Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Почва как возможная среда обитания фитопатогенных микоплазм

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Почва как возможная среда обитания фитопатогенных микоплазм"



На правах рукописи

ПОЧВА КАК ВОЗМОЖНАЯ СРЕДА ОБИТАНИЯ ФИТОПАТОГЕННЫХ МИКОПЛАЗМ

Специальность 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена на кафедре микробиологии Московской сечьскохозяйственной академии им. К А Тимирязева

Официальные оппоненты

Научный руководитечь

кандидат биологических наук, доцент А А Ванькова доктор биологических наук, профессор В С Гузев кандидат биологических наук, доцент О О Белошапкина

Ведущая организация Институт микробиологии им С Н Виноградского РАН

Защита диссертации состоится«^»"^^2005 в 15 ' часов на заседании диссертационного совета Д-220 043 03 при Московской сельскохозяйственной академии им К А Тимирязева

Адрес 127550, Москва, Тимирязевская ул , 49 Ученый совет МСХА им К А Тимирязева

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной Научной библиотеке Московской сельскохозяйственной академии им К А Тимирязева

Автореферат разослан &3- ОчХ1£ 200^~г

Ученый секретарь

диссертационного совета

В А Калинин

Актуальность проблемы. Микоплазмы - простейшие лишенные клеточной стенки прокариоты, объединённые в класс Mollicutes. Малый размер генома и ограниченные биосинтетические ' возможности обусловили их сосуществование с клетками высших эукариот. Все известные микоплазмы, встречающиеся в природе относят к симбионтам животных, насекомых и растений. Фитопатогенные микоплазмы являются возбудителями более 600 заболеваний растений из 96 семейств (Борхсениус и др., 2002). Микоплазмозы растений широко распространены в регионах интенсивного возделывания сельскохозяйственных культур (Волгоградской, Саратовской, Астраханской областях, Краснодарском крае, на Северном Кавказе) и наносят огромный ущерб сельскому хозяйству России, снижая урожай пшеницы на 80-90%, картофеля — на 18-20%, томатов и других пасленовых на 25-38% (Власов и др., 1985, 2000; Скрипаль, 1988; Борхсениус и др., 1989; Самсонова, 2000).

Основную роль в распространении микоплазмозов растений отводят насекомым-переносчикам (Власов и др., 1985; Богоутдинов, 2001). Заболевание может передаваться также через паразитическое растение повилику (Яковлева, 1992). Накопителем и источником инфекции являются многолетние растения, поскольку в их корнях микоплазмы способны перезимовывать, а весной мигрировать в вегетативные органы. Фитоплазмы сохраняются зимой в многолетних сорняках, клубнях, корнеплодах, луковицах (Дементьева, 1987; Seemuller et al., 1998а; Приходько, 1999; Davies, 2000). В последние годы (Мидянник, 1995; Чернов и др., 1999) экспериментально в условиях in vitro ; подтверждена возможность проникновения микоплазмы Acholeplasma laidlawii через неповрежденную корневую систему люцерны и гороха в надземную часть растений. Этот факт позволяет предположить существование совершенно иного механизма передачи инфекции — через корневую систему непосредственно из почвы, которая может играть роль естественного резервуара фитопатогенных микоплазм.

Проведение экологических исследований микоплазм, изучение \ возможности их обитания в почве и механизмов инфицирования растений

> своевременно, так как позволит разработать эффективные меры

предотвращения заболеваний растений и решить проблемы управления микоплазменными инфекциями.

Цель работы - выяснить пригодность почвы как среды обитания фитопатогенных микоплазм, изучить динамику численности интродуцированной популяции микоплазм в почве и возможность проникновения микоплазм из почвы в растение через корневую систему.

Задачи исследования:

а Разработка эффективных селективных методов выявления и количественного учета микоплазм в почве

• Применение метода ПЦР для идентификации микоплазм в черноземной почве

• Определение динамики численности интродуцированной популяции микоплазм в почве

• Изучение влияния абиотических и биотических факторов среды на численность интродуцированной популяции АсИо1ер1азта 1аг<Нсми в почве

• Изучение возможности проникновения микоплазм из почвы в растение через корневую систему

Научная новизна. Разработаны и впервые применены сетективные приемы выделения микоплазм из почвы, зактючающиеся в механической предварительной обработке почвы, использовании селективной среды и повышенной температуры инкубации посевов Впервые экспериментально установлено, что почва может играть роль естественного резервуара и источника фитопатогенных микоплазм Длительность выживания микоплазм в почве зависит от типа почвы Показано, что 4сИо1ер1а^та 1тсНам>и способна проникать непосредственно из почвы в растения через корневую систему, мигрировать в надземные ткани растения и длительно персистировать в них, вызывая специфические морфологические изменения растений

Практическая значимость. В результате проделанной работы разработаны методические подходы для выявления и количественного учета микоплазм в почве Использованы метод посева на селективную питательную среду и ПЦР-анализ Установлено, что для проведения ПЦР в черноземной почве целесообразно использовать непрямой способ выделения ДНК, так как при непосредственном экстрагировании ДНК из почвы происходит ингибирование полимеразной цепной реакции Рекомендованные методы могут быть использованы в экологических исследованиях микоплазм в почве, что пополнит наши знания об этой малоизученной группе микроорганизмов, а также о биоразнообразии почв, в сельском хозяйстве для диагностики возбудителей болезней растений при разработке мер борьбы с микоплазмозами и предотвращения эпифитотий

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на 11-м Международном конгрессе по молекулярным

взаимодействиям между растениями и микроорганизмами (Санкт Петербург,

2003); конференции молодых ученых и специалистов МСХА (Москва, 2003); научной конференции МСХА (Москва, 2004).

