Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние компонентов внеклеточного матрикса на функциональную активность гепатоцитов

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Влияние компонентов внеклеточного матрикса на функциональную активность гепатоцитов"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ мм. Н. К. КОЛЬЦОВА

нл правах рукописи

КУДРЯВЦЕВА Елена Иосифовна

ВЛИЯНИЕ КОМПОНЕНТОВ ВНЕКЛЕТОЧНОГО МАТРИКСА НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ГЕПАТОЦИТОВ.

оз. 00.11. эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1992

)

Работа выполнена в Онкологическом научной центре АМН. Научные руководители -

чл. -корр. Российской АН. доктор биологических наук, проф. г. И. Абелев

чл. -корр. Российской АМН, доктор медицинских наук, проф. Р. М. Хаитов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук А. Т. Михайлов

кандидат биологических, наук • И. В. Будунова

Ведущая организация Биологический Факультет, Московский Государственный Университет им. М. В. Ломоносова.

Защита состоится " " 1992 года,

в часов, на заседании специализированного совета

К 002.85. 01. при Институте биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН (Москва, ул. Вавилова, 265.

с диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института биологии развития им. К К. Кольцова РАН.

Автореферат разослан " " 1992 г.

__Ученый секретарь совета

кандидат биологических наук Е. М. Протопопова

ВВЕДЕНИЕ.

АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ.

Изучение закономерностей дифференцировки клеток, их связь с процессами канцерогенеза и регенерации - одна из наиболее актуальных задач современной биологии. В настоящее время активно изучаются молекулярные механизмы регуляции дифференциальной экспрессии генов. Однако становится все более понятно, что на судьбу клетки как в эмбриогенезе, так и во взрослой ткани огромное влияние оказывает ее непосредственное микроокружение -контакты с соседями и с окружающим внеклеточным матриксом. Особый интерес вызывает связь между процессами морфогенеза, приво- . дящими к изменению морфологии ткани и иногда к изменению формы каждой отдельной клетки, и синтетической активностью этих клеток. По многим наблюдениям такая связь существует и, видимо, играет важную роль в поддержании целостности тканей и органов, а тага® в процессе последовательного включения генов в развитии организмов. В то же время, изучение этого уровня регуляции тормозится отсутствием детально разработанных экспериментальных систем.

В настоящей работе приводятся данные, указывающие на ■ то, что в печени млекопитающих тканевой уровень регуляции, а именно, локальные межклеточные взаимодействия'и взаимодействия клеток с внеклеточным матриксом, играют существенную роль в регуляции экспрессии гелатоцитарных генов. Разработанные нами экспериментальные системы, связанные с воссозданием в культуре тканей дефинитивной структуры печеночных балок и с сохранением взросло! о геп^т^шита. могут оказаться весьма полезными

для молекулярно-биологического изучения тканевых механизмов регуляции дифференциальной экспрессии генов. Таким образом, актуальность- настоящей работы связана с изучением тканевого уровня регуляции экспрессии гепатоцитарных генов, в первую очередь -раково-эмбрионального печеночного белка альфа-фэтопротеина (АШ).

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

Хорошо известно, что АШ обнаруживается в развивающейся и в регенерирующей печени млекопитающих, а также гепатоцеллкшяр- ■ ных карциномах САбелев, 1979; Энгельгардт, 1977; Энгельгардт, 1984]. Существует довольно много экспериментальных данных, говорящих о том, что "включение" этого эмбрионального синтеза во взрослых клетках связано с локальными перестройками структуры

тканей [Gleibennan et al, 1983). йэщвая ре-зкспреесия АФП наблюдается в первичных культурах гепатоцитов, изолированных из интактной печени взрослых мшэй СГлейбермаи, 1982]. Существую? данные, что на экспрессию фетального фенотипа в культуре гепатоцитов могут влиять как локальные межклеточные взаимодействия, так и различнее компоненты внеклеточного матрикса, а также их искусственные аналоги СГлейберман и др., 1987; Sleibeiman et al, 1S89; Koide et al, -1990; Lescoat et al, 1985; Michalopoulos et al, 1975; Reid et al, 1986; Spray et al, 198?].

Все имеющиеся данные о синтезе АФП гепатоциташ*свидетельствует о том, что os приурочен к областям с нарушенной балочной структурой, характерной для взрослой печени. Это наводит на мысль-,:.о. существовании тканевого-уроБШр.регу^цю1с:шгеза..этого ' белка [Glelfcernan, Abe Is v. 19853."". '

Целью . ластсгкзэй работы " было изучение закономерностей ре-экспрессии А®1 в культурах мышиных гепатоцитов и поиск воз-кожных путей регуляции этого синтеза, связанных с межклеточными взаимодействиями и взаимодействиями клеток "с внеклеточным мат- . риксом. ■ • ■' .... ; •

Дгя этого, предаолагадось разработать 'культуральнь!е модели, в которых сохранялась бы in vitro балочная, структура, характерная для взрослой лечени. to предполагали, что воссоздание в культуре взрослых органотшичэских. структур способно стабильно ингибировать ьознишовение в гепатоцитах синтеза АФП.

На . первой зтап'е работы предполагалось, что такая модель может быть создана ври добавлении к юноелойньм культурам' ииш-ных гепатоцитов различных ' компонентов внеклеточного матрикса (коллаген, глшозоаминогликаны). Этот путь не привел к желаем результатам. ...

В ходе дальнейшей работы были разработаны две другие куль-туральные системы, обладающие нужными свойствам!, одна из них -зто культивирование гепатоцитов внутри коллагенового геля. Другая - ко-культивирование гепатоцитов с линией эпителиальных клеток печени крыс [Guguen-Gut 1 louzo et al, 1983]. ■■ •

Кроме того, одной из задач работы было изучение локализации различных' компонентов внеклеточного матрикса (коллаген IV типа, фибронектин, лашнш, знтаетин, гепаран-сульфат протеог-ликан) в нормальной и регенерирующей печени мышей. _

В качестзе контроля за физиологическим состоянием клеток в культуре и их морфологией км выбрали:

а) локализацию ряда домекспецифических мембранных маркеров гепа-тоцитов С антиген желчных капилляров [Bsloshapkina, Khramkova, ,19743, рецептор к асиалогликопротеинам [Rosenfeld et al, 19863); б) распределение в цитоплазме актиновых и цитокератино-вьнс филаментов; в)функционирование высокопроницаемых,,межклеточных контактов.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ, ПУБЛИКАЦИИ И АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Диссертация состоит из разделов: Введение, Обзор литературы,; Материал и методы,' Результаты, Обсуждение, Выводы, Библиография." Общий объем работа - 160 стр. ыашшопксного текста.

