bove JM, Colflesh DE, Williamson DL. Mycoplasma lactucae sp. nov., a sterol-requiring mollicute from a plant surface// Int. J. Syst. Bacterid.-I990.-Vol.40.№2.ф P.138-142.

181. Saglio P., Lhospital M., Fleche D.et al. Spiroplasma citri gen. and sp. nov.: a mycoplasma like organism associated with «stab-born» disease of citrus//Intern. J. System. Bacterid.- 1973.-Vol.23.-P.191-204.

182. Seemueller E., Marcone C., Lauer U., Ragozzino A., Goschl M. Current status of molecular classification of the phytoplasmas// J. Plant Pathology.-1998(6).-Vol.80.-P.3-26.

183. Seemuller E., Stolz H., Kison H. Persistence of the European stone fruit yellows phytoplasma in aerial parts of Prunus Taxa During the dormant season// J. of Phytopathology.-1998(a).-Vol. 146(8-9)-P.407-410.

184. Seiffert G. Uber das Vorkommen filtrabler Mikroorganismen in der Nature und ihre Zuchtbarkeit//Zbl. Bakteriol., Parasitenkunde und Infektionskrankh.-1937.-Vol.l39.№7.-P.337.

185. Shiomi T. Ecological studies on pathogen of melon hairy root//JARQ.-1991.-Vol.25.№3 .-P. 181 -184.

186. Smart C.M., Schneider В., Blomquist C.L. et al. Phytoplasma-Specific PCRprimers based on sequences of the 16S-23S r RNA spacer region// App. and Environm. Microbiol.-1996.-Vol.62.№8.-P.2988-2993.

187. Torsvik V., Ovreas L., Thingstad T.F. Procaryotic diversity magnitude, dynamics and controlling factors// Environm. microbiol.-2002.-Vol.296.-P.1064-1068.Ф

188. Torsvik V., Sorheim R., Goksoyr J. Total bacterial diversity in soil and communities (a review)// J. Industr. Microbiol.-1996.-Vol.l7.-P.170-178.

189. Trevors J.T., Psenner R. From self-assembly of life to present-day bacteria: a possible role for nannocells // FEMS Microbiology Reviews.- 2001.-Vol.25.-P. 573-582.

190. Tully J.G., Rose D.L., Carle P., Bove J.M. et al. Acholeplasma entomophilum ф sp. nov. from gut contents of a wide range of host insects// Int. J. System.

191. Bacterid.-1988 .-Vol.3 8.-P. 164-167.

192. Tully J.G., Whitcomb R.F. The spiroplasmas and their taxonomic relationships; summary// Rev. of Infec. Diseases.- 1982.-Vol.4.№3.-P.154-156.

193. Tully J.G., Whitcomb R.F., Rose D.L., Bove J.M. et al. Acholeplasma brassicae sp. nov. and Acholeplasma palmae sp. nov., two non-sterol-requiring Mollicutes from plant surfaces// Int. J. System. Bacterid.-1994.-Vol.44.-P.680-684.

194. Vainshtein M., Kudryashova E., Suzina N., Ariskina E., Voronkov V. Formation of bacterial nanocells// Instruments, Methods and Missions for Astrobiology.-1998.-Vol.3441 .-P.95-99.

195. Valenta V., Musil M. Investigations on European yellows type viruses// Phytopathol. Z.- 1963.- Vol.47.№l.-P.38-65.

196. Van der Riet FD. Diseases of plants transmissible between plants and man (phytonoses) exist//Med. Hypotheses.-1997.-Vol.49№4.-P.359-361.

197. Van der Riet FS. Diseases of plants transmissible between plants and man

198. Phytonoses) exist--follow-up paper//Med. Hypotheses.-2000.-Vol.54.№2.-P.310-311.

199. Whitesides M.D., Oliver J.D. Resuscitation of Vibrio vulnificus from the viable but nonculturable stata// Appl.Environ. Microbiol.-1997.-Vol.63.-P.1002-1005.

200. Zelcer A., Bar-Joseph M., Loebenstein G. Mycoplasma-like bodies associated with little- leaf disease of citrus// Israel J. Agric. Res.-1971.-Vol.21.№4.-P.137-142.

201. Zhou J., Davey M.E., Figueras J.B., Rivkina E., Gilichinsky D., Tiedje J.M. Phylogenetic diversity of a bacterial community determined from Siberian tundra soil DNA //Microbiology.-1997.-Vol. 143 .-P.3913-3919.