Публикации. Материалы диссертации изложены в 4 печатных работах.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена, на 139 страницах машинописного текста и включает в себя следующие разделы: введение, обзор литературы, описание объектов и методов исследования, результаты и обсуждение, выводы и список литературы, включающий 213 наименования, в том числе 107 - зарубежных авторов. В работе представлено 4 таблицы, 30 рисунков.

Автор выражает искреннюю признательность и благодарность научному руководителю к.б.н. A.A. Ваньковой, д.б.н. JI.B. Васильевой (ИНМИ РАН), д.б.н. проф. Шильниковой В.К., к.б.н. П.И. Иванову, д.б.н. И.В. Раковской (НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН), д.б.н. В.М. Чернову, к.б.н. Ю.В. Гоголеву и н.с. Hi. Мухаметшиной (КИББ КНЦ РАН, лаборатория молекулярных основ патогенеза), к.б.н. Г.И. Карлову (лаборатория биотехнологии МСХА), а также аспирантам и сотрудникам кафедр биотехнологии и микробиологии за помощь и ценные консультации при выполнении работы.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объектов исследования использовали 2 штамма микоплазмы Acholeplasma laidlawii. Первый (1) получен из НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. Второй (2) штамм предоставлен лабораторией молекулярных основ патогенеза КИББ КНЦ РАН.

. В опытах использовали чернозём обыкновенный карбонатный (Воронежская область, Таловский район) и дерново-подзолистую почву (Москва, Полевая опытная станция МСХА им. К.А. Тимирязева), горох посевной (Pisum sativum) сорт Тан, предоставленный ТатНИИСХ НПО "Нива" и томат (Lycopersicum esculentum Mill.) - 3-х сортов: Морковный (детерминантный), Золотая Капля и Манимейкер (индетерминантные),

A. laidlawii культивировали в жидкой питательной среде Mycoplasma Broth Base (Becton Dickinson, USA). Для накопления биомассы культуру инкубировали при температуре 28°С в течение 4 суток. Для увеличения титра и удаления питательной среды клетки центрифугировали при 12000g 20 мин +4°С. Надосадочную жидкость сливали, осадок осторожно ресуспендировали в небольшом количестве воды. Определение концентрации микоплазм в

суспензии проводили титрованием в полужидкой среде Mycoplasma Agar Base (0,3% агара) и подсчетом КОЕ в толще среды, а также колориметрически на ФЭК с использованием светофильтра с длиной волны 590 нм.

Для изучения динамики численности стрептомицинустойчивый пггамм А laidlawii интродуцировали в черноземную почву, равномерно внося водную суспензию культуры в стаканчики с 25г почвы влажностью 60% ПВ при +20°С в 3-кратной повторности A laidlawii в почве определяли микробиологическим посевом на плотную среду и методом ПЦР. Из почвенной суспензии A laidlawii высевали на плотную среду (1,4% агара) со стрептомицином в концентрации 1,4 мг/мл посте предварительной десорбции, которую проводили встряхиванием водной почвенной суспензии (10 1) на механической качалке WU-4 при 180 об/мин в течение 10 мин Посевы инкубировали в термостате при +37°С Наблюдение и подсчет колоний проводили на 7-10 сутки с помощью бинокулярной лупы МБС-10 при увеличении х32 и х56

При выделении ДНК для ПЦР анализа использовали непрямой метод, который заключается в предварительной десорбции микробных клеток из субстрата, лизисе клеток, а затем экстракции и очистке ДНК После проведения десорбции клеток из почвы, почвенную суспензию фильтровали через бумажный фильтр для удаления грубых почвенных частиц Затем фильтрат центрифугировали при 2500g в течение 1 мин для осаждения метких

почвенных частиц Процедуру повторяли, если суспензия содержала почвенные частицы Супернатант отбирали и осаждали микробные клетки центрифугированием при 12000g 20 мин (^"С) Осадок использовали для выделения ДНК Очистку ДНК проводили с использованием классической процедуры фенольно-хлороформной экстракции (Маниатис и др ,1984)

Для определения A laidlawii в растениях методом ПЦР анализа 100 мг исследуемых тканей после тщательного предварительного отмывания помещали в фарфоровую ступку и гомогенизировали Гомогенат использовали для выделения ДНК

Реакцию ПЦР проводили в программируемом амплификаторе "Терцик' (Россия) Для выявления A laidlawii в качестве праймеров использовали олигонуклеотиды, синтезированные в НПО "Литех" Последовательность праймеров составлена на основе первичной структуры рибосомного оперона A laidlawii (Kong et al ,2001) AF - 5'GAG АТС TTT GAA AAG TAGATA AAT GAT GTC TGA AAA GAA ATA AGG3', AR - 5'CTT CGA CCG ATT TTC CCA CAT CGT TCA ТС 3', фланкирующие ампликон размером 362 п о в области межгенного спейсерного района ДНК 16S-23S рРНК Программа реакции амплификации 95°С - 2 сек, 62°С - 2 сек, 72°С - 10 сек 40 циклов, 72°С - 5 мин, хранение 10°С Для выявления A laidlawii также были использованы