Материалы работы были доложены на Всесоюзном совепрнии "Клеточные и молекулярные механизмы канцерогенеза и антиканцерогенеза".. (Ленинград, 1988); на симпозиумах:. "Regulation of liver gene expression" (Cold Spring Harbor/ USA, 1939); "89' Sapporo cancer seminars" (Sapporor, Japan, 1989); XVIII Mseting-.' of.* the. Internationa). Society for Gncodeveloprental Biology end Medicine (Шскза, 1990).

Диеертациия была апробирована на совместной конференции лабораторий генетики' иммунного ответа йн-та иммунологии Ш СССР и -лаборатории иммунохимии ВОНЦ АШ СССР.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА "И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ

В данной работе впервые показано,' что создание в культуре условий, приводящих к формированию лсЧбпс-гпз балтг,'1 является решающим моментом в кнгибкции синтеза АШ взрослыми гептоцитаки.

¡Впервые обнаружено, что трехмерная организация внеклеточного матрикса является достаточным условием для образования in vitro балочной структуры.

Впэрзые найдена четкая кореляция изжду сохранением гепато-цкгом нераспластанной формы и отсутствием в нем синтеза АФП, что говорит о том, что форма ¡гаетки сала по себе мокет служить фактором регуляции экспрессии генов.

Впервые обнаружено, что одним из самых ранних событий в паренхиме печенк при регенераии является появление одного из компонентов баз&яьнмх мекбрак зягактина

Все эти результаты имеют преимущественно теоретическое значение.

Практическую ценность представляют разработанные культу-ральнке модели, возводящие сохранять взрослые функции гепато-цитов в культуре. Эти модели могут быть использованы для изучения различных аспектов биологии и патологии печени.

МАТЕРИАЛЫ И NETQUbl

Культивирование. Суспензию гепатоцитов получали-после дву-хэтапной перфузии через нижнюю полую вену печени взрослых мышей линии С5782/6 in situ последовательно раствором ESTA и коллаге-назы стандартным способом. В качестве субстратов .использовали сухой желатин,"еухой коллаген и коллагековый гель. Затем чашки культивировали в среде Лейбовича L-15 (Flow) с 10% фатальной коровьей сыворотки с добавлением глюгамина и антибиотиков.

Иммуногкстохкшческие методы. В работе были использованы кроличьи аффино очищенные антитела к альфа-фетопротеину мышей, кроличьи моноспецвфические адсорбированные антисыворотки к мышиному коллагену " IV типа (Е. Engvall, La Jolla Cancer Research Foundation, USA) и к мышиному рецептору к ас налог ликопрот е ину (Д. Ы. Беленький, Иа-т биол. и мед. химии АМН СССР), кроличьи аффино очищенные антитела к ламшшну и фибронектину ( А. Е Любимов, БОНД АШ СССР), мышиные шноклональные антитела к цитокератшу с М.М. 49 кДа й к вименгину (лаб. механизмов канцерогенеза ВОВД АШ СССР, рук. - проф. И. М. Васильев), крысиные моноклональные антитела к ламинину, энтатаину и гепаран-сульфат протеогликану мыши (к.К Любимов, ВОЩ АМН СССР)-. В качестве вторых антител использовали антикроличьи антитела, конъюгированные с перокси-дазой (Amersham, UK) или с F ITC (Sigma, USA), антикрысиные антитела, конъюгированные с яерокеидазой (Artersham, UK), антимутные антитела, конъюгированные с пероксидазой (Dakopatta, Danmark) или.с FÎTC (Signa, USA). В некоторых случаях для выявления актина использовали фаллоидин меченый TRI ТС (Sigma, USA);

Для ишукогистогимического выявления компонентов матрикса in vivo кусочки органов в-7£ растворе желатины замораживали в ладком азоте. Срезы толщиной 5-7 мкы изготовляли на криостате фирмы Leitz (FRS), фиксировали в течение в течение 5 мин в за-буференном.при pH 7,4 10% формалине, отмывали не менее 1 часа в

«

забуфзренном физиологическом растворе и дальше обрабатывали последовательно первыш и вторыми антителами. Для выявления внутри- и внеклеточных антигенов в культурах гепатсцитов культуры фиксировали в течение 10-15 мин в 10X забуференном формалине с 0,05% сапонина. Обработку непрямыми кшун о г ис т о хкшче с -кими методами проводили после отмывки (не менее одного часа) в физиологическом растворе, содержащем сапонин.

Выявление высоко-проницаемых контактов. Эти опыты были проведены совместно с ¡0. Ю. Шарове кой (отдел математических методов в биологии «^факультетской проблемной научно-исследовательской лаборатории ¡ЛГУ). С помощью люминесцентного фазовокон-трэетного микроскопа ЛМАМ И-2 (ЛСМО, Ленинград), используя водкошмерсионньй объектив 40х и микрэмашшулятор, в клетки вводили''микроздаетрод с отверстием менее .1 щм, .через который яонофорезом'в клетки подавали флюоресцентный краситель Лвцифе-ровый иелзЕнй СН (Б1вта). О наличии высокопронкцаешк контактов судили по перетеканию красителя в соседние кяэтки. Количество клеток, в которые перетек краситель, подсчитывали через 2 минуты после вкалывания.

РЕЗ/ЛЬТАТЫ И ОБСУЖПЕНИЕ.

1. Внеклеточный натрикс в нативной взрослой мышиной

печени и при регенерации после частичной гепатэктог-тии и отравления СС?_ . -

Среда исследованных на'® компонентов матрикса, выделяется группа'кз трех (коллаген IV типа, фибронектмн н геларан-сульфат протеоглккач), локализация которых во »«роо^ой ¡¿гг^й «

при регенерации на св.етовом уровне практически не различается. Ярко, окрэливается базальная мембрана вокруг крупных сосудов печеночной дольки - триад и центральных вен, кроые того, окрашивание выявляется на синусной поверхности гепатоцкгов. Каши данные хорошо согласуются с тлеющимися по этому поводу в литературе [МзгЪтег-Негоапс^ег, 1984]. При регенерации печени после отравления СС1 принципиальных изменений в локализации этих компонентов матрикса не происходит. Как и преоде антитела выявляет1 крупные сосуды и поверхность синусов. Лишь в зоне некроза, в результате гибели гепатоцитов, их расположение теряет свою правильность.

- б -

Распределение ламинита несколько иное. В нативной взрослой печени он довольно ярко выявляется вокруг крупных сосудов, но практически отсутствует на синусной поверхности гепатоцитов или выявляется очень слабо в отдельных небольших областях. При регенерации печени после отравления CCI или частичной гепатзкто-мии на 1-Е сутки после воздействия наблюдается резкое усиление окраски в синусах. После восстановления массы органа лаыинин вновь перестает выявляться на синусной поверхности. Картина поведения ламинина при регенерации, полученная наш,_ полностью совпадает с описанной в литературе [Carlsson et al, 19811.

Наибольший интерес предстазляют данные по распределению гликопротеина знтактияа, компонента внеклеточного матрикса, обычно : .обнаруживаемого ; в комплексе с ¿аминином СCarlin et al, 1S813. В интактной взрослой печени он распределен практически так же, как лаыиннн. После частичной гепатэктомш ели отравления CCI энтактин начинает выявляться на синусной поверхности гепатоцитов. .Окраска дереттся^весь.период регенерации.(5-5 суток) и после завершния ее" исчезает, •' сохраняясь только вокруг '. крушиж .сосудов. .. ' ■ '■ ' : , :

Особый интерес представляет .-вопрос о том, в какой момент появляется" в синусах окраска'на энтактин? Ухе через 30 минут после операции гепатэкгоши энгактйн' выявляется на всех синусных поверхностях гепатоцитов;"После отравления CCI опрашивание на энгактйн появляется лишь на 5^6 час после воздействия, примерно в то же вреш когда вокруг центральных вен появляются зо- -ны некрозов. Столь- быстрое появление белка наводит на мысль, что после воздействия на Печень повреждающего агента происходит не синтез и отлозкевие в матриксе вновь синтезированного знтак-тина, . а лишь его демаскировка Эту точку зрения подтверждают тага® результаты обработки стекол с криостатными срезами взрослой интактной печени раствором трипсина В ряде случаев она приводит к появлении в синусах окраски на энтактин.

Таким образом, наш данные указывает на существенные перестройки в организации матрикса при изменении функционального и физиологического состояния печени, что указывает на возможную роль матрикса в регуляции функциональной активности гепатоцитов.

2. Функциональная активность взрослых мышиных гепатоцитов в культуре.

1) Культура взрослых мышыных гепатси^гтов на желатиновой подложке и на сухом коллагене.

'Стандартная культура мышиных гепатоцитов, описанная в литературе СГлейберман, 1982], в нашей работе служила контролем. Поведение взрослых мышиных гепатоцитов на нзлатиновой поююжке и на сухом коллагене практически идентично. Клетки прикрепляются к подложке и в течение первых 10-12 часов распластываются. В дальнейшем процесс распластывания продолжается; морфология гепатоцитов становится все более фибробластоподобкой и приблизительно на 3 сутки геяатоциты приобретают подвижность. В .стандартных условиях такая культура сохраняет етзиеспособность 8-10 дней. На последних этапах некоторые клетки сливаются,, образуя. кногоядерные структуры. Такая эволюция морфологии гепатоцита в культуре от эпителиальной к фибробластоподобпой сопряшна с коренной перестройкой щетоскелета. В натизной взрослой клетке, находящейся з балочной структуре, актин о вый цитоске лет -'представлен тонкой.внутриплазматичеекой сетью фаамэнтов и подмемб-_ ранным кортикальным слоем со значительным сгущением под«-желчным капилляром. Еа первые сутки в культуре актш в клетке представлен диффузной сеткой. Примерно на вторые сутки по краю клеток появляются фокальные контакта К концу вторах, в начале третьих суток культивирования в цитоплазме появляются яркие прямые ак-тиновые пучки - стресс-фибриллы. Во всей видимости, их появление оовпалает с приобретением клетками подкякяости. В процессе дальнейшего культивирования количество стресс-фибрилл а цихол лазме нарастает.- Параллельно с изменениями актинового цитоске-лета перестраивается и промезкуточные физзменты [Караганова, 19863. В гепатоцитах, как и во всех эпителиальных клетках, промежуточные фяламенты представлении прекератинами;' виментин, специфичный для клеток соединительной тканк, отсутствует. В на-тивной взрослой печени прекератины довольно плотной сетью заполняют всю цитоплазму, образую заметные сгущения только в области подлежащей под желчным капилляром, то есть там же, где и актин, а также перинуклеарное кольцо. В культуре гепатоцитов в-первую очередь исчезает сгущение вокруг взлчного капилляра. Прекератины в цитоплазме представлены ветвящейся древовидной

структурой. На вторые-третьи сутки культивирования в большинстве гепатоцитов начинает появляться виментиновый цитоскелет [Караганова, 1986].

В процессе культивирования гепатоилтов происходят заметные изменения спектра секретируешх белков. Постепенно затухает синтез альбумина UUchalopoulos, 1975; Ben-Ze'ev eL al, 1S88], зато ■ на S сутки культивирования во взрослых мышиных гепатоцитах возобновляется сиггез эмбриоспецифического белка сыворотки крови - альс^а-фетопротеина (АФП) СГлейберман, 19821. _Качкная с этого срока в культуре выявляются методом иммулогистохншш отдельные АФП-подокшельные клетки. Процент таких клеток может сильно варьироЕагь в . зависимости от плотности культуры • CSleibeman et si., 19891 21,' возможно, от других,причин.V.,Парал-лельно гепагоцигк в таких культурах теряет межлеточные коммуникации (вшокопрсшцаамые контакты), осуш.ествляемые через щелевые контакты. • - •;

Изменение морфологии в.свою очередь связано с нарушением -локализации домэнссецифических-маркеров гепатоцитов. В данной работе мы игуана.: два "л<штоте!Швдео!1ди.-ыаркера - .антиген 1 I Be 1 oshapk í na, Khra-nkova, -19743 ¿ ^обнаружвакйщйся - во. взрослой - - ' печени только на шмбране желчного калилляра, и рецептор к'аси-алогликопрогеинам, напротив, присутствующей на всей плазматической мембране, кроме той es части, которая обращена в' желчный капилляр CRosenfeld et al., 19861. У клеток, помещенных в культуру, сразу ле исчезает полярность мекбраны, сба антигена распределяются по всей плазматической мембране. В отличии от ситуа- • ции in vivo, где не удается обнаружить антиген 1 внутри клетки и выявить места его синтеза," in vitro с первых же часов культивирования большие количества этого антигена выявляются в области аппарата Гольдта. Оба маркера исчезают с ыембраны клеток через 3-4 дня культивирования, хотя в цитоплазме они выявляются,и на более поздние сроки.

Из разбора ситуаций, в которых появляются АФП-позитивные клетки (эмбриональная" печень до установления балочной структуры; области прилегающие к некрозам при регенерации печени; некоторые гепатоцеядалярные опухоли, в значительной степени теряющие балочную структуру; а также клетки в культуре, приобретшие фибробластоподобннй фенотип), было выдвинуто предполозкение, что

- д -

регуляция синтеза этого белка осуществляется на тканевом уровне, в зависнюсти от того образуют клетки структуру балки или нет [Gleiberman, Abelev, 1985].

Добавление в культуральную среду полианиона декстран-сульфата в концентрации 20-100 мкг/мл приводит к образованию из ге-натоцитов балкоподобкых агрегатов и одновременно подавляет синтез АФП ЕГлейберман и др. , 1987]. Однако' ни одна из исследованных молекул гликозоаминогликанов, по строении напоминадах декстран- сульфат, в сходной экспериментальной системе не дала четкого эффекта С этой точки зрения наш были исследовании: хояд-роитин-сульфат к, хондроитинсулъфат В, хондрожгин-сульфат С, гепаран-сульфат, гепарин. Различные _ сочетания данных веществ также не далк желаемого результата.