последовательности праймеров, синтезированные в ЗАО "Синтол". Подбор праймеров проводили с использованием программы Aligo 4.1. на основании сиквенса в базе данных GenBank. Ml-5'GAT GAA/ TG/T AGT AGC CGG TCG TAT CGG GA3', M2-5'CC/T AGG GTA GGC AAT CCT G/AT TAG ATG GGA CT3', фланкирующие ампликон размером 533 п.о. Программа реакции амплификации: 95°С - 1 мин, 55°С - 1 мин, 72°С - 2 мин 30 циклов; 72°С - 5 мин; хранение 10°С. Продукты амплификации выявляли, с помощью электрофоретического разделения фрагментов ДНК в 1,5% агарозном геле по свечению в ультрафиолетовом свете в присутствии 10 мкг/мл бромистого этидия.

В опыте по изучению влияния pH почвы на динамику численности А. laidlawii использовали естественную дерново-подзолистую почву (рНКа 5,1) и ту же почву с внесением СаО для нейтрализации кислотности (pHKci 8,0).

Опыты с растениями проводили в фитотроне при 18-часовом световом дне, температуре +20°С (горох), +22-24°С (томаты) и освещенности 5 тыс. лк. Способность проникать А. laidlawii через корневую систему в растение из водной бактериальной суспензии определяли, помещая проросшие семена в бактериальную суспензию, из почвы - выращивая растения с интродуцированной в почву популяцией микоплазм. Детекцию А. laidlawii в растениях проводили ПЦР анализом в корнях, стеблях и листьях.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Методические приемы работы с микоплазмами 1. Разработка эффективных селективных методов для выделения Acholeplasma laidlawii из почвы

Проводили сравнительные исследования эффективности селективных приемов для наиболее полного выявления микоплазм из почвы: влияние состава питательных сред, различных способов предварительной обработки почвы, температуры инкубации посевов. С этой целью использовали следующие агаризованные среды: среду на основе гидролизата бычьего сердца (ГБС) (НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН) и Mycoplasma Broth Base (MB) (Becton Dickinson, USA). Обе среды используются для культивирования патогенных видов микоплазм в медицинских лабораториях. Чистую культуру A. laidlawii выращивали на среде ГБС (pH 6,5) с добавлением сыворотки и без неё, так как ахолеплазмы хорошо размножаются и на бессывороточной среде (Борхсениус и др., 2002).'Рост культуры в полужидкой среде с добавлением сыворотки заметно интенсивней, чем рост без этого компонента: характерное разрастание A. laidlawii в виде "облака" наблюдали на 5 сутки по всему

столбику среды В среде без сыворотки рост культуры значительно более ограничен

Для визуального наблюдения за ростом А 1тсИсми испытывали ГБС разной плотности - с содержанием 0,4, 0,6, 0,8 и 2% агара В полужидких средах с разным содержанием агара наблюдали отличающиеся по плотности и величине колонии В среде с 0,4% агара на 3 сутки культивирования отмечали рыхлые полупрозрачные с нечетко очерченным краем колонии В средах с 0,6 и 0,8% агара колонии вырастали на 5 сутки и они были более компактные и имели четкий край Темно-коричневый цвет и стабая прозрачность среды ГБС в целом затрудняли визуальное определение роста А 1аиЯата в полужидкой среде А 1аиПамт на плотной (2% агара) среде образует точечные колонии, диаметр которых не превышает 1 мм При высеве из почвы, большую часть поверхности питательной среды в чашке занимали быстрорастущие почвенные микроорганизмы, в первую очередь микромицеты, и подсчет колоний микоплазм был не возможен Для подавления почвенных грибов в птотную среду добавляли нистатин в концентрации 1000 и 50 Ед/мл среды Первая концентрация применяется в почвенной микробиологии, вторая в медицине (Раковская, 1999) При концентрации 1000 Ед/мл подавлялся рост не только грибов, но и микоплазм При концентрации антибиотика в среде 50 Ед/мл микоплазмы развивались, а рост грибов подавлялся Однако, нистатин не полностью растворялся в среде, и его частицы мешали учету мелких колоний микоплазм по размеру равных частичкам нистатина

Визуальное наблюдение за развитием колоний мгасотазм на среде МВ (рН 8,0) осуществлялось значитетьно проще, так как она имеет бледно-жеттый цвет и хорошую прозрачность Рост А 1аиПегли изучали в среде различной плотности В жидкой среде наблюдалось слабое равномерное опалесцирующее помутнение среды В толще полужидкой среды (0,3% агара) колонии вырастают на 3-4 сутки посте посева разведений и имеют вид бетоватых полупрозрачных сфер в диаметре 0,5 1,5 мм На ппотной среде (1,4% агара) вырастают округлые, точечные колонии (0,1 .1,0 мм) в виде яичпицы-глазуньи с приподнятым центром и плоским ободком Содержание агара в птотной среде (1,4%) ниже, чем в обычных плотных питательных средах, что позволяет ахолеплазмам, которые относятся к факультативным анаэробам, легче проникать в толщу агара При высевах на плотную среду МВ из почвы резко снижалась численность почвенных микроорганизмов, особенно грибов, по сравнению с численностью их при высеве на ГБС, что можно объяснить щелочной реакцией среды МВ Для кучьтивирования и учета А 1акВтл/п в почве была использована среда МВ