2) Монокультура взрослых мьшиныя гепатоцитов на кол-лаге новом геле.

Если в качестве. подложки использовать колдагекоЕый гель, то гепатоцкты быстро прикрепляются к этому субстрату, но медленнее распластывается. Первые 1-2 дня они сохраняют;' поджатую форму и, - выстраиваясь з характеряые цепочки,- образуют 'разветвленные структуры, по морфологии и строения акгинового ' цитоске-лета капоШ'Шаювде . печеночные балки. Сднзко структура эта непрочна и удеркивается'не более 1-2 суток. В дальнейшем гепатоци-ты приобретает яодбилшость к, ьидкш, не икея возытиоетк выползать на участки свободного геля, начинают ползти друг по другу. В результате получается образование внешне сохраняющее счсртсппл m фат-a каяпой отдельной клетки из

эпителиальной превращается в фибробластоподсбкук. 3 таких культура:-: на 3-4 сутки появляются А®-позитивные клетки. Активовый скелет в твких клетках представлен сетью стресс-фибрилл.

В серия опытов коллагеновый гель перед посадкой на него ¡слеток в течении нескольких часов икубировалн в' культуральной среде, содержащей гликозозмгшогликаны (хондроитш- сульфаты: А,В,С; гепарэн-сульфат; гепарин). Дата незначительные количества гепарина препятствовали полимеризация коллагена. Прочие из перечисленных веществ ни поодиночке, ни в различных сочетаниях не нарушали структуру геля и не оказывали существенного влияния на вре-мя сохранения балкоподебнкх структурах.

35 Культивирование взрослых мышиных гепатоцитов внутри коллагеновогс геля.

Более длительное сохранение в культуре балочной морфологии было достигнуто при культивировании гепатоцитов не на поверхности геля, а внутри него. На чашки Петри (диаметр - 40 ш), покрытые коллагеном, наносили суспензию. М1ляиных гепатоцитов. После прикрепления гавых клеток чашки отмывали. Затем среду по возможности полно отсасывали, быстро покрывали клетки раствором для полимеризации и помещали чашки в термостат на несколько минут. Как только верхний слой коллагенового геля лолимэризозал-сл, в чашку добавляли культуральную среду. Культура: удовлетворяла нашим требованиям, - гели на " всей площади соприкосновения верхний слой гехч хорово сололнмеризовался с ншякч.'Дш; -образования балочной структуры требуется довольно, высокая" плотность клеток, поэтому мы после нанесения.на чашет клеточной суспензии' подвергали их легкой-роуацииг в;результате .чего'в-центре образовывалась зона првшешой-.шоткости. . -.■,'..

Еа первые-.су!та^к7льтивированш^гепатоциты,г.заключенные внутрь геля,' слегка-распластывалиеь;^ Затем ^клетюг'^ находящиеся на небольшом расстоянии начинали устанавливать контакты друг с другом. В результате они выстраивались в разветвленные цепочки клеток, сохраняющих полигональную форму. На этой стадии культивирования (1 сутки) культура гепатоцитов внутри геля по морфологии очень похода на культуру на геле-того же срока. Отличие проявляется на вторые сутки, когда культура гепатоцитов внутри геля приобретает еще большее сходство с печеночной балкой. В зоне контакта между гепатоциташ образуются структуры по своей морфологии идентичные желчным капиллярам. Такая балочная организация культуры внутри геля может сохраняться 7-12 суток. Ее стойкость, по-видимому, зависит от конкретных условий микроокружения вокруг каждой клетки. В какой-то момент она нарушается, и клетки начинают ползти друг по другу, приобретая фибробласто-подобную форму. Эмпирически найдена закономерность, что сохранению балочной структуры способствует ежедневная смена культу-ральной среды.

Таким образом, гепатоциты, культивируемые внутри коллагенового геля, образуют структуры по морфологии практически идеи-

- и -

тичные бажам взрослой печени. Этот вывод подтверждает экспрессия и локализация доменспецифических антигенов, организация в клетках актинового цитоскелета, а также опыты по установлению степени связи клеток через щелевые контакты. В качестве доменспецифических маркеров были выбраны антиген 1 и рецептор к асиа-логликопротеикам (РАГП).-

Антиген 1. На первые сутки культивирования антиген распределен по всей мембране гепатоцитов, кроме того, небольшая окрашенная область выявляется в цитоплазме клеток Вероятнее всего, это - аппарат Гольдгки. Его выявление свидетельствует об активном синтезе антигена На вторые сутки антиген попреднему распределен по всей мембране. Более ярко окрашиваются зоны контакта кэяду клетками. Иногда видно, что антиген собран лишь в небольшой частей зоны контакта. Повидимому, эта часть' является образующимся желчным капилляром. Аппарат Голь дет выявляется.- На третьи сутки 'большая часть антигена i выявляется в желчных капиллярах, но незначительные количества его еще распределены по всей кембрена гепатоцктов. Аппарат Гольдам'выявляется/.-слабо в части клеток.'■ Еа пятые сутки он перестает выявляться."4 Антиген 1 ".присутствует только" на кембране желчных кашшнров;и исчезает с ' плазматической в тех областях культуры, где клетки, сохраняют балочную структуру. Тал, где эта структура нарушена,- гепатоцкты приобрели форму фиброблэстов, антиген i не выявляется.

Рецептор к аакалогдеюпрогекнам. В "баночных" областях этот картер обнаруживается на -той поверхности гепатоцитов, которая гомологична синусной - таковой является вся внешняя поверхности база от. солркксоагазяся с водлагеяовьм гелем. На мембране, кояуакгярущзй с соседней клеткой, a tatas в адовом капилляре,- антиген не выявляется. Надо отметить, что в данной системе интенсивность выявления этого маркера нгвысока, он практически отсутствует в цгвголлагмз, в противоположность тому, что кэблюлается in vivo, г да внутриклеточный РАГП составляет 901 [Doyle et al, 1982].

/истин. Актин выявляли с помоптью фаллоидина, коньютирован-ног-о с TRITC. Окрашивание показало, что в областях, имеющих балочную морфологии, распределение акт-ина соответствует таковому в интакпюй взрослой печени: выявлялся тонкий подмембранный слой с многократным усилением яркости окрашкгния под мембраной

окружающей желчный капилляр. В областях, где клетки приобрели распластанную морфзлогию, наблюдается распределение актина типичное для фибробластоподобных клеток - в цитоплазме появляются . яркие пучки актина (стресс-фибриллы).

Прекератины. Выявление прекератиювых филаментов в гепато-цитах, культивируемых внутри геля, с помощью специфических антител проводилось только в двухдневных культурах. Выявлены сгущения вокруг жэлченс капилляров с отходящей от них сетью волокон, заполняющих вес цитоплазму.

Высоко-проницаемые контакты (B1IK). In vivo гепатоцьтк в балке характеризуются хорошо развитой системой межклеточных коммуникаций, осуществляемой через ВПК, морфологическим субст-. ратоы.которых является щелевые контакты.Через ВПК осуществляет--с-я электрическая сшзь, - свободная дкффузш конов и . метаболитов с молекулярной массой не более 1000 Да Бак было показано в ряде работ, эта связь резко падает или даке исчезает .' вовсе при • неопластической трансформации клеток и при помещении 'Hxjb ^культуру ÍSpray et al,1989; Gleiberinap. et al, 1989].¿Уровень межклеточной связи вг.шх. культурах.был", измерен тодом шкроиньекцзи в клетку-люминесцентного красга'еляглюцйфе-рового желтого с ¡.щекулярной массой 440 Да, способного проходить через отверстия'щелевых контактов. Степень сзязи оценивали по количеству клеаж, в которые краситель проникал га одну' минуту. В участках культуры с балочной морфологией высокий уровень связи деряаяся все время существования данной структуры. Связь между кяеткааа исчезала параллельно нарушению организации балки. В тех областях, где клетки приобретали фибробластоподоб- ' ную форму, она практически отсутствовала.

Альфа-фетопротеин (АФП). Иммуногистохимическое изучение синтеза АФП в культуре -внутри коллагенового геля показывает следующее. Среди клеток полигональной формы, включенных в структуру балки, АЙЬнозитивные клетки полностью отсутствуют. Напротив, там, где балочная структура нарушена, клетки распластаны и ползут друг по" другу, обнаруживается значительное количество клеток, синтезирующих АФП. Процент таких клеток ■ могкет колебаться. Далеко не каддый гепатоцит, имеющий фибробластопо-' добную морфологию, становится АФП-синтезирующим. Но безусловно верно, что АШ-синтезирующие клетки встречаются только среди

гепатоцитов, приобретших фибробластоподобную морфологию. Этот вывод хорош иллюстрирует опыт по двойному окрашиванию культур внутри геля антителами к АФП и фаллоидином. Области возможной локализации АФП-позитивных клеток четко совпадают с областями-, где актиновый цитоскелег представлен яркими пучками, пронизывающими цитоплазму клеток. Напротив, там, где актин выявляется только вокруг желчных капилляров и в виде тонкой сети под мембраной - АФП-позитивные клетки отсутствуют.

4) Ко-культивирование взрослых мышиных гепатоцитов с л1-!нией крысиных кепаренхиматозных эпителиальных клеток

печени iаи-20.

Второй экспериментальной моделью, в которой удаюсь создать условия , необходимые для организации гепатоцитов в балки, оказалась система, в которой взрослые мышиные гепатониты культивируют совместно с клетками эпителиальной печеночной линии 1АК-20. Иоде ль эта впервые описанна- А. Гийкво . Сби^иеп-6ulliouzo.et.al, 1883;• БиШоиго, 1986]. После прикреплениячге--патоцитов^к субстрату (стандартное желатиновое покрытие или-су-.-. . хой коллаген) культуры отмывают от -неприкрепившхся клеток, а затем добавляют суспензию клеток линии 1АЙ-20. На чашку ' Петри диаметром 40 мм мы наносили 150-200 тысяч гепатоцитов и 500-600 тысяч 1А1?-20. Причем, в отличие от описанной в литературе скс-тёш, клетки линии 1АЙ-20 мы наносили не равномерно на всю чашку, а легкой ротацией добивались того, что в центре образовывалась зона повышенной плотности. Таким образом в одной чашке ГЬхри обрассг^слг.сь две плевно поп^п.тгяптие лруг в лпуга зоны: центральная, с более высокой плотностью 1АД-20 и периферическая - с более низкой. В дальнейшем, когда мы будем употреблять обозначения "центр" и "периферия", мы будем иметь в виду именно это. разделение по плотности. Мы не добавляли в культуральную среду глюкокортиковды, как это требуется по стандартной методике. Это дополнение является существенным, так как известно, что глюкокортикоиды сами по' себе являются ингибиторами синтеза АФП, действуя непосредственно на уровне генома.

На первые сутки культивирования морфология отдельных гепатоцитов практически не отличалась от морфологии гепатоцитов того же срока в стандартной монокультуре на субстрате, покрытом

желатиной или сухим коллагеном. Видны либо одиночные, хорошо распластанные клетки с ровным краем; либо островки, состоящие из распластанных гепатоцитов, пространство между которыми занято слоем 1Ай-20. На-этой стадии кяетки линии 1АЙ-20 используют для прикрепления все пространство, незанятое г-епатоцитами, но отсутствуют на поверхности гепатоцитов. Клетки 1АН-20, подползающие под. гепатоциты, такке отсутствуют. В последующие несколько суток культивирования "плотность 1А1?-20 постепенно растет за счет их размножения. В результате они начинают конкурировать с гепатоцитами за субстрат. Особенно сильно эта конкуренция выражена в центральных районах, где плотность УР-20 была исходно выше. Как следствие этой разницы в-шюености, морфология гепа-тоцитарных островков в центре ■ и на'г: периферии начинает различаться.Клетки центральных 'ост1»вков-''£бдаЬв4ан®ся, перестают распластываться, напротив, гепатоциты из-" периферийных островков, слабо теснимые клетками Ш-20, распластываются и приобретают подвижность практически так газ, как контрольные клетки в обыздой'юноиультуре. йГдала^е^ф^р^игедьно -нау 3-5 4 сутки культивирования гепатоциты в-центральныхто'строзкз^: приобретают эпителиальную морфологию^; 1Ю^.н^'пдявди1ется?'2елтак8 'капилляры. ■ Структура згих' островков стансвигся--вденйпшой" печеночной балке.. При фазово-контрастной микроскопии, шш при окргюке фиксированных культур гематоксилином видно, что все гепатоцитарные островки, обладающие палочной структурой, ккеет на своей поверхности, обращенной в культуральнуга среду, непрерывный слой клеток линии 1№-20. Таким образом, .гепатоциты в этих островкех так же, как и клетки внутри гашатенового геля, находятся в трехмерной системе. На периферии, где плотность 1АЯ-20 шшэ, гепатоцитарные островки ■ состоят кз распластанных клеток и, по крайней мере, в подавляющем большинстве случаев не имеют "крыши" из Ш-20. Наличие или отсутствие "крыши" из 1А15-20 хорошо доказывается опытами по микроиньекци» люминесцентного красителя лзсциферового. зкелтого в одну из клеток 1АКг20. Дело в том, • что эта линия обладает высоким уровнем межклеточной связи, поэтому иньекция красителя в одну из клеток делает хорошо заметным расположение всего окружающего данную кяету пласта