Для изучения поведения фитопатогенных микоплазм . в почве антибиотикоустойчивый штамм А. ШсИаыи интродупировали в почву и реверсировали его вновь на питательную среду с антибиотиками. Антибиотикоустойчивые штаммы А. ШсЧсмп получали методом "приучения" исходной культуры к возрастающей концентрации антибиотиков путем постепенного отбора резистентных форм. Были получены штаммы А. 1аШсти устойчивые к стрептомицину и рифамггицину. В процессе культивирования антибиотикоустойчивых штаммов А. ■ ШсИажи на среде с антибиотиками отказались от рифампицина, так он окрашивал среду в темно-бордовый цвет, что затрудняло видимость колоний микоплазмы. Стрептомицин не менял цвета среды, поэтому для высева микоплазм из почвы использовали питательную среду со стрептомицином. При посеве чистой культуры и высеве из почвы на плотную питательную среду стрептомицинустойчивого штамма А. 1аШсмп выявлен полиморфизм колоний. Кроме классических колоний в виде яичницы-глазуньи наблюдались атипичные колонии двух видов: без плоского периферического ободка "пузырчатые" и шероховатые. Размер атипичных колоний был меньше, чем классических колоний. Методом ПЦР подтверждено, что типичные и атипичные по форме и размерам колонии стрептомицинустойчивого штамма А. 1аиИ1атг в чистой культуре и выделяемые из почвы идентичны исходному штамму.

Клетки почвенных микроорганизмов располагаются преимущественно на поверхности твердой фазы почвы и адсорбируются на почвенных частицах. Для учета интродуцированной стрептомицинустойчивой популяции микоплазм А. 1аЫ1смИ в почве необходимо было разработать наиболее эффективный метод десорбции. Обработку почвы с целью десорбции клеток проводили через сутки после интродукции А. ¡аийсмп в черноземную почву. Учет численности А. ШсИамп, десорбированной из почвы разными способами, проводили методом посева на плотную среду со стрептомицином.

Результаты опыта (табл. 1) показали, что наибольшее количество клеток десорбировалось при встряхивании почвенной суспензии в колбе на механической качалке в течение 10 мин - 1,7* 108 КОЕ/г почвы при исходном титре клеток 10® КОЕ/г почвы. При обработке почвенной суспензии ультразвуком (УЗ) с добавлением ПАВ и без них численность десорбированных клеток на порядок и более ниже, чем при встряхивании. Негативное влияние УЗ обработки на клетки микоплазм, видимо, связано с отсутствием у них клеточной стенки. Сочетание ПАВ с различными способами' механической обработки не привела к увеличению изолированных клеток микоплазм из почвы. Малоэффективно также растирание в ступке. Оптимальный вариант десорбции микоплазм из почвы - встряхивание почвенной суспензии, который

использовали при подготовке почвы к микробиологическому посеву и ПЦР анализу

Таблица 1

Влияние различных способов десорбции на численность интродуцированной в почву популяции АсИо1ер1а$та \aidlawu определяемую чашечным методом_

№ Варианты опыта Численность КОЕ г воздушно-сухой почвы

1 Встряхивание в колбе 10 мин 1,7* 108

2 Встряхивание в колбе с 0,01% Т\уе(.п-60 10 мин 1,2* 108

3 Обработка УЗ 0,5 мин 1,8* Ю7

4 Обработка УЗ 1 мин 4,2* 107

5 Обработка УЗ 2 мин 4,8*106

6 Обработка УЗ 3 мин 4,5* 106

7 Обработка УЗ с 0 01% БИЯ 0,5 мин <1.0* 106

8 Обработка УЗ с 0,01% БОБ 1 чин <1,0*106

9 Обработка УЗ с 0,01% Тугееп-бО 0,5 мин 3 2*107

10 Растирание в ступке 5 мин 1,4*106

11 Растирание в стгке с 0,01% ЯОЗ 5 мин <1,0*10"

Наблюдения посевов из почвы при инкубации в различных температурных условиях показали, что при 28°С на чашках быстро вырастают колонии почвенных бактерий, которые не подавляются антибиотиком, добавленным в среду, и мешают подсчету колоний микоплазм При 37°С колонии микоплазм вырастают быстрей, чем при 28°С, а рост большинства других почвенных микроорганизмов угнетается относительно высокой температурой Температуру 37°С использовали как "элективную" для А 1аиЯа\»и при учете ее чистенности в почве

2. Метод ПЦР для детекции Ас1го1ер1а5та 1аиНап>Н в почве

Оценивали 2 способа выделения ДНК из почвы с помощью прямого и непрямого метода Прямой метод позволяет выделять тотальную ДНК с минимальными потерями и считается более точным, поэтому ему отдается предпочтение. Однако, в литературе нам не удалось найти методики для черноземной почвы Поэтому испытывали различные модификации прямого метода, применяемые для других почв 1 Замораживание-оттаивание почвенного образца с использованием жидкого азота для лизиса клеток в почве 2 Ультразвуковая обработка (22 кГц, 0,4А, 2 мин, 4 раза) почвенной суспензии

для лизиса клеток. 3. Экспресс-набор для выделения ДНК из биопроб (НПФ "Литех"). 4. Низкосолевой буфер (TESP: 50mM Tris, 20тМ EDTA, ЮОтМ NaCl, 1%PVP) для десорбции микробных клеток из почвенных частиц в раствор с дальнейшим лизисом клеток в нем. 5. Высокосолевой буфер (TESAP с добавлением О.ЗМ CH3COONa и 0.6М NaCl) для десорбции микробных клеток га почвенных частиц. 6. Сочетание разных методик.