При дальнейшем культивировании центральная гона островков, имеющих балочную структур у, расширяется, захватывая все более

периферические районы. Такое расширение обусловлено тем, что периферические островки, состоящие из распластанных клеток, под действием увеличивающейся плотности ¡№-20, претерпевают морфологическую перестройку. Мы считаем, что эта перестройка проис-„ ходит вследствии наползания клеток 1А1?-20 на верхнюю поверхность гепатоцитарных островков. Доказать, что такая перестройка действительно имеет место, можно серией опытов по добавлению клеток линии 1А1?-20 не сразу после прикрепления гепатоцитов, а через различные промежутки времени ( на первые, вторые и третьи сутки культивирования). В этих случаях в момент добавления 1АК-20 гепатоцигы уже приобрели распластанную морфологии, а на третьи сутки уже и подвишость. Однако во всех исследованных случаях через 3-5 дней после добавления 1АК-20 в таких культурах появились . гепатоцигарные островки с балочной структурой. Таким образом, распластанный фенотип не является для гепатоцита необратимы!,!, и в определенных условиях микроотфузЕНия он может ' быть преобразован _в . эпителиальный. По крайней мере, фенотип, характерный,для 3-х...суток культивирования, является' обратимым.. /Полное восстадовленйе'^алочной /морфологии.'в таких островках -^•подтверждается распределением актина -

"Так же, как и в случае культуры гепатоцитов внутри геля, мы подтвердили наличие балочной структуры в центральных островках и отсутствие ее' в периферических используя такие показатели, как локализация- доменелецифических маркеров, организация. актинового цитоскелета и прекератинов, наличие между клетками - высокопроницаемых контактов.

Антиген 1. На первые сутки культивирования антиген 1 выявляется на всей мембране гепатоцитов, несколько более интенсивно в зоне их контакта между собой. В областях контакта с 1А!?-20 такого усиления окраски нет. Окрайка распределена по всей зоне контакта гепатоцитов равномерно. В цитоплазме всех гепатоцитов выявляется аппарат Гольдш. На вторые сутки в центральных островках несколько изменяется локализация антигена 1. Он попреж-нему выявляется в аппарате Гольджи и на мембране в зоне контакта гепатоцитов, но в некоторых случаях он распределен ухе не по всей площади контакта, а локализуется в структуре, морфологически идентичной желчному капилляру. Как и в культурах внутри геля, создается впечатление, что при образовании згалчного ка-

пилляра антиген 1, распределенный по всей зоне контакта, собирается в ту ее часть, которая обращена в просвет желчного капилляра. В периферических гепатоцктарных островках, как и на. тот же срок в монокультуре на ¡гелатине-, данный антиген распределен по всей мембране. Аппарат Гольда выявляется слабо или не выявляется вовсе. На 3-4 сутки культивирования в каздой чашке выявляются следующие зоны по распределению антигена 1: в центральных островках с балочной структурой он локзлкзуеч-ся исключительно на мембране желчных капилляров, затем следует небольшая зона, содер;«адая островки из гелатоцитов средней степени распластанности, в которых антиген 1 слабо окрашивает всю плазматическую меьйрану. И, наконец, на са«ай пернферш чашей, где плотность. ¡АК-20 наиболее низка и располагаются островки из на-, иболее распластанных клеток, там антиген'1 практически'не выявляется. Аппарат Гольджк на. этот.срок не выявляется во всех трех зонах. В дальнейшем (мы исследовали распределение антигена 1 на -5 к 9 сутки) принципиальное строение, культуры не меняется. За исключением того, что центр, состоящей-из * балочных островков, постепенно,^расширяется, а периферическая "еона,_соотзетст£енко, сокращается,-■ ■ ■ -----

Рецептор к асиалоглккопготеинам (РАГП). Локализацию РАГП в ко-культурах исследовали на 5 и 9 сутки культквироЕалия. В обоих случаях распределение РАГП-сщ5тезкрувщкх клеток" подчинялось одинаковые закономерностям. Центральные гепатоцитарные островки сохраняют рецептор, периферические - нет. Граница^ разделяющая-РАГП-позитивные к РАГП-негативные островки очень резкая. Включение синтеза РАГП не вполне совпадает с'моментом организации, гепатецитов в банки. Экспрессия РАГП начинается в клеткам с еще распластанной морфологией . Причем,-в аткх еще фкбробластопо-добньж клетках интенсивность метки даиж несколько випе , чем в клетках, входящих в состав балет. Трудно что-либо говорить о количестве рецептора на плазматической г.ккбраке этих клеиок., но количество данного белка в цитоплазме у них существенно выиэ. Эта же закономерность прослекквается и при сравнении культур 5-х и 9-х суток. Ба 9-е сутки количество внутриклеточного рецептора в балкоподобных островках заметно ниже, чем на 5-е сутки в аналогичной зоне. Создается впечатление, что в какой-то момент эволюции гепатоцит&рного островка в сторону балочной ор-

ганизации наблюдается резкий всплеск синтеза РЛГП, а затем его количество постепенно приходит в норму. В полностью сформированных балочных островках РАГД локализуется частично в цитоплазме, частично - на всей поверхности плазматической мембраны, за исключением той ее части, которая обращена в желчный капилляр. Эта картина полностью соответствует локализации данного маркера ln vivo.

Актин. Распределение актиновых филаментов также обнаруживает сходство с той картиной, которую мы наблюдаем в культурах гепатощгхов внутри коллагенового геля. В центральных областях с установившейся: балочной структурой распределение актина типично балочное - заметное сгущение окраски вокруг зкелчнсго шпилляра ... и тоиккл подмембранная сеть. В гепатоцитарных островках,. состо-. ящях из распластанных клеток, актиновый цитоскелет, соответст--венно, представлен пучками в цитоплазме.

Прекератины. В центральных балочных островках гепатоцитов • прекератины образуют, довольно плотную сеть, заполняющую всю цитоплазму клеток," с заметным сгущением плотности этой сети вок-- желчного капилляра. Зта картина, аналогична наблюдаемой в -■ .нативной печени. В"периферических островках из 'распластанных 'клеток прекератины в цитоплазме представлении отдельными ветвящимися пучками, то есть так же, как в стандартной культуре ге- ' патоцитов на желатиновой подложке.

Еысоко-дронмцаемые контакты. Измерение уровня мегкклеточной связи . в ко-культурах таете дало результаты, сходные с тем, что мы наблюдали в культурах внутри геля. В центральных балочных островках уровень связи был высок. В некоторых случаях за одну минуту краска перетекала в 10-15 соседних клеток Напротив, в островках состоящих из распластанных или вытянутых клеток, связь между гепатощгаами практически отсутствовала. Никогда не наблюдалось связи между гепатоцитами и линией IAR-20, хотя, как это уже упоминалось, IAR-20 внутри своего пласта обладают высоким уровнем связи.

Все приведенные результаты (локализация доменспецифических маркеров, строение актинового цитоскелета и локализация промежуточных филаментов, закономерности наличия и отсутствия связи через щелевые контакты) однозначно говорят о том, что центральные островки, состоящие из полигональных клеток и похожие на

. - 18 -

печеночные балеи по морфологии, действительно имеют структуру идентичную балочной. В го же время, островки, состоящие из распластанных клеток в той яе культуре такими свойствами не обладают и по своему поведению не отличаются от гепатоцитов в стандартной монокультуре на желатине.

Локализация АФП-синтезирующих клеток. На 1-2 сутки АИЬпо-зитивные клетки отсутствовали во всех ко-культурах, В некоторых культурах на 3-4 сутки еще нет гепатоцитарных островков с балочной структурой и клетки во всех островках имеют более менее распластанную морфологию. В таких культурах на всей поверхности чашки специфические антитела к АЩ выявляют довольно большое количество гепатоцитов, синтезирующих этот белок. Все ^АФП-положительные клетки имеют фибробластоподобную морфологии!";- .В . тех чашках, где на 4 сутки культизярования уже "сформировались островки в центре, АФП-клетки в балочных островках отсутствуют, зато, на периферии, в островках из распластанных гепатоцитов, их процент попрежнему велик.. Если в центральном районе- иногда и удается обнаружить А®-позитивную клетку, то она, как правило, имеет-, распластанную форму . и;£вшадаег из структуры;балки.; Еа: последующие сроки культивирования". (5-10; сутки) принципиальная схема распределения А®Ь-позитивных клеток сохраняется'- они обнаруживаются только в периферических" островках, состоящих из распластанных клеток, и отсутствуют в центральных, имеющие структуру балки. Однако нужно отметить, что по мере старения культуры, и в периферических островках процент АФП-клеток- постепенно снижается. Возможно, это как-то связано с нарастанием плотности 1АГ?-20. Те немногочисленные клетки, которые мы находим на периферии 10-дневных культур, выглядят лежащими над плотно' зажатыми окружающими их 1АЯ-20 клетками гепатоцитарного островка Все . АФ1Ьклетки этого срока имеют очень сильно распластанную, сильно поляризованную форму.

Грубое выявление внеклеточного ыатрикса проводилось с помощью окраски ко-культуры азаном. Известно, что зто окрашивание хорошо выявляет фибриллярный компонент внеклеточного матрккса соединительной ткани и базальной мембраны,'в основном - коллагены различного типа В ко-культурах окрашивание появляется на 3-4 сутки как четкий ободок вокруг островков эпителиальной фор-ми, легаций междугепатоциташ.и .слоем ДАИ-го.^Постепенно, к 10..

суткам этот слой утолщается, зазор медце островком и окружающим его слоем IAR-20 становится более выраженным.

Наши данные говорят о том, что критическим фактором для поддержания органотипической организации печени в культуре является трехмерная организация внеклеточного матрикса Это неудивительно, если вспомнить, что в нативной печени , в отличии от условий, в которые попадают клетки в стандартной культуре, вся свободная поверхность гепатоцита покрыта сетью из компонентов матрикса А роль.крепящей конструкции зтой структуры по данным иммунозлектронной микроскопии печени человека отведена именно молекулам коллагена 1 типа [Martinez-Hernandez, 1984]. .Мы связываем установление органотипической структуры в центральных островках ко-культур с наличием трехмерного окружения ■ вокруг них. У всех балочных островков на верхней поверхности, обращенной к культуральной среде, лежит сплошной слой IAR-20. Окрашивание культур азаном выявляет толстые пучки волокон внеклеточного матрикса, окружающие центральные островки. ' По ' своей' морфологии и по тому,-что хорош окрашиваются азаном они больше, всего•■ псхоки на пучки коллагена 1 типа В последнее время ело-- -.¿килось представление, что такой контакт гепагоцитов с клетками печеночных эпителиальных линий, предположительно происходящими из клеток Геринга или эпителия желчных протоков, является спе- • цифическим фактором,для поддержания экспрессии многих печеночных специфических генов [Guillouzo, 1986]. Однако наши данные говорят в пользу того, что для поддержания печеночной морфологии, а, возможно, и синтеза некоторой части печеночных белков, прямой контакт с эпителиальными ллемпеши йечени является псспо-цифичным.' Он может быть с успехом заменен трехмерным коллагено-вым гелем. Эту точку зрения также подтверддают недавно появившиеся работы, в которых линии эпителиальных клеток печени заменены на фибробласты CKurl-Harcuch et al, 1989]. Важным выводом данной работы является то, что матрикс способен, видимо, поддерживать органотипическую морфологию и функции клеток только в том случае, если он окружает их со всех сторон, образуя трехмерную сеть. Не исключено, что состав трехмерного матрикса может быть более или менее благоприятен для поддержания балочной структуры.

- 20 -

Распределение АФП-позитивных клеток в ко-культуре и внутри геля всегда подчиняется следующим закономерностям: в гепатоци-тарных островках, имеющих законченную балочную структуру, АФП-позитивные клетки полностью отсутствуют, а в островках не имеющих такой структуры или имеющих только отдельные ее черты, появляется вероятность обнаружения АФП-клеток. Причем, эта вероятность тем выше, чем более-распластанную морфологию имеют клетки, образующие данный островок.

Таким образом, в данной работе подтверждено предположение о том, что синтез эмбриоспецифического печеночного белка регулируется на тканевом уровне. По крайней мере, мошо утверждать, что такой способ регуляции существует наряду с прямым воздействием. глюкокортикоидов на уровень транскрипции специфической АФП-мРЕК [беиШп еЬ а1, 1988]. .. ".'' гГ:".. .

Однако неясно, что влияет на скктёз: А®1 - эпителиальная форма клеток или же те специфические взащодействия медду.ними, в которые они вступает, находясь в составе";,балок. Предпологм-тельно, роль таких специфических взашодэйствий -мож? быть отведена щелевым контактам, объединяющий:все?®клетки-'- в^бзлке в единую метаболмгичеа^ую систему. В предыдущих "работах А. С. Глей-берыана и КХ И Шаровской показано, что появление АФП-клеток в стандартных культурах взрослых мышиных гепатоцитов четко ¡коррелирует с исчезновением связи между клетками [61е1Ьегтал еЬ а1, 1989]. Однако, опыты по культЕвироЕанкю • одиночных гепатоцитов (какие-либо взаимодействия между клетками с помощью щелевых контактов или каких-нибудь других колекул на мембране исключены) внутри геля и в ко-культурах показывают,' что фор;ла клеток/ невидимому, в данной системе является критически.! фактором.

55 Одиночные клетки в ко-культурах и внутри коллаге-

нового ГЕЛЯ.