Проверка контрольных проб почвы с разными титрами внесения клеток A. laidlawii 103;103;107;Ю' КОЕ/г показала, что продукты амплификации регистрируются только при высоком содержании микробных клеток в почве 108-109 КОЕ/г почвы на момент выделения ДНК. Отсутствие результатов при низких титрах можно объяснить адсорбцией ДНК лизированных клеток на почвенных частицах и (или) ингибированием полимеразной цепной реакции посторонними веществами из почвы, например, гуминовыми кислотами, которые в большом количестве присутствуют в черноземных почвах.

Для очистки ДНК от примесей, ингибирующих ПЦР, были испытаны следующие приемы: 1. Использование носителей ДНК, которые одновременно являются ингибиторами её неспецифической адсорбции: ДНК лосося, тРНК. 2. Гельфильтрация через колонки с Sephadex G 50, G 100. 3. Использование цетавлона (цетил этидиумбромид, СТАВ). 4. Отделение ДНК от примесей с помощью электрофореза в легкоплавкой агарозе. 5. Классическая фенольно-хлороформная методика (Маниатис и др.,1984). 6. Совместное применение нескольких способов очистки ДНК.

Все испытанные методики по очистке ДНК от ингибиторов оказались не эффективны. Выделенная ДНК содержала примеси коричневого цвета, которые имели свойства схожие с нуклеиновыми кислотами, поэтому отделить их не удалось. Использование прямого метода выделения ДНК из черноземной почвы, содержащей большое количество гуминовых кислот, не дало положительного результата.

Для идентификации микоплазм в почве методом ПЦР использовали непрямой метод выделения ДНК из микроорганизмов, который давал положительные результаты при низких титрах A. laidlawii в почве.

Динамика численности и идентификация Acholeplasma laidlawii в почве

Изучена динамика численности ингродуцированной популяции А. laidlawii (штамм 1) в различных по физико-химическим свойствам почвах -. чернозёме обыкновенном и дерново-подзолистой почве.

-дерново подзолистая почва

1 0

\

\

О

3

4

сутки

Рис 1 Динамика интродуцированной популяции АсИо1ер1азта ¡сисПаи/п в черноземе обыкновенном и дерново-подзолистой почве

Результаты исследования показали (рис 1), что в дерново-подзолистой почве внесенная попутяция 4 1тсИсми через сутки после интродукции в почву не определяется на питательной среде В черноземе популяция уменьшается постепенно и через сутки сохраняет довольно высокую численность - 107 КОЕ'г почвы по сравнению с дерново-подзолистой почвой Высев почвенной суспензии на 4 сутки также показал высокий уровень популяции микоплазм в почве - 10е КОЕ'г почвы Быстрая гибечь популяции в дерново-цодзочистой почве, вероятно, связана с неблагоприятной дта ахолептазм кистотностью Таким образом, черноземная почва более благоприятна для ахолеплазм, чем дерново-подзолистая почва

Оценка длительности выживания интродуцированной популяции А 1аиИсгл>11 в черноземной почве ПЦР анализом и микробиологическим посевом показала, что популяция сохранялась в почве в течение 15 суток (рис 2, 3)

1 2 3 4 5 6 7

Рис 2 Электрофореграмма результатов ПЦР по срокам идентификации Аско1ер!сита ¡сиеИаюи в черноземе

1 2 3 4 5 - 1,5,10,15,17 суток после интродукции 4 ¡аиНстт в почву соответственно 6 - почожительный контроль (чистая культураЛ каШаит) 7 - отрицатечьный контроль

--г^т-

о

5

сутки

10

15 1К

I

Рис 3 Динамика численности интродуцированной популяции ЛсИо1ер1а$та 1аиМа\т в черноземе

Изучена динамика численности А 1акИсгл,и в почве при интродукции на разных исходных уровнях попутяционной плотности 108 КОЕ/г, 109 КОЕ/г, 10й КОЕ/г почвы (рис 4) Численность интродуцированной гюпучяшш снижалась во всех вариантах независимо от количества внесенной культуры Популяция, внесенная в титре 108 КОЕ/г почвы постепенно сокращалась и достоверно микоплазмы опредетялись в почве методом посева в течение 6 суток (7*103 КОЕ/г почвы), на 8 сутки микоплазмы не обнаружены В варианте с титром внесения 1 ¡агсИтт 109 КОЕ/г почвы регистрировали плавное снижение численности и идентифицировали А 1аиИа\т в почве методом посева в течение 15 суток

0 2 4 6 \в 10 12 14 16 « 20 22 2>*-.26

I с*тк" 4, I

Рис 4 Динамика численности интродуцированных попутяций АсЬо1ер1шта ¡тсИсти в почве в зависимости от начального титра

12 11 • 10 ■

При исходном титре внесения А. ШсИсти 10" КОЕ/г почвы численность популяции в ходе опыта менялась с тенденцией к убыванию. Микоплазмы достоверно выделялись в течение 19 суток (1,2*102 КОЕ/г почвы). Посев пробы на 26 сутки показал, что микоплазмы не изолируются из почвы на плотную питательную среду. Известно, что при интродукции микробной популяции в естественную среду действуют механизмы антибиоза со стороны почвенных микроорганизмов (Звягинцев, 1987; Кожевин, 2000). По мере снижения популяционной плотности микроорганизмов наблюдается ослабление отрицательных механизмов, но это не всегда ведет к стабилизации популяции. Популяции, характеризующиеся высоким уровнем трат на поддержание в результате внутрипопуляционной конкуренции, могут быстро погибнуть в условиях голодания (Кожевин, 2000) или перейти в некультивируемое состояние.

Влияние температуры и кислотности почвы на динамику численности АсИо1ер1а$та Ш(Иаи>Н

Изучена динамика численности интродуцированной популяции А. ШсИт/И в черноземной почве при разных температурных режимах и значениях кислотности. Исследования показали, что при всех изучаемых температурных условиях +4°С, +20°С и +28°С происходит снижение численности А. 1а1сИсм>Н (штамм 1) в почве, но динамика процесса различна (рис.5).

Рис.5 Динамика численности интродуцированной в почву популяции

АсИокрЬэта 1аШ1смН при различных температурных режимах

Наиболее резкое сокращение численности наблюдалось при +28°С - в течение 2 суток она уменьшилась почти на 3 порядка (начальный титр 8x107

9

КОЕ/г почвы) На б-й день микоплазмы на питательной среде не выявлялись Падение численности микоплазм наблюдается и в вариантах при температурах +4°С и +20°С, но оно не такое резкое Достоверно А 1аиИа\т выявляются на 6 сутки в количестве 2,1x10 и 6,7к103 КОЕ/г почвы Однако, на 8-е сутки микоплазма в почве не выявлена в обоих вариантах Таким образом, высокая температура неблагоприятна для ахолеплазм и сокращает время существования их в почве

Наблюдения за динамикой численности популяции А Шсйсмп в почве при разной кислотности показали, что в естественной дерново-подзолистой почве (рНКС1 5,1) через 1 сутки микоплазмы не обнаруживались, в дерново-подзолистой с внесением СаО (рНка 8,0) их уровень снижался до 103 КОЕ/г и микоплазмы не выявлялись на 5 сутки (рис 6) Высокая кислотность почвы негативно влияет на развитие микоплазм в почве Стедует отметить, что при одинаковых титрах инокутюма и рН черноземной и дерново-подзолистой почв период выявления А ¡тсИсм/и в черноземе составил 15 дней, а в дерново-подзолистой не более 5 суток Следовательно, жизнеспособность микоплазм зависит не только от рН, но и от других физико-химических свойств почв

Рис 6 Динамика численности интродуцированной популяции АсЬо1ер1скта 1а1сИам>н в дерново-подзолистой почве с внесением СаО и без внесения

Влияние растений гороха посевного на длительность выживания Ас1ю1ер1а$та !аиИапч! в почве

В модельном опыте изучено влияние растений гороха посевного на поведение интродуцированной популяции А 1шс1!аыц в черноземную почву Установлено, что популяция сокращается в варианте с растениями и без них

(рис.7). Существенных различий между вариантами на 10 сутки посева проб не обнаружено. В следующие 5 дней в обоих вариантах снижение численности популяции незначительно. На 15 сутки выявлена существенная разница между вариантами с растениями и без растений. Вероятно, корневые выделения гороха посевного влияют на развитие микоплазм в почве в этот период. Возможно, это связано с интенсивностью корневых выделений и их составом в это время (20-дневные растения). В последующие 2 дня опыта популяция в обоих вариантах уменьшается на порядок. На 17 сутки после инокуляции микоплазм в почву различий в их численности не выявлено. Через 20 суток микоплазм в обоих вариантах не обнаружено.

Почва без растения Почва с растением

Рис.7 Влияние растений гороха посевного на длительность выживания Ас1ю1ер1азта 1а1(11сти в почве

Таким образом, растения гороха не оказывали существенного влияния на срок выживания А. ШсИсти в почве.

Проникновение Аско1ерШта 1аШакН через корневую систему в растение гороха

Корневые эксудаты растений "привлекают" почвенные микроорганизмы к корням и способствуют более интенсивному росту микроорганизмов в

ризосфере (Звягинцев, 1987) На разных стадиях развития растений выделяются различные по составу и количеству эксудаты

Исследовали способность 4 ¡тсЯсмт проникать в растения гороха на разных стадиях развития через корни из почвы Результаты ПЦР анализа растений гороха показали отсутствие микоплазм в листьях, стеблях и корнях растений во всех вариантах опытах

Известно, что А 1аиИамт является распространенным фитопатогеном (Власов и др, 1985) В природных условиях поражаемость растения в значительной степени зависит от вида, сорта и стадии развития растения во время поражения, экологических условий, времени поражения, вида насекомого-переносчика и многих других как природных, так и антропогенных факторов (Скрипаль, 1988) По литературным данным известно, что 6-дневные проростки люцерны, зараженные А ¡аиНати через месяц погибали, а подращенные до 2-3 недель -сохраняли жизнеспособность длительное время (до 8 мес) (Мидянник, 1995) Чернов (1998) установил, что развитие заболевания, а также характер его симптомов у растений гороха, инфицированных А 1аиЛаюи, зависят от конкретных растений и их индивидуального генотипа Поражаемость растения зависит и от вирулентности штамма микроорганизма, т е его способности проникать в растение