Особый интерес представляет изучение синтеза АФП в редких культурах, где большинство клеток остаются 'одиночными, фи выращивании такой редкой культуры в стандартных условиях на желатине или коллагене процент АФП клеток резко повышается по сравнению с более плотными культурами. При культивировании одиночных гепатоцитов внутри геля число АФП-клеток в процентном соог-

ношении не увеличивается. Среди одиночных клеток, сумевших распластаться внутри геля, есть АФП-позитивные, однако, среди сохранивших поджатую форму, АФП-позитивных нет. Во многих таких клетках стандартный иммунопероксидазный метод окрашивания выявляет небольшие гранулы около ядра, однако, предварительная забивка эндогенной.пероксидазы с.помощью 30 минутной обработки чашки метиловым спиртом с 0,1% перекиси водорода приводит к полному исчезновению этих гранул. Сходный результат получен и в ко-культурах с редким посевом гепатоцитов. Среди одиночных клеток, имеющих распластанную морфологию, процент АФП-клеток явно повышается, но все' одиночные клетки, сохранившие или приобретшие подлитую морфологию, являются АФП-негативными.

Если поджатая форма взрослого гепагоцита исключает возможность синтеза в нем АФП, то распластанная морфология является необходимым условием для синтеза АШ, но не достаточным. Создается впечатление, что включение работы АФП-гена в распластанных клетках .- вероятностный процесс.

Остается открыть»/ вопрос о механизме воздействия на клетку трехмерного внеклеточного матрикса Мы предполагаем, что. трехмерный матрикс создает каркас, -задающий характер распределения на мембране взаимодействующих с ним рецепторов, что в свою очередь определяет тип строения цитоскелета клетки, связанного с рецепторами, к матриксу ["Nelson et al, 1990]. Каким образом строение цитоскелета может определять регуляцию экспрессии тех или иных генов - одна из интригующих проблем современной биологам. ялнп_ сто рйШАиие ятого вопроса, возможно, пвольет свет на взаимосвязь между морфогенезом и дифференцировкой клеток. -

ВЬВОПЫ

1. Показано, что гепатоциты взрослых мышей способны восстанавливать и длительное время поддерживать органотипическую организацию в культуре при выращивании их внутри . коллагенового геля, приготовленного из сухожилий крысиных хвостов, и при ко-культивировании их с непаренхиматозной эпителиальной линией клеток печеночного происхождения.

2. В органотипических структурах гепатоциты восстанавливали полигональную форму с образованием желчных капилляров. Орга-

нотипическая структура характеризуется аналогичным взрослой ткани распределением доменспецифичеких антигенов печени (антигена желчных .капилляров и рецептора к асиалоглккопротекнам), элементов цитоскелета (актина и прекерагинов), отсутствием синтеза Еименгина В органотипических структурах, так же как во взрослой печени, наблюдается высокий уровень межклеточной связи.

3. Создание и поддержание органотипической балочной структуры печени в обоих исследованных системах сопровождалось воссозданием трехмерной организации внеклеточного матрикса, окружающего клетки.

4. -Контакт с коллагеном или коллагеновым. гелем в стандарт- , ной двумерной системе культивирования не приводил к организации гепатоцитов в балки. .-.'. • .....

5. В ко-культурах балочные островки гепатоцитов располагались только в областях, где клетки эпителиальной печеночной линии покрывали их .сверху сплошным слоем... Гепатоцитарные островки без. такого покрытия состояли из клеток фибробластоподобной морфологии. ■ . : . ' • . . :'.*/ ;• .' ..

6. В обоих исследованных системах клетки, скнтезирувпцка : альфа-фэтопрэтеин, располагались только е участках культуры ' с• локальными нарушениями балочной структуры, среди клеток, приоб- . ретших фибробластоподобну» морфологию, потерявиих доменспецифи-ческие маркеры, межклеточную связь и балочную организации .цитоскелета

7. Опыты по культивированию одиночных гепатоцитов показа- .. ли, что для . ингибицш! синтеза А®1 критическим фактором" скорее является сохранение «гормы клеток (ингкбщия распластывания), а не медгепатоцитарные контакты.

8. Выявлено резкое изменение локализации энтактика н лами-нипа в регенерирующей печени. Появление в паренхиме регенерирующей печени знтактина - одно из первых событий, сопровождающих регенерации. ' Вероятно, что наряду с трехмерной организацией матрикса, изменение его химического состава существенно для ре1-гуляции фенотипа гепатоцитов.

-Ч

- 23 -

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

Gleiberman A. S. , Kudrjavtseva Е. I. , Sharovskaya Yu. Yu. , Abelev G. I., Synthesis of alpha-fetoprotein in hepatocytos is co-ordinately regulated v/ith cell-cell and cell-matrix interactions, Ktol. Biol. Med. , (1989), 6, 95-107.

Sharovskaya Yu. Yu. , Gleiberman A. S., Kudrjavtseva E.-I. , Intercellular coimnjnication and alpha-fetoprotein synthesis in adult hepatocyte culture, In: Intercellular communication, Ed: F. Bucauskas, Manchester University Press, Manchester and New York, 1991, 91-106. .

■ ГлейОермзн А. С. , Шаровская Ю. Ю., Кудрявцева E. К , Регуляция синтеза альфа-фетопротеина в культурах гепатоцитов.взрослых мышей, Цитология, т. XXXV:N9, 1988, стр. 1126.'

Gleiberman A. S. , Kudrjavtseva Е. I., Sharovskaya Yu. Yu., and Abelev G.I., Cell-cell, and cell-matrix interactions are involved in the regulation of alpha-fetoprotein synthesis in hepatocytes. In: Regulation of liver gene expression. Cold Spring Harbor, New York, '1989 , 209.

. -■'.г;.'.Gleiberman A.S., Kudrjavtseva. E. I., Sharovskaya - Yu. Yu., Abelev G. I., Regulation of alpha-fetoprotein synthesis in mouse hepatocytes in vitro. In: "89' Sapporo cancer seminars", Sapporo, 1989b, 50.

Gleiberman A. S., Kudrjavtseva E. I., Sharovskaya Yu. Yu. , and> Abelev S.I. , Tissue mechanisms involved in the regulation of AFP synthesis. In: Abstract book of XVIII meeting og the.. international society for cncodevelcpmental biology and .medicine, musgoh, 1S3G, 7.

Kudrjavtseva E. I., Ljubirrov A. V., Gleibernen A. S., Extracellular matrix reorganization during liver regeneration. In: Abstract book of XVIII meeting og the international society for oncodevelopmental biology and medicine, Moscow, 1990, 64.

Kudrjavtseva E. I., Gleiberman A.S. , Cell shape as a critical factor in the reexpression of alpha-fetoprotein synthesis in primary culture of adult mouse hepatocytes. In: Abstract book of XVIII meeting og the.international society for oncodevelopnental biology and medicine, Moscow, 1990, 64.