При изучении способности стрептомишшустойчивого штамма Л ¡акИами (штамм 1) проникать через корни гороха из водной суспензии с различными титрами признаки микоплазмоза у растений визуально не наблюдали Данные ПЦР показали, что в корнях и стеблях растений А ¡сисИсти отсутствует

Известно, что потеря вирулентности для многих патогенов может произойти вследствие длительного пассирования на питательных средах (Борхсениус и др, 2002) На вирулентность фитопатогена также может влиять генетическая маркировка популяции с помощью антибиотика, так как устойчивость к антибиотику приобретается вследствие изменений генов в тазмидах Вирулентность фитопатогенов также определяется генами в гпазмиде (Шлегечь, 1987) Изменение одного или группы генов может привести к мутации других

Таким образом, стрептомицинустойчивый штамм А ¡агсНсти не проявляет вирулентности по отношению к растениям гороха Потеря вирулентности может быть связана с приобретенной антибиотикоустойчивостью штамма и его длительным пассированием на питательных средах

Проникновение Ас1ю1ер1азта ШМаи'И через корневую систему в растение томата

Изучали способность А. 1ахс11<тИ (штамм 2) проникать в растение томата через корневую систему из водной суспензии (3 сорта томата) и непосредственно из почвы (сорт Манимейкер).

При изучении способности проникновения А. Ыс1!ан>и (штамм 2) из водной суспензии в растения томата результаты ПЦР анализа показали присутствие А. Ш<ЛапИ во всех исследованных сортах томата, что видно на элекгрофореграмме (рис.8) первого срока отбора образцов через 10 дней после инфицирования растений.

I. )

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Рис.8 Электрофореграмма продуктов амплификации опытных вариантов 1 - 4 - растения томата сорта "Золотая Капля", инфицированные А. ШДамИ. 5 -неинфицированные растения томата сорта "Золотая Капля" (контроль). 6 - 9 - растения томата сорта "Морковный", инфицированные А. ШсИсми. 10 - неинфицированные растения томата сорта "Морковный" (контроль). 11 - 14 - растения томата сорта "Манимейкер", инфицированные А. Ш<Н<гл/И. 15 - неинфицированные растения томата сорта "Манимейкер" (контроль). 16 - чистая культура А. ШДсглп (положительный контроль). 17 - маркер размеров ДНК.

В инфицированных растениях сортов Морковный и Манимейкер А. ШсНсмп идентифицировали в течение всего срока проведения опыта - 2,5 месяца (табл.2). В растениях сорта Золотая Капля положительный ответ зарегистрирован только в первый срок - на 10-й день после инфицирования. Это, по-видимому, связано с тем, что сорт Золотая Капля обладает устойчивостью к А. 1т<Нсгмп, подавляя дальнейшее развитие инфекционного агента с помощью механизмов активной иммунной защиты, которые включаются в ответ на проникновение фитопатогена. Полученные данные по идентификации А. \aidlawn в растениях разных сортов томата по срокам отбора проб представлены в таблице 2.

Таблица 2

Идентификация АсИо1ер1азта 1агс11аюи в различных сортах томата методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Сорт томата Вариант опыта Срок отбора (дни)

10 14 ' 18 22 1 75

Морковный инфицир контроль + + + + +

Золотая Капля инфицир контроль + - - - -

Манимейкер инфицир котггроль + + _ + _ _ + _

Таким образом, при инфицировании томата из бактериальной суспензии 4 1аи11ами проникает через корневую систему в растения, мигрирует в надземные органы и длительно персистирует в них Это показано ПЦР анализом образцов надземной части растений, которые не контактировали с микоплазмами Штамм (2) А ¡аиНатг является вирулентным по отношению к исстедованным сортам томата, которые показали различную устойчивость к инфекционному агенту

Результаты биометрических измерений растений показали, что длина эпикотиля и площадь листовой поверхности сортов Морковный и Манимейкер больше по сравнению с контрольными растениями на 14, 18, 22 день отбора образцов У сорта Золотая Капля достоверных различий между инфицированными и контрольными растениями по дчине эпикотиля и тощади листовой поверхности не выявлено (рис 9, 10) Внедрение А кисИтт и ее длительная персистенция в вегетирующих растениях томата сортов Манимейкер и Морковный оказало воздействие на их развитие, проявляющееся в более интенсивном росте Интенсивный рост инфицированных растений свидетельствует о том, что метаболические процессы проходили активнее, что, в свою очередь, является иммунным ответом макроорганизма на присутствие микроорганизма В течение всего срока проведения опыта инфицированные растения не обнаруживали таких симптомов как пожечтение, увядание, скручивание листьев, метколистность, кроме более интенсивного роста растений Колонизация тканей растений микоплазмами, как известно, может вызывать или не вызывать патологических реакций у разных индивидуумов Это объясняется высоким естественным иммунитетом растений и благоприятными условиями дтя их развития

Я сорт Морковный ■ сорт Золотая капля В сорт Манимейк«р В Контроль

18

дни отбора

22

Рис.9. Влияние инфицирования А. 1а1<йауеН на длину эпикотиля растений томата

■ сорт Морковный

■ сорт Золотая капля □ сорт Маниивйкер Ш Контроль

45-,

40-

35 ■

30 •

9 25-

и гО-

16-

ID-

S'

0-

* =

14 18

дни отбора

Рис.10. Влияние инфицирования A. laidlawii на площадь листовой поверхности растений томата

* Известно, что A. laidlawii способна проникать в растения люцерны и гороха из питательной среды через неповрежденную корневую систему в условиях in vitro (Иванов и др., 1992; Мидянник, 1995; Чернов, 1997; Чернов и др., 1999). Нами установлено, что A. laidlawii способна проникать в растения томата и сохраняться в почве в течение 15 дней. Это позволяет предположить, что микоплазмы могут проникать в растения через корневую систему непосредственно из почвы.

По результатам ПЦР анализа растений томата, выращенных в почве с интродуцированной популяцией A. laidlawii (Ю9КОЕ/г почвы) установлено присутствие в растениях фитоплазм во все сроки отбора образцов (10, 14, 18, 22,30 дней). A. laidlawii может проникать непосредственно из почвы в растение томата и мигрировать в надземные части растения. Проникновение микоплазмы происходит через корневую систему томата непосредственно из почвы, так как это единственное место контакта микоплазм и растений. ДНК A. laidlawii обнаружена как в подземной, так и в надземной частях томата.

Таким образом, результаты исследований показали, что A laidlawu одинаково хорошо проникает в корневую систему растений томата, как из водной суспензии, так и непосредственно из почвы и мигрирует в надземные органы растения A laidlawu способна персистировать в растении, способствуя интенсивному росту растений, что обусловлено ответными реакциями организма-хозяина на инфекционный агент Установленная способность А laidlawu проникать из почвы через корневую систему при искусственном инфицировании дает основание полагать, что фитоплазмы и в природных условиях могут проникать в растения через почву, которая может играть роль естественного резервуара и источника фитопатогенных микоплазм

ВЫВОДЫ

1 В условиях модельных опытов разработаны методические приемы интродукции, выделения и количественного учета ахотеплазм в почве на основе проверки и сравнения ранее известных методов, заключающиеся в предварительной обработке почвенной суспензии встряхиванием в течение 10 мин, использовании питательной среды Mycoplasma Agar Base (Becton Dickinson, USA) с антибиотиком и температуры инкубации посевов 37°С

2 Установлено, что для проведения ПЦР анализа в черноземе обыкновенном при непосредственном экстрагировании ДНК из почвы происходит ингибирование потимеразной цепной реакции, поэтому целесообразно использовать непрямой способ выделения тотальной ДНК, который заключается в предварительной десорбции клеток микроорганизмов из почвы Метод ПЦР анализа может служить дтя оценки почвы как возможного источника микоплазмозного заражения

3 Показано двумя параллельными методами (микробиологическим посевом и ПЦР), что интродуцированная популяция Acholeplasma laidlawu сохраняется в черноземе обыкновенном в течение 15 суток, а в дерново-подзолистой почве погибает в течение первых суток Наблюдения за динамикой популяции показали, что численность интродуцированной популяции Acholeplasma laidlawu не стабилизируется Время выживания определяется уровнем внесения популяции и факторами окружающей среды

4 В результате исследований показано, что повышение кислотности почвы (до pH 5,1) и температуры (до 28°С) неблагоприятно влияли на развитие ахолеплазм в почве Растения гороха посевного не оказывали существенного влияния на длительность выживания Acholeplasma laidlawu в почве

5. Установлена способность Аско1ер!азта ШсИсми проникать через корневую систему, как из водной суспензии, так и непосредственно из почвы в растения томата, а также мигрировать в надземные части растений и длительно персистировать в них (75 суток). Таким образом; почва может служить естественным резервуаром и источником фитоплазм.

6. Выявлено, что колонии стрептомицинустойчивого штамма АсЪо1ер1ахта Шс11ан>Н проявляют полиморфизм, как в чистой культуре, так и при высеве из почвы. Установлена потеря вирулентности стрептомицинустойчивого штамма АсИо1ер1азта 1тс11смИ, которая возможно является следствием приобретенной антибиотикоустойчивости и длительного пассирования на питательных средах.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Серебренникова Л. А. Почва как возможная среда обитания фитопатогенных микоплазм. Материалы научной конференции молодых ученых и специалистов МСХА, 2003С.311 -319.

2. Серебренникова Л.А., Ванькова А.А., Васильева Л.В., Иванов П.И. Почва как среда обитания для фитопатогенных микоплазм (Soil as the habitat for pathogenic mycoplasmas) //11-th International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions, 2003 in Saint-Petersburg, P.l 64. •

3. Ванькова А.А., Серебренникова Л.А. Динамика популяции Acholeplasma laidlawii в почве. //Доклады ТСХА.- 2004. вып.276-С.288-291.

4. Ванькова А.А., Серебренникова Л.А., Карлов Г.И., Тараканов И.Г., Чергейко Г.М., Куприянов А.А. Проникновение микоплазмы Acholeplasma laidlawii из почвы в растения томата через корневую систему. В сб: Актуальные проблемы почвоведения, агрохимии и экологии.- МСХА.- 2004.-С.368-374.

Объем 1 25 I! л

Зак 3^7

Тираж 100 *>кз

Центр оперативной полиграфии ФГОУ ВПО МСХА им К А Тимирязева 1Москва y^ Тимирязевская 44